LT6159B

LT6159B - Seleno baltymų (selprot) gavimas

Info

Publication number: LT6159B
Application number: LT2013069A
Authority: LT
Inventors: Klimašauskas; Rakauskaitė; Masevičius
Original assignee: Vilniaus Universitetas
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2015-05-25
Also published as: EP3019194B1; WO2015005756A1; LT2013069A; EP3019194A1

Abstract

Pritaikius UAG kodono supresiją, vykdomą genetiškai modifikuoto mielių kamieno, pasiūlytas bendras metodas, leidžiantis į bet kurią baltymo poziciją įjungti šviesai jautria grupe apsaugotą selenocisteiną (Sec). Baltymas, kurio sudėtyje yra selenocisteino liekana(-os), apsaugota fotoreaktyvia nitrobenzilo grupe, yra sintetinamas ir išgryninamas iš mielių ląstelių. Apsauginė grupė pašalinama apšvitinus baltymą (esantį ląstelėse arba išgrynintą) UV šviesa, ir tokiu būdu atkuriant Sec. Pasiūlytas metodas galėtų palengvinti selenobaltymų sintezę ir tuo pačiu išplėsti jų biotechnologinį bei biofarmacinį potencialą.

Description

Išradimas susijęs su kryptingu retų ir nenatūralių aminorūgščių įjungimu į baltymus, ypač su in vivo rekombinantinių baltymų sintezės technologija, paremta UAG kodono supresija genetiškai koduojamomis nenatūraliomis aminorūgštimis.

Išradimo apžvalga

Rekombinantinių baltymų inžinerija ir sintezė ląstelėje yra plačiai išplėtota sritis, skirta biomolekulių struktūtos ir funkcijos tyrimams bei praktiniam taikymui medicinoje ir pramonėje. Deja, dažnai yra labai sunku sukurti ir pagaminti baltymą, kuris turėtų pageidaujamą fermentinį aktyvumą ar biologinę funkciją (Brustad, E.M. and Arnold, F.H. (2011) Curr. Opin. Chem. Biol. 15(2), 201-210). Selenocisteino (Sec), 21-os aminorūgšties įjungimas į dirbtinius baltymus yra vienas iš būdų, leidžiantis suteikti jiems naujų savybių. Sec yra cisteino (Cys) analogas, turintis seleno atomą vietoje sieros, kas Sec suteikia unikalių fizikocheminių charakteristikų. Palyginus su Cys tiolio grupe, Sec selenolio grupė pasižymi aukštesniu nukleofiliškumu, žemesniu pKa ir žemesniu oksidacijos-redukcijos potencialu. Dėl išskirtinio cheminio reaktyvumo Sec sugeba pakeisti struktūrines ir fermentines baltymo savybes. Pavyzdžiui, baltymų inžinerijoje Sec įjungiamas į katalizinį fermento centrą, kuomet siekiama išplėsti natūraliai susiformavusį fermento katalizinį pajėgumą. (Huang, X. et ai. (2011) Chem. Soc. Rev. 40, 1171-1184). Kita vertus, unikalus Sec cheminis reaktyvumas su elektrofilais ir oksidacijos reagentais yra naudingas selektyviai konjugacijai, žymėjimui ar baltymo dimerizacijos vietų kūrimui (Heras, I.L. etai. (2011) Anai. Bioanal. Chem. 400(6), 1717-27; Arnėr, E. (2010) Exp. Cell. Res. 316(8), 1296-303; Johansson, L. et ai. (2005) Biochim. Biophys. Actą. 1726(1), 1-13). Dar daugiau, selenocisteino, savo sudėtyje turinčio vertingų Se izotopų, įjungimas į baltymus yra naudojamas fazės nustatymui daugybinių bangos ilgių anomalios difrakcijos kristalografijoje, pozitronų emisijos tomogtafijoje PET (⁷³Se), specifiniame žymėjime radionuklidais (⁷⁵Se) ir didelės raiškos BMR (⁷⁷Se) tyrimuose (Johansson, L. et ai. (2005) Biochim. Biophys. Actą. 1726(1), 1-13). Ne mažiau reikšminga selenologijos sritis yra efektyvi gamtinių rekombinantinių selenobaltymų sintezė bakterijų (Arnėr, E.S.J. (2002) Met. Enzymol. 347, 226-235) arba eukariotų ląstelėse (Liu, H. etai. (2012) Protein Expr Purif. 84(1), 59-63.

Nepaisant aukšto technologinio potencialo, Sec įjungti į rekombinantinius baltymus nėra paprasta. Dirbtinių selenobaltymų sintezei buvo pasiūlyta visa eilė metodų, tačiau iki šiol nė vienas iš jų neleido preciziškai į baltymus įterpti selenocisteiną ir gauti geras produkto išeigas (Johansson, L. et ai. (2005) Biochim. Biophys. Actą. 1726(1), 1-13). Pavyzdžiui, baltymų susiuvimo metodus riboja kietos fazės sintezė, kuri paprastai leidžia susintetinti ne ilgesnius nei 50-ies aminorūgščių peptidus. Jei Sec turi būti įjungtas toliau 50-osios pozicijos, būtina siūti tris peptidinius fragmentus. Kadangi peptidų susiuvimui reikalinga N-galinio Cys liekana, šis metodas baltymo sekoje neišvengiamai sukuria papildomas Cys mutacijas (Muir, T. W. (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 249-289). Kitu atveju, kuomet serino (Ser) liekanos chemiškai paverčiamos į Sec, reakcija vyksta su visais baltymo Ser, todėl ji netinka, kai baltymuose reikia atlikti vienintelį pakeitimą selenocisteinu (Wu, Z.-P., Hilvert, D. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111, 4513-4514). Panaši specifiškumo problema iškyla kada baltymas, savo sudėtyje turintis keletą Cys, yra sintetinamas Cys-auksotrofinio mikroorganizmo, auginamo terpėje su Sec - gaunamas produktas su daugybiniais Sec (Muller, S. et ai. (1994) Biochem. 33, 3404-3412). Rekombinantiniu baltymų sintezę bakterijose, vykstant gamtinio UGA kodono supresijai, riboja techniniai sunkumai. Jie atsiranda todėl, kad bakterinių selenobaltymų iRNR šalia UGA kodono yra plaukų segtuko pavidalo Sec įterpimo seka (SECIS). Ši SECIS struktūra, o taip pat joje esantys 4 konservatyvūs nukleotidai yra absoliučiai reikalingi, kad transliacijos metu Sec būtų nukreiptas į peptidinę grandinę (Yoshizavva, S., Bock, A. (2009) Biochim. et Biophys. Actą. 1790, 14041414). Taigi, praktiškai yra beveik neįmanoma rekombinantinėje iRNR sukurti dirbtinę SECIS struktūrą, tuo pačiu metu neįvedant į baltymo seką papildomų mutacijų. Kitaip nei bakterinės transliacijos atveju, baltymų raiškos sistemos žinduolių ląstelėse iš esmės tinka kryptingam Sec įjungimui j baltymą be papildomų sekos pakeitimų, nes žinduolių SECIS yra netransliuojamoje 3’UTR srityje. Deja, šios sistemos reikalauja nemažų išlaidų ir neleidžia gauti gerų produkto išeigų (Berry, M.J. etai. (1993) EMBO J., 12 (8), 3315-3322). Tas pats pasakytina ir apie in vitro baltymų raiškos sistemas, kurias sudaro brangūs komponentai ir kurioms reikia sudėtingais cheminiais metodais paruošiamos tRNR su prijungtu Sec (Kang, T.J., Suga, H. (2008) Biochem. Cell Biol. 86, 92-99).

