TW201840582A - 肽化合物及其製造方法、篩選用組成物、以及肽化合物的選擇方法 - Google Patents

肽化合物及其製造方法、篩選用組成物、以及肽化合物的選擇方法 Download PDF

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Abstract

本發明的課題在於提供一種細胞膜滲透性優異之新穎的環肽化合 物、其製造方法、篩選用組成物以及結合於靶物質之環肽化合物的選擇方法。依本發明，可提供下述式(1)所表示之肽化合物或其鹽。式中，各記號具有本說明書中所記載之含義。

Description

肽化合物及其製造方法、篩選用組成物、以及肽化合物的選擇方法
本發明關於一種肽化合物、其製造方法及篩選用組成物。本發明進一步關於結合於靶物質之肽化合物的選擇方法。
包含環狀結構或非天然胺基酸之肽由於膜滲透性、靶結合能力及生物體內穩定性優異，因此作為新的創藥系列而受到矚目。例如，在專利文獻1及非專利文獻1中記載有包括硫醚環化方法或三唑環化方法之環肽化合物的製造方法、以及使用上述環肽化合物之藥劑探索方法。
藥劑探索方法基於如下：形成經轉譯之肽與成為該肽的來源之基因連結之複合體，藉由解讀結合於靶物質之肽複合體的基因來判斷肽結構。作為形成該複合體之方法，在專利文獻2中記載有包括以下階段之生成DNA肽複合體之方法：使RNA(核糖核酸)分子與肽受體交聯之階段；轉譯RNA來生成肽產物之階段；及反轉錄RNA來生成DNA(去氧核糖核酸)．肽複合體之階段。又，在專利文獻3中記載有包括以下階段之生成RNA．肽複合體之方法：提供RNA分子之階段；及以在RNA分子的3’末端形成共價鍵之方式化學連結肽受體之階段。
另一方面，作為形成環狀化合物之方法，已知有幾種方法。例如，在專利文獻4中記載有伴隨二硫化物的還元及醯胺鍵的水解之、形成噻唑啉 環之方法。
【先前技術文獻】 【專利文獻】
【專利文獻1】日本特開2012-058092號公報
【專利文獻2】國際公開第2000/032823號小冊子
【專利文獻3】日本特開2010-284172號公報
【專利文獻4】美國專利第2015/0056137號說明書
【非專利文獻】
【非專利文獻1】特殊環肽的轉譯合成與對醫藥品探索之開展、生化學 第82卷 第6號、pp505-514、2010
本發明的課題在於提供一種細胞膜滲透性優異之新穎的肽化合物、其製造方法及篩選用組成物。本發明的另一課題在於提供一種結合於靶物質之肽化合物的選擇方法。
本發明人等對上述課題重複進行了深入研究，其結果顯現，本說明書中所記載之通式(1)所表示之化合物或其鹽具有優異之細胞膜滲透性。另外，本發明人等發現通式(1)所表示之化合物或其鹽係作為環肽庫而有用之化合物。又，本發明人等發現，在無細胞轉譯系中，藉由使具有氰基之胺基酸與通式(2)所表示之胺基酸(半胱胺酸等具有反應性基之胺基酸)進行反應，能夠製造環肽。另外，本發明人等發現，基於具有氰基之胺基酸及通式(2)所表示之胺基酸的反應之環肽的製造方法在建構環肽庫之方面有用。本發明係基於該等見解而完成者。
亦即，依本發明，可提供以下發明。
<1>一種下述式(1)所表示之肽化合物或其鹽。
式中，X表示S、NH或O，A表示單鍵、可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基或與B所鍵結之碳原子成為一體而由*-CR0=C(B)-表示之2價的基團，R0表示氫原子或取代基，*表示與X鍵結之位置，B表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，其中，A及B並不同時為單鍵，Z表示羥基或胺基，p個R可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，當G不表示G所鍵結之碳與A成為一體而由*-CR0=C(B)-表示之2價的基團時，G表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，t1個W1可以相同或不同，表示單鍵、-CH2(C6H5NH)-、-CH2(C6H5O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基， t2個W2可以相同或不同，表示單鍵、-CO-、-COO-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHCO-、-(CH2CH2O)-、-(CH2CH2CH2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，J表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，n個Xaa分別獨立地表示任意的胺基酸殘基或任意的胺基酸類似物殘基，m個Xbb分別獨立地表示任意的胺基酸殘基或任意的胺基酸類似物殘基，p表示0~4的整數，t1表示0~6的整數，t2表示0~6的整數，m表示0~20的整數n表示1~20的整數。
<2>如<1>所述之肽化合物或其鹽，其中上述式(1)所表示之肽化合物為下述式(1A)所表示之肽化合物。
式中， A1表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基或與N所鍵結之碳原子成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團，*表示與S鍵結之位置，p1個R1可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，t11個W11可以相同或不同，表示單鍵、-CH2(C6H5NH)-、-CH2(C6H5O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，t21個W21可以相同或不同，表示單鍵、-CO-、-COO-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHCO-、-(CH2CH2O)-、-(CH2CH2CH2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，當G1不表示G1所鍵結之碳與A1成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團時，表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，J1表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，p1表示0~4的整數，t11表示0~6的整數，t21表示0~6的整數，Z、Xaa、Xbb、m及n表示與<1>中之定義相同之含義。
<3>如<1>所述之肽化合物或其鹽，其中上述式(1)所表示之肽化合物為下述式(1B)所表示之肽化合物。
【化學式3】
式中，A2表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基或與N所鍵結之碳原子成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團，*表示與S鍵結之位置，當G2不表示G2所鍵結之碳與A2成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團時，表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，p2個R2可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，J2表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，p2表示0~4的整數，q2表示0~6的整數，但是，p2和q2不會同時成為0。
Z、Xaa、Xbb、m及n表示與<1>中之定義相同之含義。
<4>如<1>至<3>中任一項所述之肽化合物或其鹽，其中上述R、R1或R2為選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻唑基、可以具有取代基之伸苯并噁唑基、可以具有取代基之伸苯并咪唑基、可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸苯并呋喃基、可以具有取代基之伸異苯并呋喃基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹 啉基、可以具有取代基之伸異喹啉基、可以具有取代基之伸喹唑啉基、可以具有取代基之伸噌啉(cinnolylene)基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸苯并噻二唑基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒基、可以具有取代基之伸嘧啶基、可以具有取代基之伸吡基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸噁二唑基、可以具有取代基之伸噻二唑基、可以具有取代基之伸吡唑基、可以具有取代基之伸異噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸咪唑并噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑并吡啶基、可以具有取代基之伸咪唑并嗒基、可以具有取代基之伸咪唑并嘧啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡基、可以具有取代基之伸吡唑并嘧啶基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之伸噻吩基、可以具有取代基之伸呋喃基、可以具有取代基之伸吡咯基、可以具有取代基之伸苯基及可以具有取代基之伸萘基。
<5>如<1>至<4>中任一項所述之肽化合物或其鹽，其中上述R或R1或R2為選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒基、可以具有取代基之伸吡基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸噻吩基及可以具有取代基之伸苯基。
<6>如<1>至<5>中任一項所述之肽化合物或其鹽，其中構成上述肽化合物的環狀部之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數為3~20。
<7>如<1>至<6>中任一項所述之肽化合物或其鹽，其中構成上述肽化合物之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數為3~20。
<8>一種篩選用組成物，其包含<1>至<7>中任一項所述之肽化合物或其鹽。
<9>一種結合於靶物質之肽化合物或其鹽的選擇方法，其包括以下步驟：使包含<1>至<7>中任一項所述之肽化合物或其鹽之肽庫與靶物質接觸，並選擇結合於上述靶物質之肽化合物或其鹽。
<10>一種肽化合物或其鹽的製造方法，其包括以下製程：製造肽鏈之製程，該肽鏈在肽鏈中或C末端具有在側鏈上具有氰基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基，且在N末端具有下述式(2)的結構；及使上述氰基與下述式(2)的結構進行反應而形成具有下述式(3)所表示之鍵之環狀部之製程。
式中，X表示S、NH或O，A表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，B表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，G表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，*表示與肽鏈之鍵結部位，A及B並不同時為單鍵：【化學式5】
式中，X、A、G及B的含義與式(2)中之定義相同。
<11>一種結合於靶物質之肽化合物的選擇方法，其包括以下製程：利用<10>中所記載之方法來製造具有環狀部之肽化合物之製程；及使包含上述肽化合物或其鹽之肽庫與靶物質接觸，並選擇結合於上述靶物質之肽化合物或其鹽之製程。
<12>如<11>所述之選擇方法，其包括以下製程。
(i)製備核酸庫，藉由包含用非天然胺基酸醯基化之伸長用tRNA之無細胞轉譯系進行轉譯，製備出包含有非天然胺基酸隨機導入到肽序列中之肽化合物之資料庫之製程；(ii)使肽庫與靶物質接觸之製程；及(iii)選擇結合於靶物質之肽化合物之製程，在上述(i)的製程中，根據對構成資料庫之各肽化合物進行編碼之核酸序列轉譯構成資料庫之各肽化合物，核酸序列與作為其轉譯產物之肽連結而建構體外展示庫(in vitro display library)，上述(iii)的製程包括以下步驟：決定對結合於靶物質之肽化合物進行編碼之核酸序列，根據核酸序列決定肽序列，並選擇肽化合物。
<13>如<10>至<12>中任一項所述之方法，其中在側鏈上具有上述氰基之上述胺基酸殘基和/或上述胺基酸類似物殘基為下述式(4)所表示之結構。
【化學式6】
式中，m1個Q1可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基及可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基中的至少1種，T1表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，n1表示0~6的整數，m1表示1至4的整數，*表示與構成肽鏈之胺基酸殘基和/或胺基酸類似物殘基之鍵結位置。
<14>如<10>至<12>中任一項所述之方法，其中在側鏈上具有上述氰基之上述胺基酸殘基和/或上述胺基酸類似物殘基為下述式(5)所表示之結構。
式中，l2個Q2可以相同或不同，表示單鍵、-CH2(C6H5NH)-、-CH2(C6H5O) -、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，n2個Q3可以相同或不同，表示單鍵、-CO-、-COO-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHCO-、-(CH2CH2O)-、-(CH2CH2CH2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，m2個Q4可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基及可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基中的至少1種，T2表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，l2表示0~6的整數，n2表示0~6的整數，m2表示1~4的整數，*表示與構成肽鏈之胺基酸殘基和/或胺基酸類似物殘基之鍵結位置。
<15>如<13>或<14>所述之方法，其中上述Q1或Q4為選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻唑基、可以具有取代基之伸苯并噁唑基、可以具有取代基之伸苯并咪唑基、可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸苯并呋喃基、可以具有取代基之伸異苯并呋喃基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸異喹啉基、可以具有取代基之伸喹唑啉基、可以具有取代基之伸噌啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸苯并噻二唑基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒基、可以具有取代基之伸嘧啶基、可以具有取代基之伸吡基、可以具有取代基之伸噻唑基、可 以具有取代基之伸咪唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸噁二唑基、可以具有取代基之伸噻二唑基、可以具有取代基之伸吡唑基、可以具有取代基之伸異噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸咪唑并噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑并吡啶基、可以具有取代基之伸咪唑并嗒基、可以具有取代基之伸咪唑并嘧啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡基、可以具有取代基之伸吡唑并嘧啶基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之伸噻吩基、可以具有取代基之伸呋喃基、可以具有取代基之伸吡咯基、可以具有取代基之伸苯基及可以具有取代基之伸萘基。
<16>如<13>至<15>中任一項所述之方法，其中上述Q1或Q4為選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒基、可以具有取代基之伸吡基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸噻吩基及可以具有取代基之伸苯基。
<17>如<10>至<16>中任一項所述之方法，其中上述式(2)為下述式(2A)所表示之結構。
式中，A1表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基。G表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基。
<18>如<10>至<17>中任一項所述之方法，其中上述式(2)為選自下述式中之至少1種結構。
<19>如<10>至<18>中任一項所述之方法，其中使上述氰基與上述式(2)的結構進行反應而形成上述式(3)所表示之鍵之製程的反應溶劑為水。
<20>如<10>至<19>中任一項所述之方法，其中使上述氰基與上述式(2)的結構進行反應而形成上述式(3)所表示之鍵之製程的反應液的pH為6.0~8.5。
<21>如<10>至<20>中任一項所述之方法，其中構成具有上述環狀部之肽化合物的環狀部之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數為3~20。
<22>如<10>至<21>中任一項所述之方法，其中構成具有上述環狀部之肽化合物之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數為3~20。
<23>如<10>至<22>中任一項所述之方法，其中使用藉由對在天然胺基酸的轉譯中分配之密碼子除去天然胺基酸而成為空的密碼子、終止密碼子或四鹼基密碼子，將在側鏈上具備具有上述氰基之伸雜芳基、具有氰基之伸芳基或具有氰基之伸烷基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基導入到肽鏈中。
<24>一種篩選用組成物，其係具有環狀部之肽化合物或其鹽，上述環狀部含有具有下述式(6)所表示之結構之肽化合物或其鹽。
式中，X表示S、NH或O，A表示單鍵、可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基或與B所鍵結之碳原子成為一體而由*-CR0=C(B)-表示之2價的基團，R0表示氫原子或取代基，*表示與X鍵結之位置，B表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，其中，A及B並不同時為單鍵，p個R可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，當G不表示G所鍵結之碳與A成為一體而由*-CR0=C(B)-表示之2價的基團時，表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，p表示0~4的整數。
本發明的肽化合物的細胞膜滲透性優異。依本發明的肽化合物的製造方法，能夠製造細胞膜滲透性優異之環肽化合物。本發明的肽化合物及篩選用組成物在結合於靶物質之環肽化合物的選擇方法中有用。
以下，詳細說明本發明。
在本發明中，只要沒有特別指定，%為質量%。
在本發明中，只要沒有特別指定，各術語具有以下含義。
在本發明中，“~”係以將其前後所記載之數值作為下限值及上限值而包含之含義來使用。
鹵素原子係指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
C1-6烷基係指甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基、戊基、異戊基、2-甲基丁基、2-戊基、3-戊基及己基等直鏈狀或支鏈狀的C1-6烷基。
C3-8環烷基係指環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環庚基等C3-8環烷基。
C1-6烷氧基C1-6烷基係指甲氧基甲基及1-乙氧基乙基等C1-6烷氧基C1-6烷基。
C6-20芳基C1-6烷基係指苄基、二苯基甲基、三甲苯基、苯乙基、2-苯基丙基、3-苯基丙基及萘基甲基等C6-20芳基C1-6烷基(烷基部分為C1-6烷基之芳烷基)。
C1-6烷氧基係指甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、環丙氧基、丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、環丁氧基、戊氧基及己氧基等直鏈狀、環狀或支鏈狀的C1-6烷氧基。
C6-20芳氧基係指苯氧基及萘氧基等C6-20芳氧基。
C1-6烷硫基係指甲硫基、乙硫基、丙硫基、異丙硫基、丁硫基、第 二丁硫基、異丁硫基、第三丁硫基、戊硫基、異戊硫基、2-甲基丁硫基、2-戊硫基、3-戊硫基及己硫基等直鏈狀或支鏈狀C1-6烷硫基。
C6-20芳硫基係指苯硫基及2-萘硫基等C6-20芳硫基。
C1-6烷基胺基係指甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、異丙基胺基、丁基胺基、第二丁基胺基、第三丁基胺基、戊基胺基及己基胺基等直鏈狀或支鏈狀的C1-6烷基胺基。
C6-20芳基胺基係指苯基胺基、對甲苯基胺基及2-萘基胺基等C6-20芳基胺基。
C2-6烯基係指乙烯基、烯丙基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、異丁烯基、1,3-丁二烯、戊烯基及己烯基等直鏈狀或支鏈狀的C2-6烯基。
C3-8環烯基係指環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基等C3-8環烯基。
C2-6炔基係指乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基及己炔基等直鏈狀或支鏈狀的C2-6炔基。
C1-6烷基羰基係指乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基及三甲基乙醯基(pivaloyl)等C1-6烷基羰基。
C1-30烷基羰基係指乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、三甲基乙醯基及棕櫚醯基等C1-30烷基羰基。
C6-20芳基羰基係指苯甲醯基等碳數6~20的芳基羰基。
雜環式羰基係指菸鹼醯基(nicotinoyl)、噻吩甲醯基(thenoyl)、吡咯啶并羰基或呋喃甲醯基(furoyl)等雜環式羰基。
C1-6烷基磺醯基係指甲基磺醯基、乙基磺醯基及丙基磺醯基等C1-6烷基磺醯基。
C6-20芳基磺醯基係指苯磺醯基、對甲苯磺醯基或萘磺醯基等C6-20芳基磺醯基。
C1-6烷基亞磺醯基係指甲基亞磺醯基、乙基亞磺醯基及丙基亞磺醯基等C1-6烷基亞磺醯基。
C6-20芳基亞磺醯基係指苯亞磺醯基、對甲苯亞磺醯基或萘亞磺醯基等C6-20芳基亞磺醯基。
C6-20芳基係指苯基或萘基等碳數6~20的芳基。
單環的含氮雜環式基係指氮丙啶基、氮雜環丁基、吡咯啶基、吡咯啉基、吡咯基、哌啶基、四氫吡啶基、二氫吡啶基、吡啶基、高哌啶基、八氫吖辛因基(azocinyl)、咪唑啶基、咪唑啉基、咪唑基、吡唑啶基、吡唑啉基、吡唑基、哌嗪基、二氮雜環庚烷基(diazepanyl)、吡基、嗒基、嘧啶基、高哌嗪基、三唑基及四唑基等包含形成上述環之雜原子且還包含單環的含氮雜芳基之單環的含氮雜環式基。
單環的含氧雜環式基係指氧雜環丁基、四氫呋喃基、呋喃基、四氫吡喃基、吡喃基、1,3-二噁烷基及1,4-二噁烷基等僅包含氧原子作為形成上述環之雜原子之單環的含氧雜環式基。
單環的含硫雜環式基係指噻吩基、四氫噻喃基(thiopyranyl)、1,1-二氧化四氫噻喃基等。
單環的含氮．氧雜環式基係指噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、嗎啉基及氧雜氮雜環庚烷基(oxazepanyl)等僅包含氮原子及氧原子作為形成上述環之雜原子之單環的含氮．氧雜環式基。
單環的含氮．硫雜環式基係指噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、硫代嗎啉基、1-氧化硫代嗎啉基及1,1-二氧化硫代嗎啉基等僅包含氮原子及硫原子作為形 成上述環之雜原子之單環的含氮．硫雜環式基。
單環的雜環式基係指單環的含氮雜環式基、單環的含氧雜環式基、單環的含硫雜環式基、單環的含氮．氧雜環式基或單環的含氮．硫雜環式基。
二環式的含氮雜環式基係指二氫吲哚基、吲哚基、異二氫吲哚基、異吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、吡唑并吡啶基、喹啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、異喹啉基、喹嗪基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、二氫喹喔啉基、喹喔啉基、萘啶基、嘌呤基、蝶呤基及奎寧環基(quinuclidinyl group)等僅包含氮原子作為形成上述環之雜原子之二環式的含氮雜環式基。
二環式的含氧雜環式基係指2,3-二氫苯并呋喃基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、色滿基(chromanyl)、色烯基(chromenyl)、異色滿基、1,3-苯并苯并二氧雜環戊烯基(benzodioxolyl)、1,3-苯并二噁烷基及1,4-苯并二噁烷基等僅包含氧原子作為形成上述環之雜原子之二環式的含氧雜環式基。
二環式的含硫雜環式基係指2,3-二氫苯并噻吩基及苯并噻吩基等僅包含硫原子作為形成上述環之雜原子之二環式的含硫雜環式基。
二環式的含氮．氧雜環式基係指苯并噁唑基、苯并異噁唑基、苯并噁二唑基、苯并嗎啉基、二氫吡喃并吡啶基、二噁茂(dioxo)吡啶基、呋喃并吡啶基、二氫二氧芑(dihyrodioxyno)吡啶基及二氫吡啶并噁嗪基等僅包含氮原子及氧原子作為形成上述環之雜原子之二環式的含氮．氧雜環式基。
二環式的含氮．硫雜環式基係指苯并噻唑基、苯并異噻唑基及苯并噻二唑基等包含氮原子及硫原子作為形成上述環之雜原子之二環式的含氮．硫雜環式基。
二環式的雜環式基係指二環式的含氮雜環式基、二環式的含氧雜環式 基、二環式的含硫雜環式基、二環式的含氮．氧雜環式基或二環式的含氮．硫雜環式基。
螺環式雜環式基係指2,6-二氮雜螺環[3.3]庚基、2,7-二氮雜螺環[3.5]壬基、2-氧雜-6-氮雜螺環[3.3]庚基、1,4-二氧雜螺環[4.5]癸基、1-氧雜-8-氮雜螺環[4.5]癸基及1-硫雜-8-氮雜螺環[4.5]癸基等包含一個以上的氮原子、氧原子或硫原子作為形成上述環之雜原子之螺環式雜環式基。
交聯式雜環式基係指3-氧雜-8-氮雜雙環[3.2.1]辛基、8-氧雜-3-氮雜雙環[3.2.1]辛基及奎寧環基等包含一個以上的氮原子且可以進一步包含一個以上的氧原子或硫原子作為形成上述環之雜原子之交聯式雜環式基。
雜環式基係指單環的雜環式基、二環式的雜環式基、螺環式雜環基及交聯式雜環基。
碳數1~6的伸烷基係指亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸異丙基、伸正丁基、伸正戊基、伸正己基及伸環己基等直鏈狀或環狀的C1-6伸烷基。
碳數6~10的伸芳基係指伸苯基或伸萘基等碳數6~20的伸芳基。
其中，碳數1~6的伸烷基、碳數6~10的伸芳基的碳數不包含取代基的碳數。伸雜芳基係指2價的雜環式基。
肽化合物為胺基酸或胺基酸類似物進行醯胺鍵結或酯鍵結而形成之化合物的總稱。又，具有環狀部之肽化合物(亦稱為環肽化合物)為肽化合物在同一分子內經由共價鍵結而環化之化合物的總稱。將上述化合物進一步進行化學修飾而獲得之化合物亦包含於本發明的肽化合物。本發明的肽化合物可以具有直鏈部。
構成肽化合物之胺基酸及胺基酸類似物有時分別稱為胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基。胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基係指來源於胺基酸及 胺基酸類似物殘基之1價或2價的基團。
本發明中之胺基酸係指α、β及γ-胺基酸，並不限定於天然胺基酸(天然胺基酸係指蛋白質中所包含之20種胺基酸。具體而言，係指Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys、Met、Lys、Arg、Pro)，亦可以為非天然胺基酸。非天然胺基酸係指上述天然胺基酸以外的胺基酸。蛋白質中所包含之20種胺基酸以外的存在於自然界之天然胺基酸視為非天然胺基酸。在α-胺基酸的情況下，可以為L型胺基酸亦可以為D型胺基酸，亦可以為α,α-二烷基胺基酸。胺基酸側鏈除了氫原子以外，例如可以經選自可以具有取代基之C1-6烷基、可以具有取代基之C3-8環烷基、可以具有取代基之C2-6烯基、可以具有取代基之C2-6炔基、可以具有取代基之C6-20芳基、可以具有取代基之雜環式基、可以具有取代基之C6-20芳基C1-6烷基等中之基團取代。
胺基酸類似物較佳為α-羥基羧酸及α-巰基羧酸。α-羥基羧酸及α-巰基羧酸的側鏈與胺基酸同樣地，除了氫原子以外，可以具有各種取代基(可以具有自由取代基)。α-羥基羧酸及α-巰基羧酸的立體結構可以對應於胺基酸的L型或D型中的任一種，側鏈例如可以經選自可以具有取代基之C1-6烷基、可以具有取代基之C3-8環烷基、可以具有取代基之C2-6烯基、可以具有取代基之C2-6炔基、可以具有取代基之C6-20芳基、可以具有取代基之雜環式基、可以具有取代基之C6-20芳基C1-6烷基等中之基團取代。取代基的數量並不限定於1個，亦可以具有2個以上。例如，可以具有S原子，且進一步具有胺基或鹵素原子等官能基。
<本發明的肽化合物或其鹽>
本發明的肽化合物或其鹽為下述式(1)所表示之肽化合物或其鹽。本 發明的肽化合物或其鹽的細胞膜滲透性優異，較佳為代謝穩定性亦優異。
X表示S、NH或O。X較佳為表示S。
A表示單鍵、可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基或與B所鍵結之碳原子成為一體而由*-CR0=C(B)-表示之2價的基團，R0表示氫原子或取代基，*表示與X鍵結之位置。
A較佳為表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基或與B所鍵結之碳原子成為一體而由*-CR0=C(B)-表示之2價的基團，R0表示氫原子或取代基。
A更佳為表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基。
A進一步較佳為表示伸乙基或可以具有取代基之亞甲基。
A特佳為表示亞甲基。
R0較佳為表示氫原子。
B表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，其中，A及B並不同時為單鍵。
B較佳為表示單鍵。
在A及B的定義中，作為“可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基”中之取代基，能夠舉出C1-6烷基、C3-8環烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-20芳基、雜環式基、C6-20芳基C1-6烷基。
作為R0的定義中之取代基，能夠舉出C1-6烷基、C3-8環烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-20芳基、雜環式基、C6-20芳基C1-6烷基。
當G不表示與G所鍵結之碳與A成為一體而由*-CR0=C(B)-表示之2價的基團時，表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基。
G較佳為甲基、乙基或氫原子，更佳為氫原子。
Z表示羥基或胺基。Z較佳為表示胺基。
R表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基。
作為R的可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，可以具有取代基之伸苯基、可以具有取代基之伸萘基為較佳，可以具有取代基之伸苯基為更佳。
作為R的較佳例，可以舉出選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻唑基、可以具有取代基之伸苯并噁唑基、可以具有取代基之伸苯并咪唑基、可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸苯并呋喃基、可以具有取代基之伸異苯并呋喃基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸異喹啉基、可以具有取代基之伸喹唑啉基、可以具有取代基之伸噌啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸苯并噻二唑基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒基、可以具有取代基之伸嘧啶基、可以具有取代基之伸吡基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸噁二唑基、可以具有取代基之伸噻二 唑基、可以具有取代基之伸吡唑基、可以具有取代基之伸異噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸咪唑并噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑并吡啶基、可以具有取代基之伸咪唑并嗒基、可以具有取代基之伸咪唑并嘧啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡基、可以具有取代基之伸吡唑并嘧啶基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之伸噻吩基、可以具有取代基之伸呋喃基、可以具有取代基之伸吡咯基、可以具有取代基之伸苯基及可以具有取代基之伸萘基。
