TW201906636A - 處理腫瘤之方法中使用的奈米顆粒 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於處理腫瘤的方法。特定言之，本發明提供奈米顆粒與游離輻射組合用於處理腫瘤的新穎用途，其中奈米顆粒的組合作用誘導腫瘤細胞的衰老及/或同類相食。

Description

處理腫瘤之方法中使用的奈米顆粒
本發明係關於處理腫瘤的方法。特別地，本發明提供奈米顆粒與游離輻射組合用於處理腫瘤的新穎用途，其中奈米顆粒的組合作用誘導腫瘤細胞的衰老及/或同類相食。
放射療法(也稱為放療)是最常用的抗腫瘤策略之一。超過一半的癌症患者接受單獨或與手術或化療組合的游離輻射(ionizing radiation；IR)。1最近在醫學物理學中取得的進展(低能量/高能量輻射的發展，單次、低次或超級分次治療(fractionation)計劃的實施以及所用劑量率的多樣化)以及創新醫療技術的發展(如3D-順形放射治療(3D-conformational radiotherapy；3D-CRT)、強度調變放射治療(intensity modulated radiation therapy；IMRT)、立體定向放射手術(stereotactic radiosurgery；SRS)和功能成像))有助於更好地對腫瘤提供有效劑量的輻射，同時保護周圍健康組織，對周圍健康組織的影響是放射治療最常見的副作用。2已經開發了奈米藥物(例如放射性同位素標記的或金屬奈米顆粒)的若干應用，以藉由使用奈米材料作為成像劑或造影劑(contrast agent)來更好地將輻射劑量遞送到腫瘤部位及/或作為放射增敏劑，增強在腫瘤中的劑量沉積和減少輻射相關的副作用，從而改良該治療指數。3,4,5,6,7考慮到 經任何組織吸收的輻射劑量與材料的相對原子序的平方(Z2)(其中Z是原子序)有關8，已廣泛調查了含有高Z原子的奈米顆粒(如金或釓)改良放療的潛力。在暴露於游離輻射的情況下，基於重金屬的奈米顆粒產生光子和鄂惹電子，其改良在腫瘤中的總劑量率沉積，誘導活性含氧物(reactive oxygen species；ROS)的產生並導致許多腫瘤(包括例如黑色素瘤、神經膠質母細胞瘤、乳房癌和肺癌)的細胞損傷。9,10,11儘管幾個臨床前動物模型揭示了基於重金屬的奈米顆粒與游離輻射的組合可減少腫瘤生長的能力，但是仍然需要改良奈米顆粒與游離輻射組合在抗癌治療中的使用。
在本揭示案中，發明人探索了含有高Z元素的奈米顆粒，特別是釓基奈米顆粒(gadolinium-based nanoparticle；GdBN)與游離輻射的組合，以藉由非細胞自主性機制來誘導細胞衰老和死亡的能力。發明人揭示了在GdBN存在下癌細胞的照射增強了經照射的癌細胞經歷衰老的能力。與此同時，本案發明人觀察到受照射的癌細胞也表現出同類相食(cannibalism)活性並且在活細胞吞噬後消除了照射和未照射兩者的鄰近癌細胞。本案發明人進一步破解了在GdBN存在下由癌細胞照射引起的生物效應中涉及的訊號傳導途徑，並揭示在GdBN存在下照射後，癌細胞的增殖可能由於衰老和細胞同類相食誘導而削弱，該等誘導由NOX5和ROCK1活性介導。這些發現對於將奈米顆粒和游離輻射加以組合的抗癌治療的優化開闢了新的見解。
本揭示案的第一態樣係關於一種在有需要的受試者中處理腫瘤的方法，該方法包括： a.將有效量的奈米顆粒的懸浮液投予有需要的受試者的腫瘤，該等奈米顆粒包含原子序Z高於40，較佳高於50且平均流體動力學直徑低於10nm，較佳低於5nm，例如1至5nm的元素；以及b.將包含奈米顆粒的該腫瘤暴露於有效劑量的游離輻射；其中游離輻射和奈米顆粒的組合作用誘導受照射的腫瘤細胞的衰老及/或細胞同類相食。
在具體的實施例中，該腫瘤暴露於每分劑(fraction)游離輻射至少3Gy，例如3Gy至9Gy，或5Gy至7Gy的劑量。在前一實施例的更具體的實施例中，游離輻射的總劑量以不超過10個分劑投予，例如在連續3週至8週內投予。
在一個具體實施例中，該方法還包括在治療步驟之前確定腫瘤中NOX5及/或ROCK1的表現量(expression level)或活性的步驟。通常，待治療的受試者選自具有腫瘤的受試者，其中NOX5及/或ROCK1的活性或表現量高於或至少實質上與對照值相同。
在具體的實施例中，該方法還包括在暴露於游離輻射步驟之前或同時或之後投予NOX5及/或ROCK1活性的增強劑或調節劑，以增加腫瘤中的NOX5及/或ROCK1活性的步驟。
在較佳的實施例中，游離輻射和奈米顆粒的組合作用誘導針對腫瘤細胞的由NOX5活性介導的免疫反應。
在具體的實施例中，該方法還包括在暴露於游離輻射步驟之前或同時或之後投予免疫治療劑的步驟，以便與由游離輻射和奈米顆粒的組合作用誘導的免疫反應相加或協同地進一步增強針對腫瘤細胞的免疫反應。通常，該免疫治療劑可選自免疫檢查點抑制劑，例如PD1/PDL1抑制劑、CTLA4抑制劑。
在一具體實施例中，待治療的受試者選自具有對誘導細胞凋亡的化學治療具有抗性的腫瘤的受試者。
在具體的實施例中，該方法還包括在腫瘤細胞中投予衰老誘導劑的步驟，以便與由游離輻射和奈米顆粒的組合作用誘導的衰老相加或協同地進一步增強腫瘤細胞的衰老。通常，可投予亞致死劑量的化學治療劑作為衰老誘導劑。
在上述治療的方法中，未照射的細胞可以藉由相鄰照射細胞的細胞同類相食進一步被殺死。
在具體的實施例中，與藉由游離輻射的相同暴露但在不存在奈米顆粒的情況下所誘導的衰老相比，衰老增強了至少10%、20%、30%、40%或至少50%的因子。
類似地，在具體的實施例中，與藉由游離輻射的相同暴露但在不存在奈米顆粒的情況下所誘導的細胞同類相食相比，細胞同類相食增強了至少10%、20%、30%、40%或至少50%的因子。
在具體的實施例中，暴露於游離輻射的腫瘤體積小於待治療腫瘤的總體積，例如小至少10%(以體積計)，或小至少20%(以體積計)，或小至少30%(以體積計)，或小至少40%(以體積計)，或小至少50%(以體積計)。
該方法可進一步使得能夠治療位於暴露於游離輻射的區域之外的腫瘤。
在較佳實施例中，該等游離輻射是X射線或γ射線輻射。
在較佳的實施例中，該奈米顆粒包含稀土金屬，較佳釓，作為高Z元素。例如，在照射時，腫瘤中的高Z元素(例如釓)濃度可以在0.1與10μg高Z元素g-1之間。
在進一步較佳的實施例中，該奈米顆粒包含高Z元素，例如稀土元素的螯合物。
通常，該奈米顆粒可包含：‧聚有機矽氧烷；‧與該聚有機矽氧烷共價結合的螯合物；‧由螯合物複合的高Z元素，例如稀土元素。
在前面的實施例中，該等螯合物可以有利地選自：DOTA、DTPA、DTPABA、DOTAGA。例如，稀土元素的該等螯合物是釓的螯合物，較佳地，螯合Gd3+的DOTAGA。更具體地，每個奈米顆粒的高Z元素(例如稀土元素)的比率，例如每個奈米顆粒的釓比率，可以在3與100之間，較佳在5與20之間。
在具體的實施例中，奈米顆粒可以靜脈內投予。例如，可以在受試者中靜脈內注射15mg/kg至100mg/kg之間的奈米顆粒的單劑量。
在具體的實施例中，奈米顆粒以0.1mg/l至1g/l，較佳0.1至100mg/l的濃度存在於腫瘤的照射區域中。
本發明的另一態樣係關於一種在有需要的受試者中誘導腫瘤細胞的衰老及/或細胞同類相食及/或針對該等腫瘤細胞的免疫反應的方法，該方法包括：a.將有效量的奈米顆粒的懸浮液投予有需要的受試者的腫瘤，該等奈米顆粒包含原子序Z高於50且平均直徑低於10nm，較佳低於5nm的元素；和b.將包含奈米顆粒的該腫瘤暴露於有效劑量的游離輻射；其中游離輻射和奈米顆粒的組合作用誘導受照射的腫瘤細胞的衰老及/或細胞同類相食及/或誘導針對該等腫瘤細胞的免疫反應。
本發明的另一態樣係關於一種用於上述定義的治療方法的奈米顆粒的懸浮液。特別地，本發明係關於一種奈米顆粒的懸浮液，其用於在有需要的受試者中處理腫瘤的方法，該方法包括：a.將有效量的奈米顆粒懸浮液投予有需要的受試者的腫瘤，該等奈米顆粒包含原子序Z高於40，較佳高於50且平均流體動力學直徑低於10nm，較佳低於5nm，例如介於1nm與5nm之間的元素；以及b.將包含奈米顆粒的該腫瘤暴露於有效劑量的游離輻射；其中游離輻射和奈米顆粒的組合作用誘導受照射的腫瘤細胞的衰老及/或細胞同類相食。
圖1釓基奈米顆粒(GdBN)使癌細胞對游離輻射引起的衰老敏感。(a，b)在處理48小時後，顯示在存在(或不存在)1.2mM釓基奈米顆粒(GdBN+XR)的情況下用6格雷X射線(XR)照射HCT116細胞後觀察到的SA-β-Gal活性的顯微照片和頻率(比例尺=10μm)(n=3)。(c，d)還顯示了p21的螢光顯微照片和頻率(比例尺=10μm)(n=3)。(e)顯示24小時處理後，p21表現的免疫墨點檢測。將GAPDH用作上樣對照(loading control)。免疫墨點代表3次獨立實驗。(f-h)在培養24或48小時後，分析了在1.2mM GdBN存在(或不存在)下用6格雷X-ραψσ(XR)照射的HCT116細胞的細胞週期分佈。顯示了細胞週期分析的定量資料(平均值±SEM，n=3)。(i)在存在(或不存在)1.2mM釓基奈米顆粒下用6格雷X射線(XR)照射並且在24小時後分析的p53 +/+、p53 R248W/+和p53 R248W/- HCT116細胞上的p21表現的免疫墨點檢測。將GAPDH用作上樣對照。免疫墨點代表3次獨立實驗。(j)在存在(或不存在)1.2mM 釓基奈米顆粒的情況下用6格雷X射線(XR)照射p53 +/+、p53 R248W/+和p53 R248W/- HCT116細胞後檢測到的SA-β-Gal活性的頻率(GdBN+XR)。照射後48小時進行SA-β-Gal活性的測定(平均值±SEM，n=3)。顯示了統計學顯著性。*代表p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，並且****p<0.0001。
