TW201900192A

TW201900192A - 用於活減毒阿爾法病毒配方之組成物及方法

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Publication number: TW201900192A
Application number: TW107130863A
Authority: TW
Inventors: 丹Ｔ史汀奇康柏; 吉爾Ａ利文葛德; 萊斯洛瓦爾瓜
Original assignee: 美商武田疫苗股份有限公司
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2019-01-01
Also published as: JP2020193231A; HK1220358A1; US10806781B2; AU2018236897B2; JP6426695B2; US20140271715A1; CA2903711A1; SG10201909051QA; JP6761015B2; ECSP20007842A; MX2015012894A; US10137186B2; DOP2015000226A; CN111729077A; JP2019031543A; EP2968515B1; TWI649087B; AP2015008733A0; EP2968515A1; CN105377293A

Abstract

此處實施例係有關於用於經減毒活的阿爾法病毒配方之組成物及方法。於某些實施例中，活減毒病毒組成物包括但非限制性，一或多個活減毒阿爾法病毒及組成物以減少活減毒阿爾法病毒的失活化及/或降解。於其它實施例中，該活減毒病毒組成物可為疫苗組成物。於又其它實施例中，活減毒阿爾法病毒組成物可包括HEPES緩衝劑。於其它實施例中，該HEPES緩衝劑可進一步包括碳水化合物及明膠。

Description

用於活減毒阿爾法病毒配方之組成物及方法

優先權

本PCT申請案請求美國臨時申請案第61/784,122號申請日2013年3月14日之優先權。此一臨時申請案全文係爰引於此並融入本說明書之揭示用於全部目的。

發明領域

此處實施例係有關於用於穩定化活減毒病毒之組成物及方法。其它實施例係有關於用於減少活減毒病毒之降解的組成物及方法。又有其它實施例係有關於此等組成物用於針對可攜式應用的套組及方法。

發明背景

保護對抗病毒感染之疫苗可有效地用以減少人類或動物疾病之發生率。針對病毒疫苗最成功的技術中之一者為使用該病毒之一弱化的或減毒的種系(「活減毒病毒」)免疫接種動物或人類。由於免疫接種後之複製受限制，故減毒種系不會引發疾病。但該有限的病毒複製已足以表現病毒抗原的全部技能，及產生對該病毒之強力且長期持續的免疫反應。如此，當隨後暴露於該病毒之一病原性種系時，接受免疫接種的個人被保護免於該疾病之侵襲。此等活減毒病毒疫苗乃屬於在公共衛生上使用的最成功的疫苗。

在美國核准銷售的大部分病毒疫苗為活減毒疫苗。高度成功的活病毒疫苗包括黃熱病17D病毒、沙賓氏小兒麻痺病毒型1、2及3、麻疹、腮腺炎、德國麻疹、水痘及牛痘病毒。牛痘病毒疫苗用於控制天花爆發，結果導致第一個且唯一一個被根除的人類疾病。沙賓氏小兒麻痺病毒疫苗協助防止全球嚴重疾病，且正在用於致力於根除小兒麻痺。兒童期接受麻疹、腮腺炎、德國麻疹及水痘疫苗之疫苗接種預防了全球數以百萬計的死亡及發病。

奇昆古尼亞熱(Chikungunya fever)乃蚊蟲媒介的病毒性疾病，晚近在非洲及亞洲捲土重來，造成數以百萬計的重度的且經常為慢性的關節痛病例。奇昆古尼亞熱晚近出現在加勒比海地區，證實已經傳播至西半球。對抗此種病況的疫苗不僅可在全球地方流行病疫區預防該病，同時也能減低輸入美國及美洲其它部分的風險。

晚近技術的進展，諸如重新分類、反向遺傳學及寒冷適應，已經導致流行性感冒及輪狀病毒之活減毒病毒疫苗許可執照的核發。使用重組DNA技術發展的多種活病毒疫苗正在動物及人體臨床試驗中。此等重組病毒疫苗仰賴已經明確地界定特徵的減毒病毒疫苗之操控。安全的減毒病毒經遺傳工程處理以表現針對其它病毒性或細菌性病原的保護性抗原。

為了讓活減毒病毒疫苗有效，病毒在免疫接種之後須能複製。因此，任何失活化病毒因素皆可能重創疫苗。除了凍乾外，已經識別各種添加劑，其有助於穩定化活減毒病毒疫苗中的病毒(例如參考Burke,Hsu等人1999)。

其它常用疫苗對極端溫度敏感；過熱或意外冷凍可能失活化疫苗。在開發中國家整個分銷過程中維持此種「低溫傳輸系統」尤為困難。因此，仍然需要改良既有的及新發展的活減毒阿爾法病毒組成物配方之安定性。

發明概要

此處實施例係有關於減少或預防活減毒阿爾法病毒組成物之劣化或失活化之方法及組成物。所揭示的某些組成物包括可減少活減毒阿爾法病毒劣化的成分組合。此處其它實施例係有關於大為提升活減毒阿爾法病毒之安定性的賦形劑組合。此處又其它組成物及方法係有關於減少低溫(例如冷藏或冷凍儲存)需求，同時延長水性及/或重新調製活減毒阿爾法病毒的儲存壽命。依據此等實施例，活減毒阿爾法病毒組成物能夠用以在個體內對阿爾法病毒誘生免疫反應，其中該個體能夠具有由該阿爾法病毒引發感染之減低的發生率。

若干實施例針對組成物可包括但非限制性，一或多個活減毒阿爾法病毒，諸如一或多個活減毒阿爾法病毒組合HEPES緩衝劑、一或多個碳水化合物及明膠。依據此等實施例，於個體內有用的任何HEPES緩衝劑及任何明膠產物皆可用於該組成物。明膠來源可從衍生自哺乳動物來源者至合成生成明膠形式。用於該組成物的碳水化合物包括但非僅限於蔗糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、果糖、山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇及其它碳水化合物來源。於某些實施例中，要求全部三種成分以穩定化活減毒阿爾法病毒組成物。於其它實施例中，組成物內可添加鹽以提供鹽度或滲透度給該組成物(例如氯化鈉或其它鹽)。於某些實施例中，此處預期涵蓋之組成物可包括但非限制性，約pH 6.0至pH 10.0經緩衝之HEPES於約1mM至40mM HEPES；一或多個碳水化合物劑於約1%至25% w/v；及一或多個蛋白質劑於約0.01%至5.0% w/v，其中該組成物減少活減毒阿爾法病毒之失活化及/或降解。

此處預期涵蓋之組成物可增加穩定化及/或減少活減毒阿爾法病毒之失活化及/或降解包括但非限制性，奇昆古尼亞病毒(chikungunya virus)、奧奈氏病毒(o’nyong’nyong virus)、羅斯河病毒(Ross River virus)、東方馬腦炎、委內瑞拉馬腦炎病毒及西方馬腦炎或冠狀病毒科及披衣病毒科中之其它阿爾法病毒。其它桑利基森林(Semliki Forest)病毒複合物包括但非限制性，貝巴魯(Bebaru)病毒、馬雅羅(Mayaro)病毒、亞型：尤納(Una)病毒、奧奈氏病毒：亞型：伊博-奧拉(Igbo-Ora)病毒、羅斯河病毒：亞型：貝巴魯病毒；亞型：蓋塔(Getah)病毒；亞型：鷺山(Sagiyama)病毒、桑利基病毒：亞型：米崔(Me Tri)病毒。