作為R的更佳例，可以舉出選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒基、可以具有取代基之伸吡基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸噻吩基及可以具有取代基之伸苯基。
W1可以相同或不同，表示單鍵、-CH2(C6H5NH)-、-CH2(C6H5O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基。較佳為表示單鍵、-CH2(C6H5NH)-或-CH2(C6H5O)-。
W2可以相同或不同，表示單鍵、-CO-、-COO-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHCO-、-(CH2CH2O)-、-(CH2CH2CH2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基。較佳為表示單鍵、-NHCO-、-(CH2CH2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳 基。
關於R、W1及W2的定義中之取代基、以及作為R的較佳例及R的更佳例而例示之結構中之取代基，能夠舉出取代基組群A1中所記載之取代基。
取代基組群A1：鹵素原子、氰基、硝基、甲醯基、羧基、磺酸基、羥基、胺基、巰基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C1-6烷基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C3-8環烷基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C1-6烷氧基C1-6烷基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C6-20芳基C1-6烷基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C1-6烷氧基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C6-20芳氧基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C1-6烷基胺基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C6-20芳基胺基、 可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C1-6烷硫基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C6-20芳硫基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C2-6烯基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C3-8環烯基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C2-6炔基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C6-20芳基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之雜環式基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C1-30烷基羰基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C6-20芳基羰基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C1-6烷基磺醯基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C6-20芳基磺醯基、可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C1-6烷基亞磺醯基、及可以具有選自取代基組群A2中之一個以上的取代基之C6-20芳基亞磺醯基。
取代基組群A2：鹵素原子、羥基、氰基、可以具有選自取代基組群A3中之一個以上的取代基之C1-6烷基、可以具有選自取代基組群A3中之一個以上的取代基之C3-8環烷基、可以具有選自取代基組群A3中之一個以上的取代基之C1-6烷氧基、可以具有選自取代基組群A3中之一個以上的取代基之C1-6烷氧基C1-6 烷基、可以具有選自取代基組群A3中之一個以上的取代基之C1-6烷基羰基、可以具有選自取代基組群A3中之一個以上的取代基之C1-6烷基磺醯基、可以具有選自取代基組群A3中之一個以上的取代基之雜環式基、NR12R13(R12及R13分別獨立地為氫原子、C1-6烷基)、可以具有選自取代基組群A3中之一個以上的取代基之雜環式羰基。
取代基組群A3：鹵素原子、羥基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基。
J表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，較佳為甲基或氫原子，更佳為氫原子。
n個Xaa分別獨立地表示任意的胺基酸殘基或任意的胺基酸類似物殘基。
m個Xbb分別獨立地表示任意的胺基酸殘基或任意的胺基酸類似物殘基。
p表示0~4的整數，較佳為表示0~2，更佳為表示0~1。
t1表示0~6的整數，較佳為表示0~2的整數。
t2表示0~6的整數，較佳為表示0~2的整數。
m表示0~20的整數。m較佳為表示0~10，更佳為表示0~5的整數。
n表示1~20的整數。n較佳為表示1~18，更佳為表示3~13的整數。
構成肽化合物的環狀部之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數係3~20為較佳，5~15為更佳。
構成肽化合物之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數係3~20為較佳，5~20為更佳。
式(1)所表示之肽化合物較佳為下述式(1A)所表示之肽化合物。
A1表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基、或者表示與N所鍵結之碳原子成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團，*表示與S鍵結之位置。
A1較佳為表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基。
A1更佳為表示伸乙基或可以具有取代基之亞甲基。
A1進一步較佳為表示亞甲基。
A1的定義中之取代基與關於式(1)的A的定義而上述者相同。
當G1不表示G1所鍵結之碳與A1成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團時，表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基。G1較佳為表示乙基、甲基或氫原子，進一步較佳為表示氫原子。
R1表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基。
R1較佳為表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之伸苯基。
R1的較佳例及R1的更佳例與R的較佳例及R的更佳例相同。
R1的定義中之取代基與關於式(1)的R的定義而上述者相同。
W11表示單鍵、-CH2(C6H5NH)-、-CH2(C6H5O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基。較佳為表示單鍵、-CH2(C6H5NH)-、-CH2(C6H5O)-。
W21表示單鍵、-CO-、-COO-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHCO-、-(CH2CH2O)-、-(CH2CH2CH2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基。較佳為表示單鍵、-NHCO-、-(CH2CH2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基。
J1表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，較佳為甲基、氫原子。
p1表示0~4的整數，較佳為表示0或1。
t11表示0~6的整數，較佳為表示0~2的整數。
t21表示0~6的整數，較佳為表示0~2的整數。
Z、Xaa、Xbb、m及n表示與(1)中之定義相同之含義。
式(1)所表示之肽化合物較佳為下述式(1B)所表示之肽化合物。
【化學式13】
A2表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基或與N所鍵結之碳原子成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團，*表示與S鍵結之位置。
A2較佳為表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基。
A2更佳為表示伸乙基或可以具有取代基之亞甲基。
A2進一步較佳為表示亞甲基。
A2的定義中之取代基與關於式(1)的A的定義而上述者相同。
當G2不表示G2所鍵結之碳與A2成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團時，表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基。G2較佳為表示乙基、甲基、氫原子。
R2表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基。
R2較佳為表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之伸苯基。
R2的較佳例及R2的更佳例與R的較佳例及R的更佳例相同。
R2的定義中之取代基與關於式(1)的R的定義而上述者相同。
J2表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，較佳為甲基、氫原子。
p2表示0~4的整數，較佳為表示0~2的整數，更佳為表示0或1。
q2表示0~6的整數，較佳為表示0~4的整數，更佳為表示0~2的整數，特佳為表示0或1。
其中，p2和q2不會同時成為0。
Z、Xaa、Xbb、m及n表示與(1)中之定義相同之含義。
作為肽化合物或其鹽，能夠舉出通常已知之胺基等鹼性基、羧基等酸性基及羥基中之鹽。
另外，當在本說明書中簡稱為肽化合物時，亦包含肽化合物的鹽。
作為鹼性基中之鹽，例如可以舉出與鹽酸、溴化氫酸、硝酸及硫酸等無機酸之鹽；與甲酸、乙酸、檸檬酸、草酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、天冬胺酸、三氯乙酸及三氟乙酸等有機羧酸之鹽；以及與甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、均三甲苯磺酸及萘磺酸等磺酸之鹽。
作為酸性基中之鹽，例如可以舉出與鈉及鉀等鹼金屬之鹽；與鈣及鎂等第二族金屬之鹽；銨鹽；以及與三甲胺、三乙胺基、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎福林、二乙胺、二環己基胺、普魯卡因、二苄基胺、N-苄基-β-苯乙基胺、1-二苯羥甲胺及N,N'-二苄基乙二胺等含氮有機鹼之鹽等。
在肽化合物或其鹽中，當存在異構體(例如，光學異構體及幾何異構體等)時，本發明包含該等異構體，又，包含溶劑合物、水合物及各種形狀的晶體。
<篩選用組成物>
依本發明，可提供包含上述本發明的肽化合物或其鹽之篩選用組成物。
依本發明，還可以提供含有具有環狀部之肽化合物或其鹽之篩選用組成 物，上述環狀部具有下述式(6)所表示之結構。
式中，X表示S、NH或O，A表示單鍵、可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基或與B所鍵結之碳原子成為一體而由*-CR0=C(B)-表示之2價的基團，R0表示氫原子或取代基，*表示與X鍵結之位置，B表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，其中，A及B並不同時為單鍵，p個R可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，當G不表示G所鍵結之碳與A成為一體而由*-CR0=C(B)-表示之2價的基團時，表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，p表示0~4的整數。
式(6)中之記號的含義、較佳範圍與關於式(1)而上述者相同。
關於篩選的靶物質及篩選，在本說明書中後述。
<肽化合物的製造方法>
本發明的肽化合物的製造方法並沒有特別限定，可以利用使用無細胞轉譯系之方法來製造，亦可以藉由肽的化學合成來製造。
例如，製造肽鏈(鏈狀肽)，該肽鏈在肽鏈中或C末端具有在側鏈上具有氰基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基，且在N末端具有下述式(2)的結構，使氰基與式(2)的結構進行反應而形成具有下述式(3)所表示之鍵之環狀部，藉此，能夠由包含天然胺基酸及非天然胺基酸的非環狀的肽化合物製造具有環狀部之肽化合物。
本發明的肽化合物亦能夠藉由化學合成來製造。肽化合物的合成可以為固相合成亦可以為液相合成，但較佳為固相合成。肽化合物的固相合成對所屬技術領域中具有通常知識者而言是公知的，例如可以舉出作為胺基的保護而使用Fmoc基(茀基-甲氧基-羰基)之Fmoc基合成法、以及作為胺基的保護而使用Boc基(第三丁氧基羰基)之Boc基合成法等。肽化合物的化學合成一般利用自動肽合成裝置來進行。
式(2)中，X表示S、NH或O。X較佳為表示S。
A表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基。
A較佳為表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基。
A更佳為表示伸乙基或可以具有取代基之亞甲基。
A進一步較佳為表示亞甲基。
B表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基。其中，A及B並不同時為單鍵。
B較佳為表示單鍵。
G表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基。G較佳為表示氫原子。
*表示與肽鏈之鍵結部位，
式中，X、A、G及B的含義與式(2)中之定義相同。
在A及B的定義中，作為“可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基”中之取代基，能夠舉出C1-6烷基、C3-8環烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-20芳基、雜環式基、C6-20芳基C1-6烷基。
在側鏈上具有氰基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基較佳為下述式(4)所表示之結構。
式(4)中，m1個Q1可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基及可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基中的至少1種。
Q1較佳為表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之碳數6~ 20的伸芳基。
Q1更佳為表示可以具有取代基之伸雜芳基或可以具有取代基之伸苯基。
T1表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，較佳為甲基、氫原子。
n1表示0~6的整數，較佳為表示0~3的整數，更佳為表示1或2，進一步較佳為表示1。
m1表示1~4的整數，較佳為表示1或2，更佳為表示1。
*表示與構成肽鏈之胺基酸殘基和/或胺基酸類似物殘基之鍵結位置。
在側鏈上具有氰基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基較佳為下述式(5)所表示之結構。
式(5)中，Q2表示單鍵、-CH2(C6H5NH)-、-CH2(C6H5O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基。Q2較佳為表示單鍵、-CH2(C6H5NH)-、-CH2(C6H5O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基。
Q3表示單鍵、-CO-、-COO-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHCO-、-(CH2CH2O)-、-(CH2CH2CH2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可 以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基。Q3較佳為表示單鍵、-NHCO-、-(CH2CH2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基。
Q4表示可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基及可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基中的至少1種。Q4較佳為表示可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基。
T2表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，較佳為甲基、氫原子。
l2表示0~6的整數，較佳為表示0~2的整數。
n2表示0~6的整數，較佳為表示0~2的整數。
m2表示1~4的整數，較佳為表示1或2。
*表示與構成肽鏈之胺基酸殘基和/或胺基酸類似物殘基之鍵結位置。
作為Q1及Q4的較佳例，可以舉出選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻唑基、可以具有取代基之伸苯并噁唑基、可以具有取代基之伸苯并咪唑基、可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸苯并呋喃基、可以具有取代基之伸異苯并呋喃基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸異喹啉基、可以具有取代基之伸喹唑啉基、可以具有取代基之伸噌啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸苯并噻二唑基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒基、可以具有取代基之伸嘧啶基、可以具有取代基之伸吡基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸噁二唑基、可以具有取代基之伸噻二唑基、可以具有取代基之伸吡唑基、可以具有取代基之伸異 噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸咪唑并噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑并吡啶基、可以具有取代基之伸咪唑并嗒基、可以具有取代基之伸咪唑并嘧啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡基、可以具有取代基之伸吡唑并嘧啶基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之伸噻吩基、可以具有取代基之伸呋喃基、可以具有取代基之伸吡咯基、可以具有取代基之伸苯基及可以具有取代基之伸萘基。
作為Q1及Q4的更佳例，可以舉出選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒基、可以具有取代基之伸吡基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸噻吩基及可以具有取代基之伸苯基。
式(2)所表示之結構較佳為下述式(2A)所表示之結構。
式(2A)中，A1表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基。A1較佳為表示伸乙基、或可以具有取代基之亞甲基。A1更佳為表示亞甲基。
G表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基。G較佳為表示乙基、甲基或氫原子。
式(2)更佳為選自下述式中之至少1種結構。
使氰基與式(2)的結構進行反應而形成式(3)所表示之鍵之製程的反應溶劑較佳為水或有機溶劑。當利用基於無細胞轉譯系之合成來作為非環肽以及環肽的製造方法時，作為反應溶劑，水為較佳。
作為水，可以為純的蒸餾水、緩衝液及鹽(NaCl等)的水溶液或在上述蒸餾水或上述水溶液中進一步包含有機溶劑和/或界面活性劑者。當利用無細胞轉譯系進行合成時，如此使用水作為反應溶劑為較佳。作為緩衝液，能夠舉出HEPES(2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)緩衝液、磷酸緩衝液等具有緩衝能力之適當的緩衝液。作為有機溶劑，能夠與水或緩衝液混合之有機溶劑為較佳，例如可以舉出甲醇、二甲基亞碸或聚乙二醇等。作為界面活性劑，能夠舉出Triton X(商品名稱)、Brij(商品名稱)、Tween(商品名稱)等。較佳的有機溶劑含率的範圍為20%以下，更佳的範圍為15%以下，進一步較佳的範圍為10%以下。當包含有機溶劑時，有機溶劑含率大於0%。
又，當利用化學合成來作為非環肽以及環肽的製造方法時，作為反應溶劑，有機溶劑為較佳。作為有機溶劑，可以舉出二甲基乙醯胺、N-甲基-2-吡咯啶酮、N,N-二甲基甲醯胺、甲醇、乙醇、異丙醇、四氫呋喃、二噁烷、乙腈。在該情況下，可以與水混合而使用。當將有機溶劑和水混合而使用時，含有20%以上的有機溶劑為較佳，更佳為20%以上且70%以下，進一步較佳為30%以上且60%以下。
使氰基與式(2)的結構進行反應而形成式(3)所表示之鍵之製程的pH較佳為6.0~8.5。藉由將pH調整在上述範圍內，能夠以良好的產率 得到環肽。
製造肽鏈之製程較佳為合成未被保護的非環肽之製程，該肽鏈在肽鏈中或C末端具有在側鏈上具有氰基之胺基酸殘基和/或胺基酸類似物殘基，且在N末端具有式(2)的結構。藉由合成未被保護的非環肽，能夠在其後的製程(環肽的合成製程)中簡化作為目標物之環肽的純化。又，當將經合成之肽用作肽庫時，不加入合成後去保護製程而能夠直接進行評價。作為在側鏈上具有氰基之胺基酸殘基和/或胺基酸類似物殘基，在側鏈上具有具有氰基之伸雜芳基、具有氰基之伸芳基或具有氰基之伸烷基之胺基酸殘基和/或胺基酸類似物殘基為較佳。
使氰基與上述式(2)的結構進行反應而形成式(3)所表示之鍵之製程較佳為在無觸媒下進行之製程。從簡便性的觀點而言，能夠在無觸媒下進行上述製程為較佳。
從兼顧對靶之結合性(藥理活性)和膜滲透性之觀點而言，構成具有環狀部之肽化合物的環狀部之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數較佳為3~20，更佳為5~15。
構成具有環狀部之肽化合物之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數為3~20，更佳為5~20。
當利用無細胞轉譯系合成肽時，能夠利用藉由對在終止密碼子、四鹼基密碼子、天然胺基酸的轉譯中分配之密碼子除去天然胺基酸而成為空之密碼子來導入在側鏈上具有氰基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基。較佳為使用終止密碼子、四鹼基密碼子來導入。
<肽化合物的選擇方法>
依本發明，可提供結合於靶物質之肽化合物的選擇方法，其包括以下步 驟：使包含本發明的肽化合物或其鹽之肽庫與靶物質接觸，並選擇結合於靶物質之肽化合物或其鹽。
依本發明，還可以提供結合於靶物質之肽化合物的選擇方法，其包括以下製程：利用上述本發明的方法來製造具有環狀部之肽化合物之製程；及使包含上述肽化合物或其鹽之肽庫與靶物質接觸，並選擇結合於靶物質之肽化合物或其鹽之製程。
肽庫係指由多種肽構成之集合體。選擇係指從集合體選擇具備目標功能之肽之行為，有時亦被稱為篩選。
肽庫可以為對本發明的肽化合物包含由天然胺基酸構成之非環狀的肽化合物者，亦可以為包含由天然胺基酸構成之環狀的肽化合物者。
對本發明的肽化合物包含由天然胺基酸構成之非環肽化合物或由天然胺基酸構成之環狀的肽化合物者為較佳。
本發明之結合於靶物質之肽化合物的選擇方法較佳為包括以下製程。
(i)製備核酸庫，藉由包含用非天然胺基酸醯基化之伸長用tRNA之無細胞轉譯系進行轉譯，製備出包含有非天然胺基酸隨機導入到肽序列中之肽之資料庫之製程；(ii)使肽庫與靶物質接觸之製程；及(iii)選擇結合於靶物質之肽之製程。
在(i)的製程中，可以根據對肽進行編碼之核酸序列轉譯構成資料庫之各肽，核酸序列與作為其轉譯產物之肽連結而建構體外展示庫。
在核酸序列中，對肽進行編碼之區域可以係包含由不同之複數個三聯體的重複構成之隨機序列者，亦可以係隨機序列中的三聯體的至少一部分為與 指定非天然胺基酸之密碼子對應之序列，藉由用非天然胺基酸醯基化之伸長用tRNA的反密碼子與指定非天然胺基酸之密碼子的匹配而非天然胺基酸被導入到肽序列中。
(iii)的製程可以係決定對結合於靶物質之肽進行編碼之核酸序列，根據核酸序列決定肽序列，並選擇肽化合物者。
本發明中之“核酸”亦能夠包含去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或具有人工鹼基之核苷酸衍生物。又，亦能夠包含肽核酸(PNA)。本發明中之核酸只要目標遺傳訊息得到保持，則亦可以為該等核酸中的任一種或者與該等核酸混合。亦即，DNA-RNA的混合核苷酸或如DNA和RNA之類的不同核酸連結於1條鏈之嵌合核酸亦包含於本發明中之核酸。
在本發明中，能夠適宜使用包含該等核酸作為模板之展示庫等核酸庫。
體外展示係指使用無細胞轉譯系(亦稱為體外轉譯系)合成之肽與遺傳訊息建立對應關聯而提示者，核糖體展示、mRNA展示、DNA展示等是公知的。任一展示均具有如下機制：藉由連結記錄在mRNA或DNA之遺傳訊息與利用該遺傳訊息編碼之肽而作為[遺傳訊息]-[轉譯產物]的複合體建立對應關聯。在核糖體展示中形成mRNA-核糖體-肽的複合體。在mRNA展示中形成mRNA-肽的複合體。在DNA展示中形成DNA-肽的複合體。在本發明中能夠利用任意的體外展示庫。
使資料庫與所希望之經固定之靶接觸，並洗去未結合於靶之分子，藉此能夠進行結合之肽的濃縮(淘選法(panning method))。藉由分析與經該種過程而選擇之肽建立對應關聯之基因訊息，能夠明確結合於靶之蛋白質的序列。例如，在mRNA display(Proc Natl Acad Sci USA.1997；94：12297-302.RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides a nd proteins.Roberts RW,Szostak JW.)或in vitro virus(FEBS Lett.1997：414：405-8.In vitro virus：bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro。Nemoto N,Miyamoto-Sato E,Husimi Y,Yanagawa H.)中報告有利用胺基醯基tRNA的類似物亦即抗生物質嘌呤黴素非特異性地連結於基於核糖體之mRNA轉譯伸長中的蛋白質之方法。
若預先使嘌呤黴素等間隙子(spacer)結合於從包含T7啟動子等啟動子之DNA庫藉由轉錄而獲得之mRNA的資料庫的3'端，利用無細胞轉譯系將mRNA轉譯為蛋白質，則嘌呤黴素利用核糖體而與胺基酸不同地納入到蛋白質中，mRNA與編碼成該mRNA之蛋白質連結，成為mRNA與其產物建立對應關聯之資料庫。在該過程中，不包含大腸桿菌等的轉化，因此可實現高效率，能夠建構大規模的展示庫(109~1014種)。由附在包含藉由淘選而濃縮、選擇之分子之基因訊息之標籤(tag)亦即mRNA合成cDNA，PCR擴增，藉由分析鹼基序列，能夠明確結合之蛋白的序列。成為資料庫的模板之DNA庫的未固定胺基酸殘基之部位能夠藉由混合鹼基進行合成而獲得。還有以下方法：若能夠重複A、T、G、C的4個鹼基的混合(N)的3的倍數個、或者以密碼子的第一字母、第二字母為N、第三字母為W、M、K、S等2個鹼基的混合之形式合成，並將進一步導入之胺基酸的種類抑制為16種以下，則能夠使第三字母成為1種鹼基。又，準備相當於密碼子的3字母之密碼子單元，將其以任意的比例混合並用於合成，藉此能夠自由調整胺基酸殘基的出現頻度。
利用無細胞轉譯系之展示庫中，除了mRNA展示以外，已知有由對結合有肽與嘌呤黴素的複合體之肽進行編碼之cDNA構成之資料庫亦即c DNA展示(Nucleic Acids Res.2009；37(16)：e108.cDNA display：a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions.Yamaguchi J,Naimuddi n M,Biyani M,Sasaki T,Machida M,Kubo T,Funatsu T,Husimi Y,Nemoto N.)；利用在mRNA轉譯中核糖體與轉譯產物比較穩定的複合體之核糖體展示(Proc Natl Acad Sci U S A.1994；91：9022-6.An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries.Mattheakis LC,Bhatt RR,Dower WJ.)；利用噬菌體內切核酸酶(bacteriophage endonuclease)P2A與DNA形成共價鍵之共價展示(covalent display)(Nucleic Acids Res.2005；33：e10.Covalent antibody display-an in vitro antibody-DNA library selection system.Reiersen H,Lobersli I,Loset GA,Hvattum E,Simonsen B,Stacy JE,McGregor D,Fitzgerald K,Welschof M,Brekke OH,Marvik OJ.)；利用微生物的質體的複製開始蛋白RepA結合於複製開始點ori之CIS展示(Proc Natl Acad Sci U S A.2004；101：2806-10.CIS display：In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes.Odegrip R,Coomber D,Eldridge B,Hederer R,Kuhlman PA,Ullman C,FitzGerald K,McGregor D.)。又，亦已知有按構成DNA庫之DNA每1分子，將轉錄轉譯系放入油包水(water-in-oil)乳液或脂質體來進行轉譯反應之體外分室化(in vitro compartmentalization)(Nat Biotechnol.1998；16：652-6.Man-made cell-like compartments for molecular evolution.Tawfik DS,Griffiths AD.)。能夠適當使用公知的方法並使用上述方法。
在本發明中，能夠使用以下所記載之無細胞轉譯系將該等核酸庫 進行轉譯。當使用無細胞轉譯系時，在目標核酸的下游包含編碼間隙子之序列為較佳。作為間隙子序列，可以舉出包含甘胺酸或絲胺酸之序列，但並不限定於此。又，將嘌呤黴素(puromycin)、其衍生物等利用核糖體進行轉譯時，在被納入肽中之化合物與核酸庫之間包含由RNA、DNA、六乙二醇(spc18)的聚合物(例如5個聚合物)等形成之連結子(linker)為較佳。
無細胞轉譯系
在本發明的肽化合物的製造方法中，使用無細胞轉譯系等蛋白質製造系為較佳。無細胞轉譯系係，除了從細胞提取之核糖體以外，將參與轉譯之蛋白因子群、tRNA、胺基酸、ATP(腺苷三磷酸)等能量源、其再生系組合者，能夠將mRNA轉譯為蛋白。本發明的無細胞轉譯系中，除了該等以外，能夠包含開始因子、伸長因子、解離因子、胺基醯基tRNA合成酶(ARS)、甲硫胺醯基tRNA轉甲醯基酶等。該等因子能夠藉由從各種細胞的提取液進行純化而獲得。用於將因子純化之細胞例如能夠舉出原核細胞或真核細胞。作為原核細胞，能夠舉出大腸桿菌細胞、高度好熱菌細胞或枯草桿菌細胞。作為真核細胞，已知有以酵母細胞、小麥胚芽、兔網狀紅血球、植物細胞、昆蟲細胞或動物細胞作為材料者。
無細胞轉譯系係，藉由將材料的細胞破碎並進行離心分離、透析等而製備之提取液中加入tRNA、胺基酸、ATP等者。例如，能夠使用將大腸桿菌(Methods Enzymol.1983；101：674-90.Prokaryotic coupled transcription-translation.Chen HZ,Zubay G.)、酵母(J.Biol.Chem.1979 254：3965-3969.The preparation and characterization of a cell-free system from Saccharomyces cerevisiae that translates natural messenger ribonucleic acid.E Gasior,F Herrera,I Sadnik,C S McLaughlin,and K Moldave)、小麥 胚芽(Methods Enzymol.1983；96：38-50.Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system.Erickson AH,Blobel G.)、兔網狀紅血球(Methods Enzymol.1983；96：50-74.Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA.Jackson RJ,Hunt T.)、Hela細胞(Methods Enzymol.1996；275：35-57.Assays for poliovirus polymerase,3D(Pol),and authentic RNA replication in HeLa S10 extracts.Barton DJ,Morasco BJ,Flanegan JB.)、昆蟲細胞(Comp Biochem Physiol B.1989；93：803-6.Cell-free translation in lysates from Spodoptera frugiperda(Lepidoptera：Noctuidae)cells.Swerdel MR,Fallon AM.)作為材料者。藉由加入T7 RNA聚合酶等RNA聚合酶，能夠使從DNA之轉錄、轉譯成對。另一方面，PUREfrex(註冊商標)係將大腸桿菌的轉譯所需要之蛋白因子類、能量再生系酶、核糖體分別提取、純化，並與tRNA、胺基酸、ATP、GTP(鳥苷三磷酸)等混合而得到之再構成無細胞轉譯系。不僅雜質的含量少，而且係再構成系，能夠容易製作不含欲排除之蛋白因子、胺基酸之系((i)Nat Biotechnol.2001；19：751-5.Cell-free translation reconstituted with purified components.Shimizu Y,Inoue A,Tomari Y,Suzuki T,Yokogawa T,Nishikawa K,Ueda T.(ii)Methods Mol Biol.2010；607：11-21.PURE technology.Shimizu Y,Ueda T.)。在本發明中，能夠適當使用公知的方法並使用上述方法。