圖2藉由共聚焦螢光顯微鏡檢測GdBN+XR引發的非細胞自主死亡方式。(a)用XR或GdBN+XR處理人類結腸癌HCT116細胞後用於檢測細胞同類相食的實驗方法。(b，c)顯示在未經處理的(綠色)CMFDA標記的HCT116細胞與在指定濃度的釓基奈米顆粒(GdBN)存在(或不存在)下用不同劑量的X-ραψσ照射的(紅色)CMTMR標記的HCT116細胞共培養24小時後，藉由共焦螢光顯微鏡檢測到的同類相食細胞的顯微照片和頻率。同類相食細胞的代表性共聚焦影像顯示在(b)中(比例尺=10μm)。同類相食細胞的頻率在(c)中(平均值±SEM，n=3)。(d)顯示在未處理(綠色)CMFDA標記的HCT116細胞與在1.2mM GdBN存在(或不存在)下用6格雷X射線(XR)或6格雷γ射線(γR)照射的(紅色)CMTMR標記的HCT116細胞共培養24小時後，藉由共聚焦螢光顯微鏡檢測到的同類相食細胞的頻率。(e)顯示R(G)、R(R)、G(R)或G(G)的同類相食細胞的頻率已確定並顯示(平均值±SEM，n=3)。(f-j)人類結腸癌HCT116細胞未經處理(對照)(f)，用1.2mM GdBN處理(g)，用6格雷X射線(XR)照射(h)在1.2mM GdBN存在下用6格雷X射線進行照射(GdBN+XR)，並在24小時後用DiOC6(3)和碘化丙啶(PI)共染色以評估細胞凋亡和壞死相關的參數。代表性的點圖顯示在(f-i)中，定量資料顯示在(j)中。(平均值±SEM，n=3)。顯示了統計學顯著性。*代表p<0.05，***p<0.001，並且****p<0.0001。
圖3 ROCK1的活化是XR-和GdBN+XR-介導的細胞同類相食所必需的。(a)顯示了在存在(或不存在)1.2mM GdBN的情況下用6格雷的X射線(XR)照射人類結腸癌HCT116細胞後檢測到的凋亡蛋白酶-3(CASP3a)的蛋白水解切割的代表性免疫墨點。處理後24小時進行免疫墨點。將GAPDH用作上樣對照(n=3)。(b)顯示了人類結腸癌HCT116細胞的MLC2或MLC2S19*的代表性免疫墨點，該等細胞在存在(或不存在)1.2mM GdBN的情況下用6格雷X射線(XR)照射，並在處理後24小時與30μM的Y27632一起在24小時內培養。將GAPDH用作上樣對照(n=3)。(c)在不存在或存在30μM的Y27632或100μM的Z-VAD-fmk(n=3)的情況下，在對照、XR-或GdBN+XR-處理的HCT116細胞的24h同型培養後藉由共聚焦顯微鏡測定同類相食細胞的百分比。(d)用靶HCT116細胞對ROCK1耗盡、對照、XR-或GdBN+XR-處理的HCT116細胞(和對照細胞)進行24小時異型培養後檢測到的同類相食細胞的百分比(平均值±SEM，n=3)。(e)在對照、XR-或GdBN+XR-處理的HCT116細胞與已經耗盡或未耗盡ROCK1的靶HCT116細胞進行24小時異型培養後檢測到的同類相食細胞的百分比(平均值±SEM，n=3)。(f)顯示對照、XR-和GdBN+XR-處理的HCT116細胞中48小時ROCK1消耗的代表性免疫墨點。將GAPDH用作上樣對照(n=3)。顯示了統計學顯著性。*代表p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，並且****或δδδδ p<0.0001。
圖4 在組合GdBN+XR處理後觀察到的同類相食細胞中的吞噬細胞降解和衰老的檢測。(a-c)顯示了在100μM的Z-VAD-fmk存在(或不存在)下對照、XR-或GdBN+XR-處理的HCT116細胞的48小時同型培養後在單細胞和同類相食細胞中檢測到的靶細胞降解(a，d)、p21表達(b，e)和SA-β-Gal+活性(a， c，f和g)的代表性顯微照片和頻率。在共培養之前，用(紅色)CMTMR探針標記處理的細胞。箭頭指示在同類相食細胞中的靶細胞降解(a)、p21表現和SA-β-Gal活性(c)(比例尺=10μm)。(d-g)中的頻率表示為平均值±SEM(n=3)。指出了統計學顯著性。*代表p<0.05，**或δδ p<0.01，***p<0.001，並且**** p<0.0001。在圖4的g中，δδ顯示XR處理的同類相食細胞和GdBN+XR處理的同類相食細胞之間的統計學顯著性。
圖5 GdBN+XR引發的衰老和細胞同類相食需要NADPH氧化酶5(NOX5)依賴性ROS產生。(a)單細胞和同類相食細胞的代表性顯微照片和頻率顯示在未處理的HCT116細胞與HCT116細胞共培養24小時後產生的ROS，所述HCT116細胞在存在(或不存在)1.2mM GdBN的情況下用6Gy的X-ραψσ照射。如(a)中藉由使用螢光顯微鏡檢測非螢光H2DCFDA探針轉換成綠色螢光DCF+探針(比例尺=10μm)來揭示ROS產生。表現出DCF+染色的單細胞和同類相食細胞的頻率在(b)中(平均值±SEM，n=3)。(c)使用免疫墨點測定用1.2mM GdBN、6Gy XR或GdBN+XR處理HCT116細胞後檢測到的10μM的MnTBAP和100μM的NAC對p21表現的影響。顯示了3個獨立實驗的代表性免疫墨點。將GAPDH用作上樣對照。(d)在特定siRNA池(pool of specific siRNAs)轉染48小時後驗證NOX5敲除。顯示了3個獨立實驗的代表性免疫墨點。將GAPDH用作上樣對照。(e-h)未經處理的HCT116細胞與在存在(或不存在)1.2mM GdBN的情況下用6Gy的X-ραψσ照射(或不照射)的HCT116細胞共培養24或48小時後檢測到的NOX5消耗對ROS產生(e)、p21表現(f)、SA-β-Gal活性(g)和細胞同類相食(h)的影響藉由螢光顯微鏡或亮場顯微鏡來測定。顯示了表現出ROS產生(DCF+)、p21表現、SA-β-Gal+ 活性和同類相食活性的單細胞及/或同類相食細胞的頻率(平均值±SEM，n=3)。(i)未經處理的HCT116細胞與在存在(或不存在)1.2mM GdBN的情況下用6Gy的X-ραψσ照射(或不照射)的p53 +/+、p53 R248W/+或p53 R248W/- HCT116細胞共培養24小時後檢測到的p53失活對細胞同類相食的影響藉由螢光顯微鏡測定。顯示了單細胞及/或同類相食細胞的頻率(平均值±SEM，n=3)。指出了統計學顯著性。*代表p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，並且**** p<0.0001。
圖6 NOX5失活對游離輻射和GdBN+XR處理介導的腫瘤抑制的影響。(a)在shControl和shNOX5 HCT116細胞上檢測到的NOX5 mRNA的相對表現。(b，c)測量並顯示用1.2mM GdBN、6Gy X射線(XR)或1.2mM GdBN和6Gy X-射線(GdBN+XR)處理或不處理的shControl HCT116細胞(b)和shNOX5 HCT116細胞(c)的腫瘤生長。
本發明係關於一種在有需要的受試者中處理腫瘤的方法，該方法包括：a.將有效量的奈米顆粒的懸浮液投予有需要的受試者的腫瘤，該等奈米顆粒包含原子序Z高於40，較佳高於50且平均流體動力學直徑低於10nm，較佳低於5nm，例如1至5nm的元素；以及b.將包含奈米顆粒的該腫瘤暴露於有效劑量的游離輻射。
如本文所用，術語「處理(treat)」或「處理(treatment)」是用於獲得有益或期望結果，包括臨床結果的方法。有益或期望的結果可包括但不限於減輕或改良一種或多種症狀或病症，減輕疾病程度，穩定(即不惡化)疾病狀態，預防疾 病傳播，延遲或減緩疾病進展，疾病的逆轉，疾病狀態的改良或緩解，以及消退(無論是部分還是全部)。特別地，關於腫瘤的處理，術語「處理」可以指抑制腫瘤生長或減小腫瘤大小。
在根據本發明的方法中使用的奈米顆粒
本發明源於發明人所證明的令人驚訝的優點，即某些奈米顆粒與游離輻射的誘導衰老及/或細胞同類相食及/或針對腫瘤細胞的免疫反應的組合作用。
本發明方法的有利效果特別與奈米顆粒的兩個較佳特徵相關。
奈米顆粒含有高Z元素以充當放射增敏劑，例如具有高於40，例如高於50的原子序Z的元素。在具體實施例中，該高Z元素選自重金屬，更佳Au、Ag、Pt、Pd、Sn、Ta、Zr、Tb、Tm、Ce、Dy、Er、Eu、La、Nd、Pr、Lu、Yb、Bi、Hf、Ho、Pm、Sm、In和Gd，以及它們的混合物。
