TW201825112A - p53分解的誘導分子及醫藥組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種p53分解的誘導分子及包含該p53分解的誘導分子之醫藥組成物，該p53分解的誘導分子是p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記之共軛物，且能夠誘導p53蛋白或p53複合物分解，該p53親和性分子對於前述p53蛋白或p53複合物具有親和性，該蛋白質分解的誘導標記對於蛋白酶具有親和性並且不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解。

Description

p53分解的誘導分子及醫藥組成物
本揭示有關一種p53分解的誘導分子及醫藥組成物。
p53蛋白，是一種與細胞老化、停止細胞週期、誘導細胞凋亡等相關的蛋白質，能夠對引起DNA損傷的壓力(活性氧、輻射線等)等產生反應而活化。
以往，已知在阿茲海默症、巴金森氏症等神經疾病、或腦中風等缺血性傷害中，p53蛋白表現增加而誘導神經細胞死亡。又，已知p53蛋白表現增加而使心臟中的血管新生能力下降等，以致促進心臟功能障礙發作。又，已知p53蛋白表現增加而使胰臟β細胞中的粒腺體功能下降，以致使胰島素分泌能力下降，而促進糖尿病發作。 進一步，已知在製作再生醫學(regenerative medicine)中所用的多功能性幹細胞(例如誘導式多能性幹細胞(induced Pluripotent Stem Cell，iPS細胞))時，需要抑制p53基因表現。 因此，在各種疾病的治療和再生醫學中，正在研究使p53蛋白的量(表現)減少的方法論。
又，認為藉由p53蛋白活化，能夠引起抑制已癌化的細胞增殖以及誘導細胞凋亡，而抑制癌症。然而，已知人類的癌症中，50%以上的比例為p53蛋白突變，因而抑制癌細胞增殖和誘導細胞凋亡的功能下降。 因此，在癌症治療中，正在研究使突變型p53蛋白的量(表現)減少的方法論。
到目前為止，作為以RNA等級來操作標靶蛋白的量的技術，已知一種核糖核酸干擾(RNA interference，RNAi)技術，其使用小干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)來分解標靶蛋白的訊息核糖核酸(mRNA)。
又，作為以蛋白質等級來操作標靶蛋白的量的技術，已知一種使用複合物的技術，該複合物連結有能夠與標靶蛋白結合的分子和能夠與泛素連接酶(ubiquitin ligase)(E3)結合的分子(例如參照專利文獻1～2、非專利文獻1～3)。此技術，是藉由上述複合物來將標靶蛋白與泛素連接酶連接，使標靶蛋白特異性地泛素化，來將其導向藉由蛋白酶體(proteasome)來實行的分解。上述複合物，亦有時被稱為特異性和非遺傳性的細胞凋亡抑制蛋白依存性移除者(Specific and Nongenetic IAP-dependent Protein ERaser，SNIPER)、蛋白質水解靶向嵌合體(PROteolysis TArgeting Chimera，PROTAC)等。 [先前技術文獻] (專利文獻)
專利文獻1：日本特開2013-056837號公報 專利文獻2：美國專利第7208157號說明書 (非專利文獻)
非專利文獻1：Itoh, Y. et al., "Development of target protein-selective degradation inducer for protein knockdown.", Bioorg. Med. Chem., 2011, 19, 3229-3241 非專利文獻2：Demizu, Y. et al., "Design and synthesis of estrogen receptor degradation inducer based on a protein knockdown strategy.", Bioorg. Med. Chem. Lett., 2012, 15, 1793-1796 非專利文獻3：Hines, J. et al., "Posttranslational protein knockdown coupled to receptor tyrosine kinase activation with phosphoPROTACs.