Alternatyvus kryptingo tam tikrų nenatūralių aminorūgščių įterpimo į baltymus metodas yra paremtas genetiškai koduojamų nenatūralių aminorūgščių įjungimu UAG stop kodono vietoje. Ši technologija jau leido labai specifiškai j baltymus įvesti daugiau nei 70 skirtingų aminorūgščių (Liu, C.C. and Schultz, P.G. (2010) Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444), tačiau kol kas nebuvo pritaikyta Sec įterpimams/pakeitimams atlikti. Nors yra pavykę į histono H3 baltymą įterpti fenilselenocisteiną (Guo, J. et ai. (2008) Angew. Chem. Int. Ed. Engi. 47(34), 6399-6401), nebuvo pasiūlytas metodas, kuris leistų nuo Sec pašalinti apsauginę grupę (Clark, K.M. et ai. (2009) Methods Enzymol. 462, 97-115). Šiuo metodu į įvairius baltymus buvo sėkmingai įterptos aminorūgštys su šviesai jautriomis apsauginėmis grupėmis, kaip antai DMNB-Ser. Nenatūrali aminorūgštis DMNB-Ser in situ fotolizės reakcijoje vėliau buvo nesunkiai paversta Ser (Lemke, E.A. et ai. (2007) Nat. Chem. Biol. 3(12), 769-772). Proceso metu mielių ląstelės kotransformuotos plazmide, koduojančia tikslinį baltymą su TAG stop kodonu pasirinktoje geno vietoje bei plazmide pescTrpLeuRSBH5T252A, koduojančia ortogonalią UAG stop kodoną supresuojančią tRNRcuA (Ο-tRNR) ir ortogonalią aminoacil tRNR sintetazę (O-RS), kuri prie O-tRNA prijungia nenatūralią aminorūgštj DMNB-Ser (ir taip pat DMNB-Cys, Young, T.S. et ai. (2009) Biochemistry. 48(12), 2643-2653). Deja, rekombinantiniu baltymų kiekiai gauti iš tokių mielių kultūrų buvo gana vidutiniški (Lemke, E.A. etai. (2007) Nat. Chem. Biol. 3(12), 769-772; Chin, J.W. et ai. (2003) Science. 301(5635), 964-967). Rekombinantiniu baltymų išeigos buvo pagerintos optimizavus Ο-tRNR transkripciją, t.y. suliejus OtRNR geną su SNR52 promotoriumi (pSNR-LeuRS plazmidė) ir baltymų raišką atlikus mielėse LWUPF1A, iš kurių pašalintas UPF'] genas, stabilizuojantis stop kodoną turinčias iRNR (Wang, Q. and VVang, L. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130(19), 6066-6067). Nors veiksminga, ši sistema nebuvo panaudota sintetinti baltymams su DMNB-Ser arba DMNB-Cys.

Iki šiol nė viena iš egzistuojančių technologijų nepasiteisino kaip bendras metodas skirtas efektyviai sintetinti rekombinantinius baltymus, pageidaujamoje pozicijoje įvedant Sec liekaną.

Išradimo santrauka

Pirma: išradimas išsprendžia aukščiau išdėstytą problemą, panaudojant bet kurioje norimoje iRNR pozicijoje įvestą UAG kodoną, kuris mielių ląstelėse yra iškoduojamas Ο-tRNR su prijungta nenatūralia aminorūgštimi - fotochemine grupe apsaugotu selenocisteinu. Apsauginė grupė, tokia kaip 4,5-dimetoksi-2-nitrobenzilas (DMNB), yra vėliau pašalinama nuo baltymo švitinant jį UV šviesa ir mutacijos vietoje atstatant Sec. Iš principo ši strategija gali būti taikoma Sec įjungti į bet kokio baltymo bet kurią norimą poziciją. Dar daugiau: gyvose ląstelėse fotochemiškai apsaugotas selenobaltymas leistų optiškai kontroliuoti jo vykdomus biologinius procesus. Taigi, šis metodas pateikia naują įrankį baltymų inžinerijai ir konkrečiai - selenologijai.

Antra: Išradimas pateikia naują fotochemiškai apsaugoto selenocisteino junginį (I formulė) bei sintezės schemą skirtą jam gauti.

Trumpas figūrų aprašymas

Fig.1 rodo DMNB-Cys sintezės kelią.

Fig. 2 rodo DMNB-Sec sintezės kelią.

Fig. 3 iliustruoja nuo DMNB-Sec priklausomą funkciškai aktyvaus EGFP baltymo sintezę mielių S. cerevisiae ląstelėse.

Fig. 4 iliustruoja fotocheminės DMNB grupės pašalinimą nuo selenocisteino lieknos, EGFP baltymą paveikus UV šviesa (340-390 nm).

Fig. 5 iliustruoja EGFP baltymo dimerų formavimąsi paveikus baltymą UV šviesa ir susidariusių dimerų redukciją pridėjus DTT.

Fig. 6 demonstruoja, kad tiek fotoapsauginės grupės pašalinimas, tiek dimerizacija ir redukuojanti monomerizacija vyksta švelniomis sąlygomis, išsaugant EGFP baltymo funkcines savybes (fluorescenciją).

Detalus išradimo aprašymas

Visi tekste vartojami techniniai ir moksliniai terminai taikomi ir turi tokią reikšmę, kaip tai įprastai taiko ir supranta asmuo susijęs su išradimo sritimi, nebent apibrėžta kitaip. Terminu „ortogonali“ vadinama molekulė, kuri funkcionuoja kartu su endogeniniais ląstelės komponentais, tačiau pasižymi mažesniu efektyvumu palyginus su atitinkama molekule, priklausančia ląstelei ar transliacijos sistemai, arba kuri visiškai nefunkcionuoja kartu su vidiniais ląstelės komponentais. tRNR ir aminoacil-tRNR sintetazių kontekste ortogonalumu vadinamas nesugebėjimas funkcionuoti arba sumažėjęs ortogonalios tRNR efektyvumas funkcionuoti su endogenine tRNR sintetaze, palyginus su tuo, kaip endogeninė tRNR sintetazė funkcionuoja su endogenine tRNR. Ortoganaliai molekulei trūksta funkcijos, kuri yra įprasta ląstelės komplementariai endogeninei molekulei. Terminas „tikslinis kodonas“ taikomas kodonams, kuriuos transliacijos proceso metu atpažįsta O-tRNA ir kurių neatpažįsta endogeninės tRNR. Tiksliniais kodonais gali būti stop kodonai, tokie kaip, pvz., UAG, UAA, UGA.