奈米顆粒較佳具有非常小的平均流體動力學直徑。有利地選擇平均直徑例如為1nm至10nm，甚至更佳為1nm至5nm或例如1nm至5nm，通常為約3nm的奈米顆粒，其允許這些奈米顆粒在腫瘤中的優異分佈，以及快速腎臟消除(因此低毒性)。
奈米顆粒的尺寸分佈例如使用商業顆粒篩分器測量，例如基於PCS(光子相關光譜法)的Malvern Zétasizer Nano-S顆粒篩分器。該分佈的特徵在於平均流體動力學直徑。
出於本發明的目的，術語「平均流體動力學直徑」或「平均直徑」旨在表示顆粒直徑的調和平均值。用於測量該參數的方法也在標準ISO 13321：1996中描述。
在較佳的實施例中，除了包含高-Z元素之外，奈米 顆粒還包含生物相容性塗層。適用於這種生物相容性的試劑包括但不限於生物相容性聚合物，例如聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚丙烯醯胺、生物聚合物、多醣或聚矽氧烷。
奈米顆粒還可有利地用作成像劑或造影劑，例如，在影像引導的放射療法中。術語「造影劑」旨在表示在醫學成像中使用的任何產品或組合物，其目的是人為地增加對比度，使得可以相對於鄰近或非病理結構來可視化特定解剖結構(例如某些組織或器官)或病理解剖結構(例如腫瘤)。術語「成像劑」旨在表示在醫學成像中使用的任何產品或組合物，其目的是產生訊號，使得可以相對於鄰近或非病理結構來可視化特定解剖結構(例如某些組織或器官)或病理解剖結構(例如腫瘤)。造影或成像劑如何操作的原理視所使用的成像技術而定。
有利地，可以將奈米顆粒在本發明的治療方法中的用途與藉由MRI進行活體內檢測加以組合，使得能夠例如監測本發明揭示的治療處理。
較佳地，僅選擇鑭系元素，包括至少50重量%的釓(Gd)，鏑(Dy)，鑥(Lu)，鉍(Bi)或鈥(Ho)，或其混合物，例如至少50重量%的釓作為奈米顆粒中的高Z元素。
根據一個變體，將使用奈米顆粒，其中含有鑭系元素的部分在其外圍包含引起MRI訊號的鑭系元素，例如釓，並且在其中心部分包含至少一種高Z元素(例如Bi)。因此，具有非常高原子序的吸收輻射的高Z金屬可位於奈米顆粒核心的中心。
在一個特定的實施例中，可根據本發明使用的奈米顆粒的特徵在於它們包含至少一種用於T1 MRI成像的造影劑，和至少一種適用於以下成像技術之一的其他成像或造影劑：- PET或SPECT閃爍掃描術， -可見光範圍或近紅外範圍內的螢光，- X射線斷層密度測量法。
較佳地，選擇奈米顆粒使得它們的每個顆粒的弛豫率r1在50與5000mM-1.s-1之間(在37℃和1.4T下)及/或Gd重量比為至少5%，例如在5%與50%之間。
在一個具體實施例中，具有非常小的流體動力學直徑(例如1nm至10nm，較佳1nm至5nm)的該等奈米顆粒是包含高Z元素的螯合物的奈米顆粒，例如稀土元素的螯合物，並且更佳地釓或鉍的螯合物。
在可較佳與前一實施例組合的具體實施例中，該等奈米顆粒包含：‧聚有機矽氧烷，‧與該聚有機矽氧烷共價結合的螯合物，‧由螯合物複合的高Z元素。
在可較佳與前一實施例組合的一個具體實施例中，該等螯合物選自DOTA、DTPA、EDTA、EGTA、BAPTA、NOTA、DOTAGA和DTPABA，及其混合物。
在可較佳與前一實施例組合的一個具體實施例中，稀土元素的該等螯合物是釓及/或鉍的螯合物，較佳螯合Gd3+及/或Bi的DTPA或DOTAGA。
在具體和較佳的實施例中，每個奈米顆粒的高Z元素的比率，例如每個奈米顆粒的稀土元素，例如，釓(視情況地與DOTAGA螯合)的比率為3至100，較佳5至20，通常約10。
對於藉由閃爍掃描成像，奈米顆粒可另外包含可用於閃爍掃描的放射性同位素，並且其較佳地選自In、Tc、Ga、Cu、Zr、Y或Lu的放射性同位素，例如：111In、99mTc、67Ga、68Ga、 64Cu、89Zr、90Y或177Lu。
對於近紅外範圍內的螢光，奈米顆粒可另外包含選自Nd、Yb或Er的鑭系元素。
對於可見光範圍內的螢光，可以使用奈米顆粒另外包含選自Eu或Tb的鑭系元素。
對於近紅外範圍內的螢光，奈米顆粒可另外包含選自Cyanine 5.5、Cyanine 7、Alexa 680、Alexa 700、Alexa 750、Alexa 790、Bodipy的有機螢光團。
在具體的實施例中，雜合奈米顆粒(hybrid nanoparticles)是核-殼型。基於由稀土氧化物和視情況官能化的聚有機矽氧烷基質組成的核的核-殼型奈米顆粒是已知的(特別參見WO 2005/088314、WO 2009/053644)。
奈米顆粒可以進一步用分子官能化，該等分子允許將奈米顆粒靶向特定組織。該等試劑可以藉由共價偶聯來偶聯至奈米顆粒，或藉由非共價鍵合捕獲，例如藉由包封或親水/疏水相互作用或使用螯合劑。
在一個具體實施例中，使用雜合奈米顆粒，其包含：- 聚有機矽氧烷(POS)基質，包括稀土陽離子Mn+，n為2至4的整數，視情況地部分為金屬氧化物及/或羥基氧化物的形式，視情況與摻雜陽離子Dm+相關，m為2與6之間的整數，D較佳為除M以外的稀土金屬、錒系元素及/或過渡元素；- 藉由共價鍵-Si-C-與POS共價結合的螯合物；- Mn+陽離子，並且在適當情況下，Dm+陽離子被螯合物複合；在適當的情況下，靶向分子用於靶向奈米顆粒，該靶向分子被接枝到POS或螯合物上。
在核-殼型結構的情況下，POS基質形成圍繞基於 金屬陽離子的核的表面層。其厚度可以為0.5nm至10nm，並且可以佔總體積的25%至75%。
POS基質用作相對於外部介質的針對核心的保護(特別是防止水解)並且它優化造影劑的性質(例如發光)。它還允許藉由螯合劑和靶向分子的接枝來實現奈米顆粒的官能化。
有利地，螯合物選自以下產物：- 多胺基多羧酸及其衍生物的產物，甚至更佳在包括DOTA、DTPA、EDTA、EGTA、BAPTA、NOTA、DOTAGA、DTPABA及其混合物的亞組中；- 包含卟啉、氯、1,10-啡啉、聯吡啶、三聯吡啶、環胺、三氮雜環壬烷及其衍生物及其混合物的產物；及其混合物。
如果M是鑭系元素，例如Gd，螯合物有利地選自具有鑭系元素複合性質的那些螯合物，特別是複合常數log(KCl)大於15，較佳20的那些螯合物。作為鑭系元素複合螯合劑的較佳實例，可以提及包含以下單元的螯合劑：二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)，或1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)或其衍生物和1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1，戊二酸酐-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)。
另外，視預期的應用而定，奈米顆粒視情況摻雜有另一種稀土或錒系金屬陽離子，例如鑭系元素，或甚至兩種不同的鑭系元素，其中至少一種選自Eu和Tb。
「無核」超細奈米顆粒
在一個更特別較佳的實施例中，特別是由於它們非常小的尺寸和剛性結構，可以根據本發明使用的奈米顆粒藉由自上而下的合成途徑獲得，包括以下步驟：- 獲得金屬(M)氧化物核，其中M是選自稀土、錒系元素和 過渡元素的高-Z元素；- 在M氧化物核心周圍添加聚矽氧烷殼，例如藉由溶膠凝膠過程；- 將螯合劑接枝到POS殼上，使螯合劑藉由-Si-C-共價鍵與該POS殼結合，從而獲得核-殼前體奈米顆粒；及- 在水溶液中純化和轉移核-殼前體奈米顆粒；其中接枝劑的量足以在步驟d溶解金屬(M)氧化物核，並且使(M)的陽離子形式複合，從而將所得雜合奈米顆粒的平均流體動力學直徑減小至小於10nm，較佳小於5nm，例如1nm至5nm的平均直徑。
根據上述模式獲得的這些奈米顆粒不包含由至少一個塗層包封的金屬氧化物核。關於這些奈米顆粒的合成的更多細節在下一部分中給出。
這種自上而下的合成方法導致觀察到的尺寸通常在1nm與5nm之間。然後使用的術語是超細奈米顆粒。
這些「超細」或「無核」奈米顆粒視情況地接枝到靶向分子，特別是如下段所述的靶向肺組織的分子。
這些超細奈米顆粒的另一個特徵是保持物體的剛性和注射後顆粒的整體幾何形狀。這種強的三維剛性由聚矽氧烷基質提供，其中大部分矽藉由氧橋與3個或4個其他矽原子鍵合。與市售化合物(例如基於Gd-DOTA的複合物)相比，這種剛性與其小尺寸的組合使得可以增加這些奈米顆粒在中頻(20MHz至60MHz)的弛豫率，但對於存在於新一代高場MRI中的高於100MHz的頻率也是如此。
較佳地，對於20MHz的頻率，用於根據本發明的方法的奈米顆粒具有大於5mM-1.s-1(在37℃下)(Mn+離子)，較佳 10mM-1.s-1(在37℃下)(Mn+離子)的每個Mn+離子的弛豫率r1。例如，它們的每個奈米顆粒的弛豫率r1為50至5000mM-1.s-1之間。甚至更好的是，這些奈米顆粒在60MHz下所具有的每個Mn+離子的弛豫率r1大於或等於20MHz下每Mn+離子的弛豫率r1。這裡考慮的弛豫率r1是每個Mn+(例如釓)離子的弛豫率。r1由下式提取：1/T1=[1/T1]水+r1[Mn+]。
關於這些超細奈米顆粒的進一步細節，合成它們的方法及其用途描述於專利申請案WO 2011/135101中，其藉由引用併入。
獲得根據本發明使用的奈米顆粒的較佳實施例的方法