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2013, 110(22), 8942-8947
[發明所欲解決的問題] 然而，RNAi技術存在脫靶效應(off-target effect)的問題，而難以特異性地控制標靶蛋白的量。又，RNAi技術難以傳遞siRNA，在對於醫藥的應用上有許多問題。
另一方面，相較於RNAi技術，使用了連結有能夠與標靶蛋白結合的分子和能夠與泛素連接酶結合上的分子之複合物的技術，容易應用於醫藥。然而，使標靶蛋白泛素化的方法中，存在如下所述的問題點。 (1)泛素連接酶存在許多種類，且具有標靶特異性。因此，為了使特定的標靶蛋白泛素化，例如，需要配合標靶蛋白來設計分子等，進行個別對應。 (2)泛素化訊息難以控制。例如，已知除了蛋白質分解以外，蛋白質的泛素化還與分化、癌化等的訊息相關。又，已知蛋白質的泛素化存在組織特異性和時間特異性。因此，推測存在下述情形：標靶蛋白的泛素化成為其他訊息，而非標靶蛋白分解的訊息。 (3)存在泛素或泛素化酶有缺陷的情形。例如，有時因突變等而泛素或泛素化酶無法正常發揮功能(功能障礙(malfunction))，而該情況亦經常為疾病的原因。因此，推測存在下述情形：標靶蛋白的泛素化無法誘導標靶蛋白分解。
現在，一般而言是設計抑制劑、活化劑等來作為醫藥品。然而，p53蛋白，是作為無法成藥的標靶(undruggable targets)而有名的轉錄因子，至今仍未進展到開發藥物。
本揭示是有鑑於如上所述之事由而完成，其目的在於提供一種p53分解的誘導分子及包含該p53分解的誘導分子之醫藥組成物，該p53分解的誘導分子能夠誘導p53蛋白分解或p53複合物分解。 [解決問題的技術手段]
用以解決上述問題的具體手段，包含以下實施態樣。 ＜1＞一種p53分解的誘導分子，其是p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記之共軛物，且能夠誘導p53蛋白或p53複合物分解，該p53親和性分子對於前述p53蛋白或p53複合物具有親和性，該蛋白質分解的誘導標記對於蛋白酶具有親和性並且不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解。
＜2＞如＜1＞所述之p53分解的誘導分子，其中，該p53分解的誘導分子能夠非泛素依存性地誘導前述p53蛋白或p53複合物分解。
＜3＞如＜1＞或＜2＞所述之p53分解的誘導分子，其中，前述蛋白質分解的誘導標記具有蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制活性去活化後的結構。
＜4＞如＜1＞～＜3＞中任一項所述之p53分解的誘導分子，其中，前述蛋白酶是蛋白酶體。
＜5＞如＜4＞所述之p53分解的誘導分子，其中，前述蛋白質分解的誘導標記具有蛋白酶體抑制劑的蛋白酶體抑制活性去活化後的結構。
＜6＞如＜5＞所述之p53分解的誘導分子，其中，前述蛋白酶體抑制活性是對於選自類半胱天冬酶活性、類胰蛋白酶活性、及類胰凝乳蛋白酶活性中的至少一種的抑制活性。
＜7＞一種醫藥組成物，其包含＜1＞～＜6＞中任一項所述之p53分解的誘導分子。
＜8＞如＜7＞所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物用於預防或治療由p53蛋白所媒介的疾病或症狀。