Terminas „transliacijos sistema“ taikomas komponentams, kurie j augančią polipeptidinę grandinę įjungia aminorūgštį; šiuos komponentus gali sudaryti, pvz., ribosomos, tRNR, tRNR sintetazės, iRNR ir panašūs. O-tRNA ir O-RS gali būti pridėtos į in vitro ar in vivo transliacijos sistemas arba būti jų dalimi. Išradimo metodais parinktos komponentų grupės veikia ląstelėje. Sistemai priklausanti nenatūrali aminorūgštis gali būti sintetinė aminorūgštis, tokia kaip šviesai jautria grupe apsaugotas selenocisteinas, egzogeniškai pridedamas į augimo terpę.

Aptariamas išradimas susijęs su baltymų turinčių nenatūralią aminorūgštį vienoje ar keliose pasirinktose pozicijose sinteze, taikant transliacijos sistemą. Metodas susideda iš:

a) Transliacijos sistemos, laikant, kad ji susideda iš:

i) nenatūralios amino rūgšties, kuri yra fotolabiliu bloku apsaugotas selenocisteinas;

ii) ortogonalios aminoacil-tRNR sintetazės (O-RS);

iii) ortogonalios tRNR (Ο-tRNR), kurią minėta O-RS aminoacilina fotolabiliu bloku apsaugotu selenocisteinu, pastarajam teikdama pirmenybę prieš natūralias aminorūgštis;

iv) nukleorūgšties, kuri koduoja tikslinį baltymą ir turi bent vieną tikslinį kodoną, kuris yra atpažįstamas minėtos O-tRNR;

b) Minėtos nenatūralios amino rūgšties įtraukimo pasirinktoje pozicijoje tiksliniame baltyme atliekant šio baltymo transliaciją (sintezę), kuri vykdoma pasitelkiant minėtą tikslinį kodoną, tuo būdu gaunant tikslinj baltymą turintį nenatūralią aminorūgštį pasirinktoje pozicijoje.

Aprašomas metodas gali būti išplėstas įtraukiant žingsnį c). Šis žingsnis fotolabilios apsauginės grupės pašalinimas veikiant transliacijos sistemą ar išgrynintą baltymą UV spindulių šaltiniu.

Ląstelės šeimininkės, kuriose atliekamos procedūros, pasirenkamos teikiant prerogatyvą bakterijų, mielių arba žinduolių ląstelėms; pirmenybė ypač teikiama mielių ląstelėms. Pirmuoju pasirinkimu iš mielių ląstelių yra Saccharomyces cerevisiae.

Toliau išradimas susijęs su fotolabiliu bloku apsaugotu selenocisteinu aprašomu formule I:

kur

R yra H, alkilas arba alkoksi-, karboksimetoksi grupė,

R¹ yra H, alkilas, arilas, alkoksi, hidroksi arba halogenatomai,

R² ir R³ kiekvienas nepriklausomai reiškia H, alkilą, arilą, alkoksi, hidroksi grupę, CO₂R⁵ arba halogenatomą; kur jeigu R ir R² arba R ir R³ yra alkoksi, R² arba R³ gali sudaryti penkianares, šešianares arba septynianares ciklines struktūras derinyje su R,

R⁴ yra H, metilas, alkilas, -CH2OR⁵ arba -CO2R⁵,

R⁵ yra H- arba alkilas.

Pirmenybė teikiama renkantis fotolabiliu bloku apsaugotą selenocisteino darinį - 4,5dimetoksi-2-nitrobenzilselenocisteinui (DMNB-Sec).

Toliau išradimas susijęs su fotolabiliu bloku apsaugoto selenocisteino aprašomo formule I sinteze, kuri susideda iš šių stadijų: N‘,N-apsaugoto selenocistino redukcija, susidariusio junginio reakcija su pasirinktu (1,3,4,5- ir arba alfa- pakeistu) 2-nitrobenzil- halogenidu, sulfonatu, fosfatu arba karboksilatu bei aminogrupės deblokavimo. Selenocistino aminogrupės gali būti apsaugotos fref-butoksikarbonil-, karboksibenzil-, aliloksikarbonil-, metoksikarbonil arba etoksikarbonil- apsauginėmis grupėmis.

Fotolabiliu bloku apsaugotas selenocisteinas aprašomas formule I toliau naudojamas šiame išradime aprašomame metode.

Aptariamasis išradimas, skirtas kryptingam Sec įjungimui j baltymus, yra paremtas UAG kodono supresijos technologija, naudojama kai kurioms kitoms nenatūralioms aminorūgštims įjungti į baltymus. Šiam metodui naudojamos mielių ląstelės, kurios yra transformuotos plazmidėmis, norimoje tikslinio geno pozicijoje turinčiomis genų inžinerijos metodais įvestą TAG stop kodoną. Sistemą sudaro šie pagrindiniai komponentai:

1. mielių padermė LWUPF1A, kurioje įvesta (?PE1-geno delecija;

2. plazmidė pRR6;

3. sintetinė šviesai jautria grupe apsaugota aminorūgštis DMNB-Sec;

4. plazmidė, turinti pageidaujamoje tikslinio geno pozicijoje genų inžinerijos metodu įvestą TAG stop kodoną (pavyzdžiu naudojama pGFP-TAG).

pRR6 plazmidė buvo sukonstruota genų inžinerijos metodais laukinio tipo LeuRS geną iš plazmidės pSNR-LeuRS (Wang, Q. and Wang, L. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130(19), 6066-6067) pakeitus mutuotu, specifišku DMNB-Ser, genu LeuRSBH5T252A iš plazmidės pescTrpLeuRSBH5T252A (Lemke, E.A. et al. (2007) Nat. Chem. Biol. 3(12), 769-772). DNR nukleotidų seka, reprezentuojanti LeuRSBH5T252A geną, yra pateikta kaip Seka Nr. 1:

atgcaagagcaataccgcccggaagagatagaatccaaagtacagcttcattgggatgagaagcgcacatttgaa gtaaccgaagacgagagcaaagagaagtattactgcctgtctgggcagccctatccttctggtcgactacacatggg ccacgtacgtaactacaccatcggtgacgtgatcgcccgctaccagcgtatgctgggcaaaaacgtcctgcagccga tcggctgggacgcgtttggtctgcctgcggaaggcgcggcggtgaaaaacaacaccgctccggcaccgtggacgta cgacaacatcgcgtatatgaaaaaccagctcaaaatgctgggctttggttatgactggagccgcgagctggcaacct gtacgccggaatactaccgttgggaacagaaattcttcaccgagctgtataaaaaaggcctggtatataagaagactt ctgcggtcaactggtgtccgaacgaccagaccgtactggcgaacgaacaagttatcgacggctgctgctggcgctgc gataccaaagttgaacgtaaagagatcccgcagtggtttatcaaaatcactgcttacgctgacgagctgctcaacgat ctggataaactggatcactggccagacaccgttaaaaccatgcagcgtaactggatcggtcgttccgaaggcgtgga gatcaccttcaacgttaacgactatgacaacacgctgaccgtttacactacccgcccggacgcgtttatgggttgtacct acctggcggtagctgcgggtcatccgctggcgcagaaagcggcggaaaataatcctgaactggcggcctttattgac gaatgccgtaacaccaaagttgccgaagctgaaatggcgacgatggagaaaaaaggcgtcgatactggctttaaa gcggttcacccattaacgggcgaagaaattcccgtttgggcagcaaacttcgtattgatggagtacggcacgggcgc agttatggcggtaccggggcacgaccagcgcgactacgagtttgcctctaaatacggcctgaacatcaaaccggttat cctggoagctgacggctctgagccagatctttctcagcaagccctgactgaaaaaggcgtgctgttcaactctggcga gttcaacggtcttgaccatgaagcggccttcaacgccatcgccgataaactgactgcgatgggcgttggcgagcgtaa agtgaactaccgcctgcgcgactggggtgtttcccgtcagcgttactggggcgcgccgattccgatggtgactctagaa gacggtaccgtaatgccgaccccggacgaccagctgccggtgatcctgccggaagatgtggtaatggacggcatta ccagcccgattaaagcagatccggagtgggcgaaaactaccgttaacggtatgccagcactgcgtgaaaccgaca ctttcgacacctttatggagtcctcctggctgtatgcgcgctacacttgcccgcagtacaaagaaggtatgctggattccg aagcggctaactactggctgccggtggatatcggtattggtggtattgaacacgccattatgtttctgctctacttccgcttc ttccacaaactgatgcgtgatgcaggcatggtgaactctgacgaaccagcgaaacagttgctgtgtcagggtatggtg ctggcagatgccttctactatgttggcgaaaacggcgaacgtaactgggtttccccggttgatgctatcgttgaacgtga cgagaaaggccgtatcgtgaaagcgaaagatgcggcaggccatgaactggtttataccggcatgagcaaaatgtcc aagtcgaagaacaacggtatcgacccgcaggtgatggttgaacgttacggcgcggacaccgttcgtctgtttatgatgt ttgcttctccggctgatatgactctcgaatggcaggaatccggtgtggaaggggctaaccgcttcctgaaacgtgtctgg aaactggtttacgagcacacagcaaaaggtgatgttgcggcactgaacgttgatgcgctgactgaaaatcagaaag cgctgcgtcgcgatgtgcataaaacgatcgctaaagtgaccgatgatatcggccgtcgtcagaccttcaacaccgca attgcggcgattatggagctgatgaacaaactggcgaaagcaccaaccgatggcgagcaggatcgcgctctgatgc aggaagcactgctggccgttgtccgtatgcttaacccgttcaccccgcacatctgcttcacgctgtggcaggaactgaa aggcgaaggcgatatcgacaacgcgccgtggccggttgctgacgaaaaagcgatggtggaagactccacgctggt cgtggtgcaggttaacggtaaagtccgtgccaaaatcaccgttccggtggacgcaacggaagaacaggttcgcgaa cgtgctggccaggaacatctggtagcaaaatatcttgatggcgttactgtacgtaaagtgatttacgtaccaggtaaact cctcaatctggtcgttggctaa

Šviesai jautria grupe apsaugotas selenocisteinas DMNB-Sec buvo chemiškai susintetintas iš selenocistino kaip trifluoracetato druska, panaudojus naujai sukurtą procedūrą. Tokia pati procedūra gali būti panaudota sintetinti kitiems, šviesai jautria grupe apsaugotiems, selenocisteinams, kurių formulė Nr. 1:

kur:

R yra H, alkilas arba alkoksi, karboksimetoksi grupė,

R¹ yra H, alkilas, arilas, alkoksi, hidroksi arba halogenatomai,

R² ir R³ kiekvienas nepriklausomai reiškia H, alkilą, arilą, alkoksi, hidroksi grupę, CO₂R⁵ arba halogenatomą; kur jeigu R ir R² arba R ir R³ yra alkoksidarinius, R² arba R gali sudaryti penkianares, šešianares arba septynianares ciklines struktūras derinyje su R,

R⁴ yra H, metilas, alkilas, -CH2OR⁵ arba -CO2R⁵,

R⁵ yra H- arba alkilas.

Kaip pavyzdį mes naudojome plazmidę pGFP-TAG (Wang, Q. and Wang, L.

(2008) J. Am. Chem. Soc. 130(19), 6066-6067), kuri koduoja EGFP baltymą su TAG mutacija nereikšmingoje Tyr39 pozicijoje.

Baltymo sintezei mielių LVVUPFln ląstelės buvo transformuotos pRR6 ir pGFP-TAG plazmidžių mišiniu, ir atrinkti transformantai auginami terpėje su 4 mM DMNB-Sec. Viso ilgio aktyvus baltymas susiformuoja tik tuomet, kai nenatūrali aminorūgštis yra įjungiama į baltymo grandinę iškodavus UAG kodoną. EGFP baltymas su prilietu 6-His oligopeptidu ir kurio Tyr39 pakeistas nenatūralia aminorūgštimi DMNB-Sec buvo išgrynintas iš mielių ląstelių imobilizuotų metalų afininės chromatografijos būdu. Izoliuoto EGFP baltymo su DMNB-Sec identiškumas patvirtintas masių spektrometrijos metodu. Seleno-EGFP baltymo išeiga sudarė 1 mg/l.

Pateikiamas metodas Sec apsaugoti naudoja šviesai jautrią DMNB grupę, tokiu būdu apsaugodamas chemiškai aktyvią selenolio grupę nuo cheminių reakcijų su biopolimerais, metabolitais ir kitomis molekulėmis (tame tarpe, aktyviais deguonies dariniais), esančiais ląstelės aplinkoje. Pasibaigus baltymo sintezei fotoapsauginė grupė gali būti pašalinta in vivo, apšvitinus UV šviesa ląsteles producentes, arba in vitro - apšvitinus išgryninto baltymo tirpalą.

Anksčiau buvo parodyta, kad O-RS, optimizuota nenatūraliai aminorūgščiai DMNB-Ser, taip pat gali veikti su DNMB-Cys (Young, T.S. et ai. (2009) Biochemistry. 48(12), 2643-2653). Mūsų nuostabai pasirodė, kad ši O-RS taip pat yra aktyvi su DMNB-Sec. Nors DMNB apsaugotas Sec nuo DMNB-Ser ir DMNB-Cys skiriasi tik vienu atomu, iš karto nebuvo akivaizdu, kad tokį nenatūralios aminorūgšties pakeitimą gerai toleruos mutantinė ortogonali LeuRS. Viena abejonės priežasčių yra ta, kad palyginti su sieros ir deguonies, seleno van der VVaals spindulys yra žymiai ilgesnis, dėl to mažiau tikėtina, kad didesnė aminorūgštis DMNB-Sec gerai atitiks fermento kišenę. Antra, dėl žymiai didesnio cheminio seleno reaktyvumo su elektrofilais ir oksidantais, DMNB-Sec gali greitai suirti augimo terpėje arba mielių ląstelės viduje. Trečia, anksčiau nebuvo nagrinėtas 4 mM DMNB-Sec toksiškumas mielių ląstelėms, nors žinoma, kad joms yra toksiškos žymiai mažesnės kai kurių Se junginių koncentracijos (pvz., 0,25 mM SeMet, Kitajima, T. et ai. (2012) J. Biol.

