TW201903146A - 使用由人類神經或膠細胞產生的重組人類艾杜糖醛酸鹽 (iduronate)-2-硫酸酯酶 (ids) 之黏多醣病ii之治療 - Google Patents

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Abstract

本發明描述用於向診斷患有黏多醣病II (MPS II)之人類個體之中樞神經系統(CNS)的腦脊髓液遞送由人類神經元或膠細胞產生的重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)的組合物及方法。

Description

使用由人類神經或膠細胞產生的重組人類艾杜糖醛酸鹽 (IDURONATE)-2-硫酸酯酶 (IDS) 之黏多醣病II之治療
本發明描述用於向診斷患有黏多醣病II (MPS II)之人類個體之中樞神經系統(CNS)的腦脊髓液(CSF)遞送由人類神經元或膠細胞產生的重組人類艾杜糖醛酸鹽(iduronate)-2-硫酸酯酶(IDS)的組合物及方法。
亨特症候群/MPS II為一種在0.5至1.3/100,000男性出生人口中出現的罕見X性聯隱性遺傳疾病。此進展性及破壞性疾病係由以下引起：IDS基因之基因突變，從而導致溶酶體儲存酶艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶缺陷，該艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶為一種硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素之溶酶體代謝所需的酶。此等普遍存在的多醣(稱為GAG (葡糖胺聚糖))在MPS II患者之組織及器官中積聚，從而引起特徵性儲存病變及多樣疾病後遺症。在此患者群體中，發病率及死亡率很高；已報導在具有重度表型(特徵為神經認知退化)之患者中在11.7歲之平均年齡及在具有輕微或減弱表型中在21.7歲之平均年齡發生死亡。(Young等人, 1982, A clinical and genetic study of Hunter's syndrome. 2 Differences between the mild and severe forms. J. Medical Genetics 19:408-411)。大部分(三分之二)患者據報導患有重度形式的此疾病。(Wraith JE等人, 2007, Enzyme replacement therapy in patients who have mucopolysaccharidosis I and are younger than 5 years: Results of a multinational study of recombinant human alpha-L-Iduronidase (Laronidase). Pediatrics 120(1):E37-E46)。儘管疾病主要感染男生，但已報導由於非隨機x失活及/或基因之兩個對偶基因之突變而感染女性。(Martin等人, 2008, Recognition and diagnosis of mucopolysaccharidosis II (Hunter Syndrome). Pediatrics 121:e377)。然而，MPS II在雌性中係極其罕見的，發生率小於2%。 患有MPS II之患者在出生時看起來正常，但疾病之體徵及症狀通常在18個月與4歲年齡之間呈現重度形式，且在4歲與8歲年齡之間呈現減弱形式。對於所有感染患者常見之體徵及症狀包括身材短小、面部特徵粗糙、大頭畸形、巨舌畸形、聽覺損失、肝脾腫大、脂肪營養不良、關節攣縮、脊柱狹窄及腕隧道症候群。在大部分患者中出現頻繁上呼吸道及耳感染，且通常找到進展性呼吸道堵塞，從而導致睡眠呼吸暫停及通常死亡。心臟病為此群體中之一個主要原因，且表徵為瓣膜功能障礙，從而導致右及左心室肥大及心臟衰竭。死亡一般歸因於阻塞性呼吸道疾病或心臟衰竭。 在重度形式的疾病中，可滿足早期發育重要事件，但在18-24個月，容易出現發育遲緩。一些患者在一歲不能通過聽覺篩選測試，且其他重要事件延緩，包括不支持坐之能力、行走及說話能力。發育進展在3歲與5歲之間開始平穩，其中據報導在約6.5歲開始退化。在~50%之變得排便訓練之患有MPS II之兒童中，大部分(若並非所有)將由於疾病進展而失去此能力。(Wraith等人, 2007, 同前文獻；Martin等人, 2008, 同前文獻)。 患有顯著神經受累之患者呈現嚴重的行為障礙，包括當神經退化減弱此行為時，在兩歲時開始且持續直至8-9歲為止之過動症、頑固及攻擊。(Muenzer等人, 2009, Mucopolysaccharidosis I: Management and Treatment Guidelines, Pediatric 123(1): 19-29)。 在超過一半的達到10歲之重度感染患者中報導有癲癇，且在死亡時，患有CNS受累之大部分患者呈嚴重精神障礙且需要持久護理。(Wraith等人, 2007, 同前文獻；Martin等人, 2008, 同前文獻)。儘管患有減弱疾病之患者呈現正常心智功能，但MRI成像揭露在患有MPS II之所有患者中總體大腦異常，包括白質病變、擴大的腦室及大腦萎縮。(Muenzer等人, 2009, 同前文獻)。 利用由HT1080 (纖維肉瘤)細胞(Elaprase®，Shire Human Genetic Therapies)產生的重組艾杜硫酸酯酶(idursulfase)之酶置換療法(ERT)為治療亨特症候群之唯一經批准產品，且以每週輸注來投與。(ELAPRASE (艾杜硫酸酯酶)注射[藥品說明書]。Lexington, MA: Shire Human Genetic Therapies, Inc; 2013,可在http://pi.shirecontent.com/PI/PDFs/Elaprase_USA_ENG.pdf獲得)。 然而，作為目前所投與之ERT並不跨越血腦障壁，且因此不能解決患有重度疾病(亦即具有CNS/神經認知及行為受累之MPS II)之患者之未滿足的需要。在設計成解決此問題之最近臨床試驗中，使用植入脊柱(利用經由在下肋上之切口而植入進入口，在L4/L5階上插入導管)之鞘內藥物遞送裝置，向兒科患者每月一次投與調配用於鞘內投與之艾杜硫酸酯酶(Elaprase)。患者亦同時接受每週一次i.v.艾杜硫酸酯酶。參見Muenzer等人, 2016, Genetics in Med 18: 73-81, esp. 第74頁；其摘要可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25834948?dopt=Abstract獲得)。裝置故障引起部分校正、總手術校正、或移除6/12 (50%)之所治療患者。值得注意的是，12/14 SAE (嚴重不良跡象)為裝置相關的(裝置插入之併發症、裝置錯位/連接問題、裝置斷裂/故障/失效、植入部位感染、操作性疼痛及創傷開裂)。(Muenzer等人, 2016, 第75頁, 第2欄及圖1)。此兒科群體的高活動等級加劇裝置斷裂及導管自脊柱管移動。(Muenzer等人, 2016，在第78頁論述)。
本發明涉及向診斷患有黏多醣病II (MPS II)之人類個體之中樞神經系統(CNS)之腦脊髓液(CSF)遞送由人類神經元或膠細胞產生的重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(rhIDS)，該人類個體包括(但不限於)診斷患有亨特症候群(Hunter syndrome)的患者。 在一較佳實施例中，經由基因療法，例如藉由向診斷患有MPS II之患者(人類個體)之CSF投與編碼人類IDS (hIDS)或hIDS之衍生物的病毒載體或其他DNA表現構築體，從而產生向CNS持續供應轉基因產物的轉導神經元及/或膠細胞永久性庫，來實現治療。至CSF中之分泌自神經元/膠細胞庫之rhIDS將被CNS中之細胞內吞，從而引起接受者細胞中之酶促缺陷的「交叉校正」。此外，已出乎意料地發現，CNS中之經轉導神經及膠細胞庫可將重組酶遞送至CNS及全身兩者，此可降低或消除對全身性治療(例如每週i.v.注射酶)之需求。 在一替代實施例中，hIDS可由細胞培養物(例如生物反應器)中之人類神經元或膠細胞產生，且例如藉由將酶注入至CSF中，直接注入至CNS中及/或全身，作為酶置換療法(「ERT」)而投與。然而，基因療法提供優於ERT的若干優勢，此係由於酶之全身遞送將不會引起治療CNS，因為酶不能跨越血腦障壁；以及不同於本發明之基因療法，將酶直接遞送至CSF及/或CNS，將需要重複注射，此不僅為繁重的，而且具有感染風險。 由轉基因編碼之hIDS可包括(但不限於)：人類IDS (hIDS) (如圖1中所展示)，其具有SEQ ID NO. 1之胺基酸序列；及hIDS之衍生物，其具有胺基酸取代、缺失或添加，例如包括(但不限於)選自展示於圖2中之IDS異種同源物中之對應非保守殘基之胺基酸取代，其限制條件為，此類突變不包括位置84處之半胱胺酸殘基(C84)的置換，該位置84處之半胱胺酸殘基為酶活性所需的(Millat等人, 1997, Biochem J 326: 243-247)；或已在重度、重度-中度、中度或減弱MPS II表型中鑑別的突變，例如如圖3中所展示的，或如由Sukegawa-Hayasaka等人, 2006, J Inhert Metab Dis 29: 755-761 (報導「減弱的」突變R48P、A85T、W337R，及截斷突變Q531X；以及「嚴重」突變P86L、S333L、S349I、R468Q、R468L)；Millat等人, 1998, BBA 1406: 214-218 (報導「減弱的」突變P480L及P480Q；以及「嚴重」突變P86L)；以及Bonucelli等人, 2001, BBA 1537:233-238中所報導的，其各者以全文引用的方式併入本文中。 舉例而言，hIDS之特定位置處之胺基酸取代可選自圖2中所比對之IDS異種同源物中之彼位置處發現的對應非保守胺基酸殘基，其限制條件為，此類取代不包括展示於圖3中或如由Sukegawa-Hayasaka等人, 2006, 同前文獻；Millat等人, 1998,同前文獻；或Bonucelli等人, 2001, 同前文獻中所報導的有害突變中的任一者，各文獻以全文引用的方式併入本文中。可使用在活體外、細胞培養物或測試動物分析中之習知分析來測試所得轉基因產物，以確保突變並不破壞IDS功能。所選擇之較佳胺基酸取代、缺失或添加應為保持或增加IDS之酶活性、穩定性或半衰期的彼等，如藉由在活體外、MPS II細胞培養物或動物模型中之習知分析所測試。舉例而言，可使用習知酶分析利用例如4-甲基香豆素基α-L-吡喃艾杜糖醛酸2-硫酸鹽或4-甲基香豆素基硫酸鹽作為受質，來評定轉基因產物之酶活性(對於可使用之例示性IDS酶分析，參見例如Lee等人, 2015, Clin. Biochem. 48(18):1350-1353，Dean等人, 2006, Clin. Chem. 52(4):643-649，其各者以全文引用的方式併入本文中)。可在細胞培養物中評定轉基因產物校正MPS II表型之能力；例如藉由利用編碼hIDS或衍生物之病毒載體或其他DNA表現構築體轉導培養物中之MPS II細胞；藉由向培養物中之MPS II細胞添加轉基因產物或衍生物；或藉由將MPS II細胞與經工程改造表現並分泌rhIDS一衍生物之人類神經元/宿主膠細胞一起共培養，及例如藉由偵測IDS酶活性及/或培養物中之MPS II細胞中之GAG儲存的減少來測定MPS II培養細胞中的缺陷的校正(參見例如Stroncek等人, 1999, Transfusion 39(4):343-350，其以全文引用的方式併入本文中)。 已描述可用於評定本文中所描述之療法之MPS II的動物模型。舉例而言，藉由利用新黴素抗性基因置換IDS 基因之外顯子4及5來工程改造MPS II的基因敲除小鼠模型(IDS基因敲除)。(Garcia等人, 2007, J Inherit Metab Dis 30: 924-34)。此IDS基因敲除小鼠展現許多MPS II之特徵，包括骨骼異常、肝脾腫大、泌尿及組織GAG提高及大腦儲存病變(Muenzer等人, 2001, Acta Paediatr增刊91:98-99)；且用於評定MPS II中之酶置換療法在支援ERT臨床試驗上的效果。因此，此小鼠模型為為了研究基因療法遞送由神經元或膠細胞產生的rIDS作為MPS II之治療的效果的相關模型(參見例如，Polito及Cosma, 2009, Am. J. Hum. Genet. 85(2):296-301，其以全文引用的方式併入本文中)。 較佳地，由人類神經元/膠細胞產生的hIDS轉基因應受在神經元及/或膠細胞中起作用之表現控制元件(例如CB7啟動子(雞β-肌動蛋白啟動子及CMV增強子))控制，且可包括增強由載體驅動之轉基因之表現的其他表現控制元件(例如雞β-肌動蛋白內含子及兔β-血球蛋白polyA信號)。hIDS轉基因之cDNA構築體應包括確保由經轉導CNS細胞恰當共轉譯及轉譯後加工(糖基化及蛋白質硫酸化)之信號肽的編碼序列。由CNS細胞使用之此類信號肽可包括但不限於： ●寡樹突神經膠細胞-髓鞘糖蛋白(hOMG)信號肽： MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC (SEQ ID NO:2) ● E1A刺激基因2之細胞抑制子(hCREG2)信號肽： MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG (SEQ ID NO:3) ●含有2B之V集及跨膜域(hVSTM2B)信號肽：MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLFVADA (SEQ ID NO:4) ●原鈣黏著蛋白α-1 (hPCADHA1)信號肽： MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG (SEQ ID NO:5) ● FAM19A1 (TAFA1)信號肽： MAMVSAMSWVLYLWISACA (SEQ ID NO:6) ●介白素-2信號肽： MYRMQLLSCIALILALVTNS (SEQ ID NO:14) 信號肽亦可在本文中被稱作為前導序列或前導肽。 用於遞送轉基因之重組載體應對於CNS中之細胞具有趨向性，該等細胞包括但限於神經元及/或膠細胞。此類載體可包括非複製重組腺相關病毒載體(「rAAV」)，特定言之攜帶AAV9或AAVrh10衣殼之彼等為較佳的。可使用AAV變體衣殼，包括(但不限於)由Wilson在美國專利第7,906,111號(其以全文引用的方式併入本文中)中所描述之彼等，其中AAV/hu.31及AAV/hu.32尤其較佳；以及由Chatterjee在美國專利第8,628,966號、美國專利第8,927,514號及Smith等人, 2014, Mol Ther 22: 1625-1634 (其各者以全文引用的方式併入本文中)中所描述之AAV變體衣殼。然而，可使用其他病毒載體，包括(但不限於)慢病毒載體、牛痘病毒載體或被稱作「裸DNA」構築體之非病毒表現載體。 在一個實施例中，可使用構築體1來遞送轉基因。構築體1為含有人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶表現盒、具有血清型9衣殼的重組腺相關病毒，其中表現由巨細胞病毒(CMV)增強子與雞β肌動蛋白啟動子(CB7)之雜合體驅動，其中IDS表現盒由反向末端重複序列(ITR)側接，且轉基因包括雞β肌動蛋白內含子及兔β血球蛋白聚腺苷酸化(polyA)信號。 適合於向CSF投與之醫藥組合物包含rhIDS載體於調配物緩衝液中之懸浮液，該調配物緩衝液包含生理學上相容的水性緩衝劑、界面活性劑及視情況存在之賦形劑。在某些實施例中，醫藥組合物適合於鞘內投與。在某些實施例中，醫藥組合物適合於腦池內投與(注射至大池中)。在某些實施例中，醫藥組合物適合於經由C1-2穿刺注射至蛛膜下空間中。在某些實施例中，醫藥組合物適合於腦室內投與。在某些實施例中，醫藥組合物適合於經由腰穿刺投與。 應經由鞘內投與(亦即注射至蛛膜下空間中，使得重組載體經由CSF分配且轉導CNS中之細胞)向CSF投與治療有效劑量的重組載體。此可以多種方式，例如藉由顱內(腦池或腦室)注射、或注射至腰池中來實現。舉例而言，可藉由CT引導的枕下穿刺來進行腦池內(IC)注射(至大池中)；或當對於患者為可行的時，可經由C1-2穿刺來進行注射至蛛膜下空間中；或可使用腰穿刺(通常為了收集CSF樣本而進行之診斷性步驟)來進入CSF。或者，可使用腦室內(ICV)投與(用於引入不穿過血腦障壁之抗感染或抗癌藥物的更好的侵入性技術)來直接將重組載體滴注至大腦腦室中。或者，可使用鼻內投與來將重組載體遞送至CNS。 CSF濃度可藉由直接量測獲自枕骨之CSF液體或腰穿刺物中之rhIDS之濃度來監測，或藉由自患者血清中偵測到之rhIDS濃度外推來評估。 藉助於背景技術，將人類IDS轉譯為含有圖1中所描繪之八個潛在N-糖基化位點(N31 、N115 、N144 、N246 、N280 、N325 、N513 及N537 )的550個胺基酸多肽，且包括在加工期間裂解的25個胺基酸信號序列。在於高基氏體中修飾初始76 kDa胞內前體寡醣鏈之後，其轉化成磷酸化的90 kDa前體。藉由糖基化修飾及蛋白質裂解經由各種胞內中間物將此前體加工成主要55 kDa形式。概言之，在移除25個胺基酸信號序列之後，蛋白水解加工涉及：N31 下游之N端蛋白質裂解，移除八個胺基酸(殘基26-33)之前肽；及N513 上游之C端蛋白質裂解，其釋放18 kDa多肽且產生轉化成55 kDa成熟形式之62 kDa中間物。進一步蛋白質裂解產生位於溶酶體腔室中之45 kDa成熟形式。(對於自Millat等人, 1997, Exp Cell Res 230: 362-367 (「Millat 1997」)；Millat等人 1997, Biochem J. 326: 243-247 (「Millat 1997a」)；以及Froissart等人, 1995, Biochem J. 309:425-430再現的圖式，參見圖4，該等文獻各者以全文引用的方式併入本文中)。 酶活性所需之C84 之甲醯基甘胺酸修飾(在圖1中以粗體展示)可能作為早期轉譯後或共轉譯事件，最可能在內質網中發生。(參見Millat 1997a, citing Schmidt等人, 1995, Cell 82: 271-278)。在高基氏體中繼續轉譯後加工，包括添加含聚糖之唾液酸之複合物及獲得標記用於遞送至溶酶體腔室之酶的甘露糖-6-磷酸殘基。(對於簡明綜述，參見Clarke, 2008, Expert Opin Pharmacother 9: 311-317，其以全文引用的方式併入本文中)。儘管無單一糖基化位點為IDS穩定性所必須的，但位置N280 處之糖基化對於細胞內化及經由甘露糖-6-磷酸(M6P)受體之溶酶體靶向為重要的。(Chung等人, 2014, Glycoconj J 31:309-315在第310頁, 第一行)。在正常生理狀態下，IDS以極低含量產生，且自細胞分泌極少的酶(若存在)。(Clarke, 2008,同前文獻)。 本發明部分地基於以下原理： (i) CNS中之神經元及膠細胞為CNS中之擁有轉譯後加工分泌蛋白之細胞機制的分泌細胞，該轉譯後加工包括糖基化、甘露糖-6-磷酸化及酪胺酸-O-硫酸化穩固過程。對於由人類CNS細胞進行之轉譯後修飾，參見例如Sleat等人, 2005, Proteomics 5: 1520-1532，及Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98，其描述人類大腦甘露糖-6-磷酸糖蛋白質組，且提及，大腦含有具有比在其他組織中發現的高許多數目之個別同功異型物及甘露糖-6-磷酸化蛋白質的更多的蛋白質；以及Kanan等人, 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567，及Kanan及Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131，報導由神經元細胞分泌的酪胺酸硫酸化糖蛋白的生產，其各者以全文引用的方式併入本文中。 (ii)人類大腦產生多種天然/原生IDS之同功異型物。特定言之，人類大腦甘露糖-6-磷酸化糖蛋白之N端定序揭露，大腦中之hIDS變體之成熟42 kDa鏈之N端序列在如下位置34或36處開始：T34 DALNVLLI；以及A36 LNVLLIIV。(Sleat, 2005, Proteomics 5: 1520-1532, 表S2)。發現八個N-連接糖基化位點中之兩個(即N280 及N116 )在獲自人類大腦之IDS中為甘露糖-6-磷酸化的。(Sleat等人, 2006, Mol & Cell Proeomics 5.4: 686-701,在表V處報導)。 (iii)在hIDS加工期間，兩個多肽(76 kDa及90 kDa)由神經細胞及膠細胞分泌，但僅90 kDa多肽為甘露糖-6-磷酸化的，其為分泌形式之酶達成交叉校正所必需的。(參見Millat, 1997，圖1為經轉導類淋巴母細胞細胞之結果；及Froissart 1995，圖4展示經轉導纖維母細胞中之類似結果，在培養基中，僅90 kDa形式為磷酸化的)。有趣的是，已證明，由神經元及膠細胞產生的重組IDS可比由其他細胞(諸如腎臟)產生的重組IDS，更易於由接受者CNS細胞內吞。Daniele 2002 (Biochimica et Biophysica Acta 1588(3):203-9)表明，M6P受體介導由非轉導神經元及膠細胞之接受者群體對來自經轉導神經元及膠細胞培養物之改良性培養基的重組IDS的內吞作用，該等重組IDS恰當地將前體加工成45 kDa成熟活性形式。由神經元及膠細胞株產生的重組IDS之攝取(74%，內吞作用)遠超過由腎細胞株產生的酶之攝取(5.6%，內吞作用)。在各情況下，攝取受M6P抑制，指示重組IDS攝取為M6P受體介導的。(參見Daniele 2002，表2及4，以及下表1中概述之在第205-206頁的結果的隨附描述)。表 1 . Daniele 2002 中 報導 之 結果之概述 (iv)本文中所描述之基因療法應引起約90 kDa (如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測) (取決於所使用之分析)之hIDS糖蛋白前體連續分泌，該hIDS糖蛋白前體為酶活性的。首先，在人類大腦之大腦皮質中表現引起為IDS活性所需之C84 之甲醯基甘胺酸修飾的酶——FGly產生酶(FGE，亦稱為SUMF1) (可在例如http://www.genecards.org找到關於SUMF1之基因表現資料)。其次，應吸收由經轉導神經元及膠細胞原位產生的分泌性經糖基化/磷酸化rIDS，且由CNS中之未轉導之神經及膠細胞正確地加工。在不受任何理論束縛之情況下，顯然，若向CNS投與，則由基因療法原位生產的分泌性rhIDS前體可比ERT使用之傳統重組酶更易於由CNS中之接受者細胞內吞。舉例而言，Elaprase® (在HT1080 (一種纖維肉瘤細胞株)中製備)為一種據報導分子量約為76 kDa之純化蛋白，不是呈現更大量磷酸化、由神經元及膠細胞分泌的90 kDa物種。儘管八個N-連接糖基化位點據報導完全佔據Elaprase® ，且含有兩個雙甘露糖-6-磷酸末端聚糖以及複合高度唾液酸化聚糖，但C84 轉譯後修飾為FGly (其為酶活性的絕對要求)僅約50%。(Clarke, 2008, Expert Opin Pharmacother 9:311-317；Elaprase® 全部處方資訊及EMA申請)。