＜9＞如＜8＞所述之醫藥組成物，其中，前述由p53蛋白所媒介的疾病或症狀為癌症、細胞老化、神經疾病、神經細胞死亡、糖尿病、或心臟功能障礙。
＜10＞如＜9＞所述之醫藥組成物，其中，前述由p53蛋白所媒介的疾病或症狀為細胞老化。 [發明的功效]
根據本揭示，能夠提供一種p53分解的誘導分子及包含該p53分解的誘導分子之醫藥組成物，該p53分解的誘導分子能夠誘導p53蛋白或p53複合物分解。
以下，詳細說明本發明的實施形態。但是，本發明不限定於以下實施形態。 在本說明書中使用「～」來表示的數值範圍，表示包含「～」前後所記載的數值來分別作為最小值和最大值的範圍。 本說明書中，胺基酸是以本技術領域中習知的單字母符號(例如，若為甘胺酸則是「G」)或三字母符號(例如，若為甘胺酸則是「Gly」)來標記。
＜p53分解的誘導分子＞ 本揭示的p53分解的誘導分子，是p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記之共軛物，且能夠誘導p53蛋白分解，該p53親和性分子對於p53蛋白或p53複合物具有親和性，該蛋白質分解的誘導標記對於蛋白酶具有親和性並且不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解。根據本揭示的p53分解的誘導分子，能夠在不藉由使p53蛋白或p53複合物泛素化的情況下(亦即非泛素依存性地)，將p53蛋白或p53複合物導向藉由蛋白酶(例如蛋白酶體)來進行的分解(knockdown)。
再者，四泛素鏈(Ub4 )等多泛素鏈或類泛素結構域(UbL)，可能作為蛋白質分解的誘導標記來發揮功能，但當將多泛素鏈或類泛素結構域作為蛋白質分解的誘導標記時，是藉由p53親和性分子來間接地使p53蛋白或p53複合物泛素化。本說明書中，這樣的p53蛋白或p53複合物的間接泛素化，亦視為包括在p53蛋白或p53複合物的泛素化內。
(p53親和性分子) 用以構成本揭示的p53分解的誘導分子的p53親和性分子，是對於p53蛋白或p53複合物具有親和性的分子。
作為p53複合物，可無特別限制地列舉：p53/MDM2複合物(p53蛋白與MDM2蛋白之複合物。以下相同)、p53/E6複合物、p53/HDM2複合物、p53/AICD複合物、p53/RUNX2複合物、p53/RUNX3複合物等與公知的分子之複合物，該等公知的分子已知能夠與p53蛋白進行交互作用。
此處，對於p53複合物具有親和性的分子中，包含對於能夠與p53蛋白形成複合的分子具有親和性的分子、及對於所形成的複合物具有親和性的分子。
p53蛋白，可以是野生型亦可以是突變型。作為突變型，可列舉例如：R175H突變型(自N末端起算第175個胺基酸殘基由精胺酸(R)突變成組胺酸(H)。以下相同)、R110L和R248W突變型、V157F突變型、S166Y突變型、L194F突變型、R213Q和M237H突變型、G245V突變型、G245S突變型、R248Q突變型、R248W突變型、I254D突變型、L264L突變型、R273H和P309S突變型、R273C突變型、R280K突變型、R282W突變型、R273H突變型、S176Y和R248W突變型、V173A突變型、R249S突變型、Y220C突變型、V272M突變型、G266Q突變型、G175E突變型、S241F突變型等。
以往，已知在阿茲海默症、巴金森氏症等神經疾病、或腦中風等缺血性傷害中，p53蛋白表現增加，而誘導神經細胞死亡。 又，已知心臟功能障礙、糖尿病等疾病中，心臟組織、胰臟組織等之中的p53蛋白的表現量增加，並且已知藉由投予對於p53蛋白的抑制劑能夠改善這些疾病。 又，p53蛋白，亦被指出作為老化因子而與生活習慣病(lifestyle related disease)所引起的動脈硬化、代謝異常等相關。 進一步，已知在製作再生醫學中所用的多功能性幹細胞(例如iPS細胞)時，需要抑制p53基因表現。
