JP2022505464A - 方法及び組成物 - Google Patents

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Abstract

Figure 2022505464000001
本発明は、ポリペプチドへの２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）の遺伝的組込み、ＤＡＰを含む非天然アミノ酸、ＤＡＰを含む非天然アミノ酸をｔＲＮＡにチャージするためのｔＲＮＡシンテターゼ、並びに得られるポリペプチドを、例えば、酵素反応における基質及び／又は中間体の捕捉において、使用する方法に関する。本発明はまた、式（Ｉ）若しくは（II）の化合物、又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物に関する。
【化１】

Description

本発明は、ポリペプチドへの２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ、2,3-diamino propionic acid）の遺伝的組込み、ＤＡＰを含む非天然アミノ酸、ＤＡＰを含む非天然アミノ酸をｔＲＮＡにチャージするためのｔＲＮＡシンテターゼ、並びに得られるポリペプチドを、例えば、酵素反応における基質及び／又は中間体の捕捉において、使用する方法に関する。
多くの酵素は、酵素活性部位のセリン又はシステイン側鎖に結合した共有結合中間体を介して進行する反応を行う（Holliday, G.L., Mitchell, J.B.O. & Thornton, J.M. Understanding the Functional Roles of Amino Acid Residues in Enzyme Catalysis. Journal of molecular biology 390, 560-577 (2009)）。ヒドロキシル又はスルフヒドリル基と基質中のカルボニル基との反応によって、活性化エステル又はチオエステル中間体が形成され、これは、選択された求核剤とのさらなる反応を介して急速に生成物に変換される。チオエステル及びエステルの半減期は通常、数分～数時間である（Yang, W. & Drueckhammer, D.G. Understanding the relative acyl-transfer reactivity of oxoesters and thioesters: computational analysis of transition state delocalization effects. Journal of the American Chemical Society 123, 11004-11009 (2001)）ので、これらの重要なアシル－酵素中間体を単離して特徴付けることは困難である。
これらの中間体を安定的に捕捉する戦略により、ネイティブ基質(native substrate)の同定、並びに他の方法では定義が難しい中間体及び機能状態の特徴付けが可能になる。公知のアプローチでは、カルボニル基の求電子置換を有する基質類似体を使用して、アシル－酵素中間体の類似体を捕捉することができる（Liu, B., Schofield, C.J. & Wilmouth, R.C. Structural analyses on intermediates in serine protease catalysis. Journal of Biological Chemistry 281, 24024-24035 (2006)、Ngo, P.D., Mansoorabadi, S.O. & Frey, P.A. Serine Protease Catalysis: A Computational Study of Tetrahedral Intermediates and Inhibitory Adducts. J Phys Chem B 120, 7353-7359 (2016)、Cleary, J.A., Doherty, W., Evans, P. & Malthouse, J.P.G. Quantifying tetrahedral adduct formation and stabilization in the cysteine and the serine proteases. Bba-Proteins Proteom 1854, 1382-1391 (2015)）。他の公知の場合には、酵素活性部位の変異が、そのアシル－酵素中間体の安定化を可能にし得る（Scaglione, J.B. et al. Biochemical and structural characterization of the tautomycetin thioesterase: analysis of a stereoselective polyketide hydrolase. Angew Chem Int Ed Engl 49, 5726-5730 (2010)）。これらのアプローチは貴重な洞察を提供したが、基質類似体の合成を必要とし、非ネイティブ活性部位又は非ネイティブ基質との複合体をもたらし、これがこれらの技術の欠点となっている。ユビキチン分野では、Ｅ２の重要なシステイン残基をリジンで置き換え、ユビキビンのＣ末端にアミド結合を作ることが可能であり；これが、タンパク質ユビキチン化経路への多くの洞察をもたらした（Cappadocia, L. & Lima, C.D. Ubiquitin-like Protein Conjugation: Structures, Chemistry, and Mechanism. Chem Rev 118, 889-918 (2018)、Plechanovova, A., Jaffray, E.G., Tatham, M.H., Naismith, J.H. & Hay, R.T. Structure of a RING E3 ligase and ubiquitin-loaded E2 primed for catalysis. Nature 489, 115-U135 (2012)）。しかし、このコンジュゲーションは通常、高いｐＨを必要とし、得られる置換はイソステリック(isosteric)とは言い難く、これがこのアプローチの欠点となっている。したがって、この戦略は、アシル－酵素中間体を介して進行するほとんどの酵素クラスへの適用が好適でなく、これは、当技術分野における課題である。
アシル－酵素中間体は、酵素中のシステイン又はセリン残基のスルフヒドリル又はヒドロキシ側鎖と基質中のカルボニル基との間で形成され、これは、非リボソーム性ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ、non-ribosomal peptide synthetase）及びプロテアーゼによって媒介されるものを含む多様な生物学的転換において遍在する。これらの重要なチオエステル及びエステル中間体は不安定であって、通常、半減期が数分から数時間であり、このことがそれらの特徴付けを困難にしている。これは、当技術分野における課題である。
２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）を含むポリペプチドは、当技術分野において開示されている。具体的には、ＤＡＰを有する１種又は２種以上のポリペプチドが、従来技術において固相合成／コンジュゲーション技術によって生産されている（Virdee, S., Macmillan, D., & Waksman, G. (2010) Chemistry & Biology vol 17 pages 274-284 "Semisynthetic Src SH2 domains demonstrate altered phosphopeptide specificity induced by incorporation of unnatural lysine derivatives."を参照）。しかし、従来の固相合成／コンジュゲーション技術による、ＤＡＰを含むポリペプチドの生産には多くの課題がある。例えば、従来技術の技術を用いて、生物学的に最も重要なドメイン又はモチーフ、例えば、酵素の活性部位にＤＡＰを組み込むことは極めて困難であるか又は不可能である。これは、活性部位が化学的コンジュゲーションには利用できないため、及び／又は固相合成によって作られるタンパク質が、正しいコンフォメーションを達成するために化学的リフォールディングを必要とするためである。これは、労力を要するだけでなく、非常に信頼性がなく、予測不可能であり、非常に多くの場合失敗に終わる。これらは、当技術分野における課題である。
Holliday, G.L., Mitchell, J.B.O. & Thornton, J.M. Understanding the Functional Roles of Amino Acid Residues in Enzyme Catalysis. Journal of molecular biology 390, 560-577 (2009) Yang, W. & Drueckhammer, D.G. Understanding the relative acyl-transfer reactivity of oxoesters and thioesters: computational analysis of transition state delocalization effects. Journal of the American Chemical Society 123, 11004-11009 (2001) Liu, B., Schofield, C.J. & Wilmouth, R.C. Structural analyses on intermediates in serine protease catalysis. Journal of Biological Chemistry 281, 24024-24035 (2006) Ngo, P.D., Mansoorabadi, S.O. & Frey, P.A. Serine Protease Catalysis: A Computational Study of Tetrahedral Intermediates and Inhibitory Adducts. J Phys Chem B 120, 7353-7359 (2016) Cleary, J.A., Doherty, W., Evans, P. & Malthouse, J.P.G. Quantifying tetrahedral adduct formation and stabilization in the cysteine and the serine proteases. Bba-Proteins Proteom 1854, 1382-1391 (2015) Scaglione, J.B. et al. Biochemical and structural characterization of the tautomycetin thioesterase: analysis of a stereoselective polyketide hydrolase. Angew Chem Int Ed Engl 49, 5726-5730 (2010) Cappadocia, L. & Lima, C.D. Ubiquitin-like Protein Conjugation: Structures, Chemistry, and Mechanism. Chem Rev 118, 889-918 (2018) Plechanovova, A., Jaffray, E.G., Tatham, M.H., Naismith, J.H. & Hay, R.T. Structure of a RING E3 ligase and ubiquitin-loaded E2 primed for catalysis. Nature 489, 115-U135 (2012) Virdee, S., Macmillan, D., & Waksman, G. (2010) Chemistry & Biology vol 17 pages 274-284 "Semisynthetic Src SH2 domains demonstrate altered phosphopeptide specificity induced by incorporation of unnatural lysine derivatives"
本発明によって提供される重要な技術的進歩は、２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）を含むポリペプチドを生産する新しい方法である。これは、従来技術において改変するのが困難又は不可能であった場所へのＤＡＰの組込み、例えば、酵素活性部位への組込みにおいて特に有用である。
これらの方法は、天然に存在する翻訳機構（例えば、細胞自体のリボソーム）を介するポリペプチドへの組込みに役立つ新しい非天然アミノ酸に基づく。これらの方法にはまた、直交性ｔＲＮＡに新しい非天然アミノ酸をチャージすることができる新しいｔＲＮＡシンテターゼが関与する。新しい非天然アミノ酸は、ポリペプチドに組み込まれると、容易に脱保護されて、ポリペプチド主鎖中にＤＡＰを残すことができる。
したがって、本発明は、従来技術の技術を使用しては現在可能でない、一連のタンパク質への及び／又はタンパク質内の一連の場所へのＤＡＰの組込みを可能にする。
したがって、一態様において、本発明は、式（Ｉ）若しくは（II）
Figure 2022505464000002
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、アミノ酸残基又はペプチドであり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル又はＣ５－２０アリールであり、
ｑは、１、２又は３であり、
Ｒ３又はＲ４はそれぞれ、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＯＣ１－６アルキル、ＳＣ１－６アルキル、ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）及びＮ（Ｃ１－６アルキル）２から独立して選択され、
Ｘは、Ｘ１－Ｙ、Ｓ－Ｓ－Ｒ５、Ｓｅ－Ｓｅ－Ｒ５、Ｏ－ＮＨ－Ｒ５、Ｓ－ＮＨ－Ｒ５、Ｓｅ－ＮＨ－Ｒ５、Ｘ２－Ｙ１、Ｘ３－Ｙ２、Ｎ３又はＮＨ－Ｓ（Ｏ）２－Ｙ３であり、
Ｘ１は、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ、ＮＨ又はＮ（Ｃ１－６アルキル）であり、
Ｘ２は、Ｓ、Ｓｅ又はＯであり、
Ｘ３は、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏであり、
Ｘ４は、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｒ５は、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＯＣ１－６アルキル、ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、ペプチド、糖、Ｃ３－２０ヘテロシクリル及び核酸から選択され、
Ｙは、
Figure 2022505464000003
から選択される保護基であり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ’、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ２Ｒ’、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’及びＮＨＲ’から選択され、
Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、Ｏ（Ｃ５－２０アリール）及びＯ（Ｃ３－２０ヘテロアリール）から独立して選択されるか、又はＲ７及びＲ８は一緒に連結されて、Ｏ－ＣＨ２－Ｏ基を形成し、
各Ｒ’は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル及びＣ５－２０アリールから独立して選択され、
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ’、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ２Ｒ’及びＣ５－２０アリールから選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル及びＣ１－６ハロアルキルから選択され、
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル及びＣ１－６ハロアルキルから選択され、
Ｘ５は、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、Ｎ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ’、Ｎ－Ｓ（Ｏ）２Ｈ、Ｎ－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’又はＮＲ’であり、
Ｙ１は、
Figure 2022505464000004
から選択される保護基であり、
Ｙ２は、
Figure 2022505464000005
、ｔ－Ｂｕ及びＣＨ２Ｐｈから選択される保護基であり、
Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又はＮ（Ｒ１３）４ ＋であり、
Ｚは、Ｓｉ又はＧｅであり、
Ｒ１２は、Ｃ１－６アルキル又はＣ（Ｏ）－（Ｃ５－２０アリール）であり、
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、アリル又はＣ５－２０アリールであり、
Ｙ３は、保護基
Figure 2022505464000006
である］
の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物を提供する。
一態様において、本発明は、前述の非天然アミノ酸を含むポリペプチドであって、前記非天然アミノ酸がペプチド結合を介して前記ポリペプチドに結合されている、ポリペプチドを提供する。
一態様において、本発明は、ＤＡＰを含むポリペプチドを調製する方法であって、前述のポリペプチドを脱保護するステップを含む、方法に関する。好適には、前記脱保護するステップは、３６５ｎｍ、３５ｍＷｃｍ－２における１分間の照射を含む。
一態様において、本発明は、変異Ｙ２７１Ｃ、Ｎ３１１Ｑ、Ｙ３４９Ｆ及びＶ３６６Ｃを含むＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼに関する。好適には、前記ＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼは、前記変異を含むメタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkerii）ＰｙｌＲＳ（ＭｂＰｙｌＲＳ）ｔＲＮＡシンテターゼである。
一態様において、本発明は、２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）を含むポリペプチドを生産する方法であって、前述の非天然アミノ酸をポリペプチドに遺伝的に組み込むステップと、前記非天然アミノ酸を脱保護して２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）にする任意のステップとを含む、方法に関する。
好適には、ポリペプチドの生産は、
（ｉ）ポリペプチドをコードする核酸を用意するステップであって、核酸が、請求項１～１０のいずれかに記載の非天然アミノ酸をコードする直交性コドンを含む、ステップと、
（ii）前記直交性コドンを認識できる直交性ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対の存在下で前記核酸を翻訳し、前記非天然アミノ酸をペプチド鎖に組み込むステップと
を含む。
好適には、前記直交性コドンは、アンバーコドン（ＴＡＧ）を含み、前記ｔＲＮＡは、ＭｂｔＲＮＡＣＵＡを含み、前記ｔＲＮＡシンテターゼは、変異Ｙ２７１Ｃ、Ｎ３１１Ｑ、Ｙ３４９Ｆ及びＶ３６６Ｃを有するＭｂＰｙｌＲＳシンテターゼを含む。
好適には、前記非天然アミノ酸は、
Figure 2022505464000007
を含む。
一態様において、本発明は、前述のポリペプチド又は前述の方法であって、前記ポリペプチドが酵素であり、前記非天然アミノ酸が、前記酵素の活性部位内のアミノ酸残基に対応する位置に組み込まれる、ポリペプチド又は方法に関する。
一態様において、本発明は、前述のペプチドであって、前記ペプチドが酵素であり、前記酵素が、International Nomenclature and Classification of EnzymesによるＥＣ３．４ペプチダーゼ、ＥＣ３．４．２２．４４ペプチダーゼ又はＥＣ２．３．２．２３ Ｅ２ユビキチン結合酵素である、ペプチドに関する。
一態様において、本発明は、１～２０個の２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）基を含む、前述のポリペプチドに関する。好適には、前記ポリペプチドは、単一の２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）基を含む。
一態様において、本発明は、前述のポリペプチド又は前述の方法であって、前記非天然アミノ酸が、野生型ポリペプチド中のシステイン、セリン又はトレオニン残基に対応する位置に、任意に野生型ポリペプチド中のシステイン又はセリン残基に対応する位置に、組み込まれるポリペプチド又は方法に関する。
一態様において、本発明は、２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）を含むポリペプチドの生産における、前述の非天然アミノ酸の使用に関する。好適には、ポリペプチドの生産は、前述の方法を実施することを含む。
一態様において、本発明は、酵素の基質を捕捉する方法であって、
ａ）活性部位に少なくとも１つの２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）基を含む酵素を用意するステップと、
ｂ）前記酵素を、前記酵素の候補基質と接触させるステップと、
ｃ）インキュベートして前記ＤＡＰ基を前記候補基質と反応させるステップと
を含む、方法である。
好適には、前記基質は代謝産物である。
好適には、前記酵素は、ペプチダーゼ、又はユビキチン結合酵素、又はヒドロラーゼ、又は炭素－硫黄結合を形成する酵素である。
次に、添付の図面を参照して、本発明の実施形態をさらに説明する。
アシル－酵素中間体を介して進行する活性部位における、システイン及びセリン求核剤を有する酵素の一般的なメカニズムを示す図である。 ａ、ｂ， 活性部位のセリン又はシステイン求核剤は、カルボニル基と反応して、Ｒ１－ＸＨ（式中、Ｘは通常、ＮＨ、Ｏ、Ｓである）の喪失によって崩壊してアシル－酵素中間体となる四面体の中間体（図示せず）を形成する。求核性Ｒ３（通常、ヒドロキル、アミン又はチオール）によるアシル－酵素中間体の攻撃により、結合した基質断片が放出され、酵素が再生される。ｃ， システイン又はセリンを２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）で置き換えると、切断に対して抵抗性の第１のアシル－酵素中間体へと進行する酵素が作製され得る。 バリノマイシンシンテターゼ及び提示される、バリノマイシンの生合成を示す図である。 バリノマイシンシンテターゼのサブユニットＶｌｍ１及びＶｌｍ２は、Ｄ－α－ヒドロキシイソ吉草酸（Ｄ－α－ｈｉｖ）、Ｄ－バリン（Ｄ－ｖａｌ）、Ｌ－乳酸（Ｌ－ｌａｃ）及びＬ－バリン（Ｌ－ｖａｌ）を逐次的に縮合させて、テトラデプシペプチジル（Ｄ－ｈｉｖ－Ｄ－ｖａｌ－Ｌ－ｌａｃ－Ｌ－ｖａｌ）中間体を形成する。Ｄ－α－ｈｉｖ及びＬ－ｌａｃは、ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインを含む、特殊なモジュール１及び３による、それらの前駆体ケト酸の選択及びケト還元によって生じる。テトラデプシペプチジル中間体がオリゴマー化されてオクタデプシペプチジル中間体及び次いでドデカデプシペプチジル中間体となり、ドデカデプシペプチジル中間体は末端チオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインによって環化されて、バリノマイシンを産生する。Ａ：アデニル化ドメイン、ＰＣＰ：ペプチジル担体タンパク質ドメイン；Ｃ：縮合ドメイン。カノニカルなＮＲＰＳの合成サイクルについては、補足図１を参照のこと。 ～ 組換えタンパク質へのＤＡＰ組込みの遺伝的指示を示す図である。 ａ， 本明細書中で検討したＤＡＰ及び保護バージョンの構造。１： ２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）。２： （Ｓ）－３－（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）－２－アミノプロパン酸。３： （Ｓ）－２－アミノ－３－（（２－ニトロベンジル）アミノ）プロパン酸。４： （２Ｓ）－２－アミノ－３－（（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル）アミノ）プロパン酸。５： （２Ｓ）－２－アミノ－３－（（（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸。６： （２Ｓ）－２－アミノ－３－（（（２－（（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル）チオ）エトキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸。ｂ～ｆ， 抽出物に対して行った、ＬＣ－ＭＳアッセイによる化合物２～６の細胞内濃度の決定。ダークブルー色のトレースは、各化合物について１００μＭ標準物質を表す。ライトブルー色のトレースは、各化合物について１０μＭ標準物質を表す。赤色のトレースは、化合物の非存在下で増殖させた細胞に起因する。茶色のトレースは、化合物の非存在下で増殖させたが、１０μＭまでの化合物でスパイクされた細胞に起因する。緑色のトレースは、１ｍＭの化合物の存在下で増殖させた細胞に起因する。ｇ， ＤＡＰＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対の表現型決定。ＤＡＰＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対及びｃａｔ（１１２ＴＡＧ）を含む細胞を、６の存在下又は非存在下で、示された濃度のクロラムフェニコールにおいてプレーティングした。ｈ， １５０位に６又はＢｏｃＫのいずれかを含むｓｆＧＦＰの発現。発現及び精製後、等容量のタンパク質溶液をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードし、クーマシー染色するか（上部ゲル）、又はα－Ｈｉｓ抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した（下部ゲル）。ｉ， コードされた６がＵＶ光で脱保護されて、中間体（赤）となり、それが自然に断片化して、ＤＡＰが露出された。ｊ， ｓｆＧＦＰにおける６の脱保護に続いて、ＥＳＩ－ＭＳ分析を行った。緑色のトレース：１５０位に６を含む精製ｓｆＧＦＰ：予想質量：２８０９６．２７Ｄａ；実測質量：２８０９７．２１Ｄａ。赤色のトレース：６を中間体に変換するための照射後の、６を含むｓｆＧＦＰ：予想質量：２７９０２．２２Ｄａ；実測質量：２７９０４．１４Ｄａ。青色のトレース：照射（６を中間体に変換するための）及び中間体をＤＡＰ（１）に変換するためのさらなるインキュベーション後の、６を含むｓｆＧＦＰ：予想質量：２７７９８．２３Ｄａ；実測質量：２７８００．８８Ｄａ。各トレースはまた、Ｎ末端メチオニンの自然消失によって生じるタンパク質付加物の質量を示す。 ～ ＴＥＶ（Ｃ１５１ＤＡＰ）によりアシル－酵素中間体を安定的にトラップすることを示す図である。 図４ａは、ＴＥＶプロテアーゼの示されたバリアントを、Ｕｂ－ｔｅｖ－Ｈｉｓと共にインキュベートしたことを示す。ＴＥＶ（ｗｔ）の使用は、ＴＥＶ切断配列の切断を生じる。ＴＥＶ（Ｃ１５１Ａ）の使用は最小切断を生じる。ＴＥＶの活性部位におけるＤＡＰの存在は、クーマシーゲルに新しいバンドの存在をもたらし、これは、イソペプチド連結ＴＥＶ（Ｃ１５１ＤＡＰ）－Ｕｂ複合体（左）を表す。反応のαＵｂ及びαＳｔｒｅｐウエスタンブロットにより、複合体の同一性が確認される（ＴＥＶコンストラクトは、Ｓｔｒｅｐタグを含む）。図４ｂは、イソペプチド連結ＴＥＶ（Ｃ１５１ＤＡＰ）－Ｕｂ複合体のタンデム質量分析を示す。タンデム質量分析は、所望の部位におけるＤＡＰ修飾(modification)及び残基上の予想されるｔｅｖ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ修飾を、はっきりと同定し、これは、ＤＡＰ上のＵｂ捕捉と一致する。 テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣからＶｌｍ ＴＥによって作られた小分子生成物がオリゴマー化経路を明確化することを示すグラフである。 テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７（１．７ｍＭ）とＶｌｍ ＴＥ（６．５μＭ）との反応のＨＲ－ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳからの抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）。ａ， ＴＥｗｔは主生成物としてバリノマイシンを産生する。オクタデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １１、ドデカデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １５、及び１６量体デプシペプチジル－ＳＮＡＣ １９の存在により、補足図１０ｂのオリゴマー化のシナリオが確認される。ｂ， ＴＥＤＡＰは少量のオクタデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １１を産生する。ｃ， 酵素を含まない対照反応は、溶液中のチオエステルの無触媒加水分解に由来する可能性が高い少量のテトラデプシペプチド９を示す。各化合物の正確な質量分析及びｍ／ｚ計算値からの偏差に関しては、補足表２を参照。 ～ ＴＥＤＡＰの複合体の結晶構造を示している。 ａ， ＴＥｗｔの代表的な電子密度（１．０σにおいて輪郭が描かれた２ｍＦｏ－ＤＦｃマップ）。ｂ， ＴＥｗｔの構造。リッド（灰色）はほぼ完全に秩序化されているが、タンパク質のコアよりも高いＢ因子を有する。ｃ， ＴＥＤＡＰのデコンボリューション質量スペクトル。ｄ， デオキシ－テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ８と共にインキュベートされたＴＥＤＡＰのデコンボリューション質量スペクトル。ｅ， バリノマイシンと共にインキュベートされたＴＥＤＡＰのデコンボリューション質量スペクトル。ｆ及びｇ， テトラデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ（ｆ）及びドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ（ｇ）のデプシペプチド残基に関する不偏ｍＦｏ－ＤＦｃ電子密度マップ（緑色のメッシュ、２．５σ）。アミド結合が、ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ、茶色のスティック）及びデプシペプチド残基（シアン色のスティック）を連結させる。ｈ及びｉ， テトラデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ（ｈ）及びドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ（ｉ）複合体の活性部位。ＤＡＰ及びｖａｌ４（ｈ）又はｖａｌ１２（ｉ）によって形成されたアミドのカルボニル酸素は、Ａ２３９９及びＬ２４６４の主鎖アミンによって形成されたオキシアニオンホールに近接して位置付けられている。触媒三残基Ｈ２６２５及びＤ２４９０がスティックで示されている。ｊ， テトラデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰのリッドは、ＴＥｗｔに見られるものと類似した位置にあるが、ｋ， ドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰの全ての結晶学的に独立した分子（Ｐ１及びＨ３空間群構造から）は、ＴＥｗｔに見られるものとははっきり異なる、一連の類似したコンフォメーションである。ｌ， テトラデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ及びドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰの構造間におけるリッドヘリックスＬα１～Ｌα４の実質的なコンフォメーション変化の図解。わかりやすくするために、可動ヘリックスは、徐々に波長が高くなる色で示されている。 ＰＣＰドメインとＴＥドメインとの相互作用のモデル化及び推定上の経路を示す図である。 ａ， ドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰとＥｎｔＦ ＰＣＰ－ＴＥジドメインとの構造との重ね合わせ（Liu, Y., Zheng, T. & Bruner, S.D. Structural basis for phosphopantetheinyl carrier domain interactions in the terminal module of nonribosomal peptide synthetases. Chemistry & biology 18, 1482-1488 (2011)）が、活性部位へのＰＰＥ部分の進路を示す。ｂ， リッドは、ドデカデプシペプチドが直線的に伸長するのを立体的に防ぎ、この立体ブロック及びリッドとドデカデプシペプチドとの非常に疎水性の大きい非特異的相互作用により、カールバック（curling back）に好都合に働く。ｃ， オクタデプシペプチジル－ＴＥから始まるオリゴマー化及び環化の仮説上の経路。ｉ， 観察されるアポ／テトラデプシペプチドのコンフォメーションにおけるＬα１の位置が、ペプチドコンフォメーションの伸長を促進している。ii， テトラデプシペプチジル－ＰＣＰは、ＰＣＰドメインに結合した約３０Åのテトラデプシペプチジル－ＰＰＥを収容しそれを活性部位に向けて導くことができるであろう、ドデカデプシペプチド様リッドのコンフォメーションをおそらく使用して、その末端ヒドロキシルにオクタデプシペプチドを受け入れる。iii， ＰＣＰドメインは、Ｓｅｒ２４６３に戻すためのチオエステルを提示する。iv， 最後に、ドデカデプシペプチド－ＴＥＤＡＰ構造において観察されるリッドのコンフォメーションは、環化のためにドデカデプシペプチドをＳｅｒ２４６３に向かってカールバックするのに役立つことができるであろう。 ～ 補足図１である。 ～ 補足図２である。 補足図３である。 ～ 補足図４である。 補足図５である。 ～ 補足図６である。 ～ 補足図７である。 補足図８である。 補足図９である。 補足図１０である。 補足図１１である。 補足図１２である。 補足図１３である。 補足図１４である。 補足図１５である。 ～ 写真を示す図である。ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）を用いたユビキチン化試験。Ａ： Ｕｂ及びβ－メルカプトエタノールの存在下及び非存在下における、ＵＢＥ２Ｌ３（ｗｔ）、ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６Ａ）又はＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）のいずれかを用いたユビキチン化反応のクーマシー染色。Ｕｂ及びβ－メルカプトエタノールの存在下又は非存在下における、ＵＢＥ２Ｌ３（ｗｔ）、ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６Ａ）又はＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）のいずれかを用いたユビキチン化反応のαＨＡ（Ｂ）及びαＵＢＥ２Ｌ３（１１１－１２５）（Ｃ）ウエスタンブロット。Ｕｂ－ＵＢＥ２Ｌ３：チオエステル連結（ＵＢＥ２Ｌ３［ｗｔ］）又はイソペプチド連結（ＵＢＥ２Ｌ３［Ｃ８６ＤＡＰ］）Ｅ２－Ｕｂ複合体。ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）とＵｂの間に形成された複合体は、β－メルカプトエタノールの存在に感受性でなく、これは、β－メルカプトエタノールの存在下で低減されるＵＢＥ２Ｌ３（ｗｔ）とＵｂとの複合体とは異なる。 写真を示す図である。 写真を示す図である。
ここで、本発明者らは、遺伝的にコードされた２，３－ジアミノプロピオン酸がどのように酵素反応の構造的洞察を可能にするかを開示する。特に、本発明者らは、バリノマイシンの生合成におけるアシル－チオエステラーゼ中間体を介するこのアプローチを例示する。
本発明は、（例えば）大腸菌（E.coli）において産生される組換えタンパク質への２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）の効率的な組込みを遺伝的に指示する戦略を可能にする。本発明者らは、触媒残基、例えば、システイン又はセリン残基をＤＡＰでどのように置き換えるかを教示する。これは、安定なアミド結合を介して連結されているアシル－酵素複合体の効率的な捕捉を可能にする。
例えば、バリノマイシンシンテターゼ（Ｖｌｍ ＴＥ、valinomycin synthetase）のチオエステラーゼドメインが、直鎖テトラデプシペプチドのドデカデプシペプチドへの逐次三量体化と、ドデカデプシペプチドのバリノマイシンへの逐次環化の両方を促進する生合成経路を解明することによって、本発明を実証する。ＤＡＰコンジュゲートとしてのＶｌｍ ＴＥの触媒サイクルにおける最初及び最後のアシル－ＴＥ中間体を捕捉することによって、本発明の使用は、ＮＲＰＳのＴＥドメインのコンフォメーション変化が直鎖基質のオリゴマー化から環化への切り替えをどのように制御するかについての構造的洞察を提供する。本発明によって可能になるこのような戦略は、多様なアシル－酵素中間体の特徴付けを容易にすることに用途を見出す。さらに、本発明は、機能が知られていない酵素に対するネイティブ基質の捕捉及び同定を可能にすることに用途を見出す。
一態様において、本発明は、前述の同種組換えポリペプチドに関する。好適には、前記ポリペプチドは、前述の方法によって作られる。
一態様において、本発明は、本明細書中に記載された方法に従って生産されたポリペプチドに関する。これらの新しい方法の生成物であるということだけでなく、このようなポリペプチドは、前述の非天然アミノ酸を含む又はＤＡＰを含むという技術的特徴を有する。
変異は、当技術分野におけるその普通の意味を有し、言及される残基、モチーフ又はドメインの置換、トランケーション又は欠失を指し得る。変異は、ポリペプチドレベルで、例えば、変異配列を有するポリペプチドの合成によって行ってもよいし、又はヌクレオチドレベルで、例えば、変異配列をコードする核酸であって、その後に翻訳されて変異ポリペプチドを産生し得る核酸を作ることによって行ってもよい。アミノ酸が所与の変異部位の置換アミノ酸と特定されない場合、好適には、前記部位のランダム化を使用する。デフォルトの変異として、アラニン（Ａ）を使用し得る。好適には、特定の部位において使用する変異は、本明細書中に記載する通りである。
断片は、長さが、好適には少なくとも１０アミノ酸、好適には少なくとも２５アミノ酸、好適には少なくとも５０アミノ酸、好適には少なくとも１００アミノ酸、好適には少なくとも２００アミノ酸、好適には少なくとも２５０アミノ酸、好適には少なくとも３００アミノ酸、好適には少なくとも３１３アミノ酸、又は好適には目的のポリペプチドの大部分である。
本発明の方法は、インビボでも又はインビトロでも実施できる。
一実施形態において、好適には、本発明の方法は、人体又は動物体には適用されない。好適には、本発明の方法は、インビトロの方法である。好適には、この方法は、人体又は動物体の存在を必要としない。好適には、この方法は、人体又は動物体の診断又は手術又は治療の方法ではない。
用語「含む（comprises）」（comprise、comprising）は、当技術分野におけるその普通の意味、すなわち、述べられた特徴又は特徴の群が含まれるという意味を有すると理解すべきであるが、この用語は、任意の他の述べられた特徴又は特徴の群もまた存在することを排除するものではない。
ＤＡＰの組込み
本発明者らは、スルフヒドリル又はヒドロキシル基をアミノ基で置き換える、触媒システイン又はセリン残基の、アミノ酸での選択的な置き換えが、アミド結合を介して連結されたアシル－酵素中間体の捕捉を可能にすると仮定した（図１ｃ）。リジン側鎖のアミンの共役酸は１０．５のｐＫａを有するのに対し、ＤＡＰのベータアミノ基の共役酸のＰＫａは９．４である（Hay, R.W. & Morris, P.J. Interaction of Dl-2,3-Diaminopropionic Acid and Its Methyl Ester with Metal Ions .1. Formation Constants. J Chem Soc A, 3562-& (1971)）。さらに、ＤＡＰがペプチドに組み込まれると、ｐＫａは、主鎖アミドの電子求引効果によって実質的に低下する：ＤＡＰのカルボキシレートへの単一のペプチド結合は、ベータアミノ基の共役酸のｐＫａを７．５に低下させ（Lan, Y. et al. Incorporation of 2,3-Diaminopropionic Acid into Linear Cationic Amphipathic Peptides Produces pH-Sensitive Vectors. Chembiochem 11, 1266-1272 (2010)）、より長いペプチドにおいては６．３のｐＫａが報告された（Lan, Y. et al. Incorporation of 2,3-Diaminopropionic Acid into Linear Cationic Amphipathic Peptides Produces pH-Sensitive Vectors. Chembiochem 11, 1266-1272 (2010)）。したがって、本発明者らは、ＤＡＰを使用して、酵素の活性部位内のＣｙｓ又はＳｅｒを置き換えたならば、ＤＡＰ側鎖のかなりの部分が生理的ｐＨにおいて中性アミンとして存在すると予想した。これらのアミンは、求核剤として作用するのに利用でき、酵素の基質とアミド結合を形成し得る。水溶液中におけるアミンの半減期はほぼ５００年程度であり（Radzicka, A. & Wolfenden, R. Rates of uncatalyzed peptide bond hydrolysis in neutral solution and the transition state affinities of proteases. Journal of the American Chemical Society 118, 6105-6109 (1996)）、本発明者らは、不安定なチオエステル及びエステル中間体のアミド類似体が実質的に安定化され、それによって求核剤又は溶媒との後続反応が進行しないか又は大幅に減弱されると予想した（図１ｃ）。
二次代謝産物を産生する巨大酵素である非リボソーム性ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）及びポリケチドシンセターゼ（ＰＫＳ、polyketide synthase）は、それらの合成サイクルにおいて非常に複雑なアシル－酵素中間体を生成する。これらの分子機械は、チオテンプレート生合成経路を使用して、小さいアシル分子を組み立てて、臨床的な抗がん剤、抗生物質、抗真菌剤及び免疫抑制剤を含む、広範な生物学的に活性な天然産物にする（補足図１）。それらの詳細な分子機能を解き明かそうとする従来技術の試みは、それらの複数のアシル－酵素中間体を高分解能で特徴付けるという難題によって妨げられてきた。この難題は、直鎖ペプチジル又はデプシペプチジル基質をオリゴマー化又は環化するＮＲＰＳ経路からのチオエステラーゼ（ＴＥ、thioesterase）ドメインによって例示される。これらのＴＥドメインは、抗生物質であるグラミシジンＳ（Hoyer, K.M., Mahlert, C. & Marahiel, M.A. The iterative gramicidin s thioesterase catalyzes peptide ligation and cyclization. Chemistry & biology 14, 13-22 (2007)）、嘔吐毒素であるセレウリド（Alonzo, D.A., Magarvey, N.A. & Schmeing, T.M. Characterization of cereulide synthetase, a toxin-producing macromolecular machine. PloS one 10, e0128569 (2015)、Magarvey, N.A., Ehling-Schulz, M. & Walsh, C.T. Characterization of the cereulide NRPS alpha-hydroxy acid specifying modules: activation of alpha-keto acids and chiral reduction on the assembly line. Journal of the American Chemical Society 128, 10698-10699 (2006)）、シデロフォアであるエンテロバクチン及びバチリバクチン（Shaw-Reid, C.A. et al. Assembly line enzymology by multimodular nonribosomal peptide synthetases: the thioesterase domain of E. coli EntF catalyzes both elongation and cyclolactonization. Chemistry & biology 6, 385-400 (1999)、May, J.J., Wendrich, T.M. & Marahiel, M.A. The dhb operon of Bacillus subtilis encodes the biosynthetic template for the catecholic siderophore 2,3-dihydroxybenzoate-glycine-threonine trimeric ester bacillibactin. J Biol Chem 276, 7209-7217 (2001)）、抗がん性のコングロバチン（Zhou, Y. et al. Iterative Mechanism of Macrodiolide Formation in the Anticancer Compound Conglobatin. Chemistry & biology 22, 745-754 (2015)）、ＤＮＡビスインターカレーターであるチオコラリン（Robbel, L., Hoyer, K.M. & Marahiel, M.A. TioS T-TE--a prototypical thioesterase responsible for cyclodimerization of the quinoline- and quinoxaline-type class of chromodepsipeptides. FEBS J 276, 1641-1653 (2009)）並びに抗菌性、抗腫瘍性及び細胞毒性を有するカリウムイオノフォアデプシペプチドであるバリノマイシン（Magarvey, N.A., Ehling-Schulz, M. & Walsh, C.T. Characterization of the cereulide NRPS alpha-hydroxy acid specifying modules: activation of alpha-keto acids and chiral reduction on the assembly line. Journal of the American Chemical Society 128, 10698-10699 (2006)、Jaitzig, J., Li, J., Sussmuth, R.D. & Neubauer, P. Reconstituted biosynthesis of the nonribosomal macrolactone antibiotic valinomycin in Escherichia coli. ACS Synth Biol 3, 432-438 (2014)）の生合成に関与する。それらは最初に、それらのペプチジル中間体を、生物活性化合物において見られるコピー数まで、しかしそれを超えずに、オリゴマー化し、次いで、完成生成物の最終放出及び環化を触媒しなければならない。さらに、合成サイクルに再組込みすることができないために役に立たない副生物である、遊離の直鎖ペプチドが自然加水分解によって実質的に形成されないように、必要とされるオリゴマー化及び環化は十分に高速でなければならない。