Chem. 287(13), 10032-8). Ketvirta, nors tiolių chemija ir turi panašumų su seleno chemija, mes nustatėme, kad efektyviai DMNB-Sec sintezei iš selenocistino visiškai netiko analogiškas DMNB-Cys sintezės iš cistino kelias, todėl jame reikėjo atlikti svarbių pakeitimų. Galiausiai, anksčiau nebuvo aprašytas fotocheminis DMNB grupės pašalinimas nuo Sec arba kitų Se junginių, ir nebuvo aišku, ar ši reakcija vyktų panašiai, kaip stebėta su Ser (Lemke, E.A. etai. (2007) Nat. Chem. Biol. 3(12), 769-772) ar Cys (Rathert, P. etai., (2007) Chembiochem. 8(2), 202-207).

Aprašytas metodas gali būti naudojamas bet kokių rekombinantinių selenobaltymų sintezei mielėse. Žinomų selenobaltymų sąrašas yra pateiktas http://www.selenodb.org/ interneto svetainėje.

Aprašytasis metodas gali būti naudojamas bet kurių kitų dirbtinai modifikuotų baltymų sintezei, kuriuose viena ar keletas Sec liekanų būtų įterptos pageidaujamose baltymo pozicijose. Įterpti Sec toliau gali būti naudojami kryptingam baltymo žymėjimui ar cheminei modifikacijai. Sec liekanos yra veikiamos tais pačiais reagentais, skirtais Cys modifikavimui, tačiau švelniai rūgštiniame pH (pH<7) ši reakcija tampa selektyvi Sec. Įjungto Sec liekanos taip pat gali būti panaudotos šviesa kontroliuojamam funkcinių baltymų dimerų formavimui, kaip kad parodyta su EGFP.

Aprašytasis metodas gali būti taikomas bet kokių dirbtinai modifikuotų fermentų sintezei, kuriuose vienas ar keletas Sec įterpiami pasirinktose aktyvaus centro arba netoli jo esančiose pozicijose. Tokia pozicija dažnai yra fermento katalizinio Cys ar Ser liekanos, pakeičiamos Sec. Technologija praktiškai galėtų būti taikoma šioms fermentų klasėms: tiolių oksidoreduktazėms, (EC 1.8.3.2), baltymų tirozino fosfatazėms (EC 3.1.3.48), Cys peptidazėms (EC 3.4.22) (MEROPS interneto duomenų bazė: //merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/family_index?type=P#C), vienos anglies pirimidino-5 transferazėms (tokioms kaip deoksicitidilato 5hidroksimetiltransferazės (EC 2.1.2.8), timidilato sintetazės (EC 2.1.1.45) ir daugybė DNR citozino-5 metiltransferazių (EC 2.1.1.37)), RNR citozino-5 metiltransferazėms (sąrašas paskelbtas http://modomics.genesilico.pI/reactions/C:m5C/) ir RNR uracil-5 metiltransferazėms (sąrašas paskelbtas http://modomics.genesilico.pI/reactions/U:m5U/) (Bujnicki J. et ai. (2004) Nucleic

Acids Res. 32(8), 2453-63). Taip pat buvo parodyta, kad DNR citozino-5 metiltransferazės (pvz., M.Hhal, M.Sssl, M.HpalI, M.AIul, M2.Eco31l) ir jų dirbtiniai variantai katalizuoja nuo sekos priklausančias nekanonines reakcijas, kaip kad didesnių nei metilo grupių pernašą nuo sintetinių kofaktorių analogų (Lukinavičius G. et ai. (2012) Nucleic Acids Res., 40(22), 11594-11602; US2013130922A1), formaldehido pridėjimą arba pašalinimą 5- citozino pozicijoje (Liutkevičiūtė Z. et ai., (2009) Nat. Chem. Biol. 5, 400-402) ir alifatinių tiolių bei selenolių pridėjimą DNR 5hidroksimetilcitozino liekanose (Liutkevičiūtė Z. et ai., (2011) Angew. Chem. Int. Ed., 50, 2090-2093). Šios naujos reakcijos gali būti naudojamos genominės DNR epigenetinių modifikacijų, tipiškai vykstančių CpG dinukleotido sekose, analizei. Pakeitus katalizinį Cys selenocisteinu būtų įmanoma sustiprinti šių fermentų katalizės jėgą ypač praktiškai svarbiose nekanoninėse reakcijose.

Pavyzdžiai pavyzdys. Fotoapsaugotos aminorūgšties sintezė

DMNB-Cys sintezė (Fig. 1)

Cistino dimetilo esteris 1

Cistino suspensija (5 g, 20,8 mmol) metanolyje (100 ml) buvo atšaldyta iki 70 °C, ir į reakcijos kolbą pridėta tionilchlorido (3,75 ml, 19,24 mmol). Palaukta, kol reakcijos mišinys pasieks kambario temperatūrą, tada 6 valandas virinta. Metanolis išgarintas sumažintame slėgyje, o nuosėdos ištirpintos metanolyje. Pridėjus dietilo eterio, produktas iškrito baltų kristalų nuosėdomis. Gauto produkto hidrochlorido druskos pavidale išeiga buvo 69 g (94%).

A/,A/’-bis(fe/f-butoksikarbonil)cistino dimetilo esteris 2

Reakcija atlikta pagal literatūroje aprašytą procedūrą (Busnel et ai., (2005) Bioorg. Med. Chem. 13(7), 2373-80).

/V-(fref-butoksikarbonil)cisteino metilo esteris 3

Reakcija atlikta pagal literatūroje aprašytą procedūrą (Busnel etai., (2005)).

A/-(fref-butoksikarbonil)-S-(4,5-dimetoksi-2-nitrobenzil)cisteino metilo esteris /V-(fref-butoksiarbonil)cisteino metilo esterio suspensija (1,94 g, 8,25 mmol), 4,5-dimetoksi-2-nitrobenzilbromidas (2,40 g, 8,73 mmol) ir natrio karbonatas (1,51 g,

14,25 mmol) tetrahidrofurane (THF) (50 ml) virinta 60 valandų, tada reakcija nutraukta įpylus 50 ml vandens. THF išgarintas sumažintame slėgyje, ir produktas ekstrahuotas DCM. DCM išgarintas, o tai, kas liko, išgryninta chromatografijos kolonėle (C₆H₆:CHCI₃ 1:1, R_f = 0,23). Aprašyta procedūra leido gauti 2,16 g (61%) tikslinio produkto.

¹H NMR (400 MHz, CDCI3): δ = 1,47 (9H, s, 3xCH3), 2,91 (1H, dd J = 14, 5,6Hz, SCH^Hb), 2,98 (1H, dd J = 14, 5,6Hz, SCHAHs), 3,78 (3H, s, OCH3), 3,97 (3H, s, ArOCH3), 4,03 (3H, s, ArOCH3), 4,09 (1H, d J= 13.6Hz, BnCHAHBS), 4.17 (1H, d J = 13,6Hz, BnCHAHsS), 4,56 (1H, brm, CH), 5,35 (1H, d J = 7.6Hz, NH), 6,94 (1H, s, ArH), 7,69 (1H, s, ArH). ¹³C NMR (100 Mz, CDCI3): δ = 28,3, 34,4, 34,5, 52,7, 53,4, 56,4, 56,5, 80,3, 108,8, 113,4, 128,7, 140,5, 148,0, 153,0, 155,2, 174,4. EI. analizė Ci₈H₂₆N₂O₈S: apsk. - C, 50,22; H, 6,09; N, 6,51; S, 7,45. rasta - C, 50,39; H, 6,25; N, 6,53; S, 7,22. HRMS (Ci₈H₂6N₂O₈S): m/z [M+Naf, apsk.: 453,1302; rasta: 453,1310.