因此，作為較佳的p53親和性分子的一例，可列舉對野生型(正常型)p53蛋白或野生型(正常型)p53複合物(野生型p53蛋白與對野生型p53蛋白具有親和性的分子之複合物)具有親和性的分子。藉由p53親和性分子對野生型p53蛋白或野生型p53複合物具有親和性，能夠將此野生型p53蛋白或野生型p53複合物導向藉由蛋白酶(例如蛋白酶體)來進行的分解(knockdown)。作為結果， p53分解的誘導分子包含對野生型p53蛋白或野生型p53複合物具有親和性的p53親和性分子，該p53親和性分子被認為對於心臟功能障礙、糖尿病等各種疾病的預防或治療、及製作前述多功能性幹細胞是有用的。
又，已知在人類的癌症中，p53蛋白高頻率地突變，且突變型p53蛋白阻礙野生型p53蛋白的作用，而阻礙藉由野生型p53蛋白實行的癌細胞增殖抑制及細胞凋亡的誘導。
因此，作為較佳的p53親和性分子的另一例，可列舉對突變型p53蛋白或突變型p53複合物(突變型p53蛋白與對突變型p53蛋白具有親和性的分子之複合物)具有親和性的分子。藉由p53親和性分子對突變型p53蛋白或突變型p53複合物具有親和性，能夠將此突變型p53蛋白或突變型p53複合物導向藉由蛋白酶(例如蛋白酶體)來進行的分解(knockdown)。作為結果，p53分解的誘導分子包含對突變型p53蛋白或突變型p53複合物具有親和性的p53親和性分子，該p53分解的誘導分子被認為對於癌症等各種疾病的預防或治療是有用的。
再者，前述使標靶蛋白泛素化的方法中，被認為是對構成p53複合物的其中一種蛋白質進行泛素化，且p53複合物分離成各蛋白質後，僅分解泛素化後的蛋白質。相對於此，p53分解的誘導分子包含對p53複合物具有親和性的p53親和性分子，該p53分解的誘導分子在能夠分解p53複合物本身的觀點上非常有用。
本說明書中，「對於p53蛋白或p53複合物具有親和性」，例如意指能夠藉由共價鍵、氫鍵、疏水鍵、凡得瓦力等來對於p53蛋白或p53複合物進行結合。當其他已知能夠與p53蛋白或p53複合物進行交互作用的分子(蛋白質、胜肽、抗體、DNA、RNA、代謝物、低分子化合物等)與p53蛋白或p53複合物的交互作用，濃度依存性地受到某種分子的影響時，能夠判斷該分子對於p53蛋白或p53複合物具有親和性。
作為p53親和性分子，可列舉：低分子化合物、天然物、胜肽、抗體等。再者，在本揭示中，除了包含2個H鏈與2個L鏈之所謂的免疫球蛋白(Ig)以外，抗體中還包含Ig的Fab片段、F(ab’)片段等抗體中的包含可變部位之片段等。p53親和性分子的分子量，在低分子化合物中，例如較佳是50～5000的範圍。
p53親和性分子的結構，只要對於p53蛋白或p53複合物具有親和性，並無特別限制。作為p53親和性分子，能夠使用對於p53蛋白具有親和性的p53抑制劑或p53活化劑、對於p53/MDM2複合物具有親和性的MDM2抑制劑、p53/MDM2複合物的蛋白質之間交互作用(protein-protein interaction，PPI)抑制劑等。又，p53親和性分子，亦能夠從候補分子中藉由篩選(screening)來獲得。
p53親和性分子的一例，如以下表1～表7所示。但是，能夠使用於本揭示的p53分解的誘導分子中的Ras蛋白親和性分子不限定於這些例子。關於p53親和性分子，可根據需要而參照既有的資料庫(Binding DB(https：//www.bindingdb.org/bind /index.jsp)、PCI DB(http：//www.tanpaku.org/ pci/pci_home.html)、ProtChemSI(http：// pcidb.russelllab.org/)等)的資訊。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