アシル－ＴＥ中間体の高分解能構造は、ＴＥが基質の運命をどのように制御するかについての機構的洞察を提供し、実質的な進歩に相当するであろう。一握りの高分解能アシル－ＴＥ構造が得られており、中でも最も注目すべきはポリケチドであるピクロマイシンを形成するＴＥ及び非ネイティブ基質類似体に関するものである（Akey, D.L. et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nat Chem Biol 2, 537-542 (2006)）。これらは、推定上のオキシアニオンホールの同定に役立ち、ＴＥドメインの「リッド」要素と基質との相互作用を実証した。ＴＥドメインの構造研究は、小分子基質の低いＫｄ値の組合せ（Samel, S.A., Wagner, B., Marahiel, M.A. & Essen, L.O. The thioesterase domain of the fengycin biosynthesis cluster: a structural base for the macrocyclization of a non-ribosomal lipopeptide. Journal of molecular biology 359, 876-889 (2006)）、ＴＥドメインへの結合時におけるペプチド鎖の複数のコンフォメーション（Tseng, C.C. et al. Characterization of the surfactin synthetase C-terminal thioesterase domain as a cyclic depsipeptide synthase. Biochemistry 41, 13350-13359 (2002)、Bruner, S.D. et al. Structural basis for the cyclization of the lipopeptide antibiotic surfactin by the thioesterase domain SrfTE. Structure 10, 301-310 (2002)）、及び特に、結晶学的な時間的尺度と比較して高速であるアシル－ＴＥ中間体の加水分解速度（Samel, S.A., Wagner, B., Marahiel, M.A. & Essen, L.O. The thioesterase domain of the fengycin biosynthesis cluster: a structural base for the macrocyclization of a non-ribosomal lipopeptide. Journal of molecular biology 359, 876-889 (2006)、Bruner, S.D. et al. Structural basis for the cyclization of the lipopeptide antibiotic surfactin by the thioesterase domain SrfTE. Structure 10, 301-310 (2002)）が組み合わさることによって妨げられてきた。これらは、従来技術のアプローチに関連する課題である。
本発明によって提供される安定なアシル－ＴＥ中間体にアクセスする能力は、非リボソーム性ペプチドの生合成並びにポリケチド及び脂肪酸の生合成におけるＴＥドメイン選択性のメカニズムを、当業者が特徴付けできるようにする意味ある利点である。
以下により詳細に記載するように、本発明者らは、温和な条件下でＤＡＰに翻訳後変換され得るアミノ酸を組み込んでいるアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を進化させた。本発明者らは、大腸菌において産生された組込みタンパク質へのＤＡＰの部位特異的組込みへのこの対の使用を実証する。本発明者らは、システインプロテアーゼ及びＮＲＰＳ ＴＥドメインに関するアシル－酵素中間体の効率的な捕捉を実証する。バリノマイシンシンテターゼ（Ｖｌｍ）、２－タンパク質、４－モジュールＮＲＰＳは、ヒドロキシ酸（アルファ－ケト酸のインサイチュ還元に由来する）及びアミノ酸をテトラデプシペプチド中間体に代替的に連結し、ＴＥドメイン（Ｖｌｍ ＴＥ）が漸進的にドデカデプシペプチドへと三量体化し、次いで関してバリノマイシンを生じることが提示されている（Magarvey, N.A., Ehling-Schulz, M. & Walsh, C.T. Characterization of the cereulide NRPS alpha-hydroxy acid specifying modules: activation of alpha-keto acids and chiral reduction on the assembly line. Journal of the American Chemical Society 128, 10698-10699 (2006)、Jaitzig, J., Li, J., Sussmuth, R.D. & Neubauer, P. Reconstituted biosynthesis of the nonribosomal macrolactone antibiotic valinomycin in Escherichia coli. ACS Synth Biol 3, 432-438 (2014)）（図２）。
本発明者らは、テトラデプシペプチドをバリノマイシンに変換するための生合成経路を解明するのに使用される本発明を実証する。Ｖｌｍ ＴＥ中の触媒セリンをＤＡＰで置き換えることによって、本発明者らは、安定なデオキシ－テトラデプシペプチジル－Ｎ－ＴＥＤＡＰ及びドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰコンジュゲートにどのようにアクセスするかを実証する。これらのコンジュゲートの構造的特徴付けは、Ｖｌｍ ＴＥの触媒サイクルにおける最初及び最後のアシル－ＴＥ中間体についての洞察を提供する。したがって、本発明は、基質の運命が、直鎖前駆体をオリゴマー化及び環化するＮＲＰＳのＴＥドメインのコンフォメーション変化によってどのように決定され得るかを検討し／明らかにすることに用途を見出す。
好適には、ポリペプチドは、前述した単一のＤＡＰ基及び／又は非天然アミノ酸の残基を含む。これは、前述したＤＡＰ基／非天然アミノ酸を対象とする可能性がある、あらゆるさらなる化学修飾に対する特異性、並びに／又はＤＡＰが酵素の活性部位に存在する場合における捕捉の特異性を維持するという利点を有する。例えば、目的のポリペプチド中に前述した単一のＤＡＰ基／非天然アミノ酸しか存在しない場合には、部分修飾／又は部分脱保護の問題、又は同じポリペプチド中の代わりのＤＡＰ基間で異なる反応微小環境の問題（これは、ポリペプチドの異なる場所にある異なるＤＡＰ基間に不等な反応性をもたらす可能性がある）の可能性が有利に回避される。
好適には、ポリペプチドは２個のＤＡＰ基を含み；好適には、ポリペプチドは３個のＤＡＰ基を含み；好適には、ポリペプチドは４個のＤＡＰ基を含み；好適には、ポリペプチドは５個のＤＡＰ基を含み；好適には、ポリペプチドは１０個又はさらにはそれ以上のＤＡＰ基、例えば、１５～２０個のＤＡＰ基を含む。最も好適には、ポリペプチドは１～５個のＤＡＰ基を含む。最も好適には、ポリペプチドは１個のＤＡＰ基を含む。
原則として、前述の複数の非天然アミノ酸（同じ非天然アミノ酸の複数のコピー又は２種若しくは３種以上の異なる非天然アミノ酸のそれぞれの１つ若しくは２つ以上のコピーのいずれか）が、同じ又は異なる直交性コドン／直交性ｔＲＮＡ対によって組み込まれる可能性がある。好適には、複数の非天然アミノ酸が（前述の直交性ｔＲＮＡシンテターゼと一緒に）、複数のアンバーコドンの挿入／翻訳によって組み込まれる。
新規化学物質（ＮＣＥ）
新規化学物質（ＮＣＥ、novel chemical entity）は、従来の方法で一般式を用いて本明細書中に記載される。式（Ｉ）若しくは（II）
Figure 2022505464000008
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、アミノ酸残基又はペプチドであり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル又はＣ５－２０アリールであり、
ｑは、１、２又は３であり、
Ｒ３又はＲ４はそれぞれ、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＯＣ１－６アルキル、ＳＣ１－６アルキル、ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）及びＮ（Ｃ１－６アルキル）２から独立して選択され、
Ｘは、Ｘ１－Ｙ、Ｓ－Ｓ－Ｒ５、Ｓｅ－Ｓｅ－Ｒ５、Ｏ－ＮＨ－Ｒ５、Ｓ－ＮＨ－Ｒ５、Ｓｅ－ＮＨ－Ｒ５、Ｘ２－Ｙ１、Ｘ３－Ｙ２、Ｎ３又はＮＨ－Ｓ（Ｏ）２－Ｙ３であり、
Ｘ１は、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ、ＮＨ又はＮ（Ｃ１－６アルキル）であり、
Ｘ２は、Ｓ、Ｓｅ又はＯであり、
Ｘ３は、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏであり、
Ｘ４は、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｒ５は、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＯＣ１－６アルキル、ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、ペプチド、糖、Ｃ３－２０ヘテロシクリル及び核酸から選択され、
Ｙは、
Figure 2022505464000009
から選択される保護基であり、
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ’、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ２Ｒ’、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’及びＮＨＲ’から選択され、
Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、Ｏ（Ｃ５－２０アリール）及びＯ（Ｃ３－２０ヘテロアリール）から独立して選択されるか、又はＲ７及びＲ８は一緒に連結されて、Ｏ－ＣＨ２－Ｏ基を形成し、
各Ｒ’は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル及びＣ５－２０アリールから独立して選択され、
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ’、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ２Ｒ’及びＣ５－２０アリールから選択され、
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル及びＣ１－６ハロアルキルから選択され、
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル及びＣ１－６ハロアルキルから選択され、
Ｘ５は、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、Ｎ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ’、Ｎ－Ｓ（Ｏ）２Ｈ、Ｎ－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’又はＮＲ’であり、
Ｙ１は、
Figure 2022505464000010
から選択される保護基であり、
Ｙ２は、
Figure 2022505464000011
、ｔ－Ｂｕ及びＣＨ２Ｐｈから選択される保護基であり、
Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又はＮ（Ｒ１３）４ ＋であり、
Ｚは、Ｓｉ又はＧｅであり、
Ｒ１２は、Ｃ１－６アルキル又はＣ（Ｏ）－（Ｃ５－２０アリール）であり、
Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、アリル又はＣ５－２０アリールであり、
Ｙ３は、保護基
Figure 2022505464000012
である］
の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物が記載される。
用語「又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物」は、示された構造の塩、溶媒和物、互変異性体、異性体形態も含まれることを意味する。その混合物は、これらの形態の混合物が存在すること、例えば、本発明の化合物が互変異性体の塩を含み得ることを意味する。
「薬学的に許容される」物質は、健全な医学的判断の範囲内で、対象の組織と接触して使用するのに好適であって、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがなく、合理的な利益対リスク比に相応し、それらの意図された使用に効果的な物質を指す。
「医薬組成物」は、１種又は２種以上の原薬と１種又は２種以上の賦形剤との組合せを指す。
本明細書中で使用するように、「溶媒和物」は、溶質（例えば、式（Ｉ）～（II）又は本明細書中の任意の他の化合物若しくはその塩）と溶媒によって形成された可変化学量論の複合体(complex of variable stoichiometry)を指す。薬学的に許容される溶媒和物は、結晶化の間中に溶媒分子が結晶格子中に組み込まれる結晶化合物の場合に形成され得る。組み込まれる溶媒分子は、水分子又は非水分子、例えば、これらに限定されないが、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、酢酸、エタノールアミン及び酢酸エチル分子であり得る。
「独立して選択される」は、例えば、「Ｒ３又はＲ４はそれぞれ、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルキル、．．．から独立して選択され」という文脈に関連して使用され、官能基の各事例、例えば、Ｒ３が、列挙された選択肢から、化合物中のＲ３又はＲ４のあらゆる他の事例とは独立して選択されることを意味する。したがって、例えば、化合物中のＲ３の第１の事例ではＨが選択され得、化合物中のＲ３の次の事例ではメチルが選択され得、化合物中のＲ４の第１の事例ではエチルが選択され得る。
本明細書中で、Ｃ１－６アルキルは、一般に１～６個の炭素原子を有する、直鎖及び分枝飽和炭化水素基、より好適には、Ｃ１－５アルキル、より好適にはＣ１－４アルキル、より好適にはＣ１－３アルキルを指す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチル、ペンタ－１－イル、ペンタ－２－イル、ペンタ－３－イル、３－メチルブタ－１－イル、３－メチルブタ－２－イル、２－メチルブタ－２－イル、２，２，２－トリメチルエタ－１－イル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチルなどが挙げられる。
本明細書中で、「アミノ酸残基」は、アミノ酸のアミン又はカルボン酸末端のいずれかがペプチド結合で置き換えられているアミノ酸を指す。
Ｃ５－２０アリールは、少なくとも１つの芳香環を有し、それらの環員を構成する特定の数の炭素原子を有する、完全に不飽和の単環式、二環式及び多環式芳香族炭化水素を指す（例えば、Ｃ６－１４アリールは、環員として６～１４個の炭素原子を有するアリール基を指す）。アリール基は、そのような結合又は置換が原子価要件に反しない限り、任意の環原子において親基又は基質に結合でき、１つ又は２つ以上の非水素置換基を含むことができる。アリール基の例としては、フェニル、ビフェニル、シクロブタベンゼニル、ナフタレニル、ベンゾシクロヘプテニル、アズレニル、ビフェニレニル、アントラセニル、フェナントレニル、ナフタセニル、ピレニル、シクロヘプタトリエンカチオンに由来する基などが挙げられる。少なくとも１つが芳香環である縮合環を含むアリール基の例としては、これらに限定されないが、インダニル、インデニル、イソインデニル、テトラリニル、アセナフテニル、フルオレニル、フェナレニル、アセフェナントレニル及びアセアントレニルが挙げられる。
「ハロ」又は「ハロゲン」は、－Ｆ、－ＣＩ、－Ｂｒ又は－Ｉを指す。
「Ｃ１－６ハロアルキル」は、水素原子のうちの１つ又は２つ以上がハロ原子で置き換えられているＣ１－６アルキル基に由来する基を指す。好適には、Ｃ１－６ハロアルキルは、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３、ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨＣｌ２又はＣＣｌ３である。
「Ｃ３－２０ヘテロアリール」は、炭素又はヘテロ原子のいずれであろうと、３～２０個の環原子を含み、そのうち１～１０個が環ヘテロ原子である、不飽和の単環式、二環式及び多環式芳香族基を指す。好適には、各環は、３～７個の環原子及び１～４個のヘテロ原子を有する。好適には、各環ヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される。二環式及び多環式は、前記で列挙した単環式複素環のいずれかがベンゼン環に縮合している、あらゆる二環式又は多環式基を含み得る。ヘテロアリール基は、そのような結合又は置換が原子価要件に反しない又は化学的に不安定な化合物をもたらさない限り、任意の環原子において親基又は基質に結合でき、１つ又は２つ以上の非水素置換基を含むことができる。
単環式ヘテロアリール基の例としては、これらに限定されないが、以下に由来するものが挙げられる：
Ｎ１： ピロール、ピリジン；
Ｏ１： フラン；
Ｓ１： チオフェン；
Ｎ１Ｏ１： オキサゾール、イソオキサゾール、イソオキサジン；
Ｎ２Ｏ１： オキサジアゾール（例えば、１－オキサ－２，３－ジアゾリル、１－オキサ－２，４－ジアゾリル、１－オキサ－２，５－ジアゾリル、１－オキサ－３，４－ジアゾリル）；
Ｎ３Ｏ１： オキサトリアゾール；
Ｎ１Ｓ１： チアゾール、イソチアゾール；
Ｎ２： イミダゾール、ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン（例えば、シトシン、チミン、ウラシル）、ピラジン；
Ｎ３： トリアゾール、トリアジン；及び
Ｎ４： テトラゾール。
縮合環を含むヘテロアリールの例としては、これらに限定されないが、以下に由来するものが挙げられる：
Ｏ１： ベンゾフラン、イソベンゾフラン、クロメン、イソクロメン、クロマン、イソクロマン、ジベンゾフラン、キサンテン；
Ｎ１： インドール、イソインドール、インドリジン、イソインドリン、キノリン、イソキノリン、キノリジン、カルバゾール、アクリジン、フェナントリジン；
Ｓ１： ベンゾチオフラン、ジベンゾチオフェン、チオキサンテン；
Ｎ１Ｏ１： ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾオキサジン、フェノキサジン；
Ｎ１Ｓ１： ベンゾチアゾール、フェノチアジン；
Ｏ１Ｓ１： フェノキサチイン；
Ｎ２： ベンゾイミダール、インダゾール、ベンゾジアジン、ピリドピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、フタラジン、ナフチリジン、ベンゾジアゼピン、カルボリン、ペリミジン、ピリドインドール、フェナジン、フェナントロリン、フェナジン；
Ｏ２： ベンゾジオキソール、ベンゾジオキサン、オキサントレン；
Ｓ２： チアントレン；
Ｎ２Ｏ１： ベンゾフラザン；
Ｎ２Ｓ１： ベントチアジアゾール；
Ｎ３： ベンゾトリアゾール；
Ｎ４： プリン（例えば、アデニン、グアニン）、プテリジン。
「Ｃ３－２０ヘテロシクリル」は、炭素原子又はヘテロ原子のいずれであろうと、３～２０個の環原子から構成され、そのうち１～１０個が環ヘテロ原子である、環原子を有する、飽和又は部分不飽和の単環式、二環式及び多環式基を指す。好適には、各環は３～７個の環原子及び１～４個のヘテロ原子を有する（例えば、好適には、Ｃ３－５ヘテロシクリルは、３～５個の環原子及び１～４個のヘテロ原子を環員として有するヘテロシクリル基を指す）。環ヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される。
二環式シクロアルキル基と同様に、二環式ヘテロシクリル基は、孤立した環、スピロ環、縮合環及び架橋環を含み得る。ヘテロシクリル基は、そのような結合又は置換が原子価要件に反しない又は化学的に不安定な化合物をもたらさない限り、任意の環原子において親基又は基質に結合でき、１つ又は２つ以上の非水素置換基を含むことができる。
単環式ヘテロシクリル基の例としては、これらに限定されないが、以下に由来するものが挙げられる：
Ｎ１： アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピロリン、２Ｈ－ピロール又は３Ｈ－ピロール、ピペリジン、ジヒドロピリジン、テトラヒドロピリジン、アゼピン；
Ｏ１： オキシラン、オキセタン、テトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ジヒドロピラン、ピラン、オキセピン；
Ｓ１： チイラン、チエタン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン、チエパン；
Ｏ２： ジオキソラン（dioxoiane）、ジオキサン及びジオキセパン；
Ｏ３： トリオキサン；
Ｎ２： イミダゾリジン（imidazoiidine）、ピラゾリジン、イミダゾリン、ピラゾリン、ピペラジン；
Ｎ１Ｏ１： テトラヒドロオキサゾール、ジヒドロオキサゾール、テトラヒドロイソオキサゾール、ジヒドロイソオキサゾール、モルホリン、テトラヒドロオキサジン、ジヒドロオキサジン、オキサジン；
Ｎ１Ｓ１： チアゾリン、チアゾリジン、チオモルホリン；
Ｎ２Ｏ１： オキサジアジン；
Ｏ１Ｓ１： オキサチオール及びオキサチアン（チオキサン）；並びに
Ｎ１Ｏ１Ｓ１： オキサチアジン。
置換単環式ヘテロシクリル基の例としては、環状形態の糖、例えば、フラノース、例えば、アラビノフラノース、リキソフラノース、リボフラノース及びキシロフラノース、並びにピラノース、例えば、アロピラノース（aliopyranose）、アルトロピラノース、グルコピラノース、マンノピラノース、グロピラノース、イドピラノース、ガラクトピラノース及びタロピラノースに由来するものが挙げられる。
本明細書中で使用する用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに結合された複数のアミノ酸残基を含む直鎖分子を指す。
保護基は、官能基の化学修飾によって分子中に導入されて、官能基の特徴的な化学的性質を一時的にマスクして、官能基が別の反応に干渉するのを防ぐ基である。光分解反応によって除去され得る（例えば、光分解反応によって除去され得る／除去可能である／脱保護され得る）保護基は、放射線エネルギー、例えば、光によって除去され得る基である。保護基は、Wuts, P.G.M. and Greene, T.W., Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Edition, Wiley-lnterscience, 2007及びP. Kocienski, Protective Groups, 3rd Edition (2005)に記載されている。
「糖」置換基は、糖のヒドロキシル基からのＨが、式（Ｉ）又は（II）の化合物の残りの部分に糖置換基を結合する結合で置き換えられた単糖又は多糖を表す。好適には、糖は単糖である。好適には、糖は、グルコース、マンノース又はガラクトースである。好適には、保護基は光不安定性であり、したがって、３００ｎｍ超の波長λｍａｘにおいて脱保護され得る。これらは、生体系に有害でない波長である。
一態様において、好適には、式（Ｉ）又は（II）の非天然アミノ酸は、
Figure 2022505464000013

又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。したがって、この態様において、式（Ｉ）又は（II）の非天然アミノ酸はＤ型である。
より好適には、式（Ｉ）又は（II）の非天然アミノ酸は、
Figure 2022505464000014
又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。したがって、このより好適な態様において、式（Ｉ）又は（II）の非天然アミノ酸はＬ型である。
好適には、式（Ｉ）又は（II）の非天然アミノ酸は、
Figure 2022505464000015
又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。好適には、式（Ｉ）又は（II）の前記非天然アミノ酸はＤ型である。より好適には、式（Ｉ）又は（II）の前記非天然アミノ酸はＬ型である。
より好適には、式（Ｉ）又は（II）の非天然アミノ酸は、
Figure 2022505464000016
又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。
好適には、非天然アミノ酸は、式（Ｉ）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。
好適には、式（Ｉ）の非天然アミノ酸は、下記式
Figure 2022505464000017
を有する又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。
好適には、式（Ｉ）の非天然アミノ酸は、下記式
Figure 2022505464000018
を有する又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。
好適には、式（Ｉ）の非天然アミノ酸は、下記式
Figure 2022505464000019
を有する又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。
好適には、Ｘは、Ｘ１－Ｙ、Ｓ－Ｓ－Ｒ５、Ｏ－ＮＨ－Ｒ５、Ｓ－ＮＨ－Ｒ５、Ｘ２－Ｙ１、Ｘ３－Ｙ２、Ｎ３又はＮＨ－Ｓ（Ｏ）２－Ｙ３である。好適には、Ｘは、Ｘ１－Ｙ、Ｘ２－Ｙ１、Ｘ３－Ｙ２、Ｎ３又はＮＨ－Ｓ（Ｏ）２－Ｙ３である。より好適には、ＸはＸ１－Ｙである。
好適には、Ｘ１は、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ３）又はＮ（ＣＨ２ＣＨ３）である。より好適には、Ｘ１は、Ｓ又はＯである。より好適には、Ｘ１はＳである。
好適には、Ｘ２は、Ｓ又はＯである。好適には、Ｘ２はＳである。
好適には、Ｘ４は、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ、Ｏ、Ｓ又はＮＨである。好適には、Ｘ４はＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏである。
好適には、Ｘ５は、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、Ｎ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ３、Ｎ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ３、Ｎ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｐｈ、Ｎ－Ｓ（Ｏ）２ＣＨ３、Ｎ－Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ３、Ｎ－ＣＨ３、Ｎ－ＣＨ２ＣＨ３又はＮ－Ｐｈである。より好適には、Ｘ５は、Ｓ、Ｏ、ＮＨ又はＮ－ＣＨ３である。
Ｒ１は、Ｈ、アミノ酸残基又はペプチドである。好適には、Ｒ１は、Ｈ、又はタンパク質構成アミノ酸残基である。最も好適には、Ｒ１はＨである。
好適には、Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル又はフェニルである。より好適には、Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３又はフェニルである。より好適には、Ｒ２はＨである。
好適には、ｑは、１又は２である。より好適には、ｑは１である。
好適には、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、Ｐｈ、ピリジル、ピロリル、イミダゾリル、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＳＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＨ３、ＮＨ（ＣＨ３）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）、Ｎ（ＣＨ３）２及びＮ（ＣＨ２ＣＨ３）２から独立して選択される。
好適には、各Ｒ３は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、Ｐｈ、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ３である。より好適には、各Ｒ３はＨである。
好適には、各Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、Ｐｈ、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ３である。より好適には、各Ｒ４はＨである。
好適には、Ｒ５は、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＯＣ１－６アルキル、ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）及びＮ（Ｃ１－６アルキル）２から選択される。
より好適には、Ｒ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、Ｐｈ、ピリジル、ピロリル、イミダゾリル、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＳＣＨ３、ＳＣＨ２ＣＨ３、ＮＨ（ＣＨ３）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）、Ｎ（ＣＨ３）２又はＮ（ＣＨ２ＣＨ３）２である。
Ｒ６又はＲ９がＨ以外の置換基である場合、保護基Ｙは、Ｒ６又はＲ９が結合している炭素に立体中心を含む。好適には、Ｙは、ラセミ混合物であり、又はＲ６若しくはＲ９が結合している炭素における立体中心に関して（Ｒ）配置又は（Ｓ）配置を有する。
一部の態様において、より好適には、Ｙは、Ｒ６又はＲ９が結合している炭素における立体中心に関して（Ｒ）配置を有する。
一部の態様において、より好適には、Ｙは、Ｒ６又はＲ９が結合している炭素における立体中心に関して（Ｓ）配置を有する。
好適には、式（Ｉ）若しくは(II)の化合物又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物は、Ｙ基を含む。
好適には、Ｙは、
Figure 2022505464000020
Figure 2022505464000021
である。
より好適には、非天然アミノ酸は、
Figure 2022505464000022
であるＹ基を含む。
より好適には、非天然アミノ酸は、
Figure 2022505464000023
であるＹ基を含む。
好適には、Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３及びＰｈから選択される。
より好適には、Ｒ６はＣＨ３である。
好適には、Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３及びＯ－Ｐｈから独立して選択されるか、又はＲ７及びＲ８は一緒に連結されて、Ｏ－ＣＨ２－Ｏ基を形成する。
一部の態様において、より好適には、Ｒ７及びＲ８は同じである。好適には、Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３若しくはＯＣＨ２ＣＨ３であるか、又はＲ７及びＲ８は一緒に連結されて、Ｏ－ＣＨ２－Ｏ基を形成する。
より好適には、Ｒ７及びＲ８は一緒に連結されて、Ｏ－ＣＨ２－Ｏ基を形成する。
好適には、各Ｒ’は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３及びＰｈから独立して選択される。
好適には、Ｒ９は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３及びＰｈから選択される。好適には、Ｒ９は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３及びＣＦ３から選択される。
好適には、Ｒ１０は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３及びＣＦ３から選択される。
好適には、Ｒ１１は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３及びＣＦ３から選択される。
好適には、一態様において、Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋又はＫ＋である。
一態様において、Ｍ＋はＬｉ＋である。代替的な一態様において、Ｍ＋はＮａ＋である。代替的な一態様において、Ｍ＋はＮ（Ｒ１３）４ ＋である。より好適な一態様において、Ｍ＋はＫ＋である。
一態様において、ＺはＳｉである。
代替的な一態様において、ＺはＧｅである。
好適には、Ｒ１２は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３又はＣ（Ｏ）－（Ｐｈ）である。
一態様において、好適には、Ｒ１３は、Ｃ１－６アルキル、アリル又はＣ５－２０アリールである。代替的な一態様において、好適には、Ｒ１３は、Ｈ、ＣＨ３若しくはＣＨ２ＣＨ３又はアリルである。好適には、Ｒ１３は、ＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３である。
より好適には、Ｙは、
Figure 2022505464000024
である。
一部の態様において、Ｙは、
Figure 2022505464000025
である。
一実施形態において、式（Ｉ）又は（II）の化合物は、
Figure 2022505464000026
又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。
非常に好適な実施形態は、
Figure 2022505464000027
として表されるか、又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。
この実施形態は、本明細書中において、「６」若しくは「化合物６」又は「ＤＡＰ５」と称することがあり、これらの名称はそれぞれ、前記で示した同じ化学構造を指す。
一態様において、より好適には、非天然アミノ酸は、
Figure 2022505464000028
又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。
より好適には、非天然アミノ酸は、式（III）若しくは（IV）の化合物又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。一態様において、非天然アミノ酸は、式（III）の化合物又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。別の態様において、非天然アミノ酸は、式（IV）の化合物又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物である。
一態様において、図３の化合物２、３、４又は５のうちの１種若しくは２種以上を、前述のシンテターゼ、又は例えば、（Nguyen, D.P. et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. Journal of the American Chemical Society 136, 2240-2243 (2014)）に記載されているシンテターゼ、すなわち、変異Ｎ３１１Ｍ、Ｃ３１３Ｑ、Ｖ３６６Ｇ、Ｗ３８２Ｎ、Ｒ８５Ｈを有するＭｂＰｙｌＲＳであるシンテターゼ「ＰＣＣ１ＲＳ」を使用して、インビトロ翻訳系において使用できる。このＰＣＣ１ＲＳシンテターゼは、非常に類似した非天然アミノ酸（光ケージ化（photocaged）システイン）を組み込んでおり、本発明者らは、それが、１原子（又は水素原子と共に２原子）のみ異なる保護バージョンのＤＡＰを受け入れるであろうと主張する。別の技術は、ｔＲＮＡに任意のアミノ酸を実質的にロードすることができる、いわゆる「フレキシザイム」をｔＲＮＡにロードすることにあるであろう（例えば、Morimoto et al., 2011, Acc. Chem Res. 44を参照）。その場合、これらはインビトロ系で使用できるであろう。理論によって拘束されることを望まないが、本発明者らは、図３の類似化合物２、３、４又は５は、細胞に入ることができないため、細胞内で機能しないと考える。
他の形態
特に明記しない限り、これらの置換基の周知のイオン、塩又は溶媒和物形態は、前記に含まれる。例えば、カルボン酸（－ＣＯＯＨ）への言及はまた、そのアニオン（カルボキシレート）形態（－ＣＯＯ－）、塩又は溶媒和物を含む。同様に、アミノ酸への言及は、アミノ基のプロトン化形態（－Ｎ＋ＨＲ１Ｒ２）、塩又は溶媒和物、例えば、塩酸塩を含む。同様に、ヒドロキシル基の言及はまた、そのアニオン形態（－Ｏ－）、塩又は溶媒和物を含む。
異性体、塩及び溶媒和物
ある特定の化合物は、１つ又は２つ以上の幾何学的形態、光学的形態、エナンチオマー形態、ジアステレオマー形態、エピマー形態、アトロプ形態、立体異性体形態、互変異性体形態、立体配座形態又はアノマー形態で存在し得、その例としては、これらに限定されないが、ｃｉｓ型及びｔｒａｎｓ型；Ｅ型及びＺ型；ｃ型、ｔ型及びｒ型；エンド型及びエキソ型；Ｒ型、Ｓ型及びメソ型；Ｄ型及びＬ型；ｄ型及びｌ型；（＋）型及び（－）型；ケト型、エノール型及びエノレート型；ｓｙｎ型及びａｎｔｉ型；シンクリナル型及びアンチクリナル型；アルファ型及びベータ型；アキシャル型及びエクアトリアル型；舟型、いす型、ねじれ型、エンベロープ型及び半いす型；並びにこれらの組合せが挙げられ、これらを「異性体」（又は「異性体形態」）と総称する。
互変異性体形態に関して以下で論じるように、本明細書中に記載する用語「異性体」からは、構造異性体（structural isomer）（構造異性体（constitutional isomer））（すなわち、単に原子の空間的位置ではなく原子間の接続が異なる異性体）は除外することに留意されたい。例えば、メトキシ基、－ＯＣＨ３への言及は、その構造異性体、ヒドロキシメチル基、－ＣＨ２ＯＨへの言及と解釈してはならない。
構造の種類への言及は、その種類の範囲に入る構造的な異性体の形態を含むといってよい（例えば、Ｃ１－７アルキルはｎ－プロピル及びイソプロピルを含み、ブチルはｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル及びｔｅｒｔ－ブチルを含み、メトキシフェニルはオルト－メトキシフェニル、メタ－メトキシフェニル及びパラ－メトキシフェニルを含む）。
上記の除外は、互変異性体形態、例えば、アミド／イミノアルコール－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－／－Ｎ＝Ｃ（－ＯＨ）－；又はケト型、エノール型及びエノレート型、例えば、以下の互変異性体対：ケト／エノール、イミン／エナミン、アミド／イミノアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エンチオール、Ｎ－ニトロソ／ヒドロキシアゾ及びニトロ／ａｃｉ－ニトロにおけるようなものには適用されない。
用語「異性体」には、特に、１つ又は２つ以上の同位体置換を有する化合物が含まれることに留意されたい。例えば、Ｈは、１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）及び３Ｈ（Ｔ）を含む任意の同位体形態であり得；Ｃは、１１Ｃ、１２Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃを含む任意の同位体形態であり得；Ｏは、１６Ｏ及び１８Ｏを含む任意の同位体形態であり得る、などである。例えば、化合物６は、以下：
Figure 2022505464000029
に示される、１３Ｃ及び１５Ｎ同位体標識化合物又は１８Ｏ同位体標識化合物であり得る。
特に明記しない限り、特定の化合物への言及は、その（全又は部分）ラセミ混合物及びあらゆる他の混合物を含む、このような異性体形態の全てを含む。他の方法で指定される結合の一例は、以下：
Figure 2022505464000030
に示す指定された立体化学構造を有するＤＡＰ中のＣＨ基である。
このような異性体形態の調製の方法（例えば、不斉合成）及び分離の方法（例えば、分別結晶及びクロマトグラフィー手段）は、当技術分野において公知であり、又は本明細書中に教示した方法若しくは公知の方法を公知のやり方で適合させることによって、容易に得ることができる。
特に明記しない限り、特定の化合物への言及は、例えば以下に論じる、そのイオン、塩、溶媒和物及び保護形態も含む。
一部の実施形態において、式（Ｉ）又は(II)の化合物又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物は、式（Ｉ）又は(II)の化合物の薬学的に許容される塩を含む。
前記で具体的に名前を挙げた化合物を含む、式（Ｉ）又は(II)の化合物は、薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物及び水和物を含み得る。これらの塩は、無毒性の酸付加塩（二酸を含む）及び塩基塩（base salt）を含む。
化合物がカチオン性である又はカチオン性であり得る官能基（例えば、－ＮＨ２は－ＮＨ３ ＋であり得る）を有する場合、好適なアニオンと共に酸付加塩が形成され得る。好適な無機アニオンの例としては、これらに限定されないが、以下の無機酸：塩酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、硫酸、亜硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、リン酸及び亜リン酸に由来するものが挙げられる。好適な有機アニオンの例としては、これらに限定されないが、以下の有機酸：２－アセチオキシ安息香酸（2-acetyoxybenzoic acid）、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン（glucheptonic）酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸及び吉草酸に由来するものが挙げられる。好適なポリマー有機アニオンの例としては、これらに限定されないが、以下のポリマー酸：タンニン酸、カルボキシメチルセルロースに由来するものが挙げられる。このような塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、シクラミン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩（esylate）、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチルスルホン酸塩、ナフチル酸塩（naphthylate）、２－ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ピログルタミン酸塩、サッカリン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩及びキシノホエート（xinofoate）塩が含まれる。
例えば、化合物がアニオン性である又はアニオン性であり得る官能基（例えば、－ＣＯＯＨはＣＯＯ－であり得る）を有する場合、好適なカチオンと共に塩基塩が形成され得る。好適な無機カチオンの例としては、これらに限定されないが、アルカリ金属又はアルカリ土類金属カチオン等の金属カチオン、アンモニウム及び置換アンモニウムカチオン並びにアミンが挙げられる。好適な金属カチオンの例としては、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、亜鉛（Ｚｎ２＋）及びアルミニウム（Ａｌ３＋）が挙げられる、好適な有機カチオンの例としては、これらに限定されないが、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４ ＋）及び置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２ ＋、ＮＨＲ３ ＋、ＮＲ４ ＋）が挙げられる。幾つかの好適な置換アンモニウムイオンの例は、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン及びトロメタミン、並びにアミノ酸、例えば、リジン及びアルギニンに由来するものである。通常の第四級アンモニウムイオンの一例は、Ｎ（ＣＨ３）４ ＋である。好適なアミンの例としては、アルギニン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、グリシン、リジン、Ｎ－メチルグルカミン、オラミン、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール及びプロカインが挙げられる。有用な酸付加塩及び塩基塩についての論考については、S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci. (1977) 66:1-19を参照；また、Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (2011)を参照。