奇昆古尼亞病毒乃具有約11.6kb正訊息單股 RNA基因體的阿爾法病毒。其係屬於桑利基森林病毒複合物中之一個成員，且與羅斯病毒、奧奈氏病毒、及桑利基森林病毒密切相關。此處描述的組成物可用於桑利基森林病毒複合物中之任何成員以增加穩定化及/或減少用在疫苗組成物中之活減毒病毒之失活化及/或降解。

人類上皮、內皮、一次纖維母細胞及單核細胞衍生之巨噬細胞於試管試驗中對奇昆古尼亞病毒是姑息縱容的，但病毒複製具有高度細胞致病性，但對型I及型II干擾素敏感。於活體內，奇昆古尼亞病毒顯示在纖維母細胞、骨骼肌始祖細胞及肌纖維內複製。

其它實施例有關活減毒病毒組成物及方法有關於能夠減少或預防由此處預期涵蓋之阿爾法病毒中之一或多者引發醫事病況發作的疫苗或免疫原性組成物。此處揭示之藥學組成物係有關於製備用於或配方用於導入一個體諸如人、動物諸如家畜或牲畜之組成物。

於某些實施例中，此處預期涵蓋之組成物可被部分或全部脫水或再水合。又，此處揭示之組成物可在活減毒阿爾法病毒組成物凍乾期間及凍乾後使用。依據此等實施例，組成物可為20%或以上、30%或以上、40%或以上、50%或以上、60%或以上、70%或以上、80%或以上、或90%或95%或以上脫水。此處描述之組成物能夠延長水性或再水合活減毒阿爾法病毒之儲存壽命。此處揭示之組成物在寬廣範圍之溫度，諸如室溫、零下溫度、升溫(例如-80℃-37℃及以上)、凍乾或液體/冷凍條件下提高活減毒阿爾法病毒之安定性。於某些實施例中，比較不暴露於HEPES緩衝劑、碳水化合物及明膠之至少一個組成物的活減毒阿爾法病毒組成物，此處揭示之組成物能夠提高活減毒阿爾法病毒之安定性2倍、4倍、10倍或以上。

其它實施例有關減少活減毒阿爾法病毒之失活化之方法包括但非限制性，組合一或多個活減毒阿爾法病毒與能夠減少活減毒病毒之失活化之組成物包括但非限制性，一或多個蛋白質劑；一或多個醣類或多元醇劑；及一或多個緩衝劑，其中該組成物減少活減毒病毒之失活化。依據此等實施例，該活減毒病毒可包括但非僅限於披衣病毒或冠狀病毒，或於某些實施例中，任何阿爾法病毒。

於某些實施例中，此處預期涵蓋之組成物能夠於室溫(例如約20℃至約25℃或甚至高達37℃)或冷藏溫度(例如約0℃至約10℃)減少水合活減毒阿爾法病毒之失活化及/或降解長達大於12至24小時。於若干實施例中，組合組成物能夠維持約100%活減毒阿爾法病毒達大於24小時。此外，此處預期涵蓋之組合組成物能夠減少水合活減毒病毒之失活化為期至少2個冷凍週期，至少3、至少4、至少5、至少6及更多個解凍週期。其它方法係有關於能夠於冷藏溫度(例如約0℃至約10℃)減少水合活減毒病毒之失活化歷時約24小時至約50日。此等方法中預期涵蓋之組成物可包括但非僅限於緩衝劑、HEPES緩衝劑、一或多個碳水化合物諸如蔗糖或海藻糖及一或多個蛋白質劑含明膠。於某些實施例中，減毒病毒組成物於約37℃大於20小時後保有約100%病毒效價，於約4℃之冷藏溫度經50日後保有約100%病毒效價。此處其它實施例可包括活減毒阿爾法病毒於約21℃經7日後保有約90%或約80%病毒效價，於約4℃之冷藏溫度經50日後保有約90%或約80%病毒效價。其它期望實施例包括比較其它業界已知之組成物於約37℃歷數小時(例如20小時)後維持約3倍至約10倍病毒效價的活減毒病毒組成物(參考例如圖3及圖4)。當組成物儲存於約37℃時，此處揭示之組成物可減少該活減毒阿爾法病毒之降解。

其它實施例有關減少活減毒病毒組成物之失活化的套組包括但非限制性，一容器；及一組成物包括但非限制性，約pH 6.0至pH 8.0經緩衝之HEPES於約1mM至30mM HEPES；一或多個碳水化合物劑(例如蔗糖及/或海藻糖)於約1%至25% w/v；及一或多個蛋白質劑包括明膠於約0.01%至5.0% w/v，其中該組成物減少活減毒阿爾法病毒之失活化及/或降解。依據此等實施例，一套組可進一步包含一或多個活減毒阿爾法病毒。於其它實施例中，一套組可進一步包含鹽溶液(例如氯化鈉)。

於其它實施例中，此處預期涵蓋之組成物可含有微量或不含二價陽離子。例如，此處預期涵蓋之組成物可含有微量或不含鈣/鎂(Ca⁺²/Mg⁺²)。

後文附圖構成本說明書之一部分且係含括以進一步驗證本文特定實施例之某些面向。藉參考此等圖式中之一或多者組合此處呈示的詳細說明部分，將可更明白地瞭解此等實施例。

圖1表示使用各種組成物用以於37℃測試範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗的範例直方圖。

圖2表示使用具有不同碳水化合物劑之組成物用以於4℃測試範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗的範例直方圖。

圖3表示使用各種組成物用以於37℃測試範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗的範例直方圖。

圖4表示使用各種組成物用以於37℃測試範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗的範例直方圖。

圖5表示使用各種液體組成物用以於4℃測試範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗所得資料作圖的範例線圖。

圖6表示使用各種液體組成物用以於-80℃測試範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗所得資料作圖的範例線圖。

圖7表示使用各種凍乾組成物用以於4℃測試範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗所得資料作圖的範例線圖。

圖8表示使用各種凍乾組成物之實驗所得資料作圖的範例線圖，表示於-80℃範例減毒阿爾法病毒組成物之範例直方圖。

圖9表示使用具有不同明膠配方之各種組成物用以測試範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗的範例直方圖。

圖10表示使用具有不同明膠配方之各種組成物用以測試於冷凍-解凍處理後範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗的範例直方圖。

圖11表示使用具有不同明膠配方之各種組成物用以測試於凍乾後範例減毒阿爾法病毒組成物之安定性之實驗的範例直方圖。

定義

如此處使用，「一a」或「一an」可表示一物項中之一者或多於一者。

如此處使用，「約」可表示至多且含正負5%，例如約100可表示95至至多105。

如此處使用，「碳水化合物」劑可表示一或多個單醣(例如葡萄糖、半乳糖、核糖、甘露糖、鼠李糖、塔洛糖、木糖、或阿洛糖、阿拉伯糖)、一或多個雙醣(例如海藻糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖、半乳糖、龍膽二糖、昆布二糖、木二糖、甘露二糖、乳糖或果糖)、參醣(例如阿卡洛糖、棉子糖、松三糖、潘糖、或纖維三糖)或糖聚合物(例如葡萄聚糖、黃膠、普魯蘭聚糖(pullulan)、環糊精、直鏈澱粉、支鏈澱粉、澱粉、纖維寡醣、纖維素、麥芽寡醣、肝醣、殼聚糖、或幾丁質)。