核糖體、tRNA等無細胞轉譯系中所包含之各種因子能夠利用所屬技術領域中具有通常知識者周知的方法從大腸桿菌細胞或酵母細胞進行純化。又，tRNA或胺基醯基tRNA合成酶除了天然存在者以外，亦能夠使用識別人工tRNA或非天然胺基酸之人工胺基醯基tRNA合成酶。藉由使用人 工tRNA或人工胺基醯基tRNA合成酶，能夠合成部位特異地導入有非天然胺基酸之肽。
非天然胺基酸向肽之轉譯導入，需要具有正交性且高效地被納入到核糖體中之tRNA((i)Biochemistry.2003：42：9598-608.Adaptation of an orthogonal archaeal leucyl-tRNA and synthetase pair for four-base,amber,and opal suppression.Anderson JC,Schultz PG.,(ii)Chem Biol.2003；10：1077-84.Using a solid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code.Murakami H,Kourouklis D,Suga H.(iii)日本專利第4917044號)的胺基醯基化。作為將tRNA胺基醯基化之方法，能夠使用以下5種方法。
(1)在細胞內，按在tRNA的胺基醯基化的過程中與tRNA結合之胺基酸準備有胺基醯基tRNA合成酶。係利用某種胺基醯基tRNA合成酶容許N-Me His等非天然胺基酸之方法、亦即準備容許非天然胺基酸之變異胺基醯基tRNA合成酶並利用其之方法((i)Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99：9715-20.An engineered Escherichia coli tyrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in eukaryotic translation and its application in a wheat germ cell-free system.Kiga D,Sakamoto K,Kodama K,Kigawa T,Matsuda T,Yabuki T,Shirouzu M,Harada Y,Nakayama H,Takio K,Hasegawa Y,Endo Y,Hirao I,Yokoyama S.(ii)Science.2003；301：964-7.An expanded eukaryotic geneticcode.Chin JW,Cropp TA,Anderson JC,Mukherji M,Zhang Z,Schultz PG.Chin,JW.(iii)Proc Natl Acad Sci U S A.2006；103：4356-61.Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnatural amino acids.Hartman MC,Josep hson K,Szostak JW.)。
亦能夠使用(2)在試驗管內將tRNA胺基醯基化之後，對胺基酸進行化學修飾之方法(J Am Chem Soc.2008；130：6131-6.Ribosomal synthesis of N-methyl peptides.Subtelny AO,Hartman MC,Szostak JW.)。
(3)藉由從tRNA的3’末端的CCA序列去除了CA者與另外製備之胺基醯基化之pdCpA(由去氧胞苷和腺苷酸構成之二核苷酸)用RNA連接酶結合，能夠獲得胺基醯基tRNA(Biochemistry.1984；23：1468-73.T4 RNA ligase mediated preparation of novel“chemically misacylated”tRNAPheS.Heckler TG,Chang LH,Zama Y,Naka T,Chorghade MS,Hecht SM.)。
亦有(4)利用將各種非天然胺基酸的活性酯載持於tRNA之核糖核酸酵素亦即Flexizyme進行之胺基醯基化(J Am Chem Soc.2002；124：6834-5.Aminoacyl-tRNA synthesis by a resin-immobilized ribozyme.Murakami H,Bonzagni NJ,Suga H.)。亦能夠使用將tRNA和胺基酸活性酯在陽離子性微胞中進行超音波混合之方法(Chem Commun(Camb).2005；(34)：4321-3.Simple and quick chemical aminoacylation of tRNA in cationic micellar solution under ultrasonic agitation.Hashimoto N,Ninomiya K,Endo T,Sisido M.)。
(5)亦能夠藉由將與tRNA的3’末端附近為互補之PNA上結合有胺基酸活性酯者加入到tRNA來進行胺基醯基化(J Am Chem Soc.2004；126：15984-9.In situ chemical aminoacylation with amino acid thioesters linked to a peptide nucleic acid.Ninomiya K,Minohata T,Nishimura M,Sisido M.)。
作為導入非天然胺基酸之密碼子而利用終止密碼子之方法已有許多報告，但藉由使用PUREfrex(註冊商標)能夠建構去除了天然胺基酸、ARS之合成系，因此能夠針對編碼胺基酸之密碼子，代替已除去之天然胺基酸來導入非天然胺基酸，亦即能夠利用藉由對在天然胺基酸的轉譯中分配之密碼子除去天然胺基酸而成為空之密碼子來導入非天然胺基酸(J Am Chem Soc.2005：127：11727-35.Ribosomal synthesis of unnatural peptides.Josephson K,Hartman MC,Szostak JW.)。另外，藉由解開密碼子的退化性(degeneracy)及利用四鹼基密碼子之密碼子的擴展，無需除去天然胺基酸而能夠加入非天然胺基酸(Kwon I,et al.Breaking the degeneracy of the genetic code.J Am Chem Soe.2003,125,7512-3.T,Hohsaka et al.J Am Chem Soc.1996,118,9778.)。亦即，作為在側鏈上具備具有氰基之伸雜芳基、具有氰基之伸芳基或具有氰基之伸烷基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基，可以使用藉由對在天然胺基酸的轉譯中分配之密碼子除去天然胺基酸而成為空的密碼子、終止密碼子或四鹼基密碼子中的任一種。
在天然轉譯中，按照以下所示之通用基因密碼表，對64種密碼子分別分配有20種蛋白質性胺基酸及轉譯的終止(停止)。
在本發明中，除了肽鏈伸長反應中所使用之密碼子以外，開始密碼子亦能夠改寫。開始密碼子係指定轉譯開始之密碼子，對在mRNA上成為肽的N末端之開始胺基酸進行編碼。mRNA的轉譯的開始需要被稱作開始tRNA之特定的tRNA。欲開始轉譯，經胺基醯基化之開始tRNA與開始因子(IF)一同結合於核糖體的小次單元(small subunit)，核糖體的小次單元結合於mRNA上的開始密碼子。開始tRNA具有與開始密碼子對應之反密碼子，識別開始密碼子。在通用密碼表中，作為開始密碼子，一般使用作為甲硫胺酸的密碼子之AUG，因此開始tRNA具有與甲硫胺酸對應之反密碼子，開始tRNA必然搬運甲硫胺酸(原核細胞中為甲醯甲硫胺酸)。
有藉由利用啟動聯讀(開始密碼子的跳讀(skip))而不需要準備基於上述甲硫胺酸以外的胺基酸、胺基酸類似物或N末端羧酸類似物的N末端導入之末端為多樣之肽化合物或肽化合物庫的合成法中的複數種胺基醯基轉譯開始tRNA之方法。啟動聯讀(Initiation read through)一般係指，蛋白或肽從以AUG密碼子編碼之轉譯開始胺基酸亦即甲硫胺酸轉譯，但在無細胞轉譯系中不含轉譯開始甲硫胺醯基tRNA之情況或者欲從轉譯效率低的非天然胺基酸附加於轉譯開始tRNA者開始轉譯時，從編碼為第2位後的密碼子之胺基酸產生轉譯產物之現象。
作為利用啟動聯讀之方法，能夠使用如下方法：將甲硫胺酸以外的任意的天然胺基酸編碼為編碼肽之mRNA的開始密碼子後的第2位密碼 子，並以不含甲硫胺酸或轉譯開始甲硫胺酸tRNA之轉譯系進行轉譯，藉此製作將N末端作為甲硫胺酸以外的任意的天然胺基酸之肽或肽庫。作為另一報告，已知有藉由使酶例如肽去甲醯基酶(peptide deformylase)與甲硫胺酸胺基胺肽酶(Methionine aminopeptidase)作用而去除肽的N末端的甲硫胺酸之方法(Meinnel,T.,et al.Biochimie(1993)75,1061-1075,Methionine as translation start signal：A review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli.)。
又，亦能夠使用藉由使用其他所希望之胺基酸經胺基醯基化之轉譯開始tRNA進行轉譯而將N末端轉譯為所希望之胺基酸之方法。已知有在非天然胺基酸的N末端導入時，利用胺基酸的容許度比伸長時高且結構與天然型胺基酸大不相同之胺基酸、胺基酸類似物(J Am Chem Soc.2009 Apr 15；131(14)：5040-1.Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides.Goto Y,Suga H.)。
(肽的環狀化)
在本發明中，能夠利用經轉譯合成之非環狀的肽的分子內特異反應來將肽環狀化。
肽的環狀化藉由以下製程(i)及(ii)來實施。
(i)藉由轉譯合成來合成在分子內具有能夠進行鍵形成反應之一組官能基之官能基1及官能基2之非環肽化合物之製程；及(ii)藉由上述官能基1及官能基2的鍵形成反應而將上述非環肽化合物環狀化之製程。
能夠進行鍵形成反應之一組官能基係指，在一組官能基之間亦即官能基1與官能基2之間能夠進行鍵形成反應，而且作為該反應的結果，使 非環肽化合物成為環肽化合物之官能基的組。
在本發明中，作為上述一組官能基，使用氰基與上述式(2)的結構的組合。
亦即，在本發明中，製造肽鏈，該肽鏈在肽鏈中或C末端具有在側鏈上具有氰基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基，且在N末端具有上述式(2)的結構，使上述氰基與上述式(2)的結構進行反應而形成本說明書中所記載之式(3)所表示之鍵，藉此能夠製造環肽化合物。
由於藉由存在於非環肽化合物之、上述一組官能基之間的鍵形成而形成環，因此將構成非環肽化合物之要素(典型的為胺基酸)作為一個單位，該種一組官能基需要存在於不同構成要素的單位上。將該種構成要素稱為胺基酸化合物，將構成要素的單位稱為胺基酸化合物單位。亦即，非環肽化合物係在不同之胺基酸化合物單位上具有一組官能基之化合物。在非環肽化合物中，在具有其中一個官能基之胺基酸化合物單位與具有另一個官能基之胺基酸化合物單位之間存在1~18個胺基酸化合物單位為較佳，存在1~15個胺基酸化合物單位為更佳，存在3~13個胺基酸化合物單位為進一步較佳。
關於具有官能基2之胺基酸，例如，作為天然胺基酸能夠舉出半胱胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。作為非天然胺基酸，亦能夠使用具有-SH基之非天然胺基酸(例如，青黴胺、高半胱胺酸、巰基正纈胺酸等)、具有-NH2基之非天然胺基酸(例如，α,β-二胺基丙酸、α,γ-二胺基酪酸等)或具有OH基之非天然胺基酸(例如，高絲胺酸等)。
作為具有官能基2之胺基酸，半胱胺酸、a-甲基-半胱胺酸、青黴胺、高半胱胺酸為較佳。具有官能基2之胺基酸在至少包含該胺基酸及對應之tRN A之再構成型轉譯系中於肽鏈伸長反應中被導入。
藉由將如上述那樣合成之非環肽化合物環狀化而合成環肽化合物。官能基1及官能基2的鍵形成反應的條件根據官能基的種類來設定。
非環肽化合物的環狀化在將非環肽化合物分離之後，能夠藉由暴露於適當的反應條件來進行。或者，無需將非環肽化合物分離而能夠藉由將無細胞轉譯系調整為適當的反應條件來進行環狀化。又，根據一組官能基的種類，有時在用於合成非環肽化合物之無細胞轉譯系的條件下進行環狀化，在該情況下，無需進行特別的反應條件的調整而能夠獲得環肽化合物。
關於用於非環肽化合物的環狀化之較佳反應條件，在本說明書中如上所述。
(編碼肽之模板核酸)
在本發明中，可以藉由在無細胞轉譯系中從在編碼肽之區域具有隨機序列之模板核酸(mRNA或對應之DNA)進行轉譯合成來合成具有隨機的胺基酸序列之肽庫。另外，能夠藉由將轉譯系與體外展示技術進行組合而構成資料庫之肽以隨有編碼肽之核酸序列之狀態進行篩選。在該情況下，遺傳訊息從作為其轉譯產物亦即肽而提示(展示)之展示庫中進行肽適配體(aptamer)的選擇。藉此，資料庫中的各隨機肽分子上會附加能夠藉由分子生物學手法進行擴增及讀取之標籤。
在本發明中，可以將與肽的胺基酸序列對應之模板亦即RNA或DNA的序列設計為編碼肽的隨機資料庫。具體而言，在鹼基序列中編碼肽之區域包含由不同之複數個三聯體的重複構成之隨機序列，隨機序列中的三聯體的至少一部分成為與指定非天然胺基酸之密碼子對應之序列。
又，在編碼肽之區域中，亦可以係隨機序列中的四鹼基(四聯體)密碼 子的至少一部分為與指定非天然胺基酸之密碼子對應之序列。
在本發明中，亦可以設計為由RNA或DNA的序列號環肽。具體而言，在鹼基序列中編碼肽之區域沿著從mRNA序列的5’至3’的方向依序包含與以下(a)至(c)對應之鹼基序列：(a)指定具有官能基1之胺基酸之密碼子；(b)由不同之複數個三聯體的重複構成之隨機序列；及(c)指定具有官能基2之胺基酸之密碼子。
隨機的mRNA序列被設計為在作為其轉譯產物之隨機的胺基酸序列中非天然胺基酸以一定的概率出現。亦即，上述(b)的隨機序列中的三聯體的至少一部分成為指定非天然胺基酸，藉此非天然胺基酸導入到在作為轉譯產物之隨機肽的胺基酸序列的一部分。非天然胺基酸的導入藉由在核糖體上的肽鏈伸長反應中，連結有非天然胺基酸之伸長反應用tRNA的反密碼子與指定非天然胺基酸之密碼子匹配而達成。另外，藉由能夠進行鍵形成反應之一組官能基亦即官能基1及官能基2之間的鍵形成反應，作為轉譯產物之肽被環狀化。如上所述，為了非天然胺基酸的導入而使用之tRNA係藉由體外轉錄反應而製備之人工tRNA為較佳。
在本發明中，在由根據目的最佳化之成分構成之無細胞轉譯系中加入與成為轉譯模板之鹼基序列對應之DNA或RNA分子來利用。與利用活細胞之蛋白質顯現系同樣地，核酸序列中除了編碼目標胺基酸序列之區域以外，根據所使用之轉譯系能夠附加包含對轉譯有利之鹼基序列。例如，在利用來源於大腸桿菌之核糖體之系的情況下，在開始密碼子的上游包含夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno：SD)序列或ε序列等，藉此轉譯反應的效率上升。
在編碼肽之區域的N末端配置開始密碼子。開始密碼子通常為三聯體序列AUG。
在C末端側以體外展示用包含用於連結核酸分子和作為其轉譯產物之肽之序列。例如，當利用使用嘌呤黴素連結子之mRNA展示法時，將在mRNA庫預先連結有嘌呤黴素連結子者加入轉譯系，藉此形成mRNA-肽的複合體庫。為了將嘌呤黴素高效地納入核糖體的A位，通常在mRNA的3’末端側與嘌呤黴素之間插入連結子。嘌呤黴素在核糖體上作為肽転移反應的基質(胺基醯基tRNA類似體)發揮功能，藉由結合於伸長肽的C末端而連結mRNA和肽。mRNA展示法係藉由在體外轉譯系中經由適當的連結子連結mRNA和肽而使基因型與表現型一體化之技術，只要可達成該種目的，則亦能夠利用包含具有其他同樣的功能之物質之連結子來代替嘌呤黴素，這在所屬技術領域中具有通常知識者的識別範圍內。
隨機序列以由任意序列的三聯體構成之密碼子的重複所構成，並且被設計為一部分成為指定在側鏈上具有氰基之胺基酸那樣的非天然胺基酸之密碼子。又，可以在隨機序列中包含四鹼基(四聯體)密碼子，亦可以使該四鹼基密碼子指定在側鏈上具有氰基之胺基酸那樣的非天然胺基酸。
以N1N2N3密碼子表示構成隨機序列之三聯體，對可能的序列進行說明。N1和N2分別獨立地可以為A、U、C或G中的任1個。另外，N3亦可以為A、U、C或G中的任1個。或者，N3可以為選自A、U、C及G的4種鹼基中的任意3種中之任1個。或者，N3可以為選自A、U、C及G的4種鹼基中的任意2種中之任1個。或者，能夠將N3規定為A、U、C或G中的1個。
例如，作為構成隨機序列之mRNA序列上的三聯體的例子，可以 舉出NNU密碼子或NNK密碼子{N為A、U、C或G中的任一種核糖核苷酸，K為C或G中的任一種核糖核苷酸}。
(體外選擇(in vitro celection))
在本發明中，由無細胞轉譯系建構之肽庫能夠與以mRNA展示為代表之體外展示技術完全適合，因此能夠從109種以上的高的多樣性的肽庫構建結合於靶之肽分子。
體外展示技術作為分子進化工程的工具而被利用。在分子進化工程中，以創製具有所希望之功能或性質之蛋白質或肽為目的，大規模準備有可能性之基因，從中選擇具有目標表現型之選殖體。基本上，最初製備DNA集團(DNA庫)，獲得RNA集團(RNA庫)作為體外轉錄產物，從而獲得肽集團(肽庫)作為體外轉譯產物。在任一篩選系中從該肽庫選擇具有所希望之功能或性質者。例如，欲獲得結合於特定蛋白質之肽分子時，能夠使肽集團流入到將靶蛋白質固相化之管柱中，並回收結合於管柱之肽分子的混合物。此時，藉由體外展示技術，各肽分子上如標籤那樣附加有作為其模板之核酸分子。若為mRNA展示庫，則在各肽分子上附加有mRNA。因此，從所回收之肽-mRNA複合體的集團以反轉錄酶恢復為DNA，並以PCR(聚合酶連鎖反應)擴增而獲得具有目標表現型之包含較多選殖且施加有偏壓之資料庫之後，再次進行相同之選擇實驗。或者，為了避免回收RNA適配體之可能性，亦能夠以將核酸部分設為2條鏈(DNA/RNA混合)之目的而在選擇前進行反轉錄反應。藉由重複該操作，隨著時間的經過，具有所希望之表現型之選殖體在集團中逐漸濃縮。
當將肽適配體鑒定時，重複進行如下製程，亦即，將體外展示庫和靶物質混合，並選擇提示結合於靶物質之肽之對應關聯分子(活性種)， 由所選擇之對應關聯分子的核酸部分藉由PCR製備核酸庫，藉此能夠將結合於靶物質之肽適配體的基因選殖。
作為靶物質，一般而言，可以舉出蛋白質、核酸、包括複合脂質之脂質、包括糖鏈之糖、其他生物體分子等、以及金屬或顏料等。
作為靶物質，疾病治療的生物體內分子、尤其習知之分子量小於500的低分子化合物所能特有之不具有空間之分子、或抗體等高分子化合物無法接觸之細胞內蛋白質、核酸、膜蛋白質的細胞內區域或膜蛋白質的膜貫通分域(domain)等為較佳。
作為靶物質，例如可以舉出G蛋白質偶聯受體(G Protein-Coupled Receptor，GPCR)、核內受體、蛋白質激酶、蛋白酶、酯酶、離子通道、代謝酶、非結構化(Unstructured)蛋白質、RNA、DNA、脂肪酸、磷脂、固醇等。
作為靶物質的具體例，可以舉出以下：c-Myc、STAT、AP1、CREB、SREBP等轉錄因子、GPR143、GRM1、ADORA1、毒蕈鹼(muscarine)性乙醯膽鹼受體、大麻素受體、GLP-1受體、PTH受體等G蛋白質偶聯型受體(G Protein-Coupled Receptor、GPCR)、TNF、TNFR、IL-6、IL-6R等細胞素或其受體、P2X受體、菸鹼性乙醯膽鹼受體等離子通道型受體、EGFR、PDGFR等酪胺酸激酶型受體、p53、XIAP、Mcl-1、Bcl-2、MDM2、MLL、BRD4、USP7、YAP等細胞質蛋白質miR-21、miR206等microRNA、cfDNA、粒線體DNA等DNA類。
又，可以係金、銀、銅、鉑、鈀等金屬或其金屬鹽成為靶物質，亦可以係氧化鈦、硫酸鋇、碳黑、二氧化矽、氧化鐵、偶氮色素、酞菁、蒽醌等顏料成為靶物質。
為了選擇活性種，需要使[遺傳訊息]-[肽]複合體與靶物質接觸，利用適當的方法從未結合於靶物質之其他複數個複合體分離出提示結合於靶物質之肽之複合體，並進行回收。作為該種回收方法，很多技術是公知的。
例如，若已對靶物質實施能夠藉由對固相之結合而回收之修飾，則非常便利。例如，可以預先對靶物質進行生物素修飾，利用對經固相化之生物素結合蛋白質之特異結合來回收。作為該種特異結合，除了生物素結合蛋白質(抗生物素蛋白、鏈霉親和素等)/生物素的組合以外，能夠利用麥芽糖結合蛋白質/麥芽糖、多聚組胺酸肽/金屬離子(鎳、鈷等)、麩胱甘肽-S-轉移酶/麩胱甘肽、抗體/抗原(抗原決定區)等，但並不限定於該等。
本發明包括以下步驟：使肽庫與靶物質接觸，並選擇提示結合於靶物質之肽之活性種，將所選擇之活性種的核酸序列擴增，並將擴增之核酸序列作為模板，重複進行從在無細胞轉譯系中再次合成之肽的資料庫選擇活性種之體外切片(in vitro section)，藉此創製結合於靶物質之肽。
結合於靶物質之肽化合物的創製包括以下步驟：回收提示結合於靶物質之肽之活性種並分析核酸序列，根據核酸序列決定肽序列，基於所獲得之肽序列選擇適當的肽，藉此獲得結合於靶物質之肽的胺基酸序列及核酸序列。另外，基於所獲得之序列訊息，並使用任意的方法能夠對肽進行合成、純化及分離。使用所獲得之肽來進行靶蛋白質的結合評價或抑制活性的確認，從而能夠獲得活性高的肽。
【實施例】
利用以下實施例對本發明進行說明，但本發明並不限定於該等。
當沒有特殊記載時，利用管柱層析之純化中使用了自動純化裝置ISOLERA(Biotage Inc.)或中壓液相層析裝置YFLC W-prep 2XY(YAMAZEN CORPORATION)。
當沒有特殊記載時，矽膠管柱層析中之載體使用了SNAP KP-Sil Cartridge(Biotage Inc.)、Hi-Flash Colum W001、W002、W003、W004或W005(YAMAZEN CORPORATION)。
NH二氧化矽使用了SNAP KP-NH Cartridge(Biotage Inc.)。
洗提液中之混合比為容量比。
例如，“氯仿/甲醇=90/10→50/50”係指將“氯仿/甲醇=90/10”的洗提液改變為“氯仿/甲醇=50/50”的洗提液。
使用同時進行ACQUITY SQD LC/MS System(Waters Corporation，游離法：ESI(ElectroSpray Ionization，電灑游離)法或LCMS-2010EV(SHIMADZU CORPORATION，游離法：ESI及APCI(Atomospheric Pressure Chemical Ionization，大氣壓化學游離)之游離法來測定了質譜(MS)。
當沒有特殊記載時，表中的MS係指MS(ESI m/z)：(M+H)。
微波反應裝置使用了InitiatorTM(Biotage Inc.)。流動式氫化反應裝置使用了H-Cube(ThalesNano公司)。
使用四甲基矽烷作為內部基準，使用Bruker AV300(Bruker公司)來測定核磁共振(NMR)質譜，並以ppm表示總δ值。
使用SQD(Waters Corporation)來測定保持時間(RT)，並以分鐘(min)表示。
管柱：Waters Corporation製造，BEHC 18 1.7μm，2.1×30mm
溶劑：A液：0.1%甲酸-水
B液：0.1%甲酸-乙腈
梯度循環：0.00min(A液/B液=95/5)、2.00min(A液/B液=5/95)、3.0 0min(A液/B液=5/95)
流速：0.5mL/min
管柱溫度：室溫
檢測波長：254nm
MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of flight mass spectrum：基質輔助雷射脫附游離-飛行時間質譜)使用了ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF MS(Bruker Daltonics Co.製造)。基質使用了α-氰基-4-羥基桂皮酸。
4-溴-2-氰基噻唑的合成
向4-溴-1,3-噻唑-2-甲醛(carbaldehyde)(500mg)的甲醇(MeOH)溶液5mL中加入N-甲基嗎福林(NMM)430μL及羥基胺鹽酸鹽(200mg)，並在室溫下攪拌了12小時。減壓蒸餾除去溶劑之後，加入蒸餾水、乙酸乙酯，進行了提取操作。將有機層用蒸餾水及飽和食鹽水清洗，並且用硫酸鎂使其乾燥。向獲得之殘渣中加入二氯甲烷10mL及1,1’-羰基二咪唑(CDI)430mg，並在室溫下攪拌了2小時。蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→10/90)純化殘渣，獲得了黃色固體的標題化合物(450mg)。
MS(ESI m/z)：190.9(M+H)
RT(min)：1.06
4-溴-2-氰基呋喃的合成
與4-溴-2-氰基噻唑的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：172.0(M+H)
RT(min)：1.18
3-溴-4-硝基芐腈的合成
(1)3-溴-4-硝基苯甲醯胺的合成
向3-溴-4-硝基苯甲酸(2.35g)的乙腈溶液(20mL)中加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯(DMT-MM)(3.95g)及氨的甲醇溶液(7mol/L、8mL)，並在室溫下攪拌了3.5小時。向反應溶液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，獲得了淡黃色固體的標題化合物(2.26g)。
MS(ESI m/z)：246.9(M+H)
RT(min)：0.96
(2)3-溴-4-硝基芐腈的合成
向3-溴-4-硝基苯甲醯胺2.0g中加入了四氫呋喃(THF)10mL及三乙胺(TEA)4mL。在冰浴下滴加三氟乙酸酐(TFAA)1.8mL，並攪拌了2小時。 蒸餾除去溶劑之後，向所獲得之殘渣中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→15/85)進行純化，獲得了淡黃色固體的標題化合物1.45g。
MS(ESI m/z)：228.1(M+H)
RT(min)：1.31
6-溴苯并[b]噻吩-2-甲腈(carbonitrile)的合成
將6-溴苯并[b]噻吩-2-羧酸作為起始原料，與3-溴-4-硝基芐腈的合成同樣地進行實施。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.03(1H,s),7.86(1H,s),7.75(1H,d,J=8.6Hz),7.59(1H,dd,J=8.6,2.0Hz)。
MS(ESI m/z)：239.0(M+H)
RT(min)：1.69
6-溴苯并呋喃-2-甲腈的合成
(1)2-(5-溴-2-甲醯苯氧基)乙腈的合成
向4-溴-2-羥基苯甲醛(1.1g)中加入N,N-二甲基甲醯胺(DMF)(5mL)、 碳酸鉀(1.2g)及溴乙腈(460μL)，並在室溫下攪拌了15小時。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→10/90→30/70)進行純化，獲得了淡黃色油狀的標題化合物(1.1g)。
MS(ESI m/z)：241.0(M+H)
RT(min)：1.25
(2)6-溴苯并呋喃-2-甲腈的合成
向2-(5-溴-2-甲醯苯氧基)乙腈(1.1g)中加入DMF(10mL)及碳酸鉀(0.95g)，並在100℃下攪拌了1小時。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→10/90)進行純化，獲得了淡黃色固體的標題化合物(1.1g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.76(1H,s),7.59-7.47(2H,m),7.44(1H,s)。
MS(ESI m/z)：223.0(M+H)
RT(min)：1.64
4-溴-1-(四氫-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-3-甲腈的合成
向4-溴-1H-吡唑-3-甲腈(1.06g)的THF溶液(14mL)中加入3,4-二氫吡喃(0.98mL)及三氟乙酸(47μL)，並在60℃下攪拌了18小時。減壓蒸 餾除去溶劑，並將所獲得之殘渣溶解於二氯甲烷中。將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→13/87→25/75)進行純化，獲得了白色固體的標題化合物(1.30g)。
MS(ESI m/z)：256.8(M+H)
RT(min)：1.44
(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-碘丙酸第三丁酯的合成
在冰浴下，向三苯基膦(PPh3)(7.35g)及咪唑(1.96g)的二氯甲烷溶液(50mL)中添加碘(7.29g)之後，將溶液的溫度升溫至室溫，並攪拌了1小時。然後，在冰浴下滴加了(第三丁氧基羰基)-L-絲胺酸第三丁酯(Boc-Ser-OtBu)(5.0g)的二氯甲烷溶液(10mL)。Boc表示第三丁氧基羰基，tBu表示第三丁基。滴加結束後，將溶液的溫度升溫至室溫，並攪拌了16小時。濾出不溶物之後，減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→5/95)純化殘渣，獲得了淡黃色固體的標題化合物(5.35g)。
MS(ESI m/z)：372.1(M+H)
RT(min)：1.83
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸第三丁酯的合成
【化學式28】
向鋅粉末(116mg)中加入DMF(2mL)及碘(25mg)，並在氮氣環境下攪拌了5分鐘。然後，加入(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-碘丙酸第三丁酯(226mg)及碘(25mg)，在氮氣環境下於室溫進一步攪拌了30分鐘。向該溶液中添加6-溴喹啉-2-甲腈(185mg)、三(二亞苄基丙酮)二鈀(0)(亦記為Pd2(dba)3)(13mg)及2-二環己基膦基-2’,6’-二甲氧基聯苯(Sphos)(12mg)，並在60℃、氮氣環境下攪拌了4小時。藉由Celite過濾來去除不溶物，蒸餾除去濾液的溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→15/85)純化殘渣，獲得了淡黃色油狀的標題化合物(90mg)。
MS(ESI m/z)：398.2(M+H)
RT(min)：1.72
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表2所示之化合物的合成。
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-基)丙酸第三丁酯的合成
(1)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-硝基苯基)丙酸第三丁酯的合成
將(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-硝基苯基)丙酸(Boc-Phe(pNO2)-OH)(318mg)溶解於甲苯(10mL)中，並加熱至80℃。向該溶液中滴加了N,N-二甲基甲醯胺-二第三丁基縮醛(1.0mL)。滴加後，在80℃下攪拌了1小時。藉由液相層析-質譜分析(LC-MS)確認原料的消失，並冷卻至室溫。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→15/85)進行純化，獲得了透明液體的標題化合物349mg。
MS(ESI m/z)：367.9(M+H)
RT(min)：1.75
(2)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺基苯基)丙酸第三丁酯的合成
將還元鐵1.0g及氯化銨(300mg)溶解於乙醇(EtOH)(15mL)及蒸餾水(15mL)中，並在80℃下加熱了20分鐘。向該溶液中添加(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-硝基苯基)丙酸第三丁酯(349mg)的乙醇溶液(5mL)，並在80℃下攪拌了1.5小時。藉由Celite過濾來去除不溶物，並 減壓蒸餾除去了濾液。向所獲得之殘渣中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層利用飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行乾燥，減壓蒸餾除去溶劑，獲得了茶色油狀的標題化合物327mg。
MS(ESI m/z)：337.0(M+H)
RT(min)：1.20
(3)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺基-3-溴苯基)丙酸第三丁酯的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺基苯基)丙酸第三丁酯(300mg)的DMF溶液(10mL)中加入N-溴琥珀醯亞胺(NBS)173mg，並在室溫下攪拌了1小時。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→15/85→20/80)進行純化，獲得了透明液體的標題化合物(280mg)。
MS(ESI m/z)：416.9(M+H)
RT(min)：1.72
(4)(S、E)-3-(3-溴-4-((4-氯-5H-1,2,3-二噻唑-5-亞基)胺基)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺基-3-溴苯基)丙酸第三丁酯(280mg)的二氯甲烷溶液(10mL)中添加Appel’s salt(4,5-二氯-1,2,3-二噻唑鎓氯化物)170mg，並在室溫下攪拌了3.5小時。向該溶液中添加吡啶(Py)110μL，進一步在室溫下攪拌了1小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→10/90→15/85)進行純化，獲得了黃色油狀的標題化合物280mg。