薬学的に許容される塩は、種々の方法を使用して調製し得る。例えば、式（Ｉ）又は(II)の化合物を適切な酸又は塩基を反応させて、所望の塩を生じてもよい。また、式（Ｉ）又は(II)の化合物の前駆体を酸又は塩基を反応させて、酸不安定基若しくは塩基不安定基を除去してもよく、又は前駆体のラクトン若しくはラクタム基を開環させてもよい。加えて、式（Ｉ）又は(II)の化合物の塩を、適切な酸若しくは塩基で処理することによって又はイオン交換樹脂を接触させることによって、別の塩に変換してもよい。反応に続いて、次に、塩が溶液から沈殿する場合は濾過して又は蒸発させて塩を回収することによって、塩を単離することができる。塩の電離度は、完全電離からほとんど非電離まで様々であり得る。
活性化合物の対応する溶媒和物を調製、精製及び／又は取り扱うのが簡便である又は望ましい場合がある。用語「溶媒和物」は、化合物と１つ又は２つ以上の薬学的に許容される溶媒分子（例えば、ＥｔＯＨ）とを含む分子複合体を表す。用語「水和物」は、溶媒が水である溶媒和物である。薬学的に許容される溶媒和物は、溶媒が同位体置換されている（例えば、Ｄ２Ｏ、アセトン－ｄ６、ＤＭＳＯ－ｄ６）可能性があるものを含む。
有機化合物の溶媒和物及び水和物に関する、現在認められている分類系は、孤立部位溶媒和物（isolated site solvate）、チャネル溶媒和物（channel solvate）及び金属イオン配位溶媒和物及び水和物を区別するものである。例えば、K. R. Morris (H. G. Brittain ed.) Polymorphism in Pharmaceutical Solids (1995)を参照。孤立部位溶媒和物及び水和物は、溶媒（例えば、水）分子が、有機化合物の介在分子によって互いの直接接触から孤立しているものである。チャネル溶媒和物においては、溶媒分子は格子チャネル中にあり、格子チャネル中で、溶媒分子は他の溶媒分子に隣接している。金属イオン配位溶媒和物においては、溶媒分子は金属イオンに結合している。
溶媒又は水が強固に結合している場合には、複合体は、湿度とは無関係の、明確に定義された化学量論を有することになる。しかし、チャネル溶媒和物及び吸湿性化合物におけるように、溶媒又は水が弱く結合している場合には、水又は溶媒の含有率は、湿度及び乾燥条件によって異なることになる。このような場合、典型的には、非化学量論が観察されることになる。
遺伝的組込み
遺伝的組込みによる本発明によるポリペプチドの生産に関しては、前記遺伝的組込みは好ましくは、直交性又は拡張遺伝暗号を使用する。この遺伝暗号においては、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を使用することによって目的の非天然アミノ酸を遺伝的に組み込むことができるように、１つ又は２つ以上の特定の直交性コドンがその非天然アミノ酸をコードするように割り当てられている。直交性ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対は、原則として、ｔＲＮＡに非天然アミノ酸をチャージできる及び直交性コドンに応答して目的の非天然アミノ酸をポリペプチド鎖に組み込むことができる、任意のこのような対であることができる。
直交性コドンは、直交性コドンのアンバー、オーカー、オパール又は四つ組コドン（quadruplet codon）であり得る。コドンは単に、目的の非天然アミノ酸を運搬するのに使用されることになる直交性ｔＲＮＡに対応しなければならないだけである。最も好適には、直交性コドンはアンバーである。
本明細書中に示した具体例の多くは、アンバーコドン及び対応するｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼを使用したこと留意すべきである。前述の通り、これらは多様であり得る。あるいは、目的の非天然アミノ酸に働きかけることができる代替ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼ対をわざわざ使用又は選択することなく他のコドンを使用するために、ｔＲＮＡのアンチコドン領域を単に、最適のコドンに望ましいアンチコドン領域とスワップしてもよい。アンチコドン領域は、ｔＲＮＡのチャージ又は組込み機能にもｔＲＮＡシンテターゼによる認識にも関与しないので、このようなスワップは完全に熟練作業者の領域内である。したがって、一部の実施形態において、本発明において使用するｔＲＮＡのアンチコドン領域、例えば、ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ又はＭｍｔＲＮＡＣＵＡは交換可能である、すなわち、アンチコドンをスワップして代わりのコドンを認識させるようにキメラｔＲＮＡＣＵＡを使用でき、その結果、オーカー、オパール又は四つ組コドンを含む、本明細書中で論じた異なる直交性コドンに応答して目的の非天然アミノ酸を組み込むことができ、それに対応して、目的の非天然アミノ酸を組み込もうとするポリペプチドをコードする核酸を変異させて、目的の非天然アミノ酸の組込み点に同族のコドンを導入する。最も好適には、直交性コドンはアンバーである。
したがって、所望のチャージ活性が保持されるならば、必要に応じて、代替直交性ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を使用してもよい。
メタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）ＰｙｌＴ遺伝子は、ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ ｔＲＮＡ（すなわち、ＭｂｔＲＮＡＰｙｌ ＣＵＡ）をコードする。好適には、ｔＲＮＡＣＵＡ配列は、以下の通りである：
ｔＲＮＡｃｕａ
ＭｂＰｙｌＴ（ＭＳ株，Genbank受入番号ＡＹ０６４４０１から）
gggaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggt
tagattcccggggtttccgcca
このｔＲＮＡには使用できる２つのバリアントがある。一方は、gggから開始し（前述）、他方は、ggaから開始する（下記）:
ｔＲＮＡｃｕａ「gga」バリアント
ＭｂＰｙｌＴ（ＭＳ株，Genbank受入番号ＡＹ０６４４０１から）
ggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggt
tagattcccggggtttccgcca
これら２つのバリアント間に実質的な差異はない。
メタノサルシナ・バーケリＰｙｌＳ遺伝子は、ＭｂＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼタンパク質をコードする。
ｔＲＮＡシンテターゼ
必要な場合には、当業者は、ＭｂＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼタンパク質を、使用される特定の非天然アミノ酸に対して最適化するように変異させることにより適合させることができる。変異の必要性（もしあれば）は、使用される特定の非天然アミノ酸によって異なる。ＭｂＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼを変異させる必要がある可能性のある一例は、使用される特定の非天然アミノ酸がＭｂＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼタンパク質によってプロセシングされない場合である。
本発明において、本発明者らは、新規シンテターゼＤＡＰＲＳの作製に著しい知的努力を注いだ。特に、実施例３を参照されたい。好適には、本発明のシンテターゼは、２７１位にＣ、３１１位にＱ、３４９位にＦ及び３６６位にＣ（すなわち、ＭｂＰｙｌＲＳに関して、Ｙ２７１Ｃ、Ｎ３１１Ｑ、Ｙ３４９Ｆ及びＶ３６６Ｃ）、又は別の種からの異なる開始シンテターゼ配列／主鎖シンテターゼ配列を使用する場合には、同等の位置を含む。
新規シンテターゼＤＡＰＲＳの例示的な配列：
ＤＡＰＲＳ（変異残基には下線を引いてある）：
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLCNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVQFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVFGDTLDIMHGDLELSSACVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
好ましくは、直交性シンテターゼ／ｔＲＮＡ対は、メタノサルシナ・バーケリＭＳピロールリジン（pyrrolysine）ｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｂＰｙｌＲＳ）及びその同族のアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ＭｂｔＲＮＡＣＵＡ）（すなわち、ＭｂｔＲＮＡＰｙｌ ＣＵＡ）であり、前記ＭｂＰｙｌＲＳは、その活性に重要な、ここに説明する変異を含む、すなわち、ＭｂＰｙｌＲＳは、２７１位にＣ、３１１位にＱ、３４９位にＦ及び３６６位にＣ（すなわち、Ｙ２７１Ｃ、Ｎ３１１Ｑ、Ｙ３４９Ｆ及びＶ３６６Ｃ）を含む。
本発明のｔＲＮＡシンテターゼは様々であり得る。実施例においては、特定のｔＲＮＡシンテターゼ配列を使用した場合があるが、本発明を、それらの実施例のみに限局することを意図しない。
原則として、本発明では、同じｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能を提供する任意のｔＲＮＡシンテターゼを用いることができる。
例えば、ｔＲＮＡシンテターゼは、任意の好適な種、例えば、古細菌、例えば、メタノサルシナ・バーケリ ＭＳ；メタノサルシナ・バーケリ菌株Ｆｕｓａｒｏ；メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）Ｇｏ１；メタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）Ｃ２Ａ；メタノサルシナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）；又はメタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）に由来し得る。あるいは、ｔＲＮＡシンテターゼは、細菌、例えば、デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense）ＤＣＢ－２；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス Ｙ５１；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス ＰＣＰ１；デスルホトマキュラム・アセトキシダンス（Desulfotomaculum acetoxidans）ＤＳＭ ７７１に由来し得る。
これらの生物に由来する例示的な配列は、公開されている配列である。ピロールリジンｔＲＮＡシンテターゼの例示的な配列として、以下の例を示す：
＞Ｍ．バーケリＭＳ／１～４１９／
メタノサルシナ・バーケリ ＭＳ
バージョンＱ６ＷＲＨ６．１ ＧＩ：７４５０１４１１
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
＞Ｍ．バーケリＦ／１～４１９／
メタノサルシナ・バーケリ菌株Ｆｕｓａｒｏ
バージョンＹＰ＿３０４３９５．１ ＧＩ：７３６６８３８０
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKASTDTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRDFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPDPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLESLIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
＞Ｍ．マゼイ／１～４５４
メタノサルシナ・マゼイ Ｇｏ１
バージョンＮＰ＿６３３４６９．１ ＧＩ：２１２２７５４７
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
＞Ｍ．アセチボランス／１～４４３
メタノサルシナ・アセチボランス Ｃ２Ａ
バージョンＮＰ＿６１５１２８．２ ＧＩ：１６１４８４９４４
MDKKPLDTLISATGLWMSRTGMIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGERLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCRHCRVSDEDINNFLTKTSEEKTTVKVKVVSAPRVRKAMPKSVARAPKPLEATAQVPLSGSKPAPATPVSAPAQAPAPSTGSASATSASAQRMANSAAAPAAPVPTSAPALTKGQLDRLEGLLSPKDEISLDSEKPFRELESELLSRRKKDLKRIYAEERENYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINSDTELSKQVFRIDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIITEFLNHLGIDFEIIGDSCMVYGNTLDVMHDDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRAARSESYYNGISTNL
＞Ｍ．サーモフィラ／１～４７８
メタノサルシナ・サーモフィラ、バージョンＤＱ０１７２５０．１ ＧＩ：６７７７３３０８
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGKLHKIRHHEVSKRKIYIEMECGERLVVNNSRSCRAARALRHHKYRKICKHCRVSDEDLNKFLTRTNEDKSNAKVTVVSAPKIRKVMPKSVARTPKPLENTAPVQTLPSESQPAPTTPISASTTAPASTSTTAPAPASTTAPAPASTTAPASASTTISTSAMPASTSAQGTTKFNYISGGFPRPIPVQASAPALTKSQIDRLQGLLSPKDEISLDSGTPFRKLESELLSRRRKDLKQIYAEEREHYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPMEYIERMGIDNDKELSKQIFRVDNNFCLRPMLAPNLYNYLRKLNRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIIKDFLDYLGIDFEIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPVPMDRDWGINKPWIGAGFGLERLLKVMHNFKNIKRASRSESYYNGISTNL
＞Ｍ．ブルトニイ／１～４１６
メタノコッコイデス・ブルトニイ ＤＳＭ ６２４２、バージョンＹＰ＿５６６７１０．１ ＧＩ：９１７７４０１８
MEKQLLDVLVELNGVWLSRSGLLHGIRNFEITTKHIHIETDCGARFTVRNSRSSRSARSLRHNKYRKPCKRCRPADEQIDRFVKKTFKEKRQTVSVFSSPKKHVPKKPKVAVIKSFSISTPSPKEASVSNSIPTPSISVVKDEVKVPEVKYTPSQIERLKTLMSPDDKIPIQDELPEFKVLEKELIQRRRDDLKKMYEEDREDRLGKLERDITEFFVDRGFLEIKSPIMIPFEYIERMGIDKDDHLNKQIFRVDESMCLRPMLAPCLYNYLRKLDKVLPDPIRIFEIGPCYRKESDGSSHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENMEALIDEFLEHLGIEYEIEADNCMVYGDTIDIMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGVNKPWMGAGFGLERLLKVRHNYTNIRRASRSELYYNGINTNL
＞Ｄ．ハフニエンス＿ＤＣＢ－２／１～２７９
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス ＤＣＢ－２
バージョンＹＰ＿００２４６１２８９．１ ＧＩ：２１９６７０８５４
MSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN
＞Ｄ．ハフニエンス＿Ｙ５１／１～３１２
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス Ｙ５１
バージョンＹＰ＿５２１１９２．１ ＧＩ：８９８９７７０５
MDRIDHTDSKFVQAGETPVLPATFMFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN
＞Ｄ．ハフニエンスＰＣＰ１／１～２８８
デスルフィトバクテリウム・ハフニエンス
バージョンＡＹ６９２３４０．１ ＧＩ：５３７７１７７２
MFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEKLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIFDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN
＞Ｄ．アセトキシダンス／１～２７７
デスルホトマキュラム・アセトキシダンスＤＳＭ ７７１
バージョンＹＰ＿００３１８９６１４．１ ＧＩ：２５８５１３３９２
MSFLWTVSQQKRLSELNASEEEKNMSFSSTSDREAAYKRVEMRLINESKQRLNKLRHETRPAICALENRLAAALRGAGFVQVATPVILSKKLLGKMTITDEHALFSQVFWIEENKCLRPMLAPNLYYILKDLLRLWEKPVRIFEIGSCFRKESQGSNHLNEFTMLNLVEWGLPEEQRQKRISELAKLVMDETGIDEYHLEHAESVVYGETVDVMHRDIELGSGALGPHFLDGRWGVVGPWVGIGFGLERLLMVEQGGQNVRSMGKSLTYLDGVRLNI
特定のｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能が、ｔＲＮＡシンテターゼを変異させることによって提供された場合には、別の野生型ｔＲＮＡシンテターゼ配列、例えば、前記から選択されるものを使用するだけでは適切でない場合がある。このシナリオにおいては、同じＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能を保存することが重要となる。これは、例示的なｔＲＮＡシンテターゼを代わりのｔＲＮＡシンテターゼ主鎖、例えば、前記から選択されるものに移動させることによって、達成される。
このように、選択された変異を、対応するｔＲＮＡシンテターゼ配列、例えば、例示的なＭ．ｂａｒｋｅｒｉ及び／又はＭ．ｍａｚｅｉ配列を超えて他の生物からの対応するｐｙｌＳ配列に移動させることが可能であるはずである。
標的ｔＲＮＡシンテターゼタンパク質／主鎖は、既知のｔＲＮＡシンテターゼ、例えば、例示的なＭ．ｂａｒｋｅｒｉ及び／又はＭ．ｍａｚｅｉ配列へのアラインメントによって選択し得る。
次に、この主題についてｐｙｌＳ（ピロールリジンｔＲＮＡシンテターゼ）配列に言及することによって説明するが、その原則は、目的の特定のｔＲＮＡシンテターゼに等しく適用される。
例えば、全てのＰｙｌＳ配列のアラインメントを調製することができる。これらは、全体的な配列同一性％が低い可能性がある。したがって、配列を既知のｔＲＮＡシンテターゼにアラインして（単に低い配列同一性スコアを使用するのではなく）、使用されている配列が実際にｔＲＮＡシンテターゼであることを確実にするなどして、配列を研究することが重要である。
したがって、好適には、配列同一性が考慮されている場合、前記のｔＲＮＡシンテターゼの例の配列全体にわたって好適に考慮される。好適には、同一性％は、前記配列のアラインメントから定義されるものであり得る。
触媒領域に焦点を合わせることが有用であり得る。このねらいは、高い同一性％を定義できるｔＲＮＡ触媒領域を提供して、同じｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能、例えば、新しい又は非天然アミノ酸認識をもたらすように翻訳された変異を受け入れるのに好適な主鎖スキャフォールドを捕捉／同定することである。
したがって、好適には、配列同一性が考慮されている場合、触媒領域全体にわたって好適に考慮される。好適には、同一性％は、触媒領域から定義されるものであり得る。
代わりのｔＲＮＡシンテターゼ主鎖への変異の「移動」又は「移植」は、ｔＲＮＡシンテターゼ主鎖をコードするヌクレオチド配列の部位特異的変異誘発によって達成できる。この技術は、当技術分野において周知である。本質的には、主鎖ｐｙｌＳ配列を選択し（例えば、前記で論じた活性部位アラインメントを使用して）、選択した変異を、対応する／相同的な位置に移動させる（すなわち、対応する／相同的な位置において作る）。
数値アドレスを使用して特定のアミノ酸残基に言及する場合、特に明らかでない限り、番号付けは、参照配列としてＭｂＰｙｌＲＳ（メタノサルシナ・バーケリのピロールリジル（pyrrolysyl）－ｔＲＮＡシンテターゼ）アミノ酸配列（すなわち、公開されている野生型メタノサルシナ・バーケリ ＰｙｌＳ遺伝子 受入番号Ｑ４６Ｅ７７）によってコードされている）：
MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNN SRSCRTARAF RHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSA PKVKKAMPKS VSRAPKPLEN PVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSA PAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKP FRELESELVT RRKNDFQRLY TNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELS KQIFRVDKNL CLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDG KEHLEEFTMV NFCQMGSGCT RENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYG DTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREWGIDK PWIGAGFGLE RLLKVMHGFK NIKRASRSES YYNGISTNL
を使用して、行う。
これは、目的の残基を位置付けるために当技術分野においてよく理解されているようにして使用されるべきである。これは、必ずしも厳密な計数作業ではない－状況又はアラインメントに注意を払わなければならない。例えば、目的のタンパク質が、長さがわずかに異なるものである場合、（例えば）Ｌ２６６に対応する、その配列中の正しい残基の位置付けには、アラインされる配列と、厳選した同等の又は対応する残基とを必要とし得、目的の配列の２６６番目の残基を単に採用するのではない。これは、十分に、熟練した読み手の領域内である。
本明細書中で使用する変異の表記法は、当技術分野における標準である。例えば、Ｌ２６６Ｍは、野生型配列の２６６位のＬに対応するアミノ酸がＭで置き換えられていることを意味する。
この表記法において、導入されるアミノ酸が最も重要な情報である。例えば、「Ｌ２６６Ｍ」変異が別のシンテターゼ出発配列（主鎖配列）に移植される場合、この代わりの出発配列は２６６位に（又は、前記で説明した参照配列のＬ２６６に対応する位置に）「Ｌ」を有していない可能性もおそらくある。しかし、この場合、参照配列のＬ２６６に対応する正しいアミノ酸を、目的のシンテターゼ出発配列（主鎖配列）において同定すること、及びこの残基（それが何であれ）をＭに変化させることが、重要である。したがって、代わりの主鎖／出発配列に移植する場合、「Ｌ２６６Ｍ」は「Ｘ２６６Ｍ」と理解され得る。
本明細書中に記載した例示的なＤＡＰＲＳシンテターゼに関して、変異は、Ｍ．ｂ．参照配列（前記を参照）と比較してＹ２７１Ｃ、Ｎ３１１Ｑ、Ｙ３４９Ｆ及びＶ３６６Ｃと表記され、又は出発配列中のそれらの位置に異なるアミノ酸を有する主鎖に移植する場合には、Ｘ２７１Ｃ、Ｘ３１１Ｑ、Ｘ３４９Ｆ及びＸ３６６Ｃと理解できるであろう。
次に、代わりのｔＲＮＡ主鎖間の変異の移植を、例示的なＭ．ｂａｒｋｅｒｉ及びＭ．ｍａｚｅｉ配列に関して説明するが、同じ原則が、他の主鎖への又は他の主鎖からの移植に等しく適用される。
例えば、Ｍｂ ＡｃＫＲＳは、ＡｃＫの組込みのために設計されたシンテターゼである。
親タンパク質／主鎖：Ｍ．バーケリ ＰｙｌＳ
変異：Ｌ２６６Ｖ、Ｌ２７０Ｉ、Ｙ２７１Ｆ、Ｌ２７４Ａ、Ｃ３１７Ｆ
Ｍｂ ＰＣＫＲＳ：ＰＣＫの組込みのために設計されたシンテターゼ
親タンパク質／主鎖：Ｍ．バーケリ ＰｙｌＳ
変異：Ｍ２４１Ｆ、Ａ２６７Ｓ、Ｙ２７１Ｃ、Ｌ２７４Ｍ
同じ基質特性を有するシンテターゼを、これらの変異をＭ．マゼイ ＰｙｌＳに移植することによって得ることができる。したがって、Ｍｂ主鎖からＭｍ ｔＲＮＡ主鎖に変異を移植することによって、以下のシンテターゼ：
変異Ｌ３０１Ｖ、Ｌ３０５Ｉ、Ｙ３０６Ｆ、Ｌ３０９Ａ、Ｃ３４８ＦをＭ．マゼイ ＰｙｌＳに導入するＭｍ ＡｃＫＲＳ、及び
変異Ｍ２７６Ｆ、Ａ３０２Ｓ、Ｙ３０６Ｃ、Ｌ３０９ＭをＭ．マゼイ ＰｙｌＳに導入するＭｍ ＰＣＫＲＳ
を生成し得る。
これらの例示的な移植変異シンテターゼの完全長配列を、以下に示す。
>Mb_PylS/1-419
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
>Mb_AcKRS/1-419
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSGEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMVAPTIFNYARKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFFQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
>Mb_PCKRS/1-419
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERFGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLSPTLCNYMRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL
>Mm_PylS/1-454
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>Mm_AcKRS/1-454
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>Mm_PCKRS/1-454
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同じ原則が、他の変異及び／又は他の主鎖に等しく適用される。
このようにして生産された移植ポリペプチドは有利には、所望の機能／基質特異性が保存されていることを保証するために試験するべきである。
一実施形態において、ｔＲＮＡが１つの種、例えば、メタノサルシナ・バーケリに由来し、ｔＲＮＡシンテターゼが別の種、例えば、メタノサルシナ・マゼイに由来し得る。別の実施形態において、ｔＲＮＡが第１の種、例えば、メタノサルシナ・マゼイに由来し、ｔＲＮＡシンテターゼが第２の種、例えば、メタノサルシナ・バーケリに由来し得る。直交性対が、異なる種に由来するｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを含む場合には、直交性対が効果的に一緒に機能する、すなわち、ｔＲＮＡシンテターゼが目的のアミノ酸のｔＲＮＡを効果的にアミノアシル化することになるという条件を必ず伴う。
最も好適には、直交性対は、同じ種からのｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを含む。
ｔＲＮＡシンテターゼの性質及びその活性に役立つ特定の変異について、以下に別々に論じる。
ｔＲＮＡシンテターゼ分子のチャージ／アシル化部分がＰｙｌ ｔＲＮＡシンテターゼに基づく又はそれに由来するならば、キメラｔＲＮＡシンテターゼを生産し得る。すなわち、ｔＲＮＡ分子のアンチコドン部分は、例えば、代わりのコドン、例えば、センスコドン、四つ組コドン、アンバーコドン又は別の「停止」コドンなどの代替コドンの認識においてｔＲＮＡを指示するための作業者の選択に応じて異なり得る。しかし、ｔＲＮＡ分子の機能的なアシル化／チャージ部分は、前述の非天然アミノ酸に関して有用なチャージ活性を保存する（preserve）ために、保存（conserve）されるべきである。
メタノサルシナ・バーケリ及びメタノサルシナ・マゼイのｔＲＮＡはいずれも好適である。いずれにせよ、これらのｔＲＮＡは、１ヌクレオチドしか異ならない。この１ヌクレオチドの差異は、それらの活性に影響を及ぼさない。したがって、いずれのｔＲＮＡも本発明において等しく適用できる。
使用するｔＲＮＡは様々であってもよく、例えば、変異していてもよい。いかなる場合でも、Ｐｙｌ ｔＲＮＡのこのようなバリアント又は変異体はいずれも、ｔＲＮＡに前述の非天然アミノ酸をチャージするのに使用されるｔＲＮＡシンテターゼと生産的に相互作用する能力を常に保持すべきである。
ｔＲＮＡシンテターゼ
メタノサルシナ・バーケリ及びメタノサルシナ・マゼイ種のピロールリジンｔＲＮＡシンテターゼは、ｔＲＮＡに前述の非天然アミノ酸をチャージするのに役立つ、本明細書中に記載した変異を含むならば、好適である。
ペプチド結合による非天然アミノ酸の組込み
本明細書中に記載した非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込んでいる直接生成物が、ペプチド結合によってポリペプチド主鎖に結合した前記非天然アミノ酸の残基を含むポリペプチドであることは、明らかであろう。これは、厳密な意味では、ポリペプチドは言及した非天然アミノ酸を正確には含まず、むしろ、縮合反応を受けたそれの残基を含むことを意味する。これは、言及した非天然アミノ酸のアミノ酸基が、ポリペプチ鎖中のその隣接アミノ酸残基と反応し、その結果、ペプチド結合に基づき、言及した非天然アミノ酸の１つの残基が組み込まれると共に１分子のＨ２Ｏが遊離されるためである。「ポリペプチド鎖への非天然アミノ酸Ｘの組込み」又は「非天然アミノ酸Ｘを含むポリペプチド」への言及は、それに応じて解釈すべきである。これは完全に当技術分野における従来の命名法であり、例えば、アミノ酸、例えば、バリンがポリペプチド鎖に組み込まれる場合には、ポリペプチド鎖はバリンを含むと記載されるが、実際には、ポリペプチド鎖は、前述の通り、そのアミノ酸基の反応並びにペプチド結合の形成及び１つのＨ２Ｏ分子の遊離によってポリペプチド鎖に結合したバリンのアミノ酸残基を含む。
一態様において、本発明は、前述の非天然アミノ酸を含むポリペプチドに関する。
一態様において、本発明は、前述の非天然アミノ酸を含むポリペプチドであって、前記非天然アミノ酸がペプチド結合を介して前記ポリペプチドに結合している、ポリペプチドに関する。
一態様において、本発明は、前述の非天然アミノ酸を含むポリペプチドであって、前記非天然アミノ酸がペプチド結合を介して前記ポリペプチドに結合している、ポリペプチドに関する。
一態様において、本発明は、ペプチド結合によって、又はペプチド結合を介して組み込まれた、前述の非天然アミノ酸を含むポリペプチドに関する。
一態様において、本発明は、ペプチド結合によって、又はペプチド結合を介して組み込まれた、前述の非天然アミノ酸の残基を含むポリペプチドに関する。
本明細書中において、「非天然アミノ酸」は、天然にはコードされていない又はいかなる生物の遺伝暗号にも見られないアミノ酸を指す。したがって、非天然アミノ酸は、アミン及びカルボン酸官能基並びに側鎖を含むが、タンパク質を組み立てるのに翻訳機構によって使用されるタンパク質構成アミノ酸のいずれでもない化合物である。
同様に、本明細書中に開示する例示的な非天然アミノ酸は、「ＤＡＰを含む非天然アミノ酸」又は「ＤＡＰを含むアミノ酸」などと称することもある。明らかに、ＩＵＰＡＣ命名規則の最も厳密な意味では、ＤＡＰは２つのＮＨ２基を有するが、論じられる非天然アミノ酸は単一のＮＨ２基を有し、他方のＮＨ２基はＨ原子を失い、代わりに対応するＮ原子を介してアミノ酸側鎖の残りの部分に結合している。これにもかかわらず、「ＤＡＰを含む非天然アミノ酸」又は「ＤＡＰを含むアミノ酸」への言及は、当技術分野においてよく見られるように本明細書中でも使用し、それぞれＨ２Ｎ－Ｃ－（ＣＯＯＨ）－Ｃ－Ｎ（Ｈ）－Ｒ部分を含む（すなわち、「ＤＡＰ」を含む）化合物２、３、４、５及び６の１つ又はいずれかを指すことがある。
宿主細胞、ベクター、タンパク質産生
前述した方法のための、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換え型の複製可能なベクターに組み込むことができる。このベクターを使用して、適合性宿主中で核酸を複製することができる。したがって、さらなる一実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを作る方法であって、複製可能なベクターに本発明のポリヌクレオチドを導入するステップと、そのベクターを適合性宿主細胞（compatible host cell）に導入するステップと、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させるステップとによる、方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収し得る。好適な宿主細胞としては、細菌、例えば、大腸菌が挙げられる。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を可能にできる制御配列に作動可能に連結される、すなわち、ベクターは発現ベクターである。用語「作動可能に連結される」は、記載された成分が、意図される方法で機能させることができる関係にあることを意味する。コード配列に「動作可能に連結される」調節配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性の条件下で達成されるようにライゲートされる。
本発明のベクターは、記載された好適な宿主細胞を形質転換又はそれにトランスフェクトして、本発明のタンパク質の発現を可能にすることができる。このプロセスは、前述の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、タンパク質をコードするコード配列のベクターによる発現を可能にする条件下で培養するステップと、発現されたタンパク質を回収する任意のステップとを含む。
ベクターは、例えば、複製開始点、任意に前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び任意にプロモーターのレギュレーターを備えるプラスミド又はウイルスベクターであり得る。ベクターは、１つ又は２つ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子を含み得る。ベクターは、例えば、宿主細胞にトランスフェクト又は宿主細胞を形質転換するのに使用できる。
本発明のタンパク質をコードする配列に動作可能に連結された制御配列は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。これらの制御配列は、発現ベクターが使用されるように設計された宿主細胞と適合性（compatible）であるように選択し得る。プロモーターという用語は、当技術分野において周知であり、ミニマルプロモーターから、上流要素を含むプロモーター及びエンハンサーに及ぶ、サイズ及び複雑性が様々な核酸領域を包含する。
本発明の別の態様は、ＤＡＰを含む非天然アミノ酸を、好適には細胞中で、選択されたタンパク質に遺伝的に及び部位特異的に組み込む方法、例えば、インビトロの方法である。前記方法によって遺伝的に組み込むことの１つの利点は、この実施形態では、ＤＡＰを含むタンパク質を標的細胞中で直接合成できるので、いったん形成されると、ＤＡＰを含むタンパク質を細胞に送達する必要性がなくなることである。この方法は、以下のステップ：
（ｉ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列の所望の部位において、直交性コドン、例えば、アンバーコドンを導入するか、又は特定のコドンを直交性コドン、例えば、アンバーコドンで置き換えるステップと、
（ii）直交性ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対、例えば、ＤＡＰＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対の発現系を細胞に導入するステップと、
本発明によるＤＡＰを含む非天然アミノ酸を含む培地中で細胞を増殖させるステップと
を含む。
ステップ（ｉ）は、タンパク質の遺伝子配列の所望の部位において特定のコドンを直交性コドン、例えば、アンバーコドンで置き換えることを伴う。これは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するコンストラクト、例えば、プラスミドを単に導入することによって達成でき、ＤＡＰを含む非天然アミノ酸の導入する又はそれでの置き換えが所望される部位が、直交性コドン、例えば、アンバーコドンを含むように変えられる。これは、十分に当業者の能力の範囲内であり、その例を本明細書中に示す。
ステップ（ii）は、所望の場所にＤＡＰを含む非天然アミノ酸を特異的に組み込む直交性発現系（例えば、アンバーコドン）を必要とする。したがって、前記ｔＲＮＡにＤＡＰを含む非天然アミノ酸を一緒にチャージできる、特異的な直交性ｔＲＮＡシンテターゼ、例えば、ＤＡＰＲＳ－ｔＲＮＡシンテターゼと特異的な対応する直交性ｔＲＮＡ対が必要とされる。これらの例を、本明細書中に示す。
タンパク質の発現及び精製
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、本発明のタンパク質の発現に使用し得る。
好適な宿主細胞としては、細菌、例えば、大腸菌、又はある特定の真核生物細胞が挙げられる。
真核生物細胞に関しては、ＰｙｌＳ／ＰｙｌＴ系を使用する多くのＵＡＡが真核生物細胞において機能することが示されている（最も近い例は、光ケージ化システインについての（Nguyen, D.P. et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. Journal of the American Chemical Society 136, 2240-2243 (2014)）であり；この文献を、真核生物細胞における操作の教示のために、参照することによって本明細書中に組み込む）。
真核生物細胞は、任意の好適な真核生物細胞、例えば、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９昆虫細胞）、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞又はヒト細胞であり得る。
好適には、真核細胞は哺乳動物細胞である。好適には、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
一実施形態において、好適には、真核生物細胞、哺乳動物細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞はインビトロである。この実施形態において、細胞はインビボ細胞ではない。
好適には、宿主細胞は細菌細胞である、好適には、宿主細胞は大腸菌である。好適には、宿主細胞は、大腸菌細胞である。好適には、大腸菌細胞は、ＢＬ２１ ＤＥ３大腸菌細胞である。
一態様において、本発明は、前述の２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）を含むポリペプチドを生産する方法であって、生細胞の内部で実施される、方法に関する。
好適には、前記方法は、前述の非天然アミノ酸をポリペプチドに遺伝的に組み込むステップと、前記非天然アミノ酸を脱保護して２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）にする任意のステップとを含む。
好適には、前記生細胞は、大腸菌細胞、例えば、ＢＬ２１ ＤＥ３大腸菌細胞を含む。
好適には、前記生細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。
宿主細胞は、本発明のタンパク質の発現を可能にする好適な条件下で培養をすればよい。本発明のタンパク質の発現は、それらが継続的に産生されるように構成的であってもよいし、又は、発現の開始に刺激を必要とするように誘導的であってもよい。誘導性発現の場合には、タンパク質産生は、必要とされる場合には、例えば、培地へのインデューサー物質、例えば、デキサメタゾンン又はＩＰＴＧの添加によって開始できる。
ヒト胎児由来腎臓ラージＴ抗原（ＨＥＫ２９３Ｔ、Human Embryonic Kidney with large T antigen）細胞は、広く入手可能であり、例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６がLGC Standards社、Ｑｕｅｅｎｓ Ｒｏａｄ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＴＷ１１ ０ＬＹ、ＵＫから入手可能である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、当技術分野において公知であるように、例えば、必要に応じて適切な補充を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Dulbecco’s modified eagle medium）中で培養し得る。
ＢＬ２１ ＤＥ３大腸菌細胞は、広く入手可能であり、例えば、Ｃ２５２７Ｉ又はＣ２５２７ＨがNew England Biolabs New England Biolabs社、２４０ Ｃｏｕｎｔｙ Ｒｏａｄ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ ０１９３８－２７３２、ＵＳＡから入手可能である。これらは、当技術分野において周知であるように、供給業者からの指示に従って培養できる。
本発明のタンパク質は、酵素的、化学的及び／又は浸透圧溶解並びに物理的破壊を含む、当技術分野において公知の種々の技術によって、宿主細胞から抽出できる。
本発明のタンパク質は、当技術分野において公知の標準的な技術、例えば、分取クロマトグラフィー、アフィニティー精製又は任意の他の好適な技術によって精製できる。
組込みの標的部位
好適には、前述のＤＡＰ及び／又は非天然アミノ酸は、野生型ポリペプチドのシステイン、セリン又はトレオニン残基に対応する位置に組み込まれ、野生型ポリペプチドのシステイン又はセリン残基に対応する位置に組み込まれていてもよく、最も好適には野生型ポリペプチドのシステイン残基に対応する位置に組み込まれる。
より好適には、前述のＤＡＰ及び／又は非天然アミノ酸は、野生型ポリペプチドの触媒システイン、触媒セリン又は触媒トレオニン残基に対応する位置に組み込まれ、野生型ポリペプチドの触媒システイン又は触媒セリン残基に対応する位置に組み込まれていてもよく、最も好適には野生型ポリペプチドの触媒システイン残基に対応する位置に組み込まれる。
酵素
本発明は、ＤＡＰの組込みによる、酵素の活性部位の修飾に特定の用途を見出す。好適には、本明細書中に記載したＤＡＰ又は非天然アミノ酸は、野生型酵素の活性部位内のアミノ酸に対応する位置に組み込まれる。好適には、本明細書中に記載したＤＡＰ又は非天然アミノ酸は、野生型酵素の活性部位内の触媒アミノ酸に対応する位置に組み込まれる。
好適には、ポリペプチドは酵素である。好適には、エステル又はチオエステル中間体を生成する酵素。好適には、本発明のポリペプチドは、この一般的なメカニズムに従う酵素であり；より好適には、ポリペプチドは、セリンヒドロラーゼ（ヒトゲノム中の遺伝子の１％によってコードされる）であり得；好適には、酵素は、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、デユビキチナーゼ、リパーゼ、コリンエステラーゼ、チオエステラーゼ、ホスホリパーゼ、グリカンヒドロラーゼ（Di Cera, E. Serine proteases. IUBMB Life 61, 510-515 (2009)、Hedstrom, L. Serine protease mechanism and specificity. Chem Rev 102, 4501-4523 (2002)、Long, J.Z. & Cravatt, B.F. The Metabolic Serine Hydrolases and Their Functions in Mammalian Physiology and Disease. Chem Rev 111, 6022-6063 (2011)）、システインプロテアーゼ（例えば、カスパーゼ）、又はユビキチン化及び／若しくはＳＵＭＯ化に関与する酵素（例えば、Ｅ１、Ｅ２又はある特定の、Ｅ３のファミリー）（Verma, S., Dixit, R. & Pandey, K.C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Front Pharmacol 7 (2016)、Otto, H.H. & Schirmeister, T. Cysteine proteases and their inhibitors. Chem Rev 97, 133-171 (1997)、Swatek, K.N. & Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Res 26, 399-422 (2016)）であり得る。
より好適には、本明細書中に記載したＤＡＰ又は非天然アミノ酸は、酵素、例えば、プロテアーゼによって組み込まれる。
International Nomenclature and Classification of Enzymesシステム(国際生化学・分子生物学連合命名法委員会（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology）によって、IUPAC-IUBMB生物化学命名法合同委員会（ＪＣＢＮ、Joint Commission on Biochemical Nomenclature）との協議によって作成及び改定）（例えば、http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/を参照）を参照して、好適には、本明細書中に記載したＤＡＰ又は非天然アミノ酸は、分類群：