如此處使用，CHIKV可表示奇昆古尼亞病毒。

如此處使用，TCID50可表示50%組織培養感染劑量。

如此處使用，HB可表示HEPES緩衝劑鹽水。

如此處使用，HBS可表示HEPES緩衝劑鹽水+蔗糖。

如此處使用，HSG可表示HEPES緩衝劑鹽水+蔗糖+明膠。

如此處使用，IRES可表示內部核糖體進入位置。

如此處使用，DMEM可表示杜氏改性最低必需培養基。

如此處使用，MCT可表示微離心管。

如此處使用，PBS可表示磷酸鹽緩衝鹽水。

如此處使用，FBS可表示胎牛血清。

如此處使用，Pre-MVS可表示預主宰病毒種子。

如此處使用，取決於所述配方，Lyo可表示凍乾或脫水。

如此處使用，明膠可為半透明無色脆性(乾燥時)無味固體物質，衍生自得自各種動物副產物或其它之膠原蛋白。常見用作為膠凝劑且為市面上可購得。任何市面上可購得分離的或合成明膠劑皆預期涵蓋於此處。

如此處使用，「減毒病毒」可表示當投予動物體時顯示減少的或無臨床病徵的病毒。

詳細說明

於下列章節中，描述範例組成物及方法以便詳細說明各種實施例。熟諳技藝人士須瞭解實施各種實施例並不要求採用此處摘述的特定細節之全部或甚至部分，反而可經由例行實驗修正濃度、時間及其它特定細節。某些情況下，眾所周知之方法或成分不含括於本詳細說明部分。

於此處揭示之某些實施例中，已經評估阿爾法病毒疫苗之安定性。於某些實施例中，已經驗證一種配方，其提供顯著保護效果避免液體、冷凍、凍乾及再水合活減毒阿爾法病毒配方的效價損失。於某些實施例中，此處揭示之組成物係有關於HEPES緩衝劑、包括明膠之一或多種蛋白質劑及一或多種碳水化合物劑中之二或多種或全部三種成分的組合。於某些實施例中，此處揭示之組成物可包括阿爾法病毒於HEPES緩衝劑，碳水化合物包括蔗糖或海藻糖中之至少一者及衍生自任何來源之明膠(例如藥物級或能夠導入體內的等級)。此等配方可用在活減毒阿爾法病毒於約-80℃至約37℃或以上儲存溫度的液體儲存或凍乾儲存而不會顯著喪失CHIK疫苗。例如儲存於4℃對此種配方亦屬可能，原因在於12週後並未觀察得顯著效價損失。

此處實施例係有關於減少或預防活減毒阿爾法病毒組成物之劣化或失活化的方法及組成物。所揭示的某些組成物可包括減少活減毒病毒劣化之成分組合。此處其它實施例係有關於大為增強活減毒病毒安定性之賦形劑的某些組合。此處又有其它組成物及方法係有關於減少低溫需求(例如冷藏或冷凍儲存)同時延長水性及/或重新調製活減毒阿爾法病毒之儲存壽命。

依據此等實施例，某些活減毒病毒係有關阿爾法病毒。有關組成物之若干實施例可包括但非限制性一或多種活減毒阿爾法病毒，諸如一或多種活減毒阿爾法病毒組合HEPES緩衝劑、一或多種碳水化合物及/或一或多種蛋白質劑包括明膠。於某些實施例中，此處揭示之阿爾法病毒配方包括至少全部三種不同成分。於其它實施例中，可添加鹽來提高配方的緩衝能力。

此處預期涵蓋之組成物可提高活減毒阿爾法病毒之安定性及/或減少失活化及/或降解，病毒包括但非限於活減毒阿爾法病毒其包括但非限於奇昆古尼亞病毒、奧奈氏病毒、羅斯河病毒、東方馬腦炎、委內瑞拉馬腦炎病毒及西方馬腦炎、或冠狀病毒科及披衣病毒科之其它阿爾法病毒。

其它實施例係有關於能夠減少或預防由此處涵蓋之阿爾法病毒中之一或多者所引發的醫事病情發作之疫苗組成物。於某些實施例中，活減毒阿爾法病毒無法在蚊子體內複製。於其它實施例中，此處預期涵蓋之活減毒阿爾法病毒經操控而在真核生物的控制之下(例如插入IRES序列)。

於某些實施例中，此處涵蓋之組成物可部分地或全部脫水或水合。於其它實施例中，預期用於此處組成物之碳水化合物劑可包括但非限制性蔗糖、果糖、半乳糖及海藻糖。

於某些實施例中，HEPES緩衝劑為約1mM至約 40mM；碳水化合物濃度為約1至約25% w/v；及明膠為約0.01%至約5%。於其它實施例中，HEPES緩衝劑為約1mM至約20mM；碳水化合物濃度為約5至約20% w/v；及明膠為約0.1%至約2%。於又其它實施例中，HEPES緩衝劑為約5mM至約15mM；碳水化合物濃度為約5至約25% w/v；及明膠為約0.5%至約1.5%。於某些實施例中，配方可進一步包括10-150mM鹽(例如氯化鈉)。其它鹽可用於此處某些實施例。

此處若干實施例係有關於部分或全部脫水活減毒阿爾法病毒組成物。依據此等實施例，組成物可為20%或以上；30%或以上；40%或以上；50%或以上；60%或以上；70%或以上；80%或以上；或90%或以上脫水。於又其它實施例中，此處揭示之組成物可為完全凍乾組成物。

其它實施例係有關於減少活減毒阿爾法病毒失活化之方法包括但非限制性，組合一或多種活減毒阿爾法病毒與能夠減少活減毒阿爾法病毒失活化之組成物包括但非限制性一或多種蛋白質劑；一或多種碳水化合物、醣類或多元醇劑；及HEPES緩衝劑，其中該組成物減少活減毒阿爾法病毒之失活化。依據此等實施例，活減毒病毒可包括特別阿爾法病毒，諸如CHIK相關病毒(例如桑利基森林複合病毒)。

此外，此處揭示之方法及組成物可包括該組合之冷凍乾燥或其它脫水方法。依據此等方法及組成物，該等方法及組成物減少冷凍乾燥或部分脫水或全部脫水活減毒病毒之失活化。於其它方法中，減少活減毒病毒失活化之組成物可包括水性組成物，或可包含脫水後之再水合組成物。此處描述之組成物能夠延長水性或再水合活減毒阿爾法病毒之儲存壽命。

