相關申請案之交叉參考
本申請案根據35 U.S.C. § 119(e)主張2017年4月12日申請之美國臨時申請案第62/484,652號之權益，該申請案以全文引用之方式併入本文中。
定義及一般參數
如本說明書中所使用，以下術語及片語一般意欲具有如在下文中闡述之含義，使用其之上下文另外指示的方面除外。 如本文中所使用，在定量量測之情形下所使用的術語「約」意味著指定含量± 10%，或者指定含量± 5%或± 1%。 術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留根本化合物之生物學有效性及特性且在生物學上或其他方面並非不合需要的本文所揭示之化合物的鹽。存在酸加成鹽及鹼加成鹽。醫藥學上可接受之酸加成鹽可由無機酸及有機酸製備。 適用於與根本化合物反應形成醫藥學上可接受之鹽(分別為酸加成或鹼加成鹽)之酸及鹼為熟習此項技術者所已知。若本文中所描述之化合物以酸加成鹽形式獲得，則可藉由使酸鹽溶液鹼化獲得遊離鹼。反之，若產物為遊離鹼，則可根據由鹼化合物製備酸加成鹽之習知程序，藉由將該遊離鹼溶解於適合之有機溶劑中且用酸處理該溶液來產生加成鹽，尤其醫藥學上可接受之加成鹽。熟習此項技術者將認識到可用於製備無毒性醫藥學上可接受之加成鹽的各種合成方法。醫藥學上可接受之酸加成鹽可由無機酸及有機酸製備。衍生自無機酸之鹽包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似者之鹽。衍生自有機酸之鹽包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸及其類似者之鹽。同樣，醫藥學上可接受之鹼加成鹽可由無機鹼及有機鹼製備。衍生自無機鹼之鹽包括僅例如鈉、鉀、鋰、銨、鈣及鎂之鹽。衍生自有機鹼之鹽包括(但不限於)一級胺、二級胺及三級胺之鹽，該等胺諸如烷基胺(亦即，NH
2
(烷基))、二烷基胺(亦即，HN(烷基)
2
)、三烷基胺(亦即，N(烷基)
3
)、經取代之烷基胺(亦即，NH
2
(經取代之烷基))、二(經取代之烷基)胺(亦即，HN(經取代之烷基)
2
)、三(經取代之烷基)胺(亦即，N(經取代之烷基)
3
)、烯基胺(亦即，NH
2
(烯基))、二烯基胺(亦即，HN(烯基)
2
)、三烯基胺(亦即，N(烯基)
3
)、經取代之烯基胺(亦即，NH
2
(經取代之烯基))、二(經取代之烯基)胺(亦即，HN(經取代之烯基)
2
)、三(經取代之烯基)胺(亦即，N(經取代之烯基)
3
、單環烷基胺、二環烷基胺或三環烷基胺(亦即，NH
2
(環烷基)、HN(環烷基)
2
、N(環烷基)
3
)、單芳基胺、二芳基胺或三芳基胺(亦即，NH
2
(芳基)、HN(芳基)
2
、N(芳基)
3
)或混合胺等。僅舉例而言，適合之胺的特定實例包括異丙胺、三甲基胺、二乙基胺、三(異丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、哌嗪、哌啶、嗎啉、N-乙基哌啶及其類似者。類似地，由根本化合物(上文所揭示)製備醫藥學上可接受之鹽的方法為熟習此項技術者所已知且揭示於例如Berge等人,
Journal of Pharmaceutical Science
, 1977年1月，第66卷, 第1期及其他來源中。 如本文中所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括賦形劑或諸如溶劑、稀釋劑、分散介質、塗層、抗菌劑及抗真菌劑之劑、等滲劑及吸收延緩及類似者，該等劑對所揭示化合物或其之使用為無毒的。製備醫藥學上活性物質之組合物的此等載劑及試劑之用途在所屬領域中為熟知的(參見，例如Remington的
Pharmaceutical Sciences
, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA, 第17版(1985)；及
Modern Pharmaceutics
, Marcel Dekker, Inc. 第3版(G.S. Banker & C.T. Rhodes, 編)。 術語「治療有效量」及「有效量」可互換地使用且係指當以一或多個劑量投與至需要此治療之患者(例如，人類)時，足以實現如下所定義之治療的化合物之量。治療有效量應視患者、所治療的疾病、患者的體重及/或年齡、疾病的嚴重程度或由合格處方者或護理者決定的投與方式而變化。 術語「治療(treatment/treating)」意味著投與式(I)化合物或醫藥學上可接受之鹽，以便：(i)延遲疾病發作，即導致疾病的臨床症狀不發展或延緩其發展；(ii)抑制疾病，即遏制臨床症狀的發展；及/或(iii)緩解疾病，即導致臨床症狀或其嚴重程度的消退。
肝臟疾病