Figure 2022505464000031
からの１つ又は２つ以上の酵素からの酵素に組み込まれる。
産業用途
本発明はとりわけ、２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）を含むポリペプチドを生産する新しい方法を提供する。これには、例えば、目的の分子、例えば、研究されている酵素の基質を共有結合によって捕捉するその反応性を利用する、様々な産業用途がある。これはまた、酵素活性部位の中心部にＤＡＰを組み込むことによって可能になる、類似したアプローチを介して、代謝経路の精査を可能にする。小分子薬物が酵素によってどのように修飾／代謝されるかを特定するための及び／又はそれらのタンパク質標的を特定するための、小分子薬物の研究／捕捉も、用途に含まれる。
タンパク質の構造の特徴付けは、多くの創薬プロジェクトの出発点となることが多い。ＤＡＰは、酵素活性部位のセリン又はシステイン側鎖に結合した共有結合中間体を介して進行するあらゆるタンパク質触媒反応に使用できるので、広範な応用可能性を有する。ＤＡＰは、これらの共有結合中間体を構造的に特徴付けるのに使用できる。それに加えて、ＤＡＰはまた、これらの酵素の新しい基質の同定も可能にし、これもまた、新薬開発戦略の出発点となり得る。
さらなる用途
本発明者らの技術は、ＤＡＰを組換えタンパク質に部位特異的に組み込むことを可能にする。ＤＡＰは、酵素活性部位のセリン又はシステイン側鎖に結合した共有結合中間体を介して進行するあらゆるタンパク質触媒反応に使用できる。ＤＡＰは、これらの共有結合中間体を構造的に特徴付けるのに使用できるが、これらの酵素の新しい基質の同定も可能にする。
本発明者らは、温和な条件下でＤＡＰに翻訳後変換され得るアミノ酸（ＤＡＰ５）を組み込むアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を進化させた。これにより、本発明者らは、大腸菌において産生される組換えタンパク質にＤＡＰを部位特異的に組み込むことができる。これにより、本発明者らは、アシル－酵素中間体を効率的に捕捉することができる。
一実施形態において、本発明は、同族ｔＲＮＡ（cognate tRNA）にＤＡＰ５をロード（load）するために進化させた、ピロールリジンｔＲＮＡシンテターゼの変異体（ＤＡＰＲＳ）を使用してタンパク質に組み込まれる、アミノ酸（ＤＡＰ５）を提供する。これにより、温和な条件下で脱保護されてＤＡＰになり得る、部位特異的に組み込まれたＤＡＰ５を有する組込みタンパク質の合成が可能になる。
好適には、脱保護のための照射は、１分未満、好適には約１分間、好適には１分間、好適には少なくとも１分間である。好適には、脱保護のための照射は、１ミリ秒～１２０秒間、より好適には1ミリ秒～６０秒間である。最も好適には、脱保護のための照射は、１分間である。
好適には、続いて照射後に、凍結温度より高い任意の温度でタンパク質をインキュベートする。インキュベーションは、脱保護の第２の段階である。完了までに要する時間は、ＤＡＰを組み込むタンパク質によって異なる。実施例においては、試料は照射後に１～２ｈインキュベートした。
一態様において、本発明は、酵素の基質を捕捉する方法に関する。
好適な基質は、チオエステル又はエステル中間体結合が前記基質に対する酵素の作用によって作製されるものである（注記：基質はエステル又はチオエステルを含まない－好適には、基質は、これらの部分が触媒作用中に作製されるような化学構造を有する）。好適には、これらの結合は、酵素の、その基質に対する求核攻撃後に又はその結果として作製される。本発明によるＤＡＰによる活性部位残基の置換の場合には、作製される結合はアミド結合である（以下でより詳細に論じる）。
好適には、前記基質は、安定なアミド類似体として捕捉される。
好適には、前記基質は、天然に存在する基質の類似体であり得る。
好適には、前記酵素は、システインプロテアーゼ又はチオエステラーゼである。
好適には、前記酵素は、１つ又は２つ以上のアシル－酵素中間体を介して、より好適には、１つ又は２つ以上のシステイン－又はセリン－結合アシル－酵素中間体を介して作用する。
一実施形態において、本発明は、小分子（薬物）を添加して形成される中間体酵素－基質複合体を調べるのに使用できる。これにより、薬物が、種々の複合体形成の間にこの酵素－基質相互作用をどのように破壊するかを解明できる。したがって、小分子が酵素の基質である場合、これは本発明の有用な用途である。ＤＡＰは、求核性（触媒）残基、好適にはシステイン及び／又はセリンと置き換わるならば、あらゆる基質を捕捉する。
本発明は、コードされた２，３－ジアミノプロピオン酸を介する生合成アシル－酵素中間体についての洞察の探求に用途を見出す。
さらなる特定の及び好ましい態様は、添付した独立請求項及び従属請求項に記載する。従属請求項の特徴は、独立請求項の特徴をと適宜組み合わせてもよく、特許請求の範囲に明示的に記載したもの以外の組合せであってもよい。
装置の構成が、機能を提供するように操作可能であると記載されている場合、これは、その機能を提供するか又はその機能を提供するように適合若しくは構成された、装置の構成を含むことが理解されるであろう。
［実施例］
組換えタンパク質におけるＤＡＰ誘導体の遺伝的コード化
本発明者らは、細胞内に構成的に存在するシステイン及びセリンとのＤＡＰの構造的類似性は、ＤＡＰを選択的に組み込むアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼを発見することが困難であり得ることを示唆していると推論した。したがって、本発明者らは、ＤＡＰの４つの保護バージョン（化合物２～５）を設計及び合成した（図３ａ、補足図２）。本発明者らは、これらのアミノ酸に関するアミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡＣＵＡ対の発見により、タンパク質への部位特異的組込みが可能になる、及び遷移金属触媒作用（Li, J. et al. Palladium-triggered deprotection chemistry for protein activation in living cells. Nat Chem 6, 352-361 (2014)）（２）又は光（Baker, A.S. & Deiters, A. Optical Control of Protein Function through Unnatural Amino Acid Mutagenesis and Other Optogenetic Approaches. Acs Chemical Biology 9, 1398-1407 (2014)）（３～５）を介した、コードされたアミノ酸の翻訳後脱保護によりＤＡＰが露出されると予想した。
化合物３及び４はそれぞれ、本発明者らがＰＣＣ１ＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ及びＰＣＣ２ＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を使用してタンパク質に予め組み込んだ光ケージ化（photocaged）システイン誘導体に対する保存的ＳＨ－ＮＨ２置換を含む（Nguyen, D.P. et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. Journal of the American Chemical Society 136, 2240-2243 (2014)）。（これらの対は、ピロールリジル－ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡＣＵＡ対に由来した）。この類似性は、これらの対がアンバーコドンに応答して、３又は４の組込みを指示する可能性があることを示唆した。しかし、本発明者らは、細胞に３又は４及びその関連した対が提供された場合には、これらの対はレポーター遺伝子中のアンバーコドンを抑制するようには機能しないことを見出した。
アミノ酸２～５を組み込む直交性アミノアシル－ｔＲＮＡシンテターゼを発見する努力の一環として、本発明者らは、ＭｂＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対の５つのバリアントライブラリー（Ｓｕｓａｎ１、Ｓｕｓａｎ２（Nguyen, D.P. et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. Journal of the American Chemical Society 136, 2240-2243 (2014)）、Ｓｕｓａｎ４、ＰｙｌＳ ｆｗｄ（Nguyen, D.P., Elliott, T., Holt, M., Muir, T.W. & Chin, J.W. Genetically Encoded 1,2-Aminothiols Facilitate Rapid and Site-Specific Protein Labeling via a Bio-orthogonal Cyanobenzothiazole Condensation. Journal of the American Chemical Society 133, 11418-11421 (2011)）及びＤ３（補足表１））を調べた。これらのライブラリーは、シンテターゼの活性部位の残基をランダム化しており、ｎｃＡＡの組込みを可能にするために以前に作製された。Ｓｕｓａｎ２ライブラリーは、以前は、システインの光ケージ化誘導体のためのシンテターゼを発見するために使用されていた（Nguyen, D.P. et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. Journal of the American Chemical Society 136, 2240-2243 (2014)）。本発明者らは、各ライブラリーを、各ｎｃＡＡの存在下における２ラウンドの連続ポジティブ選択及びｎｃＡＡの非存在下における１ラウンドのネガティブ選択に供した（Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Genetically encoding N-epsilon-acetyllysine in recombinant proteins. Nature Chemical Biology 4, 232-234 (2008)、Chin, J.W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu Rev Biochem 83, 379-408 (2014)、Liu, C.C. & Schultz, P.G. Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annual Review of Biochemistry, Vol 79 79, 413-444 (2010)）。しかし、本発明者らは、これらの選択からは化合物２～５のためのシンテターゼ／ｔＲＮＡ対は発見しなかった。
化合物２～５のｌｏｇＰ予測値を調べることにより、それらが非常に親水性であることが明らかになり、そのことが、それらが細胞に入るかどうかを本発明者らが調べる動機となった。ＬＣ－ＭＳに基づくアミノ酸取込みアッセイ（Zhang, M.S. et al. Biosynthesis and genetic encoding of phosphothreonine through parallel selection and deep sequencing. Nat Methods 14, 729-736 (2017)）を使用した場合、本発明者らは、細胞内で実質的な量のアミノ酸２～５を検出しなかった。本発明者らのデータは、化合物２～５の細胞内濃度は実質的に１０μＭ未満であることを示唆している（図３ｂ～ｅ）。これらの観察は、化合物２～５が大腸菌によっては効率的に取り込まれないか又は代謝されることを示唆している。これは、これらのアミノ酸をインビボで組み込むためのシンテターゼを選択することが可能でなかった理由を説明し得る。
ＤＡＰを含む好ましい非天然アミノ酸
ＤＡＰの保護バージョンをコードするという課題に取り組むために、本発明者らは、翻訳後に脱保護されて側鎖アミンを露出させることができると本発明者らが予想する、アミノ酸６を設計及び合成した（補足図２）。このアミノ酸は、アミノ酸１～５よりも好都合なｌｏｇＰ予測値を有しており、本発明者らは、細胞培地に１ｍＭの６を添加すると、細胞内濃度が約２ｍＭとなることを見出した（図３ｆ）。したがって、アミノ酸２～５とは異なり、アミノ酸６はミリモル濃度で大腸菌内に蓄積することができる。
ＤＡＰ ｔＲＮＡシンテターゼ（「ＤＡＰＲＳ」）の作製
多くの以前のアプローチの失敗を考慮して、発明者らは、ランダム化される位置がＰｙｌＲＳの活性部位における６のモデルに基づいて注意深く選択された、完全に新しいライブラリー、ＤＡＰＲＳｌｉｂを考案及び作製した（補足図３及び補足表１）。
このように知力を働かせた結果、５つの位置（Ｙ２７１；Ｎ３１１；Ｙ３４９；Ｖ３６６；Ｗ３８２）が２０種の正準アミノ酸（canonical amino acids）全てにランダム化され、３．４×１０７個の異なる配列の理論上のライブラリー多様性がもたらされると判断した。本発明者らは、ＤＡＰＲＳｌｉｂを６の存在下及び非存在下で３ラウンドの連続ポジティブ及びネガティブ選択（Neumann, H., Peak-Chew, S.Y. & Chin, J.W. Genetically encoding N-epsilon-acetyllysine in recombinant proteins. Nature Chemical Biology 4, 232-234 (2008)）に供した。この選択に続いて、本発明者らは、ｃａｔ（１１２ＴＡＧ）レポーターを含む細胞中で９６種のクローンをスクリーニングした。
本発明者らは、６の存在下で高レベルのクロラムフェニコール耐性を及び６の非存在下で最小のクロラムフェニコール耐性を付与する単一のクローンを得た（図３ｇ）。
選択したシンテターゼは、ＭｂＰｙｌＲＳに関して４つの活性部位変異（Ｙ２７１Ｃ、Ｎ３１１Ｑ、Ｙ３４９Ｆ、及びＶ３６６Ｃ）を含む。
（ライブラリーはランダム化された５つの位置を含んでいたが、ＤＡＰＲＳには４つの変異しか存在しない－ＤＡＰＲＳでは５番目の位置が野生型（すなわち、Ｗ３８２）であることに留意すべきである。）
ＤＡＰを含む非天然アミノ酸の、ポリペプチドへの組込み
タンパク質への６の、遺伝的に指示された部位特異的組込みをさらに特徴付けるために、１５０位にアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を含むスーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）（ｓｆＧＦＰ（１５０ＴＡＧ）Ｈｉｓ６）をＤＡＰＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌ ＣＵＡ及び１ｍＭの６の存在下で発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した（図３ｈ及び補足図４ａ）。ベンチマークとして、同じ遺伝子を、ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌ ＣＵＡ及び１ｍＭの、効率的なアンバー抑制をもたらすことが知られている（Virdee, S., Ye, Y., Nguyen, D.P., Komander, D. & Chin, J.W. Engineered diubiquitin synthesis reveals Lys29-isopeptide specificity of an OTU deubiquitinase. Nature Chemical Biology 6, 750-757 (2010)）Ｎε－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－リジン（ＢｏｃＫ）の存在下で発現させた。
６を組み込んだＧＦＰ（ＧＦＰ（６））の収量は、ＢｏｃＫ組込みの収量と同程度であり、これは、ＤＡＰＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌ ＣＵＡ対の効率性を示している。
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）により、ＤＡＰＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌ ＣＵＡ対がアンバーコドンに応答してタンパク質への６の組込みを指示することが確認される（図３ｉ、ｊ）。
ＤＡＰを含むアミノ酸の脱保護
ここで、本発明者らは、ＤＡＰを含むアミノ酸の脱保護が、ＤＡＰ基をポリペプチド主鎖に残し、それによってＤＡＰを含むポリペプチドを生じることを実証する。
本発明者らは、アミノ酸６を組み込んだタンパク質に３６５ｎｍの光を照射すると、スルフヒドリル基を含む中間体が現れ、これがさらなる反応を受けてＤＡＰをもたらす（カルバメートのカルボニルへのスルフヒドリル基の５ｅｘｏ－ｔｒｉｇ環化及び得られた四面体中間体の崩壊によるアミノ基の放出、又はエピスルフィド及び二酸化炭素を形成してアミノ基を放出することのいずれかにより）可能性があると予想した。実際に、ＧＦＰ（６）の照射（３６５ｎｍ、３５ｍＷｃｍ－２、１ｍｉｎ）は、予想されるスルフヒドリルへの６の完全な脱保護をもたらした（図３ｉ、ｊ）。その後の３７℃におけるタンパク質のインキュベーションにより、所望のアミノ基が完全に脱保護され、ＧＦＰ中のアミノ酸１が現れた（図３ｉ、ｊ）。
システインプロテアーゼアシル－酵素中間体の安定的な捕捉
タバコエッチウイルス（ＴＥＶ、tobacco etch virus）プロテアーゼのようなシステインプロテアーゼは通常、Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ触媒三残基を含み、それらの同族の基質で処理すると、チオエステル中間体を生成する（Verma, S., Dixit, R. & Pandey, K.C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Front Pharmacol 7 (2016)、Phan, J. et al. Structural basis for the substrate specificity of tobacco etch virus protease. Journal of Biological Chemistry 277, 50564-50572 (2002)）。したがって、本発明者らは、ＴＥＶプロテアーゼの活性部位システインをＤＡＰで置き換えて、アシル－酵素中間体を捕捉することを目標とした。０．１ｍＭの６が与えられ、Ｈｉｓ６－リポイル－ＴＥＶ（１５１ＴＡＧ）－Ｓｔｒｅｐを発現している大腸菌及びＤＡＰＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌ ＣＵＡ対を使用して、活性部位の触媒システインを６で置き換える、ＴＥＶＣｙｓ１５１６プロテアーゼを生成した。タンパク質を、タンデムアフィニティークロマトグラフィーによって培養物１リットル当たり約０．１ｍｇの収量で精製し、ＥＳＩ－ＭＳにより、遺伝的にコードされた部位に６が組み込まれていることが確認された。光脱保護は、コードされた６をスルフヒドリル中間体に定量的に変換し、ＥＳＩ－ＭＳで判断した場合、タンパク質の約７０％がその後に完全に脱保護され、ＴＥＶ（ＴＥＶＤＡＰ）の１５１位にアミノ酸１が現れた（補足図５）。
触媒システインをＤＡＰで置き換えると共有結合プロテアーゼ－基質中間体の捕捉が可能になることを実証するために、本発明者らは、ＴＥＶＤＡＰをモデル基質、Ｕｂ－ｔｅｖ－Ｈｉｓ６（ＴＥＶ切断部位（ｔｅｖ）がユビキチン及びヘキサヒスチジンタグと隣接している）と共にインキュベートし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質種を分離した。本発明者らは、ＴＥＶＤＡＰよりもゆっくりと移動する新しいバンドの形成を観察し、ｔｅｖ部位の切断により生成されたであろう遊離ユビキチンを観察しなかった（図４ａ及び補足図４）。ウエスタンブロットは、新しいバンドがＴＥＶとユビキチンの両方を含むことを示している（図４ａ）。対照実験により、野生型ＴＥＶがＵｂ－ｔｅｖ－Ｈｉｓ６を切断して、より急速に移動するＵｂにすること、及びＴＥＶ（Ｃ１５１Ａ）がＵｂ－ｔｅｖ－Ｈｉｓ６を切断しないことが確認される（図４ａ）。これらの実験は、Ｃｙｓ１５１ＤＡＰ置換が、ＴＥＶ及びＵｂを含む、移動度がより遅いバンドの形成に不可欠であること、並びにＵｂがＴＥＶＤＡＰ変異体から放出されないことを実証する。移動度がより遅いバンドのトリプシンＭＳ／ＭＳにより、ＤＡＰとＵｂの間のイソペプチド結合が同定され、これによりＴＥＶＤＡＰ－Ｕｂの形成が確認される（図４ｂ）。したがって、ＴＥＶの触媒システインをＤＡＰで置換すると、プロテアーゼサイクルの第１のステップ：基質カルボニルへの求核攻撃を経て、第１の四面体中間体を形成するプロテアーゼの作製が可能になる。この中間体は崩壊して、基質のＣ末端断片が放出され、加水分解を受けない安定なアミド結合によって、プロテアーゼに共有結合した基質のＮ末端断片が残される。
Ｖｌｍ ＴＥの活性及び合成経路
ＴＥドメイン機能についての洞察を得るため及びＤＡＰ組込み系で使用するためにそれを調製するために、本発明者らは、Ｖｌｍ ＴＥをクローン化及び発現させ、得られたＶｌｍ ＴＥ（ＴＥｗｔ、野生型）タンパク質を、生化学的及び構造的研究のために精製した。ＴＥドメインのネイティブ基質は、チオエステルによってホスホパンテテイン－ＰＣＰに連結されたペプチド中間体（ペプチジル－ＰＣＰ）である。グラミシジンＳ、サーファクチン及びフェンギシンシンテターゼ（Hoyer, K.M., Mahlert, C. & Marahiel, M.A. The iterative gramicidin s thioesterase catalyzes peptide ligation and cyclization. Chemistry & biology 14, 13-22 (2007)、Samel, S.A., Wagner, B., Marahiel, M.A. & Essen, L.O. The thioesterase domain of the fengycin biosynthesis cluster: a structural base for the macrocyclization of a non-ribosomal lipopeptide. Journal of molecular biology 359, 876-889 (2006)、Tseng, C.C. et al. Characterization of the surfactin synthetase C-terminal thioesterase domain as a cyclic depsipeptide synthase. Biochemistry 41, 13350-13359 (2002)）に由来するものを含むＮＲＰＳ ＴＥドメインにおいて、ＰＣＰ連結基質は、ペプチド中間体がチオエステルによってＮ－アセチルシステインに連結している小分子（ペプチジル－ＳＮＡＣ）によって模倣できる。本発明者らは、ネイティブペプチドのＳＮＡＣ誘導体、Ｄ－ｈｉｖ－Ｄ－ｖａｌ－Ｌ－ｌａｃ－Ｌ－ｖａｌ－ＳＮＡＣ（テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７、補足図６及び補足図７）を合成し、Ｖｌｍ ＴＥｗｔとのそのインキュベーションがバリノマイシンの産生をもたらすことを見出した（図５、補足図８、９及び補足表２）。これは、Ｖｌｍ ＴＥｗｔがテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７を使用して、その触媒サイクルの全段階：テトラデプシペプチド中間体のオクタデプシペプチドへのオリゴマー化、オクタデプシペプチドのドデカデプシペプチドへのオリゴマー化、及びドデカデプシペプチドの環化によるバリノマイシンの放出を完了できることを実証している。
バリノマイシン合成において検出される合成中間体から、２つの可能な経路を差別化するＶｌｍ ＴＥｗｔによって触媒されるオリゴマー化経路が明らかになる（補足図１０）（Hoyer, K.M., Mahlert, C. & Marahiel, M.A. The iterative gramicidin s thioesterase catalyzes peptide ligation and cyclization. Chemistry & biology 14, 13-22 (2007)、Trauger, J.W., Kohli, R.M., Mootz, H.D., Marahiel, M.A. & Walsh, C.T. Peptide cyclization catalysed by the thioesterase domain of tyrocidine synthetase. Nature 407, 215-218 (2000)）。Ｖｌｍ ＴＥｗｔは、テトラデプシペプチジル－Ｏ－ＴＥ中のＤ－ｈｉｖの遠位ヒドロキシルとテトラデプシペプチジル－Ｓ－ＰＣＰからのＬ－ｖａｌのカルボニルとの間のエステル結合形成によって（「順方向移動」）、又はテトラデプシペプチジル－Ｓ－ＰＣＰ中のＤ－ｈｉｖの遠位ヒドロキシルとテトラデプシペプチジル－Ｏ－ＴＥからのＬ－ｖａｌのカルボニルとの間のエステル結合形成（「逆方向移動」、そのように称されるのは、オクタデプシペプチドが後で再びＴＥドメインに移されることになるためである）によって、Ｄ－ｈｉｖ－Ｄ－ｖａｌ－Ｌ－ｌａｃ－Ｌ－ｖａｌ部分を潜在的にオリゴマー化する可能性がある。テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７からのバリノマイシン合成の反応のＬＣ－ＭＳは、「逆方向移動」オリゴマー化経路でのみ産生される中間体である、オクタデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １１及びドデカデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １５に相当する質量のシグナルを示した（補足図７及び補足図１０）。一貫して、テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７と末端ヒドロキシルを欠いているテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ（デオキシ－テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ８）との混合物を使用した実験は、デオキシ－オクタデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １２及びデオキシ－ドデカデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １６のピークを示した（補足図９）。オリゴマー化－環化デプシペプチドシンテターゼがより正準な（canonical）グラミシジンＳシンテターゼ（Hoyer, K.M., Mahlert, C. & Marahiel, M.A. The iterative gramicidin s thioesterase catalyzes peptide ligation and cyclization. Chemistry & biology 14, 13-22 (2007)、Trauger, J.W., Kohli, R.M., Mootz, H.D., Marahiel, M.A. & Walsh, C.T. Peptide cyclization catalysed by the thioesterase domain of tyrocidine synthetase. Nature 407, 215-218 (2000)）と類似した経路を使用することは、全てのオリゴマー化－環化ＮＲＰＳ（又はＰＫＳ（Zhou, Y., Prediger, P., Dias, L.C., Murphy, A.C. & Leadlay, P.F. Macrodiolide formation by the thioesterase of a modular polyketide synthase. Angew Chem Int Ed Engl 54, 5232-5235 (2015)））がこの合成スキームを使用することを示唆する。最後に、バリノマイシン合成アッセイはまた、１６量体デプシペプチジル－ＳＮＡＣ １９、２０量体デプシペプチジル－ＳＮＡＣ ２３及び環状１６量体デプシペプチド ２９に相当する小さなピークを示し、これは、Ｖｌｍ ＴＥドメインが、最終生成物の柔軟性が以前考えられていたよりも若干高いことを示している（図５及び補足図８）。
ＴＥドメインによって媒介されるバリノマイシン合成における重要な中間体の可視化
次に、本発明者らは、ＴＥｗｔの強固な及び反復可能な成長のための結晶化条件を得て最適化し、その構造を決定した（図６、補足図１１、及び補足表３）。Ｖｌｍ ＴＥは、タイプＩ ＴＥドメインに典型的なα／βヒドロラーゼの折り畳みの形を取り、Ｓｅｒ２４６３、Ｈｉｓ２６２５及びＡｓｐ２４９０のカノニカルなＳｅｒ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ触媒三残基（Horsman, M.E., Hari, T.P.A. & Boddy, C.N. Polyketide synthase and non-ribosomal peptide synthetase thioesterase selectivity: Logic gate or a victim of fate? Natrual Products Reports (2015)）がＴＥの「リッド」で覆われている。リッドは可動性であることが知られている構造要素であり、基質の位置付けから溶媒の排除まで様々な、ＴＥドメイン機能における役割を果たすことが示唆されている（Samel, S.A., Wagner, B., Marahiel, M.A. & Essen, L.O. The thioesterase domain of the fengycin biosynthesis cluster: a structural base for the macrocyclization of a non-ribosomal lipopeptide. Journal of molecular biology 359, 876-889 (2006)、Frueh, D.P. et al. Dynamic thiolation-thioesterase structure of a non-ribosomal peptide synthetase. Nature 454, 903-906 (2008)、Whicher, J.R. et al. Structure and function of the RedJ protein, a thioesterase from the prodiginine biosynthetic pathway in Streptomyces coelicolor. J Biol Chem 286, 22558-22569 (2011)）。組成は実質的に異なる可能性があるが、典型的なリッドは約５０個の残基及び約２～４個のヘリックスから構成されている。Ｖｌｍ ＴＥリッド領域は約８８個の残基（約２４９４～２５８２）であり、拡張ループ、ここではバンドルとして見られる３つのヘリックス（Ｌα１～３）、短い５残基のヘリックス（Ｌα４）、長いヘリックス（Ｌα５）及び別の短いヘリックス（Ｌα６）から構成されている（図６ｂ）。本発明者らは、ＴＥｗｔの２つの構造を得たが、これらはリット領域のみが異なる。１つの構造において、リッドはほぼ完全に秩序化されているが、Ｌα１～４を含む領域ではＢファクターが顕著に高く、そのため、ドメインの残りの部分とはほとんど接触しない（補足図１１ｂ）。第２のＴＥｗｔ構造において、Ｌα４～５は第１の構造で観察されるものと類似した位置を有するが、Ｌα３は活性部位に向かって１０°回転しており、Ｌα１～２は無秩序すぎて、モデル化できない。
Ｖｌｍ ＴＥをデプシペプチジル－ＳＮＡＣ分子と共にインキュベートしても、安定なコンジュゲートは得られず（補足図１２ａ～ｃ及び補足表４）、ＴＥｗｔ結晶をデプシペプチジル－ＳＮＡＣ分子と共に浸漬する幾つかの試みでは、活性部位の解釈可能なリガンド電子密度及び周辺部のンフォメーション変化を明らかにできなかった。他のグループは、ＳＮＡＣ分子からアシル－酵素複合体を可視化しようとした場合の同様な頓挫を報告している（補足表６）（Samel, S.A., Wagner, B., Marahiel, M.A. & Essen, L.O. The thioesterase domain of the fengycin biosynthesis cluster: a structural base for the macrocyclization of a non-ribosomal lipopeptide. Journal of molecular biology 359, 876-889 (2006)、Bruner, S.D. et al. Structural basis for the cyclization of the lipopeptide antibiotic surfactin by the thioesterase domain SrfTE. Structure 10, 301-310 (2002)）。本発明者らは、バリノマイシンのＶｌｍ ＴＥによって媒介される合成におけるアシル－中間体は急速に加水分解し、したがって、予想通り、野生型Ｖｌｍ ＴＥを使用して結晶学によって生合成中間体を可視化することは並外れて困難であると結論付ける。
Ｖｌｍ ＴＥのアシル－酵素複合体の可視化を可能にするために、本発明者らは、活性部位のセリン２４６３がＤＡＰ（ＴＥＤＡＰ）によって置き換えられたＶｌｍ ＴＥを生産した。ＤＡＰＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を含み、０．１ｍＭの６が補充された大腸菌におけるＶｌｍ２ＴＥ（２４６３ＴＡＧ）の発現により、セリン２４６３が６によって置き換えられたＶｌｍ ＴＥの精製が可能になり、収量は培養物１リットル当たり約０．１～０．５ｍｇであった。６の脱保護により、ＴＥＤＡＰが定量的に生産された（図６ｃ及び補足図１３）。
Ｖｌｍ ＴＥの触媒サイクルにおける第１のアシル－ＴＥ中間体についての洞察を提供するために、本発明者らは、テトラデプシペプチジル－Ｎ－ＴＥＤＡＰコンジュゲートを捕捉した。ＴＥＤＡＰをテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７と共にインキュベートすると、安定なデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ中間体が６０％を超える収率で生産され（補足図１２ｄ及び補足表４）、本発明者らは、バリノマイシン合成を観察しなかった。しかし、注目すべきことには、少量のオクタデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １１が観察された（図５ｂ及び補足図８ｂ）。オクタデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １１は、テトラデプシペプチジル－Ｎ－ＴＥＤＡＰに対するテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７のヒドロキシル基のＴＥＤＡＰ触媒攻撃によって形成される可能性があり、これは、ＴＥＤＡＰがアミドに対するヒドロキシルの攻撃を成功裏に触媒する力を有することを示している。少量のオクタデプシペプチジル－ＳＮＡＣ １１しか形成されなかったので、この反応が、より等エネルギーのエステル対エステル反応よりもはるかに遅いことは明白である。アミドに対するヒドロキシルの攻撃は、基質ペプチド主鎖がエステル連結アシル－酵素中間体から切断される、関連セリンプロテアーゼ（Ekici, O.D., Paetzel, M. & Dalbey, R.E. Unconventional serine proteases: variations on the catalytic Ser/His/Asp triad configuration. Protein Sci 17, 2023-2037 (2008)）によって用いられる第１の反応に類似している。しかし、この反応を行うようには進化しなかったこのＴＥドメインが、それを触媒することができたことは、驚くべきことである。
本発明者らは、テトラデプシペプチジル－Ｎ－ＴＥＤＡＰコンジュゲートに対するテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７のヒドロキシル基のＴＥＤＡＰ触媒攻撃が、コンジュゲートの観察された非定量的収率の一因である可能性があると仮定した。したがって、本発明者らは、デオキシ－テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ８をＴＥＤＡＰとコンジュゲートさせるための条件を最適化し、デオキシ－デプシペプチジル－ＴＥＤＡＰコンジュゲート（約７０％）を生産した（図６ｄ及び補足表４）。
デオキシ－テトラデプシペプチジル－Ｎ－ＴＥＤＡＰコンジュゲートの構造を決定するために、本発明者らは、予め形成したＴＥＤＡＰ結晶をデオキシ－テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ８基質類似体と共にインキュベートした。得られた電子密度は、デオキシ－テトラデプシペプチドの残基ＤＡＰ２４６３とＬ－ｖａｌ４の間のアミド結合に関して、若干弱いがはっきりした密度を示す（図６ｆ、ｈ）。Ｌ－ｖａｌ４の位置のカルボニル酸素は、残基Ａｌａ２３９９及びＬｅｕ２４６４の主鎖アミド、推定上のオキシアニオンホールに近接している（Tseng, C.C. et al. Characterization of the surfactin synthetase C-terminal thioesterase domain as a cyclic depsipeptide synthase. Biochemistry 41, 13350-13359 (2002)）。次の残基Ｌ－ｌａｃ３に対する密度もあるが、デオキシ－テトラデプシペプチドはアーチ形にせり出しており、これは柔軟性を示しているので、隣接するＤ－ｖａｌ２及びＤ－ｈｉｖ１を、信頼性をもってモデル化するには不十分である。デオキシ－テトラデプシペプチドは、第１のＴＥｗｔ構造とほぼ同一のコンフォメーションのリッドとは相互作用しない（補足図１１ｂ）。
次に、本発明者らは、ドデカデプシペプチジル－Ｎ－ＴＥＤＡＰコンジュゲートを捕捉することにより、Ｖｌｍ ＴＥの触媒サイクルにおける最後のアシル－ＴＥ中間体についての洞察を得ることに焦点を当てた。本発明者らは、バリノマイシン及びＴＥＤＡＰのインキュベーションは、環化の逆に類似した反応によってドデカデプシペプチジル－Ｎ－ＴＥＤＡＰをもたらす可能性がある、並びにこのコンジュゲートはアミド結合のおかげで熱力学的に好都合なものとなる、と推論した。実際に、最適化された条件下で、本発明者らは、ドデカデプシペプチジル－Ｎ－ＴＥＤＡＰコンジュゲートが約６５～１００％の収率で形成されることを観察した（図６ｅ及び補足表４）。ドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰを用いる結晶化試験では、ＴＥｗｔと類似した条件において結晶が生じたが、形態が異なり、２つの異なる空間群（非対称ユニット当たり２分子及び６分子をそれぞれ有するＨ３及びＰ１）に属していた（補足表３）。
ドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰの８つの結晶学的に独立した分子は全て、ドデカデプシペプチドに対して若干の密度を示した。分子Ｐ１＿Ａ～Ｆ及びＨ３＿Ａ～Ｂはそれぞれ、４、３、２、２、２、２、３及び１個のドデカデプシペプチド残基に対して強い密度を示す（補足図１４）。追加のより弱い密度が、最大全１２残基を収容できるであろう一部の分子に存在し（補足図１５）、他の分子においては、より弱い密度が、遠位残基の複数のコンフォメーションを示唆するが、この密度に明確にモデル化することはできなかった。モデル化されたデプシペプチドは全て、活性部位ＤＡＰから離れて類似した軌道をたどる。ＤＡＰに結合したＬ－ｖａｌ残基が届かないデプシペプチドとＴＥドメインの間に一貫した相互作用はない（図６ｇ、ｉ）。むしろ、各デプシペプチドはリッドと異なる接触をする。リッドは、ヘリックスＬα１、３、４及び５並びにＬα１のＮ末端側のストランドで構成される半球状のポケット／立体バリアを形成する。ドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰの結晶学的に独立した各分子のリッドは、類似しているが同一ではない位置にあり、リッドヘリックス間のループは、ほとんどの分子において無秩序である（図６ｋ）。これもまた、リッドの可動性を強調し、ドデカデプシペプチジルのコンフォメーション及び秩序の程度が分子間で異なる理由を説明している（図６ｋ）。半球状のバリアは、Ｖｌｍ ＴＥのアポ及びテトラデプシペプチジル結合構造の両方に見られるリッドのコンフォメーションに関して、ドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ構造におけるリッドの大幅な再配置のためにのみ生じる（図６ｌ）。
アポ／テトラデプシペプチド結合構造におけるＶｌｍ ＴＥリッドの位置を、ドデカデプシペプチド結合構造におけるリッドの位置と比較すると、その極端な可動性が実証及び強調される。一方のリッドのコンフォメーションから他方のコンフォメーションに遷移するために、ヘリックスＬα５～６はその位置を維持し、Ｌα３～４は約４５°回転して約１３Å位置を変え（translocate）、Ｌα２は約２５Å位置を変え、Ｌα１は短くなり、約１３Å位置を変えて、Ｌα３～４と反対方向に９０°超回転する（図６ｌ、補足アニメーション１、２）。この劇的な再配置は、Ｖｌｍ ＴＥのリッドヘリックスが、アポ／テトラデプシペプチジル結合構造及びドデカデプシペプチジル結合コンフォメーションの点で顕著に異なるような方法で、一緒に納まることを意味する。
はっきりと異なるリッドのコンフォメーションは、デプシペプチドの可能な場所に直接影響する。リッドのアポ／テトラデプシペプチド結合コンフォメーションにおいて、ヘリックスＬα１のＣ末端はＳｅｒ／ＤＡＰ２４６３の１０Å以内に入り、テトラデプシペプチドがＴＥコアヘリックスαＥに向かって伸長するように導く。リッドのドデカデプシペプチド結合コンフォメーションにおいて、Ｌα１に隣接するループがテトラデプシペプチド結合構造中のテトラデプシペプチドが占める場所をブロックする。さらに、ドデカデプシペプチド結合構造においては、Ｌα１のＮ末端が半球状のポケットの一部を形成し、これが、環化ステップ中にドデカデプシペプチドをＳｅｒ／ＤＡＰ２４６３に向かってカールバックするのに役立つ可能性がある。
結晶構造のモデル及び構造因子は、受入番号６ＥＣＢ、６ＥＣＣ、６ＥＣＤ、６ＥＣＥ及び６ＥＣＦでProtein Data Bankに寄託されている。
方法
一般的合成手順。
以下の例外を除いて、試薬は全てSigma-Aldrich社から購入した：Ｌ－乳酸はFisher Scientific社から購入し、ＥＤＣは、Oakwood Chemicals社（Ｅｓｔｉｌｌ、ＳＣ）から、入手可能な最も高純度で購入して、さらに精製せずに使用した。バリノマイシンは、Sigma-Aldrich社及びBioShop Canada社から購入した。溶媒は全て、Fisher Scientific社から購入した。反応は全て、特に断りのない限り、乾燥溶媒を使用してアルゴン雰囲気下で行った。ＮＭＲ分光法は、１Ｈスペクトルの場合は４００ＭＨｚ及び１３Ｃスペクトルの場合は１００ＭＨｚで動作するBruker AVANCE IIを用いて、１Ｈスペクトルの場合３００ＭＨｚで、１３Ｃスペクトルの場合は７５ＭＨｚで動作するBruker AVANCE 300を用いて、行った。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ、high-resolution mass spectroscopy）は、ＥＳＩ測定に対してMicromass Q-TOF I（John L. Holmes Mass Spectroscopy Facility社）で行った。
略語：Ｍ＝モル濃度；ｃｏｎｃ．＝濃；ｍｏｌ＝モル；ｍｍｏｌ＝ミリモル；℃＝摂氏度；ｅｑ．＝当量；ｈ＝時間；ｍｉｎ＝分；ｒ．ｔ．＝室温；ｃａｔ．＝触媒、ａｑ．＝水性；Ｓｕ＝スクシンイミジル；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；ａｔｍ＝雰囲気；Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル；ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ－ブチル；Ｅｔ＝エチル；Ｐｈ＝フェニル；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸；ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン；ＬＣ－ＭＳ＝液体クロマトグラフィー－質量分析；ＥＬＳ＝蒸発光散乱。
アミノ酸の合成
アミノ酸の調製のための一般的な合成スキームを以下に示し、試薬及び条件は以下の通りである：
Figure 2022505464000032