於某些實施例中，此處涵蓋之組成物能夠於室溫(例如約20℃至約25℃或甚至高達37℃)或冷藏溫度(例如約0℃至約10℃)歷時大於12至24小時減少水合活減毒阿爾法病毒之失活化及/或降解。於若干實施例中，組合組成物能夠維持約100%活減毒阿爾法病毒歷時大於24小時。此外，此處涵蓋之組合組成物能夠於至少兩個冷凍及解凍循環期間減少水合或減毒病毒之失活化。其它方法係有關於組合組成物能夠於冷藏溫度(例如約0℃至約10℃)歷時約24小時至約50日減少水合活減毒病毒之失活化。此等方法中涵蓋之組成物可包括但非限制性緩衝劑、HEPES緩衝劑、一或多種碳水化合物諸如蔗糖或海藻糖及一或多種蛋白質劑包括明膠。於某些實施例中，活減毒病毒組成物於約37℃歷時大於20小時後維持於約100%病毒效價，及於約4℃之冷藏溫度經50日後維持於約100%病毒效價。此處其它實施例可包括活減毒阿爾法病毒組成物於約21℃歷時約7日後維持於約90%或80%病毒效價，及於約4℃冷藏溫度歷時50日後維持於約90%或約80%病毒效價。涵蓋之其它實施例包括於約37℃歷經數小時(例如20小時後)，比較技藝界已知之其它組成物維持於約3倍至約10倍病毒效價濃度之活減毒病毒組成物(例如參考圖4及5)。當組成物係儲存於約37℃及其它溫度時，此處揭示之組成物減少活減毒阿爾法病毒之降解。

其它實施例係有關於減少活減毒病毒組成物之失活化之套組包括但非限制性一個容器；及組成物包括但非限制性於pH 6.0至pH 8.0之經緩衝的HEPES，一或多種碳水化合物劑(例如蔗糖及/或海藻糖)，及包括明膠之一或多種蛋白質劑，其中該組成物減少活減毒阿爾法病毒之失活化及/或降解。依據此等實施例，一個套組進一步包括一或多種活減毒阿爾法病毒，於約1至40mM HEPES於pH 6.0至pH 8.0之經緩衝的HEPES，於約1至25% w/v之一或多種碳水化合物，及於約0.01至5.0% w/v之一或多種蛋白質劑包括明膠，其中該組成物減少活減毒阿爾法病毒之失活化及/或降解。

於其它實施例中，此處預期之組成物可含有微量或不含二價陽離子。例如此處預期之組成物可含有微量或不含鈣/鎂(Ca⁺²/Mg⁺²)。

未曾識別任何活減毒阿爾法病毒疫苗配方可提供於大於2-8℃溫度長期凍乾配方之安定性。此外，未曾描述任何配方可防止水性疫苗之效價損失、安定化或減少降解歷時大於數小時。

也曾描述其它活減毒病毒配方(例如參考Burke、Hsu等人1999)。一種常用安定劑稱做SPGA為2至10%蔗糖、磷酸鹽、麩胺酸鉀及0.5至2%血清白蛋白之混合物(例如參考Bovarnick、Miller等人1950)。此種基本配方之各種修改已經識別使用不同陽離子，使用澱粉水解產物及葡萄聚糖替代蔗糖，及使用酪蛋白水解產物或聚乙烯基吡咯啶酮取代血清白蛋白等修改。其它配方使用水解明膠替代血清白蛋白作為蛋白質來源(Burke、Hsu等人1999)。但明膠可能對接受預防接種的小孩引發過敏反應且可能是疫苗相關不良事件的起因。美國專利案6,210,683描述於疫苗配方中使用重組人血清白蛋白取代純化自人類血清的白蛋白。

此處揭示之實施例比較先前技術能夠提升活減毒病毒疫苗之安定性及/或減少劣化。此處揭示之某些組成物提供於或約37℃長達2小時；長達3小時；長達4小時且大於21小時之水性疫苗的安定性。此處揭示之某些組成物提供於約室溫(例如25℃)至多1日至約1週或以上之水性疫苗之安定性。此處預期之實施例提供活減毒病毒對抗例如冷凍及/或解凍，及/或升溫之保護。於某些實施例中，此處組成物可於室溫條件(例如約25℃)安定化、減少劣化及/或預防脫水活減毒病毒產物之失活化。於其它實施例中，此處預期組成物可於約25℃或高達或約37℃安定化、減少劣化及/或預防水性活減毒病毒產物之失活化。此處揭示之組成物及方法可輔助病毒疫苗於已開發區域及未開發區域的儲存、分銷、配送及投藥。

熟諳技藝人士將瞭解此處組成物或配方係有關於藉任何手段操作的病毒包括但非限制性，細胞繼代培養、重新分類、於傳染性純株結合突變、反遺傳學、其它組合DNA或RNA操控。此外，熟諳技藝人士將瞭解其它實施例係有關於經基因工程處理而表現任何其它蛋白質或RNA之病毒，包括但非限於重組阿爾法病毒。此等病毒可用作為傳染病的疫苗，治療腫瘤病症之疫苗，或導入表現蛋白質或RNA(例如基因治療、反訊息治療、核酶治療或小抑制性RNA治療)以治病之病毒。

於若干實施例中，此處組成物可含有披衣病毒或冠狀病毒或披衣病毒科之任何阿爾法病毒之具有套膜的一或多種病毒(例如套膜病毒)。於其它實施例中，此處組成物可含有披衣病毒科或冠狀病毒科之一或多種套膜正股RNA病毒。於若干實施例中，組成物可含有一或多種活減毒阿爾法病毒(例如奇昆古尼亞病毒)具有一或多個插入、刪除或突變以誘導病毒之減毒而用於疫苗組成物。

於某些實施例中，活減毒阿爾法病毒組成物可包括一或多種活減毒阿爾法病毒組構體，描述於美國專利申請案PCT/US2009/000458，申請日2009年1月23日，名稱：無法於蚊體內複製之減毒重組阿爾法病毒及其使用；及美國專利申請案第12/804,535號，申請日2010年7月23日，二案及其連續案及分割案全文皆係爰引於此並融入本說明書之揭示用於全部目的。

此處若干實施例中係有關於呈水性或凍乾形式之活減毒病毒組成物。熟諳技藝人士將瞭解可改良熱病毒安定性及預防冷凍-解凍失活化的配方將改良產物，其為藉技藝界已知方法製備的液體、粉狀、冷凍乾燥或凍乾產品。於重新調製之後，此等安定化疫苗可藉多種途徑投予，包括但非限制性皮內投予、皮下投予、肌肉投予、鼻內投予、肺投予或口服投予。技藝界已知多種裝置用於遞送疫苗包括但非限制性針筒及針頭注射，分叉針頭投予、藉皮內貼片或泵浦投予、皮內無針式噴射遞送(皮內等)、皮內顆粒遞送、或噴霧劑粉末遞送。

實施例可包括組成物其組成為一或多種活減毒病毒(如前文描述)及HEPES緩衝劑或其它緩衝劑；一或多種碳水化合物及一或多種蛋白質其包括明膠之混合物。於某些實施例中組成物包括但非僅限於一或多種活減毒阿爾法病毒、HEPES緩衝劑或其它緩衝劑；一或多種碳水化合物及一或多種蛋白質其包括明膠。