在CHO細胞中製備另一重組產物Hunterase® 。儘管據報導具有比Elaprase® 更高的FGly及活性，但甘露糖-6-磷酸化及攝取確實不同。(Chung, 2014, Glycoconj J 31:309-315)。 (v)活體內胞外IDS功效取決於經由M6P之攝取(細胞及溶酶體內化)及其活性位點甲醯基甘胺酸(FGly)，該甲醯基甘胺酸經由由甲醯基甘胺酸產生酶之轉譯後修飾自C84 轉化。如以上表1中所展示，大腦細胞(神經元及膠細胞)展示，當與由經轉導神經元及膠細胞分泌之IDS前體介質一起培育時，比與由經基因工程改造腎細胞分泌之IDS前體介質一起培育時更高的酶活性。所得活性增加五倍可能歸因於IDS之有效攝取(參見Daniele 2002，表2及4)。商業形式之IDS (其由CHO細胞或HT-1080細胞產生)之FGly含量約為50%至70%，該FGly含量決定酶活性。然而，神經元及膠細胞可改良此活性，此係歸因於IDS攝取之改良。 (vi)溶酶體蛋白(包括IDS)之細胞及次細胞遷移/攝取係經由M6P。來自大腦細胞之IDS可能含有較高M6P含量，如Daniele 2002中及Sleat, Proteomics, 2005中所報導(指示人類大腦含有比其他組織更多(在定量及定性意義兩者上)的Man6-P糖蛋白)。可能量測IDS前體之M6P含量，如Daniele 2002中所進行。在抑制性M6P (例如5 mM)存在下，預測由非神經元或非膠細胞(諸如Daniele 2002之經基因工程改造腎細胞)產生的IDS前體之攝取降低至接近於對照細胞之含量，如Daniele 2002中所展示。同時在抑制性M6P存在下，預測由大腦細胞(諸如神經元及膠細胞)產生的IDS前體之攝取仍處於高含量下，如Daniele 2002中所展示，其中攝取比對照細胞高四倍，且與在不存在抑制性M6P之情況下由經基因工程改造腎細胞產生的IDS前體之IDS活性(或攝取)含量相當。此分析允許一種預測由大腦細胞產生的IDS前體中之M6P含量的方法，且特定言之，與由不同類型之細胞產生的IDS前體中之M6P含量進行比較。本文中所描述之基因療法應引起hIDS前體之連續分泌，在此類分析中，該hIDS前體可在抑制性M6P存在下以高含量吸收至神經元及膠細胞中。 (vii) IDS前體之M6P含量及攝取亦可由90 kDa及76 kDa凝膠帶(例如SDS-PAGE凝膠帶)證實。90 kDa據報導為高度糖基化/磷酸化的，且含有M6P，而76 kDa則不是如此。可將在76 kDa至95 kDa範圍內且平均MW為80-85 kDa之極寬凝膠帶(類似於由經基因工程改造腎細胞產生的IDS前體凝膠帶(Daniele 2002，圖1))，與由大腦細胞產生的IDS前體之凝膠帶相對照。在Daniele 2002中，不能為凝膠帶，此係歸因於不能免疫沈澱IDS前體。本文中所描述之基因療法應引起不同於由經基因工程改造腎細胞產生的IDS前體凝膠帶的hIDS前體的連續分泌。 (viii)商業IDS前體之M6P含量為2至2.5 mol/mol，其大部分以二磷酸化聚糖形式存在。儘管平均地，每一IDS前體為磷酸化的，但聚糖之常態分佈將為，一些IDS前體具有2、1及0個二磷酸化M6P聚糖，呈現多個磷酸化位點。在多個磷酸化之情況下，攝取速率應顯著較高。 (ix)由人類CNS細胞之hIDS之糖基化將引起添加聚糖，此可改良轉基因產物之穩定性、半衰期及降低其非所需聚集。顯著地，添加至本發明之hIDS之聚糖包括2,6-唾液酸，其結合Neu5Ac (「NANA」)而非其羥基化衍生物NeuGc (N-羥乙醯基神經胺糖酸，亦即「NGNA」或「Neu5Gc」)。此類聚糖在於CHO細胞中製備之重組IDS產物(諸如Hunterase® )中不存在，此係因為CHO細胞不具有製備此轉譯後修飾所需之2,6-唾液酸轉移酶；且CHO細胞不產生等分GlcNAc，但其確實添加Neu5Gc (NGNA)而非Neu5Ac (NANA)作為對於人類不典型(且可能免疫原性)的唾液酸。參見例如Dumont等人, 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 (早期線上第1-13頁，第5頁處)；以及Hague等人, 1998 Electrophor 19:2612-2630 (「[t]he CHO cell line is considered 『phenotypically restricted』, in terms of glycosylation, due to the lack of an α2,6-sialyl-transferase」)。此外，CHO細胞亦可產生免疫原性聚糖α-Gal抗原，其與大部分個體中存在之抗α-Gal抗體反應，且在高濃度下可觸發過敏反應。參見例如Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156。本發明之rhIDS之人類糖基化模式應降低轉基因產物該免疫原性且改良功效。 (x)轉基因產物之免疫原性可由各種因子誘導，包括患者之免疫狀況、所輸注蛋白藥物之結構及特徵、投與途徑及治療持續時間。過程相關雜質(諸如宿主細胞蛋白(HCP)、宿主細胞DNA及化學殘餘物)及產物相關雜質(諸如蛋白質降解產物)以及結構特徵(諸如糖基化、氧化及聚集(低於可見的粒子))，亦可藉由充當增強免疫反應之佐劑而增加免疫原性。過程相關雜質及產物相關雜質之量可受以下製造方法影響：細胞培養物、純化、配方、儲存及操作，其可影響商業製造的IDS產品。在基因療法中，在活體內產生蛋白質，使得不存在過程相關雜質，且蛋白質產物不可能含有產物相關的雜質/與由重組技術產生的蛋白質相關的降解產物，諸如蛋白質聚集及蛋白質氧化。聚集例如與歸因於高蛋白濃度之蛋白質生產及儲存、與生產設備及容器相互作用之表面及利用某些緩衝液系統的純化過程相關。但當在活體內表現轉基因時不存在促進聚集的此等狀況。氧化(諸如甲硫胺酸、色胺酸及組胺酸氧化)亦與蛋白質生產及儲存相關，例如由脅迫細胞培養條件、金屬與空氣接觸及緩衝液與賦形劑中之雜質引起。活體內表現之蛋白質亦可在脅迫條件下氧化，但人類(如許多生物體)配備有抗氧化防衛系統，其不僅降低氧化脅迫，且亦可修復及/或逆轉氧化。因此，活體內生產之蛋白質不大可能呈氧化形式。聚集及氧化兩者均可影響效能、藥物動力學(清除)，且可增加免疫原性問題。本文中所描述之基因療法應引起具有相比於商業製造產品免疫原性降低之hIDS前體的連續分泌。 (xi)除N-連接糖基化位點以外，hIDS含有酪胺酸(「Y」)硫酸化位點(PSSEKY165 ENTKTCRGPD)。(對於酪胺酸殘基周圍經受蛋白質酪胺酸硫酸化之胺基酸之分析，參見例如Yang等人, 2015, Molecules 20:2138-2164, 尤其在第2154頁，其以全文引用的方式併入本文中。「規則」可概述如下：具有E或D之Y殘基在Y之+5至-5位置內，且其中位置Y之-1為中性或酸性帶電荷胺基酸而非鹼性胺基酸，例如破壞硫酸化之R、K或H)。在不意欲受任何理論束縛之情況下，hIDS中之此位點之硫酸化可改良酶之穩定性及針對受質之結合親和性。hIDS之酪胺酸硫酸化(一種人類CNS細胞中之穩定轉譯後加工)應引起轉基因產物之加工及活性改良。尚未闡明溶酶體蛋白之酪胺酸硫酸化的重要性；但在其他蛋白質中，已展示增加蛋白-蛋白相互作用(抗體與受體)之親合力，且促進蛋白水解加工(肽激素)。(參見Moore, 2003, J Biol. Chem. 278: 24243-46；以及Bundegaard等人, 1995, The EMBO J 14: 3073-79)。在大腦中明顯地以較高含量(基於mRNA)表現引起酪胺酸硫酸化(其可作為IDS加工中之最終步驟發生)之酪胺醯蛋白磺基轉移酶(TPST1) (TPST1之基因表現資料可在EMBL-EBI Expression Atlas (可在http://www.ebi.ac.uk/gxa/home獲得)處找到)。此類轉譯後修飾充其量在CHO細胞產品中受到限制。不同於人類CNS細胞，CHO細胞不為分泌細胞且轉譯後酪胺酸硫酸化之能力有限。(參見例如Mikkelsen及Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537，尤其在第1537頁處之論述)。 對於前述原因，由人類神經元及/或膠細胞生產rhIDS，應引起用於治療MPS II之「生物較佳」分子，該治療經由基因療法例如藉由來實現，向診斷患有MPS II疾病(包括(但不限於)亨特疾病)之患者(人類個體) CSF投與編碼rhIDS的病毒載體或其他DNA表現構築體，在CNS中產生持續供應由經轉導CNS細胞分泌的全人類經糖基化甘露糖-6-磷酸化、硫酸化轉基因產物的永久性庫。自庫分泌至CSF中之hIDS轉基因產物將由CNS中之細胞內吞，引起MPS II接受者細胞中之酶促缺陷的「交叉校正」。在基因療法或蛋白質療法中產生的每一rhIDS分子完全糖基化、磷酸化及硫酸化，為不必要的。相反，所產生的糖蛋白群體應具有足夠的糖基化(包括2,6-唾液酸化及甘露糖-6-磷酸化)及硫酸化，以展現功效。本發明之基因療法之目標為減緩或遏止疾病之進展。可藉由量測認知功能(例如預防或降低神經認知下降)、CSF及/或血清中之疾病生物標記(諸如GAG)降低；及/或CSF及/或血清中之IDS酶活性增加來監測功效。亦可監測發炎症狀及其他安全性事件。 作為基因療法之替代例或額外治療，可藉由重組DNA技術在人類神經或膠細胞株中生產rhIDS糖蛋白，且可向診斷患有MPS II之患者全身性投與糖蛋白及/或投與至CSF中以用於ERT。可用於此類重組糖蛋白生產之人類細胞株包括(但不限於)HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11或ReNcell VM (關於可用於重組生產rHuGlyIDS糖蛋白之人類細胞株之綜述，參見例如Dumont等人, 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 「Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives」，其以全文引用的方式併入本文中)。為了確保完成糖基化，尤其唾液酸化及酪胺酸硫酸化，可藉由將宿主細胞工程改造為共表現引起酪胺酸-O-硫酸化之α-2,6-唾液酸轉移酶(或α-2,3-及α-2,6-唾液酸轉移酶)及/或TPST-1及TPST-2酶，來強化用於生產之細胞株。 儘管rhIDS之遞送應使免疫反應降至最低，但與CNS定向基因療法相關的最清晰潛在毒性來源，在呈IDS基因缺陷型且因此有可能呈蛋白質及/或用於遞送轉基因之載體不耐受之人類個體中產生針對所表現rhIDS蛋白的免疫性。 因此，在一較佳實施例中，尤其當治療患有重度疾病、已接近零IDS含量之患者時，與免疫抑制療法一起共治療患者為合理的。可使用涉及與黴酚酸組合之他克莫司(tacrolimus)或雷帕黴素(rapamycin) (西羅莫司(sirolimus))之方案或組織移植過程中使用之其他免疫抑制方案的免疫抑制療法。可在基因療法時程期間投與此類免疫抑制治療，且在某些實施例中，利用免疫抑制療法之預處理可為較佳的。基於治療醫師之判斷，可在基因療法治療之後繼續免疫抑制療法，且其後(例如在180天之後)當誘導免疫耐受性時可撤回。本發明之方法涵蓋將rhIDS遞送至CSF與其他可用治療之遞送的組合。可在基因療法治療之前、同時或之後投與額外治療。可與本發明之基因療法組合之MPS II的可用治療包括(但不限於)使用全身性投與Elaprase® 或投與Elaprase® 至CSF的酶置換療法；及/或HSCT療法。3.1 說明性實施例 3.1.1. 組 1 1.一種經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體，其由人類神經元或人類膠細胞產生。 2.如段落1之經糖基化重組人類IDS前體，其約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測。 3.如段落1之經糖基化重組人類IDS前體，其約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 4.如段落1至3中任一項之經糖基化重組人類IDS前體，其自中樞神經系統中之細胞庫分泌，該等細胞經基因工程改造以分泌該人類IDS糖蛋白前體。 5.如段落4之經糖基化重組人類IDS前體，其中該庫在人類個體之大腦中形成。 6.如段落1至5中任一項之經糖基化重組人類IDS前體，其中該人類神經元或人類膠細胞為IDS活性缺陷型。 7.如段落1至6中任一項之經糖基化重組人類IDS前體，其中該經糖基化重組人類IDS前體包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 8.一種編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中當用於轉導培養物中之初代人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引導分泌性經糖基化人類IDS前體之表現，該分泌性經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 9.一種編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中該重組核苷酸表現載體適合於向人類大腦之腦脊髓液(CSF)投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 10.如段落9之重組核苷酸表現載體，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌藉由利用細胞培養物中之該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。 11.如段落9或10之重組核苷酸表現載體，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌係在存在及不存在甘露糖-6-磷酸之情況下來確認。 12.如段落8至11中任一項之重組核苷酸表現載體，其中該人類IDS包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 13.如段落8至12中任一項之重組核苷酸表現載體，其包含控制人類神經元細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的神經元特異性啟動子、或控制人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的膠細胞特異性啟動子。 14.如段落8至13中任一項之重組核苷酸表現載體，其編碼前導肽，該前導肽確保人類神經元細胞或人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之恰當共轉譯及轉譯後加工。 15.如段落8至14中任一項之重組核苷酸表現載體，其為AAV載體。 16.如段落15之重組核苷酸表現載體，其為複製缺陷性AAV載體。 17.如段落15或16之重組核苷酸表現載體，其為AAV9或AAVrh10載體。 18.一種調配物，其包含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中該調配物適合於向人類大腦之CSF投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 19.一種套組，其包含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體及醫藥學上可接受之載劑，其中該重組核苷酸表現載體適合於向人類大腦之腦脊髓液(CSF)投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 20.一種套組，其包含含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體之調配物，其中該調配物適合於向人類大腦之CSF投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。3.1.2. 組 2 1.一種用於治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體，其中該經糖基化重組人類IDS前體係由人類神經元或人類膠細胞產生，且其中該治療包含將治療有效量之該經糖基化重組人類IDS前體遞送至該人類個體的腦脊髓液(CSF)。 2.如段落1使用之經糖基化重組人類IDS前體，其中該經糖基化重組人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測。 3.如段落1使用之經糖基化重組人類IDS前體，其中該經糖基化重組人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 4.如段落1至3中任一項使用之經糖基化重組人類IDS前體，其中該經糖基化重組人類IDS前體分泌自該中樞神經系統中之細胞庫，該等細胞經基因工程改造以分泌該經糖基化重組人類IDS前體。 5.如段落4使用之經糖基化重組人類IDS前體，其中該庫在人類個體之大腦中形成。 6.如段落1至5中任一項使用之經糖基化重組人類IDS前體，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。 7.如段落1至6中任一項使用之經糖基化重組人類IDS前體，其中該經糖基化重組人類IDS前體包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 8.一種用於治療診斷患有MPS II之人類個體之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，其中當用於轉導培養物中之初代人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引導分泌性經糖基化人類IDS前體之表現，該分泌性經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的，且其中該治療包含向該人類個體之CSF投與該重組核苷酸表現載體。 9.一種用於治療診斷患有MPS II之人類個體之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，其中該重組核苷酸表現載體適合於向人類大腦之腦脊髓液投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的，且其中該治療包含向該人類個體之該CSF投與該重組核苷酸表現載體。 10.如段落9使用之重組核苷酸表現載體，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌藉由利用細胞培養物中之該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。 11.如段落9或10使用之重組核苷酸表現載體，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌係在存在及不存在甘露糖-6-磷酸之情況下來確認。 12.如段落8至11中任一項使用之重組核苷酸表現載體，其中該人類IDS包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 13. 如段落8至12中任一項使用之重組核苷酸表現載體，其中該重組核苷酸表現載體包含控制人類神經元細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的神經元特異性啟動子、或控制人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的膠細胞特異性啟動子。 14.如段落8至13中任一項使用之重組核苷酸表現載體，其中該重組核苷酸表現載體編碼前導肽，該前導肽確保人類神經元細胞或人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之恰當共轉譯及轉譯後加工。 15.如段落8至14中任一項使用之重組核苷酸表現載體，其中該重組核苷酸表現載體為AAV載體。 16.如段落15使用之重組核苷酸表現載體，其中該重組核苷酸表現載體為複製缺陷性AAV載體。 17.如段落15或16使用之重組核苷酸表現載體，其中該重組核苷酸表現載體為AAV9或AAVrh10載體。 18.如段落8至17中任一項使用之重組核苷酸表現載體，其中藉由鞘內、腦室內、腰穿刺或鼻內投與，將該重組核苷酸表現載體遞送至該人類個體之該CSF。 19.如段落8至18中任一項使用之重組核苷酸表現載體，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。 20.一種用於治療診斷患有MPS II之人類個體之調配物，其包含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中該調配物適合於向人類大腦之CSF投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。3.1.3. 組 3 1.一種經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體之用途，其用於製造用於治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體的藥物，其中該經糖基化重組人類IDS前體由人類神經元或人類膠細胞產生，且其中該治療包含向該人類個體之腦脊髓液(CSF)遞送治療有效量之該經糖基化重組人類IDS前體。 2.如段落1之用途，其中該經糖基化重組人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測。 3.如段落1之用途，其中該經糖基化重組人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 4.如段落1至3中任一項之用途，其中該經糖基化重組人類IDS前體分泌自該中樞神經系統中之細胞庫，該等細胞經基因工程改造以分泌該經糖基化重組人類IDS前體。 5.如段落4之用途，其中該庫在人類個體之大腦中形成。 6.如段落1至5中任一項之用途，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。 7.如段落1至6中任一項之用途，其中該經糖基化重組人類IDS前體包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 8.一種編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體之用途，其用於製造用於治療診斷患有MPS II之人類個體的藥物，其中當用於轉導培養物中之初代人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引導分泌性經糖基化人類IDS前體之表現，該分泌性經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的，且其中該治療包含向該人類個體之該CSF投與該重組核苷酸表現載體。 9.一種編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體之用途，其用於製造用於治療診斷患有MPS II之人類個體的藥物，其中該重組核苷酸表現載體適合於向人類大腦之腦脊髓液投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的，且其中該治療包含向該人類個體之該CSF投與該重組核苷酸表現載體。 10.