通常，熟習此項技術者將能夠容易地製備根據本發明使用的奈米顆粒。更具體地說，將注意以下要素。
對於基於鑭系元素氧化物或羥基氧化物的核心的核-殼型奈米顆粒，將使用以醇為溶劑的生產方法，如例如P.Perriat等人，J.Coll.Int.Sci,2004,273,191；O.Tillement等人，J.Am.Chem.Soc.,2007,129,5076和P.Perriat等人，J.Phys.Chem.C,2009,113,4038所描述。
對於POS基質，可以使用幾種技術，這些技術源自Stoeber首創的技術(Stoeber,W；J.Colloid Interf Sci 1968,26,62)。也可以使用用於塗覆的方法，如Louis等人(Louis等人，2005,Chemistry of Materials,17,1673-1682)或國際申請案WO 2005/088314所描述。
在實務中，超細奈米顆粒的合成例如描述於Mignot等人Chem.Eur.J.2013,19,6122-6136：通常，核/殼型前體奈米顆粒由鑭系元素氧化物核(藉由改性多元醇途徑)和聚矽氧烷殼(藉由溶膠/凝膠)形成；該物體具有例如約10nm的流體動力學直 徑(較佳5奈米)。因此，可以藉由以下出版物中描述的方法之一種在醇中生產尺寸非常小(可調節小於10nm)的鑭系元素氧化物核：P.Perriat等人，J.Coll.Int.Sci,2004,273,191；O.Tillement等人，J.Am.Chem.Soc.,2007,129,5076和P.Perriat等人，J.Phys.Chem.C,2009,113,4038。
這些核心可以根據例如以下出版物中描述的方案塗覆一層聚矽氧烷：C.Louis等人，Chem.Mat.,2005,17,1673和O.Tillement等人，J.Am.Chem.Soc.,2007,129,5076。
將對特定金屬陽離子具有特異性的螯合劑(例如用於Gd3+的DOTAGA)接枝到聚矽氧烷的表面上；也可以將其一部分插入層內，但控制聚矽氧烷的形成是複雜的，並且簡單的外部接枝在這些非常小的尺寸下產生足夠比例的接枝。
在包含適當大小的孔的膜上，藉由透析或切向過濾的方法將奈米顆粒與合成殘餘物分離。
藉由溶解破壞核心(例如藉由改變pH或藉由將複合分子引入溶液中)。然後，核心的破壞允許聚矽氧烷層的擴散(根據緩慢腐蝕或塌陷的機制)，這使得可以最終獲得具有複雜形態的聚矽氧烷物體，其特徵尺寸為大約聚矽氧烷層厚度的大小，即遠小於迄今為止產生的物體。
因此，去除核心使得可以從直徑約5奈米的粒徑減小到約3奈米的尺寸。此外，與相同尺寸但僅在表面包含M(例如釓)的理論聚矽氧烷奈米顆粒相比，該操作使得可以增加每nm3的M(例如釓)的數量。奈米顆粒尺寸的M的數量可以藉由EDX測量的M/Si原子比來評估。
靶向分子可以接枝到這些奈米顆粒上，例如藉由在奈米顆粒的有機成分上的肽鍵合來偶聯，如Montalbetti, C.A.G.N,Falque B.Tetrahedron 2005,61,10827-10852所描述。
也可以使用「點擊化學」的偶聯方法，Jewett,J.C.；Bertozzi,C.R.Chem.Soc.Rev.2010,39,1272-1279，並且涉及以下類型的基團：-N3、-CN或-C-CH，或下列基團之一：
在一個具體實施例中，根據本發明的奈米顆粒包含具有酸功能的螯合劑，例如DOTA或DOTAGA。例如，在適當量的靶向分子存在下，使用EDC/NHS(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀醯亞胺)活化奈米顆粒的酸功能。然後將接枝的奈米顆粒純化，例如藉由切向過濾。
待治療的受試者
根據本發明的方法旨在治療患者的腫瘤，例如人類患者的腫瘤。
本文使用的術語「患者」和「受試者」可互換地指動物界的任何成員，較佳哺乳動物或人類，包括例如患有腫瘤的受試者。
在具體的實施例中，治療方法涉及惡性實體腫瘤的治療，特別是腦腫瘤(原發性和繼發性，神經膠質母細胞瘤)、骨盆腔惡性腫瘤(宮頸癌、前列腺癌、直腸癌和結腸直腸癌)、肝癌(原發性和繼發性)、頭頸癌、肺癌、食道癌、乳癌、胰臟癌。
本案發明人已經確定，藉由奈米顆粒和游離輻射的組合作用有利地誘導細胞同類相食及/或衰老是由NOX5及/或ROCK1活性介導的。實際上，當在測試的癌細胞系中活體外抑制NOX5及/或ROCK1活性時，未觀察到細胞同類相食及/或衰老的誘導。
因此，可以從具有高表現量的NOX5及/或ROCK1活性的腫瘤的患者中有利地選擇需要這種治療的患者。預測那些患者是對於將奈米顆粒和游離輻射加以組合的治療的良好反應者，以便誘導針對待治療的腫瘤細胞的衰老及/或細胞同類相食。
如本文所用，術語「NOX5」是指NADPH氧化酶5，較佳人類NOX5，其產生超氧化物。Nox5與c-abl相互作用，超氧化物的產生導致c-abl的磷酸化，而c-abl激酶活性的抑制抑制Nox5超氧化物的產生。NOX5具有由UniProtKB中的參考Q96PH1所鑒定的蛋白質序列。
如本文所用，術語「ROCK1」是指含有Rho相關的捲曲螺旋的蛋白激酶1，其是蛋白質絲胺酸/蘇胺酸激酶，其在與GTP結合形式的Rho結合時被活化。ROCK1具有由UniProtKB中的參考Q13464鑒定的蛋白質序列。
當提及「NOX5或ROCK1的表現量或活性」時，在本文中涉及基因的表現量(例如mRNA表現)及/或相應的蛋白質表現及/或相應的蛋白質活性(酶促活性)。
因此，在一個較佳的實施例中，治療方法包括確定NOX5及/或ROCK1的表現量或活性的步驟。預測患者是本發明治療的良好反應者，例如當患者腫瘤中的NOX5及/或ROCK1的表現量或活性實質上等於或高於對照值時。
如本文所用，較高的表現量或活性意指與對照值相比這種表現量或活性的統計學顯著增加，較佳地，至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%對照值增加。
如本文所用，術語「良好反應者」是指與具有對應於例如對照值的NOX5及/或ROCK1的表現量或活性的患者相比，患者可能受益於對治療的更好反應。
因此，本發明的方法包括以下步驟：(a)在從該患者的腫瘤獲得的活組織檢查或腫瘤細胞中確定作為預測性生物標誌物的NOX5及/或ROCK1的表現；以及(b)將獲得的表現值與相應的對照值進行比較。
該對照值可以是例如反應者患者及/或低反應者患者的相應腫瘤中NOX5及/或ROCK1表現的標準化(相對)平均值的平均值。
該對照值還可以藉由常規實驗確定，這視用於本發明方法的定量方法和預測性生物標誌物而定。
例如，該對照值對應於對於低反應者患者觀察到的表現量值，並且當表現量值在統計學上高於對照值時，預測患者是反應者。
或者，該對照值對應於對於反應者患者觀察到的表現量值，並且當表現量值在統計學上與對照值(閾值)不同或甚至更高時，預測患者是反應者。
或者，該對照值對應於在患者的非腫瘤組織中觀察到的NOX5及/或ROCK1表現的標準化(相對)平均值的平均值。
比較步驟可以手動或電腦輔助進行。
預測性生物標誌物NOX5及/或ROCK1的表現可以藉由確定受試者腫瘤的生物樣品中此類預測性生物標誌物的基 因或蛋白質表現來定量。量化可以是相對的(藉由將生物標誌物的量與例如具有已知量的生物標誌物的對照進行比較並且檢測與該對照相比的「更高」或「更低」量)或更準確，至少確定相對於已知對照量的具體量。
術語「核酸」和「多核苷酸」可互換使用，是指任何長度的核苷酸的聚合形式，即去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結構並且可以執行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段、外顯子、信使RNA(mRNA)、cDNA、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引子。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。若存在，對核苷酸結構之修飾可在聚合物組裝之前或之後賦予。核苷酸之序列可藉由非核苷酸組分間斷。多核苷酸可在聚合之後進一步經修飾，諸如藉由與標記組分結合。該術語還指雙鏈和單鏈的分子。除非另有說明或要求，否則作為多核苷酸的本發明的任何實施例包括雙鏈形式和已知或預測構成雙鏈形式的兩種互補單鏈形式中的每一種。
「基因」是指含有至少一個開放閱讀框(open reading frame；ORF)的多核苷酸，其能夠在轉錄和轉譯後編碼特定的多肽或蛋白質。多核苷酸序列可用於鑒定與它們相關的基因的較大片段或全長編碼序列。分離較大片段序列的方法是熟習此項技術者已知的。「基因表現」、「基因產物」或「表現」在本文中可互換使用，指基因轉錄和轉譯時產生的核酸或胺基酸(例如，肽或多肽)，生物標誌物的cDNA或RNA序列；生物標誌物基因表現，生物標誌物蛋白質表現，生物標誌物mRNA表現；生物標誌物蛋白質的功能效應，生物標誌物基因的功能效 應，cDNA或mRNA，蛋白質，cDNA，基因或mRNA活性。