於若干實施例中，碳水化合物為糖或多元醇。糖可包括但非限制性，單醣(例如葡萄糖、半乳糖、核糖、甘露糖、鼠李糖、塔洛糖、木糖、或阿洛糖阿拉伯糖)、一或多個雙醣(例如海藻糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖、龍膽二糖、昆布二糖、木二糖、甘露二糖、乳糖或果糖)、參醣(例如阿卡洛糖、棉子糖、松三糖、潘糖、或纖維三糖)或糖聚合物(例如葡萄聚糖、黃膠、普魯蘭聚糖(pullulan)、環糊精、直鏈澱粉、支鏈澱粉、澱粉、纖維寡醣、纖維素、麥芽寡醣、肝醣、殼聚糖、或幾丁質)。多元醇可包括但非限制性甘露糖醇、山梨糖醇、阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、木糖醇、糖醇、甘醇、聚糖醇、聚乙二醇、聚丙二醇、及甘油。

能忍受低水條件的無水生物有機體含有大量海藻糖。已經顯示海藻糖可預防在乾燥過程中可能造成細胞膜介穩化的膜融合事件及相變遷。結構分析提示海藻糖於脂質雙層的極性頭基間的匹配良好。海藻糖也防止不穩定蛋白質於乾燥過程的變性。相信海藻糖藉與極性蛋白質殘基的氫鍵結而穩定化蛋白質。海藻糖為兩個葡萄糖分子以1：1鍵聯所組成的雙醣。因1：1鍵聯故，海藻糖的強度極少或無減低，因此大致上與胺基酸及蛋白質不具反應性。此種缺乏減低活性改良了海藻糖於蛋白質上的安定化效果。於某些實施例中，海藻糖提供安定性給活減毒病毒。此種海藻糖之活性可能由於其有能力穩定化膜及蛋白質之衣殼蛋白兩者。

於某些實施例中，組成物可描述為典型包括生理上可接受之緩衝劑。熟諳技藝人士瞭解發現HEPES對此處揭示之阿爾法病毒組成物具有出乎意外的安定效果。此外，熟諳技藝人士瞭解調整鹽濃度至接近生理濃度(例如鹽水或0.15M總鹽)對於腸道外投予組成物為最適合，可預防細胞損傷及/或注射部位疼痛。熟諳技藝人士也將瞭解碳水化合物濃度增高，可減低鹽濃度來維持配方的相等滲透度。於某些實施例中，預期涵蓋pH大於6.8之緩衝媒介；有些活減毒病毒(例如阿爾法病毒)於低pH不穩定。於另一個實施例中，生理上可接受之緩衝劑可為磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)。

此處若干活減毒病毒疫苗組成物係有關組成物，其除了具有減低之免疫原性或非免疫原性之外，可提高活減毒病毒之安定性及/或減少劣化。

藥學組成物

此處實施例提供以適合活體內藥學投予之生物上可相容形式將組成物投予個體。「適合於活體內投予的生物上可相容形式」一詞表示欲投予之活性劑(例如本實施例之活減毒病毒)形式，其中活性劑的治療效果係超過任何毒性效應。投予治療上活性量之治療組成物係定義為於該劑量及歷經需要達成期望結果之時間週期的有效量。例如，化合物之治療活性量可依據下列因素改變，諸如個體之疾病狀況、年齡、性別及體重、及在個體內提引出期望反應之該配方能力。用法用量可經調整以提供最佳治療反應。

於若干實施例中，組成物(例如一實施例之藥物化學品、蛋白質、胜肽)可以習知方式諸如皮下、靜脈、口服投予、吸入、經皮施用、陰道內施用、局部施用、皮內或直腸投予。於更特定實施例中，該化合物可經口服或皮下投予。於另一實施例中，化合物可經靜脈投予。於一個實施例中，化合物可經鼻內諸如吸入投予。

化合物可於適當載劑或稀釋劑與組成物共同投予個體。如此處使用「藥學上可接受之載劑」一詞意圖包括稀釋劑諸如鹽水及水性緩衝溶液。活性劑也可經腸道外或腹內投予。分散液劑也可於甘油、液體聚乙二醇及其混合物及於油類製備。於尋常儲存及使用條件下，此等製劑可含有保藏劑來防止微生物生長。

適合注射用之藥學組成物可利用技藝界已知手段投予。例如，可使用無菌水性溶液(當為水可溶性時)或分散液及無菌粉末臨時製備無菌注射溶液劑或分散液劑。全部情況下，組成物可為無菌且可為流體至容易注射的程度。可進一步保藏對抗微生物諸如細菌及真菌的污染作用。藥學上可接受之載劑可為溶劑或分散介質含有例如水、異醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液體聚乙二醇等)及其適當混合物。適當流動性可例如藉使用包衣諸如卵磷脂、於分散液情況藉維持所需粒徑及藉使用界面活性劑而維持。

無菌注射用溶液劑以定量摻混活性化合物與適當溶劑或前述成分中之一者或其組合，視需要接著滅菌而製備。

當配方時，溶液劑可以與該劑量配方可相容方式及以治療上有效量投予。該配方溶液以多種劑型投予，諸如前述注射液之類別。預期緩慢釋放膠囊劑、定時釋放微粒劑等也可用來投予此處所述組成物。此等特定水性溶液特別適合用於靜脈、肌肉、皮下及腹內投予。於若干實施例中，此處揭示之配方可於暴露於本發明之阿爾法病毒之前、之中及/或之後投予。

於另一個實施例中，鼻用溶液劑或噴灑劑、噴霧劑或吸入劑可用以遞送關注之化合物。適合用於其它投予模式之額外配方包括栓劑及托劑。也可使用直腸托劑或栓劑。

口服配方包括此等常用賦形劑，諸如藥學等級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、沙卡林鈉、纖維素、碳酸鎂等。於某些實施例中，口服藥學組成物可包括惰性稀釋劑或可同化可食用載劑，或可包封於硬殼或軟殼明膠膠囊劑內，或可壓縮成錠劑，或可直接摻入三餐食物內。為了用於經口治療投予，活性化合物可摻混賦形劑及呈可食用錠劑、頰用錠、喉片、膠囊劑、酏劑、懸浮液劑、糖漿劑、片劑等形式使用。此等組成物及製劑須含有至少0.1%活性化合物。組成物及製劑之百分比當然可改變且可方便地占單元重量之約2%至約75%或較佳25-60%。於此種治療上有用組成物中之活性化合物用量為可獲得適當劑量。

套組

進一步實施例係有關用於此處描述方法及組成物之套組。組成物及活病毒配方可呈套組提供。套組也可包括適當容器，此處詳細說明之活減毒病毒組成物及選擇性地一或多種額外作用劑諸如其它抗病毒劑、抗真菌劑或抗菌劑。

套組可進一步包括用於有需要的個體經適當等分之組成物。此外，此處組成物可經部分或全部脫水或為水性。此處預期之套組取決於特定配方可儲存於室溫或如此處揭示之冷藏溫度。

套組之容器通常包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射筒或其它容器構件於其中可放置且較佳經適當等分的組成物。當提供額外成分時，套組通常也含有一或多個額外容器，此種作用劑或成分可放置於其中。此處套組典型也將包括含有該作用劑、組成物及任何其它試劑容器呈密閉約束供商業銷售的構件。此種容器可包括固定期望小瓶於其中的射出成形或吹塑模製塑膠容器。