MS(ESI m/z)：551.7(M+H)
RT(min)：2.09
(5)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-基)丙酸第三丁酯的合成
向(S、E)-3-(3-溴-4-((4-氯-5H-1,2,3-二噻唑-5-亞基)胺基)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯(280mg)的吡啶溶液(5mL)中添加碘化銅(I)110mg，並照射了微波(InitiatorTM、100℃、1.0小時、2.45GHz、0-240W)。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→15/85)進行純化，獲得了淡黃色油狀的標題化合物159mg。
MS(ESI m/z)：403.9(M+H)
RT(min)：1.82
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-6-甲氧基苯并[d]噻唑-5-基)丙酸第三丁酯的合成
(1)(S)-3-(5-胺基-4-溴-2-甲氧基苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺基-3-溴苯基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：446.0(M+H)
RT(min)：1.73
(2)(S,Z)-3-(4-溴-5-((4-氯-5H-1,2,3-二噻唑-5-亞基)胺基)-2-甲氧基苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成
與(S,E)-3-(3-溴-4-((4-氯-5H-1,2,3-二噻唑-5-亞基)胺基)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：581.8(M+H)
RT(min)：2.13
(3)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-6-甲氧基苯并[d]噻唑-5-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：434.0(M+H)
RT(min)：1.84
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)丙酸第三丁酯的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1H-吲哚-5-基)丙酸 第三丁酯179mg中加入DMF5mL、碳酸鉀(180mg)及甲磺酸甲酯(MeOMs)(50μL)，並在室溫下攪拌了3小時。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→20/80)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物(163mg)。
MS(ESI m/z)：400.1(M+H)
RT(min)：1.85
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)丙酸第三丁酯及(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)丙酸第三丁酯的混合物的合成
(1)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(3,4-二胺基苯基)丙酸第三丁酯的合成
向還元鐵110mg及氯化銨210mg中加入乙醇10mL及蒸餾水10mL，並進行了20分鐘加熱回流。然後，加入(S)-3-(4-胺基-3-硝基苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯150mg的乙醇溶液(5mL)，進行了2小時加熱回流。將反應溶液冷卻至室溫，並進行Celite過濾，減壓蒸餾除去 了所獲得之濾液。向所獲得之殘渣中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層利用飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行乾燥，減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→30/70→60/40)進行純化，獲得了茶色油狀的標題化合物81.2mg。
MS(ESI m/z)：352.1(M+H)
RT(min)：1.10
(2)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)丙酸第三丁酯的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(3,4-二胺基苯基)丙酸第三丁酯81mg中添加吡啶5mL及Appel’s salt58mg，並在室溫下攪拌30分鐘，緊接著照射了微波(InitiatorTM、150℃、30分鐘、2.45GHz、0-240W)。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→30/70→60/40)進行純化，獲得了茶色油狀的標題化合物25.2mg。
MS(ESI m/z)：387.1(M+H)
RT(min)：1.51
(3)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)丙酸第三丁酯及(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)丙酸第三丁酯的混合物的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
以維持位置異構體混合物的狀態進入下一製程。
MS(ESI m/z)：401.1(M+H)
RT(min)：1.62
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基苯并[d]噁唑-6-基)丙酸第三丁酯的合成
(1)(S)-3-(4-胺基-3-羥基苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(3,4-二胺基苯基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：353.3(M+H)
RT(min)：1.11
(2)(S,Z)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-((4-氯-5H-1,2,3-二噻唑-5-亞基)胺基)-3-羥基苯基)丙酸第三丁酯的合成
與(S,E)-3-(3-溴-4-((4-氯-5H-1,2,3-二噻唑-5-亞基)胺基)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：488.3(M+H)
RT(min)：1.97
(3)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基苯并[d]噁唑-6-基)丙酸第三丁酯的合成
向(S,Z)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-((4-氯-5H-1,2,3-二噻 唑-5-亞基)胺基)-3-羥基苯基)丙酸第三丁酯51mg中加入甲苯4mL及吡啶0.5mL，並照射了微波(InitiatorTM、150℃、30分鐘、2.45GHz、0-240W)。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→5/95→10/90)進行純化，獲得了黃色油狀的標題化合物22.2mg。
MS(ESI m/z)：388.1(M+H)
RT(min)：1.18
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(6-氰基-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)丙酸第三丁酯及(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(5-氰基-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)丙酸第三丁酯的混合物的合成
(1)N4-(2-胺基-5-氰基苯基)-N2-(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸第三丁酯的合成
向(S)-4-(第三丁氧基)-3-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-氧代丁酸300mg中加入了DMF5mL及N-甲基嗎福林120μL。在冰浴下加入氯甲酸異丁酯135μL，並攪拌了30分鐘。然後，加入3,4-二胺基芐腈138mg，並在室溫下攪拌了18小時。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/10 0→50/50)進行純化，獲得了茶色油狀的標題化合物321mg。
MS(ESI m/z)：405.1(M+H)
RT(min)：1.39
(2)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(6-氰基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成
向N4-(2-胺基-5-氰基苯基)-N2-(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸第三丁酯321mg中加入乙酸(AcOH)5mL，並在60℃下攪拌了24小時。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→35/65)進行純化，獲得了紅色油狀的標題化合物321mg。
MS(ESI m/z)：387.1(M+H)
RT(min)：1.36
(3)(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(6-氰基-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)丙酸第三丁酯及(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(5-氰基-1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)丙酸第三丁酯的混合物的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。獲得了茶色油狀的標題化合物。
以維持位置異構體的混合物的狀態進入下一製程。
MS(ESI m/z)：401.1(M+H)
RT(min)：1.49
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸氰基甲酯的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸第三丁酯(90mg)的二氯甲烷溶液(1mL)中加入三氟乙酸(TFA)5mL，並在室溫下攪拌了4小時。蒸餾除去溶劑，添加DMF 5mL、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)2mL及二碳酸二第三丁酯(Boc2O)80μL，並在室溫下攪拌了2小時。確認原料的消失之後，添加溴乙腈30μL，進一步在室溫下攪拌了5小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→20/80→40/60)進行純化，獲得了白色非晶狀的標題化合物20.4mg。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.29(1H,d,J=8.6Hz),8.15(1H,d,J=8.6Hz),7.77-7.63(3H,m),5.04-4.93(1H,m),4.89-4.64(3H,m),3.47-3.21(2H,m),1.41(9H,s)。
MS(ESI m/z)：381.1(M+H)
RT(min)：1.41
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸氰基甲酯的合成同樣地實施了下述表3所示之化合物的合成。
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基苯基)丙酸氰基甲酯的合成
向Boc-4-氰基-L-苯基丙胺酸(Boc-Phe(4-CN)-OH)0.5g的DMF溶液(10mL)中加入N,N’-二異丙基乙胺0.9mL及溴乙腈0.18mL，並在室溫下攪拌了2小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→40/60)進行純化，獲得了白色固體599mg。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.63(2H,d,J=7.9Hz),7.30(2H,d,J=7.9Hz),4.99-4.89(1H,m),4.89-4.61(3H,m),3.24(1H,dd,J=13.9,5.9Hz),3.13-3.08(1H,m),1.42(9H,s)。
MS(ESI m/z)：330.0(M+H)
RT(min)：1.39
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氰基丙酸氰基甲酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基苯基)丙酸氰基甲酯的合成同樣地進行實施。
【表4】
(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸第三丁酯的合成
向L-天冬醯胺酸-第三丁酯1.0g的乙酸乙酯溶液(20mL)中添加三乙胺815μL及二碳酸二第三丁酯(Boc2O)1.34mL，並在室溫下攪拌了15小時。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，獲得了白色固體的標題化合物1.41g。
MS(ESI m/z)：289.0
RT(min)：1.10
(S)-4-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-硫代丁酸第三丁酯的合成
向(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸第三丁酯(1.41g)的THF溶液20mL中添加勞森(Lawsson)試劑(2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3-二硫雜-2,4-二磷丁環(diphosphetane)-2,4-二硫化物)1.03g，並在室溫下攪拌了3小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→30/70→40/60)進行純化，獲得了白色固體的標題化合物1.39g。
MS(ESI m/z)：305.0
RT(min)：1.31
(S)-2-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
向(S)-4-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-硫代丁酸第三丁酯(1.39g)的乙醇溶液(20mL)中加入吡啶1.1mL及溴丙酮酸乙酯635μL，並加熱回流了3.5小時。進一步加入溴丙酮酸310μL，並加熱回流了2小時。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了 提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→20/80)進行純化，獲得了茶色油狀的標題化合物(680mg)。
MS(ESI m/z)：401.0
RT(min)：1.62
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成
向(S)-2-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)噻唑-4-羧酸乙酯(680mg)的甲醇溶液(5mL)中添加25%氨水6.5mL，並在室溫下攪拌了24小時。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=30/70→40/60→80/20)進行純化，獲得了透明油狀的標題化合物473mg。
MS(ESI m/z)：372.0
RT(min)：1.30
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成
【化學式42】
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯(312mg)的二氯甲烷溶液(5mL)中加入了三乙胺240μL。在冰浴上滴加三氟乙酸酐130μL，並在室溫下攪拌了14小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→10/90→20/80)進行純化，獲得了透明油狀的標題化合物193mg。
MS(ESI m/z)：354.0
RT(min)：1.58
4-溴-1-甲基-1H-吡咯-2-甲腈的合成
向1-甲基-1H-吡咯-2-甲腈605mg的DMF溶液(5mL)中加入NBS1.02g，並攪拌了5小時。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→5/95)進行純化，獲得了白色固體的標題化合物405mg。
MS(ESI m/z)：186.0(M+H)
RT(min)：1.26
(4-溴苯甲醯基)-L-絲胺酸甲酯的合成
【化學式44】
向甲基-L-絲胺酸酯鹽酸鹽0.84g中加入了二氯甲烷20mL、三乙胺1.51mL。在冰浴下滴加了4-溴苯甲醯氯1.19g。滴加後，在室溫下攪拌了2小時。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=50/50→100/0)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物1.49g。
MS(ESI m/z)：303.8(M+H)
RT(min)：0.98
2-(4-溴苯基)噁唑-4-羧酸甲酯的合成
向(4-溴苯甲醯基)-L-絲胺酸甲酯中加入THF15mL、伯吉斯(Burgess)試劑(N-(三乙基銨磺醯基)胺基甲酸甲酯)1.41g，並在80℃下攪拌了2小時。然後，減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，加入二氯甲烷15mL、三氯溴甲烷1.51mL、二氮雜雙環十一碳烯2.29mL，並在室溫下攪拌了2小時。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去 溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→10/90→30/70)進行純化，獲得了白色固體的標題化合物775mg。
MS(ESI m/z)：283.8(M+H)
RT(min)：1.45
1-(4-硝基苯基)-1H-咪唑-4-羧酸乙酯的合成
向1H-咪唑-4-羧酸乙酯1.2g的乙腈15mL的溶液中加入1-氟-4-硝基苯1.3g、碳酸鉀1.5g，並在60℃下攪拌了17小時。向殘渣中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，加入乙酸乙酯5mL、己烷30mL，並濾出固體。將所獲得之固體用己烷清洗，獲得了白色固體的標題化合物977mg。
MS(ESI m/z)：262.9(M+H)
RT(min)：1.10
1-(4-胺基苯基)-1H-咪唑-4-羧酸乙酯的合成
向還元鐵1.05g及氯化銨200mg中加入乙醇18mL及蒸餾水2mL，並加熱回流了20分鐘。然後，加入1-(4-硝基苯基)-1H-咪唑-4-羧酸乙酯970mg，並加熱回流了1小時。將反應溶液冷卻至室溫，並進行Celite過濾，減 壓蒸餾除去了所獲得之濾液。利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/甲醇=100/0→95/5)進行純化，獲得了黃色油狀的標題化合物819mg。
MS(ESI m/z)：232.0(M+H)
RT(min)：0.72
1-(4-溴苯基)-1H-咪唑-4-羧酸乙酯的合成
向1-(4-胺基苯基)-1H-咪唑-4-羧酸乙酯819mg中加入了乙腈10mL、溴化銅875mg。在室溫下向該溶液中滴加亞硝酸第三丁酯1.1mL，滴加後，在室溫下攪拌了4小時。向反應溶液中加入蒸餾水、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，加入乙酸乙酯5mL、己烷30mL，並濾出固體。將所獲得之固體用己烷清洗，獲得了黃色固體的標題化合物746mg。
MS(ESI m/z)：296.8(M+H)
RT(min)：1.29
6-溴咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成
向2-胺基-5-溴嘧啶2.0g中加入乙醇30mL、3-溴丙酮酸乙酯2.9mL，並進行了6小時加熱回流。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→15/85→30/70)進行純化，獲得了黃色固體的標題化合物 804mg。
MS(ESI m/z)：271.9(M+H)
RT(min)：1.06
6-溴咪唑并[1,2-a]吡-2-羧酸乙酯的合成
與6-溴咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：271.9(M+H)
RT(min)：0.92
6-溴咪唑并[1,2-b]嗒-2-羧酸乙酯的合成
與6-溴咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：271.9(M+H)
RT(min)：1.09
5-溴-1-甲基-1H-吲唑-3-甲腈的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：237.9(M+H)
RT(min)：1.48
4-溴-1-甲基-1H-吡唑-3-甲腈的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基-1-甲基-1H-吲哚-5-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：187.0(M+H)
RT(min)：1.10
6-(3-溴苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成
向6-溴吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羧酸乙酯600mg中加入(3-溴苯基)硼酸495mg、THF20mL、碳酸鈉水溶液(1.0mol/L)5.9mL，並進行了氮氣置換。向該溶液中加入四(三苯基膦)鈀(0)81.4mg，並在80℃下攪拌了9小時。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=10/90→30/70)進行純化，獲得了黃色固體的標題化合物622mg。
MS(ESI m/z)：347.8(M+H)
RT(min)：1.57
6-(3-溴苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲醯胺的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：318.9(M+H)
RT(min)：1.17
6-(3-溴苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲腈的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：300.0(M+H)
RT(min)：1.55
將(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-碘丙酸第三丁酯用於原料，並且與(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表5所示之化合物的合成。
【表5-2】
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸氰基甲酯的合成同樣地實施了下述表6所示之化合物的合成。
6-(2-溴乙醯基)吡啶甲酸乙酯的合成
向6-乙醯基吡啶甲酸乙酯990mg中加入了溴化氫(30%乙酸溶液)3.1mL。然後，添加溴300μL，並在室溫下攪拌了9小時。向反應溶液中加入蒸餾水及乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→20/80)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物1.49g。
MS(ESI m/z)：273.8(M+H)
RT(min)：1.29
2-(2-溴乙醯基)噻唑-4-羧酸甲酯的合成
與6-(2-溴乙醯基)吡啶甲酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：265.8(M+H)
RT(min)：1.08
2-(2-溴乙醯基)菸鹼酸乙酯的合成
【化學式59】
與6-(2-溴乙醯基)吡啶甲酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：273.9(M+H)
RT(min)：1.24
6-乙醯基菸鹼酸甲酯的合成
向6-氯菸鹼酸甲酯1.5g中加入甲苯20mL，並進行了氮氣置換。向該溶液中加入三丁基(1-乙氧基乙烯基)錫3.65mL、二氯雙(三苯基膦)鈀(II)308mg，並在氮氣環境下於105℃攪拌了5小時40分鐘。減壓蒸餾除去溶劑，加入甲醇10mL、濃鹽酸5mL，並在室溫下攪拌了16小時。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入蒸餾水5mL，用飽和碳酸氫鈉水溶液進行了中和處理。加入乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→40/60)進行純化，獲得了白色固體的標題化合物927mg。
MS(ESI m/z)：180.0(M+H)
RT(min)：0.97
6-(2-溴乙醯基)菸鹼酸甲酯的合成
【化學式61】
與6-(2-溴乙醯基)吡啶甲酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：259.0(M+H)
RT(min)：1.26
6-乙醯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成
與6-乙醯基菸鹼酸甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：234.0(M+H)
RT(min)：0.95
6-(2-溴乙醯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成
與6-(2-溴乙醯基)吡啶甲酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：313.9(M+H)
RT(min)：1.13
3-溴-2,2-二甲氧基丙酸的合成
向3-溴丙酮酸5.0g中加入原甲酸三甲酯10mL、硫酸400μL，並在室溫下攪拌了9小時。向反應溶液中加入二氯甲烷100mL，並用10%鹽酸水溶液100mL進行了清洗。向水層中加入乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，獲得了白色固體的標題化合物3.43g。
1H-NMR(CDCl3)δ：3.62(2H,s),3.38(6H,s)。
O-苄基-N-(3-溴-2,2-二甲氧基丙醯基)-L-絲胺酸甲酯的合成
向3-溴-2,2-二甲氧基丙酸3.43g中加入二氯甲烷50mL、二異丙基乙胺17mL、HATU(1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽)7.35g、O-甲基O-苄基-L-絲胺酸酯鹽酸鹽4,35g，並在室溫下攪拌了7小時。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入鹽酸水溶液(1mol/L)、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用鹽酸水溶液(1mol/L)、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→40/60)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物5.77g。
MS(ESI m/z)：405.9(M+H)
RT(min)：1.46
(3-溴-2,2-二甲氧基丙醯基)-L-絲胺酸甲酯的合成
【化學式66】
向O-苄基-N-(3-溴-2,2-二甲氧基丙醯基)-L-絲胺酸甲酯5.77g中加入甲醇30mL，並利用流動式氫化反應裝置(H-Cube(ThalesNano公司))實施了反應(10%氫氧化鈀/碳、40bar、60℃、2.0mL/mL)。反應後，減壓蒸餾除去溶劑，獲得了黃色油狀的標題化合物4.41g。
MS(ESI m/z)：315.9(M+H)
RT(min)：0.75
2-(2-溴-1,1-二甲氧基乙基)噁唑-4-羧酸甲酯的合成
向(3-溴-2,2-二甲氧基丙醯基)-L-絲胺酸甲酯4.41g中加入二氯甲烷50mL，並冷卻至-78℃。向該溶液中滴加(二乙基胺基)硫三氟化物2.05mL，並在-78℃下攪拌了1小時。然後，加入碳酸鉀3.75g，在-78度下攪拌1小時，並在室溫下攪拌了2小時。濾出不溶物之後，減壓蒸餾除去濾液，並加入了二氯甲烷50mL、二氮雜雙環十一碳烯4.2mL。在冰浴上滴加三氯溴甲烷3.72mL，滴加後，在室溫下攪拌了4小時30分鐘。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入蒸餾水及乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用鹽酸水溶液(1mol/L)、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=12/88→100/0)進行純化，獲得了黃色油狀的標題化合物2.57g。
MS(ESI m/z)：295.9(M+H)
RT(min)：1.05
2-(2-溴乙醯基)噁唑-4-羧酸甲酯的合成
向2-(2-溴-1,1-二甲氧基乙基)噁唑-4-羧酸甲酯2.57g中加入甲酸15mL，並在60℃下攪拌了3小時30分鐘。向反應溶液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→20/80→40/60)進行純化，獲得了白色固體的標題化合物1.46g。
MS(ESI m/z)：249.9(M+H)
RT(min)：0.93
N-(2-(苄氧基)丙醯基)-O-(第三丁基)-L-別蘇胺酸甲酯的合成
與O-苄基-N-(3-溴-2,2-二甲氧基丙醯基)-L-絲胺酸甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：352.2(M+H)
RT(min)：1.66
(2-(苄氧基)丙醯基)-L-別蘇胺酸甲酯的合成
向N-(2-(苄氧基)丙醯基)-O-(第三丁基)-L-別蘇胺酸甲酯3.91g中加入TFA10mL，並在室溫下攪拌了2小時。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入飽和碳酸氫鈉水溶液及乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=50/50→100/0)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物2.30g。
MS(ESI m/z)：296.1(M+H)
RT(min)：1.06
(2S)-2-(2-(苄氧基)丙醯胺)-3-氧代丁酸甲酯的合成
向(2-(苄氧基)丙醯基)-L-別蘇胺酸甲酯2.30g中加入了二氯甲烷15mL。在冰浴上加入戴斯-馬丁氧化劑4.29g之後，在室溫下攪拌了1小時。濾出不溶物之後，減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→20/80→40/60)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物2.18g。
MS(ESI m/z)：294.1(M+H)
RT(min)：1.26
2-(1-(苄氧基)乙基)-5-甲基噁唑-4-羧酸甲酯的合成(DL0172 1-040)
向(2S)-2-(2-(苄氧基)丙醯胺)-3-氧代丁酸甲酯2.18g中加入了二氯甲烷20mL、三乙胺4.14mL。在冰浴上加入三苯基膦3.9g、碘3.77g之後，在室溫下攪拌了3小時。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入蒸餾水及乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水、硫代硫酸鈉水溶液(10%)及飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→10/90→20/80)進行純化，獲得了黃色油狀的標題化合物1.55g。
MS(ESI m/z)：276.1(M+H)
RT(min)：1.42
2-(1-(苄氧基)乙基)-5-甲基噁唑-4-甲醯胺的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：261.1(M+H)
RT(min)：1.21
2-(1-(苄氧基)乙基)-5-甲基噁唑-4-硫代甲醯胺的合成
【化學式74】
與(S)-4-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-硫代丁酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：277.1(M+H)
RT(min)：1.49
2-(2-(1-(苄氧基)乙基)-5-甲基噁唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
向2-(1-(苄氧基)乙基)-5-甲基噁唑-4-硫代甲醯胺加入乙醇10mL、溴丙酮酸乙酯335μL，並進行了2小時加熱回流。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→15/85)進行純化，獲得了茶色油狀的標題化合物650mg。