在一個具體實施例中，「表現量」、「基因表現」、「基因產物」或「表現」表示mRNA表現、cDNA表現、蛋白質轉錄和蛋白質表現。
術語「多肽」可與術語「蛋白質」互換使用，並且在其最廣泛的意義上，是指兩個或更多個次單位胺基酸的化合物。次單位可以藉由肽鍵連接。
此類定量方法可替代地包括檢測和定量該預測性生物標誌物的相應基因表現量，其包括該預測性生物標誌物的相應mRNA的定量，例如藉由進行即時定量PCR，以及藉由使用DNA微陣列，即在限定位置結合核酸的基材，該等核酸與對應於該預測生物標誌物的擴增mRNA的cDNA特異性雜交。
通常，在具體實施例中，對從患者的生物樣品中獲得的經轉錄多核苷酸(mRNA)的混合物進行逆轉錄和定量擴增。該cDNA或mRNA可以藉由活體外技術或藉由與DNA微陣列的嚴格雜交或Northern墨點來檢測。
在任何情況下，這些檢測和定量測定的一般原理涉及在適當的條件下並且歷經一定的時間來製備可含有預測性生物標誌物和探針的樣品或反應混合物，該時間足以使預測性生物標誌物和探針相互作用並結合，因此形成可在反應混合物中檢測(和量化)的複合物。
生物標誌物的這些檢測及/或定量測定可以以多種方式進行。對於特定測定及其組成部分的適當條件是熟習此項技術者公知的。
在一具體實施例中，可以使用在此項技術中已知的方法藉由活體外形式來確定生物樣品中的預測性生物標誌物 mRNA的量(level)。
具體方法包括但不限於PCR、RT-PCR、RT-qPCR或Northern墨點。
還可以藉由檢查至少一種預測性生物標誌物的蛋白質表現或蛋白質產物來確定生物標誌物的表現量。確定蛋白質量涉及測量在從患者獲得的樣品中選擇性識別和結合生物標誌物的多肽的抗體之間發生的任何免疫特異性結合的量，並將其與對照樣品中的至少一種生物標誌物的免疫特異性結合的量進行比較。與對照表現相比，生物標誌物的蛋白質表現量可以增加或減少。
在此項技術中已知多種方法用於檢測此類生物樣品中的蛋白質表現量，包括各種免疫測定方法。它們包括但不限於放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、「三明治」免疫測定、免疫放射測定、原位免疫測定(使用例如膠體金、酶或放射性同位素標記)、西方墨點分析、免疫沉澱測定、免疫螢光測定、流式細胞術、免疫組織化學、共聚焦顯微鏡、酶測定、表面電漿共振和PAGE-SDS。NOX5或ROCK1 elisa套組可商購獲得。
或者，可以使用適當的酶測定法測量NOX1及/或ROCK1活性的酶活性作為預測性生物標誌物。例如可從PROMEGA(ADP-GloTM Kinase Assay)獲得rock1激酶測定法。
將奈米顆粒投予待治療的受試者
本發明的方法包括將有效量的奈米顆粒的懸浮液投予受試者腫瘤的步驟。
奈米顆粒可以使用不同的可能途徑投予受試者，例如局部(腫瘤內(IT)、動脈內(IA))、皮下、靜脈內(IV)、皮內、 氣道(吸入)、腹膜內、肌肉內、顱內、眼內或口腔途徑。
在具體的實施例中，靜脈內投予奈米顆粒，並且藉由被動靶向，例如藉由增強的滲透性和保留效應，有利地將奈米顆粒靶向輸送至腫瘤。
適當時，可以進行奈米顆粒的重複注射或投予。
在一個實施例中，向患者投予一定量的奈米顆粒，使得在腫瘤照射的時間下，腫瘤中的高Z元素(例如釓)濃度在0.1和10μg高Z元素g-1之間。
在一具體實施例中，在受試者中靜脈內注射15mg/kg至100mg/kg之間的奈米顆粒(例如具有釓螯合物的無核超細奈米顆粒)的單劑量。
在一具體實施例中，將奈米顆粒投予患者的腫瘤，使得奈米顆粒以0.1mg/l至1g/l之間，較佳0.1至100mg/l之間的濃度存在於腫瘤的照射區域中。
由於誘導衰老及/或細胞同類相食的作用是由NOX5及/或ROCK1活性介導的，因此向患者進一步投予NOX5及/或ROCK1活性的增強劑或調節劑可能是有利的。
因此，在治療的方法的一具體實施例中，治療的方法還包括在暴露於游離輻射的步驟之前或同時或之後投予NOX5及/或ROCK1活性的增強劑或調節劑的步驟。
如本文所用，NOX5及/或ROCK1活性的增強劑是指可以在活體內(例如，在患者的腫瘤組織中)增加NOX5及/或ROCK1活性的化合物或藥物或化合物或藥物的組合。這種增強劑可以是NOX5的氧化酶活性或ROCK1的激酶活性的直接活化劑或間接增強劑，其分別作用於NOX5或ROCK1的訊號傳導途徑的下游。
這種NOX5增強劑的實例包括順鉑、鈣離子內流(calcium influx)、佛波醇肉豆蔻酸乙酸鹽(phorbol myristate acetate)、血管收縮素II和內皮素-1。
如本文所用，NOX5及/或ROCK1活性的調節劑是指可以在活體內例如，在患者的腫瘤組織中增加、降低或消除NOX5及/或ROCK1活性的化合物或藥物或化合物或藥物的組合。這種調節劑可以是NOX5的氧化酶活性或ROCK1的激酶活性的直接活化劑或抑制劑或間接增強劑或抑制劑，分別作用於NOX5或ROCK1的訊號傳導途徑的下游。
本案發明人進一步發現，游離輻射和奈米顆粒的組合效應可以誘導針對腫瘤細胞的由NOX5活性介導的免疫反應。這種反應可以針對受照射的腫瘤的細胞，或針對患者體內的其他腫瘤細胞。
因此，例如藉由將治療方法與免疫治療相結合，增加這種免疫反應可能是有利的。因此，在一具體實施例中，本發明的方法還包括在暴露於游離輻射的步驟之前或同時或之後投予免疫治療劑的步驟，以便與由游離輻射和奈米顆粒的組合作用誘導的免疫反應相加或協同地進一步增強免疫反應。
通常，該免疫治療藥物選自免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點抑制劑在例如Parldoll DM Nat Rev Cancer 12(2012)：252-264和Herrera FG等人CA Cancer J Clin.67(2017)：65-85.doi：10.3322/caac.21358中描述。這些包括例如PD1/PDL1抑制劑，CTLA4抑制劑，更具體地，抗PD1或抗PDL1抗體及/或抗CTLA4抗體。
本案發明人的主要發現之一是奈米顆粒和游離輻射的組合效應藉由與細胞凋亡無關的機制(非細胞自主細胞死 亡機制)誘導腫瘤的細胞死亡。因此，本發明的處理方法可以更特別地適用於處理已經證明對誘導腫瘤細胞的細胞凋亡的常規化學處理具有抗性的腫瘤。這種通常的化學治療方法尤其包括順鉑和衍生物、5-氟尿嘧啶、紫杉烷類和EGFr抑制劑。
本發明的治療方法還可包括投予衰老誘導劑的步驟。這種衰老誘導劑可以有利地與游離輻射和奈米顆粒的組合效應誘導的衰老相加或協同地增強衰老。在具體的實施例中，該衰老誘導劑選自已知誘導衰老的化學治療劑，包括但不限於： 放線菌素、全反式維甲酸、阿紮胞苷、硫唑嘌呤、博來黴素、硼替佐米、卡鉑、卡培他濱、順鉑、苯丁酸氮芥、環磷醯胺、阿糖胞苷、柔紅黴素、多西紫杉醇、多西氟尿苷、多柔比星、表柔比星、埃坡黴素、依託泊苷、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、達魯賓、伊馬替尼、伊立替康、氮芥、巰基嘌呤、甲胺蝶呤、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鳥嘌呤、托泊替康、戊柔比星、維莫非尼、長春鹼、長春新鹼、長春地辛。
將腫瘤暴露於游離輻射
本文所述的奈米顆粒將用於治療腫瘤，其中放射療法是經典治療或者是最合適的治療或可以是必需的。
放射治療或放療是在醫學上使用輻射，例如，游離輻射作為控制惡性細胞的癌症治療的一部分。它用作姑息處理或治療處理。放射療法被認為是處理各種癌症類型的重要標準療法。
如本文所用，術語「放射療法」用於藉由對應於游離輻射的照射來治療腫瘤性疾病。游離輻射沉積能量藉由破壞所治療區域(靶組織)的細胞的遺傳物質來損傷或破壞該等細 胞，使得這些細胞不能繼續生長。
在具體的實施例中，本發明的方法包括將包含奈米顆粒的腫瘤暴露於有效劑量的游離輻射，其中該等游離輻射是光子，例如X射線。視它們所具有的能量而定，這些射線可用於破壞體內表面或更深處的癌細胞。X射線束的能量愈高，X射線可以愈深地進入靶組織。線性加速器和貝他加速器產生能量越來越大的X射線。使用機器將輻射(例如X射線)聚焦在癌症部位上稱為外部束放射療法。
在根據本發明的治療方法的替代實施例中，使用伽瑪射線。伽瑪射線是自發產生的，因為某些元素(如鐳、鈾和鈷60)在分解或衰變時會釋放出輻射。
游離輻射通常為2keV至25000keV，特別是2keV至6000keV(即6MeV)或2keV至1500keV(例如鈷60源)。
放射治療領域的普通熟習此項技術者知道如何根據疾病的性質和患者的體質確定合適的劑量和應用方案。特別地，此項技術者知道如何評估劑量限制性毒性(dose-limiting toxicity；DLT)以及如何相應地確定最大耐受劑量(maximum tolerated dose；MTD)。
光子輻射治療中使用的輻射量以格雷(Gy)測量，並且根據所治療的癌症的類型和階段而變化。對於治癒性病例，實體上皮腫瘤的典型劑量範圍為60Gy至80Gy。放射腫瘤學家在選擇劑量時考慮了許多其他因素，包括患者是否正在接受化療、患者合併症、是否在手術前或手術後進行放射治療、以及手術成功的程度。