S-(4,5-dimetoksi-2-nitrobenzil)cisteino hidrochloridas 5

Į /V-(fref-butoksikarbonil)-S-(4,5-dimetoksi-2-nitrobenzil)cisteino metilo esterio (0,95 g, 2,21 mmol) suspensiją acetono (25 ml) ir vandens (25 ml) mišinyje buvo pridėta koncentruotos druskos rūgšties (0,92 ml, 11,36 mmol). Reakcijos mišinys maišytas 3 dienas 60 °C (smėlio vonia) temperatūroje, tirpikliai išgarinti sumažintame slėgyje, liekana praplauta acetonu. Aprašyta procedūra leido gauti 0,74 g (95 %) tikslinio produkto.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-D6): δ = 2.95 (1H, dd J = 14,6, 6,4Hz, SC/7AHB ), 3,01 (1H, dd J = 14,6, 4,8, SCHAHs, 3,86 (3H, s, OCH3), 3,93 (3H, s, OCH3), 4,12 (1H, d J = 13,6 Hz, BnCHAHBS), 4,15-4,25 (2H, m, BnCHABsS + CH), 7,35 (1H, s, ArH), 7,70 (1 H, s, ArH), 8,62 (3H, brs, NH3), 14,04 (1H, brs, OH). ¹³C NMR (100 Mz, CDCI3): δ = 31,3, 33,7, 52,3, 56,5, 57,0, 109,4, 114,9, 129,3, 140,1, 148,0, 153,2, 170,0. HRMS (Ci₂Hi₆N₂O₆S): m/z [M+Hf, apsk.: 317,0802; rasta: 317,0805.

DMNB-Sec sintezė (Fig. 2) /y/V-bisifref-butoksikarboniOselenocistinas 1

3,8 ml selenocistino tirpalas (0,625 g, 1,88 mmol) šarminiame vandenyje (1M NaOH) buvo sumaišytas su 1,8 ml di-fref-butildikarbonato (1,633 g, 7,49 mmol) dioksane tirpalu. Reakcijos mišinys maišytas 24 vai. kambario temperatūroje, sukoncentruotas sumažintame slėgyje bei praplautas etilo acetatu. Vandens fazė buvo parūgštinta druskos rūgštimi, ir produktas ekstrahuotas etilo acetatu. Organinis sluoksnis praplautas sūrymu bei išdžiovintas bevandeniu natrio sulfatu. Etilo acetatas buvo pašalintas sumažintu slėgiu. Nuosėdos buvo perkristalintos iš benzeno ir sudarė 0,755 g (75,5 %) tikslinio produkto.

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃): δ = 1,45 (9H, s, 3xCH₃), 3,21 (1H, dd J = 12,6, 4,8Hz, SeCH_AH_B), 3,46 (1H, dd J = 12,6, 4,8Hz, SeCH_AH_B), 4,61 (1H, brm, CH), 5,37 (1H, brs, NH).

/V-(fref-butoksikarbonil)-Se-(4,5-dimetoksi-2-nitrobenzil)selenocisteinas 2 /\/,A/’-bis(fref-butoksikarbonil)selenocistino (0,755 g, 1,41 mmol) ir 4,5-dimetoksi-2nitrobenzilbromido (1,170 g, 4,24 mmol) mišinys etanolyje (30 ml) buvo atvėsintas iki 0 °C ir į reakcijos kolbą įpilta natrio borhidrido (0,161 g, 4,26 mmol). Reakcijos mišinys 75 min. maišytas kambario temperatūroje, po to reakcija sustabdyta vandeniu (70 ml). Į reakcijos mišinį pridėta etilo acetato ir parūgštinta druskos rūgštimi. Organinis sluoksnis atskirtas ir išdžiovintas virš natrio sulfato. Tirpikliai išgarinti sumažintu slėgiu, nuosėdos išgrynintos chromatografijos kolonėle (CHCI3, Rf = 0,26). Aprašyta procedūra leido gauti 1,133 g (86,5 %) tikslinio produkto.

¹H NMR (400 MHz, CDCI3): δ = 1,46 (9H, s, 3*CH3), 3,03 (1H, dd J = 13,6, 4,8Hz, SeCHAHB), 3,09 (1H, dd J = 13,6, 4,8Hz, SeCHAHs), 3,95 (3H, s, OCH3), 4,01 (3H, s, OCH3), 4,11 (1H, d J = 11,6Hz, BnC/7AHBSe), 4,21 (1H, d J = 11.6Hz, BnCHAHsSe), 4,62 (1H, brm, CH), 5,46 (1H, brm, NH), 6,83 (1H, s, ArH), 7,69 (1H, s, ArH). ¹³C NMR (100 Mz, CDCI3): δ = 25,9 (2 persidengiantys signalai aiškiai matomi iš HSQC duomenų), 28,3, 53,6, 56,4, 56,6, 80,7, 108,9, 113,2, 130,6, 139,7, 147,8, 153,2, 155,6, 174,9. EI. analizė Ci7H₂4N2O₈Se: apsk - C, 44,07; H, 5,22. rasta: C, 44,13; H, 5,53. HRMS (C₁₇H₂₄N₂O₈Se): m/z [M+Naf, apsk.: 487,0591; rasta: 487,0589.

Se-(4,5-dimetoksi-2-nitrobenzil)selenocisteino trifluoroacetatas 3 /V-(fref-butoksikarbonil)-Se-(4,5-dimetoksi-2-nitrobenzil)selenocisteinas (1,13 g, 2,44 mmol) buvo ištirpintas TFA (10 ml) ir 15 min. maišytas kambario temperatūroje. Išgaravus TFA, kietos nuosėdos praplautos DCM, nufiltruotos ir išdžiovintos. Produktas ištirpintas metanolyje, netirpūs nešvarumai nufiltruoti. Sumažintame slėgyje išgarinus metanolį, gauti 0,9 g (77 %) tikslinio produkto.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-D₆): δ = 2,95-3,11 (2H, m, SeCH₂), 3,87 (3H, s, OCH₃), 3,92 (3H, s, OCH₃), 4,14 (1H, d J = 12 Hz, BnCH_AH_BSe), 4,17-4,25 (2H, m, BnCH_AH_sSe + CH), 7,15 (1H, s, ArH), 7,70 (1H, s, ArH), 8,44 (3H, brs, NH₃). ¹³C

NMR (75 Mz, CDCb): δ = 23,4, 26,0, 53,1, 56,7, 57,0, 109,5, 114,5, 131,2, 139,8,

148,2, 153,6, 170,4. HRMS (CiaHieNaCbSe): m/z [M+H]⁺, apsk.: 365,0247; rasta:

365,0255.