肝臟疾病基於疾病持續時間對肝臟的急性或慢性損害。肝臟損害可以由感染、損傷、暴露於藥物或毒性化合物(諸如酒精或食品中之雜質)、血液中正常物質之異常堆積、自體免疫程序、基因缺陷(諸如血色素沈積症)或其他未知的原因引起。例示性肝臟疾病包括(但不限於)肝硬化、肝纖維化、非酒精性脂肪肝臟疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、酒精性脂肪變性肝炎(ASH)、肝缺血再灌注損傷、原發性膽汁性肝硬化(PBC)及肝炎(包括病毒性肝炎及酒精性肝炎兩者)。 非酒精性脂肪肝臟疾病(NAFLD)為肝臟細胞中並非由酒精引起的額外脂肪堆積。NAFLD可引起肝臟腫脹(亦即脂肪變性肝炎)，其隨後可隨時間推移引起瘢痕形成(亦即肝硬化)且可引起肝癌或肝臟衰竭。NAFLD藉由脂肪在肝細胞中之聚積表徵且常常與代謝症候群(例如，2型糖尿病、胰島素抗性、高脂質血症、高血壓)的一些態樣相關。由於攝取富含碳水化合物及高脂的飲食，此疾病的頻率變得愈加常見。NAFLD患者的子集(~20%)罹患非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。 NASH為脂肪肝臟疾病的子類型，其為NAFLD的更嚴重形式。其藉由大泡型脂肪變性、肝細胞氣球樣變性及/或炎症表徵，最終導致肝瘢痕形成(亦即纖維化)。診斷患有NASH的患者進展為晚期肝纖維化且最終為肝硬化。對於患有末期疾病的肝硬化NASH患者，目前治療為肝臟移植。 另一種常見肝臟疾病為原發性硬化性膽管炎(PSC)。其為緩慢損害肝臟內部及外部之膽管的慢性或長期肝臟疾病。在患有PSC的患者中，膽汁由於膽管阻塞而聚積在肝臟中，在此處其逐漸損害肝臟細胞且造成肝硬化或肝臟瘢痕形成。目前，沒有治癒PSC的有效治療。許多患有PSC的患者最終由於肝臟衰竭而需要肝臟移植，通常在診斷為患有該疾病之後約10年。PSC亦可引起膽管癌症。 肝纖維化為在大部分類型的慢性肝臟疾病中發生的細胞外基質蛋白(包括膠原蛋白)之過度聚積。晚期肝纖維化導致肝硬化、肝臟衰竭及門靜脈高血壓且常常需要肝臟移植。
方法
本文揭示一種治療及/或預防有需要之患者之肝臟疾病的方法，其包含將治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑及治療有效量之FXR促效劑組合投與至患者。可藉由血液中升高之酶水準的存在偵測到活性肝臟疾病的存在。特定而言，已知丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST)的血液含量超過臨床上可接受的正常範圍為正在發生肝臟損害的指示。例行監測肝臟疾病患者的ALT及AST血液含量在臨床上用以量測接受醫學治療時肝臟疾病的進展。使升高的ALT及AST降低至可接受的正常範圍內視為反映患者之持續肝臟損害的嚴重程度降低的臨床跡象。 在某些實施例中，肝臟疾病為慢性肝臟疾病。慢性肝臟疾病涉及導致纖維化及肝硬化之肝軟組織的進展性破壞。大體而言，慢性肝臟疾病可由病毒(諸如B型肝炎、C型肝炎、巨細胞病毒(CMV)或Epstein Barr二氏病毒(EBV))、毒性劑或藥物(諸如酒精、甲胺喋呤(methotrexate)或呋喃妥因(nitrofurantoin)、代謝疾病(諸如非酒精性脂肪肝臟疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、血色素沈積症或威爾森氏病(Wilson's Disease))、自體免疫疾病(諸如自體免疫慢性肝炎、原發性膽汁膽管炎(先前稱為原發性膽汁性肝硬化)或原發性硬化性膽管炎)或其他原因(諸如右心衰竭)引起。 在一個實施例中，本文中提供一種用於降低肝硬化程度的方法。在一個實施例中，肝硬化藉由正常微觀小葉架構的損失伴隨纖維化及結節性再生病理地表徵。用於量測肝硬化程度的方法為此項技術中所熟知。在一個實施例中，肝硬化程度降低了約5%至約95%。在一個實施例中，個體中肝硬化程度降低了至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%。在一個實施例中，患者之纖維化分值可自基線，例如自F4減少至F3、自F3減少至F2或自F2減少至F1。 在某些實施例中，肝臟疾病為代謝肝臟疾病。在一個實施例中，肝臟疾病為非酒精性脂肪肝臟疾病(NAFLD)。NAFLD與胰島素抗性及代謝症候群(肥胖、合併高脂質血症、糖尿病(II型)及高血壓)相關。NAFLD視為涵蓋一定範圍的疾病活動，且以肝臟中的脂肪聚積開始(肝脂肪變性)。 已顯示肥胖及胰島素抗性兩者很可能在NAFLD的疾病程序中起重要作用。除不良飲食以外，NAFLD具有數個其他已知的原因。舉例而言，NAFLD可由某些藥劑引起，該等藥劑諸如胺碘酮、抗病毒藥物(例如，核苷類似物)、阿司匹林(罕見地作為兒童之雷氏症候群(Reye's syndrome)之部分)、皮質類固醇、甲胺喋呤、他莫昔芬(tamoxifen)或四環素。藉由高果糖玉米糖漿的存在NAFLD亦與攝取清涼飲料有關，該糖漿可引起腹中脂肪的沈積增加，不過攝取蔗糖顯示類似效果(很可能由於其分解成果糖)。已知遺傳亦起作用，因為已經確認對此易感性的兩種基因突變。 若未經治療，則NAFLD可能發展成非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)，其為NAFLD之最極端形式，係其中脂肪變性與炎症及纖維化組合的狀態。NASH視為肝臟之肝硬化的主要原因。因此，本文提供一種治療及/或預防有需要之患者之非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)的方法，其包含將治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑及治療有效量之FXR促效劑組合投與至患者。 本文亦提供一種治療及/或預防有需要之患者之肝纖維化的方法，其包含將治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑及治療有效量之FXR促效劑組合投與至患者。