總劑量通常是分次的(隨時間推移展開)。對於任何疾病/解剖部位/疾病階段患者環境/年齡，定義數量和時程(游離 輻射的計劃和遞送、分劑量、分劑遞送方案、單獨或與其他抗癌劑組合的總劑量等)並且構成任何特定情況的護理標準。
用於成人的典型常規分次方案可以是每天1.8Gy至2Gy，每週五天，例如連續5週至8週。
考慮到用高劑量游離輻射獲得的根據本發明方法的奈米顆粒和游離輻射的組合效果，在一個具體實施例中，暴露於患者腫瘤的游離輻射劑量有利地被低次分割。例如，每分劑至少3Gy，例如3Gy至9Gy之間，或5Gy至7Gy之間的劑量暴露於患者的腫瘤，並且輻射總劑量以幾個分劑遞送(通常，但是不一定不超過10個分劑)。
本案發明人已經確定，使用奈米顆粒和放射療法的組合治療能夠對未經照射的腫瘤細胞產生作用，特別是藉由對這些細胞誘導細胞衰老、細胞同類相食及/或免疫反應。
因此，根據有利效果，與藉由游離輻射的相同暴露度但在不存在奈米顆粒的情況下所誘導的衰老相比，處理通常能夠使衰老增強至少10%、20%、30%、40%或至少50%的因子。
因此，根據有利效果，與藉由游離輻射的相同暴露度但在不存在奈米顆粒的情況下所誘導的細胞同類相食相比，處理通常還可以使細胞同類相食增強至少10%、20%、30%、40%或至少50%的因子。
因此，在一個實施例中，暴露於游離輻射的腫瘤體積小於待治療的總體積，例如至少10%、20%、30%、40%或至少50%(以體積計)。
另外，在某些實施例中，該方法能夠治療位於暴露於游離輻射的區域之外的腫瘤。
在第一次放射治療前例如5分鐘、15分鐘、30分鐘、 45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時，奈米顆粒可以投予給患有待處理的腫瘤的受試者。
在以下實例中，本發明方法的其它態樣和優點將變得顯而易見，這些實例僅出於說明的目的給出。
實例
材料及方法
細胞、試劑和釓基奈米顆粒
結腸直腸癌(p53+/+、p53R248W/+和p53R248/-)HCT116細胞維持在McCoy的5A培養基(Life Technology)中，該培養基補充有10%熱滅活的胎牛血清(Hycultec GmbH)、2mM L-麩醯胺酸和100IU/mL青黴素-鏈黴素(Life technology)。從Christophe Bourdon博士獲得人類結腸癌突變體HCT116 p53 R248W/-、p53 R248W/+和HCT116 p53 +/+。苄氧基羧基-Val-Ala-Asp(OMe)氟甲基酮(Z-VAD-fmk)得自Bachem。ROCK1抑制劑(Y27632)和N-乙醯半胱胺酸(NAC)來自Sigma並且錳(III)-肆(4-苯甲酸)卟啉(MnTBAP)來自Merck chemicals。釓基奈米顆粒(GdBN)獲自NH TherAguix。
RNA介導的干擾
對於ROCK1具有特異性的小干擾RNA(siRNA)(siRNA-1 ROCK1：5’ GCC GCC GGG ACC CAA CUA U 3’；siRNA-2 ROCK1：5’ GGA AUC CAG UUG AAU ACA A 3’)和對照siRNA(siRNA-1 Co.：5’ GCC GGU AUG CCG GUU AAG U 3’)獲自Sigma。SMARTpool siGENOME NOX5 siRNA(siRNA NOX5)(D-010195-05)含有4種siRNA(siRNA-1：5’ GGA GCA AGG UGU UCC AGA A 3’；siRNA-2：5’ CUA UAG ACC UGG UGA CUA C 3’；siRNA-3：5’ GCU UAU GGG CUA CGU GGU A 3’和siRNA-4：5’ CCU UCU UUG CAG AGC GAU U 3’)。對照siGENOME非靶向siRNA(表示為siRNA-2 Co.)是四種靶向加上非靶向siRNA(D-001206-13-05)池。SMARTpool siGENOME NOX5 siRNA和siGENOME非靶向siRNA池# 1購自Dharmacon。對於RNA干擾，在siRNA轉染前48小時接種HCT116細胞(在6孔板中5.0×105個細胞/2mL/孔)。然後，根據製造商的說明，使用Lipofectamine RNAi max(# 13778150，Life technologies)用10nM siRNA轉染細胞，並在隨後的實驗之前在37℃培養24小時。
放射
將HCT116細胞接種在6孔板中，並在37℃下在指定濃度的GdBN下培養1小時。然後，用X射線照射器(1Gy/min，200keV，15mA，2mm銅厚度，X-RAD 320，Precision X-Ray)或γ射線照射器(IBL-637，Cs137，1Gy/min，gamma CIS-BioInternational，IBA，Saclay，France)照射細胞。在照射後的指定時間點收穫細胞用於後續實驗。
免疫螢光和流式細胞術
如先前所述確定細胞同類相食13。簡而言之，用10μM的5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲醯基)胺基)四甲基羅丹明(Cell Tracker Orange CMTMR，Invitrogen)將處理的細胞染色，並用10μM的5-氯甲基螢光素二乙酸酯(Cell tracker Green CMFDA，Invitrogen)將未處理的細胞染色。然後在ROCK的藥理學抑制劑Y27632(30μM，TOCRIS)或泛凋亡蛋白酶抑制劑zVAD-fmk(100μM，Calbiochem)存在下共培養細胞指定的時間。對於單細胞和同類相食細胞上細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的特異性亞細胞染色，將細胞在4%多聚甲醛/磷酸鹽緩衝鹽水 (phosphate-buffered saline；PBS)中固定10分鐘，在PBS中的0.3%Triton X-100(Sigma)中透化，並用5% FCS-PBS培養1小時。將針對人類p21的兔抗體(來自Cell Signaling Technology，# 2947)用於含有1mg/ml BSA的PBS中的免疫檢測，並用來自Invitrogen的Alexa 488螢光染料共軛的山羊抗兔IgG顯示。用Hoechst 33342(Invitrogen)對細胞進行複染色，並在Zeiss LSM510上藉由螢光共聚焦顯微鏡分析或使用63×物鏡在LEICA DMi8上藉由螢光顯微鏡分析。為了藉由流式細胞術檢測細胞死亡的誘導，在37℃和5%CO2下將細胞用3,3’-二己氧基羰花青，40nM的DiOC6(3)和2μg/mL的碘化丙啶(Invitrogen，Molecular probes，OR，USA)染色30分鐘。在Guava EasyCyte(Millipore EMD)上進行細胞螢光測定，並藉由Incyte軟體(Millipore)分析資料。用10μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen)評估細胞週期分佈，如前所述14。使用LSR IITM流式細胞儀(Becton-Dickinson)定量細胞螢光。用Kaluza軟體1.5版分析螢光直方圖。
檢測衰老相關的β-半乳糖苷酶
在指定的時間，將細胞固定並使用衰老β-半乳糖苷酶染色套組(Cell signaling technologies)染色，如前所述13。
免疫墨點
在裂解緩衝液(0.1% NP40；200mM HEPES；100mM KCl；1mM EDTA；1%甘油終濃度)中製備總細胞裂解物，該緩衝液補充有蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液(不含EDTA的抑制劑，Roche-diagnostics,Meylan,France)。使用Bradford測定法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)定量蛋白質提取物。將蛋白質提取物(20-40μg)置於4-12%NuPAGE Bis-tris凝膠(Invitrogen)上，並在4℃下轉移到硝酸纖維素膜上。封閉後，根 據製造商的說明將膜在4℃下與一抗培養過夜：p21WAF1/CIP1(Cell signaling #2947)；NOX-5(Abcam #191010)；裂解凋亡蛋白酶-3(Cell signaling #9664)；MLC2S19*(Cell signaling #3671)或MLC2(Cell signaling #8505)。然後將辣根過氧化物酶共軛的山羊抗小鼠或抗兔(Southern Biotechnology)抗體培養1小時，並使用直接化學發光影像掃描(G：BOX Syngene)用增強的化學發光初免檢測(Amersham，GE-Healthcare)顯示。將GAPDH(#MAB374,EMD Millipore)用作上樣對照。
檢測ROS產生。