實施例

含括下列實施例以驗證此處程式之某些實施例。熟諳技藝人士須瞭解後文實施例中，揭示之技術表示發現於此處揭示之實務中功能良好之技術，如此可考慮為構成其實施之較佳模式。但熟諳技藝人士鑑於本文揭示須瞭解不背離此處之精髓及範圍於所揭示之特定實施例中，可做出許多改變而仍然獲得類似或相似結果。

實施例1 緩衝劑篩選

於某些具體方法中，識別適合阿爾法病毒疫苗之臨床前期及臨床測試及使用的液體組成物及可凍乾組成物。有關依據此等實施例組成物之液體組成物的一項考量為有些阿爾法病毒為pH敏感(例如對低pH)。因此，此處揭示之組成物的成分須就pH做小心考慮。於某些具體實施例中，配方之pH為約pH 6至約10，許多配方為約pH 6.5至7.5，及至多約9.5。

若干實施例中，減毒奇昆古尼亞病毒(後文稱做CHIK)用作為臨床前期及臨床試驗之阿爾法病毒組成物之範圍。提供用於此等方法之組成物。於一個具體實施例中，預定量之CHIK-IRES病毒(pMVS)，此處減毒病毒係在IRES插入之控制之下。任何減毒阿爾法病毒皆可用於此等範例組成物以提高組成物之穩定性及減少降解。初步，測試許多不同基本緩衝劑，諸如DMEM、PBS、HEPES及其它。

進行某些試驗，諸如於37℃孵育長達21小時以測試減毒病毒配方之安定性。取樣藉TCID₅₀於96孔孔板滴定針對非洲綠猴腎(Vero)細胞傳染性病毒的存在。求出比較輸入(未經孵育)疫苗對照組，剩餘病毒百分比。10⁵ TCID₅₀ CHIK病毒疫苗於單獨含PBS、20% DMEM或DMEM緩衝葡萄糖之組成物的孵育驗證強度快速喪失。發現某些範例組成物可有效安定化減毒阿爾法病毒諸如CHIK病毒疫苗，例如組成物含有各種濃度HEPES緩衝劑(4-(2-羥基乙基)-1-哌乙烷磺酸)(資料未顯示)諸如約1至約30mM HEPES。於一個實施例中，發現含有150mM NaCl及15mM HEPES(HEPES緩衝劑食鹽水，HS)之組成物比較對照組給減毒阿爾法病毒疫苗提供增高的安定性(圖1)。

圖1及2表示範例直方圖例示減毒阿爾法病毒CHIKV疫苗於37℃於各種組成物內培養約21小時後剩餘強度(以指示之時間週期剩餘總病毒百分比表示)。含不等濃度HEPES之組成物比較其它緩衝劑組成物顯著提高CHIK疫苗之安定性(20%-55%相較於低於10%，資料未顯示)。於圖1中，含15mM HEPES具有150mM NaCl或15mM HEPES之組成物比較其它驗證對疫苗安定性及強度的顯著效果。

實施例2

於若干其它範例方法中，進行於4℃之長期安定性實驗來分析各種碳水化合物(例如糖類)對阿爾法病毒疫苗安定性諸如CHIK病毒疫苗的功效，該實驗係基於觀察包括一或多種碳水化合物具有對CHIK疫苗安定性的正面效果。生成含有HEPES及碳水化合物之組成物，諸如蔗糖、乳糖、海藻糖、半乳糖、果糖、D-山梨糖醇、葡萄糖及D-甘露糖醇。於此等組成物中配方個別等分之預定濃度的CHIK-IRES疫苗(pMVS)，及於4℃培養12週。於圖2指示之時間點收集樣本及於Vero細胞上滴定。如圖2之例示，約15%海藻糖；15%蔗糖或10% D-甘露糖醇組合HEPES緩衝食鹽水(HB)之組成物驗證比其它組成物更佳的病毒安定性之同等改善。

於某些範例方法中，包括蔗糖或海藻糖之配方檢查有關阿爾法病毒疫苗及其它配方之安定性增高等性質。於某些方法中，10⁵ TCID₅₀ CHIK病毒疫苗於室溫、37℃，於有或無蛋白質存在下，與增高濃度之蔗糖或海藻糖於HEPES緩衝液(HB)之各種組成物內培養及分析安定性長達21小時。如圖3直方圖之歷史，含有HEPES緩衝劑及5%蔗糖(稱作HBS)之HEPES緩衝劑及15%海藻糖之組成物比含有HEPES緩衝劑及人血清白蛋白或於其它碳水化合物濃度之組成物更安定。

圖2為範例線圖顯示於4℃歷經12週時間液體阿爾法病毒組成物、含HEPES緩衝食鹽水及各種碳水化合物之CHIKV疫苗組成物之安定性。圖2表示範例直方圖例示於4℃於有或無0.1% HSA存在下歷經數週，於含有HEPES緩衝劑，150mM NaCl及各種濃度之碳水化合物例如蔗糖或海藻糖之組成物內培養後剩餘之總病毒百分比。

實施例3 蛋白質誘生安定性配方之篩選

於其它範例方法中，分析不同蛋白質劑之阿爾法病毒配方安定性比對照組、不含蛋白質或含其它蛋白質的配方增高。含HB或HBS具有目標蛋白質劑之組成物接受分析。每個實驗條件約10⁵減毒CHIK疫苗組成物培養(37℃歷時約21小時)後取出液分，藉TCID₅₀滴定於Vero細胞的生長。然後評估剩餘病毒效價之百分比。如圖4例示，添加明膠至含或不含碳水化合物之配方增高了阿爾法病毒疫苗於37℃之安定性(參考圖4)。

圖4表示範例直方圖例示於37℃歷時約21日，於含HEPES緩衝食鹽水及蛋白質，諸如乳鐵蛋白、崔普同(Tripton)、乳白蛋白、及明膠之組成物內培養後剩餘CHIK病毒效價的總百分比。全部試驗組成物中，含有明膠及HB緩衝劑之組成物藉疫苗安定性，藉於室溫阿爾法病毒之降解減少而驗證安定性增高。當組成物內含有碳水化合物諸如蔗糖時觀察得超過加成效果。

觀察得阿爾法病毒之安定性比較儲存於單獨含FBS或PBS之培養基的疫苗顯著增高。產生極為安定病毒疫苗之一種範例配方決定為HEPES緩衝劑、蔗糖及明膠配方。配方中包括重組明膠，大為減低此種阿爾法病毒疫苗之不安定性。

實施例4 長期安定性研究

於若干範例方法中，分析明膠濃度範圍以決定哪種明膠濃度對阿爾法病毒組成物具有最佳安定性質。於一種方法中，於某些組成物中，選擇兩種濃度的明膠與HBS組合使用(HBS+0.5%及HBS+1%明膠)。然後使用含明膠及HBS之組成物進行長期安定性研究評估於4℃或-80℃之液體CHIK疫苗(表1)。此等組成物之實施例提供如下。