如段落9之用途，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌藉由利用細胞培養物中之該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。 11.如段落9或10之用途，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌係在存在及不存在甘露糖-6-磷酸之情況下來確認。 12.如段落8至11中任一項之用途，其中該人類IDS包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 13.如段落8至12中任一項之用途，其中該重組核苷酸表現載體包含控制人類神經元細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的神經元特異性啟動子、或控制人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的膠細胞特異性啟動子。 14.如段落8至13中任一項之用途，其中該重組核苷酸表現載體編碼前導肽，該前導肽確保人類神經元細胞或人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之恰當共轉譯及轉譯後加工。 15.如段落8至14中任一項之用途，其中該重組核苷酸表現載體為AAV載體。 16.如段落15之用途，其中該重組核苷酸表現載體為複製缺陷性AAV載體。 17.如段落15或16之用途，其中該重組核苷酸表現載體為AAV9或AAVrh10載體。 18.如段落8至17中任一項之用途，其中藉由鞘內、腦室內、腰穿刺或鼻內投與，將該重組核苷酸表現載體遞送至該人類個體之該CSF。 19.如段落8至18中任一項之用途，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。 20.一種調配物之用途，其用於製造用於治療診斷患有MPS II之人類個體的藥物，其中該調配物包含編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，且其中該調配物適合於向人類大腦之CSF投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。3.1.4. 組 4 1.一種用於治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之腦脊髓液(CSF)遞送治療有效量之由人類神經元或人類膠細胞產生的經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體。 2.如段落1之方法，其中該經糖基化重組人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測。 3.如段落1之方法，其中該經糖基化重組人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 4.如段落1至3中任一項之方法，其中該經糖基化重組人類IDS前體分泌自該中樞神經系統中之細胞庫，該等細胞經基因工程改造以分泌該經糖基化重組人類IDS前體。 5.如段落4之方法，其中該庫在人類個體之大腦中形成。 6.如段落1至5中任一項之方法，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。 7.如段落1至6中任一項之方法，其中該經糖基化重組人類IDS前體包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 8.一種用於治療診斷患有MPS II之人類個體之方法，其包含向該人類個體之CSF投與編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中當用於轉導培養物中之初代人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引導分泌性經糖基化人類IDS前體之表現，該分泌性經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 9.一種用於治療診斷患有MPS II之人類個體之方法，其包含向該人類個體之CSF投與編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。 10.如段落9之方法，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌藉由利用細胞培養物中之該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。 11.如段落9或10之方法，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌係在存在及不存在甘露糖-6-磷酸之情況下來確認。 12.如段落8至11中任一項之方法，其中該人類IDS包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 13.如段落8至12中任一項之方法，其中該重組核苷酸表現載體包含控制人類神經元細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的神經元特異性啟動子、或控制人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的膠細胞特異性啟動子。 14.如段落8至13中任一項之方法，其中該重組核苷酸表現載體編碼前導肽，該前導肽確保人類神經元細胞或人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之恰當共轉譯及轉譯後加工。 15.如段落8至14中任一項之方法，其中該重組核苷酸表現載體為AAV載體。 16.如段落15之方法，其中該重組核苷酸表現載體為複製缺陷性AAV載體。 17.如段落15或16之方法，其中該重組核苷酸表現載體為AAV9或AAVrh10載體。 18.如段落8至17中任一項之方法，其中藉由鞘內、腦室內、腰穿刺或鼻內投與，將該重組核苷酸表現載體遞送至該人類個體之該CSF。 19.如段落8至18中任一項之方法，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。 20.一種用於治療診斷患有MPS II之人類個體之方法，其包含向該人類個體之CSF投與包含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體之調配物，其中該調配物適合於向人類大腦之CSF投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。3.1.5. 組 5 1.一種用於治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之腦脊髓液(CSF)遞送治療有效量之由人類神經元或人類膠細胞產生的經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體。 2.一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含： 向該人類個體之腦脊髓液(CSF)遞送治療有效量之經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體，該經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，在C84 處具有甲醯基甘胺酸殘基(圖1)，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，且為甘露糖-6-磷酸化的。 3.一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含： 向該人類個體之腦脊髓液(CSF)遞送治療有效量之經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體，該經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，在C84 處具有甲醯基甘胺酸殘基(圖1)，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc及/或α-Gal抗原，且為甘露糖-6-磷酸化的。 4.如段落1至3中任一項之方法，其中將該經糖基化重組人類IDS前體自該中樞神經系統中經基因工程改造分泌該經糖基化重組人類IDS前體至該CSF中之細胞庫遞送至該CSF。 5.如段落4之方法，其中該庫在該人類個體之大腦中形成。 6.如段落1至5中任一項之方法，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。 7.如段落1至6中任一項之方法，其中該經糖基化重組人類IDS前體包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 8.一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之腦脊髓液(CSF)投與編碼人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)的重組核苷酸表現載體，其中當用於轉導培養物中之初代人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引導分泌性經糖基化人類IDS前體之表現，該分泌性經糖基化人類IDS前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，在C84 處具有甲醯基甘胺酸殘基(圖1)，為α2,6-唾液酸化及甘露糖-6-磷酸化的。 9.一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含： 向該人類個體之大腦腦脊髓液投與治療有效量之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，使得庫在該個體之分泌經糖基化人類IDS前體的中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體為α2,6-唾液酸化及甘露糖-6-磷酸化的。 10.如段落9之方法，其中為α2,6-唾液酸化之該經糖基化人類IDS前體之分泌藉由在細胞培養物中利用該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。 11.如段落9之方法，其中為甘露糖-6-磷酸化之該經糖基化人類IDS前體之分泌藉由在細胞培養物中利用該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。 12.如段落10或11之方法，其中在存在及不存在甘露糖-6-磷酸之情況下確認分泌。 13.一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含： 向該人類個體之大腦腦脊髓液投與治療有效量之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，使得形成分泌含有α2,6-唾液酸化聚糖的經糖基化人類IDS前體的庫； 其中當用於在培養物中轉導人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引起在該細胞培養物中分泌含有α2,6-唾液酸化聚糖的該經糖基化人類IDS前體。 14.一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含： 向該人類個體之大腦腦脊髓液投與治療有效量之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，使得形成分泌含有甘露糖-6-磷酸的經糖基化人類IDS前體的庫； 其中當用於在培養物中轉導人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引起在該細胞培養物中分泌為甘露糖-6-磷酸化的該經糖基化人類IDS前體。 15.一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含： 向該人類個體之大腦腦脊髓液投與治療有效量之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，使得形成分泌含有甲醯基甘胺酸的經糖基化人類IDS前體的庫； 其中當用於在培養物中轉導人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引起在該細胞培養物中分泌含有甲醯基甘胺酸的該經糖基化人類IDS前體。 16.如段落8至15中任一項之方法，其中該人類IDS包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 17.如段落8至15中任一項之方法，其中該重組核苷酸表現載體編碼前導肽。 18.如段落8至15中任一項之方法，其中該重組核苷酸表現載體為複製缺陷性AAV載體。 19.如段落8至15中任一項之方法，其中藉由鞘內、腦室內、腰穿刺或鼻內投與將該重組核苷酸表現載體遞送至該人類個體之該CSF。 20.如段落8至15中任一項之方法，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2017年4月14日申請之美國臨時專利申請案第62/485,659號、2017年10月18日申請之美國臨時專利申請案第62/573,921號、2017年10月19日申請之美國臨時專利申請案第62/574,355號及2017年10月31日申請之美國臨時專利申請案第62/579,686號的權益，該等申請案以全文引用之方式併入本文中。對以電子方式提交之序列表之參考 本申請案以引用之方式併入隨本申請案一起提交的序列表，其呈2018年4月3日創建的名稱為「Sequence_Listing_12656-104-228.TXT」且大小為166,497位元組之正文檔案形式。 本發明涉及向診斷患有黏多醣病II (MPS II)之人類個體之中樞神經系統(CNS)之腦脊髓液(CSF)遞送由人類神經元或膠細胞產生的重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(rhIDS)，該人類個體包括(但不限於)診斷患有亨特症候群的患者。關於可根據本文中所描述之本發明使用之組合物及方法，亦參見2017年4月14日申請之國際專利申請案第PCT/US2017/027770號(公開為2017年10月19日之WO/2017/181113)，其以全文引用的方式併入本文中。 在一較佳實施例中，經由基因療法，例如藉由向診斷患有MPS II之患者(人類個體)之CSF投與編碼人類IDS (hIDS)或hIDS之衍生物的病毒載體或其他DNA表現構築體，從而產生向CNS持續供應轉基因產物的轉導神經元及/或膠細胞永久性庫，來實現治療。至CSF中之分泌自神經元/膠細胞庫之rhIDS將被CNS中之細胞內吞，從而引起接受者細胞中之酶促缺陷的「交叉校正」。此外，已出乎意料地發現，CNS中之經轉導神經及膠細胞庫可將重組酶遞送至CNS及全身兩者，此可降低或消除對全身性治療(例如每週i.v.注射酶)之需求。 在一替代實施例中，hIDS可由細胞培養物(例如生物反應器)中之人類神經元或膠細胞產生，且例如藉由將酶注入至CSF中，直接注入至CNS中及/或全身，作為酶置換療法(「ERT」)而投與。然而，基因療法提供優於ERT的若干優勢，此係由於酶之全身遞送將不會引起治療CNS，因為酶不能跨越血腦障壁；以及不同於本發明之基因療法，將酶直接遞送至CSF及/或CNS，將需要重複注射，此不僅為繁重的，而且具有感染風險。 由轉基因編碼之hIDS可包括(但不限於)：人類IDS (hIDS) (如圖1中所展示)，其具有SEQ ID NO. 1之胺基酸序列；及hIDS之衍生物，其具有胺基酸取代、缺失或添加，例如包括(但不限於)選自展示於圖2中之IDS異種同源物中之對應非保守殘基之胺基酸取代，其限制條件為，此類突變不包括位置84處之半胱胺酸殘基(C84)的置換，該位置84處之半胱胺酸殘基為酶活性所需的(Millat等人, 1997, Biochem J 326: 243-247)；或已在重度、重度-中度、中度或減弱MPS II表型中鑑別的突變，例如如圖3中所展示的，或如由Sukegawa-Hayasaka等人, 2006, J Inhert Metab Dis 29: 755-761 (報導「減弱的」突變R48P、A85T、W337R，及截斷突變Q531X；以及「嚴重」突變P86L、S333L、S349I、R468Q、R468L)；Millat等人, 1998, BBA 1406: 214-218 (報導「減弱的」突變P480L及P480Q；以及「嚴重」突變P86L)；以及Bonucelli等人, 2001, BBA 1537:233-238中所報導的，其各者以全文引用的方式併入本文中。 舉例而言，hIDS之特定位置處之胺基酸取代可選自圖2中所比對之IDS異種同源物中之彼位置處發現的對應非保守胺基酸殘基，其限制條件為，此類取代不包括展示於圖3中或如由Sukegawa-Hayasaka等人, 2006, 同前文獻；Millat等人, 1998,同前文獻；或Bonucelli等人, 2001, 同前文獻中所報導的有害突變中的任一者，各文獻以全文引用的方式併入本文中。可使用在活體外、細胞培養物或測試動物分析中之習知分析來測試所得轉基因產物，以確保突變並不破壞IDS功能。所選擇之較佳胺基酸取代、缺失或添加應為保持或增加IDS之酶活性、穩定性或半衰期的彼等，如藉由在活體外、MPS II細胞培養物或動物模型中之習知分析所測試。舉例而言，可使用習知酶分析利用例如4-甲基香豆素基α-L-吡喃艾杜糖醛酸2-硫酸鹽或4-甲基香豆素基硫酸鹽作為受質，來評定轉基因產物之酶活性(對於可使用之例示性IDS酶分析，參見例如Lee等人, 2015, Clin. Biochem. 48(18):1350-1353，Dean等人, 2006, Clin. Chem. 52(4):643-649，其各者以全文引用的方式併入本文中)。可在細胞培養物中評定轉基因產物校正MPS II表型之能力；例如藉由利用編碼hIDS或衍生物之病毒載體或其他DNA表現構築體轉導培養物中之MPS II細胞；藉由向培養物中之MPS II細胞添加轉基因產物或衍生物；或藉由將MPS II細胞與經工程改造表現並分泌rhIDS一衍生物之人類神經元/宿主膠細胞一起共培養，及例如藉由偵測IDS酶活性及/或培養物中之MPS II細胞中之GAG儲存的減少來測定MPS II培養細胞中的缺陷的校正(參見例如Stroncek等人, 1999, Transfusion 39(4):343-350，其以全文引用的方式併入本文中)。 已描述可用於評定本文中所描述之療法之MPS II的動物模型。舉例而言，藉由利用新黴素抗性基因置換IDS 基因之外顯子4及5來工程改造MPS II的基因敲除小鼠模型(IDS基因敲除)。(Garcia等人, 2007, J Inherit Metab Dis 30: 924-34)。此IDS基因敲除小鼠展現許多MPS II之特徵，包括骨骼異常、肝脾腫大、泌尿及組織GAG提高及大腦儲存病變(Muenzer等人, 2001, Acta Paediatr增刊91:98-99)；且用於評定MPS II中之酶置換療法在支援ERT臨床試驗上的效果。因此，此小鼠模型為為了研究基因療法遞送由神經元或膠細胞產生的rIDS作為MPS II之治療的效果的相關模型(參見例如，Polito及Cosma, 2009, Am. J. Hum. Genet. 85(2):296-301，其以全文引用的方式併入本文中)。 較佳地，由人類神經元/膠細胞產生的hIDS轉基因應受在神經元及/或膠細胞中起作用之表現控制元件(例如CB7啟動子(雞β-肌動蛋白啟動子及CMV增強子))控制，且可包括增強由載體驅動之轉基因之表現的其他表現控制元件(例如雞β-肌動蛋白內含子及兔β-血球蛋白polyA信號)。hIDS轉基因之cDNA構築體應包括確保由經轉導CNS細胞恰當共轉譯及轉譯後加工(糖基化及蛋白質硫酸化)之信號肽的編碼序列。由CNS細胞使用之此類信號肽可包括但不限於： ●寡樹突神經膠細胞-髓鞘糖蛋白(hOMG)信號肽： MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC (SEQ ID NO:2) ● E1A刺激基因2之細胞抑制子(hCREG2)信號肽： MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG (SEQ ID NO:3) ●含有2B之V集及跨膜域(hVSTM2B)信號肽： MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLFVADA (SEQ ID NO:4) ●原鈣黏著蛋白α-1 (hPCADHA1)信號肽： MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG (SEQ ID NO:5) ● FAM19A1 (TAFA1)信號肽： MAMVSAMSWVLYLWISACA (SEQ ID NO:6) ●介白素-2信號肽： MYRMQLLSCIALILALVTNS (SEQ ID NO:14) 信號肽亦可在本文中被稱作為前導序列或前導肽。 用於遞送轉基因之重組載體應對於CNS中之細胞具有趨向性，該等細胞包括但限於神經元及/或膠細胞。此類載體可包括非複製重組腺相關病毒載體(「rAAV」)，特定言之攜帶AAV9或AAVrh10衣殼之彼等為較佳的。可使用AAV變體衣殼，包括(但不限於)由Wilson在美國專利第7,906,111號(其以全文引用的方式併入本文中)中所描述之彼等，其中AAV/hu.31及AAV/hu.32尤其較佳；以及由Chatterjee在美國專利第8,628,966號、美國專利第8,927,514號及Smith等人, 2014, Mol Ther 22: 1625-1634 (其各者以全文引用的方式併入本文中)中所描述之AAV變體衣殼。然而，可使用其他病毒載體，包括(但不限於)慢病毒載體、牛痘病毒載體或被稱作「裸DNA」構築體之非病毒表現載體。 適合於向CSF投與之醫藥組合物包含rhIDS載體於調配物緩衝液中之懸浮液，該調配物緩衝液包含生理學上相容的水性緩衝劑、界面活性劑及視情況存在之賦形劑。在某些實施例中，醫藥組合物適合於鞘內投與。在某些實施例中，醫藥組合物適合於腦池內投與(注射至大池中)。在某些實施例中，醫藥組合物適合於經由C1-2穿刺注射至蛛膜下空間中。在某些實施例中，醫藥組合物適合於腦室內投與。在某些實施例中，醫藥組合物適合於經由腰穿刺投與。 應經由鞘內投與(亦即注射至蛛膜下空間中，使得重組載體經由CSF分配且轉導CNS中之細胞)向CSF投與治療有效劑量的重組載體。此可以多種方式，例如藉由顱內(腦池或腦室)注射、或注射至腰池中來實現。舉例而言，可藉由CT引導的枕下穿刺來進行腦池內(IC)注射(至大池中)；或當對於患者為可行的時，可經由C1-2穿刺來進行注射至蛛膜下空間中；或可使用腰穿刺(通常為了收集CSF樣本而進行之診斷性步驟)來進入CSF。或者，可使用腦室內(ICV)投與(用於引入不穿過血腦障壁之抗感染或抗癌藥物的更好的侵入性技術)來直接將重組載體滴注至大腦腦室中。或者，可使用鼻內投與來將重組載體遞送至CNS。 因為在發育兒童中提早發生之相對快速大腦生長，所以投與IC之AAV9.hIDS之總劑量取決於跨越不同年齡層所假定的大腦質量。