(蛋白質分解的誘導標記) 用以構成本揭示的p53分解的誘導分子的蛋白質分解的誘導標記，是對於蛋白酶具有親和性並且不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解之分子。以下，亦將此蛋白質分解的誘導標記稱為化學交互作用與分解(Chemical interactions and KnockDown ，CiKD)標記或化學親和性與降解動態學(Chemical AffiNities and Degradation DYnamics ，CANDDY)標記。
作為蛋白酶，並無特別限制，可列舉具有蛋白酶活性的任何分子。例如，可以是像蛋白酶體這樣的複合物型蛋白酶，亦可以是蛋白酶體以外的蛋白酶。又，只要具有蛋白酶活性，亦可以是蛋白酶體的一部分。
作為蛋白酶體，可列舉例如：26S蛋白酶體、免疫蛋白酶體、及胸腺蛋白酶體。 26S蛋白酶體，是2個19S蛋白酶體結合在20S蛋白酶體上而成。20S蛋白酶體，是由α環與β環依αββα的順序重疊而成之筒狀結構，該α環是由α1～α7的7個次單元所構成，該β環是由β1～β7的7個次單元所構成，並且β1、β2、及β5分別能夠發揮下述催化活性：類半胱天冬酶活性、類胰蛋白酶活性、及類胰凝乳蛋白酶活性。 免疫蛋白酶體，是將催化次單元β1、β2、及β5分別置換成β1i、β2i、及β5i而成(Science, 1994, 265, 1234-1237)。 胸腺蛋白酶體，是由胸腺皮質上皮細胞特異性地表現的β5t、與β1i和β2i所組裝而成(Science, 2007, 316, 1349-1353)。
又，作為蛋白酶體以外的蛋白酶，可列舉：β-分泌酶(β-secretase)、γ-分泌酶、胺基肽酶、 血管收縮素轉化酶( angiotensin converting enzyme)、鳳梨蛋白酶(bromelain)、鈣蛋白酶 (calpain)I、鈣蛋白酶II、羧基肽酶(carboxypeptidase)A、羧基肽酶B、羧基肽酶P、羧基肽酶Y、半胱天冬酶(caspase)1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶13、細胞自溶酶(cathepsin)B、細胞自溶酶C、細胞自溶酶D、細胞自溶酶G、細胞自溶酶L、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、梭菌蛋白酶(clostripain)、膠原蛋白酶(collagenase)、補體( complement)C1r、補體C1s、補體B因子、補體D因子、二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase)I、二肽基肽酶II、二肽基肽酶IV、分散酶(dispase)、彈性蛋白酶(elastase)、胞內蛋白酶(endoproteinase)Arg-C、胞內蛋白酶Glu-C、胞內蛋白酶Lys-C、無花果蛋白酶(ficin)、顆粒酶(granzyme)B、激肽釋放酶(kallikrein)、白胺酸胺基肽酶、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase)、金屬蛋白酶、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、胞漿素(plasmin)、半胱天冬酶原(procaspase)3、鏈黴蛋白酶(pronase)E、蛋白酶K、腎素(renin)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、凝血酶(thrombin)、胰蛋白酶(trypsin)、細胞質丙胺醯胺基肽酶(cytosol alanyl aminopeptidase)、腦啡肽酶(enkephalinase)、中性胜肽內切酶(neprilysin)等。
本說明書中，「對於蛋白酶具有親和性」，例如意指能夠藉由共價鍵、氫鍵、疏水鍵、凡得瓦力等來對於蛋白酶進行結合。當在某種分子的存在下蛋白酶的熱穩定性變化時，能夠判斷該分子對於蛋白酶具有親和性。