pavyzdys. Kryptingas šviesai jautria grupe apsaugoto Sec įjungimas į mielių ląstelėse sintetinamus baltymus pavyzdys rodo, kad, naudojant aprašytą baltymų raiškos sistemą mielėse, funkciškai aktyviam baltymui susintetinti reikalingos kartu veikiančios molekulės: OtRNR, O-RS ir DMNB-Cys arba DMNB-Sec. Mielių ląstelės buvo vienu metu transformuotos dviem plazmidėmis (pGFP-TAG ir pRR6) arba atskiromis plazmidėmis, o atrinkti transformantai 24 h 30 °C temperatūroje auginti selektyvioje terpėje be (1 stulpelis) arba su (2 ir 3 stulpeliai) pridėta nenatūralia aminorūgšimi. Ląstelės surinktos centrifugavimu, praplautos ir resuspenduotos vandenyje. Nuo DMNB-Sec priklausančios funkcionalaus EGFP baltymo sintezės efektyvumas buvo stebėtas gyvose ląstelėse matuojant EGFP fluorescenciją (3 figūra). Fluorescencijos matavimai atlikti 0,1 ml ląstelių suspensijos pavyzdžiuose trimis pakartojimais, naudojant Synergy H4 (BioTek Instruments, Ine.) prietaisą. Kiekvieno mėginio fluorescencijos vertės buvo pakoreguotos pagal jo OD595 absorbcijos vertes. Plazmidė pGFP-TAG koduoja EGFP baltymą, kurio funkciškai neutralioje Tyr39 pozicijoje įvestas TAG stop kodonas. pRR6 plazmidė kuoduoja TAG stop kodoną supresuojančią O-tRNR ir mutantinę ortogonalią LeuRS. Ląstelės, augdamos be nenatūralių aminorūgščių su DMNB apsaugine grupe, daugiausia sintetina ne viso ilgio nefluorescuojantį EGFP (1 stulpelis). Funkciškai aktyvus EGFP baltymas (fluorescuojantis) sintetinamas tik tuomet, kai TAG kodonas iškoduojamas jį supresuojančios O-tRNA, užkrautos nenatūralia aminorūgštimi DMNB-Cys (2 stulpelis) arba DMNB-Sec (3 stulpelis).

stulpelis. Didesnė nei foninio lygio EGFP fluorescencija ląstelėse, augintose be nenatūralių aminorūgščių, atitinka nežymų viso ilgio EGFP baltymą, kuris, greičiausiai, sintetinamas UAG kodono vietoje įjungiant leucinu užkrautas O-tRNR.

stulpelis. Ląstelės, augdamos 4 mM DMNB-Cys terpėje, fluorescuoja 6 kartus labiau, palyginti su 1 sulpelio verte. Tai reiškia, kad transliacijos metu DMNB-Cys yra prijungiama prie O-tRNA, kurios pagalba toliau įjungiama j baltymą UAG kodono vietoje.

stulpelis. Ląstelės, augdamos 4 mM DMNB-Sec terpėje, fluorescuoja panašiai kaip ląstelės, augdamos 4 mM DMNB-Cys terpėje (2 stulpelis). Tai reiškia, kad transliacijos metu DMNB-Sec yra prijungiama prie O-tRNA, kurios pagalba toliau įjungiama į baltymą UAG kodono vietoje.

stulpelis. Ląstelės, transformuotos tik pGFP-TAG plazmidė, sintetina nedidelį funkciškai aktyvaus EGFP kiekį, kas atitinka ląstelės transliacijos aparato daromas UAG kodono supresijos klaidas.

stulpelis. Fluorescencijos fonas ląstelėse be reporterinės EGFP plazmidės.

stulpelis. Mielių autofluorescencijos fonas netransformuotose ląstelėse.

stulpelis. Nefluorescuojantis 4 mM DMNB-Cys tirpalas.

stulpelis. Nefluorescuojantis 4 mM DMNB-Sec tirpalas.

Šie duomenys atitinka mielių ląstelėse vykstantį kryptingą šviesai jautria grupe apsaugoto Sec įjungimą į EGFP.

šviesa indukuotas apsauginės DMNB grupės nuskėlimas nuo selenobaltymo (Fig. 4)

Fotocheminės reakcijos metu nuo selenobaltymo, turinčio fotoapsaugotą Sec liekaną, nuskeliama šviesai jautri DMNB grupė, ir tokiu būdu baltymo sekoje atkuriamas Sec. Fig. 4 demonstruoja fotolizinio apsauginės grupės pašalinimo eigą: reakcijoje dalyvauja baltymo sekoje esanti DMNB-Sec liekana. Su 6-His oligopeptidu sulietas EGFP baltymas, kurio sekoje Tyr39 pozicijoje įjungta DMNB-Sec nenatūrali aminorūgštis, buvo išgrynintas iš mielių ląstelių panaudojant standartinę IMAC procedūrą. Baltymo tirpalas (0,2 mg/ml PBS buferyje) apšvitintas UV šviesa, skleidžiama Olympus ΑΧ70 mikroskopo per 340-390 nm sužadinimo filtrą. Pažymėtais laiko momentais 20 pi pavyzdžiai buvo paimami ESI-MS analizei, ir EGFP produktai buvo kiekybiškai įvertinti remiantis masės spektrogramomis. Apsauginė DMNB grupė efektyviai pašalinta per 40-60 min, kas rodo, kad aprašytasis metodas gali būti praktiškai pritaikytas selenobaltymų sintezei.

pavyzdys. Šviesa kontroliuojama grįžtamoji baltymų dimerizacija

Chemiškai grįžtama rekombinantinių selenobaltymų dimerizacija (Fig. 5)

Fig. 5 rodo (SecEGFP)2 dimerų formavimąsi po 20 min trukusios DMNBSecEGFP baltymo apšvitos UV spinduliais. Jis taip pat iliustruoja susidariusių dimerų redukciją DTT, ko pasėkoje susiformuoja SecEGFP baltymas. Nepriklausomai nuo pridėto 50 mM DTT, 0 min laiko taške baltymo tirpale buvo tik šviesai jautria grupe apsaugotas DMNB-SecEGFP (apskaičiuota masė: 28936 Da). Apšvitinus baltymą UV šviesa, po 20 min susidarė nauja monomerinė forma SecEGFP (apskaičiuota masė: 28741 Da) bei dimerinis produktas (SecEGFP)₂ (apskaičiuota masė: 57480 Da). Baltymo dimerai buvo visiškai redukuoti pridėjus 50 mM DTT ir suformavo monomerinius SecEGFP. Sutinkamai su ESI-MS matavimais, labiausiai tikėtina, kad esant švelniai oksiduojančioms sąlygoms (oro deguonies aplinkoje), dimerizacija vyksta susidarant Se-Se ryšiui tarp įterptų Sec liekanų, kuris yra lengvai išardomas DTT.

Funkciškai aktyvaus selenobaltymo dimerizacija (Fig. 6)

Selenobaltymo preparatai (0,167 mg/ml PBS buferyje) 20 min švitinti analogiškai kaip ESI-MS analizei, po to pridėta DTT iki 50 mM ir sumaišyta su SDSPAGE preparatų buferiu (Thermo Fisher). Nekaitinti pavyzdžiai išfrakcionuoti 12 % poliakrilamido gelyje. Gelio fluorescencija vizualizuota FLA-5100 (Fujifilm, Japonija) skaneriu. Fluorescuojantys (SecEGFP)₂ dimerai efektyviai susiformavo po 20 min DMNB-SecEGFP baltymo apšvitos UV šviesa, kurie, paveikti 50 mM DTT, pavirto fluorescuojančiais monomerais. Šis eksperimentas iliustruoja, kad tiek fotolizinis apsauginės grupės pašalinimas, tiek dimerizacija oksiduojančioje aplinkoje bei redukcinė monomerizacija gali vykti švelniomis sąlygomis, tokiu būdu išsaugant baltymo funkciją (fluorescenciją).