關於研究個體之按年齡的大腦質量，參見例如AS Dekaban, Ann Neurol, 1978 Oct; 4(4): 345-56。 表：按年齡投與之總劑量 CSF濃度可藉由直接量測獲自枕骨之CSF液體或腰穿刺物中之rhIDS之濃度來監測，或藉由自患者血清中偵測到之rhIDS濃度外推來評估。 藉助於背景技術，將人類IDS轉譯為含有圖1中所描繪之八個潛在N-糖基化位點(N31 、N115 、N144 、N246 、N280 、N325 、N513 及N537 )的550個胺基酸多肽，且包括在加工期間裂解的25個胺基酸信號序列。在於高基氏體中修飾初始76 kDa胞內前體寡醣鏈之後，其轉化成磷酸化的90 kDa前體。藉由糖基化修飾及蛋白質裂解經由各種胞內中間物將此前體加工成主要55 kDa形式。概言之，在移除25個胺基酸信號序列之後，蛋白水解加工涉及：N31 下游之N端蛋白質裂解，移除八個胺基酸(殘基26-33)之前肽；及N513 上游之C端蛋白質裂解，其釋放18 kDa多肽且產生轉化成55 kDa成熟形式之62 kDa中間物。進一步蛋白質裂解產生位於溶酶體腔室中之45 kDa成熟形式。(對於自Millat等人, 1997, Exp Cell Res 230: 362-367 (「Millat 1997」)；Millat等人 1997, Biochem J. 326: 243-247 (「Millat 1997a」)；以及Froissart等人, 1995, Biochem J. 309:425-430再現的圖式，參見圖4，該等文獻各者以全文引用的方式併入本文中)。 酶活性所需之C84 之甲醯基甘胺酸修飾(在圖1中以粗體展示)可能作為早期轉譯後或共轉譯事件，最可能在內質網中發生。(參見Millat 1997a, citing Schmidt等人, 1995, Cell 82: 271-278)。在高基氏體中繼續轉譯後加工，包括添加含聚糖之唾液酸之複合物及獲得標記用於遞送至溶酶體腔室之酶的甘露糖-6-磷酸殘基。(對於簡明綜述，參見Clarke, 2008, Expert Opin Pharmacother 9: 311-317，其以全文引用的方式併入本文中)。儘管無單一糖基化位點為IDS穩定性所必須的，但位置N280 處之糖基化對於細胞內化及經由甘露糖-6-磷酸(M6P)受體之溶酶體靶向為重要的。(Chung等人, 2014, Glycoconj J 31:309-315在第310頁第一行)。在正常生理狀態下，IDS以極低含量產生，且自細胞分泌極少的酶(若存在)。(Clarke, 2008,同前文獻)。 本發明部分地基於以下原理： (i) CNS中之神經元及膠細胞為CNS中之擁有轉譯後加工分泌蛋白之細胞機制的分泌細胞，該轉譯後加工包括糖基化、甘露糖-6-磷酸化及酪胺酸-O-硫酸化穩固過程。對於由人類CNS細胞進行之轉譯後修飾，參見例如Sleat等人, 2005, Proteomics 5: 1520-1532，及Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98，其描述人類大腦甘露糖-6-磷酸糖蛋白質組，且提及，大腦含有具有比在其他組織中發現的高許多數目之個別同功異型物及甘露糖-6-磷酸化蛋白質的更多的蛋白質；以及Kanan等人, 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567，及Kanan及Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131，報導由神經元細胞分泌的酪胺酸硫酸化糖蛋白的生產，其各者以全文引用的方式併入本文中。 (ii)人類大腦產生多種天然/原生IDS之同功異型物。特定言之，人類大腦甘露糖-6-磷酸化糖蛋白之N端定序揭露，大腦中之hIDS變體之成熟42 kDa鏈之N端序列在如下位置34或36處開始：T34 DALNVLLI；以及A36 LNVLLIIV。(Sleat, 2005, Proteomics 5: 1520-1532, 表S2)。發現八個N-連接糖基化位點中之兩個(即N280 及N116 )在獲自人類大腦之IDS中為甘露糖-6-磷酸化的。(Sleat等人, 2006, Mol & Cell Proeomics 5.4: 686-701, 在表V處報導)。 (iii)在hIDS加工期間，兩個多肽(76 kDa及90 kDa)由神經細胞及膠細胞分泌，但僅90 kDa多肽為甘露糖-6-磷酸化的，其為分泌形式之酶達成交叉校正所必需的。(參見Millat, 1997，圖1為經轉導類淋巴母細胞細胞之結果；及Froissart 1995，圖4展示經轉導纖維母細胞中之類似結果，在培養基中，僅90 kDa形式為磷酸化的)。有趣的是，已證明，由神經元及膠細胞產生的重組IDS可比由其他細胞(諸如腎臟)產生的重組IDS，更易於由接受者CNS細胞內吞。Daniele 2002表明，M6P受體介導由非轉導神經元及膠細胞之接受者群體對來自經轉導神經元及膠細胞培養物之改良性培養基的重組IDS的內吞作用，該等重組IDS恰當地將前體加工成45 kDa成熟活性形式。由神經元及膠細胞株產生的重組IDS之攝取(74%，內吞作用)遠超過由腎細胞株產生的酶之攝取(5.6%，內吞作用)。在各情況下，攝取受M6P抑制，指示重組IDS攝取為M6P受體介導的。(參見Daniele 2002，表2及4，以及下表1中概述之在第205-206頁的結果的隨附描述)。表 1 . Daniele 2002 中 報導 之 結果之概述 (iv)本文中所描述之基因療法應引起約90 kDa (如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測) (取決於所使用之分析)之hIDS糖蛋白前體連續分泌，該hIDS糖蛋白前體為酶活性的。首先，在人類大腦之大腦皮質中表現引起為IDS活性所需之C84 之甲醯基甘胺酸修飾的酶——FGly產生酶(FGE，亦稱為SUMF1) (可在例如http://www.genecards.org找到關於SUMF1之基因表現資料)。其次，應吸收由經轉導神經元及膠細胞原位產生的分泌性經糖基化/磷酸化rIDS，且由CNS中之未轉導之神經及膠細胞正確地加工。在不受任何理論束縛之情況下，顯然，若向CNS投與，則由基因療法原位生產的分泌性rhIDS前體可比ERT使用之傳統重組酶更易於由CNS中之接受者細胞內吞。舉例而言，Elaprase® (在HT1080 (一種纖維肉瘤細胞株)中製備)為一種據報導分子量約為76 kDa之純化蛋白，不是呈現更大量磷酸化、由神經元及膠細胞分泌的90 kDa物種。儘管八個N-連接糖基化位點據報導完全佔據Elaprase® ，且含有兩個雙甘露糖-6-磷酸末端聚糖以及複合高度唾液酸化聚糖，但C84 轉譯後修飾為FGly (其為酶活性的絕對要求)僅約50%。(Clarke, 2008, Expert Opin Pharmacother 9:311-317；Elaprase® 全部處方資訊及EMA申請)。在CHO細胞中製備另一重組產物Hunterase® 。儘管據報導具有比Elaprase® 更高的FGly及活性，但甘露糖-6-磷酸化及攝取確實不同。(Chung, 2014, Glycoconj J 31:309-315)。 (v)活體內胞外IDS功效取決於經由甘露糖-6-磷酸(M6P)之攝取(細胞及溶酶體內化)及其活性位點甲醯基甘胺酸(FGly)，該甲醯基甘胺酸經由由甲醯基甘胺酸產生酶之轉譯後修飾自C84 轉化。如以上表1中所展示，大腦細胞(神經元及膠細胞)展示，當與由經轉導神經元及膠細胞分泌之IDS前體介質一起培育時，比與由經基因工程改造腎細胞分泌之IDS前體介質一起培育時更高的酶活性。所得活性增加五倍可能歸因於IDS之有效攝取(參見Daniele 2002，表2及4)。商業形式之IDS (其由CHO細胞或HT-1080細胞產生)之FGly含量約為50%至70%，該FGly含量決定酶活性。然而，神經元及膠細胞可改良此活性，此係歸因於IDS攝取之改良。 (vi)溶酶體蛋白(包括IDS)之細胞及次細胞遷移/攝取係經由M6P。來自大腦細胞之IDS可能含有較高M6P含量，如Daniele 2002中及Sleat, Proteomics, 2005中所報導(指示人類大腦含有比其他組織更多(在定量及定性意義兩者上)的Man6-P糖蛋白)。可能量測IDS前體之M6P含量，如Daniele 2002中所進行。在抑制性M6P (例如5 mM)存在下，預測由非神經元或非膠細胞(諸如Daniele 2002之經基因工程改造腎細胞)產生的IDS前體之攝取降低至接近於對照細胞之含量，如Daniele 2002中所展示。同時在抑制性M6P存在下，預測由大腦細胞(諸如神經元及膠細胞)產生的IDS前體之攝取仍處於高含量下，如Daniele 2002中所展示，其中攝取比對照細胞高四倍，且與在不存在抑制性M6P之情況下由經基因工程改造腎細胞產生的IDS前體之IDS活性(或攝取)含量相當。此分析允許一種預測由大腦細胞產生的IDS前體中之M6P含量的方法，且特定言之，與由不同類型之細胞產生的IDS前體中之M6P含量進行比較。本文中所描述之基因療法應引起hIDS前體之連續分泌，在此類分析中，該hIDS前體可在抑制性M6P存在下以高含量吸收至神經元及膠細胞中。 (vii) IDS前體之M6P含量及攝取亦可由90 kDa及76 kDa凝膠帶(例如SDS-PAGE凝膠帶)證實。90 kDa據報導為高度糖基化/磷酸化的，且含有M6P，而76 kDa則不是如此。可將在76 kDa至95 kDa範圍內且平均MW為80-85 kDa之極寬凝膠帶(類似於由經基因工程改造腎細胞產生的IDS前體凝膠帶(Daniele 2002，圖1))，與由大腦細胞產生的IDS前體之凝膠帶相對照。在Daniele 2002中，不能為凝膠帶，此係歸因於不能免疫沈澱IDS前體。本文中所描述之基因療法應引起不同於由經基因工程改造腎細胞產生的IDS前體凝膠帶的hIDS前體的連續分泌。(viii)商業IDS前體之M6P含量為2至2.5 mol/mol，其大部分以二磷酸化聚糖形式存在。儘管平均地，每一IDS前體為磷酸化的，但聚糖之常態分佈將為，一些IDS前體具有2、1及0個二磷酸化M6P聚糖，呈現多個磷酸化位點。在多個磷酸化之情況下，攝取速率應顯著較高。 (ix)由人類CNS細胞之hIDS之糖基化將引起添加聚糖，此可改良轉基因產物之穩定性、半衰期及降低其非所需聚集。顯著地，添加至本發明之hIDS之聚糖包括2,6-唾液酸，其結合Neu5Ac (「NANA」)而非其羥基化衍生物NeuGc (N-羥乙醯基神經胺糖酸，亦即「NGNA」或「Neu5Gc」)。此類聚糖在於CHO細胞中製備之重組IDS產物(諸如Hunterase® )中不存在，此係因為CHO細胞不具有製備此轉譯後修飾所需之2,6-唾液酸轉移酶；且CHO細胞不產生等分GlcNAc，但其確實添加Neu5Gc (NGNA)而非Neu5Ac (NANA)作為對於人類不典型(且可能免疫原性)的唾液酸。參見例如Dumont等人, 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 (早期線上第1-13頁，第5頁處)；以及Hague等人, 1998 Electrophor 19:2612-2630 (「[t]he CHO cell line is considered 『phenotypically restricted』, in terms of glycosylation, due to the lack of an α2,6-sialyl-transferase」)。此外，CHO細胞亦可產生免疫原性聚糖α-Gal抗原，其與大部分個體中存在之抗α-Gal抗體反應，且在高濃度下可觸發過敏反應。參見例如Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156。本發明之rhIDS之人類糖基化模式應降低轉基因產物該免疫原性且改良功效。 (x)轉基因產物之免疫原性可由各種因子誘導，包括患者之免疫狀況、所輸注蛋白藥物之結構及特徵、投與途徑及治療持續時間。過程相關雜質(諸如宿主細胞蛋白(HCP)、宿主細胞DNA及化學殘餘物)及產物相關雜質(諸如蛋白質降解產物)以及結構特徵(諸如糖基化、氧化及聚集(低於可見的粒子))，亦可藉由充當增強免疫反應之佐劑而增加免疫原性。過程相關雜質及產物相關雜質之量可受以下製造方法影響：細胞培養物、純化、配方、儲存及操作，其可影響商業製造的IDS產品。在基因療法中，在活體內產生蛋白質，使得不存在過程相關雜質，且蛋白質產物不可能含有產物相關的雜質/與由重組技術產生的蛋白質相關的降解產物，諸如蛋白質聚集及蛋白質氧化。聚集例如與歸因於高蛋白濃度之蛋白質生產及儲存、與生產設備及容器相互作用之表面及利用某些緩衝液系統的純化過程相關。但當在活體內表現轉基因時不存在促進聚集的此等狀況。氧化(諸如甲硫胺酸、色胺酸及組胺酸氧化)亦與蛋白質生產及儲存相關，例如由脅迫細胞培養條件、金屬與空氣接觸及緩衝液與賦形劑中之雜質引起。活體內表現之蛋白質亦可在脅迫條件下氧化，但人類(如許多生物體)配備有抗氧化防衛系統，其不僅降低氧化脅迫，且亦可修復及/或逆轉氧化。因此，活體內生產之蛋白質不大可能呈氧化形式。聚集及氧化兩者均可影響效能、藥物動力學(清除)，且可增加免疫原性問題。本文中所描述之基因療法應引起具有相比於商業製造產品免疫原性降低之hIDS前體的連續分泌。 (xi)除N-連接糖基化位點以外，hIDS含有酪胺酸(「Y」)硫酸化位點(PSSEKY165 ENTKTCRGPD)。(對於酪胺酸殘基周圍經受蛋白質酪胺酸硫酸化之胺基酸之分析，參見例如Yang等人, 2015, Molecules 20:2138-2164, 尤其在第2154頁，其以全文引用的方式併入本文中。「規則」可概述如下：具有E或D之Y殘基在Y之+5至-5位置內，且其中位置Y之-1為中性或酸性帶電荷胺基酸而非鹼性胺基酸，例如破壞硫酸化之R、K或H)。在不意欲受任何理論束縛之情況下，hIDS中之此位點之硫酸化可改良酶之穩定性及針對受質之結合親和性。hIDS之酪胺酸硫酸化(一種人類CNS細胞中之穩定轉譯後加工)應引起轉基因產物之加工及活性改良。尚未闡明溶酶體蛋白之酪胺酸硫酸化的重要性；但在其他蛋白質中，已展示增加蛋白-蛋白相互作用(抗體與受體)之親合力，且促進蛋白水解加工(肽激素)。(參見Moore, 2003, J Biol. Chem. 278: 24243-46；以及Bundegaard等人, 1995, The EMBO J 14: 3073-79)。在大腦中明顯地以較高含量(基於mRNA)表現引起酪胺酸硫酸化(其可作為IDS加工中之最終步驟發生)之酪胺醯蛋白磺基轉移酶(TPST1) (TPST1之基因表現資料可在EMBL-EBI Expression Atlas (可在http://www.ebi.ac.uk/gxa/home獲得)處找到)。此類轉譯後修飾充其量在CHO細胞產品中受到限制。不同於人類CNS細胞，CHO細胞不為分泌細胞且轉譯後酪胺酸硫酸化之能力有限。(參見例如Mikkelsen及Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537，尤其在第1537頁處之論述)。 對於前述原因，由人類神經元及/或膠細胞生產rhIDS，應引起用於治療MPS II之「生物較佳」分子，該治療經由基因療法例如藉由來實現，向診斷患有MPS II疾病(包括(但不限於)亨特疾病)之患者(人類個體) CSF投與編碼rhIDS的病毒載體或其他DNA表現構築體，在CNS中產生持續供應由經轉導CNS細胞分泌的全人類經糖基化甘露糖-6-磷酸化、硫酸化轉基因產物的永久性庫。自庫分泌至CSF中之hIDS轉基因產物將由CNS中之細胞內吞，引起MPS II接受者細胞中之酶促缺陷的「交叉校正」。在基因療法或蛋白質療法中產生的每一rhIDS分子完全糖基化、磷酸化及硫酸化，為不必要的。相反，所產生的糖蛋白群體應具有足夠的糖基化(包括2,6-唾液酸化及甘露糖-6-磷酸化)及硫酸化，以展現功效。本發明之基因療法之目標為減緩或遏止疾病之進展。可藉由量測認知功能(例如預防或降低神經認知下降)、CSF及/或血清中之疾病生物標記(諸如GAG)降低；及/或CSF及/或血清中之IDS酶活性增加來監測功效。亦可監測發炎症狀及其他安全性事件。 作為基因療法之替代例或額外治療，可藉由重組DNA技術在人類神經或膠細胞株中生產rhIDS糖蛋白，且可向診斷患有MPS II之患者全身性投與糖蛋白及/或投與至CSF中以用於ERT。可用於此類重組糖蛋白生產之人類細胞株包括(但不限於)HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11或ReNcell VM (關於可用於重組生產rHuGlyIDS糖蛋白之人類細胞株之綜述，參見例如Dumont等人, 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 「Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives」，其以全文引用的方式併入本文中)。為了確保完成糖基化，尤其唾液酸化及酪胺酸硫酸化，可藉由將宿主細胞工程改造為共表現引起酪胺酸-O-硫酸化之α-2,6-唾液酸轉移酶(或α-2,3-及α-2,6-唾液酸轉移酶)及/或TPST-1及TPST-2酶，來強化用於生產之細胞株。 儘管rhIDS之遞送應使免疫反應降至最低，但與CNS定向基因療法相關的最清晰潛在毒性來源，在呈IDS基因缺陷型且因此有可能呈蛋白質及/或用於遞送轉基因之載體不耐受之人類個體中產生針對所表現rhIDS蛋白的免疫性。 因此，在一較佳實施例中，尤其當治療患有重度疾病、已接近零IDS含量之患者時，與免疫抑制療法一起共治療患者為合理的。可使用涉及與黴酚酸組合之他克莫司(tacrolimus)或雷帕黴素(rapamycin) (西羅莫司(sirolimus))之方案或組織移植過程中使用之其他免疫抑制方案的免疫抑制療法。可在基因療法時程期間投與此類免疫抑制治療，且在某些實施例中，利用免疫抑制療法之預處理可為較佳的。基於治療醫師之判斷，可在基因療法治療之後繼續免疫抑制療法，且其後(例如在180天之後)當誘導免疫耐受性時可撤回。本發明之方法涵蓋將rhIDS遞送至CSF與其他可用治療之遞送的組合。可在基因療法治療之前、同時或之後投與額外治療。可與本發明之基因療法組合之MPS II的可用治療包括(但不限於)使用全身性投與Elaprase® 或投與Elaprase® 至CSF的酶置換療法；及/或HSCT療法。 在某些實施例中，本文中描述一種用於治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之腦脊髓液(CSF)遞送治療有效量之由人類神經元或人類膠細胞產生的重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體。 在某些實施例中，本文中描述一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之腦脊髓液(CSF)遞送治療有效量之重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)醣蛋白前體，該重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶醣蛋白前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，在C84 處具有甲醯基甘胺酸殘基(圖1)，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，且為甘露糖-6-磷酸化的。 在某些實施例中，本文中描述一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之腦脊髓液(CSF)遞送治療有效量之重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)醣蛋白前體，該重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶醣蛋白前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，在C84 處具有甲醯基甘胺酸殘基(圖1)，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc及/或α-Gal抗原，且為甘露糖-6-磷酸化的。 在某些實施例中，將人類IDS前體自經基因工程改造分泌該IDS前體至CSF中之中樞神經系統中之細胞庫遞送至CSF。在某些實施例中，庫在個體之大腦中形成。在某些實施例中，人類個體為IDS活性缺陷型。在某些實施例中，人類IDS包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。 在某些實施例中，本文中描述一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之腦脊髓液(CSF)投與編碼人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)的重組核苷酸表現載體，其中當用於轉導培養物中之初代人類神經元細胞時，該表現載體引導分泌性人類IDS醣蛋白前體之表現，該分泌性人類IDS醣蛋白前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，在C84 處具有甲醯基甘胺酸殘基(圖1)，為α2,6-唾液酸化及甘露糖-6-磷酸化的。 在某些實施例中，本文中描述一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之大腦腦脊髓液投與治療有效量之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，使得庫在分泌重組人類IDS醣蛋白前體的個體中樞神經系統中形成，該重組人類IDS醣蛋白前體為α2,6-唾液酸化及甘露糖-6-磷酸化的。 在某些實施例中，為α2,6-唾液酸化之該重組人類IDS醣蛋白前體之分泌藉由在細胞培養物中利用該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。在某些實施例中，為甘露糖-6-磷酸化之該重組人類IDS醣蛋白前體之分泌藉由在細胞培養物中利用該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。在某些實施例中，在存在及不存在甘露糖-6-磷酸之情況下確認分泌。 在某些實施例中，本文中描述一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之大腦腦脊髓液投與治療有效量之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，使得形成分泌含有α2,6-唾液酸化聚糖的經糖基化IDS前體的庫；其中當用於在培養物中轉導人類神經元細胞時，該重組載體引起在該細胞培養物中分泌含有α2,6-唾液酸化聚糖的該經糖基化IDS前體。 在某些實施例中，本文中描述一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之大腦腦脊髓液投與治療有效量之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，使得形成分泌含有甘露糖-6-磷酸的經糖基化IDS前體的庫；其中當用於在培養物中轉導人類神經元細胞時，該重組載體引起在該細胞培養物中分泌為甘露糖-6-磷酸化的該經糖基化IDS前體。 