肝纖維化為在大部分類型的慢性肝臟疾病中發生的細胞外基質蛋白(包括膠原蛋白)的過度聚積。在某些實施例中，晚期肝纖維化導致肝硬化及肝臟衰竭。用於量測肝臟組織學(諸如纖維化程度之變化、小葉肝炎及門靜脈周圍橋連壞死)的方法為此項技術中所熟知。 在一個實施例中，肝纖維化(其係纖維組織、類纖維瘤或纖維變性之形成)之程度降低超過約90%。在一個實施例中，纖維化(其係纖維組織、類纖維瘤或纖維變性之形成)之程度降低至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約40%、至少約30%、至少約20%、至少約10%、至少約5%或至少約2%。 本文中所描述之一些實施例係針對一種治療肝臟疾病之方法，該方法包含投與治療有效量之如本文中所描述之化合物I之形式或如本文中所描述之醫藥組合物。肝臟疾病可分類為4期：F0指示無纖維化；F1指示輕度纖維化；F2指示中度纖維化；F3指示重度纖維化；及F4指示肝硬化。在一個實施例中，本文中所提供之化合物降低肝臟中纖維生成之程度。肝臟纖維生成係導致過量胞外基質成分在肝臟中沈積的過程，稱為纖維化。其在多種病狀中觀察到，例如慢性病毒性B型及C型肝炎、酒精性肝臟疾病、藥物誘導之肝臟疾病、血色素沉著症、自體免疫肝炎、威爾森氏病、原發性膽汁膽管炎(先前稱為原發性膽汁性肝硬化)、硬化性膽管炎、肝臟血吸蟲病及其他。在一個實施例中，纖維生成之程度降低超過約90%。在一個實施例中，纖維生成之程度降低至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少40%、至少約30%、至少約20%、至少約10%、至少約5%或至少2%。本文中所描述之一些實施例係針對一種治療肝臟疾病之方法，該方法包含投與治療有效量之如本文中所描述之化合物I之形式或如本文中所描述之醫藥組合物。肝臟疾病可分類為4期：F0指示無纖維化；F1指示輕度纖維化；F2指示中度纖維化；F3指示重度纖維化；且F4指示肝硬化。 在又其他實施例中，本文提供一種治療及/或預防有需要之患者之原發性硬化性膽管炎(PSC)的方法，其包含將治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑組合以及與治療有效量之FXR促效劑組合投與至患者。 已觀察到患有NASH的患者比表觀遺傳測試中健康的患者平均年長約2.8歲。由此，在一個實施例中，適用於治療NASH的化合物將適用於減緩、改善或逆轉表觀遺傳年齡或因NASH所致的老齡化影響。在另一實施例中，用於治療NASH之組合療法(諸如ASK1抑制劑化合物與如本文中所揭示之ACC抑制劑化合物以及與FXR促效劑之組合)將適用於改善或逆轉因NASH所致的老齡化影響。 在一個實施例中，ASK1抑制劑、ACC抑制劑及FXR促效劑可以組合調配物形式或以分別的醫藥組合物形式一起投與，其中各抑制劑可以任何合適劑型調配。在某些實施例中，本文提供之方法包含分別地投與包含ASK1抑制劑及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物及包含ACC抑制劑及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物以及包含FXR促效劑及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物。根據本發明之組合調配物包含ASK1抑制劑、ACC抑制劑及FXR促效劑以及一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑及視情況選用之其他治療劑。可替代地，ASK1抑制劑、ACC抑制劑或FXR促效劑中之任兩者可與以分別醫藥組合物形式投與之第三者組合於單一調配物中。含有活性成分之組合調配物可呈適用於預期投與方法之任何形式。
ASK1 抑制劑
在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為具有式(I)結構的化合物：
(I)，或其醫藥學上可接受之鹽。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為具有式(II)結構的化合物：
(II)，或其醫藥學上可接受之鹽。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為具有式(VII)結構的化合物：
(VII)，或其醫藥學上可接受之鹽。 式(I)、式(II)及式(VII)之化合物可經合成且使用熟習此項技術者所已知之方法表徵，諸如描述於美國專利申請公開案第2011/0009410號及第2013/0197037號中之彼等方法。在一個實施例中，ASK1抑制劑為式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，ASK1抑制劑為式(II)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，ASK1抑制劑為式(V)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
ACC 抑制劑
在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ACC抑制劑為具有式(III)結構之化合物：