MS(ESI m/z)：373.1(M+H)
RT(min)：1.79
2-(2-(1-羥基乙基)-5-甲基噁唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
向2-(2-(1-(苄氧基)乙基)-5-甲基噁唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯650 mg中加入了二氯甲烷5mL。在-78℃下滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液(1mol/L)1.65mL，並在-78℃下攪拌了1小時。然後，追加滴加三溴化硼的二氯甲烷溶液(1mol/L)1.65mL，並在-78℃下攪拌了1小時。在冰浴上加入蒸餾水，利用二氯甲烷進行了提取操作。將有機層用飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→25/75→50/50)純化，獲得了淡黃色固體的標題化合物372mg。
MS(ESI m/z)：283.0(M+H)
RT(min)：1.09
2-(2-乙醯基-5-甲基噁唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
與(2S)-2-(2-(苄氧基)丙醯胺)-3-氧代丁酸甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：281.0(M+H)
RT(min)：1.32
2-(2-(2-溴乙醯基)-5-甲基噁唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
與6-(2-溴乙醯基)吡啶甲酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：360.9(M+H)
RT(min)：1.50
2-(1-羥基乙基)-5-甲基噁唑-4-羧酸甲酯的合成
與2-(2-(1-羥基乙基)-5-甲基噁唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：186.1(M+H)
RT(min)：0.69
2-乙醯基-5-甲基噁唑-4-羧酸甲酯的合成
與(2S)-2-(2-(苄氧基)丙醯胺)-3-氧代丁酸甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：184.1(M+H)
RT(min)：0.81
2-(2-溴乙醯基)-5-甲基噁唑-4-羧酸甲酯的合成
與6-(2-溴乙醯基)吡啶甲酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：263.0(M+H)
RT(min)：1.08
6-氯吡啶-3-硫代甲醯胺的合成
與(S)-4-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-硫代丁酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：173.0(M+H)
RT(min)：0.85
2-(6-氯吡啶-3-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
與2-(2-(1-(苄氧基)乙基)-5-甲基噁唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：269.0(M+H)
RT(min)：1.31
2-(6-乙醯基吡啶-3-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
與6-乙醯基菸鹼酸甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：277.0(M+H)
RT(min)：1.23
2-(6-(2-溴乙醯基)吡啶-3-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
與6-(2-溴乙醯基)吡啶甲酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：356.9(M+H)
RT(min)：1.45
6-氯吡啶-2-硫代甲醯胺的合成
與(S)-4-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-硫代丁酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：173.0(M+H)
RT(min)：1.08
2-(6-氯吡啶-2-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
與2-(2-(1-(苄氧基)乙基)-5-甲基噁唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合 成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：269.0(M+H)
RT(min)：1.51
2-(6-乙醯基吡啶-2-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
與6-乙醯基菸鹼酸甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：277.0(M+H)
RT(min)：1.41
2-(6-(2-溴乙醯基)吡啶-2-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
與6-(2-溴乙醯基)吡啶甲酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：356.9(M+H)
RT(min)：1.54
(S)-2’-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)-[2,4’-聯噻唑]-4-羧酸甲酯的合成
【化學式90】
向(S)-4-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-硫代丁酸第三丁酯395mg中加入乙醇10mL、2-(2-溴乙醯基)噻唑-4-羧酸甲酯342mg，並進行了1小時加熱回流。減壓蒸餾除去溶劑，加入二甲基甲醯胺10mL、二異丙基乙胺1mL、Boc2O360μL，並在室溫下攪拌了5小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→20/80→40/60)進行純化，獲得了淡黃色油狀的標題化合物489mg。
MS(ESI m/z)：470.0(M+H)
RT(min)：1.66
與(S)-2’-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)-[2,4’-聯噻唑]-4-羧酸甲酯的合成同樣地實施了下述表7所示之化合物的合成。
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-硫代胺甲醯基(carbamothioyl)噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-4-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-硫代丁酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：388.0(M+H)
RT(min)：1.52
使用(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-硫代胺甲醯基噻 唑-2-基)丙酸第三丁酯作為原料，並且與(S)-2’-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)-[2,4’-聯噻唑]-4-羧酸甲酯的合成同樣地實施了下述表8所示之化合物的合成。
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基-[2,4’-聯噻唑]-2’-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙 酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：455.9(M+H)
RT(min)：1.46
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表9所示之化合物的合成。
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-氰基吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基)噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：471.1(M+H)
RT(min)：1.74
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-氰基吡唑并[1,5-a]嘧啶-6-基)噻唑-2-基)丙酸氰基甲酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸氰基甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：454.2(M+H)
RT(min)：1.44
1H-NMR(CDCl3)δ：9.21(1H,s),9.05(1H,s),7.63(1H,s),7.16(1H,s),5.59(1H,d,J=8.6Hz),4.97-4.68(3H,m),3.78-3.57(2H,m),1.46(9H,s)。
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-硫代胺甲醯基-[2,4’-聯噻唑]-2’-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-4-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-硫代丁酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：471.1(M+H)
RT(min)：1.68
(S)-2'''-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3- 氧代丙基)-[2,4’：2’,4”：2”,4'''-四噻唑]-4-羧酸甲酯的合成
與(S)-2’-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)-[2,4’-聯噻唑]-4-羧酸甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：636.7(M+H)
RT(min)：1.99
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(4-硫代胺甲醯基噁唑-2-基)噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-4-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-硫代丁酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：455.0(M+H)
RT(min)：1.52
(S)-2-(2-(2-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)噻唑-4-基)噁唑-4-基)噻唑-4-羧酸乙酯的合成
【化學式98】
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(4-硫代胺甲醯基噁唑-2-基)噻唑-2-基)丙酸第三丁酯76mg中加入乙醇10mL、溴丙酮酸乙酯25μL，並在加熱回流下攪拌了4小時。減壓蒸餾除去溶劑，加入THF10mL、Boc2O40μL、二異丙基乙胺1mL，並在室溫下攪拌了18小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→20/80→40/60)進行純化，獲得了淡黃色油狀的標題化合物43.8mg。
MS(ESI m/z)：551.0(M+H)
RT(min)：1.75
(S)-2-(2-(2-(2-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)噻唑-4-基)噁唑-4-基)噻唑-4-基)噁唑-4-羧酸甲酯的合成
與(S)-2’-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)-[2,4’-聯噻唑]-4-羧酸甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：604.0(M+H)
RT(min)：1.69
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(4-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)噁唑-2-基)噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：522.1(M+H)
RT(min)：1.47
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基-[2,4’：2’,4”：2”,4'''-四噻唑]-2'''-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：621.9(M+H)
RT(min)：1.76
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(4-(4-(4-胺甲醯基噁唑-2-基)噻唑-2-基)噁唑-2-基)噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：589.0(M+H)
RT(min)：1.49
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基-[2,4’-聯噻唑]-2’-基)丙酸氰基甲酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸氰基甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：438.0(M+H)
RT(min)：1.21
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸氰基甲酯的合成同樣地實施了下述表10所示之化合物的合成。
【表10-1】
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基-[2,4’-聯噻唑]-2’-基)丙酸氰基甲酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：420.0(M+H)
RT(min)：1.51
1H-NMR(CDCl3)δ：8.01(1H,s),7.99(1H,s),5.59-5.48(1H,m),4.93-4.75(3H,m),3.72-3.55(2H,m),1.45(9H,s)。
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表11所示之化合物的合成。
(S)-3-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺基苯基)丙酸第三丁酯100mg中加入DMF5mL、(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)甘胺酸97.3mg、二異丙基乙胺100μL、HATU(1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽)170mg，並在室溫下攪拌了2小時。向反應溶液中加入蒸餾水及乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水及飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→30/70→60/40)進行純化，獲得了淡黃色油狀的標題化合物183mg。
MS(ESI m/z)：616.0(M+H)
RT(min)：1.91
與(S)-3-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表12所示之化合物的合成。
(S)-3-(4-(2-胺基乙醯胺)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成
向(S)-3-(4-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯183mg中加入二氯甲烷6mL、哌啶1.2mL，並在室溫下攪拌了1小時30分鐘。減壓蒸餾除去溶劑， 並利用管柱層析(NH矽膠、甲醇/乙酸乙酯/己烷/=0/50/50→0/100/0→20/80/0)進行純化，獲得了淡黃色油狀的標題化合物117mg。
MS(ESI m/z)：394.0(M+H)
RT(min)：1.08
與(S)-3-(4-(2-胺基乙醯胺)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表13所示之化合物的合成。
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙醯胺)苯基)丙酸第三丁酯的合成
向(S)-3-(4-(2-胺基乙醯胺)苯基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸第三丁酯117mg中加入DMF5mL、二異丙基乙胺300μL、5-氰基噻吩-2-羧酸50mg、HATU(1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽)170mg，並在室溫下攪拌了12小時。向反應溶液中加入蒸餾水及乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水及飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→30/70→60/40)進行純化，獲得了淡黃色油狀的標題化合物120mg。
MS(ESI m/z)：529.2(M+H)
RT(min)：1.58
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙醯胺)苯基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表14所示之化合物的合成。
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙醯胺)苯基)丙酸氰基甲酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸氰基甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：512.2(M+H)
RT(min)：1.34
1H-NMR(DMSO-D6)δ：10.10(1H,s),9.39-9.29(1H,m),8.02(1H,d, J=4.0Hz),7.93(1H,d,J=4.0Hz),7.54-7.44(3H,m),7.18(2H,d,J=8.6Hz),5.00(2H,s),4.27-4.15(1H,m),4.15-4.02(2H,m),3.02-2.78(2H,m),1.33(9H,s)。
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙醯胺)苯基)丙酸氰基甲酯的合成同樣地實施了下述表15所示之化合物的合成。
5-氰基-N-(2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙基)噻吩-2-甲醯胺的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙醯胺)苯基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：285.0(M+H)
RT(min)：0.78
5-氰基-N-(2-(2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)噻吩-2-甲醯胺的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙醯胺)苯基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：329.0(M+H)
RT(min)：0.82
5-氰基-N-(12-羥基十二烷基)噻吩-2-甲醯胺的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯 胺)乙醯胺)苯基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：337.1(M+H)
RT(min)：1.54
4-甲基苯磺酸12-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)十二烷基酯的合成
向5-氰基-N-(12-羥基十二烷基)噻吩-2-甲醯胺230mg的氯仿溶液(10mL)中加入了三乙胺380μL。在冰浴上加入對甲苯磺醯氯195mg，並在冰浴下攪拌了2小時。追加添加三乙胺380μL、對甲苯磺醯氯195mg，並在冰浴下攪拌了3小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=5/95→15/85→30/70)進行純化，獲得了黃色油狀的標題化合物267mg。
MS(ESI m/z)：491.2(M+H)
RT(min)：2.01
4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯的合成
向2,2’-((氧基雙(乙烷-2,1-二基))雙(氧基))雙(乙-1-醇)11g中加入了THF5mL、氫氧化鈉1.92g的水溶液(5mL)。在冰浴上滴加了對甲苯磺醯氯4.32g的THF溶液(10mL)。滴加後，在室溫下攪拌了2小時。向反應溶液中加入蒸餾水及乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層 用蒸餾水及飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=50/50→100/0)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物1.30g。
MS(ESI m/z)：349.0(M+H)
RT(min)：1.08
5-(2-(2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-吡啶甲腈(picolinonitrile)的合成
向4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯231mg中加入乙腈10mL、碳酸銫371mg、5-羥基吡啶甲腈82mg，在60℃下攪拌5小時，並在90℃下攪拌了3小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(NH矽膠、乙酸乙酯/己烷=60/40→100/0)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物116mg。
MS(ESI m/z)：297.1(M+H)
RT(min)：0.80
N-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙基)-5-氰基噻吩-2-甲醯胺的合成
在冰浴上向5-氰基-N-(2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)乙基)噻吩-2-甲醯胺233mg的二氯甲烷溶液(10mL)中加入了三苯基膦312mg、四溴化 碳396mg。然後，在室溫下攪拌了24小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=35/65→70/30)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物141mg。
MS(ESI m/z)：348.9(M+H)
RT(min)：1.14
與N-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙基)-5-氰基噻吩-2-甲醯胺的合成同樣地實施了下述表16所示之化合物的合成。
(第三丁氧基羰基)-L-酪胺酸第三丁酯的合成
向L-酪胺酸第三丁酯5.19g中加入二氯甲烷50mL、三乙胺6.2mL、Boc2O6.1mL，並在室溫下攪拌了1小時30分鐘。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入鹽酸水溶液(1mol/L)及乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用鹽酸水溶液(1mol/L)、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水清洗， 並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→30/70)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物6.52g。
MS(ESI m/z)：338.1(M+H)
RT(min)：1.51
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(2-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)丙酸第三丁酯的合成
向(第三丁氧基羰基)-L-酪胺酸第三丁酯123mg中加入DMF10mL、碳酸鉀151mg、N-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙基)-5-氰基噻吩-2-甲醯胺141mg，並在室溫下攪拌了24小時。向反應溶液中加入蒸餾水及乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用蒸餾水及飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=30/70→60/40)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物178mg。
MS(ESI m/z)：604.1(M+H)
RT(min)：1.72
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(2-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表17所示之化合物的合成。
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(2-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)丙酸氰基甲酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基喹啉-6-基)丙酸氰 基甲酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：587.0(M+H)
RT(min)：1.47
1H-NMR：(CDCl3)δ：7.46-7.42(2H,m),7.06(2H,d,J=8.6Hz),6.82(2H,d,J=8.6Hz),4.98-4.54(4H,m),4.13-4.08(2H,m),3.89-3.84(2H,m),3.76-3.61(9H,m),3.06(2H,d,J=5.9Hz),1.43(9H,s)。
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-(2-(2-(2-(5-氰基噻吩-2-甲醯胺)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)丙酸氰基甲酯的合成同樣地實施了下述表18所示之化合物的合成。
(R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-碘丙酸第三丁酯的合成
與(R)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-碘丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。本說明書中，Fmoc表示9-茀基甲氧基羰基。
MS(ESI m/z)：494.0(M+H)
RT(min)：2.02
2-(6-碘吡啶-2-基)噻唑-4-羧酸烯丙酯的合成
(1)(R)-2-(6-碘吡啶-2-基)-4,5-二氫噻唑-4-羧酸烯丙酯的合成
向2-氰基-6-溴吡啶(5.0g)中加入碘化鈉(12.3g)、三甲基氯矽烷(TMSCl)(3.5mL)及丙腈(30mL)，並在90℃下攪拌了2小時。向反應溶液中加入氫氧化鈉水溶液、乙酸乙酯，進行了提取操作。將有機層用硫代硫酸鈉水溶液清洗，用無水硫酸鎂進行乾燥，並將溶劑減壓濃縮。向所獲得之殘渣中加入L-半胱胺酸3.63g、甲醇(20mL)及蒸餾水(10mL)，並在80℃下攪拌了3.5小時。減壓蒸餾除去溶劑，向所獲得之殘渣中添加甲醇/乙酸乙酯混合溶劑，並濾出固體。向所獲得之固體中添加THF(100mL)及草醯氯(2.4mL)，並攪拌了45分鐘。然後，向反應溶液中添加烯丙醇(3.4mL)，並攪 拌了4小時。向反應溶液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液、乙酸乙酯，進行了提取操作。將有機層用無水硫酸鎂進行乾燥，並減壓蒸餾除去溶劑，獲得了黃色固體的標題化合物(3.2g)。
MS(ESI m/z)：335.8(M+H)
RT(min)：1.56
(2)2-(6-碘吡啶-2-基)噻唑-4-羧酸烯丙酯的合成
向(R)-2-(6-碘吡啶-2-基)-4,5-二氫噻唑-4-羧酸烯丙酯(0.5g)中添加三氯溴甲烷(5mL)、二氮雜雙環十一碳烯(DBU)(0.3mL)，並在室溫下攪拌了10分鐘。向反應溶液中加入檸檬酸水溶液、乙酸乙酯，進行了提取操作。將有機層用無水硫酸鎂進行乾燥，並減壓蒸餾除去溶劑，獲得了白色固體的標題化合物(0.31g)。
MS(ESI m/z)：372.4(M+H)
RT(min)：1.67
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸第三丁酯的合成
向鋅粉末(2.4g)的DMF(2.6mL)溶液中加入碘(46mg)，並在氮氣環境下於室溫攪拌了5分鐘。在室溫下向反應混合物中加入(R)-2-((((9 H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-碘丙酸第三丁酯(600mg)的DMF(1.4mL)溶液及碘(46mg)，並攪拌了2小時40分鐘。在室溫下向反應混合物中加入4-溴-2-氰基噻吩(298mg)、2-二環己基膦基-2’,4’,6’-三異丙基-1,1’-聯苯(29mg)及三(二亞苄基丙酮)二鈀(28mg)，並在氮氣環境下於室溫攪拌3小時之後，對混合物進行了Celite過濾。向濾液中加入乙酸乙酯，並且用硫代硫酸鈉水溶液進行了清洗。將有機層用無水硫酸鎂乾燥之後，減壓濃縮。利用矽膠層析(正己烷：乙酸乙酯=90：10→30：70)純化所獲得之殘留物，獲得了(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸第三丁酯(127mg)。
MS(ESI m/z)：475.1(M+H)
RT(min)：1.95
與(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表19所示之化合物的合成。
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸的合成
向(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸第三丁酯(127mg)中加入TFA(1.0mL)，並在室溫下攪拌30分鐘之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。利用矽膠層析(正己烷：乙酸乙酯=70：3 0→0：100)純化所獲得之殘渣，獲得了白色固體的標題化合物63mg。
1H-NMR(MeOD)δ：7.78(2H,d,J=7.3Hz),7.59(2H,d,J=7.3Hz),7.53-7.24(6H,m),4.53-4.43(1H,m),4.36-4.11(3H,m),3.25-2.93(2H,m)。
MS(ESI m/z)：419.0(M+H)
RT(min)：1.55
與(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸的合成同樣地實施了下述表20所示之化合物的合成。
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯(193mg)的二氯甲烷溶液(2mL)中加入TFA10mL，並在室溫下攪拌了3小時。減壓蒸餾除去溶劑，添加DMF 10mL、N,N-二異丙基乙胺0.48mL、9-茀基甲基N-琥珀醯亞胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)204mg，並在室溫下攪拌了15小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=30/70→100/0)進行純化，獲得了淡黃色非晶狀的標題化合物121mg。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.78(2H,d,J=7.3Hz),7.68-7.63(1H,m),7.60-7.49(2H,m),7.45-7.28(4H,m),5.34-5.24(1H,m),4.80-4.67(1H,m),4.55-4.35(2H,m),4.18(1H,t,J=6.9Hz),3.42-3.21(2H,m)。
MS(ESI m/z)：454.9(M+H)