組成物實施例：

1. HB-HEPES緩衝液食鹽水15mM HEPES及150mM NaCl

2. HBS-HEPES緩衝劑食鹽水含5%蔗糖

3. HSG(0.5%明膠)-HEPES緩衝劑食鹽水含5%蔗糖及0.5%明膠

4. HSG(1%明膠)-HEPES緩衝劑食鹽水含5%蔗糖及1%明膠

此等組成物中調配的疫苗樣本以500微升體積儲存於1.5毫升MCT。每種配方15樣本儲存於4℃(微氣候室(Micro Climate Chamber))；型號# MCB-12-33-33-H/AC)及15樣本儲存於-80℃(社摩(Thermo)；型號# ULT2186-6-D43)。

於表1及圖5-6指示的時間點採樣進行強度評估。於4℃培養之樣本(圖5)與於-80℃培養之樣本(圖6)並列分析來驗證經歷36週的效價趨勢。如圖5線圖例示，以此種組成物配方之疫苗於4℃長達12週顯示效價損失顯著減少。培養24週後，觀察得1 log₁₀TCID₅₀或以上之病毒效價損失。添加明膠驗證對阿爾法病毒疫苗配方(減毒CHIK)之安定化有顯著正面效果。於整個研究期間全部試驗組成物中阿爾法病毒組成物於-80℃皆為安定(圖6)。

實施例4 凍乾配方

於另一個範例方法中，評估凍乾減毒阿爾法病毒配方(例如CHIK疫苗配方)之長期安定性。凍乾疫苗配方儲存於4℃(圖7)或-80℃(圖8)。於指定時間點採樣重新調製及於Vero細胞滴定，藉TCID₅₀表示。於HSG(0.5%及1%明膠兩種)中配方之範例減毒CHIK疫苗驗證於4℃大於80週病毒效價極少損失，而HB或HBS組成物於24週後損失約1 log₁₀TCID₅₀病毒效價(圖7)。歷經80週及以上時間，全部試驗組成物中之CHIK疫苗於-80℃極為安定(圖8)。

於一個範例方法中，比較來自不同來源之明膠安定化CHIK疫苗之能力。觀察得任何製造上包括希格瑪(Sigma)、默克(Merck)、泰克尼(Tekni)及傑力塔(Gelita)間並無任何差異(圖9)。

圖5-6表示範例線圖驗證於4℃(圖5)或於-80℃(圖6)長達80-90週時間，儲存於含HB、HBS或HSG之組成物內液體減毒阿爾法病毒疫苗配方(例如CHIK V)之安定性增高。圖7-8表示範例線圖驗證於4℃(圖7)或於-80℃(圖8)歷時 80-90週，於含HB、HBS或HSG組成物內之凍乾CHIK V疫苗之強度。

圖9提供得自不同來源之明膠對安定化CHIK疫苗之功效比較之範例直方圖。

圖10表示範例直方圖比較來自不同來源之明膠對冷凍-解凍(F-T)處理後CHIK疫苗安定性之效果。CHIK疫苗組成物包括含0.5%明膠之HEPES(HS)緩衝劑。試驗來自五個不同來源的明膠，包括希格瑪、默克、泰克尼、傑力塔及尼塔(Nitta)。CHIK疫苗組成物暴露於一(1X)、三(3X)或五(5X)回合F-T處理。在不同來源的明膠間並未觀察得顯著差異。因此本資料證實任何來源的明膠(例如能夠導入個體，諸如藥學等級)可用於本配方以提高活減毒病毒於此處揭示組成物之安定性。

圖11例示範例直方圖比較來自不同來源的明膠對凍乾後CHIK疫苗安定性的效果，與液體培養做比較。CHIK疫苗組成物包括含0.5%或1.0%明膠之HEPES(HS)緩衝劑。試驗得自默克及尼塔(比眉翠(beMatrix))之明膠。得自默克及尼塔之明膠間並未觀察得顯著差異。CHIK疫苗組成物製造穩定凍乾餅，比較液體配方，從凍乾重新調製後保有顯著效價。

材料及方法

個別液分預定劑量之CHIK-IRES病毒(pre-MVS)於含緩衝劑之組成物內配方，包括Hepes緩衝食鹽水(HB)、含蔗糖之HEPES緩衝食鹽水(HBS)、含蔗糖及明膠之HEPES緩衝食鹽水(HSG)於不等濃度明膠(例如0.5%及1%明膠)。經配方的水合疫苗或液體疫苗於某個溫度諸如室溫37℃、冷凍4℃或急速冷凍-80℃培養。以預定時間間隔從此等配方採樣，藉TCID₅₀於例如96孔孔板使用Vero細胞滴定感染病毒的存在。

細胞系及組織培養

製備衍生自申請人的cGMP工作細胞存庫之研究及Vero細胞存庫以進行此等實驗。獲得Vero細胞：Vero(WHO)工作細胞存庫繼代培養：142(批號#INV-VERO-WCB-001；5x10⁶)，儲存於液態氮。小瓶於水浴中快速解凍，直接接種於預先溫熱的cDMEM(杜氏改性最低必需培養基)，約19毫升含青黴素-鏈黴素 (penicillin-streptomycin)，40mM L-麩胺及10% FBS於T-75平方厘米燒瓶內及於37℃，5% CO₂培養。讓細胞生長至融合，及使用PBS胰蛋白酶(海克隆(HyClone)，例如型號#SH30042.01)及cDMEM-10次培養。此燒瓶膨脹至兩個T-185平方厘米燒瓶及生長之細胞達到100%融合。藉胰蛋白酶處理，於800 x g離心10分鐘，及重新懸浮於DMEM含20% FBS及10% DMSO於1x10⁷細胞/毫升濃度收獲細胞。此等細胞(共20毫升)等分入低溫小瓶內(20x1毫升)及貼標籤：Vero WHO WCB p#142-2(威斯曼(Waisman)(WWCB))1毫升1 x 10⁷細胞/毫升，13Jan12 LV及儲存於液態氮。

Vero WWCB_I WHO細胞經生長且維持於含青黴素-鏈黴素及10% FBS(海克隆)之杜氏改性最低必需培養基(DMEM)(DMEM-10%-FBS)。胰蛋白酶用來維持細胞。於病毒吸附前兩日，96孔孔板接種1.4 x 10⁵細胞/毫升於100微升/每孔DMEM-FBS-10%。每天監視孵育器維持於指示溫度。病毒之稀釋、吸附及TCID₅₀檢定分析係於cDMEM-FBS 2%中進行。

CHIK減毒病毒

所述各種方法中使用的分子代CHIK疫苗標示為CHIK-002(如前述)。生成CHIK疫苗及傳播於Vero細胞。前主控病毒種子備料以105 TCID₅₀/毫升濃度用於此等實驗。簡言之，於Vero細胞單層感染後生成CHIK-pre-MVS。疫苗-病毒分泌入上清液內，於澄清/去除死Vero細胞後，從培養基收獲病毒。CHIK-pre-MVS於含10% FBS之DMEM中安定化，且儲存於-80℃。