(III)，或其醫藥學上可接受之鹽。在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ACC抑制劑為具有式(IV)結構之化合物：
(IV)，或其醫藥學上可接受之鹽。式(III)及式(IV)之化合物可經合成且使用熟習此項技術者已知之方法表徵，諸如描述於國際申請公開案第WO/2013/071169號中之彼等方法。
FXR 促效劑
在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，FXR促效劑為具有式(V)結構的化合物：
(V)，或其醫藥學上可接受之鹽。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，FXR促效劑為具有式(VI)結構的化合物：
(VI)，或其醫藥學上可接受之鹽。 式(V)及式(VI)之化合物可經合成且使用熟習此項技術者已知之方法表徵，諸如描述於美國公開案第2014/0221659號中之彼等方法。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(I)化合物，ACC抑制劑為式(III)化合物，且FXR促效劑為式(V)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(I)化合物，ACC抑制劑為式(IV)化合物，且FXR促效劑為式(V)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(I)化合物，ACC抑制劑為式(III)化合物，且FXR促效劑為式(VI)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(I)化合物，ACC抑制劑為式(IV)化合物，且FXR促效劑為式(VI)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(II)化合物，ACC抑制劑為式(III)化合物，且FXR促效劑為式(V)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(II)化合物，ACC抑制劑為式(IV)化合物，且FXR促效劑為式(V)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(II)化合物，ACC抑制劑為式(III)化合物，且FXR促效劑為式(VI)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(II)化合物，ACC抑制劑為式(IV)化合物，且FXR促效劑為式(VI)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(VII)化合物，ACC抑制劑為式(III)化合物，且FXR促效劑為式(V)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(VII)化合物，ACC抑制劑為式(IV)化合物，且FXR促效劑為式(V)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(VII)化合物，ACC抑制劑為式(III)化合物，且FXR促效劑為式(VI)化合物。 在本文所揭示之方法及醫藥組合物的某些實施例中，ASK1抑制劑為式(VII)化合物，ACC抑制劑為式(IV)化合物，且FXR促效劑為式(VI)化合物。
給藥及投與
雖然單獨投與活性成分為有可能的，較佳的為將其作為如下文所描述之醫藥調配物或醫藥組合物呈遞。本發明之用於家畜及用於人類用途的調配物均包含活性成分中之至少一者以及其對應的一或多種可接受載劑及視情況選用之其他治療性成分。載劑必須在與調配物之其他成分相容及對其受體生理學無害之意義上為「可接受」的。 各活性成分可與習知載劑及賦形劑一起調配，該等載劑及賦形劑將根據普通實踐選擇。錠劑可能含有賦形劑、滑動劑、填充劑、結合劑及其類似者。水性調配物以無菌形式製備，且在意欲藉由除經口投與以外的方式遞送時通常為等滲的。所有調配物將視情況含有賦形劑，諸如Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986)中所闡述之賦形劑。賦形劑包括抗壞血酸及其他抗氧化劑、螯合劑(諸如EDTA)、碳水化合物(諸如糊精)、羥烷基纖維素、羥基烷基甲基纖維素、硬脂酸及其類似者。調配物之pH值在約3至約11範圍內，但通常為約7至10。 通常，活性成分將以0.01毫克至2公克之劑量投與。在一個實施例中，劑量將為約10毫克至450毫克。在另一實施例中，劑量將為約25至約250毫克。在另一實施例中，劑量將為約50或100毫克。在一個實施例中，劑量將為約100毫克。預期活性成分可以一日投與一次、兩次或三次。又，活性成分可以一週一次或兩次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次或每六週一次投與。在一個實施例中，ASK1抑制劑之劑量為18毫克且ACC抑制劑之劑量為20毫克以及FXR促效劑之劑量為20毫克。 活性成分之醫藥組合物可包括適合於前述投與途徑之彼等醫藥組合物。調配物可宜以單位劑型呈現且可藉由藥劑學技術中熟知之任何方法來製備。技術及調配物通常見於Remington的Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA)中。