又，本說明書中，「不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解」，例如意指不會在蛋白酶的分解活性部位(active site)形成共價鍵。當即便在某種分子的存在下蛋白質仍被蛋白酶分解，且進一步使蛋白酶抑制劑共存則能夠抑制蛋白質分解時，能夠判斷該分子不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解。
作為蛋白質分解的誘導標記，可列舉低分子化合物、天然物、胜肽、抗體等。蛋白質分解的誘導標記的分子量，例如，較佳是50～200000的範圍。當蛋白質分解的誘導標記為低分子化合物時，蛋白質分解的誘導標記的分子量，例如，較佳是50～5000的範圍。
蛋白質分解的誘導標記的結構，只要對於蛋白酶具有親和性並且不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解，並無特別限制。蛋白質分解的誘導標記，例如，能夠從候補分子中藉由篩選來獲得。又，亦能夠藉由使蛋白酶抑制劑(例如蛋白酶體抑制劑)的蛋白酶抑制活性(例如蛋白酶體抑制活性)去活化來製造。
在其中一態樣中，蛋白質分解的誘導標記能夠設為例如由下述式(I)表示的結構。已確認由下述式(I)表示的化合物，對於蛋白酶具有親和性，並且不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解(例如參照後述參考例1～4)。
式(I)中，R1 和R2 各自獨立地表示碳數1～20的烴基、碳數1～20的烷氧基、碳數6～20的芳氧基、羥基、羧基、胺基、或鹵基。
作為烴基，可列舉：烷基、烯基、芳基、此等的組合等。具體而言，可列舉：甲基、乙基等碳數1～20的烷基；乙烯基、烯丙基等碳數2～20的烯基；苯基、萘基等碳數6～20的芳基；苯甲基、苯乙基等碳數7～20的芳基烷基；甲苯基、二甲苯基等碳數7～20的烷基芳基等。 作為鹵基，可列舉：氟基、氯基、溴基等。
在另一態樣中，蛋白質分解的誘導標記，能夠設為蛋白酶體抑制劑的蛋白酶體抑制活性去活化後的結構。作為蛋白酶體抑制活性，更具體而言，可列舉對於選自類半胱天冬酶活性、類胰蛋白酶活性、及類胰凝乳蛋白酶活性中的至少一種的抑制活性。
此處，「蛋白酶體抑制活性去活化後的結構」中，除了蛋白酶體抑制活性完全消失後的結構以外，亦包含蛋白酶體抑制活性減弱後的結構。在其中一態樣中，蛋白質分解的誘導標記，對於選自類半胱天冬酶活性、類胰蛋白酶活性、及類胰凝乳蛋白酶活性中的至少一種的50%抑制濃度(IC50 )是原本的蛋白酶體抑制劑的50%抑制濃度(IC50 )的2倍以上。
作為蛋白酶體抑制劑，能夠使用具有蛋白酶體抑制活性的任何化合物。蛋白酶體抑制劑，是對於蛋白酶體(複合物型蛋白酶)具有親和性並且能夠抑制藉由蛋白酶體來實行的蛋白質分解之化合物。因此，能夠藉由將蛋白酶體抑制劑的活性部位置換成其他結構部分而使蛋白酶體抑制活性去活化，來獲得蛋白質分解的誘導標記。 蛋白酶體抑制劑，其作為抗癌劑等的研究正在進展，且存在許多作為醫藥品的已許可的化合物和臨床試驗中的化合物。又，蛋白酶體抑制劑，其分子量較小且大多疏水性低，亦不易產生細胞膜通透性、細胞毒性等問題。因此，以蛋白酶體抑制劑作為基礎來合成蛋白質分解的誘導標記，非常合理且有效率。
蛋白酶體抑制劑的一例，如以下表8和表9所示。表8和表9所示的蛋白酶體抑制劑，皆是對於20S蛋白酶體的活性中心部具有親和性的20S蛋白酶體抑制劑。又，表8和表9所示的蛋白酶體抑制劑，當然亦對於26S蛋白酶體具有親和性。但是，能夠使用於製造蛋白質分解的誘導標記的蛋白酶體抑制劑不限定於這些例子。
[表8]
[表9]
例如，已知亞硼酸型蛋白酶體抑制劑也就是硼替佐米(Bortezomib)，如下述式所示，是藉由活性部位也就是亞硼醯基與20S蛋白酶體的分解活性部位形成共價鍵，來抑制蛋白酶體活性(Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115)。