試薬及び条件：（ｉ）２ａ（１０．０ｍｍｏｌ）、ＨＣｌ（１，４－ジオキサン中４Ｍ）（８．０ｅｑ．）、Ｅｔ３ＳｉＨ（２ｅｑ．）、ｒ．ｔ．、１ｈ、９０％（２）；（ii）１ｂ（１９．２ｍｍｏｌ）、２－ニトロベンジルブロミド（１．２ｅｑ．）、ＤＩＰＥＡ（２．０ｅｑ．）、乾燥ＴＨＦ、ｒ．ｔ．、１０ｈ、６７％（３ａ）；（iii）３ａ（１１．６ｍｍｏｌ）、ＨＣｌ（１，４－ジオキサン中４Ｍ）（８．６２ｅｑ．）、Ｅｔ３ＳｉＨ（２．７ｅｑ．）、ｒ．ｔ．、２４ｈ、９９％（３・２ＨＣｌ）；（iv）氷ＣＨ３ＣＯＯＨ中４ａ（２０．０ｍｍｏｌ）（１．５６３Ｍ）、ｃｏｎｃ．ＨＮＯ３（７０％）に滴下添加、０℃、１ｈの滴下添加、次いで４０℃、２．５ｈ、５８％（４ｂ）；（ｖ）４ｂ（２０９．０ｍｍｏｌ）、ＮａＢＨ４（０．９ｅｑ．）、少しずつ添加（８×１５ｍｉｎ）、ｒ．ｔ．、ＣＨ３ＯＨ－Ｃ２Ｈ５ＯＨ－ＣＨ２Ｃｌ２（４４：２９：２７）、次いで４ｈ（合計時間＝６ｈ）、ｒ．ｔ．、９９％（４ｃ）；（vi）４ｃ（７５．０ｍｍｏｌ）、ＰＢｒ３（０．４ｅｑ．、滴下添加）、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、次いで乾燥ピリジン（ｃａｔ．）、０℃、１５ｍｉｎ、次いでｒ．ｔ．、１．５ｈ、８９％（４ｄ）；（vii）Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯｔＢｕ １ｂ（１５．０ｍｍｏｌ）、１３（１．２ｅｑ．）、ＤＩＰＥＡ（３．０ｅｑ．）、乾燥ＴＨＦ、ｒ．ｔ．、６４ｈ、８２％（４ｅ）；（viii）４ｅ（９．４９ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（２０．６４ｅｑ．）、Ｅｔ３ＳｉＨ（６．６０ｅｑ．）、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、７３％（４・２ＣＦ３ＣＯＯＨ）；（ix）４ｃ（１００．０ｍｍｏｌ）、Ｓｕ２Ｏ（１．５ｅｑ．）、ＤＩＰＥＡ（３．０ｅｑ．）、乾燥ＣＨ３ＣＮ、ｒ．ｔ．、１６ｈ、９２％（５ａ）；（ｘ）方法１：Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯｔＢｕ １ｂ（１４．０５ｍｍｏｌ）、５ａ（１．２ｅｑ．）、ＤＩＰＥＡ（３．０ｅｑ．）、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２／乾燥ＴＨＦ（２：１）、ｒ．ｔ．２０ｈ、９４％（５ｃ）；方法２：５ａ（１２．５ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯＨ １ａ（１．２５ｅｑ．）、ＤＩＰＥＡ（３．０ｅｑ．）、乾燥ＴＨＦ／乾燥ＣＨ３ＣＮ（９：１）、ｒ．ｔ．、２４ｈ、９９％（５ｂ）；（xi）５ｂ（９．２ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（２１．３ｅｑ．）、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、ｒ．ｔ．、９９％（５・ＣＦ３ＣＯＯＨ）；（xii）４ｄ（２１．０ｍｍｏｌ）、２－メルカプトエタノール（１．０５ｅｑ．）、１，４－ジオキサン（脱気）、ａｑ．ＮａＯＨ（脱気Ｈ２Ｏ中０．５Ｍ、１．０ｅｑ．）、ｒ．ｔ．、１２ｈ、暗所、アルゴンａｔｍ．、９５％（６ａ）；（xiii）６ａ（６１．０ｍｍｏｌ）、Ｓｕ２Ｏ（１．４ｅｑ．）、乾燥ＤＩＰＥＡ（４．０ｅｑ．）、乾燥ＣＨ３ＣＮ、ｒ．ｔ．、暗所、アルゴンａｔｍ．、１４ｈ、定量的変換（６ｂ）；（xiv）方法１：６ｂ（１８．０ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯｔＢｕ．ＨＣｌ １ｂ（１．６ｅｑ．）、乾燥ＤＩＰＥＡ（３．０ｅｑ．）、乾燥ＣＨ３ＣＮ、ｒ．ｔ．、１０ｈ、暗所、アルゴンａｔｍ．、９４％（６ｃ）；方法２：６ｂ（６０．０ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯＨ．ＨＣｌ １ａ（１．１ｅｑ．）、乾燥ＤＩＰＥＡ（４．０ｅｑ．）、乾燥ＣＨ３ＣＮ、ｒ．ｔ．、１４ｈ、暗所、アルゴンａｔｍ．、９６％（６ｄ）；（xv）方法１：６ｃ（１２．０６６ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（２１．６４７ｅｑ．）、乾燥Ｅｔ３ＳｉＨ（１０．３７８ｅｑ．）、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、ｒ．ｔ．、暗所、２４ｈ、ＬＣ－ＭＳ機器（逆相、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ）によりモニタリング、生成物を研和（ＣＨ３ＯＨ／Ｅｔ２Ｏ）によって精製、６４％（６・ＴＦＡ）；方法２：６ｄ（５７．６２６ｍｍｏｌ）、ＴＦＡ（９．０６５ｅｑ．）、乾燥Ｅｔ３ＳｉＨ（２．１７３ｅｑ．）、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、ｒ．ｔ．、暗所、５ｈ、ＬＣ－ＭＳ機器（逆相、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ）によりモニタリング、反応が不完全だった場合は追加のＴＦＡ（２ｅｑ．まで）を加えてより長く撹拌させておいた、生成物を研和（乾燥ＣＨ３ＯＨ／Ｅｔ２Ｏ）によって精製、６３％（６・ＴＦＡ）。
（Ｓ）－３－｛［（アリルオキシ）カルボニル］アミノ｝－２－アミノプロパン酸（２）
Figure 2022505464000033
Ｂｏｃ－Ｄａｐ（Ａｌｌｏｃ）－ＯＨ ２ａ（４．３２５ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．、Bachem Ltd.社から購入）を乾燥２５０ｍＬ一口丸底フラスコに入れ、ＨＣｌ（１，４－ジオキサン中４Ｍ、６０．０ｍＬ、２４０．０ｍｍｏｌ、１６．０ｅｑ．）に溶解させた。この溶液に乾燥Ｅｔ３ＳｉＨ（１０．０ｍＬ、６２．６０７５ｍｍｏｌ、４．１７４ｅｑ．）をｒ．ｔ．で添加すると、直ちにフェイントホワイト（faint white）色の沈殿物が出現し、これは、窒素雰囲気下、ｒ．ｔ．で撹拌すると時間と共に時に強さが増大した。２４ｈ後、インテンスホワイト（intense white）色の沈殿物が観察され、ＬＣ－ＭＳ分析（Ｃ１８逆相カラム、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ、勾配）により反応が完了していると判断した。次いで、混合物を減圧下で蒸発させ、生成物を乾燥ＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）に溶解させ、続いて減圧下で蒸発乾固させた。これを３回繰り返して、共沸蒸発によって１，４－ジオキサンの大部分を除去した。残留物を乾燥ＣＨ３ＯＨ（１０ｍＬ）に再溶解させ、乾燥Ｅｔ２Ｏ（５００ｍＬ）で研和して、生成物を沈殿させた。これを濾過し、さらなるＥｔ２Ｏ（２×１２５ｍＬ）で洗浄し、高真空（＜０．１ｍｂａｒ）で一晩乾燥させて、（Ｓ）－３－｛［（アリルオキシ）カルボニル］アミノ｝－２－アミノプロパン酸ＨＣｌ塩２をブライトホワイト（bright white）色粉末として得た（３．０３ｇ、９０％）；１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ３．４２～３．５６（ｍ，２Ｈ）、４．４８（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ）、５．１５～５．３６（ｍ，２Ｈ）、５．８０～５．９８（ｍ，１Ｈ）、７．４４～７．６０（ｍ，１Ｈ）、８．２４～８．７０（広幅なｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ４０．４（ＣＨ２）、５２．４（ＣＨ）、６４．７（ＣＨ２）、１１７．２（ＣＨ２）、１３３．４（ＣＨ）、１５６．２（Ｃ）、１６９．１（Ｃ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ（相対強度）１８９［（Ｍ＋Ｈ）＋，１００］、１３４（４）、８１（９）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ Ｃ７Ｈ１３Ｏ４Ｎ２［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：１８９．０８７０、実測値１８９．０８６６（Δ＝－２．１９ｐｐｍ）
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－［（２－ニトロベンジル）アミノ］プロパノエート（３ａ）
Figure 2022505464000034
Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ １ｂ（５．０ｇ、１９．２０６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を乾燥５００ｍＬ二口丸底フラスコに入れ、これに乾燥ＴＨＦ（７５ｍＬ）、続いて乾燥ＤＩＰＥＡ（６．６９ｍＬ、３８．４１２ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）を添加した。内容物をアルゴン雰囲気下、０℃において撹拌させておいた。２－ニトロベンジルブロミド（４．９７９ｇ、２３．０４８ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ．）を別の乾燥２５０ｍＬ一口丸底フラスコに入れ、乾燥ＴＨＦ（１２５ｍＬ）に溶解させ、次いで、得られた溶液を、アルゴンの陽圧下、０℃において５ｍｉｎかけてカニューレによって、Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯｔＢｕを含む主フラスコに移した。次いで、混合物をｒ．ｔ．まで加温し、ｒ．ｔ．において１０ｈにわたって撹拌させておいた。次いで、反応混合物を減圧濃縮し、粗混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で抽出し、ブライン溶液（３×２５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、蒸発乾固させて、ブラウン色の粘稠な油状物を得た。生成物を、ＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィー（勾配；溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝１：９→１：４）によって精製して、所望の生成物、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－［（２－ニトロベンジル）アミノ］プロパノエート３ａをフェイントイエロー色の粘稠な油状物として得た（５．０５ｇ、６７％）：Ｒｆ＝０．２７（ＳｉＯ２プレート、ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝１：４）；１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，内部標準としてＴＭＳを含むＣＤＣｌ３）δ１．４４（ｓ，９Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）、２．８５～３．４０（ｍ，２Ｈ）、４．０２（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．０７（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．２２～４．３５（ｍ，１Ｈ）、５．２０～５．５５（ｍ，１Ｈ）、７．４１（ｄｄｄ，Ｊ＝８．４，８．４，２．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．５０～７．６７（ｍ，２Ｈ）、７．９４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，内部標準としてＴＭＳを含むＣＤＣｌ３）δ２８．１（ＣＨ３）、２８．５（ＣＨ３）、５０．７（ＣＨ２）、５０．９（ＣＨ２）、５４．４（ＣＨ）、７９．９（Ｃ）、８２．３（Ｃ）、１２４．９（ＣＨ）、１２８．２（ＣＨ）、１３１．３（ＣＨ）、１３３．３（ＣＨ）、１３５．５（Ｃ）、１４９．２（Ｃ）、１５５．７（Ｃ）、１７０．９（Ｃ）。
（Ｓ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）アミノ］プロパン酸 ３
Figure 2022505464000035
乾燥１００ｍＬ一口丸底フラスコに、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－［（２－ニトロベンジル）アミノ］プロパノエート ３ａ（４．５９ｇ、１１．６０７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を装入した。ＨＣｌ（２５ｍＬ、１，４－ジオキサン中４Ｍ、１００．０ｍｍｏｌ、８．６１５ｅｑ．）、続いて乾燥Ｅｔ３ＳｉＨ（５．０ｍＬ、３１．３０４ｍｍｏｌ、２．６９７ｅｑ．）を添加した。内容物を暗所でアルゴン雰囲気下において撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣ分析（ＳｉＯ２プレート、ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝３：７）によって定期的に監視した。４８ｈ後、インテンスホワイト色の沈殿物が形成され、ＴＬＣ及びＬＣ－ＭＳ分析（Ｃ１８逆相カラム、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ、勾配）により反応が完了していると判断した。内容物を減圧下で蒸発乾固させた。残りの１，４－ジオキサンを共沸蒸発、３×乾燥ＣＨ３ＯＨ（２５ｍＬ）によって除去した。次いで、内容物を乾燥ＣＨ３ＯＨ（２５ｍＬ）に再溶解させ、０℃に冷却し、乾燥Ｅｔ２Ｏ（４００ｍＬ）を用いて研和し、暗所で室温において激しく撹拌して、色の濃い沈殿物を得た。沈殿物を濾過し、さらなる乾燥Ｅｔ２Ｏ（１５０ｍＬ）、続いて乾燥ｎ－ヘキサン（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで暗所において高真空下（＜０．１ｍｂａｒ）で１４ｈにわたって蒸発乾固させて、所望の生成物、（Ｓ）－２－アミノ－３－［（２－ニトロベンジル）アミノ］プロパン酸ＨＣｌ塩３をオフホワイト色粉末として得た（３．５７５ｇ、９９％）：１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ３．６８（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，５．６Ｈｚ，１Ｈ）、３．８１（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，７．７Ｈｚ，１Ｈ）；４．４８（ｄｄ，Ｊ＝７．７，５．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．６５（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．６９（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．７４～７．８２（ｍ，１Ｈ）、７．８４～７．９５（ｍ，２Ｈ）、８．３０（見かけ上ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ４７．８（ＣＨ２）、５０．２（ＣＨ）、５０．７（ＣＨ２）、１２７．１（ＣＨ）、１２７．３（Ｃ）、１３２．８（ＣＨ）、１３５．３（ＣＨ）、１３６．０（ＣＨ）、１５０．３（Ｃ）、１６９．０（Ｃ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋，ＬＣ－ＭＳ）ｍ／ｚ（相対強度）２４０［（Ｍ＋Ｈ）＋，１００％］。
４’，５’－メチレンジオキシ－２’－ニトロアセトフェノン（４ｂ）
Figure 2022505464000036
McGall et al.（McGall, G. H. et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society 119, 5081-5090, doi:DOI 10.1021/ja964427a (1997)）によって記載された手順をわずかに変更したものに従って、３’，４’－（メチレンジオキシ）アセトフェノン４ａ（１６．４１６ｇ、０．１ｍｏｌ）の氷ＣＨ３ＣＯＯＨ（６４ｍＬ）中溶液を、０℃において１ｈかけて、ｃｏｎｃ．ＨＮＯ３（１３６ｍＬ、強度７０％）を含む２リットル三口丸底フラスコに滴下添加した。反応混合物を、添加中及びさらに１ｈにわたって、アルゴン雰囲気下で撹拌しながら０℃に維持した。次いで、混合物を４０℃に加温し、さらに２．５ｈ撹拌した。最後に、混合物をｒ．ｔ．に冷却し、ビーカー中の砕氷（１リットル）にゆっくり注いだ。イエロー色沈殿物が出現した。これを１５分間撹拌し、次いで濾過した。イエロー色固体を水（３×２００ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥させた。次いで、粗イエロー色固体を再結晶（ＴＨＦ／ｎ－ヘキサン）、次いでＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィー［溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ｎ－ヘキサン（１：１）から１００％ＣＨ２Ｃｌ２］によって精製して、４’，５’－メチレンジオキシ－２’－ニトロアセトフェノン（Nguyen, D.P. et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. Journal of the American Chemical Society 136, 2240-2243 (2014)、McGall, G. H. et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society 119, 5081-5090, doi:DOI 10.1021/ja964427a (1997)、Pendrak, I., Wittrock, R. & Kingsbury, W. D. Synthesis and Anti-Hsv Activity of Methylenedioxy Mappicine Ketone Analogs. J Org Chem 60, 2912-2915, doi:DOI 10.1021/jo00114a050 (1995)）４ｂをイエロー色結晶として得た（１２．１４１ｇ、５８％）：Ｒｆ＝０．５２（ＣＨ２Ｃｌ２）；ｍ．ｐ．１２２．８～１２４．０℃（（Pendrak, I., Wittrock, R. & Kingsbury, W. D. Synthesis and Anti-Hsv Activity of Methylenedioxy Mappicine Ketone Analogs. J Org Chem 60, 2912-2915, doi:DOI 10.1021/jo00114a050 (1995)）ｍ．ｐ．１１２℃）；１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２．４５（ｓ，３Ｈ）、６．１６（ｓ，２Ｈ）、６．７１（ｓ，１Ｈ）、７．４８（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ３０．２（ＣＨ３）、１０３．８（ＣＨ２）、１０４．８（ＣＨ）、１０６．２（ＣＨ）、１３５．１（Ｃ）、１４０．１（Ｃ）、１４８．９（Ｃ）、１５２．８（Ｃ）、１９９．３（Ｃ）；ＩＲ（ＣＨ２Ｃｌ２）νｍａｘ２９８０、１７０８、１５２５、１５０６、１４８４、１４２４、１３６２、１３３８、１２７１、１１５２、１０３８、９３２、８７５、８１９ｃｍ－１；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ（相対強度）２３２［（Ｍ＋Ｎａ）＋，１０％］、２１０（２）、２０９（７）、１９４（１００）、１７１（４５）、１３０（３２）、１１１（９）。
（Ｒ，Ｓ）－１－［４’，５’－（メチレンジオキシ）－２’－ニトロフェニル］エタノール（４ｃ）
Figure 2022505464000037
４’，５’－メチレンジオキシ－２’－ニトロアセトフェノン ４ｂ（４３．７１４ｇ、０．２０９ｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を、２リットル一口丸底フラスコ中でＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍＬ）、ＣＨ３ＯＨ（６５０ｍＬ）及び無水ＣＨ３ＣＨ２ＯＨ（４２５ｍＬ）に懸濁させた。混合物をｒ．ｔ．において１０ｍｉｎ超音波処理して、イエロー色固体の大部分を溶解させた。ＮａＢＨ４顆粒（７．１１６ｇ、０．１８８ｍｏｌ、０．９ｅｑ．）を１５℃において８回に分けて（それぞれ０．８９０ｇ）１５ｍｉｎ毎に（合計時間＝２ｈ）イエロー色懸濁液に添加した。注：ＮａＢＨ４が溶解すると発泡が出現し、反応混合物は均質なイエロー色溶液になった。添加完了後、反応混合物をｒ．ｔ．でさらに４ｈ撹拌した。この後、ＴＬＣ分析（ＳｉＯ２、ＴＬＣ溶離剤：１００％ＣＨ２Ｃｌ２）によって、反応が完了していると判断し、ｒ．ｔ．でさらに２ｈ撹拌しながら乾燥アセトン（１００ｍＬ）を添加することによって、反応をクエンチした。次いで、混合物を減圧下で蒸発乾固させて、イエロー色固体を得た。続いて、固体をＣＨ２Ｃｌ２（８００ｍＬ）に再溶解させ、逐次的に飽和ａｑ．ＮＨ４Ｃｌ溶液（３×５００ｍＬ）で、最後に飽和ａｑ．ＮａＣｌ溶液（６×８００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、高真空で蒸発乾固させて、（Ｒ，Ｓ）－１－［４’，５’－（メチレンジオキシ）－２’－ニトロフェニル］エタノール（Nguyen, D.P. et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. Journal of the American Chemical Society 136, 2240-2243 (2014)、McGall, G. H. et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society 119, 5081-5090, doi:DOI 10.1021/ja964427a (1997)）４ｃをイエロー色固体として得た（４３．５６３ｇ、９９％）：Ｒｆ＝０．１９（ＣＨ２Ｃｌ２）；ｍ．ｐ．７６．５～７７．５℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．５０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）、２．５４（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．４２（ｑｄ，Ｊ＝６．３，３．０Ｈｚ，２Ｈ）、６．０９６（見かけ上ｄ，２ＪＨＨ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ，ジアステレオトピックＯＣＨ２Ｏ）、６．１０４（見かけ上ｄ，２ＪＨＨ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ，ジアステレオトピックＯＣＨ２Ｏ）、７．２４（ｓ，１Ｈ）、７．４２（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２４．３（ＣＨ３）、６５．８（ＣＨ）、１０３．１（ＣＨ２）、１０５．２（ＣＨ）、１０６．４（ＣＨ）、１３９．２（Ｃ）、１４１．５（Ｃ）、１４７．０（Ｃ）、１５２．５（Ｃ）；ＩＲ（ＣＨ２Ｃｌ２）νｍａｘ３６４９、２９８０、２８８９、２３６０、２３４３、１５２１、１５０６、１４８２、１３９３、１３４０、１２５３、１１３５、１０９０、１０３８、９３４、８１９ｃｍ－１；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ（相対強度）２３４［（Ｍ＋Ｎａ）＋，１％］、１９４［（Ｍ－ＯＨ）＋，１００］、１３０（２０）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ Ｃ９Ｈ９ＮＯ５［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：２３４．０３７３、実測値２３４．０３６４（Δ＝－３．９５ｐｐｍ）。
（Ｒ，Ｓ）－１－ブロモ－１－［４’，５’－（メチレンジオキシ）－２’－ニトロフェニル］エタン（４ｄ）
Figure 2022505464000038
１リットル三口丸底フラスコを、真空中でヒートガンを使用して１００℃超において１５ｍｉｎ乾燥させ、乾燥アルゴンガスでパージし、室温まで冷却させた。これに、（Ｒ，Ｓ）－１－［４’，５’－（メチレンジオキシ）－２’－ニトロフェニル］エタノール、４ｃ（１５．８３８ｇ、７５．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を添加した。４ｃを乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３７５ｍＬ、完全に溶解させるには超音波処理が必要であった）に溶解させ、アルゴン雰囲気下で０℃に冷却し、丸底フラスコをアルミ箔で包んで、遮光した。２０ｍｉｎ後、ＰＢｒ３（２．８２ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ、０．４ｅｑ．）を、０℃においてシリンジポンプを使用して１０ｍｉｎにわたって滴下添加し、続いて乾燥ピリジン（０．５ｍＬ）を添加した。イエロー色反応混合物を０℃において１５ｍｉｎにわたって撹拌し、次いでｒ．ｔ．にし、１．５ｈにわたって連続的に撹拌した。ＴＬＣ分析（ＳｉＯ２、ＴＬＣ溶離剤：１００％ＣＨ２Ｃｌ２）によって、反応が完了していると判断し、０℃に冷却し、乾燥ＣＨ３ＯＨ（１５ｍＬ）の添加によってクエンチし、ｒ．ｔ．に加温し、アルゴン雰囲気下で３０ｍｉｎにわたって撹拌した。クエンチの完了後、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下で反応混合物を蒸発乾固させた。得られたイエロー色ゴム状物を、ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）及び飽和ａｑ．ＮａＨＣＯ３溶液（３００ｍＬ）に溶解させた。内容物を分液漏斗に入れ、水性相を廃棄し、有機相を、さらなる飽和ａｑ．ＮａＨＣＯ３溶液（１×３００ｍＬ）及び飽和ａｑ．ＮａＣｌ溶液（３×３００ｍＬ）で逐次洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、蒸発乾固させて、イエロー色固体を得た。粗生成物を、ＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィー［溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２／ｎ－ヘキサン（１：１）、次いで１００％ＣＨ２Ｃｌ２］によって精製して、（Ｒ，Ｓ）－１－ブロモ－１－［４’，５’－（メチレンジオキシ）－２’－ニトロフェニル］エタン（Nguyen, D.P. et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. Journal of the American Chemical Society 136, 2240-2243 (2014)）４ｄ（１８．３３０ｇ、８９％）の純粋な試料をシャイニングイエロー色の結晶として得た。試料を－２０℃の冷凍庫中、乾燥雰囲気で暗所において数ヶ月間保存し、著しい分解はなかった：Ｒｆ＝０．１７（ＣＨ２Ｃｌ２／ｎ－ヘキサン、１：４）；ｍ．ｐ．７６．１～７７．８℃；１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２．０４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）、５．８９（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、６．１３（ｓ，２Ｈ）、７．２７（ｓ，１Ｈ）、７．３５（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２７．６（ＣＨ３）、４２．９（ＣＨ）、１０３．３（ＣＨ２）、１０５．１（ＣＨ）、１０８．８（ＣＨ）、１３４．８（Ｃ）、１４１．６（Ｃ）、１４７．７（Ｃ）、１５２．１（Ｃ）；ＩＲ（ＣＨ２Ｃｌ２）νｍａｘ２９８１、２９７０、２９３０、１６１５、１５０４、１４８１、１４２０、１３９５、１３８５、１３２８、１３０５、１２５７、１１５６、１１４１、１０５７、１０２８、１０１４、９５７、９２５、８７２、８１５、７５２、７３０、７１９、６９８ｃｍ－１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ Ｃ９Ｈ８ ７９ＢｒＮＯ４［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値：２９５．９５２９、実測値２９５．９５１９（Δ＝－３．４５ｐｐｍ）。
ｔｅｒｔ－ブチル （２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］アミノ｝プロパノエート（４ｅ）
Figure 2022505464000039
Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ １ｂ（６．２３３ｇ、２１．０ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を、乾燥１リットル三口丸底フラスコ中で乾燥ＴＨＦ（２７５ｍＬ）に懸濁させ、乾燥ＤＩＰＥＡ（９．９８ｍＬ、５７．２７３ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を添加した。内容物を窒素雰囲気下、ｒ．ｔ．で１０ｍｉｎにわたって撹拌した。フラスコをアルミ箔で包み、内容物を暗所で保管した。次いで、（Ｒ，Ｓ）－１－ブロモ－１－［４’，５’－（メチレンジオキシ）－２’－ニトロフェニル］エタン ４ｄ（５．２３２ｇ、１９．０９１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を反応混合物に添加した。均質なイエロー色溶液を暗所で窒素雰囲気下、ｒ．ｔ．において６８ｈにわたって撹拌させておいた。ＴＬＣ分析（ＳｉＯ２プレート；ＣＨ２Ｃｌ２／ｎ－ヘキサン＝３：７）によって、反応が完了していると判断し、減圧下で蒸発乾固させて、ダークブラウン色の油状物を得た。粗反応油状物をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）に溶解させ、飽和ブライン溶液（３×５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、蒸発乾固させて、ダークブラウン色の粘稠な油状物を得た。次いで、これを、ＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィー（勾配；溶離剤：１００％ＣＨ２Ｃｌ２、次いでＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＮＥｔ３＝９４：５：１）によって精製して、所望の生成物、ｔｅｒｔ－ブチル （２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］アミノ｝プロパノエート ４ｅをイエロー－ブラウン色の粘着性ゴム状物として得た（７．４９ｇ、８７％）：Ｒｆ＝０．１３（ＳｉＯ２プレート、ＣＨ２Ｃｌ２）；１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，内部標準としてＴＭＳを含むＣＤＣｌ３）δ１．３４及び１．３６（２×ｄ，Ｊ＝３．６及び３．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．４２及び１．４５０（２×ｓ，９Ｈ）、１．４５４及び１．４７（２×ｓ，９Ｈ）、２．５４～２．７４（ｍ，１Ｈ）、２．７５～２．８９（ｍ，１Ｈ）、４．０３～４．２７（ｍ，１Ｈ）、４．２８～４．５３（ｍ，１Ｈ）、５．１５～５．４３（ｍ，１Ｈ）、６．０５～６．１０（ｍ，２Ｈ）、７．２１（見かけ上広幅なｓ，１Ｈ）、７．３４５及び７．３５２（２×ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，内部標準としてＴＭＳを含むＣＤＣｌ３）δ（ジアステレオマーの混合物）２３．９（ＣＨ３）、２４．０（ＣＨ３）、２８．１２（ＣＨ３）、２８．１５（ＣＨ３）、２８．４１（ＣＨ３）、２８．４６（ＣＨ３）、４９．３（ＣＨ２）、４９．４（ＣＨ２）、５３．１（ＣＨ）、５３．２（ＣＨ）、５４．３（ＣＨ）、５４．５（ＣＨ）、７９．９（Ｃ）、８０．１（Ｃ）、８２．３（Ｃ）、８２．４（Ｃ）、１０２．８（２×ＣＨ２）、１０５．２（２×ＣＨ）、１０６．７７（ＣＨ）、１０６．８３（ＣＨ）、１３８．１（Ｃ）、１４３．３０（Ｃ）、１４３．３７（Ｃ）、１４６．７（Ｃ）、１５２．１（Ｃ）、１５２．２（Ｃ）、１５５．５（Ｃ）、１５５．６（Ｃ）、１７０．７（Ｃ）、１７０．８（Ｃ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ（相対強度）４５４［（Ｍ＋Ｈ）＋，８６％］、３０１（７０）、２６１（１００）、２０５（７）、２０３（１０）、１８６（７）、１４７（１０）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ Ｃ２１Ｈ３２Ｏ８Ｎ３［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：４５４．２１８４、実測値４５４．２２０１（Δ＝３．６５ｐｐｍ）。
（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］アミノ｝プロパン酸（４）
Figure 2022505464000040
ｔｅｒｔ－ブチル （２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］アミノ｝プロパノエート ４ｅ（４．３０３ｇ、９．４８９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を、光を排除するためにアルミ箔で包んだ乾燥２５０ｍＬ丸底フラスコ中で乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解させた。新たに蒸留したＣＦ３ＣＯＯＨ（１５ｍＬ、１９５．８８７ｍｍｏｌ、２０．６４４ｅｑ．）を添加すると、イエロー色溶液がブラウン色に変わった。乾燥Ｅｔ３ＳｉＨ（１０．０ｍＬ、６２．６０８ｍｍｏｌ、６．５９８ｅｑ．）を添加し、反応混合物を暗所でｒ．ｔ．において撹拌した。反応をＬＣ－ＭＳ分析によって定期的に監視した。４８ｈ後、ＬＣ－ＭＳ分析（Ｃ１８逆相カラム、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ、勾配）によって反応が完了していると判断し、次いで、混合物を蒸発乾固させて、ダークブラウン色のゴム状物を得た。乾燥２Ｌ丸底フラスコ中で、このゴム状物を無水ＣＨ３ＯＨ（１０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下において０℃に冷却した。これを、０℃において乾燥Ｅｔ２Ｏ（９００ｍＬ）の添加によって研和し、次いで、ｒ．ｔ．で１ｈにわたって激しく撹拌して、ペールイエロー色の沈殿物を得た。沈殿物を濾過し、追加の乾燥Ｅｔ２Ｏ（２×２００ｍＬ）で、続いてｎ－ヘキサン（１５０ｍＬ）で洗浄した。ペールイエロー色の粉末を、１００ｍＬ丸底フラスコに移し、暗所において高真空（＜０．１ｍｂａｒ）で４０ｈにわたって乾燥させた。（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］アミノ｝プロパン酸 ４が、さらさらしたペールイエロー色の粉末として得られた（３．６４６ｇ、７３％）。生成物は、ＣＦ３ＣＯＯＨの塩及びエピマーの約１：１混合物である。生成物を暗所でアルゴン下、－２０℃において保存した：１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，内部標準としてＴＭＳを含むＤＭＳＯ－ｄ６）δ１．３６及び１．３８（２×ｄ，Ｊ＝３．８及び３．８Ｈｚ，３Ｈ）、２．６５～２．９５及び２．９６～３．２０（２×ｍ，１Ｈ）、３．０７～３．２５（ｍ，１Ｈ）、３．６０～３．７０（ｍ，１Ｈ）、３．７１～３．８５及び４．１８～４．４４（２×ｍ，１Ｈ）、６．２１及び６．２３（２×ｄ，Ｊ＝３．５及び２．９Ｈｚ，２Ｈ）、７．４１及び７．４２（２×ｓ，１Ｈ）、７．５２及び７．５３（２×ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，内部標準としてＴＭＳを含むＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ジアステレオマーの混合物）２２．６（ＣＨ３）、２２．７（ＣＨ３）、３８．５（ＣＨ２）、４５．８（ＣＨ２）、５１．６（ＣＨ）、５１．８（ＣＨ）、５２．３（ＣＨ）、５２．６（ＣＨ）、１０３．２（ＣＨ２）、１０３．３（ＣＨ２）、１０４．５（ＣＨ）、１０４．６（ＣＨ）、１０６．４（ＣＨ）、１０６．６（ＣＨ）、１１７．１（Ｃ，ｑ，１ＪＣ－Ｆ＝２９９．０Ｈｚ）、１３５．４（Ｃ）、１３５．６（Ｃ）、１４２．９６（Ｃ）、１４３．０１（Ｃ）、１４６．６１（Ｃ）、１４６．６６（Ｃ）、１５１．９３（Ｃ）、１５１．９６（Ｃ）、１５８．５６（Ｃ，ｑ，２ＪＣ－Ｆ＝３１．５Ｈｚ）、１６８．７（２×Ｃ）、１６９．６（２×Ｃ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ（相対強度）２９８［（Ｍ＋Ｈ）＋，１００％］、２６１（１０）、２２５（１０）、２１１（４）、１４７（１２）、１４４（９）、１３４（６）、１０５（９）、８２（３１）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ Ｃ１２Ｈ１６Ｏ６Ｎ３［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：２９８．１０３４、実測値２９８．１０３９（Δ＝１．７４ｐｐｍ）。
２，５－ジオキソピロリジン－１－イル （１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル）カーボネート（５ａ）
Figure 2022505464000041
（Ｒ，Ｓ）－１－［４’，５’－（メチレンジオキシ）－２’－ニトロフェニル］エタノール ４ｃ（４２．２３４ｇ、２００．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を、乾燥２リットル三口丸底フラスコに装入し、乾燥ＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）に溶解させた。この溶液に、乾燥ＤＩＰＥＡ（１０４．５ｍＬ、６００．０ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）、続いてＮ，Ｎ－ジスクシンイミジルカーボネート（８０．８９６ｇの純度≧９５％、３００ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を添加した。フラスコをアルミ箔で包んで、内容物を暗所で保管した。不均質なイエロー色反応混合物を、暗所でアルゴン雰囲気下、ｒ．ｔ．において撹拌した。１６ｈ後、反応混合物は均質であり、ＴＬＣ分析（ＳｉＯ２プレート、ＣＨ３ＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１：１９）によって反応が完了していると判断した。次いで、イエロー色反応混合物を、Biotage（登録商標）Isolute ＨＭ－Ｎ吸着剤に吸着させ、減圧乾燥させた。次いで速やかに、これを、暗所においてＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィー［溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２、次いでＣＨ３ＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１：１９］に供して、所望の生成物、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル－（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル）カーボネート ５ａをイエロー色の針状結晶として得た（６５．０５１ｇ、９２％）［注：ＳｉＯ２への長時間曝露時の生成物の分解を回避するために、フラッシュカラムは速やかに行わなければならない］。生成物５ａを直ちに、後続ステップに使用した。これは、－２０℃の冷凍庫中で暗所において保存可能である：Ｒｆ＝０．６（ＳｉＯ２プレート、ＣＨ３ＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１：１９）；１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，内部標準としてＴＭＳを含むＣＤＣｌ３）δ１．７５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）、２．８１（ｓ，４Ｈ）、６．１５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，２Ｈ）、６．４２（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．１１（ｓ，１Ｈ）、７．５１（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，内部標準としてＴＭＳを含むＣＤＣｌ３）δ２２．２（ＣＨ３）、２５．６（ＣＨ２）、７６．４（ＣＨ）、１０３．５（ＣＨ２）、１０５．５（ＣＨ）、１０５．８（ＣＨ）、１３３．１（Ｃ）、１４１．６（Ｃ）、１４８．０（Ｃ）、１５０．７（Ｃ）、１５３．０（Ｃ）、１６８．６（Ｃ）。
（２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－（｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ］カルボニル｝－アミノ）プロパン酸（５ｂ）
Figure 2022505464000042
Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯＨ １ａ（２．５５３ｇ、１２．５ｍｍｏｌ、１．２５ｅｑ．）を、光を排除するためにアルミ箔で包んだ乾燥１リットル一口丸底フラスコ中で乾燥ＴＨＦ（１８０ｍＬ）及び乾燥ＣＨ３ＣＮ（２０ｍＬ）に懸濁させた。この混合物に、乾燥ＤＩＰＥＡ（５．２３ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を添加し、内容物をアルゴン雰囲気下、ｒ．ｔ．で２０ｍｉｎにわたって撹拌し、その後、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル－（１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル）カーボネート ５ａ（３．５２３ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を添加した。この不均質混合物を暗所でアルゴン雰囲気下、ｒ．ｔ．において撹拌し、反応の進行を、ＬＣ－ＭＳ分析によって定期的に監視した。数時間後、不均質混合物は均質なイエロー色溶液になり始めた。２４ｈ後、反応が完了していると判断し、内容物をBiotage（登録商標）Isolute HM-N吸着剤に吸着させ、減圧乾燥させた。次いで速やかに、これを、暗所においてＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィー［溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２、次いでＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＨ＝９４：５：１］に供して、所望の生成物、（２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－（｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロパン酸 ５ｂをブラウン－イエロー色ゴム状物として得た。これを、減圧下でＣＨ２Ｃｌ２／シクロヘキサン（１：１）を使用する共沸蒸発に供して、生成物５ｂから残留ＣＨ３ＣＯＯＨを除去した。生成物を高真空で乾燥させて、５ｂの純粋な試料をイエロー色固体（４．３６０ｇ、９９％）及びエピマーの約１：１混合物として得た；Ｒｆ＝０．４１（ＳｉＯ２プレート、ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＨ＝９４：５：１）；ＭＳ（ＥＳＩ－、ＬＣ－ＭＳ）ｍ／ｚ（相対強度）４４０［（Ｍ－Ｈ）－、１００％］。
（２Ｓ）－２－アミノ－３－（｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ］カルボニル｝－アミノ）プロパン酸（５）
Figure 2022505464000043
新たに蒸留したＣＦ３ＣＯＯＨ（１５ｍＬ、１９５．８９４ｍｍｏｌ、２１．２９３ｅｑ．）を、アルミ箔で包んだ乾燥１Ｌ一口丸底フラスコ中で、（２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－（｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）－エトキシ］カルボニル｝アミノ）プロパン酸 ５ｂ（４．０６１ｇ、９．２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の溶液に添加した。ＣＦ３ＣＯＯＨを添加すると、イエロー色溶液がダークブラウン色に変わった。反応物を暗所でｒ．ｔ．において撹拌し、ＴＬＣ分析によって監視した。２ｈ後、ＴＬＣ分析（ＳｉＯ２プレート；ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＨ＝９４：５：１）及びＬＣ－ＭＳ分析（Ｃ１８逆相カラム、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ、勾配）の両方によって、反応が完了していると判断した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固させて、ダークブラウン色のゴム状物を得た。このゴム状物を乾燥ＣＨ３ＯＨ（５ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却し、乾燥Ｅｔ２Ｏ（０．９Ｌ）を用いて研和して、ペールイエロー色沈殿物を得た。混合物を、暗所でアルゴン雰囲気下、ｒ．ｔ．において激しく撹拌させておいた。次いで、ペールイエロー色沈殿物を濾過し、Ｅｔ２Ｏ（２×１００ｍＬ）及び乾燥ヘキサン（５０ｍＬ）で洗浄した。これを真空中で（＜０．１ｍｂａｒ）２日間暗所で乾燥させて、所望の（２Ｓ）－２－アミノ－３－（｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エトキシ］カルボニル｝－アミノ）プロパン酸ＴＦＡ塩 ５を、微細なペールイエロー色粉末（４．１３２ｇ、９９％）及び１Ｈ及び１３ＣＮＭＲ分光分析によって観察されたエピマーの約１：１混合物として得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ１．５７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）、２．６８（ｓ，２Ｈ）、３．４１～３．５８（ｍ，１Ｈ）、３．５９～３．７４（ｍ，１Ｈ）、３．７８～４．１５（ｍ，１Ｈ）、６．１４（ｓ，２Ｈ）、６．２２（ｑ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．１２（見かけ上ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．４７（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ２２．４（ＣＨ３）、２２．５（ＣＨ３）、４２．１（ＣＨ２）、４２．３（ＣＨ２）、５５．６（ＣＨ）、５５．９（ＣＨ）、７０．４（２×ＣＨ）、１０４．８（２×ＣＨ２）、１０５．７（２×ＣＨ）、１０６．７（ＣＨ）、１０６．９（ＣＨ）、１１８．２（Ｃ，ｑ，１ＪＣ－Ｆ＝２９２．６Ｈｚ）、１３６．８（Ｃ）、１３７．１（Ｃ）、１４２．８（Ｃ）、１４２．９（Ｃ）、１４８．８（Ｃ）、１５４．０（Ｃ）、１５８．５（Ｃ）、１５８．６（Ｃ）、１６３．１（Ｃ，ｑ，２ＪＣ－Ｆ＝３４．４Ｈｚ）、１７０．９（２×Ｃ）、１７４．９（２×Ｃ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ（相対強度）３４２［（Ｍ＋Ｈ）＋，１００％］、３１１（１０）、２３３（５）、１８９（９）、１３０（１９）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ Ｃ１３Ｈ１６Ｏ８Ｎ３［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３４２．０９３２、実測値３４２．０９２３（Δ＝－２．６３ｐｐｍ）。