在某些實施例中，本文中描述一種治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之大腦腦脊髓液投與治療有效量之編碼人類IDS的重組核苷酸表現載體，使得形成分泌含有甲醯基甘胺酸的經糖基化IDS前體的庫；其中當用於在培養物中轉導人類神經元細胞時，該重組載體引起在該細胞培養物中分泌含有甲醯基甘胺酸的該經糖基化IDS前體。 在某些實施例中，人類IDS包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。在某些實施例中，IDS轉基因編碼前導肽。在某些實施例中，表現載體為複製缺陷性AAV載體。在某些實施例中，藉由鞘內(例如腦池內、C1-2穿刺(若對於患者可行)或腰穿刺)、腦室內或鼻內投與，將表現載體遞送至個體之CSF。在某些實施例中，人類個體為IDS活性缺陷型。 在較佳實施例中，經糖基化IDS不含有可偵測NeuGc及/或α-Gal。本文中所使用之片語「可偵測NeuGc及/或α-Gal」意謂可藉由此項技術中已知之標準分析方法偵測的NeuGc及/或α-Gal部分。舉例而言，對於偵測NeuGc之方法，可藉由HPLC根據Hara等人, 1989, 「Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and N-Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection.」 J. Chromatogr., B: Biomed. 377: 111-119來偵測NeuGc，該文獻以引用之方式併入本文中。或者，可藉由質譜分析來偵測NeuGc。可使用以下方法來偵測α-Gal：ELISA，參見例如Galili等人, 1998, 「A sensitive assay for measuring alpha-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody.」 Transplantation. 65(8):1129-32；或質譜分析，參見例如Ayoub等人, 2013, 「Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques.」 Landes Bioscience. 5(5): 699-710。亦參見Platts-Mills等人, 2015, 「Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal」 Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260中引用之參考文獻。5.1 加工、 N - 糖基化及酪胺酸硫酸化 5.1.1. 加工 人類IDS包括在加工期間裂解的25個胺基酸信號序列。在初始76 kDa胞內IDS前體之寡醣鏈於高基氏體中修飾之後，其轉化成磷酸化90 kDa IDS前體。藉由糖基化修飾及蛋白質裂解經由各種胞內中間物將此前體加工成主要55 kDa形式。概言之，在移除25個胺基酸信號序列之後，蛋白水解加工涉及：N31 下游之N端蛋白質裂解，移除八個胺基酸(殘基26-33)之前肽；及N513 上游之C端蛋白質裂解，其釋放18 kDa多肽且產生轉化成55 kDa成熟形式之62 kDa中間物。進一步蛋白質裂解產生位於溶酶體腔室中之45 kDa成熟形式。(對於自Millat等人, 1997, Exp Cell Res 230: 362-367 (「Millat 1997」)；Millat等人 1997, Biochem J. 326: 243-247 (「Millat 1997a」)；以及Froissart等人, 1995, Biochem J. 309:425-430再現的圖式，參見圖4，該等文獻各者以全文引用的方式併入本文中)。 酶活性所需之C84 之甲醯基甘胺酸修飾(在圖1中以粗體展示)可能作為早期轉譯後或共轉譯事件，最可能在內質網中發生。(參見Millat 1997a, citing Schmidt等人, 1995, Cell 82: 271-278)。在高基氏體中繼續轉譯後加工，包括添加含聚糖之唾液酸之複合物及獲得標記用於遞送至溶酶體腔室之酶的甘露糖-6-磷酸殘基。(對於簡明綜述，參見Clarke, 2008, Expert Opin Pharmacother 9: 311-317，其以全文引用的方式併入本文中)。 在一特定實施例中，當在活體內或活體外於神經元或膠細胞中表現時，根據本文所描述之方法使用之HuGlyIDS可為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)甘露糖-6-磷酸化形式的酶。由神經元及膠細胞產生的IDS可能含有較高M6P含量，如Daniele 2002中及Sleat, Proteomics, 2005 (指示人類大腦比其他組織含有更多(在定量及定性兩者意義上)的M6P糖蛋白)中所報導。可能量測IDS前體之M6P含量，如Daniele 2002中所進行。 因此，在某些實施例中，當在活體內或活體外於神經元或膠細胞中表現時，根據本文所描述之方法使用之HuGlyIDS以比於非神經元或膠細胞中表現之IDS更高含量的甘露糖-6-磷酸化。特定言之，當在活體內或活體外於神經元或膠細胞中表現時，根據本文所描述之方法使用之HuGlyIDS以比於HT1080或CHO細胞中表現之IDS更高含量的甘露糖-6-磷酸化。在某些實施例中，藉由在M6P (例如5 mM M6P)存在下由人類神經元細胞對IDS之攝取，來量測所表現IDS的甘露糖-6-磷酸化含量。在某些實施例中，當在活體內或活體外於神經元或膠細胞中表現時，根據本文所描述之方法使用之10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%、80%-90%或90%-100%的HuGlyIDS分子為甘露糖-6-磷酸化的。5.1.2. N-糖基化 CNS中之神經元及膠細胞為擁有轉譯後加工(包括糖基化及酪胺酸-O-硫酸化)分泌蛋白之細胞機制的分泌細胞。hIDS具有圖1中鑑別之八個天冬醯胺(「N」)糖基化位點(N31 ST、N115 FS、N144 HT、N246 IT、N280 IS、N325 ST、N513 FS、N537 DS)。八個N-連接糖基化位點中之兩個(即N280 及N116 )在獲自人類大腦之IDS中為甘露糖-6-磷酸化的。(Sleat等人, 2006, Mol & Cell Proeomics 5.4: 686-701, 在表V處報導)。儘管無單一糖基化位點為IDS穩定性所必須的，但位置N280 處之糖基化對於細胞內化及經由甘露糖-6-磷酸(M6P)受體之溶酶體靶向為重要的。(Chung等人, 2014, Glycoconj J 31:309-315在第310頁第一行)。在正常生理狀態下，IDS以極低含量產生，且自細胞分泌極少的酶(若存在)。(Clarke, 2008,同前文獻)。 在基因療法或蛋白質療法中產生的每一分子完全糖基化及硫酸化，為不必要的。相反，所產生之糖蛋白群體應具有足夠的糖基化及硫酸化，以展現功效。 在一特定實施例中，當在活體內或活體外於神經元或膠細胞中表現時，根據本文所描述之方法使用之HuGlyIDS可在100%其N-糖基化位點處糖基化。然而，熟習此項技術者應瞭解，不是HuGlyIDS之每一N-糖基化位點均需要N-糖基化，以獲得糖基化之益處。相反，僅當特定百分比之N-糖基化位點糖基化時及/或僅當特定百分比之所表現IDS分子糖基化時，可實現糖基化的益處。因此，在某些實施例中，當在活體內或活體外於神經元或膠細胞中表現時，根據本文所描述之方法使用之HuGlyIDS以10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%、80%-90%或90%-100%之其可用N-糖基化位點處糖基化。在某些實施例中，當在活體內或活體外於神經元或膠細胞中表現時，根據本文所描述之方法使用之10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%、80%-90%或90%-100%之HuGlyIDS分子在其至少一個可用N-糖基化位點處糖基化。 在一特定實施例中，當在活體內或活體外於神經元或膠細胞中表現HuGlyIDS時，根據本文所描述之方法使用之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%之HuGlyIDS中存在的N-糖基化位點在N-糖基化位點中存在的Asn殘基(或其他相關殘基)處糖基化。亦即，所得HuGlyIDS之至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%之N-糖基化位點糖基化。 在另一特定實施例中，當在活體內或活體外於神經元或膠細胞中表現HuGlyIDS時，根據本文所描述之方法使用之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%之HuGlyIDS分子中存在的N-糖基化位點用連接於N-糖基化位點中存在的Asn殘基(或其他相關殘基)的一致連接的聚糖糖基化。亦即，所得HuGlyIDS之至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%之N-糖基化位點具有一致連接的聚糖。 重要地，當在神經元或膠細胞中表現根據本文所描述之方法使用之IDS蛋白時，規避對在原核宿主細胞(例如大腸桿菌(E . coli ))或真核宿主細胞(例如CHO細胞)中活體外生產的需求。相反，由於本文所描述之方法(例如使用神經元或膠細胞來表現IDS)，IDS蛋白之N-糖基化位點有利地裝飾有與治療人類相關及有益的聚醣，且特定言之，在治療目標部位處。當在蛋白質生產中使用CHO細胞或大腸桿菌時，難以達成此類優點，此係因為例如CHO細胞(1)不表現2,6-唾液酸轉移酶，且因此不能在N-糖基化期間添加2,6-唾液酸；及(2)可添加Neu5Gc而非Neu5Ac作為唾液酸；以及因為大腸桿菌不天然地含有N-糖基化需要的組分。此外，當在蛋白質生產中使用不為神經元或膠細胞的人類細胞時，可能難以達成此類優點。因此，在一個實施例中，在神經元或膠細胞中表現、得到本文中所描述之治療方法中使用之HuGlyIDS的IDS蛋白質，以蛋白質在人類神經元或膠細胞中N-糖基化的方式糖基化，但不以蛋白質在CHO細胞中糖基化的方式糖基化。在另一實施例中，在神經元或膠細胞中表現、得到本文中所描述之治療方法中使用之HuGlyIDS的IDS蛋白質，以蛋白質在神經元或膠細胞中N-糖基化的方式糖基化，其中使用原核宿主細胞(例如使用大腸桿菌)在自然情況下此類糖基化係不可能的。在一個實施例中，在人類神經元或膠細胞中表現、得到本文中所描述之治療方法中使用之HuGlyIDS的IDS蛋白以蛋白質在人類神經元或膠細胞中N-糖基化的方式糖基化，但不以蛋白質在不為神經元或膠細胞的人類細胞中糖基化的方式糖基化。 用於測定蛋白質之糖基化模式的分析為本領域中已知的。舉例而言，肼解可用於分析聚糖。首先，藉由與肼(可使用Oxfordshire, UK之Ludger釋放肼解聚糖釋放套組)一起培育，自其相關蛋白質釋放多醣。親核試劑肼攻擊多糖與載體蛋白之間的糖苷鍵，且允許釋放所連接聚糖。在此處理期間，丟失N-乙醯基，且必須藉由再N-乙醯化來復原。可在碳管柱上純化游離聚糖，且隨後在還原端利用螢光體2-胺基苯甲醯胺標記。可根據Royle等人, Anal Biochem 2002, 304(1):70-90之HPLC方案，在GlycoSep-N管柱(GL Sciences)上分離經標記多醣。所得螢光層析圖指示多醣長度及重複單元之數目。可藉由收集個別峰及隨後執行MS/MS分析來搜集結構資訊。從而可確認單醣組合物及重複單元之序列，且另外可鑑別多醣組合物之均質性。可藉由MALDI-MS/MS來分析低分子量之特定峰，且結果用於確認聚糖序列。各峰對應於由某一數目之重複單元及其片段組成之聚合物。因此，層析圖允許量測聚合物長度分佈。溶離時間為聚合物長度之指示，而螢光強度與個別聚合物之莫耳豐度相關。 由於聚糖模式之均質性與聚糖長度及糖基化位點中存在之聚糖數目兩者有關，所以可使用此項技術中已知之方法，例如量測聚糖長度及流體動力學半徑之方法，來評定與蛋白質結合之聚糖模式之均質性。尺寸排阻HPLC允許量測流體動力學半徑。蛋白質中較高數目之糖基化位點引起相比於具有較少糖基化位點之載劑更高的流體動力學半徑變化。然而，當分析單一聚糖鏈時，歸因於更長受控長度，其可為更均質的。可藉由肼解、SDS PAGE及毛細管凝膠電泳來量測聚糖長度。另外，均質性亦可意謂，某些糖基化位點使用模式改變至更廣/更窄範圍。可藉由糖肽LC-MS/MS來量測此等因子。 N-糖基化對於本文所描述之方法中使用之HuGlyIDS賦予眾多益處。藉由在大腸桿菌中生產蛋白質，難以達成此類益處，此係因為大腸桿菌並不天然地擁有N-糖基化所需的組分。此外，經由例如CHO細胞中之蛋白質生產，難以達成一些益處，此係因為CHO細胞缺乏添加某些聚糖(例如2,6-唾液酸)所需之組分，及因為CHO細胞可添加聚糖(例如對於人類不典型的Neu5Gc)及α-Gal抗原，該α-Gal抗原在大部分個體中為免疫原性的且在高濃度下可觸發過敏反應。甚至進一步，經由不為神經元或膠細胞之人類細胞中之蛋白質生產，難以達成一些益處。因此，在人類神經元或膠細胞中表現IDS，引起生產包含有益聚糖的HuGlyIDS，若在CHO細胞中、在大腸桿菌中或在不為神經元或膠細胞之人類細胞中生產該等聚糖，則該等聚糖將不與蛋白質相結合。5.1.3. 酪胺酸硫酸化 除N-連接糖基化位點以外，hIDS含有酪胺酸(「Y」)硫酸化位點(PSSEKY165 ENTKTCRGPD)。(對於酪胺酸殘基周圍經受蛋白質酪胺酸硫酸化之胺基酸之分析，參見例如Yang等人, 2015, Molecules 20:2138-2164, 尤其在第2154頁，其以全文引用的方式併入本文中。「規則」可概述如下：具有E或D之Y殘基在Y之+5至-5位置內，且其中位置Y之-1為中性或酸性帶電荷胺基酸而非鹼性胺基酸，例如破壞硫酸化之R、K或H)。 重要地，不能在大腸桿菌中生產酪胺酸硫酸化蛋白質，大腸桿菌天然地並不擁有酪胺酸硫酸化所需的酶。此外，CHO細胞為酪胺酸硫酸化缺陷型，其不為分泌細胞且轉譯後酪胺酸硫酸化能力有限。參見例如Mikkelsen及Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537。有利地，本文所提供之方法尋求在神經元或膠細胞中表現IDS (例如HuGlyIDS)，該神經元或膠細胞為分泌性的且確實具有酪胺酸硫酸化的能力。用於偵測酪胺酸硫酸化的分析為本領域中已知的。參見例如Yang等人, 2015, Molecules 20:2138-2164。 hIDS之酪胺酸硫酸化(一種人類CNS細胞中之穩定轉譯後加工)應引起轉基因產物之加工及活性改良。尚未闡明溶酶體蛋白之酪胺酸硫酸化的重要性；但在其他蛋白質中，已展示增加蛋白-蛋白相互作用(抗體與受體)之親合力，且促進蛋白水解加工(肽激素)。(參見Moore, 2003, J Biol. Chem. 278:24243-46；以及Bundegaard等人, 1995, The EMBO J 14: 3073-79)。在大腦中明顯地以較高含量(基於mRNA)表現引起酪胺酸硫酸化(其可作為IDS加工中之最終步驟發生)之酪胺醯蛋白磺基轉移酶(TPST1) (TPST1之基因表現資料可在EMBL-EBI Expression Atlas (可在http://www.ebi.ac.uk/gxa/home獲得)處找到)。5.2 構築體及調配物 供本文所提供之方法使用的為編碼艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS) (例如人類IDS (hIDS))的病毒載體或其他DNA表現構築體。本文提供之病毒載體及其他DNA表現構築體包括任何合適的用於遞送轉基因至腦脊髓液(CSF)的方法。遞送轉基因之手段包括病毒載體、脂質體、其他含脂質複合物、其他大分子複合物、合成的經修飾mRNA、未經修飾mRNA、小分子、非生物學活性分子(例如金粒子)、聚合分子(例如樹枝狀聚合物)、裸DNA、質體、噬菌體、轉座子、黏質體或游離基因體。在一些實施例中，載體為靶向載體，例如靶向神經元細胞的載體。 在一些態樣中，本發明提供核酸以供使用，其中核酸編碼IDS (例如hIDS)，其可操作地連接於選自由以下組成之群的啟動子：巨細胞病毒(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子(Rous sarcoma virus promoter)、MMT啟動子、EF-1α啟動子、UB6啟動子、雞β肌動蛋白啟動子、CAG啟動子、RPE65啟動子及視蛋白啟動子。 在某些實施例中，本文提供重組載體，其包含一或多個核酸(例如聚核苷酸)。核酸可包含DNA、RNA或DNA與RNA之組合。在某些實施例中，DNA包含選自由以下組成之群之序列中之一或多者：啟動子序列、相關基因(轉基因，例如IDS)之序列、非轉譯區及終止序列。在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含可操作地連接於相關基因之啟動子。 在某些實施例中，本文所揭示之核酸(例如聚核苷酸)及核酸序列可為密碼子最佳化的，例如經由熟習此項技術者已知之任何密碼子最佳化技術(參見例如Quax等人, 2015, Mol Cell 59:149-161之綜述)。 在另一態樣中，本發明提供調配物，其包含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中該調配物適合於向人類大腦之腦脊髓液投與，使得庫在分泌重組人類IDS醣蛋白前體之人類中樞神經系統中形成，該重組人類IDS醣蛋白前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。舉例而言，調配物可能含有使得其適合於向人類大腦之腦脊髓液投與之緩衝液(諸如，具有特定pH之緩衝液、或含有特定成分之緩衝液)，使得庫在分泌重組人類IDS醣蛋白前體之人類中樞神經系統中形成，該重組人類IDS醣蛋白前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。在一特定實施例中，緩衝液包含生理相容水性緩衝液、界面活性劑及視情況存在之賦形劑。 在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體及醫藥學上可接受之載劑，其中該重組核苷酸表現載體適合於向人類大腦之腦脊髓液(CSF)投與，使得庫在分泌重組人類IDS醣蛋白前體之人類中樞神經系統中形成，該重組人類IDS醣蛋白前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包含含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體之調配物，其中該調配物適合於向人類大腦之CSF投與，使得庫在分泌重組人類IDS醣蛋白前體之人類中樞神經系統中形成，該重組人類IDS醣蛋白前體約為90 kDa (例如85 kDa、86 kDa、87 kDa、88 kDa、89 kDa、90 kDa、91 kDa、92 kDa、93 kDa、94 kDa或95 kDa)，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。本文中所描述之套組包含重組核苷酸表現載體或一或多個容器中之調配物。視情況與此類一或多個容器相關的可為呈由管理醫藥或生物產品之製造、使用或銷售的政府機構所規定之形式的注意事項，該注意事項反映由人類投藥之製造、使用或銷售機構之批准。 可根據如在本發明中所提供之用於治療人類患者之方法，使用本文中涵蓋的調配物及套組。5.2.1. mRNA 在某些實施例中，本文提供之載體為編碼相關基因(例如轉基因，例如IDS)之經修飾mRNA。例如在以下中教示用於遞送轉基因至CSF之經修飾及未經修飾mRNA的合成：Hocquemiller等人, 2016, Human Gene Therapy 27(7):478-496，其以全文引用的方式併入本文中。在某些實施例中，本文提供一種編碼IDS (例如hIDS)之經修飾mRNA。5.2.2. 病毒載體 病毒載體包括腺病毒、腺相關病毒(AAV，例如AAV9、AAVrh10)、慢病毒、輔助依賴型腺病毒、單純疱疹病毒、痘病毒、日本紅血球凝集素病毒(HVJ)、α病毒、牛痘病毒及反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體包括基於鼠類白血病病毒(MLV)之載體及基於人類免疫缺乏病毒(HIV)之載體。α病毒載體包括勝利基森林病毒(semliki forest virus) (SFV)及辛得比斯病毒(sindbis virus) (SIN)。在某些實施例中，本文提供之病毒載體為重組病毒載體。在某些實施例中，更改本文提供之病毒載體，使得其在人體內為複製缺陷型。在某些實施例中，病毒載體為雜合載體，例如置放於「無助」腺病毒載體中之AAV載體。在某些實施例中，本文提供病毒載體，其包含來自第一病毒之病毒衣殼及來自第二病毒之病毒包膜蛋白。在特定實施例中，第二病毒為水泡性口炎病毒(VSV)。在更具體實施例中，包膜蛋白為VSV-G蛋白。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體為基於HIV之病毒載體。在某些實施例中，本文提供之基於HIV之載體包含至少兩個聚核苷酸，其中gag及pol基因來自HIV基因組，且env基因來自另一病毒。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體為基於單純疱疹病毒之病毒載體。在某些實施例中，對本文提供之基於單純疱疹病毒之載體進行修飾，使得其不包含一或多個立即早期(IE)基因，從而呈現其非細胞毒性。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體為基於MLV之病毒載體。在某些實施例中，本文提供之基於MLV之載體包含至多8 kb之替代病毒基因的異源DNA。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體為基於慢病毒之病毒載體。在某些實施例中，本文提供之慢病毒載體來源於人類慢病毒。在某些實施例中，本文提供之慢病毒載體來源於非人類慢病毒。在某些實施例中，將本文提供之慢病毒載體封裝至慢病毒衣殼中。在某些實施例中，本文提供之慢病毒載體包含以下元件中之一或多者：長末端重複序列、引子結合位點、多嘌呤區、att位點及衣殼化位點。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體為基於α病毒之病毒載體。在某些實施例中，本文提供之α病毒載體為重組、複製缺陷性α病毒。在某些實施例中，本文提供之α病毒載體中之α病毒複製子藉由在其病毒粒子表面上展示功能性異源配位體而靶向特定細胞類型。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體為基於AAV之病毒載體。在較佳實施例中，本文提供之病毒載體為基於AAV9或AAVrh10之病毒載體。在某些實施例中，本文提供之基於AAV9或AAVrh10之病毒載體保持對於CNS細胞之趨向性。已鑑別多種AAV血清型。在某些實施例中，本文提供之基於AAV之載體包含來自一或多個AAV血清型之組分。在某些實施例中，本文提供之基於AAV之載體包含來自以下中之一或多者之組分：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV10或AAV11。在較佳實施例中，本文提供之基於AAV之載體包含來自以下中之一或多者之組分：AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV10或AAV11血清型。