此等方法包括使活性成分與構成一或多種附屬成分之載劑結合的步驟。一般而言，藉由使活性成分與液體載劑或細粉狀固體載劑或兩者均勻且緊密結合且接著必要時使產物成形來製備調配物。 適合於經口投與的調配物可呈現為分散單元形式，諸如各含有預定量之活性成分的膠囊、扁囊劑或錠劑；粉末或顆粒形式；於水性或非水性液體中之溶液或懸浮液形式；或呈水包油液體乳液或油包水液體乳液形式。活性成分亦可以大丸劑、舐劑或糊劑形式呈現。在某些實施例中，活性成分可以皮下注射形式投與。 錠劑可藉由視情況與一或多種輔助成分一起壓縮或成型來製造。壓縮錠劑可藉由在適合機器中壓縮視情況與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、界面活性劑混合的自由流動形式(諸如粉末或顆粒)之活性成分來製備。可藉由在適合機器中模製經惰性液體稀釋劑濕潤之粉末狀活性成分之混合物來製備模製錠劑。可將錠劑視情況包覆或刻痕且視情況調配，以便提供自其緩慢或控制釋放之活性成分。 活性成分可藉由任何適於病狀的途徑投與。適合途徑包括經口、直腸、經鼻、局部(包括口腔及舌下)、陰道及非經腸(包括皮下、肌肉內、靜脈內、皮內、鞘內及硬膜外)及其類似途徑。應瞭解，較佳途徑可隨例如接受者之病狀而變化。在某些實施例中，活性成分為經口生物可利用的且可因此經口給藥。在一個實施例中，患者為人類。 當與本文中所揭示之方法組合使用時，ASK1抑制劑、ACC抑制劑及FXR促效劑可以單一醫藥組合物形式一起投與或以超過一種醫藥組合物形式分別(同時或依序)投與。在某些實施例中，ASK1抑制劑、ACC抑制劑及FXR促效劑一起投與。在其他實施例中，ASK1抑制劑、ACC抑制劑及FXR促效劑分別投與。在一些態樣中，ASK1抑制劑在ACC抑制劑及FXR促效劑之前投與。在一些態樣中，ACC抑制劑在ASK1抑制劑及FXR促效劑之前投與。在一些態樣中，FXR促效劑在ASK1抑制劑及ACC抑制劑之前投與。當分別投與時，ASK1抑制劑、ACC抑制劑及FXR促效劑可藉由相同或不同的遞送途徑投與至患者。
醫藥組合物
本發明之醫藥組合物包含選自式(I)化合物、式(II)化合物及式(VII)化合物的有效量之ASK1抑制劑，選自式(III)化合物及式(IV)化合物的有效量之ACC抑制劑，及選自式(V)化合物及式(VI)化合物的有效量之FXR促效劑。 當用於例如經口使用時，可製備錠劑、糖衣錠、口含錠、水性或油性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳液、硬或軟膠囊、糖漿或酏劑。可根據製造醫藥組合物之技術中已知的任何方法製備欲用於經口使用之組合物，且此等組合物可含有一或多種試劑，包括甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑，以便提供可口製劑。含有與適用於製造錠劑之醫藥學上可接受之無毒賦形劑摻合之活性成分的錠劑為可接受的。此等賦形劑可為例如惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣或碳酸鈉、乳糖、單水合乳糖、交聯羧甲基纖維素鈉、普維酮(povidone)、磷酸鈣或磷酸鈉；製粒劑及崩解劑，諸如玉米澱粉或褐藻酸；黏合劑，諸如纖維素、微晶纖維素、澱粉、明膠或阿拉伯膠；及潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可未經包覆或可利用已知技術(包括微囊封裝)包覆以延緩在胃腸道中之崩解及吸附，且因此提供較長時段的持續作用。舉例而言，可單獨或伴以蠟採用諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之時間延遲物質。 用於經口使用之調配物亦可呈現為硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈現為軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(諸如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。 本發明之水性懸浮液含有與適用於製造水性懸浮液之賦形劑摻合之活性物質。此等賦形劑包括：懸浮劑，諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯膠；及分散劑或濕潤劑，諸如天然存在之磷脂(例如，卵磷脂)、環氧烷與脂肪酸之縮合產物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、環氧乙烷與長鏈脂族醇之縮合產物(例如，十七伸乙基氧基十六醇)、環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己醣醇酸酐之部分酯的縮合產物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)。水性懸浮液亦可含有一或多種防腐劑，諸如乙基或對羥基苯甲酸正丙酯；一或多種著色劑；一或多種調味劑及一或多種甜味劑，諸如蔗糖或糖精。 油性懸浮液可藉由使活性成分懸浮於植物油(諸如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)中或礦物油(諸如液體石蠟)中來調配。