２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エタン－１－オール（６ａ）
Figure 2022505464000044
新たに調製したＮａＯＨの溶液（０．５Ｍ、４０ｍＬの脱イオンＨ２Ｏ中８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を５００ｍＬの丸い三口丸底フラスコ（round 3-necked round-bottomed flask）に入れ、ｒ．ｔ．でアルゴンガス流によるバブリングによって溶液を脱気した。３０ｍｉｎ後、メルカプトエタノール（１．４７ｍＬ、２１．０ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ．）をフラスコに添加し、さらに１５ｍｉｎにわたって脱気を続けた。これとは別に、新たに、（Ｒ，Ｓ）－１－ブロモ－１－［４’，５’－（メチレンジオキシ）－２’－ニトロフェニル］エタン １３（５．４８１ｇ、２０．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、アルミホイルで包んだ１００ｍＬ丸底フラスコ中で、１，４－ジオキサン（２０ｍＬ）に溶解させ、暗所で１５ｍｉｎにわたって、アルゴンガス流のバブリングによって脱気した。脱気した、１３の１，４－ジオキサン中溶液を、ａｑ．ＮａＯＨ及びメルカプトエタノール溶液を含むフラスコに、ｒ．ｔ．において９０ｍｉｎの期間にわたってアルゴンガスの陽圧下でカニューレを使用して１滴ずつ移した。イエロー色沈殿物が形成された。次いで、これを、脱気された１，４－ジオキサン（６０ｍＬ）の添加によって溶解させ、続いて、均質な透明イエロー色溶液が得られるまで、３０ｍｉｎにわたって超音波処理した。次いで、内容物を、暗所でアルゴン雰囲気下、ｒ．ｔ．において１２ｈにわたって撹拌させておいた。その後、ＴＬＣ及びＬＣ－ＭＳ分析（Ｃ１８逆相カラム、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ、勾配）によって、反応が完了していると判断した。次いで、混合物を減圧蒸発させて、揮発性有機成分を除去した。次いで、イエロー色の水性内容物を、ＥｔＯＡｃ（２×１７５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（１×５００ｍＬ）、続いてブライン溶液（３×５００ｍＬ）で洗浄した。次いで、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、蒸発乾固させて、イエロー色の油状物を得た。生成物を、暗所においてＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィー（溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝３：７）によって精製して、２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エタン－１－オール ６ａを粘着性のイエロー色油状物として得た（５．１７９ｇ、９５％）：Ｒｆ＝０．３３（ＳｉＯ２プレート、ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝３：７）；１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．５５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）、１．９６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ）、２．４４～２．６５（ｍ，２Ｈ）、３．５２～３．７４（ｍ，２Ｈ）、４．７８（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．１０（ｄｄ，Ｊ＝３．８，１．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．２７（ｓ，１Ｈ）、７．２８（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２３．２（ＣＨ３）、３４．９（ＣＨ２）、３８．４（ＣＨ）、６０．９（ＣＨ２）、１０３．１（ＣＨ２）、１０４．８（ＣＨ）、１０８．０（ＣＨ）、１３６．１（Ｃ）、１４３．３（Ｃ）、１４６．９（Ｃ）、１５２．０（Ｃ）；ＩＲ（非希釈）νｍａｘ３３９３、２９８０、１６１７、１５１８、１５０３、１４８０、１４１８、１３７５、１３３２、１２５２、１１５６、１０３１、９２８、８７２、８１７、７５９；ｍ／ｚ（ＥＳＩ－，ＬＣ－ＭＳ）２７０．１［（Ｍ－Ｈ）－，１００％］。
２，５－ジオキソピロリジン－１－イル－（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エチル）カーボネート（６ｂ）
Figure 2022505464000045
ＤＡＰ誘導体 ６ｃ及び６ｄの合成のための後続反応に使用する中間体６ｂを、アルコール６ａから出発してインサイチュで合成した。５００ｍＬ三口丸底フラスコを、ヒートガンを使用して真空中で乾燥させ、アルゴンガスでパージした；この手順を、使用前に３回繰り返した。乾燥フラスコに、乾燥ＣＨ３ＣＮ（９０ｍＬ）に溶解させた２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エタン－１－オール ６ａ（４．８８３ｇ、１８．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を装入した。この反応混合物に、暗所でアルゴン雰囲気下、ｒ．ｔ．において、乾燥ＤＩＰＥＡ（９．４１ｍＬ、５４．０ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）、続いてＮ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（６．７９６ｇの純度≧９５％、２５．２ｍｍｏｌ、１．４ｅｑ．）を添加した。反応混合物が濁ったイエロー色に変わり、ホワイト色沈殿が形成され始め、１ｈ後、反応混合物は均質なイエロー－ブラウン色溶液になった。反応物を、ｒ．ｔ．で１２ｈにわたって撹拌させておき、その後、ＴＬＣ分析（ＳｉＯ２プレート、ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝３：７）によって反応が完了していると判断した。２，５－ジオキソピロリジン－１－イル－（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エチル）カーボネート ６ｂを、さらに精製せずに直ちに次のステップに持ち越した：Ｒｆ＝０．１２（ＳｉＯ２プレート、ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝３：７）。
ｔｅｒｔ－ブチル （２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－｛［（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパノエート （６ｃ）
Figure 2022505464000046
Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（８．５４８ｇ、２８．８ｍｍｏｌ、１．６ｅｑ．）を、前記で調製した６ｂの溶液に一度に添加した。イエロー色の反応混合物が数分で均質になり、内容物を暗所でアルゴン雰囲気下、において撹拌した。１０ｈ後、ＴＬＣ分析（ＳｉＯ２プレート、Ｒｆ＝０．３９、ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝３：７）及びＬＣ－ＭＳ分析（Ｃ１８逆相カラム、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ）の両方によって、６ｂの消費を確認して、反応が完了していると判断した。次いで、反応混合物をBiotage（登録商標）Isolute HM-N吸着剤に吸着させ、減圧乾燥させた。次いで、これを、暗所でＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィー［溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝３：７］に供して、所望のｔｅｒｔ－ブチル （２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－｛［（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパノエート ６ｃを、どろりとしたイエロー色ゴム状物（９．４０５ｇ、９４％）及びエピマーの約１：１混合物として得た：Ｒｆ＝０．３９（ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝３：７）；１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（エピマーの混合物）１．４４（ｓ，９Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）、１．５４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）、２．３６～２．６１（ｍ，２Ｈ）、３．４１～３．６８（ｍ，２Ｈ）、４．００～４．１８（ｍ，２Ｈ）、４．２４（広幅なｓ，１Ｈ）、４．８５（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．１５（広幅なｓ，１Ｈ）、５．４１（広幅なｓ，１Ｈ）、６．１０（ｄ，Ｊ＝６．８，２Ｈ）、７．２７（ｓ，１Ｈ）、７．２９（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２３．１（ＣＨ３）、２８．１（ＣＨ３）、２８．４（ＣＨ３）、３０．５（ＣＨ２）、３９．０（ＣＨ）、４３．２（ＣＨ２）、５４．６（ＣＨ）、６５．２（ＣＨ２）、８０．１（Ｃ）、８２．９（Ｃ）、１０３．０（ＣＨ２）、１０４．７（ＣＨ）、１０８．２（ＣＨ）、１３６．３（Ｃ）、１４３．５（Ｃ）、１４６．９（Ｃ）、１５２．１（Ｃ）、１５５．６（Ｃ）、１５６．４（Ｃ）、１６９．７（Ｃ）；ｍ／ｚ（ＥＳＩ＋，ＬＣ－ＭＳ）５５８．２［（Ｍ＋Ｈ）＋，１００％］
（２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－｛［（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸（６ｄ）
Figure 2022505464000047
Ｂｏｃ－Ｌ－Ｄａｐ－ＯＨ（１３．４７９ｇ、６６．０ｍｍｏｌ、１．０８２ｅｑ．）を、アルゴン下において６ｂ（２６．７０ｇ、前記で調製）の乾燥ＣＨ３ＣＮ（３０５ｍＬ）中溶液に一度に添加し、ｒ．ｔ．で１２ｈにわたって撹拌した。その後、ＬＣ－ＭＳ（Ｃ１８逆相カラム、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ）によって、反応が完了していると判断し、内容物を、Biotage（登録商標）Isolute HM-N吸着剤に吸着させ、減圧乾燥させた。次いで、これを、暗所で球状ＳｉＯ２でのフラッシュクロマトグラフィー［Supelco（登録商標）、Sigma Aldrich Ltd.社から購入、粒径４０～７５μｍ；勾配；溶離剤：ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝１：１→７：３→１：０］に供して、所望の（２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－｛［（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸 ６ｄをどろどろしたイエロー色ゴム状物（２８．９９５ｇ、９５％）及びエピマーの約１：１混合物として得た：１Ｈ ＮＭＲ［４００．１３ＭＨｚ，内部標準として０．１％ｖ／ｖのＴＭＳを含むＣＤＣｌ３］δ（エピマーの混合物）１．４３（ｓ，９Ｈ）、１．５２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）、２．３０～２．９５（ｍ，２Ｈ）、３．３３～３．８２（広幅なｍ，２Ｈ）、３．８６～４．１８（ｍ，２Ｈ）、４．２０～４．４８（ｍ，１Ｈ）、４．６４～４．９７（ｍ，１Ｈ）、５．３４～５．５８（広幅なｓ，１Ｈ）、５．６０～５．８４（広幅なｓ，１Ｈ）、６．２０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．１０～７．３９（ｍ，２Ｈ）、８．４７（広幅なｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ［１００．６１ＭＨｚ，内部標準として０．１％ｖ／ｖのＴＭＳを含むＣＤＣｌ３］δ２３．１（ＣＨ３）、２８．４（３×ＣＨ３）、３０．５（ＣＨ２）、３９．０（ＣＨ）、４２．７（ＣＨ２）、５４．４（ＣＨ）、６５．３（ＣＨ２）、８０．８（Ｃ）、１０３．１（ＣＨ２）、１０４．７（ＣＨ）、１０８．１（ＣＨ）、１３６．２（Ｃ）、１４３．４（Ｃ）、１４６．９（Ｃ）、１５２．１（Ｃ）、１５６．３（Ｃ）、１５７．２（Ｃ）、１７３．５（Ｃ）；ｍ／ｚ（ＥＳＩ－，ＬＣ－ＭＳ）５００．１［（Ｍ－Ｈ）－，１００％］
（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛［（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸（６）
Figure 2022505464000048
方法Ｉ（６ｃから調製）：
（２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－｛［（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパノエート ６ｃ（６．７２８ｇ、１２．０６６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）の乾燥試料を、乾燥２５０ｍＬ一口丸底フラスコに入れ、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解させ、フラスコを箔に包んで、光を排除した。この溶液に乾燥Ｅｔ３ＳｉＨ（２０ｍＬ、１２５．２１５ｍｍｏｌ、１０．３７８ｅｑ．）を添加し、続いて、新たに蒸留したＣＦ３ＣＯＯＨ（２０ｍＬ、２６１．１８２ｍｍｏｌ、２１．６４７ｅｑ．）を、ｒ．ｔ．においてシリンジを用いて１５ｍｉｎかけて滴下添加した。反応混合物がイエロー色からブラウン－グリーン色に変わった。これを、暗所でｒ．ｔ．において撹拌させておいた。２４ｈ後、ＴＬＣ（ＳｉＯ２プレート、ＥｔＯＡｃ／ｎ－ヘキサン＝３：７）及びＬＣ－ＭＳ分析（Ｃ１８逆相カラム、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ）によって、反応が完了していると判断した。反応混合物を暗所で減圧濃縮して、イエロー－ブラウン色のゴム状物を得た。これを無水ＣＨ３ＯＨ（２０ｍＬ）に溶解させ、減圧下で蒸発乾固させた：これを３回繰り返して、高真空（＜０．１ｍｂａｒ）で乾燥させて、残留ＣＦ３ＣＯＯＨ、Ｅｔ３ＳｉＨ及びＨ２Ｏを全て除去した。次いで、イエロー－ブラウン色のゴム状物を乾燥ＣＨ３ＯＨ（４０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下で、乾燥２Ｌ丸底フラスコに移し、０℃に冷却した。暗所でアルゴンガスの陽圧下においてこの溶液に、カニューレによって乾燥Ｅｔ２Ｏ（２Ｌ）を添加し、内容物を、激しく撹拌した。イエロー色沈殿物が形成され、内容物を０℃において１５ｍｉｎにわたって、次いでｒ．ｔ．でさらに２ｈにわたって、激しく撹拌した。ペールイエロー色沈殿物を濾過し、乾燥Ｅｔ２Ｏ（３×２５０ｍＬ）で、最後に乾燥ｎ－ヘキサン（５０ｍＬ）で洗浄した。生成物を暗所において真空中で（＜０．１ｍｂａｒ）一晩、１４ｈにわたって乾燥させて、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛［（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エトキシ）カルボニル］アミノ｝－プロパン酸ＴＦＡ塩 ６を、ペールイエロー色粉末（３．９４０ｇ、６３％）及びエピマーの１：１混合物として得た：１Ｈ ＮＭＲ［４００．１３ＭＨｚ，内部標準として１％ｖ／ｖのＴＭＳを含むＣＤ３ＯＤ／ＣＦ３ＣＯＯＤ（５：１）］δ（エピマーの混合物）１．５５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）、２．４９～２．７３（ｍ，２Ｈ）、３．６３（ｄｄ，Ｊ＝１５．０，６．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．７８（ｄｄｄ，Ｊ＝１５．０，３．６，２．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．０～４．２４（ｍ，３Ｈ）、４．８１（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．１１及び６．１３（２×ｓ，１Ｈ）、６．４０（ｓ，１Ｈ）、７．２９及び７．３３（２×ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ［１００．６１ＭＨｚ，内部標準として１％ｖ／ｖのＴＭＳを含むＣＤ３ＯＤ／ＣＦ３ＣＯＯＤ（５：１）］δ２３．２（ＣＨ３）、３１．４（ＣＨ２）、４０．０（ＣＨ）、４２．１（ＣＨ２）、５５．１（ＣＨ）、６５．８（ＣＨ２）、１０４．８（ＣＨ２）、１０５．６（ＣＨ）、１０９．０（ＣＨ）、１１７．０（Ｃ，１ＪＣ－Ｆ＝２８６．５Ｈｚ）、１３７．１（Ｃ）、１４４．９（Ｃ）、１４８．７（Ｃ）、１５３．７（Ｃ）、１６０．７（Ｃ）、１６０．８（Ｃ，１ＪＣ－Ｆ＝３８．１Ｈｚ）、１７０．２（Ｃ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ（相対強度）４０２［（Ｍ＋Ｈ）＋，１００％］、３８６（２０）、２２４（９）、２０８（１１）、１５１（１１）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ Ｃ１５Ｈ２０Ｎ３Ｏ８Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：４０２．０９７１、実測値４０２．０９７４（Δ＝０．７ｐｐｍ）。
保存： ＤＡＰアミノ酸 ６・ＴＦＡの乾燥試料を、低温で乾燥した暗環境で気密性の暗色ガラスバイアルに保存した。これは、３年間分解することなく安定であった。
取り扱い： ＤＡＰアミノ酸 ６・ＴＦＡは、光感受性であり、湿った空気への曝露時にわずかに吸湿性である。このため、バイアル中のそれの試料は常に、暗く乾燥した雰囲気で取り扱った。特筆すべきは、冷蔵庫又は冷凍庫から取り出した６・ＴＦＡを含むバイアルは、開封して取り扱う前に必ず、ｒ．ｔ．まで温まるようにしたことである。
方法II（６ｄから調製）：
（２Ｓ）－２－［（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ］－３－｛［（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸 ６ｄ（２６．７０ｇ、５３．２３９５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）の乾燥試料を、乾燥１リットル一口丸底フラスコに入れ、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）に溶解させた。光を排除するためにフラスコをアルミ箔で包み、乾燥Ｅｔ３ＳｉＨ（８４．６９ｍＬ、５３０．２４ｍｍｏｌ、１０．０ｅｑ．）を溶液に加えた。５ｍｉｎ後、新たに蒸留したＣＦ３ＣＯＯＨ（８１．５４ｍＬ、１．０６４８ｍｏｌ、２０．０ｅｑ．）を、１５ｍｉｎにわたって溶液に滴下添加した。溶液がイエロー－ブラウン色に変わった。これを、暗所でｒ．ｔ．において撹拌させておいた。５ｈ後、ＴＬＣ（ＳｉＯ２プレート、ＥｔＯＡｃ／ＣＨ３ＣＯＯＨ＝９８：２）及びＬＣ－ＭＳ分析（Ｃ１８逆相カラム、移動相としてＨ２Ｏ－ＣＨ３ＣＮ）によって、反応が完了していると判断した。溶液を減圧下で濃縮乾固させて、イエロー－ブラウン色ゴム状物を得た。これを、乾燥ＣＨ３ＯＨ（４０ｍＬ）に溶解させ、減圧下で蒸発乾固させた；これを３回繰り返し、生成物を高真空（＜０．１ｍｂａｒ）で乾燥させて、残留ＣＦ３ＣＯＯＨ、Ｅｔ３ＳｉＨ及びＨ２Ｏを全て除去した。イエロー－ブラウン色ゴム状物を乾燥ＣＨ３ＯＨ（４０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下で、乾燥３Ｌ丸底フラスコに移し、０℃に冷却した。内容物を激しく撹拌しながら、アルゴンガスの陽圧下でカニューレによってフラスコに乾燥Ｅｔ２Ｏ（２．５Ｌ）を添加した。ペールイエロー色沈殿物が形成された。内容物を０℃で１５ｍｉｎにわたって、次いでｒ．ｔ．で２ｈにわたって激しく撹拌した。次いで、沈殿物を濾過し、乾燥Ｅｔ２Ｏ（３×５００ｍＬ）で、続いて乾燥ｎ－ヘキサン（１５０ｍＬ）で洗浄した。生成物を暗所において高真空（＜０．１ｍｂａｒ）で一晩、１４ｈにわたって乾燥させて、（２Ｓ）－２－アミノ－３－｛［（２－｛［１－（６－ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エチル］チオ｝エトキシ）カルボニル］アミノ｝プロパン酸ＴＦＡ塩 ６を、ペールイエロー色粉末（２０．４６５ｇ、７５％）及びエピマーの約１：１混合物として得た。
Ｖｌｍ ＴＥ基質の合成
Figure 2022505464000049
デプシペプチジル－ＳＮＡＣ化合物 ７及び８の合成スキーム。
ａ，デオキシテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ８の合成。ａ）８ｃ、ＥＤＣ、ＤＭＡＰ、７２％；ｂ）ＴＦＡ、ＤＣＭ、９９％；ｃ）ＴＢＳＣｌ、Ｉｍｉｄ．、ＤＣＭ；ｄ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、７８％、２ステップ；ｅ）（ＣＯＣｌ）２、ＤＭＦ、ＤＣＭ；ｆ）ＴＥＡ、ＤＣＭ、５３％；ｇ）ＨＦ、Ｐｙｒ．、ＭｅＣＮ、８４％；ｈ）ＥＤＣ、ＤＭＡＰ、ＴＥＡ、ＤＣＭ、６０％；ｉ）ＬｉＯＨ、ＭｅＯＨ、ＴＨＦ、６０％；ｊ）ＥＤＣ、ＤＭＡＰ、ＤＭＦ、５：４ｄｒ、９２％
ｂ，テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７の合成。ａ）アリルＢｒ、Ｃｓ２ＣＯ３、ＤＭＦ、９５％；ｂ）Ｂｏｃ－ｄ－Ｖａｌ、ＥＤＣ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ、８４％；ｃ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、モルホリン、ＤＣＭ；ｄ）ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ、９４％；ｅ）ＨＣｌ、ジオキサン；ｆ）ｄ－ＨＩＶ、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ、９５％。
ｃ デオキシテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ８の構造、及び
ｄ テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７の構造。
（Ｓ）－Ｓ－（２－アセトアミドエチル） ２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－メチルブタンチオエート（７ａ）
Figure 2022505464000050
Ｂｏｃ－Ｌ－バリン（７．２９ｇ、３３．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。Ｎ－アセチル－システアミン（４．００ｇ、３３．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）。この混合物に、Ｎ－（３－ジアミノメチルプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、７．７２ｇ、４０．２７ｍｍｏｌ、１．２当量）及び４－（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ、４１０ｍｇ、３．３６ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加した。反応物を周囲温度において１６ｈにわたって撹拌した。反応をＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機画分を合わせ、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。所望の生成物（７．６９ｇ、２４．１６ｍｍｏｌ、収率７２％）を、シリカカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）によって精製した。Ｒｆ＝０．３７（アセトン：ヘキサン類２：３）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．９５（ｓ，１Ｈ）、４．９７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．２１（ｄｄ，Ｊ＝８．９，４．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．４８～３．３０（ｍ，２Ｈ）、３．０８～２．９４（ｍ，２Ｈ）、２．２２（ｔｄ，Ｊ＝１３．４，６．７Ｈｚ，１Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）、０．９６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、０．８５（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２０１．７４、１７０．３５、１５５．６６、８０．４２、６５．６８、３９．３８、３０．７７、２８．３８、２８．３３、２３．１６、１９．４０、１７．０１。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算質量値（Ｃ１４Ｈ２６Ｎ２Ｏ４ＳＮａ）３４１．１５１１、実測値３４１．１５１２。
（Ｓ）－Ｓ－（２－アセトアミドエチル）２－アミノ－３－メチルブタンチオエート（７ｂ）
Figure 2022505464000051
丸底フラスコ中で、７ａ（０．５ｇ、１．５７ｍｍｏｌ、１．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解させた。この溶液を、氷浴を使用して０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を添加した。反応を周囲温度において４５ｍｉｎにわたって進行させた。反応混合物を濃縮し、所望の生成物（３４１ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ、収率＞９９％）をシリカカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中ＭｅＯＨ ５％から１０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ８．４５（ｓ，１５７ ２Ｈ）、８．１０（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．１５（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．２７～３．１７（ｍ，２Ｈ）、３．１３～２．９８（ｍ，２Ｈ）、２．２８～２．０９（ｍ，１Ｈ）、０．９９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、０．９５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１９６．１８、１６９．３５、６３．４８、３７．７８、３０．１０、２８．４０、２２．５０、１８．０３、１７．２６。
（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパン酸（７ｃ）
Figure 2022505464000052
丸底フラスコ中で、Ｌ－乳酸エチル（５．０８ｇ、４３．０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２（５５ｍＬ）に溶解させ、溶液を、氷浴を使用して０℃に冷却した。この混合物に、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロリド（６．４８ｇ、４５．１５ｍｍｏｌ、１．０５当量）及びイミダゾール（３．５１ｇ、５１．６ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、その後、反応を周囲温度において２ｈにわたって進行させた。次いで、反応混合物をＨ２Ｏで希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。有機画分を合わせ、氷冷５％ＨＣｌ（ａｑ）で洗浄し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。粗中間体（Ｓ）－エチル ２－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ）プロパノエートをＴＨＦ（２１５ｍＬ）に溶解させた。混合物を、氷浴を使用して０℃に冷却し、ＬｉＯＨ（０．４Ｍ、２１５ｍＬ）の冷却溶液を２０ｍｉｎかけて滴下添加した。反応混合物を周囲温度で４ｈにわたって撹拌した。得られた反応混合物を、元の容量の半分まで濃縮し、得られた水溶液をＥｔ２Ｏで３回抽出した。有機画分を合わせ、ＮａＨＣＯ３飽和溶液（ａｑ）で３回抽出した。水性画分を合わせ、１Ｍ ＫＨＳＯ４（ａｑ）でｐＨ４まで酸性化し、Ｅｔ２Ｏで３回抽出した。有機画分を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。所望の生成物（６．８８ｇ、３３．７ｍｍｏｌ、２ステップで収率７８％）を得た。これは、さらに精製せずに使用した。ＮＭＲデータは、文献値（Ekici, O.D., Paetzel, M. & Dalbey, R.E. Unconventional serine proteases: variations on the catalytic Ser/His/Asp triad configuration. Protein Sci 17, 2023-2037 (2008)）と一致していた。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．３６（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、１．４５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）、０．９２（ｓ，９Ｈ）、０．１３（ｓ，６Ｈ）。
（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）プロパノイルクロリド（７ｄ）
Figure 2022505464000053
丸底フラスコ中で、７ｃ（３．７ｇ、１８ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（４５ｍＬ）に溶解させ、溶液を、氷浴を使用して０℃に冷却した。塩化オキサリル（ＤＣＭ中２．０Ｍ溶液１３．６ｍＬ、１０．０当量）及び触媒量のＤＭＦを添加した。反応は、２ｈにわたって０℃から周囲温度まで進行した。反応混合物を濃縮した。粗油状物は、精製せずに後続反応に使用した。
ＴＢＳＯ－Ｌ－Ｌａｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＳＮＡＣ（７ｅ）
Figure 2022505464000054
丸底フラスコ中で、７ｂ（１．９５ｇ、９ｍｍｏｌ、１．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）に溶解させた。粗油状物７ｄ（１８ｍｍｏｌ、２．０当量）をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解させ、この混合物に添加した。Ｅｔ３Ｎ（２．５ｍＬ、１８ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加し、反応を４ｈにわたって進行させた。反応混合物をＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、ブラインで洗浄し、濃縮した。所望の生成物（１．９３ｇ、４．７７ｍｍｏｌ、収率５３％）を、粗混合物からシリカカラムクロマトグラフィー（ヘキサン類中ＥｔＯＡｃ ５０％から９０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．２２（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、６．０３（ｓ，１Ｈ）、４．５３（ｄｄ，Ｊ＝９．３，４．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．２５（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．３８（ｑ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．０７～２．９８（ｍ，２Ｈ）、２．４０～２．２１（ｍ，１Ｈ）、１．９３（ｓ，３Ｈ）、１．３８（ｄ，Ｊ＝１５９ ６．７Ｈｚ，３Ｈ）、１．０１～０．８２（ｍ，１５Ｈ）、０．１３（ｓ，３Ｈ）、０．１２（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２００．３４、１７４．９０、１７０．４７、７０．０３、６３．４８、３９．４７、３１．０４、２８．５１、２５．８２、２３．２３、２２．０４、１９．４７、１８．００、１６．８３、－４．５４、－５．０３。
ＨＯ－Ｌ－Ｌａｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＳＮＡＣ（７ｆ）。
Figure 2022505464000055
化合物７ｅ（２５０ｍｇ、０．６１７ｍｍｏｌ、１．０当量）を、５０ｍＬポリプロピレンFalconチューブ中でアセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解させた。ピリジン（２４９μＬ、３．０９ｍｍｏｌ、５当量）及びＨＦ（４８ｗｔ．％ ａｑ． ５３３μＬ、３０．９ｍｍｏｌ、５０当量）を添加した。反応物を周囲温度において１６ｈにわたって撹拌した。反応混合物をＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで３回抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。所望の生成物（１５０．１ｍｇ、０．５１７ｍｍｏｌ、収率８４％）を、シリカカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中ＭｅＯＨ ２％から８％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．２１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．２０（ｓ，１Ｈ）、４．５４（ｄｄ，Ｊ＝９．２，５．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．３０（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．１５（ｓ，１Ｈ）、３．５２～３．３２（ｍ，２Ｈ）、３．１２～２．９４（ｍ，２Ｈ）、２．３６～２．２１（ｍ，１Ｈ）、１．９５（ｓ，３Ｈ）、１．４４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）、０．９７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）、０．９１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２００．２０、１７５．４７、１７０．９４、６８．６６、６３．７７、３９．２４、３０．９０、２８．７１、２３．２５、２１．２８、１９．４５、１７．２７。
（Ｓ）－アリル ２－ヒドロキシプロパノエート（７ｇ）
Figure 2022505464000056
丸底フラスコ中で、１ｇのＬ－乳酸（１１．１１ｍｍｏｌ、１当量）及び３．８ｇの炭酸セシウム（１１．６７ｍｍｏｌ、１．０５当量）を１３ｍＬのＤＭＦに溶解させた。臭化アリル（３．７５ｍＬ、５．３７ｇ、４４．４４ｍｍｏｌ、４当量）を周囲温度において滴下添加した。添加が完了したら、反応物を周囲温度で４８ｈにわたって撹拌した。完了時に、回転蒸発によって過剰の臭化アリルを除去し、残りの溶液を水で希釈し、次いでＥｔ２Ｏで３回抽出した。合わせた有機画分を水で２回、ブラインで１回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮して、表題化合物（１．４７ｇ、９５％）をペールイエロー色の油状物として得た。特徴付けデータは、報告値（Liu, Y., Zheng, T. & Bruner, S.D. Structural basis for phosphopantetheinyl carrier domain interactions in the terminal module of nonribosomal peptide synthetases. Chemistry & biology 18, 1482-1488 (2011)）と一致している。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．９９～５．８２（ｍ，１Ｈ）、５．４０～５．１８（ｍ，２Ｈ）、４．７１～４．５９（ｍ，２Ｈ）、４．２９（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）、２．７５（ｓ，１Ｈ）、１．４２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。
（Ｒ）－（Ｓ）－１－（アリルオキシ）－１－オキソプロパン－２－イル ２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－メチル－ブタノエート（７ｈ）。
Figure 2022505464000057
丸底フラスコ中で、１ｇの７ｇ（７．６９ｍｍｏｌ、１当量）及び１．６７ｇのＢｏｃ－Ｄ－Ｖａｌ（８．４６ｍｍｏｌ、１．１当量）を、３９ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。この溶液に、周囲温度で２．２１ｇのＥＤＣ（１１．５４ｍｍｏｌ、１．５当量）及び１．０３ｇのＤＭＡＰ（８．４６ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。得られた溶液を周囲温度で２０ｈにわたって撹拌した。反応をＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出し、ＮａＨＣＯ３（ａｑ）で洗浄し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。表題化合物（２．１２ｇ、８４％）を、シリカカラムクロマトグラフィー（ヘキサン類中２０％ ＥｔＯＡｃ）によって精製した。Ｒｆ＝０．４１（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン類１：３）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．９５～５．８１（ｍ，１Ｈ）、５．２９（ｄｄｄｄ，Ｊ＝２１．３，１１．７，６．６，１．３Ｈｚ，２Ｈ）、５．１３（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．９７（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．６７～４．５９（ｍ，２Ｈ）、４．２８（ｄｄ，Ｊ＝８．９，４．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．２５～２．１１（ｍ，１Ｈ）、１．５０（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）、１．４３（ｓ，９Ｈ）、０．９７（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、０．９１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７１．５０、１６９．９５、１５５．５６、１３１．４３、１１８．８３、７９．７７、６９．１７、６５．９３、５８．６０、３１．２８、２８．３２、１８．９９、１７．４９、１７．００。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１６Ｈ２７ＮＮａＯ６の正確な質量計算値：３５２．１７３６。実測値：３５２．１７２１。
Ｂｏｃ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌ－Ｌａｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＳＮＡＣ（７ｉ）
Figure 2022505464000058
丸底フラスコ中で、２５０ｍｇの７ｈ（０．７６ｍｍｏｌ、１当量）を、窒素雰囲気下において４ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。この溶液に８６μＬのモルホリン（８７ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ、１．３当量）及び６２ｍｇのＰｄ（ＰＰｈ３）４を一度に添加した。反応物を周囲温度で撹拌し、ＴＬＣで監視した。完了時に、１０％ ａｑ．ＨＣｌの添加によって反応をクエンチし、有機層を除去し、残りの水性画分をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。合わせた有機画分をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮し、この中間体、７ｊを直ちに後続反応において使用した。火炎乾燥した丸底フラスコに、１９４ｍｇの７ｂ（ＨＣｌ塩として、０．７６ｍｍｏｌ、１当量）及び４ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の粗７ｊ（０．７６ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。得られた溶液に、４００μＬのヒューニッヒ塩基（２９５ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ、３当量）、１５４ｍｇのＨＯＢｔ（１．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）及び２２０ｍｇのＥＤＣ（１．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応物をアルゴン下で周囲温度において２０ｈにわたって撹拌した。反応をＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出し、ＮａＨＣＯ３（ａｑ）、次いでブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。表題化合物（３５０ｍｇ、２ステップで９４％）を、シリカカラムクロマトグラフィー（ヘキサン類中４０％アセトン）によって精製した。Ｒｆ＝０．３５（アセトン：ヘキサン類２：３）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．０８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．０７（ｓ，１Ｈ）、５．３８（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．０２（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．４６～４．３９（ｍ，１Ｈ）、３．９９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．４５～３．３０（ｍ，２Ｈ）、３．１１～２．８９（ｍ，２Ｈ）、２．３０（ｄｑ，Ｊ＝１３．４，６．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．１１～２．０１（ｍ，１Ｈ）、１．９２（ｓ，３Ｈ）、１．４９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．３９（ｓ，９Ｈ）、１．０１～０．９１（ｍ，１２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２００．１４、１７１．７２、１７０．８９、１７０．４８、１５５．９２、８０．４５、７０．５８、６４．７４、５９．７４、３９．３０、３０．４７、３０．２７、２８．４６、２８．２６、２３．１０、１９．３３、１８．９０、１８．４９、１７．８５、１７．５３。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ２２Ｈ３９Ｎ３ＮａＯ７Ｓの正確な質量計算値：５１２．２４０６。実測値：５１２．２３９１
ＨＯ－Ｄ－Ｈｉｖ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌ－Ｌａｃ－Ｌ－Ｖａｌ－ＳＮＡＣ（７）
Figure 2022505464000059