在本文所描述之方法中使用基於AAV9之病毒載體。例如在以下中教示基於AAV之病毒載體之核酸序列及製備重組AAV及AAV衣殼之方法：美國專利第7,282,199 B2號、美國專利第7,790,449 B2號、美國專利第8,318,480 B2號、美國專利第8,962,332 B2號及國際專利申請案第PCT/EP2014/076466號，其各者以全文引用的方式併入本文中。在一個態樣中，本文提供基於AAV (例如AAV9或AAVrh10)之病毒載體，其編碼轉基因(例如IDS)。在特定實施例中，本文提供基於AAV9之病毒載體，其編碼IDS。在更具體實施例中，本文提供基於AAV9之病毒載體，其編碼hIDS。 在特定實施例中提供AAV9載體，其包含人造基因組，該人工基因組包含(i)表現盒，其含有在調節元件控制下的轉基因且側接ITRs；以及(ii)病毒衣殼，其具有AAV9衣殼蛋白之胺基酸序列，或與AAV9衣殼蛋白(SEQ ID NO: 26)之胺基酸序列為至少95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致，同時保持AAV9衣殼之生物功能。在某些實施例中，所編碼AAV9衣殼具有SEQ ID NO: 26之序列，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或30個胺基酸取代，且保持AAV9衣殼之生物功能。圖6提供不同AAV血清型之衣殼蛋白之胺基酸序列之比較比對，其中在比對序列中，可在某些位置處經取代之可能胺基酸根據SUBS標記之列中的比較。因此，在特定實施例中，AAV9載體包含AAV9衣殼變體，其具有在圖6之SUBS列中鑑別之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸取代，在天然AAV9序列中之彼位置處不存在該等胺基酸取代。 在某些實施例中，在本文所描述之方法中使用之AAV為Anc80或Anc80L65，如Zinn等人, 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。在某些實施例中，在本文所描述之方法中使用之AAV包含以下胺基酸插入中之一者：LGETTRP或LALGETTRP，如美國專利第9,193,956號、第9,458,517號及第9,587,282號以及美國專利申請案公開案第2016/0376323號中所描述，其各者以全文引用的方式併入本文中。在某些實施例中，在本文所描述之方法中使用之AAV為AAV.7m8，如美國專利第9,193,956號、第9,458,517號及第9,587,282號以及美國專利申請案公開案第2016/0376323號中所描述，其各者以全文引用的方式併入本文中。在某些實施例中，在本文所描述之方法中使用之AAV為在美國專利第9,585,971號中所揭示之任何AAV，諸如AAV-PHP.B。在某些實施例中，在本文所描述之方法中使用之AAV為在以下專利及專利申請案(其各者以全文引用的方式併入本文中)中之任一者中所揭示的AAV：美國專利第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號、第US 9,284,357號、第9,409,953號、第9,169,299號、第9,193,956號、第9458517號及第9,587,282號，美國專利申請案公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號，以及國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號。 在某些實施例中，可使用單鏈AAV (ssAAV)，同前文獻。在某些實施例中，可使用自補載體，例如scAAV (參見例如Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82，McCarty等人, 2001, Gene Therapy, 第8卷, 第16期, 第1248-1254頁；以及美國專利第6,596,535號、第7,125,717號及第7,456,683號，其各者以全文引用的方式併入本文中)。 在某些實施例中，在本文所描述之方法中使用之病毒載體為基於腺病毒之病毒載體。可使用重組腺病毒載體來轉移IDS。重組腺病毒可為第一代載體，其具有E1缺失，具有或不具有E3缺失且具有插入至任一缺失區中之表現盒。重組腺病毒可為第二代載體，其含有E2及E4區之完全或部分缺失。輔助依賴型腺病毒僅保持腺病毒反向末端重複序列及封裝信號(φ)。在具有或不具有保持人工基因組接近於大致36 kb之野生型大小的填充序列之情況下，將轉基因插入在封裝信號與3'ITR之間。用於製造腺病毒載體之例示性方案可在Alba et al., 2005, 「Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy,」 Gene Therapy 12:S18-S27中找到，其以全文引用的方式併入本文中。 在某些實施例中，在本文所描述之方法中使用之病毒載體為基於慢病毒之病毒載體。可使用重組慢病毒載體來轉移IDS。使用四種質體來製備構築體：含有Gag/序列之質體、含有Rev序列之質體、含有包膜蛋白之質體(亦即VSV-G)及具有封裝元件與IDS基因之Cis質體。 對於慢病毒載體製造，將四種質體共轉染至細胞(亦即基於HEK293之細胞)中，其中聚乙烯亞胺或磷酸鈣尤其可用作轉染藥劑。接著，在上清液中收集慢病毒(慢病毒需要自活性細胞出芽，因此不需要收集細胞/不應進行細胞收集)。過濾(0.45 µm)上清液，且接著添加氯化鎂及核酸酶。其他下游過程可能廣泛地變化，其中使用TFF及管柱層析為最GMP相容的一種。其他使用超速離心，無論是否利用管柱層析。用於製造慢病毒載體之例示性方案可在以下中找到：Lesch等人, 2011, 「Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors」, Gene Therapy 18:531-538，及Ausubel等人, 2012, 「Production of CGMP-Grade Lentiviral Vectors」, Bioprocess Int. 10(2):32-43，其兩者均以全文引用之方式併入本文中。 在一特定實施例中，用於本文所描述之方法之載體為編碼IDS (例如hIDS)，使得在轉導CNS中之細胞或相關細胞(例如活體內或活體外神經元細胞)後，由經轉導細胞表現IDS之經糖基化變體的載體。在一特定實施例中，用於本文所描述之方法之載體為編碼IDS (例如hIDS)，使得在轉導CNS中之細胞或相關細胞(例如活體內或活體外神經元細胞)後，由細胞表現IDS之硫酸化變體的載體。5.2.3. 基因表現之啟動子及調節子 在某些實施例中，本文提供之載體包含調節基因遞送或基因表現之組分(例如「表現控制元件」)。在某些實施例中，本文提供之載體包含調節基因表現之組分。在某些實施例中，本文提供之載體包含影響結合至細胞或靶向細胞之組分。在某些實施例中，本文提供之載體包含影響在攝取之後聚核苷酸(例如轉基因)在細胞內之位置的組分。在某些實施例中，本文提供之載體包含可用作例如偵測或選擇已吸收聚核苷酸之細胞之可偵測或選擇標記的組分。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含一或多個啟動子。在某些實施例中，啟動子為組成性啟動子。在替代實施例中，啟動子為誘導性啟動子。天然IDS基因，類似大部分管家基因，主要使用富含GC的啟動子。在一較佳實施例中，使用持久表現hIDS之強力組成性啟動子。此類啟動子包括「CAG」合成啟動子，其含有：「C」，巨細胞病毒(CMV)早期增強子元件；「A」，雞β肌動蛋白基因之啟動子以及第一外顯子及內含子；以及「G」，兔β血球蛋白基因之剪接受體(參見Miyazaki等人, 1989, Gene 79: 269-277；及Niwa等人, Gene 108: 193-199)。 在某些實施例中，啟動子為CB7啟動子(參見Dinculescu等人, 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663，其以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，CB7啟動子包括增強由載體驅動之轉基因之表現的其他表現控制元件。在某些實施例中，其他表現控制元件包括雞β-肌動蛋白內含子及/或兔β-血球蛋白polA信號。在某些實施例中，啟動子包含TATA盒。在某些實施例中，啟動子包含一或多個元件。在某些實施例中，一或多個啟動子元件可彼此為反向的或相對於彼此移動。在某些實施例中，啟動子之元件定位成協作地起作用。在某些實施例中，啟動子之元件定位成獨立地起作用。在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含選自由以下組成之群之一或多個啟動子：人類CMV即刻早期基因啟動子、SV40早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)長末端重複序列及大鼠胰島素啟動子。在某些實施例中，本文提供之載體包含選自由以下組成之群之一或多個長末端重複序列(LTR)啟動子：AAV、MLV、MMTV、SV40、RSV、HIV-1及HIV-2 LTR。在某些實施例中，本文提供之載體包含一或多個組織特異性啟動子(例如神經元細胞特異性啟動子)。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含除啟動子以外之一或多個調節元件。在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含增強子。在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含抑制子。在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含內含子或嵌合內含子。在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含聚腺苷酸化序列。5.2.4. 信號肽 在某些實施例中，本文提供之載體包含調節蛋白質遞送之組分。在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含一或多個信號肽。在某些實施例中，信號肽允許轉基因產物(例如IDS)在細胞中達成恰當封裝(例如糖基化)。在某些實施例中，信號肽允許轉基因產物(例如IDS)在細胞中達成恰當定位。在某些實施例中，信號肽允許轉基因產物(例如IDS)達成自細胞分泌。結合本文提供之載體及轉基因使用之信號肽之實例可在表1中找到。信號肽亦可在本文中被稱作為前導序列或前導肽。表 2 .與本文提供之載體一起使用的信號肽。 5.2.5. 非轉譯區 在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含一或多個非轉譯區(UTR)，例如3'及/或5' UTR。在某些實施例中，針對所需含量之蛋白質表現，對UTR進行最佳化。在某些實施例中，針對轉基因之mRNA半衰期，對UTR進行最佳化。在某些實施例中，針對轉基因之mRNA之穩定性，對UTR進行最佳化。在某些實施例中，針對轉基因之mRNA之二級結構，對UTR進行最佳化。5.2.6. 反向末端重複序列 在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含一或多個反向末端重複(ITR)序列。ITR序列可用於將重組基因表現盒封裝至病毒載體之病毒粒子中。在某些實施例中，ITR來自AAV，例如AAV9 (參見例如Yan等人, 2005, J. Virol., 79(1):364-379；美國專利第7,282,199 B2號、美國專利第7,790,449 B2號、美國專利第8,318,480 B2號、美國專利第8,962,332 B2號及國際專利申請案第PCT/EP2014/076466號，其各者以全文引用的方式併入本文中)。5.2.7. 轉基因 在某些實施例中，本文提供之載體編碼IDS轉基因。在特定實施例中，IDS受用於在神經元細胞中表現之適當表現控制元件控制。在某些實施例中，IDS (例如hIDS)轉基因包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。在某些實施例中，IDS (例如hIDS)轉基因包含與SEQ ID NO: 1中闡述之序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。 由轉基因編碼之HuGlyIDS可包括(但不限於)：人類IDS (hIDS) (如圖1中所展示)，其具有SEQ ID NO. 1之胺基酸序列；及hIDS之衍生物，其具有胺基酸取代、缺失或添加，例如包括(但不限於)選自展示於圖2中之IDS之異種同源物之對應非保守殘基之胺基酸取代，其限制條件為，此類突變不包括位置84處之半胱胺酸殘基(C84)的置換，該位置84處之半胱胺酸殘基為酶活性所需的(Millat等人, 1997, Biochem J 326: 243-247)；或已在重度、重度-中度、中度或減弱MPS II表型中鑑別的突變，例如如圖3中所展示的，或如由Sukegawa-Hayasaka等人, 2006, J Inhert Metab Dis 29: 755-761 (報導「減弱的」突變R48P、A85T、W337R，及截斷突變Q531X；以及「嚴重」突變P86L、S333L、S349I、R468Q、R468L)；Millat等人, 1998, BBA 1406: 214-218 (報導「減弱的」突變P480L及P480Q；以及「嚴重」突變P86L)；以及Bonucelli等人, 2001, BBA 1537:233-238中所報導的，其各者以全文引用的方式併入本文中。 舉例而言，hIDS之特定位置處之胺基酸取代可選自圖2中所比對之IDS異種同源物中之彼位置處發現的對應非保守胺基酸殘基，其限制條件為，此類取代不包括展示於圖3中或如由Sukegawa-Hayasaka等人, 2006, 同前文獻；Millat等人, 1998,同前文獻；或Bonucelli等人, 2001, 同前文獻中所報導的有害突變中的任一者，各文獻以全文引用的方式併入本文中。可使用在活體外、細胞培養物或測試動物分析中之習知分析來測試所得轉基因產物，以確保突變並不破壞IDS功能。所選擇之較佳胺基酸取代、缺失或添加應為保持或增加IDS之酶活性、穩定性或半衰期的彼等，如藉由在活體外、MPS II細胞培養物或動物模型中之習知分析所測試。舉例而言，可使用習知酶分析利用例如4-甲基香豆素基α-L-吡喃艾杜糖醛酸2-硫酸鹽或4-甲基香豆素基硫酸鹽作為受質，來評定轉基因產物之酶活性(對於可使用之例示性IDS酶分析，參見例如Lee等人, 2015, Clin. Biochem. 48(18):1350-1353，Dean等人, 2006, Clin. Chem. 52(4):643-649，其各者以全文引用的方式併入本文中)。可在細胞培養物中評定轉基因產物校正MPS II表型之能力；例如藉由利用編碼hIDS或衍生物之病毒載體或其他DNA表現構築體轉導培養物中之MPS II細胞；藉由向培養物中之MPS II細胞添加轉基因產物或衍生物；或藉由將MPS II細胞與經工程改造表現並分泌rhIDS一衍生物之人類神經元/宿主膠細胞一起共培養，及例如藉由偵測IDS酶活性及/或培養物中之MPS II細胞中之GAG儲存的減少來測定MPS II培養細胞中的缺陷的校正(參見例如Stroncek等人, 1999, Transfusion 39(4):343-350，其以全文引用的方式併入本文中)。5.2.8. 構築體 在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含按以下次序之以下元件：a)第一ITR序列、b)第一連接子序列、c)啟動子序列、d)第二連接子序列、e)內含子序列、f)第三連接子序列、g)編碼轉基因(例如IDS)之序列、h)第四連接子序列、i) polyA序列、j)第五連接子序列及k)第二ITR序列。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含按以下次序之以下元件：a)啟動子序列及b)編碼轉基因(例如IDS)之序列。在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含按以下次序之以下元件：a)啟動子序列及b)編碼轉基因(例如IDS)之序列，其中轉基因包含信號肽。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含按以下次序之以下元件：a)第一ITR序列、b)第一連接子序列、c)啟動子序列、d)第二連接子序列、e)內含子序列、f)第三連接子序列、g)第一UTR序列、h)編碼轉基因(例如IDS)之序列、i)第二UTR序列、j)第四連接子序列、k) polyA序列、l)第五連接子序列及m)第二ITR序列。 在某些實施例中，本文提供之病毒載體包含按以下次序之以下元件：a)第一ITR序列、b)第一連接子序列、c)啟動子序列、d)第二連接子序列、e)內含子序列、f)第三連接子序列、g)第一UTR序列、h)編碼轉基因(例如IDS)之序列、i)第二UTR序列、j)第四連接子序列、k) polyA序列、l)第五連接子序列及m)第二ITR序列，其中轉基因包含信號肽，且其中轉基因編碼hIDS。5.2.9. 載體之製造及測試 可使用宿主細胞來製造本文提供之病毒載體。可使用哺乳動物宿主細胞來製造本文提供之病毒載體，該等哺乳動物宿主細胞例如A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、初代纖維母細胞、肝細胞及肌母細胞。可使用來自人類、猴、小鼠、大鼠、兔或倉鼠之宿主細胞來製造本文提供之病毒載體。 利用編碼轉基因及相關元件之序列(亦即載體基因組)以及在宿主細胞中生產病毒的構件(例如複製及衣殼基因(例如AAV之rep及cap基因)對宿主細胞進行穩定轉化。對於生產具有AAV8衣殼之重組AAV載體之方法，參見美國專利第7,282,199 B2號之實施方式之章節IV，其以全文引用的方式併入本文中。可例如藉由TAQMAN®分析來測定該等載體之基因組複本效價。可例如藉由CsCl2 沈降來回收病毒粒子。 可使用活體外分析(例如細胞培養分析)來量測自本文中所描述之載體的轉基因表現，因此指示例如載體的效能。舉例而言，可使用HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11或ReNcell VM細胞株、或來源於神經元或膠細胞或神經元或膠細胞之先驅細胞的其他細胞株，來評定轉基因表現。一旦表現，則可測定所表現產物(亦即HuGlyIDS)之特徵，包括測定與HuGlyIDS相關之糖基化及酪胺酸硫酸化模式。5.2.10. 組合物 描述組合物，其包含編碼本文中所描述之轉基因的載體及適合載劑。適合載劑(例如用於向CSF投與，及例如向神經元細胞投與)應容易地由熟習此項技術者選擇。5.3 基因療法 描述用於向患有MPS II之人類個體投與治療有效量之轉基因構築體的方法。更特定言之描述用於向具有MPS II之患者投與(特定言之，向CSF投與)治療有效量之轉基因構築體的方法。在特定實施例中，可使用用於向CSF投與治療有效量之轉基因構築體的此類方法來治療患有亨特氏症候群的患者。5.3.1. 目標患者群體 在某些實施例中，向診斷患有MPS II之患者投與治療有效量之重組載體。在特定實施例中，患者已診斷患有輕度MPS II。在特定實施例中，患者已診斷患有重度MPS II。在特定實施例中，患者已診斷患有亨特氏症候群。 在某些實施例中，向診斷患有MPS II、已鑑別為對利用IDS (例如hIDS)之治療起反應的患者投與治療有效量之重組載體。 在某些實施例中，向兒科患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向小於三歲之患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向2至4歲之患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向大於等於4月齡且小於5歲之患者投與治療有效量之重組載體。在一特定實施例中，向患有重度MPS II且大於等於4月齡且小於5歲之患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向大於等於18月齡且小於等於8歲之患者投與治療有效量之重組載體。在一特定實施例中，向兒科男性患者且大於等於18月齡且小於等於8歲之患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向3至8歲之患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向8至16歲之患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向小於等於10歲之患者投與治療有效量之重組載體。在一特定實施例中，向患有重度MPS II且小於等於10歲之患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向大於10歲之患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向青年患者投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，向成年患者投與治療有效量之重組載體。 在某些實施例中，在用基因療法治療之前，向診斷患有MPS II、已鑑別為對利用IDS (例如hIDS)之治療起反應之患者，投與治療有效量之重組載體，注射至CSF中。5.3.2. 劑量及投藥模式 在某些實施例中，經由鞘內投與(亦即注射至蛛膜下空間中，使得重組載體經由CSF分配且轉導CNS中之細胞)，向CSF投與治療有效量之重組載體。此可以多種方式，例如藉由顱內(腦池或腦室)注射、或注射至腰池中來實現。在某些實施例中，經由腦池內(IC)注射(例如至大池中)來進行鞘內投與。在特定實施例中，藉由CT引導的枕下穿刺來進行腦池內注射。在特定實施例中，藉由腰穿刺來進行鞘內注射。在特定實施例中，藉由C1-2穿刺(若對於患者可行)來進行注射至蛛膜下空間中。在某些實施例中，經由鼻內投與向CNS投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，經由腦實質內注射向CNS投與治療有效量之重組載體。在某些實施例中，腦實質內注射係靶向紋狀體。在某些實施例中，腦實質內注射係靶向白質。在某些實施例中，藉由此項技術中已知之任何手段，例如藉由Hocquemiller等人, 2016, Human Gene Therapy 27(7):478-496 (其以全文引用之方式併入本文中)中揭示之任何手段，向CSF投與治療有效量之重組載體。 對於鞘內投與，應以注射體積向CSF投與治療有效量之重組載體，較佳地至多約20 mL。應使用適合於鞘內注射之載劑(諸如埃利奧茲B溶液(Elliotts B Solution))作為重組載體之媒劑。埃利奧茲B溶液(通用名稱：氯化鈉、碳酸氫鈉、無水右旋糖、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈣及磷酸鈉)為不含抑菌防腐劑之無菌、非致熱性等滲溶液，且用作鞘內投與化學治療劑之稀釋劑。 在一個實施例中，使用表現人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)之非複製重組AAV9載體來治療。