經口懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可添加甜味劑(諸如上述甜味劑)及調味劑以提供可口的經口製劑。此等組合物可藉由添加抗氧化劑(諸如抗壞血酸)來保存。 適用於藉由添加水來製備水性懸浮液之本發明之分散性粉末及顆粒提供活性成分與分散劑或濕潤劑、懸浮劑及一或多種防腐劑之摻合物。合適之分散劑或濕潤劑及懸浮劑由上文所揭示之試劑例示。亦可存在其他賦形劑，例如甜味劑、調味劑及著色劑。 本發明之醫藥組合物亦可呈水包油乳液形式。油相可為植物油，諸如橄欖油或花生油；礦物油，諸如液體石蠟，或此等油之混合物。適合乳化劑包括天然存在之膠狀物，諸如阿拉伯膠或黃蓍膠；天然存在之磷脂，諸如大豆卵磷脂；酯或衍生自脂肪酸及己醣醇酐之偏酯，諸如山梨糖醇單油酸酯，及此等偏酯與環氧乙烷之縮合產物，諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯。乳液亦可含有甜味劑及調味劑。糖漿及酏劑可用諸如甘油、山梨糖醇或蔗糖之甜味劑來調配。此等調配物亦可含有緩和劑、防腐劑、調味劑或著色劑。 本發明之醫藥組合物可呈無菌可注射製劑形式，諸如無菌可注射水性或油性懸浮液。此懸浮液可根據已知技術使用上文已提及之適合分散劑或濕潤劑及懸浮劑來調配。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，諸如於1,3-丁二醇中之溶液；或製備成凍乾粉末。在可接受之媒劑及溶劑中，可採用的有水、林格氏溶液(Ringer's solution)及等張氯化鈉溶液。另外，無菌不揮發性油可習知地用作溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和不揮發性油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。另外，諸如油酸之脂肪酸亦可用於製備可注射劑。 可與載劑物質組合以產生單一劑型的活性成分之量將視所治療的主體及特定投與方式(諸如經口投與或皮下注射)而變化。舉例而言，欲用於人類經口投與之時間釋放調配物可含有約1至1000 mg活性物質與合適且方便量之載劑物質複合，該載劑物質可由總組合物之約5%至約95% (重量:重量)變化。醫藥組合物可經製備以提供容易量測之投與量。舉例而言，欲用於靜脈內輸注之水溶液每毫升溶液可含有約3至500 μg活性成分，以便可以約30 mL/hr之速率進行適合體積之輸注。當經調配用於皮下投與時，調配物通常在約兩個月至約四個月的時段內投與約一個月兩次。 適用於非經腸投與之調配物包括水性及非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者之血液等張之溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑。 調配物可於單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿及小瓶)中呈現，且可在冷凍乾燥(凍乾)條件下儲存，僅需要在臨使用前添加無菌液體載劑(例如注射用水)。即用型注射溶液及懸浮液係由先前所描述種類之無菌粉末、顆粒劑及錠劑製備。較佳單位劑量調配物為含有如上文中所述之每日劑量或單位每日子劑量或其適當部分之活性成分的調配物。
實例 實例 1. 在 NASH 中 細胞凋亡信號調節激酶 (ASK1) 抑制劑 ( 式 (II) ) 與乙醯基 CoA 羧化酶抑制劑 ( 式 (VII) ) 或法尼醇 X 受體 (FXR) 促效劑 ( 式 (V) ) 組合的概念驗證研究
臨床前資料表明ASK1抑制劑與ACC抑制劑或FXR促效劑之組合比單一療法更有效。在此研究中，評估此等組合在患有NASH之個體中之安全性及功效。 征選藉由肝質子密度脂肪分數(PDFF) ≥10%且藉由MRE肝硬度≥ 2.88 kPa診斷患有NASH或肝臟生檢與NASH及2至3級纖維化一致的70個個體。連續組接收用式(II) 18 mg、式(VII) 20 mg或式(V) 30 mg的單一療法(n=10/組)，或經口QD 12週之式(II) + 式(VII) (18/20 mg)或式(II) + 式(V) (18/30 mg)的組合療法(n=20/組)。集中讀取PDFF及MRE，且在基線(BL)、W4及W12處量測血清纖維化標誌物。投與氘代水以量測脂質(脂肪重生[DNL])及纖維化相關標誌物之分數合成(資料正在申請中)。 歷經12週，所有方案均安全且耐受性良好。在單一療法與組合組之間觀測到AE之類似速率(表1)。無個體提前中止治療。與BL相比較，式(VII)引起PDFF (p=0.006)及TIMP-1 (p=0.049)之顯著改善，以及ALT及PIII-NP之非顯著減少(表1)。式(V)單一療法減少PDFF (p=0.010)、GGT (p=0.039)及ALT。式(II) + 式(VII)之組合引起PDFF (p＜0.001)、ALT (p=0.019)及PIII-NP (p=0.057)之顯著減少，而式(II) + 式(V)減少GGT (p=0.030)。 在此患有NASH之患者的概念驗證中，用式(II) + 式(VII)或式(II) + 式(V)之組合治療12週為安全的且引起肝脂肪變性、肝臟生物化學及纖維化標誌物的改善。需要更長持續時間的組織學評估研究以更好地表徵組合療法與單一療法在NASH中之功效。