丸底フラスコに、最少量のＴＨＦ中１１８ｍｇの７ｉ（０．２４ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、これを０℃に冷却した。これに、ジオキサン（Sigma社）中１ｍＬの４Ｍ ＨＣｌを添加し、反応物を周囲温度まで温まるようにした。反応をＴＬＣで監視し、完了時に、回転蒸発によって全ての溶媒を除去した。未精製中間体７ｋは直ちに後続反応に使用した。中間体７ｋを２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、これに、１２５μＬのヒューニッヒ塩基（９３ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ、３当量）、３２ｍｇのＤ－α－ヒドロキシイソ吉草酸（０．２７ｍｍｏｌ、１．１当量）、４９ｍｇのＨＯＢｔ（０．３６ｍｍｏｌ、１．５当量）及び７０ｍｇのＥＤＣ（０．３６ｍｍｏｌ、１．５当量）を逐次添加した。反応物を周囲温度で２４ｈにわたって撹拌し、完了時にＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で５回抽出し、ＮａＨＣＯ３（ａｑ）で、次いでブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。表題化合物（１１１ｍｇ、９５％）を、シリカカラムクロマトグラフィー（ヘキサン類中５０％アセトン）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．２９（ｓ，１Ｈ）、６．２０（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）、５．２６（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．５５（ｂｒ，１Ｈ）、４．４７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，６．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．２６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．９９（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．５２～３．２５（ｍ，２Ｈ）、２．９９（ｄｄｔ，Ｊ＝２０．４，１３．３，６．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．３９～２．２５（ｍ，１Ｈ）、２．２０～２．０６（ｍ，２Ｈ）、１．９７（ｓ，３Ｈ）、１．５４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）、１．０６～０．９３（ｍ，１５Ｈ）、０．８８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２００．０５、１７５．２５、１７１．６９、１７１．４３（２Ｃ）、７６．３３、７１．１４、６４．５５、５８．３９、３８．９５、３１．９５、３０．２５、３０．１２、２８．６４、２３．２２、１９．４９、１９．１７、１９．１３、１８．８３、１８．１８、１８．０４、１６．１５。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ２２Ｈ３９Ｎ３ＮａＯ７Ｓの正確な質量計算値：５１２．２４０１。実測値：５１２．２４０６
（Ｒ）－メチル ３－メチル－２－（３－メチルブタンアミド）ブタノエート（８ａ）
Figure 2022505464000060
丸底フラスコ中で、Ｄ－バリンメチルエステル塩酸塩（２５０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）に溶解させた。イソ吉草酸（２３０ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＥＤＣ（４３０ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＤＭＡＰ（２７６ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＥｔ３Ｎ（４２０μＬ、３．００ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加し、反応物を、周囲温度において１６ｈにわたって混合させた。反応をＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出し、ＮａＨＣＯ３（ａｑ）で洗浄し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。所望の化合物（１９３．７ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ、収率６０％）を、シリカカラムクロマトグラフィー（ヘキサン類中ＥｔＯＡｃ ２０～５０％）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．９６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．５７（ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．７１（ｓ，３Ｈ）、２．１９～２．０４（ｍ，４Ｈ）、０．９７～０．８６（ｍ，１２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７２．８５、１７２．４９、５６．９１、５２．１９、４６．１４、３１．３５、２６．２９、２２．５６、２２．５３、１９．０７、１７．９３
（Ｒ）－３－メチル－２－（３－メチルブタンアミド）ブタン酸（８ｂ）
Figure 2022505464000061
丸底フラスコ中で、８ａ（１８０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１．０当量）をＭｅＯＨ（２４ｍＬ）及びＴＨＦ（２４ｍＬ）に溶解させ、溶液を、氷浴を使用して０℃に冷却した。ＬｉＯＨ（１Ｍ、２４ｍＬ）を滴下添加し、溶液を４ｈかけて０℃から周囲温度まで進めた。この溶液を、１／３の容量に濃縮して、得られた水溶液を、１０％ ＨＣｌでｐＨ３まで酸性化した。溶液をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。所望の生成物（１４５ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ、収率６０％）を、シリカカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ ＭｅＯＨ＋０．５％酢酸）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ４．３２（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．２３～２．０１（ｍ，４Ｈ）、１．０１～０．９２（ｍ，１２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１７５．８４、１７４．９３、５９．００、４５．９０、３１．５３、２７．５０、２２．７６、２２．７２、１９．６５、１８．４１。
８（Ａ）及び８ｃ（Ｂ）
（Ｒ）－（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（２－アセトアミドエチル）チオ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル ３－メチル－２－（３－メチルブタンアミド）ブタノエート（８）
Figure 2022505464000062
丸底フラスコ中で、アルコール７ｆ（２５．２ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ、１．０当量）及びカルボン酸８ｂ（３５ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ、２．０当量）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた。ドライアイス／アセトン浴を使用して、この溶液を－２０℃に冷却し、ＥＤＣ（６７ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、４．０当量）及びＤＭＡＰ（２１ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加した。混合物を周囲温度まで温まるようにした。反応が１６ｈにわたって進行した。反応をＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機画分を合わせ、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。５：４の比（Ａ：Ｂ）のＣ－２．２ジアステレオマーの混合物（３７．９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、収率９２％）を粗残留物から、シリカカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中ＭｅＯＨ １％～５％）によって精製した。ジアステレオマーを、分取ＴＬＣで分離した。８（Ａ）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．２１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．１５（ｓ，１Ｈ）、５．９３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．３５（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．４４ １６７（ｄｄ，Ｊ＝８．３，６．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．２９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．５０～３．３２（ｍ，２Ｈ）、３．０８～２．９５（ｍ，２Ｈ）、２．４１～２．２９（ｍ，１Ｈ）、２．１９～２．００（ｍ，４Ｈ）、１．９６（ｓ，３Ｈ）、１．５３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．０５～０．９２（ｍ，１８Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２００．１４、１７３．４８、１７１．６２、１７１．０４、１７０．６５、７１．０３、６４．９３、５８．７１、４５．６６、３９．３３、３０．３７、３０．３５、２８．７５、２６．３１、２３．２７、２２．６３、２２．５７、１９．４８、１９．０７、１８．７９、１８．１１、１７．９１。８ｃ（Ｂ）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．９５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）、６．０４（ｓ，１Ｈ）、５．８１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．２５（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．５４（ｄｄ，Ｊ＝８．８，５．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．４９（ｄｄ，Ｊ＝７．３，４．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．４７～３．３６（ｍ，２Ｈ）、３．１１～２．９８（ｍ，２Ｈ）、２．３８～２．２６（ｍ，２Ｈ）、２．２０～２．０９（ｍ，３Ｈ）、１．９５（ｓ，３Ｈ）、１．５１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．０４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、０．９９（ｄｄ，Ｊ＝６．７，２．５Ｈｚ，１２Ｈ）、０．９４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１９９．７４、１７３．６６、１７０．８４、１７０．６８、１７０．４９、７１．６３、６４．２９、５７．９０、４６．０６、３９．３２、３０．７２、３０．５５、２８．９１、２６．３５、２３．３０、２２．６４、２２．５７、１９．４２（２Ｃ）、１８．１６、１７．９４、１７．７０。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ２２Ｈ３９Ｎ３ＮａＯ６Ｓの正確な質量計算値：４９６．２４５２。実測値：４９６．２４５７
実施例１～８の要約
本発明者らは、組換えタンパク質においてＤＡＰを遺伝的にコードする戦略について記載する。本発明者らは、触媒システイン又はセリンの代わりにＤＡＰを遺伝的にコードすることによって、不安定なチオエステル又はエステル中間体をそれらの安定なアミド類似体として捕捉できることを示す。本発明者らは、システインプロテアーゼ及びチオエステラーゼに対するこのアプローチの有用性を例示し、Ｖｌｍ ＴＥによるバリノマイシンの合成における中間体についての独自の洞察を提供した。本発明者らの結果は、ドデカペプチジル結合Ｖｌｍ ＴＥに関連するリッドの大規模な再配列を明らかにしている。重要なことに、ＤＡＰ系は、広く使用されている反応能力のある基質（例えば、プロテアーゼ部位を含むネイティブタンパク質）、基質類似体（この場合は、ＳＮＡＣ）と、市販の天然産物（ここでは、バリノマイシン及びおそらく他の環状生成物（Tseng, C.C. et al. Characterization of the surfactin synthetase C-terminal thioesterase domain as a cyclic depsipeptide synthase. Biochemistry 41, 13350-13359 (2002)））の両方を使用して、ネイティブに近いアシル－酵素複合体を形成できる。
これらの構造には、ＴＥドメイン触媒サイクルの中心的存在であるＰＣＰドメインが存在しないが、その結合部位は、情報価値のある、ＥｎｔＦの、デッドエンド阻害剤をトラップしたＰＣＰ－ＴＥ構造（Liu, Y., Zheng, T. & Bruner, S.D. Structural basis for phosphopantetheinyl carrier domain interactions in the terminal module of nonribosomal peptide synthetases. Chemistry & biology 18, 1482-1488 (2011)）から推測できる（図７）。ＰＣＰドメインはＴＥのαＥにドッキングし、ＰＰＥは約１５Å伸長して、チオールをＳｅｒ／ＤＡＰ２４６３の近くに位置付ける（図７ａ、ｃ－iii）。ＥｎｔＦ構造におけるＰＰＥの位置は、リッドのドデカペプチド結合コンフォメーションと適合性であるが、本発明者らのＶｌｍ ＴＥ構造におけるアポ／テトラペプチド結合コンフォメーションとは適合性でない。（ＥｎｔＦ構造におけるリッドは、部分的に無秩序である。）このＥｎｔＦ構造は、ＰＣＰ及びＴＥドメインがデプシペプチジル－ＰＰＥのチオエステルをＳｅｒ／ＤＡＰ２４６３の近くにどのように位置付けることができるかを示したが、Ｖｌｍでは、これらのドメインは、オリゴマー化ステップのためにはテトラデプシペプチジル－ＰＰＥの末端ヒドロキシルをＳｅｒ／ＤＡＰ２４６３の近くに位置付けすることもできなければならない。そのためには、テトラデプシペプチドのさらに約１５Åの長さ（末端ヒドロキシルとＰＰＥ硫黄の間に）がＴＥドメインに収容されなければならない（図７ｃ－iiと７ｃ－iiiを比較）。リッドは、本発明者らがドデカペプチジル－ＴＥＤＡＰ構造において観察するものと類似したポケットをおそらく使用して、これを容易にする可能性がある。
したがって、既知の構造を組み立てて、オリゴマー化及び環化の仮説上の経路にすることができる（図７）。観察されたアポ／テトラデプシペプチド結合コンフォメーションである場合、Ｖｌｍ ＴＥのＬα１は、いかなる結合したデプシペプチドも、環化のために周囲にカールするのを阻害できるであろう（図７）。ＰＣＰの結合は、ドデカデプシペプチド結合ＴＥについて本発明者らが観察したものと類似したＴＥコンフォメーションを誘導でき、それが、ＰＣＰドメインに結合した約３０Åのテトラデプシペプチジル－ＰＰＥを収容しそれを活性部位に向けて導くことができるであろう（図７ｂ）。開いた／ほとんど無秩序のリッド（ＥｎｔＦ ＰＣＰ－ＴＥに見られるような）への遷移により、ＰＣＰはＳｅｒ２４６３に戻すためにチオエステルを提示することを可能にできるであろう。最後に、半球状のポケットを有する、ドデカデプシペプチド－ＴＥＤＡＰ構造で観察されるリッドのコンフォメーションは、環化のためにドデカデプシペプチドをＳｅｒ２４６３に向かってカールバックするのに役立つ。（図７ｂ、ｃ－iv）。
ドデカデプシペプチド－ＴＥＤＡＰの構造に見られるリッドのコンフォメーション及び半球状ポケットは、チオエステラーゼサイクルの環化ステップの間中、非常に重要である可能性がある。このポケットは主に疎水性残基で構成されており、Ｓｅｒ／ＤＡＰ２４６３に結合したドデカデプシペプチドが直線的に伸長するのを防ぐ立体障害を提供する（図７ｂ）。むしろ、このリッドのコンフォメーションは、ＴＥと基質とのアシル結合に向かって基質の遊離端をカールバックさせるのに好都合である。したがって、ドデカデプシペプチドのバリノマイシンへの環化は、ポケットによってエントロピー的に制御され、ドデカペプチドのコンフォメーションはポケット及びＴＥドメイン活性部位への部分的な限局によって決定付けられると考え得る。
ＴＥドメインが真正な（bona fide）基質と共有結合している場合であっても、他の研究で見られ及びここでは劇的に見られるリッドの可動性、並びにリッドとＴＥドメインの残りの部分との特異的な相互作用の不足により、合成サイクルのこれらのステップのいずれかに単一の十分に規定されたコンフォメーションが存在する可能性が低くなる。チロシジンシンテターゼにおいて環化を促進するために、環化基質の所定の／テンプレート化コンフォメーションの形成が提示されており（Trauger, J.W., Kohli, R.M., Mootz, H.D., Marahiel, M.A. & Walsh, C.T. Peptide cyclization catalysed by the thioesterase domain of tyrocidine synthetase. Nature 407, 215-218 (2000)、Trauger, J.W., Kohli, R.M. & Walsh, C.T. Cyclization of backbone-substituted peptides catalyzed by the thioesterase domain from the tyrocidine nonribosomal peptide synthetase. Biochemistry 40, 7092-7098 (2001)）、一方、ピクロマイシンシンターゼにおいてこれを行うためにリッドとポリケチド基質との特異的な相互作用が提示されたが、Ｖｌｍ ＴＥにおけるこれらのメカニズムの証拠はない。実際に、テトラデプシペプチドはＰＣＰドメインへのライゲーションとＴＥドメインへのライゲーションとの間を行きつつ戻りつつ遷移しなければならないため、及び同じテトラデプシペプチドが１つのサイクルの間に複数の異なる位置をとらなければならないため、特異的で強い結合相互作用は合成サイクルを遅くし得るであろう。むしろ、リッドのコンフォメーションは、サイクルを通じて急速に変動し、「呼吸」し、過渡的に（transiently）、反応能力のあるコンフォメーションとなる可能性がある。興味深いことに、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）ポリケチドシンターゼＴＥドメインと新規阻害剤とは、リッドヘリックスのクラスター間で結合する（Aggarwal, A. et al. Development of a Novel Lead that Targets M. tuberculosis Polyketide Synthase 13. Cell 170, 249-259 e225 (2017)）。それは、基質結合と競合することが提示されているが、そのような阻害剤は、本発明者らがここで観察したものと同様なリッドの構造再配列を防ぐことによっても作用できるであろう。
本発明者らは、コードされたＤＡＰを利用して、バリノマイシンの合成におけるチオエステラーゼアシル－酵素中間体についての洞察を提供することに焦点を当ててきたが、ＤＡＰ系は、天然産物メガ酵素ドメイン、例えば、他の環化ＴＥドメイン、トランスグルタミナーゼ相同体縮合ドメイン及びＰＫＳケトシンターゼドメインを含む、システイン又はセリン結合アシル－酵素中間体を特徴とする多種多様な酵素の研究（Holliday, G.L., Mitchell, J.B.O. & Thornton, J.M. Understanding the Functional Roles of Amino Acid Residues in Enzyme Catalysis. Journal of molecular biology 390, 560-577 (2009)）にかなり有望である。ここで報告されたアプローチの拡大は、多様なアシル－酵素中間体の構造的及び生化学的特徴付けを容易にする。加えて、アシル－酵素中間体を介して進行する（Cravatt, B.F., Wright, A.T. & Kozarich, J.W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem 77, 383-414 (2008)）が未知の基質特異性を有する、酵素においてＤＡＰを遺伝的にコードすることにより、ネイティブ基質を共有結合によって捕捉及び同定することができる可能性がある。
ＵＢＥ２Ｌ３－ＤＡＰの発現、精製及び活性試験
ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）の、ＧＳＴ－タグアフィニティー精製、それに続く、ＴＥＶプロテアーゼによるＧＳＴ－タグの切断及びＳｔｒｅｐ－タグアフィニティー精製による精製もまた、試験した。この戦略により、クリーンな生成物が得られた。
精製されたＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）－Ｓｔｒｅｐの質量を、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによって決定した：
ＵＶ光照射前のＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）－ＳｔｒｅｐのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ：
ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）－Ｓｔｒｅｐ［１］：予想値：１９０５０．５７Ｄａ、実測値：１９０４８．７９Ｄａ；ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＩＮＴ）；Ｓｔｒｅｐ［２］：予想値：１８８５７．５３Ｄａ、実測値：１８８５３．１５Ｄａ。
ＤＡＰ５の脱保護は、２つのはっきり異なるステップで行われる。第１に、ＵＶ光の作用下で光ケージ基（photocaging group）が除去され、半脱保護された中間体となる。第２の分子内反応により、最終的に、完全に脱保護されたＤＡＰが得られる。ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）の精製後、タンパク質のほとんどが半脱保護中間体（ＵＢＥ２Ｌ３［Ｃ８６ＩＮＴ］）を含んでいるがそれの一部は完全な光ケージ化形態（photocaged form）で存在していることが判明した。ＵＶ光照射後、タンパク質の質量をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによって再び評価した：
ＵＶ光照射後のＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）－ＳｔｒｅｐのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ：ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＩＮＴ）－Ｓｔｒｅｐ［２］：予想値：１８８５７．５３Ｄａ、実測値：１８８５３．１５Ｄａ。
予想通り、ＵＶ光照射後、ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）－Ｓｔｒｅｐは検出できなかった。実際に、ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＩＮＴ）－Ｓｔｒｅｐのみを検出できた。続いて、タンパク質を３７℃で３ｈにわたってインキュベートし、その質量をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳで評価した。予想通り、ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）－Ｓｔｒｅｐが、ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＩＮＴ）－Ｓｔｒｅｐと一緒に検出された。
ＵＶ光照射及び３７℃で３ｈのインキュベーション後のＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）－ＳｔｒｅｐのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ：ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＩＮＴ）－Ｓｔｒｅｐ［２］：予想値：１８８５７．５３Ｄａ、実測値：１８８５３．１５Ｄａ；ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）－Ｓｔｒｅｐ［３］：予想値：１８７５３．５９Ｄａ、観察値：１８７５３．１３Ｄａ。
残念ながら、３７℃におけるより長いインキュベーション時間（６ｈ及び１６ｈ）は、ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＩＮＴ）－Ｓｔｒｅｐの脱保護の改善にはつながらなかった。実際に、ＤＡＰを含むタンパク質の割合は変化していないようであった。これは、ＵＶ光照射及びより長いインキュベーション時間後のＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）－Ｓｔｒｅｐの総タンパク質ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳの約３０％に相当する。ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＩＮＴ）－Ｓｔｒｅｐを３７℃において６ｈ又は１６ｈにわたってインキュベートした。脱保護の改善は認められず、ＤＡＰを含むタンパク質の割合（約３０％）はほとんど未変化のままであった。
ＵＶ光の照射及び３７℃における一晩のインキュベーションを行ったＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ５）にＵｂをチャージできるかどうか試験するために、０．２μＭのＥ１及びＨＡタグ付きＵｂをＥ２ローディング緩衝液中に含む反応を設定した。各反応（陽性対照［ｗｔ］、陰性対照［Ｃ８６Ａ］及び［Ｃ８６ＤＡＰ］）を、Ｕｂを含めて又は含めずに行った（図２３を参照）。
予想通り、ＵＢＥ２Ｌ３（ｗｔ）では、チオエステル結合Ｅ２－Ｕｂ複合体に相当する、より高分子量のバンドが観察できた。加えて、ＵＢＥ２Ｌ３［Ｃ８６ＤＡＰ］でも、イソペプチド結合Ｅ２－Ｕｂ複合体に相当する、より高分子量のバンドを検出できた。ＵＢＥ２Ｌ３の、Ｕｂとの複合体への不完全な変換（図２３）は、ＵＢＥ２Ｌ３におけるＤＡＰ５の不完全な脱保護と一致している。
ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）とＵｂの間に新しく形成されたイソペプチド結合はレドックス非感受性（redox insensitive）であり、β－メルカプトエタノールの存在下では還元することができない。これは、レドックス感受性（redox sensitive）である、ＵＢＥ２Ｌ３（ｗｔ）及びＵｂから形成された複合体とは大いに異なる（図２３）。
異なるバンドの同一性をさらに特徴付けるために、抗ＨＡ及び抗ＵＢＥ２Ｌ３ブロットの両方を行った（図２３Ｂ及びＣ）ところ、ＨＡＵｂ及びＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）の両方の存在下で形成されたより高分子量のバンドがＵＢＥ２Ｌ３及びＵｂを含むことを明らかに示している。
最後に、新しく形成された結合の化学的性質を特徴付けるために、ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）－Ｕｂ複合体に相当するバンドを切り出し、トリプシン消化後にタンデム質量分析によって分析した（Proteomics Facility、University of Bristolによって行われた）。イソペプチド結合ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）－Ｕｂ複合体のタンデム質量分析。
タンデム質量分析は、所望の部位でのＤＡＰ修飾、及びＤＡＰへのＵｂロードと一致する残基での予想されるＧｌｙ－Ｇｌｙ修飾をはっきりと同定する。
この分析により、ＵＢＥ２Ｌ３（Ｃ８６ＤＡＰ）とＵｂとの安定なアミド結合の形成がはっきりと確認された。
生細胞における適用
本実施例において、本発明者らは、生細胞における技術を実証する。
本実施例において、本発明者らは、本発明を大腸菌細胞（ＢＬ２１）及び哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）において示す。
本発明者らは、図２４及び２５に示したＴＥＶ－ＧＦＰ ＷＢデータに言及する。
特に、本発明者らは、大腸菌生細胞におけるＤａｐ媒介基質捕捉を示す図２４に言及する。ＧＦＰ（ＧＦＰはＣ末端にＴＥＶ切断部位を有する）と、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐタグ付きＴＥＶプロテアーゼ（ＷＴ／Ａｌａ／ＴＡＧ（Ｄａｐｐｃを有する又は有さない；（本実施例においては、化合物「ＤＡＰ５」を「Ｄａｐｐｃ」と称する））の種々のバリアントとを、大腸菌ＢＬ２１細胞で２０℃において共発現させた。発現の２０ｈ後、細胞にＵＶ光（３５ｍＷ／ｃｍ２）を２分間にわたって直接照射し、３７℃において振盪した。等体積の細胞を、示した時点で採取し、ウエスタンブロット（ＴＥＶに対する抗Ｓｔｒｅｐ及び抗ＧＦＰ）によって分析した。ＴＥＶ（Ｄａｐ）のみが、ＴＥＶ－ＧＦＰコンジュゲートのＵＶ依存的生成を示した。このコンジュゲートを、ＵＶ照射後１０ｍｉｎ以内に検出でき、反応は大腸菌ＢＬ２１細胞内で２ｈ以内に完了した。
さらに、本発明者らは、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＤａｐ媒介基質捕捉を示す図２５に言及する。ＧＦＰ（Ｃ末端にＴＥＶ切断部位を有するＧＦＰ）及びＣ末端Ｓｔｒｅｐタグ付きＴＥＶプロテアーゼの種々のバリアント（ＷＴ／Ａｌａ／ＴＡＧ（Ｄａｐｐｃ（ＤＡＰ５）を有する又は有さない）））をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８ｈ後、細胞にＵＶ光（８ｍＷ／ｃｍ２）を２分間にわたって直接照射した。次いで、細胞を３７℃においてインキュベートし、示した時点で採取した。細胞を溶解させ、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎＸＴによってＴＥＶをプルダウンした。プルダウンの結果を、ウエスタンブロット（ＴＥＶに対する抗Ｓｔｒｅｐ及び抗ＧＦＰ）によって分析した。ＴＥＶ（Ｄａｐ）のみがＴＥＶ－ＧＦＰコンジュゲートのＵＶ依存的生成を示した。コンジュゲートは、ＵＶ照射後３０ｍｉｎ以内に形成され始め、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのインキュベーション時間の増加とともに濃縮された。
実施例１０の追加の方法：
大腸菌におけるＴＥＶ（Ｄａｐ）－ＧＦＰｓｕｂ捕捉
ＧＦＰを含むプラスミド及びＴＥＶを含むプラスミドで同時形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、２０℃においてタンパク質を発現するように誘導した。０．１ｍＭ Ｄａｐｐｃ（ＤＡＰ５）を培地に添加して、Ｄａｐｐｃ（ＤＡＰ５）を組み込んだ。２０ｈ後、細胞をFalcon５０ｍＬコニカル遠心チューブに移し、穏やかに撹拌しながら２ｍｉｎにわたってＵＶ光（３６５ｎｍ、３５ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。次いで、細胞を５，０００ｇで５ｍｉｎにわたって遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、新たに添加した抗生物質を含む新鮮な培地に再懸濁させた。細胞培養物を３７℃で振盪した。示した各時点で、５ｍＬの細胞培養物を採取し、BugBuster（Merck社）中で溶解させた。全溶解物をＷＢ（抗Ｓｔｒｅｐ（ab76949、abcam社）及び抗ＧＦＰ（ab13970、abcam社））によって分析した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＥＶ－ＧＦＰｓｕｂ捕捉
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＧＦＰを含むプラスミド、ＴＥＶを含むプラスミドで同時トランスフェクトした。アンバー抑制のために、トランスフェクションの３０ｍｉｎ後に１ｍＭのＤａｐｐｃ（ＤＡＰ５）を添加した。トランスフェクションの４８ｈ後、６ウェルプレート中の細胞にＵＶ光（３６５ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２）を２ｍｉｎにわたって照射した。次いで、培地を新鮮な培地で置き換え、３７℃においてインキュベートした。示した各時点で、細胞を採取し、ＮＰ溶解緩衝液（Cat. No.87787、Thermo社）中で溶解させた。全溶解物をStrepTactinXTプルダウンに使用した。ビーズからの溶出液を、ＷＢ（抗Ｓｔｒｅｐ（ab76949、abcam社）及び抗ＧＦＰ（ab13970、abcam社））によって分析した。
補足的方法
本研究において使用したプライマーのリスト。変異した残基は、大文字で示してある。
Figure 2022505464000063
インバースＰＣＲによるＤＡＰＲＳｌｉｂライブラリーの作製
プラスミドpBK-pylSをテンプレートとして使用して（Phan, J. et al. Structural basis for the substrate specificity of tobacco etch virus protease. Journal of Biological Chemistry 277, 50564-50572 (2002)）、製造業者のガイドラインに従って、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Takara Bio社）を使用する逐次的な５ラウンドのインバースＰＣＲ反応によって、アミノ酸 ６のライブラリー（ＤＡＰＲＳｌｉｂ）を生成した。プライマーは、ｐｙｌＳ遺伝子の位置Ｙ２７１、Ｎ３１１、Ｙ３４９、Ｖ３６６及びＷ３８２のコドンを、２０種全ての天然アミノ酸のコドンにランダム化した（全てのプライマーを補足表１に列挙する）。得られたＰＣＲ産物をＢｓａＩ－ＨＦ及びＤｐｎＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで環状化した。ＤＮＡをEletrocompetent MegaX DH10B（商標）T1R Electrocomp（商標）大腸菌細胞（Invitrogen社）に、製造業者の指示に従って形質転換し、適切な抗生物質を含む一晩培養物に接種して、プラスミドＤＮＡを調製した。適切な抗生物質を含むＬＢ－寒天プレート上で形質転換レスキュー培養物の段階希釈液をプレーティングすることによって、多様性を推定した。単離された１０８種の形質転換体のライブラリーは、９７％の信頼度でライブラリーの理論的多様性を網羅した。
ＤＡＰ誘導体による活性ａａＲＳの選択
アミノ酸 ２～６に特異的なシンテターゼ変異体の選択を、以前に報告された（Phan, J. et al. Structural basis for the substrate specificity of tobacco etch virus protease. Journal of Biological Chemistry 277, 50564-50572 (2002)）ようにして、以下のライブラリー：ＤＡＰＲＳｌｉｂ（Ｙ２７１、Ｎ３１１、Ｙ３４９、Ｖ３６６、Ｗ３８２）、Ｄ３（Ｌ２７０、Ｙ２７１、Ｌ２７４、Ｎ３１１、Ｃ３１３）、ＰｙｌＳ ｆｗｄ（Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｌ２７４、Ｃ３１３、Ｍ３１５）、Ｓｕｓａｎ １（Ａ２６７、Ｙ２７１、Ｙ３４９、Ｖ３６６、Ｗ３８２）、Ｓｕｓａｎ ２（Ｎ３１１、Ｃ３１３、Ｖ３６６、Ｗ３８２、Ｇ３８６）、Ｓｕｓａｎ ４（Ａ２６７、Ｙ３４９、Ｓ３６４、Ｖ３６６、Ｇ３８６）を使用して実施した。簡潔には、pBKベクターにおけるＭｂＰｙｌＲＳライブラリーを、５ラウンドのポジティブとネガティブの交互選択に供した。ポジティブ選択は、所望のｎｃＡＡ（１ｍＭ）の存在下で、許容位置にアンバーコドン（コドン１１２）を有し、同族のｔＲＮＡを発現する、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼレポーターを使用して、行った。クロラムフェニコール（典型的には５０μｇ／ｍＬ）ＬＢ寒天でのポジティブ選択を生き延びた細胞は、細胞内に構成的に存在する天然アミノ酸又は細胞に添加されたｎｃＡＡのいずれかを使用すると予測される。使用したネガティブ選択では、アンバーコドンを含み、ｎｃＡＡの非存在下で同族のｔＲＮＡを提供する、バルナーゼレポーターを使用して、天然アミノ酸を使用するシンテターゼバリアントを除去した。
ＧＦＰ（１５０ＴＡＧ）Ｈｉｓ６の発現及び精製
１５０位に６が組み込まれたスーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）を、pBK_DAPRS又はpBK_PylRSベクターを含むＭｅｇａＸ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１Ｒ細胞においてpSF-sfGFP150TAGから発現させた。１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、２５μｇ／ｍＬのカナマイシン及び１ｍＭの６又はＮε－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－リジン（ＢｏｃＫ）が補充されたＬＢブロスに、形質転換細胞を接種した。０．２％（ｗ／ｖ） Ｌ－（＋）－アラビノース（Sigma社）を用いて３７℃で１６ｈにわたって、２２０ｒｐｍで振盪しながら、発現を誘導した。次いで、細菌を収集し、ポリヒスチジンアフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質を精製した。
Ｈｉｓ６－リポイル－ＴＥＶ－Ｓｔｒｅｐの発現及び精製
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、pNHD-His6-リポイル-TEVwt-Strep、pNHD-His6-リポイル-TEVAla-Strep（遺伝子は、Mark Allen社から譲り受けた）（Trauger, J.W., Kohli, R.M., Mootz, H.D., Marahiel, M.A. & Walsh, C.T. Peptide cyclization catalysed by the thioesterase domain of tyrocidine synthetase. Nature 407, 215-218 (2000)）で形質転換するか又はpSF-DAPRS-PylT（Zhou, Y., Prediger, P., Dias, L.C., Murphy, A.C. & Leadlay, P.F. Macrodiolide formation by the thioesterase of a modular polyketide synthase. Angew Chem Int Ed Engl 54, 5232-5235 (2015)） pNHD-His6-リポイル-TEVAmber-Strepで同時形質転換し、２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び（及び同時形質転換された細胞については５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）を含むＴＢ－寒天プレート上で３７℃において一晩増殖させた。２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（及び同時形質転換された細胞については５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）を含むＴＢ－培地に、幾つかの形質転換コロニーを接種した。培養物を、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（並びに同時形質転換された細胞の場合は２５μｇ／ｍＬのカナマイシン及び１００μＭの６）を含むＴＢ培地中に１：１００希釈し、３７℃でインキュベートした；ＯＤ６００が０．５～０．７に達したら、培養物を２０℃に移行させた。３０ｍｉｎのさらなるインキュベーション後、２５０μＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して、培養物を誘導し、２０℃において１６ｈにわたってタンパク質発現を実施した。細胞を、遠心分離によって収集し、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ β－メルカプトエタノール、Roche Inhibitor Cocktailタブレット１錠／５０ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Sigma社）、５０μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ（Sigma社）に再懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。溶解物を、３９’０００×ｇで３０ｍｉｎの遠心分離によって清澄化し、０．４μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜で濾過した。Ｈｉｓ６－リポイル－ＴＥＶ－Ｓｔｒｅｐを、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー（HisTrap HPカラム、GE Healthcare社）を使用してイミダゾールの直線勾配（０ｍＭ～５００ｍＭ）によって精製した。タンパク質を含む画分を、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇアフィニティー精製によって５ｍＬ ＳｔｒｅｐＴｒａｐ ＨＰカラム（GE Healthcare社）を使用してさらに精製した。試料をロード後、カラムをｓｔｒｅｐ結合緩衝液（５０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］、５ｍＭジチオトレイトール［ＤＴＴ］）で洗浄した。デスチオビオチンの直線勾配（０ｍＭ～１．２５ｍＭ）を使用して、タンパク質を溶離させた。Ｈｉｓ６－リポイル－ＴＥＶＡｍｂｅｒ－Ｓｔｒｅｐの場合は、精製の最後にタンパク質にＵＶ光（３６５ｎｍ、３５ｍＷｃｍ－２、１ｍｉｎ）を照射した。
Ｕｂｔｅｖの発現及び精製
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をpNHD-Ub-tev-His6で形質転換し、２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート上で３７℃において一晩増殖させた。２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢ培地に、形質転換から得られた幾つかのコロニーを接種した。培養物を、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む新鮮なＬＢ培地中に１：１００希釈した；ＯＤ６００が０．５に達したら、１ｍＭのＩＰＴＧを使用して培養物を誘導し、３７℃において６ｈにわたってタンパク質発現を実施した。遠心分離により細胞を収集し、５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ β－メルカプトエタノール、Roche Inhibitor Cocktailタブレット１錠／５０ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Sigma社）、５０μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ（Sigma社）に再懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。溶解物を、３９’０００×ｇで３０ｍｉｎの遠心分離及び０．４μｍ ＰＥＳ膜での濾過によって清澄化した。Ｕｂを、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー（HisTrap HPカラム、GE Healthcare社）を使用して、イミダゾールの直線勾配（３０ｍＭ～５００ｍＭ）で精製した。タンパク質を４℃において１０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌに対して一晩透析し、イオン交換クロマトグラフィー（HiTrapS ５ｍＬカラム、GE Healthcare社）によって５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．５）中のＮａＣｌ勾配（０～１Ｍ ｍＭ）を使用して、Ｕｂをさらに精製した。純粋な画分をプールしてから、２０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して一晩透析した。次いで、Amicon Ultra-15（３ｋＤａ ＭＷＣＯ）遠心フィルターデバイス（Millipore社）を使用して、試料を約１５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
ＴＥＶとＵｂｔｅｖとの反応
１５μｇのＨｉｓ６－リポイル－ＴＥＶ－Ｓｔｒｅｐを６０μｇのＵｂｔｅｖと共に３０℃でインキュベートし、１５０μＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ中で一晩反応させた。２０μＬの反応物を４～１２％のNuPAGE Bis-Trisゲル（Invitrogen社）にロードし、２－（ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液中で４５ｍｉｎにわたって泳動させた。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）、１９２ｍＭグリシン、１０％（ｖ／ｖ）メタノールを使用して、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＳＦ）膜（Roche社）にタンパク質を転写した。続いて、室温で５％（ｗ／ｖ）の粉ミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％［ｖ／ｖ］Tween 20）中で１ｈにわたって膜をブロックした。抗体（Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ－ＨＲＰコンジュゲート（αＳｔｒｅｐ）［IBA Lifesciences社］又はＰ４Ｄ１抗体（αＵｂ）［Enzo Life Sciences社］）を５％ ＴＢＳＴ－ミルク中に添加し、４℃で一晩インキュベートした。二次抗体（αＵｂ抗体用）を５％ＴＢＳＴ－ミルクに加え、室温で１ｈにわたってインキュベートした。ブロットは、Amersham増強化学発光（ＥＣＬ、enhanced chemiluminescence）（GE Healthcare社）及びChemiDoc XRS+ゲルイメージングシステム（Bio-Rad社）を使用して展開した。
ＤＡＰ誘導体の細胞内濃度の分析