RT(min)：1.62
(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-L-高絲胺酸第三丁酯的合成
向(S)-3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-(第三丁氧基)-4-氧代丁酸(5.02g)的THF溶液(30mL)中加入三乙胺(2.80mL)，在冰 浴上滴加氯甲酸乙酯(1.43mL)的THF溶液(10mL)，並在室溫下攪拌了35分鐘。濾出不溶物，向濾液中一點點添加氫化硼鈉1.36g，並在室溫下攪拌了1小時。向反應溶液中加入蒸餾水5mL之後，加入鹽酸水溶液(1mol/L)、乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用飽和食鹽水清洗，並利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，獲得了無色油狀的標題化合物(1.62g)。
MS(ESI m/z)：398.0(M+H)
RT(min)：1.61
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-4-碘丁酸第三丁酯的合成
與(R)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-碘丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：507.8(M+H)
RT(min)：1.99
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-氰基-1H-1,2,3-三唑-1-基)丙酸的合成
在室溫下向(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-疊氮基丙酸(230mg)的水/乙腈混合溶劑(=5/2，7mL)中加入2-氯丙烯腈(0.11mL)，並在80℃下攪拌了21小時。向反應溶液中加入乙酸乙酯、飽和食鹽水，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層用無水硫酸鎂進行乾燥，並減壓蒸餾除去了溶劑。向所獲得之殘渣中加入己烷/丙酮混合溶劑(15：1)，並在50℃下進行再結晶，藉此獲得了白色固體的標題化合物(145mg)。
MS(ESI m/z)：403.9(M+H)
RT(min)：1.41
1H-NMR(CDCl3)δ：7.87-7.78(2H,m),7.65-7.55(2H,m),7.49-7.41(3H,m),7.40-7.31(2H,m),5.44-5.38(1H,m),5.03-4.62(3H,m),4.56-4.50(1H,m),4.23-4.19(2H,m)。
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-硝基苯基)丙酸第三丁酯的合成
在室溫下向(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-硝基苯基)丙酸(2.5g)的THF溶液(100mL)中加入2,2,2-三氯乙醯亞胺酸第三丁酯4.5mL，並在70℃下攪拌了24小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→10/90→20/80)進行純化，獲得了黃色油狀的標題化合物(3.65g)。
MS(ESI m/z)：489.1(M+H)
RT(min)：1.96
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-戊炔酸第三丁酯的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-戊炔酸(1.5g)的乙酸乙酯溶液(5.0mL)中滴加2,2,2-三氯乙醯亞胺第三丁酯(4.6g)，並在室溫下攪拌了22小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→30/70)進行純化，獲得了無色油狀的標題化合物(1.66g)。
MS(ESI m/z)：270.1(M+H)
RT(min)：1.59
(S)-5-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)異噁唑-3-羧酸乙酯的合成
在90℃下向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-4-戊炔酸第三丁酯(1660mg)及2-氯-2-(羥基亞胺基)乙酸乙酯(2.8g)的DMF溶液(21mL)中加入三乙胺(640μL)並攪拌了15分鐘。在90℃下向反應溶液中加入三乙胺(640μL)並攪拌了15分鐘。在90℃下加入三乙胺(1278μL)並攪拌了30分鐘。向反應溶液中加入乙酸乙酯、飽和食鹽水，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用 管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→25/75)進行純化，獲得了黃色油狀的標題化合物(818mg)。
MS(ESI m/z)：385.0(M+H)
RT(min)：1.36
5-溴-1-甲基-1H-吡咯并[2、3-b]吡啶-6-甲腈的合成
向5-溴-1H-吡咯并[2、3-b]吡啶-6-甲腈(250mg)的THF/乙腈溶液(=2/l、6mL)中加入碳酸銫(919mg)、甲磺酸甲酯(115μL)，並在室溫下攪拌了16小時。向反應溶液中加入乙酸乙酯、氯化銨水溶液，利用乙酸乙酯進行了提取操作。將有機層利用硫酸鎂進行了乾燥。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→50/50)進行純化，獲得了白色固體的標題化合物(151mg)。
MS(ESI m/z)：235.6(M+H)
RT(min)：1.58
6-(3-溴苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成
與6-(3-溴苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：347.0(M+H)
RT(min)：1.45
與6-(3-溴苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成同樣地實施了下述表21所示之化合物的合成。
1-(4-溴苯基)-1H-咪唑-4-甲醯胺的合成
向1-(4-溴苯基)-1H-咪唑-4-羧酸乙酯(746mg)中加入氨的甲醇溶液(7mol/L，10mL)，並照射了微波(InitiatorTM、110℃、1.0小時、2.45GHz、0-240W)。另外，向反應溶液照射了微波(InitiatorTM、120℃、4.0小時、2.45GHz、0-240W)。減壓蒸餾除去溶劑，獲得了白色固體的標題化合物(660mg)。
MS(ESI m/z)：268.0(M+H)
RT(min)：0.98
6-(3-溴苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-甲醯胺的合成
【化學式134】
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：318.9(M+H)
RT(min)：1.00
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表22所示之化合物的合成。
6-(3-溴苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-甲腈的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：300.0(M+H)
RT(min)：1.24
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表23所示之化合物的合成。
與(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表24所示之化合物的合成。
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-胺基苯基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(3,4-二胺基苯基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：459.1(M+H)
RT(min)：1.55
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-(((烯丙氧基)羰基)胺基)苯基)丙酸第三丁酯的合成
向(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-胺基苯基)丙酸第三丁酯(2.83g)的二氯甲烷溶液(50mL)中加入二異丙基乙胺(3mL)、氯甲酸烯丙酯(722μL)，並在室溫下攪拌了2小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→20/80)進行純化，獲得了黃色油狀的標題化合物(2.52g)。
MS(ESI m/z)：543.1(M+H)
RT(min)：1.93
與(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸的合成同樣地實施了下述表25所示之化合物的合成。
(S)-5-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁氧基)-3-氧代丙基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸乙酯的合成
與6-溴咪唑并[1,2-a]嘧啶-2-羧酸乙酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：556.4(M+H)
RT(min)：1.70
(S)-5-(3-(第三丁氧基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-氧代丙基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸乙酯的合成
向(S)-5-(2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(第三丁氧基)-3-氧代丙基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸乙酯(357mg)中加入DMF(10mL)、哌啶(635μL)，並在室溫下攪拌了1小時。確認原料的消失之後，加入二異丙基乙胺(4mL)、Boc2O(3mL)，並在室溫下攪拌了3小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、乙酸乙酯/己烷=0/100→50/50→100/0)進行純化，獲得了褐色油狀的標題化合物(176mg)。
MS(ESI m/z)：434.4(M+H)
RT(min)：1.41
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-胺甲醯基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-胺甲醯基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：405.9(M+H)
RT(min)：1.19
(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基-[2,4’-聯噻唑]-2’-基)丙酸第三丁酯的合成
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基噻唑-2-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：437.9(M+H)
RT(min)：1.74
與(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-氰基-[2,4’-聯噻唑]-2’-基)丙酸第三丁酯的合成同樣地實施了下述表26所示之化合物的合成。
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-((1-(5-氰基噻吩-2-基)-1-氧代-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)氧基)苯基)丙酸的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(4-((1-(5-氰基噻吩-2-基)-1-氧代-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)氧基)苯基)丙酸第三丁酯(891mg)的二氯甲烷溶液(5mL)中加入三氟乙酸(25mL)，並在室溫下攪拌了3小時。減壓蒸餾除去溶劑，並向殘渣中加入二氯甲烷(10mL)、二異丙基乙胺(3mL)、N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰氧基]琥珀醯亞胺(464mg)，並在室溫下攪拌了2小時。減壓蒸餾除去溶劑，並利用管柱層析(矽膠、甲醇 /乙酸乙酯=0/100→30/70)進行純化，獲得了淡黃色油狀的標題化合物(921mg)。
MS(ESI m/z)：714.4(M+H)
RT(min)：1.53
(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-(2-(2-(2-(2-((6-氰基吡啶-3-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯基)丙酸的合成
與(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-((1-(5-氰基噻吩-2-基)-1-氧代-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)氧基)苯基)丙酸的合成同樣地實施了以下表所示之化合物的合成。
MS(ESI m/z)：682.2(M+H)
RT(min)：1.58
與(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-((1-(5-氰基噻吩-2-基)-1-氧代-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)氧基)苯基)丙酸的合成同樣地實施了下述表27所示之化合物的合成。
pdCpA胺基酸-1的合成
向(S)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)-3-(2-氰基苯并[d]噻唑-6-基)丙酸氰基甲酯(1.15mg)中加入pdCpA(Gene Act Inc.製造)(由去氧胞苷和腺苷酸構成之二核苷酸)的DMF溶液(1.0OD/μL)13.7μL，並且用渦流振蕩了1小時。OD表示光學密度。反應後，用0.38%甲酸水溶液/乙腈(1/1)溶液稀釋，藉由高速液相層析(HPLC)(Agilent Corp.製造之1260Infinity binary LC系統、管柱：Agilent Corp.製造之ZORBAX SB-C18(9.4×50mm)、管柱溫度：40℃、梯度條件：H2O(0.1%TFA)/乙腈(0.1%TFA)=90/10→0/100、流速：4.0mL/min、檢測波長：254nm)進行了純化。減壓蒸餾除去所獲得之目標物溶液的溶劑，並向所獲得之殘渣中加入了TFA 100μL。在室溫下振蕩1小時之後，減壓蒸餾除去溶劑，獲得了pdCpA胺基酸-1。藉由MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics Co.製造，ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF MS、基質：α-氰基-4-羥基桂皮酸)進行了鑒定。
MS(MALDI-TOF、m/z)：864.5(M-H)
關於下述表28所示之pdCpA胺基酸-2~29的合成，藉由與pdCpA胺基酸-1的合成相同之操作進行了合成。
關於下述表29所示之pdCpA胺基酸的合成，藉由與pdCpA胺基酸-1的合成相同之操作進行了合成。
在以後的使用DNA及RNA之實驗中所使用之水全部為QIAGEN公司製造之無核酸酶水(Nuclease-Free Water)。
mRNA的合成
無細胞轉譯合成中所使用之mRNA-1~mRNA-13全部按照以下方法進行了合成。
利用PCR使在開讀框(open reading frame)的上游具有T7啟動子、核糖體所結合之鹼基序列之2條鏈DNA擴增，製作出mRNA的模板DNA基 因(模板DNA-1~模板DNA-13，下述表)。使用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司製造)進行了純化。
接著，藉由轉錄反應而合成了mRNA。製備下述溶液組成1的溶液，使其在37℃下反應6小時。加入5M乙酸銨100μL，輕輕混合，並在冰上放置了20分鐘。將混合物在13200rpm、4℃下離心20分鐘之後，去除上清液，用1xTE緩衝液(buffer)(10mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L的EDTA(pH8.0))200μL使沉澱溶解。另外，Tris表示三羥甲基胺基甲烷，EDTA表示乙二胺四乙酸。加入等量的酚/氯仿=1/1(用1xTE飽和者)進行攪拌，並進行了離心。回收上層，加入等量的氯仿，並進行了攪拌、離心。回收上層，加入3mol/L乙酸鉀pH4.5 20μL、乙醇600μL，輕輕混合，並在-80℃下放置了30分鐘。在13200rpm、4℃下離心30分鐘之後，除去上清液，加入保存在-30℃之70%冷乙醇200μL，並在13200rpm、4℃下離心了5秒。去除上清液，並減壓乾燥。用分光光度計決定濃度，並以成為16μmol/L之方式使其溶解於水中。
．溶液組成1
10x緩衝液(400mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、500mmol/L NaCl、80mmol/L MgCl2、50mmol/L DTT(二硫蘇糖醇))：10μL
25mmol/L NTPs(核苷三磷酸混合物)：16μL
100mmol/L精三胺(Spermidine)：2μL
0.1%BSA(牛血清白蛋白)：1μL
核糖核酸酶抑制劑(ribonuclease inhibitor)(40unit/μL，Takara Bio Inc.製造)：1μL
無機焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase)(0.5unit/μL，Sigma-Aldrich Co.LLC.製造)：1μL
Thermo T7 RNA聚合酶(Polymerase)(50unit/μL；Toyobo Co.Ltd.製造)：4μL
mRNA的模板DNA基因(100ng/μL)：20μL
水：45μL
“序列表”
模板DNA-1~模板DNA-13的所有序列分別記載為“序列表”的 序列號1~13。
將由模板DNA-1合成之mRNA作為mRNA-1，以後，mRNA-2~mRNA-13同樣地進行規定。
琥珀抑制基因(amber suppressor)tRNA(-CA)的合成
藉由PCR，用國際公開WO07/055429中所記載之來源於山羊支原體(mycoplasma capricolum)之色胺酸tRNA突變體使3’末端的CA二核苷酸欠缺之tRNA擴增，製作出tRNA(-CA)基因，並使用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司製造)進行了純化。
接著，藉由轉錄反應而合成了tRNA(-CA)。製備下述溶液組成2的溶液，使其在37℃下反應12小時。利用RNeasy MinElute Cleanup Kit(QIAGEN公司製造)純化tRNA(-CA)，並以成為200μmol/L之方式使其溶解於水中。
．溶液組成2
10×轉錄緩衝液(Transcription Buffer)(400mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、200mmol/L MgCl2、50mmol/L DTT)：10μL
25mmol/L NTPs：16μL
100mmol/L GMP：20μL
100mmol/L靜三胺：2μL
0.1%BSA：1μL
核糖核酸酶抑制劑(ribonuclease inhibitor)(40unit/μL，Takara Bio Inc.製造)：1μL
無機焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase)(0.5unit/μL，Sigma-Aldrich Co.LLC.製造)：1μL
T7 RNA聚合酶(50unit/μL；New England Biolabs Inc.製造)：8μL
tRNA(-CA)基因(100ng/μL)：41μL
胺基醯基tRNA-1的合成(RNA部分的鹼基序列示於“序列表”的序列號14)
在1.5mL取樣管(sample tube)中製備下述溶液組成3的溶液，並在4℃下靜置了2小時。然後，向反應溶液中加入0.6mol/L乙酸鉀水溶液(pH4.5)26.7μL、乙醇160μL，並在-80℃下靜置了30分鐘。然後，進行30分鐘離心分離(4℃、13200rpm)，去除了上清液。慢慢地加入70%乙醇水溶液200μL，並進行了1分鐘離心分離(4℃、13200rpm)。再次去除上清液，並進行減壓乾燥，獲得了胺基醯基tRNA-1。所獲得之胺基醯基tRNA在即將添加到轉譯混合物之前溶解於1mmol/L乙酸鉀水溶液中。
．溶液組成3
水：14μL
5×連接緩衝液(Ligation Buffer)(275mmol/L HEPES-Na pH7.5，75mmol/L MgCl2、16.5mmol/L DTT、5mmol/L ATP)：5.34μL
0.1%BSA：0.54μL
pdCpA胺基酸-1的DMSO溶液(0.73mmol/L)：2.66μL
琥珀抑制基因tRNA(-CA)水溶液(200μmol/L)：3.34μL
T4 RNA連接酶(Ligase)溶液(Takara Bio Inc.製造，40U/μL)：0.80μL
另外，HEPES表示2-[4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸，DMSO表示二甲基亞碸。
與胺基醯基tRNA-1的合成同樣地實施了下述表31和32所示之胺基醯基tRNA-2~tRNA-68的合成。
導入有非天然胺基酸之鏈狀肽的無細胞轉譯合成及式(1)所表示之環肽的合成
本項的MALDI-TOF MS使用了ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF MS(Bruker Daltonics Co.製造)。基質使用了α-氰基-4-羥基桂皮酸。
環肽1-1的合成
在1.5mL取樣管中製備下述溶液組成4的溶液，並在37℃下培養(incubate)了1.5小時。向反應溶液中添加洗滌(wash)緩衝液(組成：20mmol/L磷酸緩衝液(pH7.5)、500mmol/L NaCl、5mM咪唑)31μL、磁珠 (magnetic beads)溶液(MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO.,LTD.製造，Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarose)10μL，並在室溫下使用渦流振蕩了30分鐘。然後，進行離心分離，去除了上清溶液。重複了3次所獲得之磁珠的清洗操作(添加洗滌緩衝液200μL→使用渦流之振蕩→離心分離→去除上清液)。向所獲得之磁珠中添加2%甲酸水溶液10μL，並在室溫下使用渦流振蕩了1小時。然後，藉由離心分離使磁珠沉降，並回收上清液，獲得了環肽1-1。藉由MALDI-TOF MS進行了所獲得之肽的鑒定。
MS(MALDI-TOF、m/z)：2382.0(M+H)
．溶液組成4
水：2μL
mRNA-1水溶液(0.02OD/μL)：1μL
胺基醯基tRNA-1水溶液(0.2OD/μL)：1μL
胺基酸水溶液(Met以外的19種胺基酸各0.3mmol/L的混合物)：1.5μL
PUREfrex(註冊商標)custom ver2(Genefrontier Corporation製造，PFC-Z1802)
溶液I：4μL
溶液II：0.5μL
溶液III：1μL
使用表33所示之mRNA及胺基醯基tRNA的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了下述表33所示之環肽1-2~27的合成。
【表33-3】
使用表34所示之mRNA及胺基醯基tRNA的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了下述表34所示之環肽的合成。
環肽1-28的合成
在1.5mL取樣管中製備上述溶液組成4的溶液，並在37℃下培養了30分鐘。向反應溶液中添加0.1mol/L磷酸緩衝液(pH6.4)70μL，並在37℃下培養了4小時。向反應溶液中添加0.1mol/L氫氧化鈉水溶液20μL、磁珠溶液(MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO.,LTD.製造，Anti-DDDDK-tag mAb-Magnetic Agarose)10μL，並在室溫下使用渦流振蕩了 30分鐘。然後，進行離心分離，去除了上清溶液。重複了3次所獲得之磁珠的清洗操作(添加洗滌緩衝液200μL→使用渦流之振蕩→離心分離→去除上清液)。向所獲得之磁珠中添加2%甲酸水溶液10μL，並在室溫下使用渦流振蕩了1小時。然後，藉由離心分離使磁珠沉降，並回收上清液，獲得了環肽1-28。藉由MALDI-TOF MS進行了所獲得之肽的鑒定。
MS(MALDI-TOF、m/z)：2325.1(M+H)
環肽1-29的合成
將環肽1-28合成時之胺基醯基tRNA-28變更為胺基醯基tRNA-29，並將緩衝液添加後的培養時間設為24小時，藉此獲得了表35所示之環肽1-29。
環肽1-30~38的合成
使用表36所示之mRNA及胺基醯基tRNA的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了下述表36所示之環肽1-30~38的合成。
環肽1-39~47的合成
使用表37所示之mRNA及胺基醯基tRNA的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了下述表37所示之環肽1-39~47的合成。
環肽1-48的合成
使用mRNA-4及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了環肽1-48的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：2159.9(M+H)
環肽1-49的合成
【化學式149】
使用mRNA-5及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了環肽1-49的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：2217.6(M+H)
環肽1-50的合成
使用mRNA-6及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了環肽1-50的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：2088.9(M+H)
環肽1-51的合成
使用mRNA-7及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了環肽1-51的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：2001.8(M+H)
環肽1-52的合成
使用mRNA-8及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了環肽1-52的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：1845.7(M+H)
環肽1-53的合成
使用mRNA-9及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了環肽1-53的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：1748.7(M+H)
環肽1-54的合成
【化學式154】
使用mRNA-10及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了環肽1-54的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：3001.3(M+H)
環肽1-55的合成
使用mRNA-11及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相 同之操作實施了環肽1-55的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：3614.6(M+H)
環肽1-56的合成
使用mRNA-12及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了環肽1-56的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：2327.0(M+H)
環肽1-57的合成
【化學式157】
使用mRNA-13及胺基醯基tRNA-10的組合，藉由與環肽1-1的合成相同之操作實施了環肽1-57的合成。
MS(MALDI-TOF、m/z)：2090.9(M+H)
使用肽自動合成裝置之肽固相合成的一般方法
使用肽自動合成裝置(Biotage Inc.製造之SyroI)進行了肽固相合成。在合成裝置中設置Rink Amide-ChemMatrix(註冊商標)(Biotage Inc.製造)、Fmoc胺基酸(0.5mol/L)的N-甲基-2-吡咯啶酮(NMP)溶液、氰基-羥基亞胺基-乙酸乙酯(1.0mol/L)及二異丙基乙胺(0.1mol/L)的NMP溶液、二異丙基碳化二亞胺(1.0mol/L)的NMP溶液、哌啶(20%v/v)的NMP溶液及乙酸酐(20%v/v)的NMP溶液，並按照手冊進行了合成。將Fmoc去保護(20分鐘)、使用NMP之清洗、Fmoc胺基酸的縮合(1小時)、使用NMP之清洗設為1循環，藉由重複該循環而使肽鏈伸長。本項的HPLC使用了1260Infinity binary LC系統(Agilent Corp.製造)或LC系統(Waters Corporation製造)。
管柱：Waters Corporation製造之X Select CSH130 C18(10×250mm) 或Waters Corporation製造之X Select CSH130 C18(19×250mm)
管柱溫度：40℃
流速：4.0mL/min(Agilent Corp.製造)、20mL/min(Waters Corporation製造)
檢測波長：220nm、254nm
環肽2-1的合成
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g，40mg)用作起始原料進行了肽固相合成。以(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(2-氰基苯并[b]噻吩-4-基)丙酸、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-N-ω-(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基)-L-精胺酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-1-(第三丁氧基羰基)-L-色胺酸(Fmoc-Trp(Boc)-OH)、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-β-環己基-D-丙胺酸(Fmoc-D-Cha-OH)、N-(9-茀基甲氧基羰基)-L-脯胺酸(Fmoc-Pro-OH)、N-α-(第三丁氧基羰基)-S-三甲苯基-L-半胱胺酸(Boc-Cys(Trt)-OH)的順序進行了縮合。伸長結束 後，用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。加入TFA：三異丙基矽烷：水(=95：2.5：2.5，2.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入HEPES緩衝液(pH7.3，2.5mL)、甲醇(0.5mL)，進行了2小時反應。使用Sep-pak C18(waters)，使肽吸附於載體之後，用水清洗，並且用乙腈及甲醇進行溶出，去除了鹽類。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0mol/L，pH8.5)進行中和，並減壓蒸餾除去溶劑，藉此獲得了白色固體的環肽2-1(0.91mg)。
MS(ESI m/z)：923.9(M+H)
RT(min)：1.19
與環肽2-1同樣地獲得了下述表38所示之化合物。
環肽3-1的合成
【化學式159】
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)100mg用作起始原料進行了肽固相合成。以(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(6-氰基吡啶-3-基)丙酸、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Cha-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Cys(Trt)-OH的順序進行了縮合。伸長結束後，用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。加入TFA：三異丙基矽烷：水(=95：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入磷酸緩衝液(pH6.4，5.0mL)、乙腈(1.0mL)，進行了2小時反應。使用Sep-pak C18(waters)使肽吸附於載體之後，用水清洗，並且用乙腈及甲醇進行溶出，去除了鹽類。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1mol/L，pH8.5)進行中和，並蒸餾除去溶劑，藉此獲得了無色油狀的環肽3-1(0. 93mg)。