表 1 ： 在 W12 處 成像、肝臟生物化學及血清纖維化標誌物的安全性及相對 (%) 變化 †
† 所有資料係距BL之中位值(IQR)相對(%)變化或% (n)。 *p＜0.05對比BL。 在此患有NASH之患者的研究中，用式(II) + 式(IV)之組合治療12週為安全的且引起肝脂肪變性、肝臟生物化學及纖維化標誌物的改善。
實例 2. 在 NASH 之大鼠模型中之功效
進行以下研究以相對於單獨的藥劑在大鼠模型中的功效，評估ACC抑制劑、ASK1抑制劑及FXR促效劑之組合在具有纖維化之非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)的該大鼠模型中的功效。藉由投與膽鹼不足的高脂肪飲食(CDHFD) 18週在雄性Wistar Han大鼠中誘導具有纖維化之NASH，該飲食不具有膽鹼，甲硫胺酸較低且飽和脂肪、膽固醇及糖分較高。對照動物保持正常飲食。18週之後，相比於對照小鼠，NASH表型在CDHFD大鼠中建立，且藉由大泡型脂肪變性、升高的ALT及AST及增加的與肝星狀細胞活化相關聯的轉錄物含量來表徵。參見Matsumoto M.等人，迅速發展非酒精性脂肪變性肝炎之纖維化之經改良小鼠模型(An improved mouse model that rapidly develops fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis)，International Journal of Experimental Pathology 2013；94:93-103。 CDHFD 8週之後，大鼠隨後用安慰劑(媒劑)、ASK1抑制劑(式(VII))、ACC抑制劑(式(III))、FXR促效劑(式(V))，用式(VII)及式(III)、式(VII)及式(V)、式(III)及式(V)或式(VII)、式(III)及式(V)之組合治療10週。對照大鼠在整個18週研究時段保持正常飲食。端點分析包括藉由天狼星紅染色(Picrosirus Red stain)量化肝纖維化，藉由α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)染色量化肝星狀細胞活化，量測促纖維變性血液標誌物Timp1、HA及PIINP，以及量測肝臟中之促纖維變性轉錄物Timp1及Col1A1。
方法 動物
雄性Wistar Han大鼠(在研究起始年齡為9週大)在Indianapolis, IN.之CrownBio用於此研究中。用於研究動物的所有步驟遵守美國農業部動物福利法(U.S. Department of Agriculture's Animal Welfare Act) (CFR 9部分1、2及3)；實驗室動物護理和使用指南(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) (實驗室動物研究協會(Institute for Laboratory Animal Research), The National Academies Press, Washington, D.C.)；及美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)，實驗室動物福利局(Office of Laboratory Animal Welfare)。
CDHFD 大鼠模型之生前實驗方案
實驗設計展示於表2中。向研究動物提供標準飲食(LabDiet 5CR4)或可商購的CDHFD (Research Diets Inc, A16092003)至多18週。CDHFD 8週之後，將10個動物(第1組)處死且向保持組開始投藥。針對其餘部分研究(第9週至第18週)，使用相同量之不含化合物(第2組至第4組，媒劑)或如以下表2中所概述之合適化合物之調配物在AM (7:00 +/-1小時)一日一次給藥動物。式(VII)化合物由Research Diets Inc混合成CDHFD。視需要在含0.5%羧基甲基纖維素鈉(培養基黏度)、1% w/w乙醇、98.5% w/w 50 mM Tris緩衝液、pH 8之反滲透水中分別或一起調配式(III)化合物及式(V)化合物。式(VII)化合物以0.03重量%調配於CDHFD中且提供至如表2中所指示之第4組、第7組、第8組及第10組中之大鼠。式(III)化合物以2 mg/mL調配且以表2中所提供之劑量投與至第5組、第7組、第9組及第10組中之大鼠，且式(V)化合物以6 mg/mL調配且以表2中所提供之劑量投與至第6組、第8組、第9組、第10組中之大鼠(所有群組：經口投與，每天一次給藥頻率)。
表 2. 實驗設計及劑量組 *
動物數目 = 10
**
動物數目 = 15 在研究的最後一次劑量之後，將每組中之一半動物在給藥2小時後安樂死且另一半在給藥24小時後安樂死。收集血液，處理成血漿且運送至South San Francisco, CA之DC Therapeutics。肝臟經收集，處理且在VDx臨床前在包埋於Davis, CA之VDx Preclinical處之石蠟中，且接著運送至Foster City之Gilead Sciences。將樣本分段為5 μm且將切片固定於玻璃載片上以用於後續染色。
天狼星 紅染色 ：