將細胞接種在蓋玻片皿(World Precision Instruments)上。根據製造商的說明書(Invitrogen)，使用螢光探針(2,7-二氯氫-螢光素二乙酸酯(H2DCFDA))評估細胞內ROS量。用Hoechst 33342(Invitrogen)對細胞進行複染色，並藉由螢光顯微鏡(Leica DMi8，使用63x物鏡)進行分析。
RNA干擾。
使用在GIPZ慢病毒載體中表達的針對NOX5基因的三種特異性小髮夾RNA(shRNA)池，進行NOX5緘默的HCT116選殖。對於NOX5具有特異性的shRNA(sh1NOX5(純系ID,V3LHS 353964：5’ CTTGGACACCTTCGATCCA3’；sh2NOX5(純系ID,V2LHS 136069)：5’ TAGAACACCTCAAAGTGGC3’；sh3NOX5(純系ID,V2LHS 136068)：5’ ACAAAGTTCACAGTGTGAG3’)和對照shRNA(shControl：5' GCCGGUAUGCCGGUUAAGU3')購自Dharmacon。使用非緘默GIPZ對照慢病毒載體(純系ID：RHS4346，Dharmacon)進行對照選殖。
定量即時RT-PCR
為了檢測NOX5 mRNA，我們使用預先設計的Applied Biosystems探針檢測NOX 5基因(Hs00225846_m1)和GAPDH(Hs02758991_g1)(用於標準化)。這些探針包含在從Applied Biosystems獲得的預製TaqMan Gene表現混合物中。用循環閾值法(CT)分析結果，並將每個樣品相對於內源性GAPDH mRNA的量來標準化。
免疫缺陷小鼠中的腫瘤生長
已經耗盡(shNOX5)或未耗盡(shControl)NOX5的人類結腸直腸HCT116細胞用1.2mM GdBN在37℃下預處理1小時，並用單劑量的6Gy X射線(XR)照射。然後，將2.5×106個shControl或shNOX5 HCT116細胞植入6週齡的瑞士裸鼠(Charles River Laboratories)中，並以時間依賴性方式監測腫瘤生長。實驗不是隨機的，按照歐盟指令63/2010進行，並由Gustave Roussy Cancer Campus的倫理委員會批准(CEEA IRCIV/IGR n°26)。
統計學分析
沒有統計方法用於預先確定樣本量。使用單向ANOVA測試確定統計學顯著性。圖例中報告了統計上顯著的值。所有實驗獨立進行至少三次。資料表示為平均值±SEM。使用GraphPad Prism版本6.0b(GraphPad軟體)進行統計分析。
結果
釓基奈米顆粒與游離輻射的組合誘導細胞衰老
正如我們之前報道的那樣13,14，游離輻射後，藉由可能同時誘導細胞衰老的不同致死方式(包括NCAD或CAD死亡)，癌細胞被消除。為了確定在釓基奈米顆粒存在下癌細胞照射的生物效應，我們首先分析了這種處理誘導癌細胞衰老的能力。因此，在1小時內用1.2mM釓基奈米顆粒(GdBN)預處理人 類結腸直腸HCT116細胞，然後用單劑量的6Gy X射線(XR)照射。2天後，分析所處理的HCT116細胞的細胞質衰老相關的β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性，細胞週期蛋白依賴性激酶抑制蛋白p21的表現和細胞週期進展。與對照相比，我們檢測到用XR處理HCT116細胞後SA-β-Gal+細胞的頻率顯著增加，並且還特別關注GdBN+XR的組合顯著增加用XR處理後檢測到的SA-β-Gal+細胞的數量(圖1a和圖1b)。藉由螢光顯微鏡(圖1c和圖1d)和蛋白質墨點(圖1e)檢測p21表現的增加的這些結果證明含釓顆粒與游離輻射的組合使癌細胞對XR後誘導衰老變得敏感。同時，我們還使用流式細胞術分析了單獨或與1.2mM GdBN組合用6Gy照射，並在24小時和48小時內培養的HCT116細胞的細胞週期分佈。與對照HCT116細胞相比，在培養24小時後檢測到已用單獨的XR或用GdBN+XR處理的HCT116細胞的G2/M期的顯著積累，但是在培養48小時後未檢測到(圖1f至圖1h)。這些結果與我們在XR與GdBN結合後檢測到的p21表現的顯著增加一致(圖1d和圖1e)。考慮到轉錄因子p53可能藉由控制p21表現而在誘導細胞衰老期間引起延長的G2停滯15,16，關於p53為野生型(p53 +/+)、突變或/和轉錄失活(p53 R248W/+或p53 R248W/-)的HCT116細胞已經用單獨或與1.2mM GdBN組合的6Gy照射，並在48小時後分析p21表達和SA-β-Gal活性。正如預測的那樣，我們觀察到XR和GdBN+XR處理後p21表現(圖1f)和SA-β-Gal活性(圖1g)顯著降低，表明XR或XR+GdBN誘導的細胞衰老都需要p53的轉錄活性。總之，這些結果表明，在含有釓的奈米顆粒存在下照射癌細胞有利於藉由誘導細胞衰老來消除受照射的癌細胞。
釓基奈米顆粒有利於受照射的癌細胞的細胞同類相食
為了進一步鑒定由GdBN和XR組合治療癌細胞誘 導的致死過程，我們確定了這種治療誘導細胞自主和非細胞自主死亡的能力。在這種情況下，如前所述13,14，我們首先在已用5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲醯基)胺基)四甲基羅丹明(CMTMR，紅色)螢光生命探針標記的未處理的HCT116細胞和用5-氯甲基螢光素二乙酸酯(CMFDA，綠色)螢光生命探針標記的同基因HCT116細胞之間進行共培養，並在指定濃度的GdBN存在(或不存在)下用不同劑量照射。共培養24小時後，針對細胞吞噬分析CMFDA+細胞和CMTMR+細胞的細胞命運。共聚焦分析顯示，在照射的(XR)或GdBN+XR處理的CMTMR+ HCT116細胞與未處理的CMFDA+ HCT116細胞的共培養期間(圖2b)，檢測到細胞吞噬。該過程以劑量依賴性方式發生(圖2c)，並且當用γ-輻射來照射癌細胞時也觀察到(圖2d)。為了進一步表徵細胞吞噬中涉及的生物學機制，我們研究了這些治療誘導細胞入侵或細胞同類相食機制的能力。使用螢光顯微鏡，我們觀察到經照射的(XR)和GdBN+XR處理的CMTMR+ HCT116細胞內化鄰近(CMFDA+或CMTMR+)HCT116細胞，而與它們接受的處理無關(圖2e)。我們注意到與受照射細胞相比，GdBN+XR處理細胞的同類相食活性顯著增加，揭示了GdBN和XR組合治療癌細胞增加了受照射細胞表現出同類相食活性的能力。與這些實驗並行地，我們還評估了受照射細胞同時經歷其他CAD形式(例如細胞凋亡和壞死)的能力。藉由分析經處理細胞的線粒體膜和質膜透化(藉由流式細胞儀同時檢測碘化3,3'-二己氧基羰花青素和碘化丙錠(DiOC6(3)/IP)染色)，我們觀察到我們檢測到的反應於XR或GdBN+XR處理的細胞同類相食是在沒有顯著誘導細胞凋亡或壞死的情況下誘導的(圖2f至圖2j)。總之，這些結果強調了這樣的事實：在用含釓奈米顆粒處理癌細胞後，可以增強被照射細 胞的細胞同類相食。
在GdBN+XR處理後檢測到的活細胞吞噬需要活化ROCK1激酶
為了精確確定我們在上文描述的細胞同類相食中涉及的分子機制，我們隨後研究了與鄰近癌細胞的活細胞吞噬相關的訊號傳導途徑。我們首先發現在XR或GdBN+XR處理後觀察到的細胞吞噬是在沒有細胞死亡誘導的情況下發生的(由XR或GdBN+XR處理後沒有促細胞凋亡裂解凋亡蛋白酶-3所揭示(圖3a))並且沒有被泛凋亡蛋白酶抑制劑Z-VAD-fmk抑制(圖3c)，表明該過程不依賴於垂死細胞的細胞凋亡吸收並且允許活癌細胞的內化。此外，我們發現用GdBN、XR或GdBN和XR組合治療HCT116細胞可活化激酶ROCK1(如在絲胺酸19(MLC2S19*)上肌球蛋白輕鏈2的磷酸化顯示)(圖3b)。我們觀察到在存在或不存在GdBN的情況下癌細胞照射後MLC2S19*的磷酸化顯著增加(圖3c)，表明在GdBN+XR處理後檢測到的鄰近癌細胞的吞噬可能需要ROCK1的活化。為了確定在XR-或GdBN+XR介導的細胞吞噬過程中ROCK-1依賴性訊號傳導途徑的貢獻，我們然後將ROCK1的藥理學抑制劑(Y27632)添加到在存在(或不存在)1.2mM GdBN時用6Gy照射的HCT116細胞的共培養物中，確定共培養24小時後細胞同類相食的頻率。我們觀察到Y27632對ROCK1的藥理學抑制作用(如圖3b所示)抑制單獨6Gy照射後和在1.2mM GdBN存在下照射HCT116細胞後檢測到的細胞同類相食(圖3c)，揭示了在XR或GdBN+XR處理後檢測到的細胞同類相食需要ROCK1的生物活性。然後，我們藉由在被吞噬(靶)細胞或吞噬(同類相食)細胞上用兩種特異性小干擾RNA(siRNA)耗盡ROCK1來更好地定義激酶ROCK1對GdBN+XR誘發的細胞同類 相食的貢獻。我們觀察到在兩種相互作用細胞上的ROCK1的消耗降低了XR或GdBN+XR處理後檢測到的細胞同類相食的頻率(圖3d和圖3e)，表明在誘導GdBN+XR介導的細胞同類相食期間，激酶ROCK1在被吞噬靶細胞和吞噬同類相食細胞中起重要作用。
被吞噬細胞的降解與同類相食細胞的衰老正相關