在某些實施例中，IDS表現盒側接反向末端重複序列(ITR)，且表現受巨細胞病毒(CMV)增強子與雞β肌動蛋白啟動子(CB7)之雜合體驅動。在某些實施例中，轉基因包括雞β肌動蛋白內含子及兔β血球蛋白聚腺苷酸化(polyA)信號。 呈在於約5至20 ml之體積中之1.4 × 1013 GC (1.1 × 1010 GC/g大腦質量)至7.0 × 1013 GC (5.6 × 1010 GC/g大腦質量)範圍內的單一均一劑量，IC (藉由枕下注射)投與rAAV9.hIDS。在患者具有針對AAV之中和抗體的情況下，可使用在高範圍下的劑量。5.4 組合療法 本發明之方法涵蓋投與HuGlyIDS至CSF與投與其他可用治療之組合。可在基因療法治療之前、同時或之後投與額外治療。可與本發明之基因療法組合之用於MPS II之可用治療包括(但不限於)使用全身性投與或投與至CSF之艾杜硫酸酯酶的酶置換療法(ERT)；及/或HSCT療法。在另一實施例中，可使用藉由重組DNA技術、在人類神經元及膠細胞株中生產的rHuGlyIDS醣蛋白來投與ERT。可用於此類重組糖蛋白生產之人類神經元及膠細胞株包括(但不限於)HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11或ReNcell VM，僅舉幾例。為了確保完成糖基化，尤其唾液酸化及酪胺酸硫酸化，可藉由將宿主細胞工程改造為共表現引起酪胺酸-O-硫酸化之α-2,6-唾液酸轉移酶(或α-2,3-及α-2,6-唾液酸轉移酶)及/或TPST-1及TPST-2酶，來強化用於生產之細胞株。5.5 生物標記 / 取樣 / 監測功效 可藉由量測認知功能(例如預防或降低神經認知下降)；CSF及/或血清中之疾病生物標記(諸如GAG)降低；及/或CSF及/或血清中之IDS酶活性增加，來監測功效。亦可監測發炎症狀及其他安全性事件。5.5.1. 疾病標記 在某些實施例中，藉由量測患者體內之疾病生物標記之含量來監測利用重組載體之治療的功效。在某些實施例中，在患者之CSF中量測疾病生物標記之含量。在某些實施例中，在患者之血清中量測疾病生物標記之含量。在某些實施例中，在患者之尿液中量測疾病生物標記之含量。在某些實施例中，疾病生物標記為GAG。在某些實施例中，疾病生物標記為IDS酶活性。在某些實施例中，疾病生物標記為發炎。在某些實施例中，疾病生物標記為安全性事件。5.5.2. 用於神經認知功能之測試 在某些實施例中，藉由量測患者體內之認知功能之含量來監測利用重組載體之治療的功效。可藉由熟習此項技術者已知之任何方法來量測認知功能。在某些實施例中，經由用於量測智商(IQ)之經驗證儀器來量測認知功能。在特定實施例中，藉由魏氏簡化智慧量表(Wechsler Abbreviated Scale of Intelligence)第二版本(WASI-II)來量測IQ。在某些實施例中，經由用於量測記憶之經驗證儀器來量測認知功能。在特定實施例中，藉由霍普金斯口頭學習測試(Hopkins Verbal Learning Test) (HVLT)來量測記憶。在某些實施例中，經由用於量測注意力之經驗證儀器來量測認知功能。在特定實施例中，藉由注意力變數測試(TOVA)來量測注意力。在某些實施例中，經由用於量測IQ、記憶及注意力中之一或多者之經驗證儀器來量測認知功能。5.5.3. 身體改變 在某些實施例中，藉由量測與患者之溶酶體儲存缺陷相關之身體特徵來監測利用重組載體之治療的功效。在某些實施例中，身體特徵為儲存病變。在某些實施例中，身體特徵為身材短小。在某些實施例中，身體特徵為面部特徵粗糙。在某些實施例中，身體特徵為阻塞性睡眠呼吸暫停。在某些實施例中，身體特徵為聽覺減弱。在某些實施例中，身體特徵為視覺減弱。在特定實施例中，視覺減弱歸因於角膜混濁。在某些實施例中，身體特徵為水腦。在某些實施例中，身體特徵為脊髓壓迫。在某些實施例中，身體特徵為肝脾腫大。在某些實施例中，身體特徵為骨骼及關節變形。在某些實施例中，身體特徵為心臟瓣膜疾病。在某些實施例中，身體特徵為反覆性上呼吸道感染。在某些實施例中，身體特徵為腕隧道症候群。在某些實施例中，身體特徵為巨舌畸形(舌擴大)。在某些實施例中，身體特徵為聲帶擴大及/或聲音改變。可藉由熟習此項技術者已知之任何方法來量測此類身體特徵。序列之表 6. 實例 6.1 實例 1 ： hIDS cDNA 構築一種基於hIDS cDNA之載體，其包含含hIDS (SEQ ID NO: 1)之轉基因。轉基因亦包含核酸，該等核酸包含選自表2中列舉之群的信號肽。視情況，載體另外包含啟動子。6.2 實例 2 ： 經取代之 hIDS cDNA 構築一種基於hIDS cDNA之載體，其包含含具有相比於SEQ ID NO: 1之hIDS序列之胺基酸取代、缺失或添加的hIDS的轉基因，例如包括(但不限於)選自展示於圖2中之IDS異種同源物中之對應非保守殘基之胺基酸取代，其限制條件為，此類突變不包括位置84處之半胱胺酸殘基(C84)的置換，該位置84處之半胱胺酸殘基為酶活性所需的(Millat等人, 1997, Biochem J 326: 243-247)；或已在重度、重度-中度、中度或減弱MPS II表型中鑑別的突變，例如如圖3中所展示的，或如由Sukegawa-Hayasaka等人, 2006, J Inhert Metab Dis 29: 755-761 (報導「減弱的」突變R48P、A85T、W337R，及截斷突變Q531X；以及「嚴重」突變P86L、S333L、S349I、R468Q、R468L)；Millat等人, 1998, BBA 1406: 214-218 (報導「減弱的」突變P480L及P480Q；以及「嚴重」突變P86L)；以及Bonucelli等人, 2001, BBA 1537:233-238中所報導的，其各者以全文引用的方式併入本文中。轉基因亦包含核酸，該等核酸包含選自表2中列舉之群的信號肽。視情況，載體另外包含啟動子。6.3 實例 3 ： 利用 hIDS 或經取代 hIDS 對 動物模型之 MPS II 的 治療 當表現為轉基因時，認為基於hIDS cDNA之載體適用於治療MPS II。以足以遞送轉基因產物及在動物之CSF中維持治療有效濃度之劑量，向MPS II之動物模型(例如，Garcia等人, 2007, J Inherit Metab Dis 30: 924-34或Muenzer等人, 2001, Acta Paediatr增刊91:98-99中所描述之小鼠模型)鞘內投與編碼hIDS的重組載體。在處理之後，評價動物在與特定動物模型之疾病相符之症狀上的改良。6.4 實例 4 ： 利用 hIDS 或經取代 hIDS 對 MPS II 之治療 當表現為轉基因時，認為基於hIDS cDNA之載體適用於治療MPS II。以足以遞送轉基因產物且在CSF中維持治療性濃度之劑量，向患有MPS II之個體鞘內投與編碼hIDS之基於cDNA的載體(例如構築體1 (參見下文))。在處理之後，評價個體在MPS II之症狀上的改良。6.5 實例 5 ： 評價構築體 1 在 患有 MPS II ( 亨特症候群 ) 之 兒科個體中之安全性、耐受性及藥效學的階段 I / II 多中心、開放標記研究 6.5.1. 大綱 研究用產品、劑量及投藥途徑 構築體1：AAV9.CB7.hIDS (具有血清型9衣殼之重組腺相關病毒，其含有人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶表現盒)。參見段落[0019]及圖5。 將呈單一腦池內(IC)劑量遞送產品。 將評價兩個劑量，1.3 × 1010 基因組複本(GC)/公克大腦質量(劑量1)及6.5 × 1010 GC/g大腦質量(劑量2)。總投與劑量將考慮基於其年齡所評估的研究個體之大腦大小。總投與產品體積將不超過5 mL。 目標 主要目標： ●為了評價在向患有重度MPS II之兒科個體投與單一IC劑量之後24週，構築體1之安全性及耐受性 次要目標： ●為了評價構築體1之長期安全性及耐受性 ●為了評價構築體1對於腦脊髓液(CSF)、血漿及尿液中之生物標記之效果 ●為了評價構築體1對於認知、行為及適應性功能之神經發育性參數之效果 ●為了評價CSF、血漿及尿液中之載體排出 探索性目標： ●為了評價構築體1之免疫原性 ●為了探索構築體1對於關於CNS之身體改變之效果 ●為了探索構築體1對於疾病之全身性表現的效果 ●為了探索構築體1對於聽覺能力之效果 ●為了探索構築體1對於暫時停止IV ERT (ELAPRASE®)之個體之血漿及尿液中之生物標記的效果 ●為了探索構築體1對於生活質量(QOL)及睡眠量測之效果 研究設計及方法 此為構築體1之階段I/II、首次在人類中、多中心、開放標記、單一臂劑量增加研究。不包括對照組。大致6名患有重度MPS II之兒科個體可參與至2劑量群組1.3 × 1010 GC/g大腦質量(劑量1)或6.5 × 1010 GC/g大腦質量(劑量2)中，且將接受單一劑量之IC注射投與的構築體1。安全性將為處理之後初始24週(初級研究時間)之主焦點。在完成初級研究時間之後，將繼續評定(安全性及功效)個體直至在用構築體1處理之後總共104週。在研究結束時，將邀請個體參與長期追蹤研究。 前3名合格個體將參與至劑量1群組(1.3 × 1010 GC/g大腦質量)中。在向第一個體投與構築體1之後，將有一個8週的安全性觀察期。內部安全性委員會(ISC)將審核對於此個體在首個8週期間獲得之安全性資料(包括在第8週訪問期間獲得之資料)，且若不存在安全性問題，則第2個體可參與。將使用相同過程來使第3個體參與。若未觀測到安全性審核觸發(SRT)事件，則將由獨立的資料監測委員會(IDMC)來評價對於第3個體，劑量1群組在至多並包括第8週訪問所獲得的所有可用安全性資料。若對第二劑量(6.5 × 1010 GC/g大腦質量)繼續進行決策，則後續2名個體將遵循與初始劑量群組相同的給藥流程，其中在已審查最後給藥個體之於首個8週期間獲得之所有安全性資料(包括在第8週訪問期間獲得之資料)之後，對各後續個體進行給藥。ISC將審核第2個體之至多並包括第2週訪問獲得之所有個體安全性資料，且可判定，對於緊接在此評定之後繼續進行對第3個體給藥係安全的。在對劑量2群組中之第3個體進行第8週訪問之後，將由IDMC來評價劑量2群組之所有可用安全性資料。 將在給藥之前至多35天，篩選出可能個體以測定對於研究的合格性。將容許滿足合格性標準之彼等個體在第-2天與第1天上午之間(根據制度實踐)進入醫院，且將在給藥前進行基線評定。個體將在第1天接受單一IC劑量之構築體1，且在給藥之後留在醫院大致30-36小時以進行觀測。將在4週期間及在第8、12、16、20及24週每週進行初級研究時間(亦即24週期間)的後續評定。在初級研究時間之後，將在第28、32、40、48、52、56、64、78及104週進行訪問。可由家庭保健護士進行第12、40及64週訪問。第20及28週評定將限於AE以及藉由電話接觸之伴隨療法的評估。 基於在動物中進行之非臨床安全性/毒理學研究中之潛在免疫原性的研究結果，所有個體在研究中均將最初接受免疫抑制(IS)，且將包括皮質類固醇(corticosteroid) (在給藥前第-1天靜脈內[IV]甲基強的松(methylprednisolone) 10 mg/kg一次，且在第2天以0.5 mg/kg/天開始口服強的松(prednisone)，其中劑量逐步減小且在第12週停止)、他克莫司(第2天至第24週口服[PO] 1 mg，每日兩次[BID]，其中目標血液含量為4-8 ng/mL，且在第24週與第32週之間的8週期間劑量逐漸減小)及西羅莫司(在第-2天，每4小時1 mg/m2 之速效劑量×3劑量，且接著自第-1天：分割為0.5 mg/m2 /天西羅莫司，BID給藥，其中目標血液含量為4-8 ng/ml，直至第48週為止)。將按照表3進行神經評定及他克莫司/西羅莫司血液含量監測。將調整西羅莫司及他克莫司之劑量以將血液含量維持在目標範圍內。 在第48週之後未計劃IS療法。若在第48週之後需要IS來控制臨床相關免疫反應，則將由主要研究者(PI)與醫學監測者及發起人進行討論來判定適當免疫抑制方案，如臨床上所指示。 功效評定將包括神經認知功能、聽覺能力、大腦MRI、肝及脾大小以及CSF、血漿及尿液中之藥效動力學(PD)生物標記之含量的量測。亦可採集作為個體之照護標準之部分進行同時加入試驗的神經認知或適應性等級，如藉由研究發起人在現場討論之後所測定。 終點 初級終點： ●在24週期間之安全性：AE及嚴重不良跡象(SAE) 二級終點： ●在104週期間之安全性：AE報導、實驗室評定、生命體徵、ECG、體檢及神經評定 ● CSF (GAG，I2S活性)、血漿(GAG，I2S活性)及尿液(GAG)中之生物標記 ●認知、行為及適應性功能之神經發育性參數： o 貝利嬰幼兒發育量表(Bayley Scales of Infant and Toddler Development)第3版本(BSID-III) (Bayley, 2005)或考夫曼兒童評估測試(Kaufman Assessment Battery for Children)第2版(KABC-II) (Kaufman, 2004) o文蘭適應行為量表(Vineland Adaptive Behavior Scales)第2版，綜合訪問形式(VABS-II) (Sparrow等人, 2005) ● CSF、血漿及尿液中之載體濃度，藉由定量聚合酶鏈反應(PCR)成構築體1去氧核糖核酸(DNA) 探索性終點： ●免疫原性量測 o CSF及血清中的AAV9之中和抗體效價及I2S之結合抗體效價 o酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析：對於AAV9及I2S之T細胞反應 o流式細胞測量術：AAV特異性調節T細胞及I2S特異性調節T細胞 ●藉由大腦之磁共振成像(MRI)評定之CNS結構異常 ●藉由腹部之MRI及超音波評定之肝及脾大小 ●藉由聽覺腦幹反應(ABR)測試量測之聽覺能力變化 ●暫時停止IV ERT (ELAPRASE®)之個體之血漿及尿液GAG ● PedsQL (版本4) ●全球睡眠量表印象 總研究持續時間可為給藥後104週，其中24週為初級安全性評估時間點。篩選可能佔據長達35天。 診斷及納入與排除標準 為了有資格參與此研究，個體必須滿足所有以下納入標準： 1.在解釋研究性質之後且在任何研究相關步驟之前，個體之法定監護人願意且能夠提供書面簽名的知情同意書。 2.為男性 3.滿足以下標準中之一者： a.具有MPS II之記錄診斷，且 ≥4個月至＜5歲，且 神經認知測試分值為＞55且≤77 (BSID-III或KABC-II)，或 b.具有MPS II之記錄診斷，且 ≥4個月且＜5歲，且 在依序神經認知測試(BSID-III或KABC-II)上，下降≥1標準差，且測試分值＞55，或 c.具有相對診斷患有具有與個體相同的IDS 突變之重度MPS II，且在遺傳學家觀點上，已遺傳重度形式的MPS II 4.在具有或不具有輔助器之情況下具有足以完成所需方案測試的聽覺及視覺能力，且在測試日順應穿戴輔助器(若適用) 滿足以下排除標準中之任一者之個體將無參與研究資格： 1.具有對於IC注射之禁忌，包括以下中之任一者： a.由加入研究之神經放射學家/神經外科醫師小組之基線MRI測試審核(1/位點)展示對於IC注射具有禁忌 b.先前頭部/頸部手術病史，其引起對於IC注射之禁忌，基於由加入研究之神經放射學家/神經外科醫師小組之可獲得資訊的審核 c.具有對於電腦斷層攝影(CT)、造影劑或對於全身麻醉之任何禁忌 d.具有對於MRI或釓之任何禁忌 e.評估腎小球濾過率(eGFR)＜30 mL/min/1.73 m2 2.具有將禁忌用強的松、他克莫司或西羅莫司治療的任何狀況 3.具有不可歸於MPS II之任何神經認知缺陷或在PI觀點上可混淆研究結果解釋的神經精神病狀診斷 4.具有對於腰穿刺之任何禁忌 5.具有腦室分流 6.已進行造血幹細胞移植(HSCT) 7.已進行利用基於AAV之基因療法產品的先前治療 8.已經由鞘內(IT)投與接受艾杜硫酸酯酶[ELAPRASE® ] 9.已接受IV艾杜硫酸酯酶[ELAPRASE® ]，且經歷認為與IV艾杜硫酸酯酶[ELAPRASE® ]投與相關的嚴重超敏反應，包括過敏反應 10.在簽署知情同意書(ICF)之前第1天之30天或5個半衰期(無論哪個較長)內，已接受任何研究用產品 11.具有在篩選之前至少3個月尚未完全緩解的任何淋巴瘤病史或其他癌症病史，除皮膚鱗狀細胞或基底細胞癌以外 12.每微升(µL)血小板計數＜100,000 13.除非個體具有先前已知吉伯特氏症候群(Gilbert's syndrome)病史且展示經結合膽紅素＜35%總膽紅素的分離膽紅素，否則在篩選時胺基轉移酶(ALT)或天冬胺酸轉胺酶(AST) ＞3 × ULN或總膽紅素＞1.5 × ULN 14.不管最大醫學治療，不受控高血壓(收縮血壓[BP] ＞180 mmHg，舒張BP ＞ 100 mmHg) 15.具有人類免疫缺乏病毒(HIV)或B型肝炎或C型肝炎病毒感染病史，或B型肝炎表面抗原或B型肝炎核心抗體或C型肝炎或HIV抗體陽性篩選測試 16.為臨床現場員工或涉及進行研究之任何其他個體的第一線家族成員，或為臨床現場員工或涉及進行研究的其他個體 17.具有臨床上顯著ECG異常，在PI觀點上其將危害個體之安全性 18.具有嚴重或不穩定醫學或心理病狀，在PI觀點上，其將危害個體之安全性或成功參與研究或研究結果之解釋 19.具有不受控癲癇，在PI觀點上，其將使個體處於過度風險下 與免疫抑制療法相關之排除標準： 20.具有對他克莫司、西羅莫司或強的松起超敏反應之病史 21.具有原發性免疫缺陷(例如常見可變免疫缺乏症候群)、脾切除術或任何傾向於經受感染之潛在病狀的病史 22.具有在篩選之前至少12週尚未完全消退的帶狀疱疹(VZV)、巨細胞病毒(CMV)或埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus) (EBV)感染 23.具有在訪問2之前至少8週未消退、要求住院或用非經腸抗感染劑治療的任何感染 24.在訪問2之前10天內，具有要求口服抗感染劑(包括抗病毒劑)的任何活躍感染 25.具有活躍肺結核(TB)病史或在篩選期間陽性Quantiferon-TB Gold測試 26.在簽署ICF之前8週內，具有任何活毒疫苗 27.在簽署ICF之前8週內進行大型手術，或計劃在研究時間期間進行大型手術 28.預測在參與6個月內有腺樣增殖切除術或扁桃體切除術需求 29.絕對嗜中性白血球計數＜1.3 × 103 /µL 30.具有PI認為將不適合於免疫抑制療法之任何病狀或實驗室異常 統計方法 所有資料將在個體資料表中呈現。將使用頻率及百分比來概述分類變數，且將使用描述性統計值(n、平均值、標準差、中值、最小值及最大值)來概述連續變數。若適當，將呈現圖形顯示。將按劑量組來報導安全性及PD終點，且亦可針對經組合的2劑量組來報導。 樣本大小及能力計算：未進行縮甲醛計算，以測定樣本大小。6.5.2. 縮寫及術語 6.5.3. 研究計劃終點 初級終點 ●在24週期間之安全性：AE及SAE 二級終點 ●在104週期間之安全性：AE報導、實驗室評定、生命體徵、心電圖(ECG)、體檢及神經評定 ● CSF (GAG，I2S活性)、血漿(GAG，I2S活性)及尿液(GAG)中之生物標記 ●認知、行為及適應性功能之神經發育性參數：o 貝利嬰幼兒發育量表(Bayley Scales of Infant and Toddler Development)第3版本(BSID-III) (Bayley, 2005)或考夫曼兒童評估測試(Kaufman Assessment Battery for Children)第2版(KABC-II) (Kaufman, 2004) o文蘭適應行為量表(Vineland Adaptive Behavior Scales)第2版，綜合訪問形式(VABS-II) (Sparrow等人, 2005) ● CSF、血漿及尿液中之載體濃度，藉由定量聚合酶鏈反應(PCR)成構築體1 DNA 探索性終點： ●免疫原性量測 o CSF及血清中的AAV9之中和抗體效價及I2S之結合抗體效價 o酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析：對於AAV9及I2S之T細胞反應 o流式細胞測量術：AAV特異性調節T細胞及I2S特異性調節T細胞 ●藉由大腦之MRI評定之CNS結構異常 ●藉由腹部之MRI評定之肝及脾大小 ●藉由聽覺腦幹反應(ABR)測試量測之聽覺能力變化 ●暫時停止IV ERT (ELAPRASE®)之個體之血漿及尿液GAG ● PedsQL (版本4) ●全球睡眠量表印象 研究設計 此為構築體1之階段I/II、首次在人類中、多中心、開放標記、單一臂劑量增加研究。大致6名患有重度MPS II之兒科個體可參與至2個劑量群組1.3 × 1010 GC/g大腦質量(劑量1)或6.5 × 1010 GC/g大腦質量(劑量2)中，且將接受單一劑量之IC注射投與的構築體1。安全性將為處理之後初始24週(初級研究時間)之主焦點。在完成初級研究時間之後，將繼續評定(安全性及功效)個體直至在用構築體1處理之後總共104週。在研究結束時，將邀請所有個體參與長期追蹤研究。 將在給藥之前至多35天，篩選出可能個體以測定對於研究的合格性。將容許滿足合格性標準之彼等個體在第-2天與第1天上午之間(根據制度實踐)進入醫院，且將在給藥前進行基線評定。個體在第1天將接受單一IC劑量之構築體1，且在給藥之後留在醫院中大致30至36小時以進行觀測。將在4週期間及在第8、12、16、20及24週每週進行初級研究時間(亦即24週期間)的後續評定。在初級研究時間之後，將在第28、32、40、48、52、56、64、78及104週進行訪問。可由家庭保健護士進行第12、40及64週訪問。第20及28週評定將限於AE以及藉由電話接觸之伴隨療法的評估。 基於非臨床研究中之研究結果，所有個體在研究中將均最初接受IS。IS療法將包括皮質類固醇(在給藥前第1天IV甲基強的松10 mg/kg一次，且在第2天以0.5 mg/kg/天開始口服強的松，其中劑量逐步減小且在第12週停止)、他克莫司(第2天至第24週口服[PO] 1 mg，每日兩次[BID]，其中目標血液含量為4-8 ng/mL，且在第24週與第32週之間的8週期間劑量逐漸減小)及西羅莫司(在第-2天，每4小時1 mg/m2 之速效劑量×3劑量，且接著自第-1天：分割為0.5 mg/m2 /天西羅莫司，一天兩次給藥，其中目標血液含量為4-8 ng/ml，直至第48週為止)。將按照表3進行神經評定及他克莫司/西羅莫司血液含量監測。將調整西羅莫司及他克莫司之劑量以將血液含量維持在目標範圍內。 在第48週之後未計劃IS療法。若在第48週之後需要IS來控制臨床相關免疫反應，則將由主要研究者(PI)與醫學監測者及發起人進行討論來判定適當免疫抑制方案，如臨床上所指示。 將經由AE及嚴重不良事件(SAE)之評定、化學、血液學、尿分析、CSF發炎之標記、免疫原性、載體排出(載體濃度)、生命體徵、心電圖(ECG)及體檢(包括神經評定)來監測構築體1之安全性及耐受性。 功效評定將包括神經認知及適應性功能、聽覺能力、大腦MRI、肝及脾大小、CSF、血漿及尿液中之PD生物標記之含量之量測。6.5.4. 個體群體及選擇 研究群體之選擇 將利用研究用產品(IP)對以下大致6名兒科個體進行處理：年齡，≥4個月至＜5歲，已記錄有歸因於MPS II之神經認知缺陷，或具有與遺傳形式之重度MPS II一致的基因型及其家族病史。 納入標準 為了有資格參與此研究，個體必須滿足所有以下標準： 1.在解釋研究性質之後且在任何研究相關步驟之前，個體之法定監護人願意且能夠提供書面簽名的知情同意書。 2.為男性 3.滿足以下標準中之一者： a.具有MPS II之記錄診斷，且 ≥4個月至＜5歲，且 神經認知測試分值為＞55且≤77 (BSID-III或KABC-II)，或 b.