檢定分析方法

TCID₅₀檢定分析方法用於定量疫苗製劑中存在的感染病毒量(強度或安定性)。TCID₅₀定義為在96孔孔板之感染孔一系列複本中有一半顯示病毒感染力徵象，例如利用CPE(細胞致病效應)證實的病毒稀釋濃度。Vero細胞(WWCB_I WHO)經生長且維持於含青黴素-鏈黴素，L-麩胺及10% FBS(海克隆)之杜氏改性必需最低培養基(DMEM 10%-FBS)。配方樣本液分於水浴中快速解凍及混合。進行pre-MVS初期稀釋成工作濃度，於96孔孔板內於例如cDMEM-2%FBS做出此等樣本之10倍稀釋系列。接種Vero單層之前稀釋病毒維持於4℃。檢定分析時，從96孔孔板吸取生長培養基，添加各100微升病毒稀釋液至各孔。孔板於37℃及5% CO₂培養3-5日。使用Spearman-Karber方法計算效價。

疫苗配方

使用含研究等級疫苗製劑及於英維拉珍(Inviragen)衍生的CHIK-IRES pMVS製備安定性實驗。為了使用此處提供之各種組成物篩選實驗及安定性研究，以終體積500微升每個樣本含有10⁵ TCID₅₀/mL病毒製備疫苗配方。樣本以所指定的緩衝劑/配方大量製造，研究開始前採樣輸入樣本作為初始效價測量值。樣本等分於MCT及儲存粒徑指定時間及溫度。針對500微升終體積每樣本含105 TCID₅₀/mL病毒製備四種配方。大量製備每個配方60個樣本，在等分成含500微升的1.5毫升MCT之前採樣輸入樣本。

配方疫苗儲存

疫苗配方儲存於4℃(微氣候室；型號#MCB-12-33-33-H/AC)及於-80℃(瑞福可(REVCO)伊萊普(Elite Plus)；型號#ULT2186-6-D43)。使用迪克森(Dickson)精靈(Wizard)2-900MHZ自動記錄器(型號#WT-220用於4℃及WT-240用於-80℃)監視兩個系統。

鑑於本文揭示無需經由不必要的實驗即可製作及執行此處揭示及請求專利的全部組成物及方法。雖然已經以較佳實施例之形式描述組成物及方法，但熟諳技藝人士顯然易知不背離此處構思、精髓及範圍，可對組成物及方法及此處所述方法之步驟或步驟順序施加各種變化。更明確言之，某些化學上及生理上兩者相關的作用劑可取代此處描述之作用劑而仍然達成相同的或相似的結果。熟諳技藝人士顯然易知的全部此等相似的取代及修正皆視為落入於隨附之申請專利範圍所界定之精髓、範圍及構思內。

Claims

一種活減毒阿爾法病毒(live,attenuated alphavirus)病毒組成物，其包含：一或多個活減毒阿爾法病毒，其中所述活阿爾法病毒係選自於由下列所組成的組群：奇昆古尼亞(CHIK)病毒(chikungunya virus)、奧奈氏病毒(o’nyong’nyong virus)、東方馬腦炎、西方馬腦炎、及委內瑞拉馬腦炎；及1.0mM至20.0mM HEPES緩衝劑；其中該組成物穩定化所述活阿爾法病毒。
如請求項1之組成物，其進一步包含鹽。
如請求項2之組成物，其中該鹽包含NaCl。
如請求項3之組成物，其中該NaCl濃度包含從10mM至200mM。
如請求項1至4中任一項之組成物，其進一步包含一或多個碳水化合物劑，其選自於由下列所組成的組群：海藻糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖(dextrose)、殼聚糖(chitosan)、及其等之組合。
如請求項5之組成物，其中該一或多個碳水化合物濃度為從5.0%至20.0% w/v。
如請求項1至4或6中任一項之組成物，其中HEPES之濃度為從5.0mM至15.0mM之HEPES緩衝劑。
如請求項7之組成物，其中所述活減毒阿爾法病毒包含活減毒CHIK病毒。
一種減少活減毒阿爾法病毒之失活化之方法，該方法包含將一或多個活減毒阿爾法病毒與包含1.0mM至20.0mM HEPES緩衝劑之一組成物組合；其中所述活減毒阿爾法病毒係選自於由下列所組成的組群：奇昆古尼亞(CHIK)病毒(chikungunya virus)、奧奈氏病毒(o’nyong’nyong virus)、羅斯河病毒(Ross River virus)、桑利基森林病毒(Semliki Forest virus)複合物、東方馬腦炎、西方馬腦炎、及委內瑞拉馬腦炎；其中該組成物減少所述活減毒阿爾法病毒之失活化。
如請求項9之方法，其中所述活減毒阿爾法病毒為CHIK病毒。
如請求項9或10之方法，其中該組成物進一步包含鹽。
如請求項11之方法，其中該鹽包含NaCl。
如請求項12之方法，其中該NaCl濃度包含從10mM至200mM。
一種如請求項1至4、6或8中任一項之組成物的用途，其係用於製備減少一與阿爾法病毒相關之健康狀況的發作或預防一與阿爾法病毒相關之健康狀況之藥物。
一種用於減少活減毒阿爾法病毒之失活化之套組，其包含：至少一個容器；活減毒阿爾法病毒，其係選自於由下列所組成的組群：奇昆古尼亞(CHIK)病毒(chikungunya virus)、奧奈氏病毒(o’nyong’nyong virus)、羅斯河病毒(Ross River virus)、桑利基森林病毒(Semliki Forest virus)複合物、東方馬腦炎、西方馬腦炎、及委內瑞拉馬腦炎；及從1.0mM至20.0mM之HEPES緩衝劑。
如請求項15之套組，其中所述活減毒阿爾法病毒包含CHIK病毒。
如請求項15或16之套組，其進一步包含鹽。
如請求項17之套組，其中該鹽包含NaCl。
如請求項18之套組，其中該NaCl濃度包含從10mM至200mM。
一種製備活減毒阿爾法病毒以供製造免疫原性組成物的方法，其包含：取得一或多個活減毒阿爾法病毒，其中所述活減毒阿爾法病毒係選自於由下列所組成的組群：奇昆古尼亞(CHIK)病毒(chikungunya virus)、奧奈氏病毒(o’nyong’nyong virus)、羅斯河病毒(Ross River virus)、桑利基森林病毒(Semliki Forest virus)複合物、東方馬腦炎、西方馬腦炎、及委內瑞拉馬腦炎；將該一或多個活減毒阿爾法病毒與一組成物組合，該組成物包含1.0mM至20.0mM之HEPES緩衝劑，其中該組成物減少所述活減毒阿爾法病毒之失活化；及儲存有所述活減毒阿爾法病毒於該組成物中的組合物以用於運輸。
如請求項20之方法，其中所述活減毒阿爾法病毒包含活減毒CHIK病毒。
如請求項20或21之方法，其中該組成物進一步包含鹽。
如請求項20之方法，其中儲存該組合物包含在儲存該組合物之前冷凍該組合物。
如請求項20之方法，其中儲存該組合物包含儲存該組合物於冷藏溫度。
如請求項20之方法，其中儲存該組合物包含儲存該組合物於室溫。