MS(ESI m/z)：869.2(M+H)
RT(min)：1.09
與環肽3-1同樣地獲得了下述表39所示之化合物。
環肽4-1的合成
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)100mg用作起始原料進行了肽固相合成。以(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(6-氰基吡啶-2-基)丙酸、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-D-苯基丙胺酸(Fmoc-D-Phe-OH)、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)甘胺酸(Fmoc-Gly-OH)、Fmoc-Gly-OH、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-O-(第三丁基)-D-酪胺酸(Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH)、Boc-Cys(Trt)-OH的順序進行了縮合。伸長結束後，用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向反應溶液中加入TFA：三異丙基矽烷：水(=95：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入HEPES緩衝液(pH7.3,5.0mL)、乙腈(1.0mL)、三(2-羧基乙基)膦(0.5mol/L，0.1mL)水溶液，在室溫下攪拌2小時之後，靜置了13小時。減壓濃縮溶液，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之 後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0M，pH8.5)進行中和，並在減壓下蒸餾除去溶劑，藉此獲得了無色油狀的環肽4-1(2.61mg)。
MS(ESI m/z)：701.0(M+H)
RT(min)：0.97
利用與環肽4-1相同之方法獲得了以下表40、41及42所示之環肽4-2~7和環肽4-8及環肽4-9。
環肽4-8
MS(ESI m/z)：1135.2
RT(min)：1.15
環肽4-9
MS(ESI m/z)：1151.2
RT(min)：1.12
環肽5-1的合成
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)50mg用作起始原料進行了肽固相合成。以N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-3-氰基-L-苯基丙胺酸(Fmoc-Phe(3-CN)-OH)、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-D-麩胺酸γ-第三丁酯(Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH)、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-D-色胺酸(Fmoc-D-Trp-OH)、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-L-亮胺酸(Fmoc-Leu-OH)、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-D-缬胺酸(Fmoc-D-Val-OH)、Boc-Cys(Trt)-OH的順序進行了縮合。伸長結束後，用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向反應溶液中加入TFA：三異丙基矽烷：水(=95：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入磷酸緩衝液(pH6.4，2.5mL)、甲醇(1.0mL)、三(2 -羧基乙基)膦(0.5mol/L，0.025mL)水溶液，並在室溫下攪拌了42小時。使用Sep-pak C18(waters)使肽吸附於載體之後，用水清洗，並且用乙腈及甲醇進行溶出，去除了鹽類。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0M，pH8.5)進行中和，並在減壓下蒸餾除去，藉此獲得了無色油狀的環肽5-1(0.67mg)。
MS(ESI m/z)：802.9(M+H)
RT(min)：1.21
環肽6-1的合成
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)50mg用作起始原料進行了肽固相合成。以(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(6-(4-((烯丙氧基)羰基)噻唑-2-基)吡啶-2-基)丙酸、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Cha-OH、Fmoc-Pro-OH的順序進行了縮合。肽伸長後，加入四(三苯基膦)鈀(0)(Pd(PPh3)4)(29mg)、氯仿：乙酸：N-甲基嗎福林(=37/2/1，1.5mL)使其反應1小時，去除了烯丙基。加入哌 啶(20%v/v)的NMP溶液，使其反應20分鐘，藉此進行Fmoc基的去除之後，加入O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸(19mg)、二異丙基乙胺(17μL)、1-甲基-2-吡咯啶酮(1.5mL)，使其反應2小時，藉此使肽環化。用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向反應溶液中加入TFA：三異丙基矽烷：水(=92.5：2.5：2.5，2.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。利用HP LC(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣，藉此獲得了白色固體的環肽6-1(0.91mg)。
MS(ESI m/z)：867.0(M+H)
RT(min)：1.11
環肽a-1-1的合成
將Rink Amide-ChemMatrix(0.48mmol/g)104mg用作起始原料進行了 肽固相合成。以(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Cha-OH、Fmoc-Pro-OH、N-(((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)-S-((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)-L-半胱胺酸的順序進行了縮合。伸長結束後，加入哌啶(20%v/v)的NMP溶液，使其反應20分鐘，藉此進行了Fmoc基的去除。用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。加入TFA：3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇：三異丙基矽烷：水(=92.5：2.5：2.5：25，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入磷酸緩衝液(pH7.0,5.0mL)、甲醇(5.0mL)、三(2-羧基乙基)膦(0.5mol/L，0.1mL)，並攪拌了1小時。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1mol/L，pH8.5)進行中和，並在減壓下蒸餾除去溶劑，藉此獲得了白色固體的環肽a-1-1(2.63mg)。
MS(ESI m/z)：888.2(M+H)
RT(min)：1.12
利用與環肽a-1-1的合成相同之方法獲得了以下表43所示之環肽a-1-2~18。
環肽a-1-19
與環肽a-1-1同樣地實施了環肽a-1-19的合成。
MS(ESI m/z)：854.1(M+H)
RT(min)：1.14
環肽a-2-1的合成
將Rink Amide-ChemMatrix(0.54mmol/g，104mg)用作起始原料進行了肽固相合成。以(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(4-((烯丙氧基)羰基)胺基)苯基)丙酸、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Cha-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Cys(Trt)-OH的順序進行了縮合。肽伸長後，加入Pd(PPh3)4(58mg)、氯仿：乙酸：N-甲基嗎福林(=37：2：1，2.0mL)，並攪拌1小時，去除了Alloc基。以Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe(3-CN)-OH的順序進行了縮合。加入哌啶(20%v/v)的NMP溶液，使其反應20分鐘，藉此進行Fmoc基的去保護，並加入乙酸酐(20%v/v)的NMP溶液，使其反應10分鐘，藉此將N末端的胺基乙醯基化。用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。加入TFA：三異丙基矽烷：水(=95：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入磷酸緩衝液(pH7.0，5mL)、甲醇(5mL)、三(2-羧基乙基)膦(0.5mol/L，0.1mL)水溶液，進行了30小時反應。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0mol/L，pH8.5)進行中和，並在減壓下蒸餾除去溶劑，藉此獲得了白色固體的環肽a-2-1(7.96mg)。
MS(ESI m/z)：1184.2(M-H)
RT(min)：1.11
環肽a-2-2
【化學式168】
與環肽a-2-1同樣地實施了環肽a-2-2的合成。
MS(ESI m/z)：1107.3(M+H)
RT(min)：1.17
環肽a-3-1
將Rink Amide-ChemMatrix(0.54mmol/g，104mg)用作起始原料進行了肽固相合成。以Fmoc-Phe(3-CN)-OH、N-(9-茀基甲氧基羰基)-L-亮胺酸(Fmoc-Leu-OH)、N-(9-茀基甲氧基羰基)-L-丙胺酸(Fmoc-Ala-OH)、N-(9-茀基甲氧基羰基)-L-苯基丙胺酸(Fmoc-Phe-OH)、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Boc-Cys(Trt)-OH的順序進行了縮合。用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。加入TFA：3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇：三異丙基矽烷：水(=92.5：2.5：2.5：2.5、3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入磷酸緩衝液(pH7.0,14mL)、甲醇(15mL)、乙腈(4mL)、三(2-羧基乙基)膦(0.5mol/L，0.1mL)水溶液，進行了38小時反應。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0mol/L，pH8.5)進行中和，並在減壓下蒸餾除去溶劑，藉此獲得了白色固體的環肽a-3-1(8.05mg)。
MS(ESI m/z)：1664.6(M+H)
RT(min)：1.53
環肽a-3-2
與環肽a-3-1同樣地獲得了環肽a-3-2。
MS(ESI m/z)：1129.5(M+H)
RT(min)：1.21
環肽a-4-1
將Rink Amide-ChemMatrix(0.54mmol/g，104mg)用作起始原料進行了肽固相合成。以Fmoc-Phe(3-CN)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-N-ε-烯丙氧基羰基-L-賴胺酸的順序進行了縮合。加入哌啶(20%v/v)的NMP溶液，使其反應20分鐘，藉此進行Fmoc基的去保護，並加入乙酸酐(20%v/v)的NMP溶液，使其反應10分鐘，藉此將N末端的胺基乙醯基化。加入Pd(PPh3)4(58mg)、氯仿：乙酸：N-甲基嗎福林(=37：2：1，2.0mL)，並攪拌1小時，去除了Alloc基。使Boc-Cys(Trt)-OH縮合之後，用二氯甲烷清洗樹脂，並在減壓下蒸餾除去了溶劑。加入TFA：3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇：三異丙基矽烷：水(=92.5：2.5：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷： 甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入磷酸緩衝液(pH7.0，5mL)、甲醇(5mL)、三(2-羧基乙基)膦(0.5mol/L，0.1mL)水溶液，進行了30小時反應。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0mol/L，pH8.5)進行中和，並在減壓下蒸餾除去溶劑，藉此獲得了白色固體的環肽a-4-1(0.24mg)。
MS(ESI m/z)：1011.5(M-H)
RT(min)：0.98
環肽7-1
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)100mg用作起始原料進行了肽固相合成。以N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-S-三甲苯基-L-半胱胺酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Cha-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH的順序進行縮合，肽伸長後，進行Fmo c基的去保護，並利用與胺基酸相同之方法使氯乙酸縮合。用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向反應溶液中加入TFA：三異丙基矽烷：水(=95：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入HEPES緩衝液(pH7.3，5.0mL)、乙腈(1.0mL)，並在室溫下攪拌了4小時。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%TFA水溶液：0.1%TFA乙腈溶液)純化所獲得之殘渣，獲得了白色固體的環肽7-1(1.4mg)。
MS(ESI m/z)：824.4(M+H)
RT(min)：1.09
利用與環肽7-1的合成相同之方法獲得了下述表44所示之環肽。
環肽8-1
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)100mg用作起始原料進行了肽固相合成。以N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-L-麩胺酸γ-烯丙酯(Fmoc-Glu(OAl)-OH)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Cha-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH的順序進行了縮合。肽伸長後，加入Pd(PPh3)4(58mg)、氯仿：乙酸：N-甲基嗎福林(=37：2：1，2.0mL)，並攪拌1小時，去除了側鏈的烯丙基。加入哌啶(20%v/v)的NMP溶液，使其反應20分鐘，藉此進行了Fmoc基的去除。加入O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸(57mg)、二異丙基乙胺(52μL)、NMP(3.0mL)，並在 室溫下使其反應2小時，藉此使肽環化。用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。在室溫下向反應溶液中加入TFA：三異丙基矽烷：水(=95：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。利用HPLC(0.1%TFA水溶液/0.1%TFA乙腈溶液)純化所獲得之殘渣，獲得了白色固體的環肽8-1(7.1mg)。
MS(ESI m/z)：792.4(M+H)
RT(min)：1.02
利用與環肽8-1的合成相同之方法獲得了下述表45所示之環肽。
環肽9-1
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)100mg用作起始原料進行了肽固相合成。以Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp(Bo c)-OH、Fmoc-D-Cha-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的順序將肽鏈伸長之後，加入哌啶(20%v/v)的NMP溶液，使其反應20分鐘，藉此進行Fmoc基的去保護，並加入乙酸酐(20%v/v)的NMP溶液，使其反應10分鐘，藉此將N末端的胺基乙醯基化。用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向反應溶液中加入TFA：3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇：三異丙基矽烷：水(=92.5：2.5：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入甲基-第三丁醚(12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。加入乙腈(20mL)、水(20mL)之後，一點點加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0mol/L，pH8.5)，將pH調整為8.0。接下來，在室溫下加入碘(0.1mol/L)的乙腈溶液直至碘的顏色消失，進行了二硫化物鍵的形成。30分鐘後，加入抗壞血酸鈉直至碘的顏色消失，並在減壓下蒸餾除去了溶劑。利用HPLC(0.1%TFA水溶液/0.1%TFA乙腈溶液)純化殘渣，獲得了白色固體的環肽9-1(7.0mg)。
MS(ESI m/z)：856.4(M+H)
RT(min)：1.15
利用與環肽9-1的合成相同之方法獲得了下述表46所示之環肽。
環肽10-1
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)80mg用作起始原料進行了肽固相合成。以N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-L-炔丙基甘胺酸(Fmoc-Pra-OH)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Cha-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH的順序，使肽伸長之後，加入哌啶(20%v/v)的NMP溶液，使其反應20分鐘，藉此進行了N末端的Fmoc基的去保護。利用與胺基酸相同之方法使疊氮基乙酸縮合。加入碘化銅(7.6mg)、二異丙基乙胺(34.4μL)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(6.4mg)、NMP(2.0mL)，並在室溫下攪拌1小時，藉此使肽環化。用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向反應溶液中加入TFA：三異丙基矽烷：水(=95：2.5：2.5，2.4mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。利用HPLC(0.1%TFA水溶液：0.1%TFA乙腈溶 液)純化所獲得之殘渣，藉此獲得了白色固體的環肽10-1(1.26mg)。
MS(ESI m/z)：859.0(M+H)
RT(min)：1.05
利用與環肽10-1的合成相同之方法獲得了下述表47所示之環肽。
所合成之環肽利用PAMPA法之膜滲透性評價
為了比較研究所合成之環肽的膜滲透性，實施了PAMPA(Parallel Arti ficial Membrane Permeability Assay：平行人工膜滲透模性分析)。
在濾板(Filter Plate)(Merck Millipore，Cat.MAIPN4550)上添加包含L-α-卵磷脂(phosphatidylcholine)(Avanti，Cat.840051P，1.67%)、1,2-二油-sn-甘油-3-磷酸-L-絲胺酸(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)(Avanti，Cat.840035P，0.33%)、正十二烷特級(WAKO，047-21612)/1-辛醇試劑特級(Kanto chemical，Cat.31013-08)=10：1之磷脂有機溶劑溶液5μL，藉此製作出人工磷脂膜。
測定方法-A
向以20μmol/L的濃度包含化合物之DMSO溶液25μL中加入50mmol/L KPB(鉀磷酸緩衝液，pH7.4或pH6.5)475μL，稀釋至最終濃度成為1μmol/L。夾住PAMPA96孔板(Filter Plate(Merck Millipore，Cat.MAIPN4550))的人工磷脂膜並向下側(供體(donor)側)每次添加300μL該化合物溶液。夾住人工磷脂膜並向上側(受體側)每次添加200μL的5%DMSO KPB(pH7.4)。在25℃下進行了4小時經由人工磷脂膜之滲透試驗。藉由LC/MS/MS測定供體板及受體板上之溶液中化合物濃度，並由下述式計算出化合物的膜滲透速度(Pe)。
其中，將C0設為供體液中的化合物初期濃度，t設為試驗時間，A設為膜過濾器面積=0.3cm2，VD設為供體液量=300μL，VA設為受體液量=200μL、CD(t)設為時間t下之供體液中化合物濃度，CA(t)設為時間t下之受體液中化合物濃度，並且設為Cequilibrium=[CD(t)*VD+CA(t)*VA]/VD+VA)。
測定方法-B
向以200μmol/L的濃度包含化合物之DMSO溶液25μL中加入50mmol/L KPB(鉀磷酸緩衝液，pH7.4或pH6.5)475μL，稀釋至最終濃度成為10μmol/L。夾住PAMPA96孔板(Filter Plate(Merck Millipore，Cat.MAIPN4550))的人工磷脂膜並向下側(供體側)每次添加300μL該化合物溶液。夾住人工磷脂膜並向上側(受體側)每次添加200μL的5%DMSO KPB(pH7.4)。在25℃下進行了4小時經由人工磷脂膜之滲透試驗。藉由LC/MS/MS測定供體板及受體板上之溶液中化合物濃度，並由下述式計算出化合物的膜滲透速度(Pe)。
其中，將C0設為供體液中的化合物初期濃度，t設為試驗時間，A設為膜過濾器面積=0.3cm2，VD設為供體液量=300μL，VA設為受體液量=200μL，CD(t)設為時間t下之供體液中化合物濃度，CA(t)設為時間t下之受體液中化合物濃度，並且設為Cequilibrium=[CD(t)*VD+CA(t)*VA]/VD+VA)。
將藉由本手法獲得之膜滲透性(Pe(10-6cm/s))記載於以下表。
評價基準如下。
+++ 0.5<Pe(10-6cm/s)
++ 0.2<Pe(10-6cm/s)0.5
+ 0.01<Pe(10-6cm/s)0.2
- 0.01Pe(10-6cm/s)
構成環肽之胺基酸序列除了環化部分以外，其他部分相同，使用本發明的環肽的製造法、硫醚環化法及三唑環化法以及二硫化物環化法的各製法合成了環肽。對於各肽，藉由PAMPA法對細胞膜滲透性進行了評價和比較。
其結果，與利用其他製法合成之環肽相比，藉由本發明合成的環肽能夠顯出優異之細胞膜滲透性。
環肽的人肝微粒體中代謝穩定性試驗
以比較研究所合成之環肽的代謝穩定性為目的，實施了使用人肝微粒體(HLM)之實驗。
在使用100mmol/L磷酸緩衝液(pH7.4)製備成終濃度為0.5mg蛋白質 (protein)/mL之人肝微粒體(BD Cat #452117)中，將終濃度1μmol/L的化合物在還元型菸鹼醯胺腺二核苷酸(NADPH)及尿核苷5’-二磷酸-α-D-葡萄糖醛酸(UDPGA)的存在下，於37℃下培養了20分鐘。實施使用乙腈之除蛋白處理，並使用LC/MS/MS將殘存之未變化體量進行定量，並計算出20分鐘時之殘存率(%)。將藉由本手法獲得之HLM殘存率(%)記載於以下表。
評價基準如下。
+++ 60%<HLM殘存率(%)
++ 40%<HLM殘存率(%)60%
+ HLM殘存率(%)40%
構成環肽之胺基酸序列除了環化部分以外，其他部分相同，使用 本發明的環肽的製造法、硫醚環化法合成了環肽。對於各肽藉由人肝微粒體中代謝穩定性試驗對代謝穩定性進行了評價和比較。
其結果，與藉由其他製法合成之環肽相比，藉由本發明合成之環肽能夠顯出優異之代謝穩定性。
<cDNA展示(display)>
展示庫中所使用之DNA庫的製備
使用合成低聚DNA(序列號15)和合成低聚DNA(序列號16)，藉由KOD-plus-(Toyobo Co.Ltd.製造)進行了伸長反應。在94℃下改質3分鐘之後，重複了5次在55℃下1分鐘、在72℃下2分鐘的循環。接下來，使用合成低聚DNA(序列號16)和合成低聚DNA(序列號17)，對於該伸長反應產物在模板上藉由KOD-plus-(Toyobo Co.Ltd.製造)進行了PCR。在94℃下改質2分鐘之後，重複5次在94℃下1分鐘、在50℃下1分鐘、在68℃下1分鐘的循環，建構出DNA庫(序列號18)。
序列中表示為N的部位係指A、T、G、C隨機出現，表示為K之部位表示T、G隨機出現。
序列號15 AAGAAGGAGATATACATATGTGCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGGGCGGTTCTGGCGGTAGC
序列號16 ATACTCAAGCTTATTTATTTACCCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTACCGCCAGAACCGCC
序列號17 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCT AGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG
序列號18
mRNA-嘌呤黴素連結子複合體的製備
將藉由PCR製備之DNA庫(序列號18)作為模板，使用Thermo T7 RNA聚合酶(Toyobo Co.Ltd.製造)製備mRNA(序列號19)，並藉由乙醇沉澱進行了純化。向2.8μmol/L的mRNA中加入5μmol/L的下述嘌呤黴素連結子A(Tsukuba Oligo Service Co.,Ltd.製造)、TBS(25mmol/L Tris、500mmol/L NaCl，pH7.5)，在90℃下使其反應1分鐘之後，每隔1分鐘以每次0.5℃降低至25℃。接下來，將365nm的UV照射30分鐘之後，藉由乙醇沉澱進行純化，製成mRNA-嘌呤黴素連結子複合體。
序列中表示為N之部位係指A、U、G、C隨機出現，表示為K之部位係指U、G隨機出現。
序列號19
【化學式176】
上述者為嘌呤黴素連結子A(Tsukuba Oligo Service Co.,Ltd.製造)。
上述者表示(Sp18)。
靶蛋白質的製備
向pET28a的質體中導入包含MCL-1的胺基酸1-172部分之基因來準備了在N末端側賦予有His6標籤、MBP、HRV3C蛋白酶識別序列、3×FLAG標籤之構築體(contruct)的質體。將該質體轉化為BL21(DE3)RIPL株，並在30℃下進行了培養。在O.D.達到0.8之時刻，添加IPTG 0.5μmol/L，誘導大量顯現之後、在16℃下徹夜培養。使回收之菌體於Lysis緩衝液B(25mmol/L Tris(pH7.5)、300mmol/L NaCl)中懸浮之後，用超音波破碎。以15krpm進行15分鐘離心分離，並使用Ni-NTA樹脂(QIAGEN公司製造)純化了離心後的上清液。吸附於Ni-NTA樹脂之試樣(sample)為含20mmol/L咪唑之Lysis緩衝液B，洗滌之後，於含200mmol/L咪唑之Lysis緩衝液B中使其溶出。向試樣中添加PreScission蛋白酶(Protease)(GE lifescience Inc.製造)，切斷His6標籤、MBP部分之同時，藉由透析徹夜置換為Dial ysis緩衝液(25mmol/L Tris(pH 7.5)、150mmol/L NaCl)。確認標籤的切斷之後，添加到經Dialysis緩衝液置換之直鏈澱粉樹脂(New England Bio Labs)中，分取了流穿(Flow Through)組分。用Amicon Ultra(Millipore Corp.製造)濃縮所獲得之試樣之後，利用HiLoad Superdex75(GE lifescience Inc.製造)進行了純化。用Amicon Ultra濃縮所獲得之試樣之後，於-80℃下保存。
蛋白質固定化珠的製作
將100μL的ANTI-FLAG M2磁珠(sigma Corporation製造)用TBS(20mmol/L Tris、150mmol/L NaCl，pH7.4)清洗，加入33μg的靶蛋白質並旋轉混合10分鐘，使蛋白質結合於珠。回收珠並且用TBS清洗，獲得了靶蛋白質固定化珠。
琥珀抑制基因tRNA(-CA)的合成
與上述方法同樣地合成了琥珀抑制基因tRNA。
胺基醯基tRNA-15(表31)的合成
與上述方法同樣地獲得了胺基醯基tRNA-15。
淘選中所使用之轉譯液
使用PUREfrex(註冊商標)custom ver2(Genefrontier Corporation製造，PFC-Z1802)，對10μL的反應液添加了下述物質。
mRNA-嘌呤黴素連結子複合體：終濃度0.6μmol/L
胺基醯基tRNA-15水溶液(0.2OD/μL)：1μL
胺基酸水溶液(Met以外的19種胺基酸各0.3mmol/L的混合物)：1.5μL
用於進行第1回淘選之轉譯、反轉錄反應、淘選、PCR
製備前述轉譯液，並在37℃下使其反應30分鐘。對該轉譯液4μL加入2μL的60mmol/L EDTA溶液，並在室溫下放置了幾分鐘。接下來，向該溶液中加入ReverTra Ace(Toyobo Co.Ltd.製造)、5×RT緩衝液(Toyobo Co.Ltd.製造)、1mmol/L dNTPs，並在30℃下保溫10分鐘、在42℃下保溫30分鐘，進行反轉錄反應，獲得了10μL的肽-mRNA複合體溶液。
對上述溶液加入10μL的靶蛋白質固定化珠及TBS，並在室溫下進行了45分鐘旋轉混合。去除上清液，用TBS+0.05% tween-20清洗4次，用TBS清洗1次，並且用純水清洗了1次。
向包含1μmol/L引子(primer)(序列號20)、1μmol/L引子(序列號21)及KOD-plus-(Toyobo Co.Ltd.製造)之PCR溶液中加入上述珠1μL，藉由PCR使cDNA擴增之後，利用QIAquick PCR純化試劑盒(purification kit)(QIAGEN公司製造)純化了DNA。將經純化之DNA作為模板，使用0.3μmol/L引子(序列號22)、0.3μmol/L引子(序列號23)及KOD-plus-(Toyobo Co.Ltd.製造)再次進行PCR，並利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司製造)純化了DNA。
序列號20 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC
序列號21 ATACTCAAGCTTATTTATTTACCCCCCGCCGCCCCCCGTCC
序列號22 GAAATTAATACGACTCACTA
序列號23 ATACTCAAGCTTATTTATTT
用於進行第2回淘選之轉錄、mRNA-嘌呤黴素連結子複合體製備、轉譯、反轉錄反應、淘選、PCR
使用Thermo T7 RNA聚合酶(Toyobo Co.Ltd.製造)，由在第1回中擴增之cDNA合成mRNA，並藉由乙醇沉澱進行了純化。接著，向mRNA中加入嘌呤黴素連結子A(將結構示於上述化學式176)，在90℃下使其反應一分鐘之後，每隔一分鐘以每次0.5℃降低至25℃。接下來，將365nm的UV照射30分鐘之後，藉由乙醇沉澱進行純化，製成mRNA-嘌呤黴素連結子複合體。製備包含0.6μmol/L mRNA-嘌呤黴素連結子複合體之前述4μL轉譯液，在37℃下保溫30分鐘之後，加入2μL的60mmol/L EDTA溶液，並在室溫下放置了幾分鐘。接下來，向該溶液中加入ReverTra Ace(Toyobo Co.Ltd.製造)、5×RT緩衝液(Toyobo Co.Ltd.製造)、1mmol/L dNTPs，在30℃下保溫10分鐘、在42℃下保溫30分鐘，進行反轉錄反應，獲得了10μL的肽-mRNA複合體溶液。
對上述溶液加入10μL的靶蛋白質固定化珠及TBS，並在室溫下進行了45分鐘旋轉混合。去除上清液，用TBS+0.05% tween-20清洗4次，用TBS清洗1次，並且用純水清洗了1次。
向包含1μmol/L引子(序列號20)、1μmol/L引子(序列號21)及KOD-plus-(Toyobo Co.Ltd.製造)之PCR溶液中加入上述珠1μL，藉由PCR使cDNA擴增之後，利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司製造)純化了DNA。將經純化之DNA作為模板，使用0.3μmol/L引子(序列號22)、0.3μmol/L引子(序列號23)及KOD-plus-(Toyobo Co.Ltd.製造)再次進行PCR，並利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司製造)純化了DNA。
在第3回中，亦重複與第2回相同之操作，藉此進行了顯出靶蛋白質特異結合之cDNA的濃縮。進行經濃縮之DNA池(pool)的鹼基序列分析，對經濃縮之肽序列進行了鑒定。
經濃縮之肽序列的化學合成環肽a-5-1的合成