ＤＡＰ誘導体の細胞内濃度の分析を以前に記載された（Zhou, Y., Prediger, P., Dias, L.C., Murphy, A.C. & Leadlay, P.F. Macrodiolide formation by the thioesterase of a modular polyketide synthase. Angew Chem Int Ed Engl 54, 5232-5235 (2015)）ようにして行った。要するに、ＤＡＰ誘導体をＬＢ培地の５ｍＬ溶液に最終濃度１ｍＭまで添加した。対照試料もまた、５ｍＬの非補充ＬＢ培地を用いて調製した。各溶液にＤＨ１０Ｂ細胞を接種した。培養物を暗所、３７℃において１２ｈにわたって２２０ｒｐｍで撹拌した。各試料のＯＤ６００を決定し、各培養物からの細胞を収集した。細胞ペレットを、再懸濁及び遠心分離のサイクルにより、１ｍＬの新鮮な氷冷ＬＢ培地で３回洗浄した。洗浄した細胞ペレットをメタノール：水（６０：４０）溶液に再懸濁させた。ジルコニウムビーズ（０．１ｍｍ）を各懸濁液に添加した。懸濁液を１２ｍｉｎにわたってボルテックスして、細胞を溶解させた。溶解物を４℃において２１０００×ｇで３０ｍｉｎにわたって遠心分離した。上清を注意深く取り除き、新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れた。溶液を４℃において２１０００×ｇで２ｈにわたって再び遠心分離した。得られた試料からの上清の１００μｌアリコートをＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳで分析した。水中０．５％～９５％のアセトニトリルの勾配を適用して、Zorbax C18（４．６×１５０ｍｍ）カラムから清澄化された溶解物を溶離させた。１ＯＤ６００単位当たり細胞８×１０８個の推定値及び０．６×１０－１５の細胞体積を使用して、濃度を推定した。
Ｖｌｍ ＴＥコンストラクトのクローニング、発現及び精製
ｖｌｍ２ＰＣＰ４－ＴＥ（ストレプトマイセス・ツシマエンシス（Streptomyces tsusimaensis）由来のＶｌｍ２の残基２２９０～２６５５をコードする、GenBank：ＡＢＡ５９５４８．１）を含むコドン最適化コンストラクトを、pJExpress411ベクター中でＡＴＵＭ（以前のＤＮＡ２．０）によって、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ、続いてタバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）切断認識配列（pJExpress411-vlm2-PCP4-TEwt）を用いて合成した。pJExpress411-vlm2-PCP4-TEwtには、ヌクレオチドの２０２４～２０２５位及び２２６７～２２６８位に２つのＢａｍＨＩ認識配列が含まれていた。ＢａｍＨＩでの消化、それに続くＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs社）でのライゲーションにより、ＰＣＰ４ドメイン配列が切り取られ、Ｖｌｍ２の残基２３６８～２６５５をコードするプラスミドpJExpress411-vlm2-TEwtが得られた。ＴＥＤＡＰの発現ベクターを生成するために、pJExpress411-vlm2-TEwtから、プライマーＴＥ＿ｆｏｒ＿ｐＮＨＤ＿ｆｗ及びＴＥ＿ｆｏｒ＿ｐＮＨＤ＿ｒｅｖを用いて、ＴＥｗｔコード配列をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、同様にして消化したpNHDプラスミドにＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートし、プラスミドpNHD-vlm2-TEwtを生成した。次に、プライマーＶｌｍ２＿ＴＥ＿Ａｍｂ＿Ｆｗ及びＶｌｍ２＿ＴＥ＿Ａｍｂ＿Ｒｅｖを使用して部位特異的変異誘発により、セリン２４６３のコドンの代わりにアンバー終止コドンを導入し、pNHD-vlm2-TEamber2463を生成した。
pJExpress411-vlm2-TEwt（ＴＥｗｔ）で形質転換された又はpNHD-Vlm2-TEamber2463及びpSF-DAPRS-PylT（ＴＥＤＡＰ）で同時形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で、ＴＥドメインを異種発現した。ＴＥｗｔを発現する培養物を、１７ｍｇ・Ｌ－１のカナマイシンが補充されたＬＢ培地中で増殖させた。ＴＥＤＡＰを発現するものを、２５ｍｇ・Ｌ－１のカナマイシン、１２．５ｍｇ・Ｌ－１のテトラサイクリン、０．１ｍＭの６（６の１００ｍＭ原液を０．４Ｍ ＮａＯＨ中で調製し、培養物に添加し、５Ｍ ＨＣｌを使用して中和した）が補充されたＴＢ培地中で増殖させた。培養物を、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６に達するまで３７℃において、２２０ｒ．ｐ．ｍで撹拌しながらインキュベートし、その後、１６℃で３０ｍｉｎにわたってインキュベートし、次いで１００μＭのＩＰＴＧで発現を誘導した。培養物を１６℃でさらに１６時間インキュベートした後、５０００ｇでの２０ｍｉｎにわたる遠心分離により収集した。細胞ペレットを－８０℃で保存した。
タンパク質の精製のために、ＴＥｗｔの細胞ペレットを、湿潤細胞１ｇ当たり５ｍＬの緩衝液ｗｔ－Ａ（５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ β－メルカプトエタノール［βＭＥ］）＋ＤＮＡｓｅＩ（Bioshop社）に再懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。溶解物を、４００００ｇで２０ｍｉｎの遠心分離によって清澄化した。清澄化した溶解物を、AKTA Primeシステム（GE Healthcare Life Sciences社）で直列に接続された２つの５ｍＬ HiTrap IMAC FF（GE Healthcare Life Sciences社）カラムに適用した。結合したタンパク質を緩衝液ｗｔ－Ｂ（緩衝液ｗｔ－Ａ＋１５０ｍＭイミダゾール）で溶離させた。ＴＥｗｔを含む画分（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって決定）をプールし、ＴＥＶプロテアーゼと共に１：１００（Ｔｅ：ＴＥＶ）の質量／質量比でインキュベートし、４℃において１６時間にわたって緩衝液ｗｔ－Ｃ（５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ βＭＥ）に対して透析した。緩衝液ｗｔ－Ａで予め平衡化した、直列に接続された２つの５ｍＬ HiTrap IMAC FFカラムに、透析した試料を適用した。切断されたタンパク質をフロースルーから回収し、緩衝液Ｑ－Ａ（５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ βＭＥ）で予め平衡化した、直列に接続された２つの５ｍＬ HiTrap Q HPカラムに適用した。２４０ｍＬを超える０～１００％の緩衝液Ｑ－Ｂ（５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ βＭＥ）の勾配によって、タンパク質を溶離させた。ＴＥｗｔを含む画分を１０ｋＤａ分子量カットオフAmicon（登録商標）Ultra遠心フィルター（Millipore社）で濃縮し、ＳＥＣ緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４又はｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン［ＴＣＥＰ］）で予め平衡化したSuperdex S-200 16/60 PGカラム（GE-Healthcare社）に注入した。精製されたＴＥｗｔを含む画分をプールし、濃縮し、急速冷凍（flash frozen）した。
ＴＥＤＡＰについての細胞再懸濁、溶解、清澄化、及びＮｉ－ＩＭＡＣ精製は、光への長時間の曝露を回避した以外はＴｅｗｔについて記載したようにして行った。Ｎｉ－ＩＭＡＣカラムから溶離させた後、試料にＵＶ光（３６５ｎｍ、ｍＷｃｍ－２、１ｍｉｎ）を照射した。ＴＥＶ切断及びそれに続くＩＭＡＣカラムは、１：１のＴＥ：ＴＥＶ比を使用した以外はＴＥｗｔについて記載したように行った。アニオン交換は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳが緩衝液としてＴＲＩＳに置き換わり、０．２ｍＭ ＴＣＥＰが移動相の還元剤としてβＭＥに置き換わった以外はＴｅｗｔについて記載したようにして行った。関連する画分を濃縮し、緩衝液Ｔ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＴＣＥＰ）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ－７５１０／３００カラムに注入した。精製ＴＥＤＡＰを含む画分をプールし、濃縮し、さらなる実験に直ちに使用した。精製ＴＥｗｔの収量は１Ｌ当たり３０～６０ｍｇ、精製ＴＥＤＡＰの収量は１Ｌ当たり０．１～０．５ｍｇであった。
結晶学
ＴＥｗｔ構造１の結晶化条件は、蒸気拡散結晶化試験において、市販のスクリーン（Qiagen社）及び１０ｍｇ・ｍＬ－１のタンパク質濃度を使用して見出した。２４ウェルプレートでの初期結晶化ヒットの最適化により、３．２μＬの１０ｍｇ・ｍＬ－１ ＴＥｗｔ、４．０μＬの１．６５Ｍ ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ９．５）及び０．８μＬの１７％ｍ／ｖ ＩＰＴＧを５００μＬの１．６５Ｍ ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ９．５）のリザーバー溶液に対してインキュベートするという、最終結晶化条件が得られた。ＴＥｗｔ構造２結晶を、０．５μＬの２２．４ｍｇ・ｍＬ－１精製ＴＥｗｔ及び０．５μＬの１．６５Ｍ ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ８．１）を５００μＬのＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ８．１）のリザーバー溶液に対してインキュベートするという同様な条件で成長させた。結晶は２４時間から４８時間の間に出現し、約１週間で最大サイズに達した。
リガンド非結合型ＴＥＤＡＰの結晶は、１．６５Ｍ ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ８．０）のリザーバー溶液を用いて、ＴＥｗｔと同様の条件で成長させた。テトラデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ複合体構造を得るために、ＴＥＤＡＰ結晶は、最大サイズに達したら、デオキシテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ８と共にインキュベートした。リザーバー溶液を、２．６６Ｍ ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ９．５）に交換し、１ｍＭデオキシテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ、２．６６Ｍ ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ９．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．２）、１０％ＤＭＳＯの溶液３２μＬをドロップに追加した。結晶を室温においてこの条件で９日間インキュベートした。
ドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ複合体結晶については、ＴＥＤＡＰ（０．１ｍｇ・ｍＬ－１）を、緩衝液Ｔ中のバリノマイシンの１．１ｍｇ・ｍＬ－１懸濁液中で室温において１６時間インキュベートした。試料を２００００ｇで遠心分離し、緩衝液Ｔで予め平衡化したSuperdex S-75 10/300カラムに適用して、過剰なバリノマイシンを除去した。関連する画分をプールし、複合体形成をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ（以下を参照）によって評価した。試料を１３．４ｍｇ・ｍＬ－１に濃縮し、ＴＥｗｔ結晶とは異なる形態を有する回折品質の結晶が、５００μＬのリザーバー溶液に対して平衡化された、１μＬのドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ複合体＋１μＬのリザーバー溶液（１．３０～１．４５ＭのＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ８．１））からなるシッティングドロップにおいて得られた。リガンドの占有率を改善する試みにおいて、これらの結晶のサブセットを、５５５μＭバリノマイシン、２Ｍ ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ８．１）、１１ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、４４ｍＭ ＮａＣｌ、０．０８８ｍＭ ＴＣＥＰを含む２０μＬの溶液の添加により、バリノマイシンと共に２４時間にわたってさらにインキュベートした。
ＴＥｗｔ及びドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ結晶を、結晶化ドロップに１０μＬ（ＴＥｗｔ構造１及びドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ）又は２０μＬ（ＴＥｗｔ構造２）の３．６Ｍ ＤＬ－リンゴ酸（ｐＨ８．１）を添加することによって凍結保護した。バリノマイシンと共にインキュベートしたドデカデプシペプチジル－ＴｅＤＡＰ結晶については、ドロップ溶液を除去し、１０μＬの３．６Ｍ ＤＬ－リンゴ酸で置き換えた。結晶を少なくとも２分間平衡化し、次いで液体窒素中で急速冷却した。テトラデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ複合体結晶をループにして、インキュベーション溶液から直接急速冷却した。ＴＥｗｔデータは最初に、Centre for Structural Biology、McGill University、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａにおいて、株式会社リガク製のRUH3R発生器及びR-AXIS IV++検出器で収集した。ＴＥｗｔ及びデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ複合体のより高解像度のデータは、Canadian Light Source（CLS）08ID-1ビームライン又はAdvanced Photon Source(APS)NE-CAT 24-ID-CビームラインでPilatus検出器を使用して収集した（拡張データ表１）。
ＴＥｗｔの構造決定
ＴＥｗｔ構造１結晶からの回折データはインデックス付けし、ｉＭｏｓｆｌｍ（Trauger, J.W., Kohli, R.M. & Walsh, C.T. Cyclization of backbone-substituted peptides catalyzed by the thioesterase domain from the tyrocidine nonribosomal peptide synthetase. Biochemistry 40, 7092-7098 (2001)）又はＤＩＡＬＳ（Aggarwal, A. et al. Development of a Novel Lead that Targets M. tuberculosis Polyketide Synthase 13. Cell 170, 249-259 e225 (2017)）を使用して空間群Ｐ４３２に統合した。さらなる空間群の決定及び尺度化は、プログラムPOINTLESS及びSCALA（Cravatt, B.F., Wright, A.T. & Kozarich, J.W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem 77, 383-414 (2008)）を使用して行った。PHASER（McGall, G. H. et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society 119, 5081-5090, doi:DOI 10.1021/ja964427a (1997)）を使用した分子置換によって、ｓｒｆＡ－Ｃ（ＰＤＢ ＩＤ ２ＶＳＱ）（Alonzo, D. A., Magarvey, N. A. & Schmeing, T. M. Characterization of cereulide synthetase, a toxin-producing macromolecular machine. PloS one 10, e0128569, doi:10.1371/journal.pone.0128569 (2015)）のＴＥドメインのSCULPTOR（Pendrak, I., Wittrock, R. & Kingsbury, W. D. Synthesis and Anti-Hsv Activity of Methylenedioxy Mappicine Ketone Analogs. J Org Chem 60, 2912-2915, doi:DOI 10.1021/jo00114a050 (1995)）修正バージョンを検索モデルとして、構造を解析した。プログラムPhenix（Shaw-Reid, C. A. et al. Assembly line enzymology by multimodular nonribosomal peptide synthetases: the thioesterase domain of E. coli EntF catalyzes both elongation and cyclolactonization. Chemistry & biology 6, 385-400, doi:10.1016/S1074-5521(99)80050-7 (1999)）及びAUTOBUILD（May, J. J., Wendrich, T. M. & Marahiel, M. A. The dhb operon of Bacillus subtilis encodes the biosynthetic template for the catecholic siderophore 2,3-dihydroxybenzoate-glycine-threonine trimeric ester bacillibactin. J Biol Chem 276, 7209-7217, doi:10.1074/jbc.M009140200 (2001)）を使用して、構造を反復的に精密化し、構築した。反復モデル構築には、Coot（Zhou, Y. et al. Iterative Mechanism of Macrodiolide Formation in the Anticancer Compound Conglobatin. Chemistry & biology 22, 745-754, doi:10.1016/j.chembiol.2015.05.010 (2015)）を使用した。TopDraw（Robbel, L., Hoyer, K. M. & Marahiel, M. A. TioS T-TE--a prototypical thioesterase responsible for cyclodimerization of the quinoline- and quinoxaline-type class of chromodepsipeptides. FEBS J 276, 1641-1653, doi:10.1111/j.1742-4658.2009.06897.x (2009)）を使用して、TEwt構造をインプットとして使用したPDBsum generate（http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html）からの結果に基づいて、トポロジー図を生成した。
ドデカデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ複合体結晶から収集した回折データセットを、iMosflm（Trauger, J.W., Kohli, R.M. & Walsh, C.T. Cyclization of backbone-substituted peptides catalyzed by the thioesterase domain from the tyrocidine nonribosomal peptide synthetase. Biochemistry 40, 7092-7098 (2001)）又はDIALS（Aggarwal, A. et al. Development of a Novel Lead that Targets M. tuberculosis Polyketide Synthase 13. Cell 170, 249-259 e225 (2017)）を使用してＰ１又はＨ３空間群にインデックス付けした。Ｈ３群に属するほとんどの結晶は双晶形成の証拠を示し、非双晶回折データのみを構造決定に使用した。PHASER（McGall, G. H. et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society 119, 5081-5090, doi:DOI 10.1021/ja964427a (1997)）を使用した分子置換によって、残基２５００～２６４７を欠くＴＥｗｔ構造を検索モデルとして使用して、Ｐ１及びＨ３空間群の両方における構造を解析した。Ｐ１構造は非対称単位に６つの分子を有するのに対し、Ｈ３構造は非対称単位に２つの分子を含んでいた。全てのデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰモデルを精密化し、ｍＦｏ－Ｆｃマップを生成してから、デプシペプチド残基をモデルにおいて構築した（図４ｃ、ｄ及び拡張データ図８）。デプシペプチドは、PDB Chemical Component Dictionaryの個々のモノマー（ＤＰＰ、ＶＡＬ、２ＯＰ、ＤＶＡ、ＶＡＤ）から構築した。モノマーライブラリー及びモノマー間の連結の拘束（すなわち、ＤＰＰ－＞ＶＡＬ、ＶＡＬ－＞２ＯＰ、２ＯＰ－＞ＤＶＡ、ＤＶＡ－＞ＶＡＤ及びＶＡＤ－＞ＶＡＬ）を、AceDRG（Liu, Y., Zheng, T. & Bruner, S. D. Structural basis for phosphopantetheinyl carrier domain interactions in the terminal module of nonribosomal peptide synthetases. Chemistry & biology 18, 1482-1488, doi:10.1016/j.chembiol.2011.09.018 (2011)）を使用して計算し、LIBCHECK（Trauger, J. W., Kohli, R. M. & Walsh, C. T. Cyclization of backbone-substituted peptides catalyzed by the thioesterase domain from the tyrocidine nonribosomal peptide synthetase. Biochemistry 40, 7092-7098 (2001)）を使用してマージした。次いで、得られた、マージされた辞書を、Coot（Zhou, Y. et al. Iterative Mechanism of Macrodiolide Formation in the Anticancer Compound Conglobatin. Chemistry & biology 22, 745-754, doi:10.1016/j.chembiol.2015.05.010 (2015)）における基質構築並びにREFMAC5（Aggarwal, A. et al. Development of a Novel Lead that Targets M. tuberculosis Polyketide Synthase 13. Cell 170, 249-259 e225, doi:10.1016/j.cell.2017.06.025 (2017)）及びphenix.refine（Shaw-Reid, C. A. et al. Assembly line enzymology by multimodular nonribosomal peptide synthetases: the thioesterase domain of E. coli EntF catalyzes both elongation and cyclolactonization. Chemistry & biology 6, 385-400, doi:10.1016/S1074-5521(99)80050-7 (1999)）における精密化に使用した。最終的な統計を、拡張データ表１に示す。
デプシペプチジル－ＴＥ複合体の形成
最終濃度０．２ｍｇ・ｍＬ－１のＴＥＤＡＰ又はＴＥｗｔを、１．７％又は１％ｖ／ｖ ＤＭＳＯを含む緩衝液Ｔ中、テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７（１．７ｍＭ）又はバリノマイシン（５０μＭ）と共に１６時間にわたってインキュベートした。反応物を１０ｋＤａ分子量カットオフAmicon（登録商標）Ultra遠心フィルター（Millipore社）中で濃縮し、２００００ｇでの遠心分離によって清澄化し、緩衝液Ｔで予め平衡化したSuperdex S-75 10/300カラムに適用して、最終ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析の前に過剰なデプシペプチジル－ＳＮＡＣ又はバリノマイシンを除去した。デオキシテトラデプシペプチジル－ＴＥＤＡＰ複合体を形成するために、最終濃度８．７ｍｇ・ｍＬ－１のＴＥＤＡＰを、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３．８％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ中、デオキシテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ８（２．６ｍＭ）と共に４０時間にわたってインキュベートした。最終ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析の前に、試料を１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）で希釈した。全てのインキュベーションは、室温で行った。
インタクトなタンパク質のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析
図２ｃ、拡張データ図３ｂ、７ｃに示す実験については、タンパク質試料を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）システム（Agilent 1200シリーズ）、続いて、6130 Quadrupoleスペクトロメーターでのインラインエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）に供した。Jupiter ５μ C4 300Aカラム、１５０ｍｍ×２．００ｍｍ（Phenomenex社）を使用して、ＬＣシステムに、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む水（溶媒Ａ）及び０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含むアセトニトリル（溶媒Ｂ）の勾配（６ｍｉｎで１０％～７５％及び１，５ｍｉｎで７５％～９５％）を使用して、タンパク質を流した。タンパク質は、２００及び２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を監視することによって検出した。タンパク質の質量は、OpenLAB CDSソフトウェア（Agilent Technologies社）を使用して、正イオンモードでのＭＳ取得からのデコンボリューションによって計算した。
図４ａ、ｂ、拡張データ図６ｄ～ｆ、７ｄ、ｅに示す実験については、タンパク質濃度を緩衝液Ｔ中で０．１ｍｇ・ｍＬ－１に調整し、Bruker Amazon Speed ETDイオントラップ質量分析計に連結されたAgilent Technologies 1260 Infinity HPLCシステム上の、９５％移動相Ａ（水中０．１％ギ酸）及び５％移動相Ｂ（１００％アセトニトリル中０．１％ギ酸）で予め平衡化したAgilentPLRP-S（１０００Ａ ５μＭ、５０×２．１ｍｍ ＩＤ）カラムに、１６ｕＬを注入した。ＭＳデータは、ExtremeScan質量範囲モードを用いて、正イオン極性、スキャン範囲５０～３０００ｍ／ｚ、蓄積時間１５８６μｓ、ＲＦレベル９６％、トラップドライブ６９．８、ＰＳＰ標的質量９２２ｍ／ｚで、５つ以上のスペクトルを平均して、収集した。外部機器のキャリブレーションは、Agilent ESIチューンミックスを使用して行った。カラムコンパートメントの温度は、運転全体を通して８０℃に設定した。注入後、初期ＨＰＬＣ条件で、試料コンパートメント切替バルブを廃液位置にして、カラムを５分間洗浄した。次に、５％～１００％までの移動相Ｂの５分間の勾配を行い、続いて１００％の移動相Ｂの均一濃度（isocratic）ステップを８分間行った。タンパク質は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を監視することによって検出した。データは、Bruker DataAnalysisソフトウェア（Bruker社）を使用して分析した。質量スペクトルは、１０．５～３分まで積分し、１００００～４００００ｍ／ｚの間のウィンドウを使用してデコンボリューションした。
タンデムＭＳ／ＭＳ分析
タンパク質は、ＭＥＳ緩衝液を含む４～１２％NuPAGE Bis-Trisゲル（Invitrogen社）上で泳動し、InstantBlue（Expedeon社）を使用して短時間染色した。バンドを切り取り、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で保存した。トリプシン消化及びタンデムＭＳ／ＭＳ分析は、Kate Heesom（Proteomics Facility、University of Bristol）によって行われた。
Ｖｌｍ ＴＥ反応生成物のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析
０．２ｍｇ・ｍＬ－１（６．５μＭ）の精製ＴＥｗｔ又はＴＥＤＡＰを、緩衝液Ｔ中、テトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７（１．７ｍＭ）又はテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ７とデオキシテトラデプシペプチジル－ＳＮＡＣ ８（各１．７ｍＭ）の混合物と共にインキュベートした。試料を室温で２４時間インキュベートし、次いで１倍容量の、アセトニトリル中０．１％ギ酸でクエンチした。次に、試料を２０，０００ｇで遠心分離し、液体窒素中で急速冷凍し、ＨＰＬＣ分析の前に－８０℃で保存した。ＨＰＬＣ－ＭＳ分析については、冷凍試料を室温で解凍し、ボルテックスして、注入前に２０，０００ｇでの遠心分離によって清澄化した。ＨＲ－ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳは、Mass Spectroscopy Facility（Department of Chemistry、McGill University）で、Bruker maXis impact QTOF質量分析計に連結されたDionex Ultimate 3000U HPLCシステムにおいて、Agilent XDB-C8（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）カラムを用いて正のＥＳＩモードで行った。イオントラップＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析は、Bruker Amazon Speed ETDイオントラップ質量分析計に連結されたAgilent Technologies 1260 Infinity HPLCシステムにおいて、正のＥＳＩモードで行った。カラムコンパートメントは、運転全体を通して４０℃に設定した。開始ＨＰＬＣ条件は、５０％移動相Ａ（Ｈ２Ｏ中０．１％ギ酸）、５０％移動相Ｂ（アセトニトリル中０．１％ギ酸）とした。注入（ＨＲ－ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳの場合は１μＬ、イオントラップＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳの場合は５μＬ）の後、５分間で５０％～９８％までの移動相Ｂの勾配を行い、続いて９８％移動相Ｂの均一濃度ステップを２０分間行った。ＨＲ－ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳについては、Ｎａ＋フォルメートを使用する最初の分析の開始時に、運転内注入を使用して内部キャリブレーションを行い、得られたキャリブレーションを後続の分析の外部キャリブレーションとして使用した。イオントラップの外部キャリブレーションは、Agilent ESIチューンミックスを使用して行った。データは、Bruker DataAnalysisソフトウェア及びSmartFormulaツール（Bruker社）を使用して分析した。
実施例１～９に関する参考文献
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本発明の例示的な実施形態を、添付の図面を参照して本明細書中に詳細に開示したが、読者は、本発明がそれらの寸分違わぬ実施形態に限定されないこと、並びに添付の特許請求の範囲及びその均等物によって定義される本発明の範囲から逸脱することなく、当業者が種々の変更及び修正を行い得ることに留意すべきである。

Claims (32)

  1. 式（Ｉ）若しくは（II）
    Figure 2022505464000064
    ［式中、
    Ｒ１は、Ｈ、アミノ酸残基又はペプチドであり、
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル又はＣ５－２０アリールであり、
    ｑは、１、２又は３であり、
    Ｒ３又はＲ４はそれぞれ、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＯＣ１－６アルキル、ＳＣ１－６アルキル、ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）及びＮ（Ｃ１－６アルキル）２から独立して選択され、
    Ｘは、Ｘ１－Ｙ、Ｓ－Ｓ－Ｒ５、Ｓｅ－Ｓｅ－Ｒ５、Ｏ－ＮＨ－Ｒ５、Ｓ－ＮＨ－Ｒ５、Ｓｅ－ＮＨ－Ｒ５、Ｘ２－Ｙ１、Ｘ３－Ｙ２、Ｎ３又はＮＨ－Ｓ（Ｏ）２－Ｙ３であり、
    Ｘ１は、Ｓ、Ｓｅ、Ｏ、ＮＨ又はＮ（Ｃ１－６アルキル）であり、
    Ｘ２は、Ｓ、Ｓｅ又はＯであり、
    Ｘ３は、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏであり、
    Ｘ４は、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、
    Ｒ５は、Ｈ、ハロ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＯＣ１－６アルキル、ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、ペプチド、糖、Ｃ３－２０ヘテロシクリル及び核酸から選択され、
    Ｙは、
    Figure 2022505464000065
    から選択される保護基であり、
    Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ’、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ２Ｒ’、Ｃ５－２０アリール、Ｃ３－２０ヘテロアリール、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’及びＮＨＲ’から選択され、
    Ｒ７及びＲ８は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、Ｏ（Ｃ５－２０アリール）及びＯ（Ｃ３－２０ヘテロアリール）から独立して選択されるか、又はＲ７及びＲ８は一緒に連結されて、Ｏ－ＣＨ２－Ｏ基を形成し、
    各Ｒ’は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル及びＣ５－２０アリールから独立して選択され、
    Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６ハロアルキル、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ’、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ２Ｒ’及びＣ５－２０アリールから選択され、
    Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル及びＣ１－６ハロアルキルから選択され、
    Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル及びＣ１－６ハロアルキルから選択され、
    Ｘ５は、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、Ｎ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－Ｒ’、Ｎ－Ｓ（Ｏ）２Ｈ、Ｎ－Ｓ（Ｏ）２Ｒ’又はＮＲ’であり、
    Ｙ１は、
    Figure 2022505464000066
    から選択される保護基であり、
    Ｙ２は、
    Figure 2022505464000067
    、ｔ－Ｂｕ及びＣＨ２Ｐｈから選択される保護基であり、
    Ｍ＋は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又はＮ（Ｒ１３）４ ＋であり、
    Ｚは、Ｓｉ又はＧｅであり、
    Ｒ１２は、Ｃ１－６アルキル又はＣ（Ｏ）－（Ｃ５－２０アリール）であり、
    Ｒ１３は、Ｈ、Ｃ１－６アルキル、アリル又はＣ５－２０アリールであり、
    Ｙ３は、保護基
    Figure 2022505464000068
    である］
    の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  2. 非天然アミノ酸が、下記式
    Figure 2022505464000069
    を有する、請求項１に記載の式（Ｉ）若しくは（II）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  3. 非天然アミノ酸が、下記式
    Figure 2022505464000070
    を有する、請求項１又は２に記載の式（Ｉ）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  4. 非天然アミノ酸が、
    Figure 2022505464000071
    であるＹ基を含む、請求項１～３のいずれかに記載の式（Ｉ）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  5. 非天然アミノ酸が、下記式
    Figure 2022505464000072
    を有する、請求項１～４のいずれかに記載の式（Ｉ）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  6. 非天然アミノ酸が、
    Figure 2022505464000073
    であるＹ基を含む、請求項１～５のいずれかに記載の式（Ｉ）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  7. Ｒ６が、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＦ３、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２ＣＨ３、ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ３及びＰｈから選択される、請求項１～６のいずれかに記載の式（Ｉ）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  8. Ｒ６がＣＨ３である、請求項１～７のいずれかに記載の式（Ｉ）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  9. Ｙが、
    Figure 2022505464000074
    である、請求項１～８のいずれかに記載の式（Ｉ）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  10. 非天然アミノ酸が、下記式
    Figure 2022505464000075
    を有する、請求項１～９のいずれかに記載の式（Ｉ）の非天然アミノ酸又はその塩、溶媒和物、互変異性体、異性体若しくは混合物。
  11. 請求項１～１０のいずれかに記載の非天然アミノ酸を含むポリペプチドであって、前記非天然アミノ酸が、ペプチド結合を介して前記ポリペプチドに結合している、前記ポリペプチド。
  12. ＤＡＰを含むポリペプチドを調製する方法であって、請求項１１に記載のポリペプチドを脱保護するステップを含む、前記方法。
  13. 脱保護するステップが、３６５ｎｍ、３５ｍＷｃｍ－２における１分間の照射を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 変異Ｙ２７１Ｃ、Ｎ３１１Ｑ、Ｙ３４９Ｆ及びＶ３６６Ｃを含む、ＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼ。
  15. 前記変異を含むメタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkerii）ＰｙｌＲＳ（ＭｂＰｙｌＲＳ）ｔＲＮＡシンテターゼである、請求項１４に記載のＰｙｌＲＳ ｔＲＮＡシンテターゼ。
  16. ２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ、2,3-diamino propionic acid）を含むポリペプチドを生産する方法であって、請求項１～１０のいずれかに記載の非天然アミノ酸をポリペプチドに遺伝的に組み込むステップと、前記非天然アミノ酸を脱保護して２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）にする任意のステップとを含む、前記方法。
  17. ポリペプチドの生産が、
    （ｉ）前記ポリペプチドをコードする核酸を用意するステップであって、前記核酸が、請求項１～１０のいずれかに記載の非天然アミノ酸をコードする直交性コドンを含む、ステップと、
    （ii）前記直交性コドンを認識できる直交性ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対の存在下で前記核酸を翻訳し、前記非天然アミノ酸をペプチド鎖に組み込むステップと
    を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 直交性コドンがアンバーコドン（ＴＡＧ）を含み、ｔＲＮＡがＭｂｔＲＮＡＣＵＡを含み、ｔＲＮＡシンテターゼが、変異Ｙ２７１Ｃ、Ｎ３１１Ｑ、Ｙ３４９Ｆ及びＶ３６６Ｃを有するＭｂＰｙｌＲＳシンテターゼを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 非天然アミノ酸が、
    Figure 2022505464000076
    を含む、請求項１６～１８のいずれかに記載の方法。
  20. 生細胞の内部で実施される、請求項１６～１９のいずれかに記載の方法。
  21. 生細胞が、ＢＬ２１ ＤＥ３大腸菌細胞等の大腸菌（E.coli）細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 生細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等の哺乳動物細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
  23. ポリペプチドが酵素であり、非天然アミノ酸が、前記酵素の活性部位内のアミノ酸残基に対応する位置に組み込まれる、請求項１１に記載のポリペプチド又は請求項１２、１３及び１６～２２のいずれかに記載の方法。
  24. 酵素が、International Nomenclature and Classification of EnzymesによるＥＣ３．４ペプチダーゼ、ＥＣ３．４．２２．４４ペプチダーゼ又はＥＣ２．３．２．２３ Ｅ２ユビキチン結合酵素である、請求項２３に記載のポリペプチド。
  25. １～２０個の２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）基を含む、請求項１１、２３及び２４のいずれかに記載のポリペプチド。
  26. 単一の２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）基を含む、請求項２５に記載のポリペプチド。
  27. 非天然アミノ酸が、野生型ポリペプチド中のシステイン、セリン又はトレオニン残基に対応する位置に組み込まれ、野生型ポリペプチド中のシステイン又はセリン残基に対応する位置に組み込まれていてもよい、請求項１１及び２３～２６のいずれかに記載のポリペプチド又は請求項１２、１３及び１６～２２のいずれかに記載の方法。
  28. ２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）を含むポリペプチドの生産における、請求項１～１０のいずれかに記載の非天然アミノ酸の使用。
  29. ポリペプチドの生産が、請求項１２、１３及び１６～２２のいずれかに記載の方法を行うことを含む、請求項２８に記載の使用。
  30. 酵素の基質を捕捉する方法であって、
    ａ）活性部位に少なくとも１つの２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）基を含む酵素を用意するステップと、
    ｂ）前記酵素を、前記酵素の候補基質と接触させるステップと、
    ｃ）インキュベートして前記ＤＡＰ基を前記候補基質と反応させるステップと
    を含む、前記方法。
  31. 基質が代謝産物である、請求項３０に記載の方法。
  32. 酵素が、ペプチダーゼ又はユビキチン結合酵素又はヒドロラーゼ又は炭素－硫黄結合を形成する酵素である、請求項３０又は３１に記載の方法。
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