在0.2%磷鉬酸(EMS，目錄號26357-01)中預處理切片，且接著隨後在室溫下含0.1% (W/V)天狼星紅(Sirius Red) 88-89-1之飽和苦味酸溶液(EMS，目錄號26357-02)中培育1小時。此切片繼之以0.01N HCl (EMS，目錄號26357)分化且以分級醇脫水。 使用Leica AT2掃描儀以40×放大率捕捉天狼星紅(PSR)染色之載片的完整載片影像。數位載片影像對掃描品質進行檢查、標註且導出至Leica Digital Image Hub檔案內合適的網路文件夾中。使用Visiopharm影像分析軟體(Visiopharm，Hoersholm，Denmark)對完整載片影像執行定量影像分析以測定PSR之程度及強度。量測總的PSR染色面積且表述為總肝臟面積染色之百分比。結果展示於圖1中。 α
-SMA:
切片於二甲苯中3次脫蠟，每次5分鐘，且隨後各自於100% EtOH中復水3次、95% EtOH中1次、80% EtOH中1次，每次3分鐘；隨後在蒸餾水中連續沖洗2次。接著於Peroxidazed 1 (Biocare Medical，目錄號PX968)內源性過氧化酶阻斷劑中培育該等切片5分鐘，且在蒸餾水中沖洗。熱誘導抗原決定基恢復接著使用Reveal Decloaker (Biocare Medical，目錄號RV1000M)在95℃下用Decloaking Chamber NxGen (Biocare Medical，目錄號DC2012)進行40分鐘，隨後用蒸餾水替換恢復緩衝液且置放於tris緩衝生理鹽水(TBS)中來逐漸冷卻。使用Intellipath自動染色儀(Biocare Medical，目錄號IPS0001)使用以下步驟在所製備載片上執行免疫組織化學： 1. 將300 µL Background Punisher (Biocare Medical，目錄號IP974G20)塗覆至載片且培育10分鐘；隨後為TBS洗滌。 2. 塗覆300 µL在Da Vinci綠稀釋劑(Biocare Medical，目錄號PD900L)中以1:50稀釋之小鼠單株SMA之初級抗體純系1A4 (Biocare Medical，目錄號CM001)。在室溫下培育30分鐘；隨後為TBS洗滌。 3. 塗覆300 µLMouse on Rat HRP聚合物(Biocare Medical，目錄號MRT621H)且培育30分鐘；隨後為TBS洗滌。 4. 製備DSB：1滴DSB色原體/1 ml底物緩衝液(Biocare Medical，目錄號分別為BRI 4014C/BRI 4013)。塗覆300 µL深空黑(Deep Space Black；DSB)色原體5分鐘；隨後為蒸餾水洗滌。 5. 用核固紅(Nuclear Fast Red) (Biocare Medical，目錄號STNFRLT)對比染色1分鐘；隨後為蒸餾水洗滌。 將載片自儀器移除且經由一系列分級組織級醇脫水至二甲苯且蓋上載片。 使用Leica AT2掃描儀以40×放大率捕捉α-SMA染色之載片的完整載片影像。數位載片影像對掃描品質進行檢查、標註且導出至Leica Digital Image Hub檔案內合適的網路文件夾中。使用Visiopharm影像分析軟體(Visiopharm，Hoersholm，Denmark)對完整載片影像執行定量影像分析以測定α-SMA之程度及強度。量測總的α-SMA染色面積且表述為總肝臟面積染色之百分比。結果展示於圖2中。
血漿 TIMP-1 ELISA:
重複兩次使用可商購大鼠TIMP-1特定ELISA套組(R&D Systems，Minneapolis，MN，目錄號RTM100)來測定血漿TIMP-1濃度。在微小修改之情況下，根據製造商的說明書在血漿中分析TIMP-1。將緩衝液RD1-21 (50 μL)添加至預塗有小鼠抗TIMP-1之ELISA培養盤孔中。在ELISA之前，產生大鼠TIMP-1之七點標準曲線(NS0表述的重組型TIMP-1：2400-37.5 pg/mL)，且血漿樣本以1:20稀釋於緩衝液RD5-17中。將樣本及標準物(各50 μL)重複兩次添加至含有RD1-21之孔，且在定軌培養盤搖動器(300 rpm)上培育(室溫) 2小時。抗原捕捉之後，培養盤用洗滌緩衝液使用自動培養盤洗滌器洗滌5次(350微升/孔/洗滌)。洗滌之後，將大鼠TIMP-1共軛物(100 μL)添加至各孔，且在定軌培養盤搖動器(300 rpm)上培育(室溫)培養盤2小時。接著洗滌培養盤5次且將底物溶液(100 μL)添加至各孔。在室溫下將培養盤避光培育30分鐘。最後，將終止溶液(100 µL)添加至各孔。緊接著在SpectraMax 190微定量盤式讀取器(Molecular Devices, Sunnyvale CA)上於450 nm處測定光學密度(O.D.)吸光率。各標準及樣本之相對O.D.為針對空白樣本校正的背景，且O.D.至TIMP-1濃縮之轉化的標準曲線使用4種參數曲線擬合方法來產生。未知的樣本TIMP-1濃度使用SoftMax Pro5軟體來測定，該軟體使用20個稀釋因數。結果展示於圖3中。
結果
實例2表明，在NASH之大鼠模型中，用ASK1抑制劑、ACC抑制劑及FXR促效劑組合治療產生比兩種組合或單一組合更大的功效。特定而言，圖1至圖3展示纖維化標誌物的顯著減少，包括天狼星陽性面積百分比、α-SMA陽性面積百分比及與纖維化相關聯的血漿標誌物、具有式(VII)化合物、式(III)化合物及式(V)化合物之三重組合的TIMP1相對於媒劑或雙重組合群組。