為了確定在XR或GdBN+XR處理後檢測到的被吞噬細胞和同類相食細胞的命運，我們藉由螢光顯微鏡檢測，在測定在1.2mM GdBN存在(或不存在)下用6Gy照射的HCT116細胞共培養24小時後觀察到的被吞噬HCT116細胞核中存在染色質濃縮和核碎裂。我們觀察到在單獨照射後或在GdBN存在下照射癌細胞後檢測到的所有被吞噬細胞都表現出靶細胞降解的跡象(圖4a和圖4d)。有趣的是，我們證明泛凋亡蛋白酶抑制劑Z-VAD-fmk未能抑制靶細胞降解(圖4d)，表明凋亡蛋白酶的活化不是執行X射線輻射或其與GdBN的組合誘發的細胞同類相食所必需的。此外，我們還發現XR或GdBN+XR誘發的同類相食細胞表現出p21表現(圖4b和圖4e)和SA-β-Gal+活性(圖4c和圖4f)的增加，表明在XR-或GdBN+XR處理之後，同類相食細胞可能經歷衰老，或者可選地，單個衰老細胞可以內化相鄰細胞。為了確定衰老的誘導或衰老細胞的同類相食活性是否與XR或GdBN+XR處理後檢測到的同類相食活性相關，我們確定了在XR或GdBN+XR處理後顯示SA-β-Gal+活性的單細胞和同類相食細胞的頻率。我們觀察到絕大多數SA-β-Gal+細胞是單細胞(圖4g)，這表明細胞同類相食似乎在誘導用XR或GdBN+XR處理的癌細胞的細胞自發衰老後發生。
GdBN+XR介導的衰老和細胞同類相食受NADPH氧化酶 5(NOX5)依賴性ROS產生的控制
考慮到活性含氧物(ROS)產生是游離輻射後誘導衰老所涉及的主要細胞應激之一17，我們分析了XR和GdBN+XR處理後的ROS產生。藉由螢光顯微鏡檢測將非螢光染料2,7-二氯氫螢光素二乙酸酯(H2DCFDA)轉化為螢光2,7-二氯氫螢光素(DCF)，我們測定了XR或GdBN+XR處理後獲得的單細胞和同類相食細胞產生ROS的能力。我們觀察到這些處理誘導單個和同類相食細胞中ROS的產生(圖5a和圖5b)。此外，我們發現已知會減少ROS產生的抗氧化劑N-乙醯半胱胺酸(NAC)和超氧化物歧化酶(SOD)模擬Mn(III)肆(4-苯甲酸)(MnTBAP)18，減少細胞衰老(如藉由檢測到p21表現(圖5c)所揭示的)，該細胞衰老在用單獨的XR或用ΓδBN+XR組合處理HCT116細胞後檢測到。這些結果表明，ROS的產生對於誘導與XR和GdBN+XR處理相關的衰老和細胞同類相食起著關鍵作用。
為了確定作為ROS產生的主要細胞內來源的NADPH氧化酶(NOX)是否可以調節這些過程19,20，我們確定NADPH氧化酶5(NOX5)-一種參與受照射人類原代纖維母細胞的死亡的NADPH氧化酶21-是否可參與ROS的產生。因此，我們評估了NOX5消耗對用XR或ΓδBN+ΞP處理HCT116細胞後檢測到的ROS產生、p21表現、SA-β-半乳糖苷酶活性和細胞同類相食的影響(圖5a至圖5h)。我們證明了用特異性小干擾RNA消耗NOX5減弱了ROS的產生(圖5d和圖5e)，降低了p21的表現(圖5f)和SA-β-Gal+活性(圖5g)並減少了在XR和ΓδBN+ΞP處理後檢測到的細胞同類相食(圖5h)。總之，這些結果表明，在用XR或GdBN+XR處理治療癌細胞後，誘導衰老和細胞同類相食需要NOX5依賴性ROS產生。
NADPH氧化酶5(NOX5)失活增強由XR和GdBN+XR處理引起的腫瘤抑制。
為了表徵NOX5失活對腫瘤生長的影響，將藉由使用短髮夾RNA的RNA干擾來耗盡(shNOX5)或未耗盡(shControl)的人類結腸直腸HCT116細胞(圖6a)在37℃下在1小時內用1.2mM GdBN預處理，然後用單劑量的6Gy X射線(XR)照射。將腫瘤細胞皮下注射到Balb/c裸鼠中並評估腫瘤生長。我們觀察到，與GdBN治療或對照小鼠相比，游離輻射減少了癌細胞植入後腫瘤的生長，並證實，釓基顆粒與游離輻射的組合(GdBN+XR)增強了XR停止腫瘤生長的能力(圖6b)。我們還觀察到NOX5的失活強烈減少了在植入已經耗盡NOX5的對照、GdBN處理、XR處理或GdBN+XR處理的HCT116細胞後獲得的腫瘤的生長(圖6c)。這些結果表明NOX5保護癌細胞免受腫瘤植入或單獨用GdBN治療，以及單獨XR或GdBN+XR的腫瘤抑制活性引起的細胞應激。總之，這些結果表明GdBN+XR與NOX5失活的組合強烈地提高了放射療法的效率。
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Claims (17)

  1. 一種供在處理有需要的受試者的腫瘤的方法中使用的奈米顆粒，前述方法包括以下步驟：a.將有效量的奈米顆粒的懸浮液投予有需要的受試者的腫瘤，前述奈米顆粒包含原子序Z高於40，較佳高於50且平均流體動力學直徑低於10nm，較佳低於5nm，例如1至5nm的元素；以及b.將包含前述奈米顆粒的前述腫瘤暴露於有效劑量的游離輻射；其中前述游離輻射和前述奈米顆粒的組合作用誘導受照射的腫瘤細胞的衰老及/或細胞同類相食。
  2. 如請求項1所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述腫瘤暴露於每分劑至少3Gy，較佳3Gy至9Gy，更佳5至7Gy的游離輻射劑量，並且總劑量較佳以最多10個分劑來投予。
  3. 如請求項1或2所記載之供使用的奈米顆粒，其中在前述步驟a和步驟b之前，前述方法還包括以下步驟：i.確定受試者腫瘤中NOX5及/或ROCK1的表現量或活性；ii.將獲得的表現值或活性與相應的對照值進行比較；iii.在腫瘤的NOX5及/或ROCK1的表現量或活性實質上等於或高於對照值的受試者中選擇受試者。
  4. 如請求項1或2所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述方法還包括在暴露於游離輻射步驟之前或同時或之後投予NOX5及/或ROCK1活性的增強劑或調節劑的步驟。
  5. 如請求項1、2或4所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述方法還包括在處理步驟之前確定腫瘤中NOX5及/或ROCK1的 表現量或活性的步驟。
  6. 如請求項1至5中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述游離輻射和前述奈米顆粒的組合作用誘導針對前述腫瘤細胞的由NOX5活性介導的免疫反應。
  7. 如請求項1至6中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述方法還包括在暴露於游離輻射步驟之前或同時或之後投予免疫治療劑的步驟。
  8. 如請求項7所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述免疫治療劑選自免疫檢查點抑制劑，例如PD1/PDL1抑制劑和CTLA4抑制劑。
  9. 如請求項1至8中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中待處理的腫瘤選自已經證明對誘導細胞凋亡的化學處理具有抗性的腫瘤。
  10. 如請求項1至9中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中未經照射的細胞藉由相鄰的經照射細胞的細胞同類相食進一步被殺死。
  11. 如請求項1至10中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中與藉由游離輻射的相同暴露但在不存在奈米顆粒的情況下所誘導的衰老細胞的數量相比，處理後的腫瘤細胞中的衰老細胞的數量增加至少10%、20%、30%、40%或至少50%的因子。
  12. 如請求項1至11中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中與藉由游離輻射的相同暴露但在不存在奈米顆粒的情況下所觀察的細胞同類相食相比，細胞同類相食增強至少10%、20%、30%、40%或至少50%的因子。
  13. 如請求項1至12中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中 暴露於前述游離輻射的腫瘤體積小於前述待處理的腫瘤的總體積，例如小至少10%(以體積計)，或小至少20%(以體積計)。
  14. 如請求項1至13中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述方法還能夠處理位於暴露於游離輻射的區域之外的腫瘤。
  15. 如請求項1至14中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述奈米顆粒包含稀土金屬，較佳釓，作為高-Z元素。
  16. 如請求項1至15中任一項所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述奈米顆粒包含高Z元素的螯合物，例如稀土元素的螯合物。
  17. 如請求項16所記載之供使用的奈米顆粒，其中前述奈米顆粒包含：‧聚有機矽氧烷；‧與前述聚有機矽氧烷共價結合的螯合物；‧由螯合物複合的高Z元素。
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