Šis pavyzdys rodo, kad tolesnis šviesa apsaugoto Sec utilizavimas gali būti naudingas tais atvejais, kada norima šviesa kontroliuoti baltymų dimerizaciją.

Claims

Išradimo apibrėžtis

1. Baltymo, apimančio nenatūralią aminorūgštį vienoje arba daugiau parinktų padėčių, gavimo būdas transliacijos sistemoje, besiskiriantis tuo, kad būdas apima:

(a) paruošimą transliacijos sistemos, apimančios:

(i) nenatūralią aminorūgštį, kuri yra fotochemiškai apsaugotas selenocisteinas;

(ii) ortogonalią aminoacil-tRNR sintetazę (O-RS);

(iii) ortogonalią tRNR (O-tRNR), kur minėta O-RS pirmenybiškai aminoacilina minėtą Ο-tRNR su minėtu fotochemiškai apsaugotu selenocisteinu; ir (iv) nukleorūgštj, koduojančią minėtą baltymą, kur minėta nukleorūgštis apima bent vieną tikslinį kodoną, kuris yra atpažįstamas Ο-tRNR; ir (b) įvedimą minėtos nenatūralios aminorūgšties į pasirinktą padėtį minėtame baltyme šio baltymo transliacijos metu, kaip atsaką į minėtą tikslinį kodoną, taip gaunant minėtą baltymą, apimantį minėtą nenatūralią aminorūgštį pasirinktoje padėtyje.
2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad fotochemiškai apsaugotas selenocisteinas apima formulę I:

kur

R yra H, alkilas arba alkoksi, karboksimetoksi grupė,

R¹ yra H, alkilas, arilas, alkoksi, hidroksi arba halogenatomas,

R² ir R³ kiekvienas nepriklausomai reiškia H, alkilą, arilą, alkoksi, hidroksi grupę, CO2R⁵ arba halogenatomą; kur jeigu R ir R² arba R ir R³ yra alkoksi grupė, R² arba R³ gali sudaryti penkianarę, šešianarę arba septynianarę ciklinę struktūrą derinyje su R,

R⁴ yra H, metilas, alkilas, -CH2OR⁵ arba -CO2R⁵,

R⁵ yra H arba alkilas.
3. Būdas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad fotochemiškai apsaugotas selenocisteinas yra 4,5-dimetoksi-2-nitrobenzilseleno cisteinas.
4. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta transliacijos sistema apima polinukleotidą, koduojantį minėtą O-tRNA, sulietą su SNR52 promotoriumi.
5. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad tikslinis kodonas, atpažįstamas minėta O-tRNA yra UAG beprasmis kodonas.
6. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta nukleorūgštis apima bent vieną TAG beprasmį kodoną.
7. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta transliacijos sistema apima nukleorūgštį, kuri koduoja mutuotą ortogonalią LeuRS.
8. Būdas pagal bet kurį ankstesnį punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta transliacijos sistema apima ląstelę, apimančią minėtą nenatūralią aminorūgštj, minėtą O-RS ir minėtą O-tRNA.
9. Būdas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelė šeimininkė yra bakterinė, mielių arba žinduolio ląstelė šeimininkė.
10. Būdas pagal 9 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelė šeimininkė yra mielių ląstelė šeimininkė.
11. Būdas pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta mielių ląstelė šeimininkė yra Saccharomyces cerevisiae ląstelė šeimininkė.
12. Būdas pagal 8-11 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta ląstelė šeimininkė dar apima UPF1 geno eliminavimą arba deleciją.
13. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas būdas dar apima fotochemiškai apsaugotas grupės pašalinimo, eksponuojant transliacijos sistemą arba išgrynintą baltymo tirpalą UV šviesoje, (c) pakopą.
14. Būdas pagal 1-13 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas baltymas yra dar naudojamas šviesa kontroliuojamai baltymo dimerizacijai.
15. Būdas pagal 1-14 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas baltymas yra dar naudojamas selektyviai konjugacijai, kryptingam žymėjimui arba kitoms cheminėms modifikacijoms.
16. Fotochemiškai apsaugotas selenocisteinas, kurio formulė I:

kur

R yra H, alkilas arba alkoksi, karboksimetoksi grupė,

R¹ yra H, alkilas, arilas, alkoksi, hidroksi arba halogenatomas,

R² ir R³ kiekvienas nepriklausomai reiškia H, alkilą, arilą, alkoksi, hidroksi grupę, CO₂R⁵ arba halogenatomą; kur jeigu R ir R² arba R ir R³ yra alkoksi grupė, R² arba R³ gali sudaryti penkianarę, šešianarę arba septynianarę ciklinę struktūrą derinyje su R,

R⁴ yra H, metilas, alkilas, CH2OR⁵ arba CO2R⁵,

R⁵ yra H arba alkilas.
17. Selenocisteino pagal 16 punktą gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad apima pakopas: Ν,Ν’-blokuoto selenocisteino redukavimą ir reagavimą su junginiu, parinktu iš atitinkamai pakeisto (1,3,4,5 ir/arba alfa padėtyse) 2nitrobenzilhalogenido, sulfonato, fosfato arba karboksilato, po to sekančiu amino grupių apsaugos pašalinimu.
18. Būdas pagal 17 punktą, besiskiriantis tuo, kad selenocistinas yra blokuotas grupe, parinkta iš butoksikarbonilo, karboksibenzilo, aliloksikarbonilo, metoksi arba etoksikarbonilo grupės.
19. Fotochemiškai apsaugotas selenocisteinas pagal 16 punktą, kur junginys yra panaudojamas būde pagal 1 punktą.
20. Baltymas, gautas būdu pagal 1-15 punktą.
21. Baltymas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas baltymas yra EGFP.
22. Baltymas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad kataliziniu arba funkciniu požiūriu svarbūs Cys arba Ser yra pakeisti Sec.
23. Būdo pagal 1 punktą panaudojimas natūralių rekombinantiniu selenobaltymų gavimui.
24. Būdo pagal 1 punktą panaudojimas gavimui dirbtinai modifikuotų baltymų, kuriuose viena arba keletas Sec liekanų yra įterptos norimose padėtyse.
25. Būdo pagal 24 punktą panaudojimas, kur viena arba keletas Sec liekanų yra įterptos pasirinktose padėtyse aktyviame centre arba netoli jo.
26. Būdo pagal 25 punktą panaudojimas, kur Sec pakeičia katalizinį Cys arba Ser minėtose pasirinktose padėtyse.
27. Būdo pagal 26 punktą panaudojimas, kur minėtas pakeitimas yra atliekamas fermente, parinktame iš grupės tiolių oksidoreduktazių, baltymo tirozinfosfatazių, Cys peptidazių ir vienos anglies pirimidin-5-transferazių.