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)100mg用作起始原料進行了肽固相合成。以(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(6-氰基吡啶-2-基)丙酸、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-O-(第三丁基)-L-酪胺酸(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)、Fmoc-Trp(Boc)-OH)、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-S-三甲苯基-L-半胱胺酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-O-第三丁基-L-絲胺酸(Fmoc-Ser(OtBu)-OH)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的順序進行了縮合。伸長結束後，加入哌啶(20%v/v)的NMP溶液，使其反應20分鐘，藉此進行了Fmoc基的去保護。用 二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向反應溶液中加入TFA：3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇：三異丙基矽烷：水(=92.5：2.5：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入磷酸緩衝液(pH7.0，2.5mL)、甲醇(2.5mL)、三(2-羧基乙基)膦(0.5mol/L，0.025mL)水溶液，並在45℃下攪拌了40分鐘。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0M，pH8.5)進行中和，並在減壓下蒸餾除去，藉此獲得了無色油狀的環肽a-5-1(21.7mg)。
MS(ESI m/z)：1957.6(M+H)
RT(min)：1.40
環肽a-5-2的合成
【化學式179】
與環肽a-5-1同樣地進行實施。
MS(ESI m/z)：1979.4(M+H)
RT(min)：1.67
環肽a-5-3的合成
將Rink Amide-ChemMatrix(0.5mmol/g)100mg用作起始原料進行了肽固相合成。以(S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(6-氰基吡啶-2-基)丙酸、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-N5-三甲苯基-L-麩胺酸(Fmoc-L-Gln(Trt)-OH)、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的順序進行了縮合。伸長結束後，用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向反應溶液中加入TFA：3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇：三異丙基矽烷：水(=92.5：2.5：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入磷酸緩衝液(pH7.0，2.5mL)、甲醇(2.5mL)、三(2-羧基乙基)膦(0.5mol/L，0.025mL)水溶液，並室溫下攪拌了2小時。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0M，pH8.5)進行中和，並在減壓下蒸餾除去，藉此獲得了無色油狀的環肽a-5-3(13.4mg)。
MS(ESI m/z)：1821.3(M+H)
RT(min)：1.56
利用與環肽a-5-3相同之方法獲得了下述表50所示之化合物。
靶蛋白質的製備
向pET28a的質體中導入包含MCL-1的胺基酸1-172部分之基因，準備了在N末端側賦予有His6標籤、MBP、TEV蛋白酶識別序列之構築體的質體。將該質體轉化為BL21(DE3)RIPL株，並在30℃下培養。在O.D.達到0.8之時刻，添加IPTG 0.5mmol/L，誘導大量顯現之後，在16℃下徹夜培養。使回收之菌體於Lysis緩衝液A(25mmol/L Tris(pH7.5)、150mmol/L NaCl)中懸浮之後，用超音波破碎。以15krpm進行15分鐘離心分離，並使用Ni-NTA樹脂(QIAGEN公司製造)純化了離心後的上清液。用含15mmol/L咪唑之Lysis緩衝液A洗滌吸附於Ni-NTA樹脂之試樣之後，於含200mmol/L咪唑之Lysis緩衝液A中使其溶出。試樣藉由透析置換為Lysis緩衝液之 後，於-80℃下保存。
利用表面電漿子共振(Surface plasmon resonance：SPR)之合成肽對靶蛋白質之結合評價
使用Biacore T200(GE healthcare公司製造)，在25℃下實施了合成肽與Mcl-1的相互作用分析的SPR實驗。對經固定化之蛋白質添加合成肽，對相互作用進行了評價。
作為電泳緩衝液，使用了以終濃度成為1vol%之方式添加有HBS-EP+(GE healthcare公司製造)之二甲基甲醯胺(DMF)或二甲基亞碸(DMSO)者。使用胺偶聯試劑盒(Amine Coupling Kit)(GE healthcare公司製造)，在Biacore用感測器晶片Series S Sensor Chip CM5(GE healthcare公司製造)上將Mcl-1固定化。為了測定解離常數(KD)，以複數種濃度添加各合成肽，獲得了對固定化Mcl-1之結合的感測圖(sensorgram)。
使用T200 evaluation software(GE healthcare公司製造)進行了所獲得之感測圖的分析。進行對DMF或DMSO之溶劑校正，接著使用除去對Mcl-1未固定化之flowcell之感測圖之感測圖，藉由平衡值分析決定了KD。將如以上那樣分析而獲得之結果示於以下表。
將KD小於50μmol/L者標記為A，將50μmol/L以上者標記為B。
mRNA展示
展示庫中所使用之DNA庫的製備
與上述方法同樣地製備出DNA庫。
mRNA-嘌呤黴素連結子複合體製備
將藉由PCR製備之DNA庫(序列號18)作為模板，使用Thermo T7 RNA聚合酶(Toyobo Co.Ltd.製造)製備mRNA(序列號19)，並藉由乙醇沉澱進行了純化。向2.8μmol/L的mRNA中加入5μmol/L的嘌呤黴素連結子B(Tsukuba Oligo Service Co.,Ltd.製造)(將結構示於下述化學式181)、TBS(25mmol/L Tris、500mmol/L NaCl，pH7.5)，在90℃下使其反應五分鐘之後，降低至25℃。接下來，將365nm的UV照射2分鐘之後，藉由乙醇沉澱進行純化，製成mRNA-嘌呤黴素連結子複合體。
上述物質為嘌呤黴素B(Tsukuba Oligo Service Co.,Ltd.製造)。
【化學式182】
靶蛋白質的製備
與上述方法同樣地製備出靶蛋白質。
蛋白質固定化珠的製作
與上述方法同樣地製作出蛋白質固定化珠。
琥珀抑制基因tRNA(-CA)的合成
與上述方法同樣地合成了琥珀抑制基因tRNA。
胺基醯基tRNA-10(表31)的合成
與上述方法同樣地獲得了胺基醯基tRNA-10。
淘選中所使用之轉譯液
使用PUREfrex(註冊商標)custom ver2(Genefrontier Corporation製造，PFC-Z1802)，對10μL的反應液添加了下述物質。
mRNA-嘌呤黴素連結子複合體：終濃度0.6μmol/L
胺基醯基tRNA-10水溶液(0.2OD/μL)：1μL
胺基酸水溶液(Met以外的19種胺基酸各0.3mmol/L的混合物)：1.5μL
用於進行第1回淘選之轉譯、淘選、反轉錄反應、PCR
製備前述轉譯液，並在37℃下使其反應30分鐘。對該轉譯液4μL加入10μL的靶蛋白質固定化珠及TBS(20mmol/L Tris、150mmol/L NaCl，pH7.4)，並在室溫下進行了45分鐘旋轉混合。去除上清液，用TBS+0.05% twe en-20清洗4次，用TBS清洗1次，並且用純水清洗了1次。接著，向珠溶液中加入ReverTra Ace(Toyobo Co.Ltd.製造)、5×RT緩衝液(Toyobo Co.Ltd.製造)、1mmol/L dNTPs，並在30℃下保溫10分鐘、在42℃下保溫30分鐘，進行反轉錄反應，獲得了12μL的肽-mRNA複合體溶液。
向包含1μmol/L引子(序列號20)、1μmol/L引子(序列號24)及KOD-Multi&Epi-(Toyobo Co.Ltd.製造)之PCR溶液中加入上述珠1μL，藉由PCR使cDNA擴增之後，利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司製造)純化了DNA。
序列號24 ATACTCAAGCTTATTTATTTACCCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTACCGCCAGAACCGCCCTA
用於進行第2回淘選之轉錄、mRNA-嘌呤黴素連結子複合體製備、轉譯、淘選、反轉錄反應、PCR
使用Thermo T7 RNA聚合酶(Toyobo Co.Ltd.製造)，由在第1回中擴增之cDNA合成mRNA，並利用RNeady MinElute Cleanup Kit(QIAGEN公司製造)進行了純化。接著，向mRNA中加入嘌呤黴素連結子B(將結構示於上述化學式181)，在90℃下使其反應5分鐘之後，降低至25℃。接下來，將365nm的UV照射2分鐘之後，藉由乙醇沉澱進行純化，製成mRNA-嘌呤黴素連結子複合體。製備包含0.6μmol/L mRNA-嘌呤黴素連結子複合體之前述4μL轉譯液，並在37℃下保溫了30分鐘。對該溶液加入10μL的ANTI-FLAG M2磁珠(sigma Corporation製造)及TBS，重複了3次在室溫下進行10分鐘翻倒混合並回收上清液之步驟。對上清液加入10μL的靶蛋白質固定化珠及TBS，並在室溫下進行了45分鐘旋轉混合。去除上清液， 用TBS+0.05% tween-20清洗4次，用TBS清洗1次，並且用純水清洗了1次。接下來，向珠溶液中加入ReverTra Ace(Toyobo Co.Ltd.製造)、5×RT緩衝液(Toyobo Co.Ltd.製造)、1mmol/L dNTPs，並在30℃下保溫10分鐘、在42℃下保溫30分鐘，進行反轉錄反應，獲得了12μL的肽-mRNA複合體溶液。
向包含1μmol/L引子(序列號20)、1μmol/L引子(序列號24)及KOD-Multi&Epi-(Toyobo Co.Ltd.製造)之PCR溶液中加入上述珠1μL，並藉由PCR使cDNA擴增之後，利用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司製造)純化了DNA。
在第3回及第4回中，亦重複與第2回相同之操作，藉此進行了顯出靶蛋白質特異結合之cDNA的濃縮。進行經濃縮之DNA池的鹼基序列分析，對經濃縮之肽序列進行了鑒定。
經濃縮之肽序列的化學合成
環肽a-6-1的合成
【化學式183】
將Rink Amide-ChemMatrix(0.48mmol/g,104mg)用作起始原料進行了肽固相合成。以2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-O-(第三丁基)-L-蘇胺酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)、Fmoc-Pro-OH、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-L-天冬胺酸β-第三丁酯(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、N-α-(9-茀基甲氧基羰基)-L-麩胺酸γ-第三丁酯(Fmoc-Glu(tBu)-OH)、Boc-Cys(Trt)-OH的順序進行了縮合。用二氯甲烷清洗樹脂之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向反應溶液中加入TFA：3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇：三異丙基矽烷：水(=92.5：2.5：2.5：2.5，3.0mL)，並進行了肽的切割和去保護。2小時後，濾出樹脂，並向濾液中加入正己烷：甲基-第三丁醚(=1：1，12mL)，產生了固體。進行離心分離，使固體沉澱之後，去除了上清液。用甲基-第三丁醚清洗固體之後，在減壓下蒸餾除去了溶劑。向所獲得之固體中加入磷 酸緩衝液(pH7.0,5mL)、甲醇(5mL)、三(2-羧基乙基)膦(0.5mol/L，0.1mL)水溶液，進行了48小時反應。在減壓下蒸餾除去溶劑，並利用HPLC(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈溶液)純化所獲得之殘渣之後，加入三乙基碳酸氫銨溶液(1.0mol/L，pH8.5)，將pH調整為中性之後，在減壓下蒸餾除去溶劑，藉此獲得了白色固體的環肽a-6-1(7.6mg)。
MS(ESI m/z)：1993.3(M+H)
RT(min)：1.10
與環肽a-6-1同樣地獲得了下述表52所示之環肽。
a-6-7的環化部位的鑒定
a-6-7由於在兩處包含作為環化部位之2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-(5-氰基噻吩-3-基)丙酸，因此為了決定結構，進行了胰蛋 白酶消化。向a-6-7的DMSO溶液(20mM，5μL)中加入胰蛋白酶(0.01mg)(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.製造)的三乙基碳酸氫銨(50mmol/L，pH8.5，95μL)溶液，並在37℃下靜置了2小時。藉由LC/MS對反應液進行分析，根據觀測到1015.1和736.1這2種MS，確認了環化部位為從N末端第5個殘基的胺基酸。
靶蛋白質的製備
與上述方法同樣地製備出靶蛋白質。
利用表面電漿子共振(SPR)之合成肽對靶蛋白質之結合評價
與上述方法同樣地評價了合成肽對靶蛋白質之結合。將所獲得之KD示於以下表。
將KD小於50μmol/L者標記為A，將50μmol/L以上者標記為B。
【產業上之可利用性】
藉由本發明的製造法及選擇方法獲得之環肽作為醫藥品、農藥、生化學用實驗試劑、細胞培養用添加劑、化妝品、功能性食品的有效成分而被利用，又，亦能夠作為過濾器或管柱層析中所使用之吸附材．分離劑而進行利用。藉由本發明的製造法及選擇方法獲得之環肽還能夠作為促進合成反應之觸媒、顏料或奈米粒子的微小固體的分散劑、水溶液的凝膠化劑而進行利用。
<110> 富士軟片股份有限公司
<120> 一種環狀肽化合物及其製造方法、以及一種環狀肽化合物的選擇方法
<130> 17F02646
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 169
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：以PCR製備之DNA
<400> 1
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<223> 人工序列之描述：以PCR製備之DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 人工序列之描述：以PCR製備之DNA
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<223> 人工序列之描述：以PCR製備之DNA
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<212> RNA
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<223> 人工序列之描述：tRNA基因
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<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
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<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
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<212> RNA
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<223> 人工序列之描述：以RNA聚合酶製備之mRNA
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<212> DNA
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<223> 人工序列之描述：合成寡核苷酸
<400> 20
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Claims (24)

  1. 一種下述式(1)所表示之肽化合物或其鹽， 式中，X表示S、NH或O，A表示單鍵、可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基或與B所鍵結之碳原子成為一體而由*-CR 0=C(B)-表示之2價的基團，R 0表示氫原子或取代基，*表示與X鍵結之位置，B表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，其中，A及B並不同時為單鍵，Z表示羥基或胺基，p個R可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基、或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，當G不表示G所鍵結之碳與A成為一體而由*-CR 0=C(B)-表示之2價的基團時，表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，t 1個W 1可以相同或不同，表示單鍵、-CH 2(C 6H 5NH)-、-CH 2(C 6H 5O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有 取代基之碳數6~20的伸芳基、或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，t 2個W 2可以相同或不同，表示單鍵、-CO-、-COO-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHCO-、-(CH 2CH 2O)-、-(CH 2CH 2CH 2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基、或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，J表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，n個Xaa分別獨立地表示任意的胺基酸殘基或任意的胺基酸類似物殘基，m個Xbb分別獨立地表示任意的胺基酸殘基或任意的胺基酸類似物殘基，p表示0~4的整數，t 1表示0~6的整數，t 2表示0~6的整數，m表示0~20的整數n表示1~20的整數。
  2. 如請求項1之肽化合物或其鹽，其中該式(1)所表示之肽化合物為下述式(1A)所表示之肽化合物， 式中，A 1表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基、或與N所鍵結之碳原子成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團，*表示與S鍵結之位置，p 1個R 1可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基、或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，t 11個W 11可以相同或不同，表示單鍵、-CH 2(C 6H 5NH)-、-CH 2(C 6H 5O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基、或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，t 21個W 21可以相同或不同，表示單鍵、-CO-、-COO-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHCO-、-(CH 2CH 2O)-、-(CH 2CH 2CH 2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基、或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，當G 1不表示G 1所鍵結之碳與A 1成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團時，表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，J 1表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，p 1表示0~4的整數，t 11表示0~6的整數，t 21表示0~6的整數，Z、Xaa、Xbb、m及n表示與請求項1中之定義相同之含義。
  3. 如請求項1之肽化合物或其鹽，其中該式(1)所表示之肽化合物為下述式(1B)所表示之肽化合物， 式中，A 2表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基、或與N所鍵結之碳原子成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團，*表示與S鍵結之位置，當G 2不表示G 2所鍵結之碳與A 2成為一體而由*-CH=C(N)-表示之2價的基團時，表示氫原子或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，J 2表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，p 2個R 2可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基、或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，p 2表示0~4的整數，q 2表示0~6的整數，但是，p 2和q 2不會同時成為0，Z、Xaa、Xbb、m及n表示與請求項1中之定義相同之含義。
  4. 如請求項1至3中任一項之肽化合物或其鹽，其中該R、R 1或R 2為選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻唑基、可以具有取代基之伸苯并噁唑基、可以具有取代基之伸苯并咪唑基、可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸苯并呋喃基、可以具有取代基 之伸異苯并呋喃基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸異喹啉基、可以具有取代基之伸喹唑啉基、可以具有取代基之伸噌啉(cinnolylene)基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸苯并噻二唑基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒 基、可以具有取代基之伸嘧啶基、可以具有取代基之伸吡 基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸噁二唑基、可以具有取代基之伸噻二唑基、可以具有取代基之伸吡唑基、可以具有取代基之伸異噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸咪唑并噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑并吡啶基、可以具有取代基之伸咪唑并嗒 基、可以具有取代基之伸咪唑并嘧啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡 基、可以具有取代基之伸吡唑并嘧啶基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之伸噻吩基、可以具有取代基之伸呋喃基、可以具有取代基之伸吡咯基、可以具有取代基之伸苯基、及可以具有取代基之伸萘基。
  5. 如請求項1至4中任一項之肽化合物或其鹽，其中該R或R 1或R 2為選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡 基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒 基、可以具有取代基之伸吡 基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸噻吩基、及可以具有取代基之伸苯基。
  6. 如請求項1至5中任一項之肽化合物或其鹽，其中構成該肽 化合物的環狀部之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數為3~20。
  7. 如請求項1至6中任一項之肽化合物或其鹽，其中構成該肽化合物之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數為3~20。
  8. 一種篩選用組成物，其包含如請求項1至7中任一項之肽化合物或其鹽。
  9. 一種結合於靶物質之肽化合物或其鹽的選擇方法，其包括：使包含如請求項1至7中任一項之肽化合物或其鹽之肽庫與靶物質接觸，並選擇結合於該靶物質之肽化合物或其鹽。
  10. 一種肽化合物或其鹽的製造方法，其包括：製造肽鏈之製程，該肽鏈在肽鏈中或C末端具有在側鏈上具有氰基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基，且在N末端具有下述式(2)的結構；及使該氰基與下述式(2)的結構進行反應，而形成具有下述式(3)所表示之鍵之環狀部之製程， 式中，X表示S、NH、或O，A表示單鍵、或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，B表示單鍵、或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，G表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，*表示與肽鏈之鍵結部位，A及B並不同時為單鍵： 式中，X、A、G及B的含義與式(2)中之定義相同。
  11. 一種結合於靶物質之肽化合物的選擇方法，其包括：利用如請求項10之方法來製造具有環狀部之肽化合物之製程；及使包含該肽化合物或其鹽之肽庫與靶物質接觸，並選擇結合於該靶物質之肽化合物或其鹽之製程。
  12. 如請求項11項之選擇方法，其包括以下製程：(i)製備核酸庫，藉由包含用非天然胺基酸醯基化之伸長用tRNA之無細胞轉譯系進行轉譯，製備出包含有非天然胺基酸隨機導入到肽序列中之肽化合物之資料庫之製程；(ii)使肽庫與靶物質接觸之製程；及(iii)選擇結合於靶物質之肽化合物之製程，在該(i)的製程中，根據對構成資料庫之各肽化合物進行編碼之核酸序列轉譯構成資料庫之各肽化合物，核酸序列與作為其轉譯產物之肽連結而建構體外展示庫，該(iii)的製程包括：決定對結合於靶物質之肽化合物進行編碼之核酸序列，根據核酸序列決定肽序列，並選擇肽化合物。
  13. 如請求項10至12中任一項之方法，其中該在側鏈上具有氰基之該胺基酸殘基和/或該胺基酸類似物殘基為下述式(4)所表示之結構， 式中，m 1個Q 1可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基、及可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基中的至少1種，T 1表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，n 1表示0至6的整數，m 1表示1至4的整數，*表示與構成肽鏈之胺基酸殘基和/或胺基酸類似物殘基之鍵結位置。
  14. 如請求項10至12中任一項之方法，其中該在側鏈上具有氰基之該胺基酸殘基和/或該胺基酸類似物殘基為下述式(5)所表示之結構， 式中，l 2個Q 2可以相同或不同，表示單鍵、-CH 2(C 6H 5NH)-、-CH 2(C 6H 5O) -、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基、或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，n 2個Q 3可以相同或不同，表示單鍵、-CO-、-COO-、-NHCO-、-NHCONH-、-CONHCO-、-(CH 2CH 2O)-、-(CH 2CH 2CH 2O)-、可以具有取代基之胺基酸殘基、可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~20的伸芳基、或可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基，m 2個Q 4可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基、可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基、及可以具有取代基之碳數1~6的伸烷基中的至少1種，T 2表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，l 2表示0~6的整數，n 2表示0~6的整數，m 2表示1~4的整數，*表示與構成肽鏈之胺基酸殘基和/或胺基酸類似物殘基之鍵結位置。
  15. 如請求項13或14項之方法，其中該Q 1或Q 4為選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻唑基、可以具有取代基之伸苯并噁唑基、可以具有取代基之伸苯并咪唑基、可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸苯并呋喃基、可以具有取代基之伸異苯并呋喃基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸異喹啉基、可以具有取代基之伸喹唑啉基、可以具有取代基之伸噌啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸苯并噻二唑基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒 基、可以具有取代基之伸嘧啶基、可以具有取代基之伸吡 基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具 有取代基之伸咪唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸噁二唑基、可以具有取代基之伸噻二唑基、可以具有取代基之伸吡唑基、可以具有取代基之伸異噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸咪唑并噻唑基、可以具有取代基之伸咪唑并吡啶基、可以具有取代基之伸咪唑并嗒 基、可以具有取代基之伸咪唑并嘧啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡 基、可以具有取代基之伸吡唑并嘧啶基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之伸噻吩基、可以具有取代基之伸呋喃基、可以具有取代基之伸吡咯基、可以具有取代基之伸苯基、及可以具有取代基之伸萘基。
  16. 如請求項13至15中任一項之方法，其中該Q 1或Q 4為選自以下中之至少1種結構：可以具有取代基之伸苯并噻吩基、可以具有取代基之伸吲哚基、可以具有取代基之伸喹啉基、可以具有取代基之伸吲唑基、可以具有取代基之伸吡咯并吡啶基、可以具有取代基之咪唑并亚吡 基、可以具有取代基之伸吡啶基、可以具有取代基之伸嗒 基、可以具有取代基之伸吡 基、可以具有取代基之伸噻唑基、可以具有取代基之伸噁唑基、可以具有取代基之伸三唑基、可以具有取代基之伸噻吩基、及可以具有取代基之伸苯基。
  17. 如請求項10至16中任一項之方法，其中該式(2)為下述式(2A)所表示之結構， 式中，A 1表示可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基；G表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基。
  18. 如請求項10至17中任一項之方法，其中該式(2)為選自下述式中之至少1種結構，
  19. 如請求項10至18中任一項之方法，其中使該氰基與該式(2)的結構進行反應而形成該式(3)所表示之鍵之製程的反應溶劑為水。
  20. 如請求項10至19中任一項之方法，其中使該氰基與該式(2)的結構進行反應而形成該式(3)所表示之鍵之製程的反應液的pH為6.0~8.5。
  21. 如請求項10至20中任一項之方法，其中構成具有該環狀部之肽化合物的環狀部之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數為3~20。
  22. 如請求項10至21中任一項之方法，其中構成具有該環狀部之肽化合物之胺基酸殘基及胺基酸類似物殘基的總數為3~20。
  23. 如請求項10至22中任一項之方法，其中使用藉由對在天然胺基酸的轉譯中分配之密碼子除去天然胺基酸而成為空的密碼子、終止密碼子或四鹼基密碼子，將該在側鏈上具備具有氰基之伸雜芳基、具有氰基之伸芳基、或具有氰基之伸烷基之胺基酸殘基或胺基酸類似物殘基導入到肽鏈中。
  24. 一種篩選用組成物，其係具有環狀部之肽化合物或其鹽，該環狀部含有具有下述式(6)所表示之結構之肽化合物或其鹽， 式中，X表示S、NH、或O，A表示單鍵、可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基、或與B所鍵結之碳原子成為一體而由*-CR 0=C(B)-表示之2價的基團，R 0表示氫原子或取代基，*表示與X鍵結之位置，B表示單鍵或可以具有取代基之碳數1或2的直鏈的伸烷基，其中，A及B並不同時為單鍵，p個R可以相同或不同，表示可以具有取代基之伸雜芳基、或可以具有取代基之碳數6~10的伸芳基，當G不表示G所鍵結之碳與A成為一體而由*-CR 0=C(B)-表示之2價的基團時，G表示氫原子、或可以具有取代基之碳數1~6的烷基，p表示0~4的整數。
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