具有MPS II之記錄診斷，且 ≥4個月且＜5歲，且 在依序神經認知測試(BSID-III或KABC-II)上，下降≥1標準差，且測試分值＞55，或 c.具有相對診斷患有攜帶與個體相同的IDS 突變之重度MPS II，且在遺傳學家觀點上，已遺傳重度形式的MPS II 4.在具有或不具有輔助器之情況下具有足以完成所需方案測試的聽覺及視覺能力，且在測試日順應穿戴輔助器(若適用)。排除標準 滿足以下排除標準中之任一者之個體將無參與研究資格： 1.具有對於IC注射之禁忌，包括以下中之任一者： a.由加入研究之神經放射學家/神經外科醫師小組之基線MRI測試審核(1/位點)展示對於IC注射具有禁忌 b.先前頭部/頸部手術病史，其引起對於IC注射之禁忌，基於由加入研究之神經放射學家/神經外科醫師小組之可獲得資訊的審核 c.具有對於電腦斷層攝影(CT)、造影劑或全身麻醉之任何禁忌 d.具有對於MRI或釓之任何禁忌 e.評估腎小球濾過率(eGFR)＜30 mL/min/1.73 m2 2.具有將禁忌用強的松、他克莫司或西羅莫司治療的任何狀況。 3.具有不可歸於MPS II之任何神經認知缺陷或在PI觀點上可混淆研究結果解釋的神經精神病狀診斷。 4.具有對於腰穿刺之任何禁忌 5.具有腦室分流 6.已進行造血幹細胞移植(HSCT)。 7.已進行利用基於AAV之基因療法產品的先前治療 8.已經由鞘內(IT)投與接受艾杜硫酸酯酶 9.已接受IV艾杜硫酸酯酶[ELAPRASE® ]，且經歷認為與IV艾杜硫酸酯酶[ELAPRASE® ]投與相關的嚴重超敏反應，包括過敏反應 10.在簽署知情同意書(ICF)之前第1天之30天或5個半衰期(無論哪個較長)內，已接受任何研究用產品 11.具有在篩選之前至少3個月尚未完全緩解的任何淋巴瘤病史或其他癌症病史，除皮膚鱗狀細胞或基底細胞癌以外。 12.每微升(µL)血小板計數＜100,000 13.除非個體具有先前已知吉伯特氏症候群(Gilbert's syndrome)病史且展示經結合膽紅素＜35%總膽紅素的分離膽紅素，否則在篩選時胺基轉移酶(ALT)或天冬胺酸轉胺酶(AST) ＞3 × ULN或總膽紅素＞1.5 × ULN。 14.不管最大醫學治療，不受控高血壓(收縮血壓[BP] ＞180 mmHg，舒張BP ＞ 100 mmHg)。 15.具有人類免疫缺乏病毒(HIV)或B型肝炎或C型肝炎病毒感染病史，或B型肝炎表面抗原或B型肝炎核心抗體或C型肝炎或HIV抗體陽性篩選測試。 16.為臨床現場員工或涉及進行研究之任何其他個體的第一線家族成員，或為臨床現場員工或涉及進行研究的其他個體。 17.具有臨床上顯著ECG異常，在PI觀點上其將危害個體之安全性。 18.具有嚴重或不穩定醫學或心理病狀，在PI觀點上，其將危害個體之安全性或成功參與研究或研究結果之解釋。 19.具有不受控癲癇，在PI觀點上，其將使個體處於過度風險下。 與免疫抑制療法相關之排除標準： 20.對他克莫司、西羅莫司或強的松起超敏反應之病史 21.原發性免疫缺陷(例如常見可變免疫缺乏症候群)、脾切除術或任何傾向於經受感染之潛在病狀的病史 22.在篩選之前至少12週尚未完全消退的帶狀疱疹(VZV)、巨細胞病毒(CMV)或埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus) (EBV)感染 23.在訪問2之前至少8週未消退、要求住院或用非經腸抗感染劑治療的任何感染 24.在訪問2之前10天內，要求口服抗感染劑(包括抗病毒劑)的任何活躍感染 25.活躍肺結核(TB)病史或在篩選期間陽性Quantiferon-TB Gold測試 26.在簽署ICF之前8週內，任何活毒疫苗 27.在簽署ICF之前8週內進行大型手術，或計劃在研究時間期間進行大型手術 28.預測在參與6個月內有腺樣增殖切除術或扁桃體切除術需求 29.絕對嗜中性白血球計數＜1.3 × 103 /µL 30. PI認為將不適合於免疫抑制療法之任何病狀或實驗室異常6.5.5. 治療 治療投與 將呈單一劑量IC投與，來給予研究用產品(IP)、構築體1 (參見圖5)。兩個劑量：1.3 × 1010 GC/g大腦質量(劑量1)或6.5 × 1010 GC/g大腦質量(劑量2)。將考慮按年齡之大腦大小差異來調整總投與劑量(總GC)。總投與產品體積將不超過5 mL。 在此研究期間將不投與參考療法。除IP以外，將給予IS療法，如下文所描述。 研究用產品 構築體1為一種含有hIDS表現盒、具有血清型9衣殼的非複製重組AAV。參見段落[0019]。 AAV =腺相關病毒；CB =雞β肌動蛋白；hIDS =人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶 構築體1為一種非複製重組AAV9載體，其允許在鞘內(IT)投與之後，在中樞神經系統(CNS)中有效表現人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(hIDS)產物。載體基因組含有側接AAV2反向末端重複序列(ITR)之hIDS表現盒。自盒之表現受CB7啟動子驅動，該CB7啟動子為巨細胞病毒(CMV)即刻早期增強子與雞β-肌動蛋白啟動子的雜合體。在雞β-肌動蛋白內含子(CI)之存在下，自此啟動子之轉錄增強。表現盒之聚腺苷酸化信號來自兔β-血球蛋白(RBG)基因。在圖5中說明構築體1之示意性表示。 呈AAV載體活性成分(AAV9.CB7.hIDS)於具有0.001% Pluronic® F68之埃利奧茲B® 溶液中之冷凍溶液形式，來供應最終IP，填充至2 mL晶體ZENITH® (CZ)小瓶中，且用不含乳膠之橡膠塞及鋁翻轉密封件來密封。小瓶應儲存在≤ -60℃下。各IP批次之濃度(以GC/mL為單位)將在分析證明書(CoA)中報導。將在投與手冊中提供詳細給藥說明書(基於產物濃度)。 免疫抑制療法 皮質類固醇 ●在投與載體之上午(給藥前第1天)，個體將在至少30分鐘內接受IV甲基強的松10 mg/kg (最大500 mg)。應在腰穿刺及IC注射IP之前，投與甲基強的松。視情況且由研究者酌情處理用乙醯胺苯酚及抗組胺劑術前用藥。 ●在第2天，將開始口服強的松，其目標為在第12週停止強的松。強的松之劑量將如下： o第2天至第2週結束：0.5 mg/kg/天 o 3及4週：0.35 mg/kg/天 o 5-8週：0.2 mg/kg/天 o 9-12週：0.1 mg/kg o 將在第12週之後停止強的松。可調整強的松之準確劑量至下一較高臨床實踐劑量。 西羅莫司 ●在載體投與之前2天(第-2天)：將投與每4小時西羅莫司1 mg/m2 之速效劑量×3 ●自第-1天：分割為0.5 mg/m2 /天西羅莫司，一天兩次給藥，其中目標血液含量為4-8 ng/ml ●將在訪問之後第48週停止西羅莫司。 他克莫司 ●將在第2天(IP投與後之日)，以1 mg之劑量，每天一兩次，開始他克莫司給藥，且進行調整以達成血液含量為4-8 ng/mL，持續24週。 ●在第24週訪問時開始，將逐漸在8週內停止他克莫司給藥。在第24週，劑量將減少大致50%。在第28週，劑量將進一步減少大致50%。將在第32週停止他克莫司。 ●將按照表3來進行他克莫司及西羅莫司血液含量監測。在段落[00205]-[00227]中論述給藥調整。 將個體分派至治療的方法 合格個體將參與其中，且在等待審核由IDMC之安全性資料之際，依序分派至劑量群組，其中初始3名個體歸為獲得1.3 × 1010 GC/g大腦質量；後續3名個體將歸為得到6.5 × 1010 GC/g大腦質量。 給藥考慮因素 研究用產品 提及針對依序給藥個體計劃之描述的段落[00175]至[00186]，包括審核個別個體之間的安全性資料，且在之後已以任何劑量給藥各群組。 免疫抑制療法 強的松給藥將以0.5 mg/kg/天開始，且在第12週訪問逐漸減小。 將進行他克莫司劑量調整，以使全血低谷濃度在首個24週維持在4至8 ng/mL內。在第24週，劑量將減少大致50%。在第28週，劑量將進一步減少大致50%。將在第32週停止他克莫司。將進行西羅莫司劑量調整，以使全血低谷濃度維持在4至8 ng/mL內。在大部分個體中，可基於以下方程式來進行劑量調整：新劑量=目前劑量× (目標濃度/目前濃度)。在利用濃度監測進一步劑量調整之前，個體應繼續新維持劑量至少7至14天。 以下藥劑及步驟為禁止的： ●在篩選之6個月內不允許IT ERT。 ●在簽署ICF之前在30天或5個半衰期(無論哪個較長)內或在研究期間(在104週期間)之任何時間的任何研究用產品 ●當西羅莫司及/或他克莫司時，應避免活毒疫苗 ●在西羅莫司及/或他克莫司時，應避免CYP3A4及/或P-醣蛋白(PgP)之強力抑制劑(諸如酮康唑(ketoconazole)、伏立康唑(voriconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、紅黴素、泰利黴素(telithromycin)或克拉黴素(clarithromycin))或CYP3A4及/或Pgp之強力誘導劑(諸如利福平(rifampin)或利福布汀(rifabutin))。 ●葡萄柚汁抑制CYP3A酶，從而引起他克莫司及西羅莫司全血低谷濃度增加。個體應避免與他克莫司及/或西羅莫司一起食用葡萄柚或飲用葡萄柚汁。 允許的藥劑及步驟 將允許個體保持在穩定的IV ERT方案以及任何支撐措施(例如物理療法)。根據當地醫院照護標準，將允許個體接受藥療，以在MRI期間預防幽閉恐懼症，及接受全身麻醉，以進行腰穿刺、MRI及神經傳導研究(ABR或感官引起的電位)。 可根據當地照護標準，由研究者酌情給予除上文所描述之藥劑以外的藥劑(認為其為個體之安全性及健康所需(例如高血壓所需))，且記錄在適當CRF部分中。等效物 儘管本發明參考其特定實施例詳細描述，但應理解功能上等效之變化在本發明之範疇內。當然，除本文中所展示及描述之彼等外，對熟習此項技術者而言，本發明之各種修改將自先前描述及隨附圖式而變得顯而易見。此類修改意欲屬於所附申請專利範圍之範疇內。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明之具體實施例的許多等效物。此類等效物意欲由以下申請專利範圍涵蓋。 本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案在本文中均以引用之方式併入說明書中，其程度如同各個別公開案、專利或專利申請案特別且個別地指示為以全文引用的方式併入本文中一般。
圖 1 .人類IDS之胺基酸序列。酶活性需要C84 之轉譯後甲醯基甘胺酸修飾(在圖1中以粗體展示)。八個N連接糖基化位點(N31 、N115 、N144 、N246 、N280 、N325 、N513 及N537 )呈粗體且加框。一個酪胺酸-O-硫酸化位點(Y)呈粗體，且完全硫酸化位點序列(PSSEKY165 ENTKTCRGPD)加框。成熟42 kDa及成熟14 kDa多肽之N端由水平箭頭指示。在大腦中，成熟42 kDa形式之N端在如下位置34或36處開始：T34 DALNVLLI；以及A36 LNVLLIIV，如圖1中所指示。(參見Sleat, 2005, Proteomics 5: 1520-1532, 表S2)。八個N-連接糖基化位點中之兩個(即N280 及N116 )在獲自人類大腦之IDS中為甘露糖-6-磷酸化的。(Sleat等人, 2006, Mol & Cell Proeomics 5.4: 686-701, 在表V處報導)。圖 2 .hIDS與已知異種同源物之多序列比對。物種名稱及蛋白質ID如下：SP|P22304|IDS_HUMAN [智人]；TR|K6ZGI9_PANTR [黑猩猩(Pan troglodytes/Chimpanzee)]；TR|K7BKV4_PANTR [黑猩猩]；TR|H9FTX2_MACMU [恆河獼猴(Macaca mulatta/Rhesus macaque)]；TRF7EJG2_CALJA [白鬢狨(Callithrix jacchus/White-tufted-ear marmoset)]；TR|U3DTL8_CALJA [白鬢狨]；TR|G7NRX7_MACMU [恆河獼猴(Macaca mulatta/Rhesus macaque)]；TR|G7Q1V9_MACFA [食蟹猴(Macaca fascicularis/Crab-eating macaque/Cynomologous monkey)]；TR|H2PX10_PONAB [蘇門答臘猩猩(Pongo abelii/Sumatran orangutan)]； TR|A0A0D9R4D1_CHLSB [綠猴(Chlorocebus sabaeus/Green monkey)]；TR|G1RST8|G1RST8_NOMLE [北方白頰長臂猿(Nomascus leucogenys/Northern white-cheeked gibbon)]；UPI0000D9F625 [恆河獼猴]；UPI000274358B [倭黑猩猩(Pan paniscus/Pygmy chimpanzee/Bonobo)]；UPI00027F6FC5 [橄欖狒狒(Papio Anubis/Olive baboon)]；UPI00027FAE03 [玻利維亞松鼠猴(Saimiri boliviensis/Bolivian squirrel monkey)]；UPI0003ABBF28 [食蟹猴]；UPI000533297F [川金絲猴(Rhinopithecus roxellana/Golden snub-nosed monkey/Pygathrix roxellana)]；UPI0005F40BD2 [彼得安哥拉疣猴(Colobus angolensis palliates/Peters'Angolan colobus)] (SEQ ID NO: 27-44)。圖 3 .hIDS之MPS II突變及對應疾病表型(輕度、中度或重度)。(來自Uniprot)。圖 4 .如Millat等人, 1997, Exp. Cell. Res. 230: 362-367，在圖7處報導之人類IDS加工。圖 5 . 構築體1之示意性表示。圖 6 .AAV衣殼1-9 (SEQ ID NO: 16-26)之Clustal多序列比對。可藉由自其他所比對AAV衣殼之對應位置「募集」胺基酸殘基，對AAV9及AAV8衣殼進行胺基酸取代(在底部列中以粗體展示)。由「HVR」指定之序列區=高變區。

Claims (40)

  1. 一種經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體，其由人類神經元或人類膠細胞產生。
  2. 如請求項1之經糖基化重組人類IDS前體，其約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測。
  3. 如請求項1之經糖基化重組人類IDS前體，其約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
  4. 如請求項1至3中任一項之經糖基化重組人類IDS前體，其自中樞神經系統中之細胞庫分泌，該等細胞經基因工程改造以分泌該人類IDS糖蛋白前體。
  5. 如請求項4之經糖基化重組人類IDS前體，其中該庫係在人類個體之大腦中形成。
  6. 如請求項1至5中任一項之經糖基化重組人類IDS前體，其中該人類神經元或人類膠細胞為IDS活性缺陷型。
  7. 如請求項1至6中任一項之經糖基化重組人類IDS前體，其中該經糖基化重組人類IDS前體包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。
  8. 一種編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中當用於轉導培養物中之初代人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引導分泌性經糖基化人類IDS前體之表現，該分泌性經糖基化人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
  9. 一種編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中該重組核苷酸表現載體適合於向人類大腦之腦脊髓液(CSF)投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
  10. 如請求項9之重組核苷酸表現載體，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌藉由利用細胞培養物中之該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。
  11. 如請求項9或10之重組核苷酸表現載體，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌係在存在及不存在甘露糖-6-磷酸之情況下來確認。
  12. 如請求項8至11中任一項之重組核苷酸表現載體，其中該人類IDS包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。
  13. 如請求項8至12中任一項之重組核苷酸表現載體，其包含控制人類神經元細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的神經元特異性啟動子、或控制人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的膠細胞特異性啟動子。
  14. 如請求項8至13中任一項之重組核苷酸表現載體，其編碼前導肽，該前導肽確保人類神經元細胞或人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之恰當共轉譯及轉譯後加工。
  15. 如請求項8至14中任一項之重組核苷酸表現載體，其為AAV載體。
  16. 如請求項15之重組核苷酸表現載體，其為複製缺陷性AAV載體。
  17. 如請求項15或16之重組核苷酸表現載體，其為AAV9或AAVrh10載體。
  18. 一種調配物，其包含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中該調配物適合於向人類大腦之CSF投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
  19. 一種套組，其包含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體及醫藥學上可接受之載劑，其中該重組核苷酸表現載體適合於向人類大腦之腦脊髓液(CSF)投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
  20. 一種套組，其包含含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體之調配物，其中該調配物適合於向人類大腦之CSF投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
  21. 一種用於治療診斷患有II型黏多醣病(MPS II)之人類個體之方法，其包含向該人類個體之腦脊髓液(CSF)遞送治療有效量之由人類神經元或人類膠細胞產生的經糖基化重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(IDS)前體。
  22. 如請求項21之方法，其中該經糖基化重組人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測。
  23. 如請求項21之方法，其中該經糖基化重組人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
  24. 如請求項21至23中任一項之方法，其中該經糖基化重組人類IDS前體分泌自該中樞神經系統中之細胞庫，該等細胞經基因工程改造以分泌該經糖基化重組人類IDS前體。
  25. 如請求項24之方法，其中該庫在人類個體之大腦中形成。
  26. 如請求項21至25中任一項之方法，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。
  27. 如請求項21至26中任一項之方法，其中該經糖基化重組人類IDS前體包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。
  28. 一種用於治療診斷患有MPS II之人類個體之方法，其包含向該人類個體之CSF投與編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，其中當用於轉導培養物中之初代人類神經元細胞時，該重組核苷酸表現載體引導分泌性經糖基化人類IDS前體之表現，該分泌性經糖基化人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
  29. 一種用於治療診斷患有MPS II之人類個體之方法，其包含向該人類個體之CSF投與編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
  30. 如請求項29之方法，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌藉由利用細胞培養物中之該重組核苷酸表現載體來轉導人類神經元細胞株來確認。
  31. 如請求項29或30之方法，其中該經糖基化人類IDS前體之分泌係在存在及不存在甘露糖-6-磷酸之情況下來確認。
  32. 如請求項28至31中任一項之方法，其中該人類IDS包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。
  33. 如請求項28至32中任一項之方法，其中該重組核苷酸表現載體包含控制人類神經元細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的神經元特異性啟動子、或控制人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之表現的膠細胞特異性啟動子。
  34. 如請求項28至33中任一項之方法，其中該重組核苷酸表現載體編碼前導肽，該前導肽確保人類神經元細胞或人類膠細胞中之該經糖基化人類IDS前體之恰當共轉譯及轉譯後加工。
  35. 如請求項28至34中任一項之方法，其中該重組核苷酸表現載體為AAV載體。
  36. 如請求項35之方法，其中該重組核苷酸表現載體為複製缺陷性AAV載體。
  37. 如請求項35或36之方法，其中該重組核苷酸表現載體為AAV9或AAVrh10載體。
  38. 如請求項28至37中任一項之方法，其中藉由鞘內、腦室內、腰穿刺或鼻內投與，將該重組核苷酸表現載體遞送至該人類個體之該CSF。
  39. 如請求項28至38中任一項之方法，其中該人類個體為IDS活性缺陷型。
  40. 一種用於治療診斷患有MPS II之人類個體之方法，其包含向該人類個體之CSF投與包含編碼人類IDS之重組核苷酸表現載體之調配物，其中該調配物適合於向人類大腦之CSF投與，使得庫在分泌經糖基化人類IDS前體之人類中樞神經系統中形成，該經糖基化人類IDS前體約為90 kDa，如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所量測，含有甲醯基甘胺酸，為α2,6-唾液酸化的，不含有可偵測NeuGc，不含有可偵測α-Gal抗原，及/或為甘露糖-6-磷酸化的。
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