又，已知亞硼酸型蛋白酶體抑制劑也就是MLN9708和MLN2238，如下述式所示，是藉由活性部位也就是亞硼酸酯部位或亞硼醯基與20S蛋白酶體的分解活性部位形成共價鍵，來抑制蛋白酶體活性(Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115)。
因此，能夠藉由將硼替佐米、MLN9708及MLN2238的活性部位也就是亞硼醯基或亞硼酸酯部位置換成其他結構部分(羧基、烷基、芳基、胺基、羥基等)來使蛋白酶體抑制活性去活化，來獲得蛋白質分解的誘導標記。
再者，關於CEP-18770等其他亞硼酸型蛋白酶體抑制劑，亦能夠藉由將活性部位置換成其他結構部分(羧基、烷基、芳基、胺基、羥基等)，來獲得蛋白質分解的誘導標記。
又，已知醛型蛋白酶體抑制劑也就是ALLN，如下述式所示，是藉由活性部位也就是醛基與20S蛋白酶體的分解活性部位形成共價鍵，來抑制蛋白酶體活性(Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115)。
因此，能夠藉由將ALLN的活性部位也就是醛基置換成其他結構部分(羧基、烷基、芳基、胺基、羥基等)來使蛋白酶體抑制活性去活化，來獲得蛋白質分解的誘導標記。
再者，關於MG-132、BSc-2118、PSI等其他醛型蛋白酶體抑制劑，亦能夠藉由將活性部位也就是醛基置換成其他結構部分(羧基、烷基、芳基、胺基、羥基等)，來獲得蛋白質分解的誘導標記。
具有蛋白酶體抑制劑的蛋白酶體抑制活性去活化後的結構之蛋白質分解的誘導標記的一例，如以下表10和表11所示。作為表中的由R表示的1價基團，可列舉：羧基、碳數1～20的烷基、碳數6～20的芳基、胺基、羥基等。
[表10]
[表11]
蛋白酶體抑制劑的其他例子，如以下表12～表17所示。關於這些蛋白酶體抑制劑，亦能夠藉由與上述同樣地進行來使蛋白酶體抑制活性去活化，來獲得蛋白質分解的誘導標記。
[表12] 20S蛋白酶體抑制劑
[表13] 20S蛋白酶體抑制劑(接續上表)
[表14] 20S蛋白酶體抑制劑(接續上表)
[表15] 19S蛋白酶體抑制劑
[表16] 20S/19S以外的構成因子抑制劑
[表17] 20S免疫蛋白酶體抑制劑
在另一態樣中，蛋白質分解的誘導標記，能夠設為蛋白酶抑制劑(前述蛋白酶體抑制劑除外)的蛋白酶抑制活性去活化後的結構。
此處，「蛋白酶抑制活性去活化後的結構」中，除了蛋白酶抑制活性完全消失後的結構以外，亦包含蛋白酶抑制活性減弱後的結構。在其中一態樣中，蛋白質分解的誘導標記，對於作為蛋白酶抑制劑的抑制對象之蛋白酶的50%抑制濃度(IC50 )是原本的蛋白酶抑制劑的50%抑制濃度(IC50 )的2倍以上。
作為蛋白酶抑制劑，能夠使用具有蛋白酶抑制活性的任何化合物。蛋白酶抑制劑，是對於蛋白酶具有親和性並且能夠抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解之化合物。因此，能夠藉由將蛋白酶抑制劑的活性部位置換成其他結構部分而使蛋白酶抑制活性去活化，來獲得蛋白質分解的誘導標記。
蛋白酶抑制劑的一例，如表18～表85所示。能夠藉由將這些蛋白酶抑制劑的活性部位置換成其他結構部分而使蛋白酶抑制活性去活化，來獲得蛋白質分解的誘導標記。但是，能夠使用於製造蛋白質分解的誘導標記的蛋白酶抑制劑不限定於這些例子。關於蛋白酶抑制劑，可根據需要而參照既有的資料庫(MEROPS-the peptidase database(http：//merops.sanger. ac.uk/index.shtml)等)的資訊。
[表18] β-分泌酶抑制劑
[表19] γ-分泌酶抑制劑
[表20] 胺基肽酶抑制劑
[表21] 血管收縮素轉化酶抑制劑
[表22] 鳳梨蛋白酶抑制劑
[表23] 鈣蛋白酶抑制劑
[表24] 鈣蛋白酶I抑制劑
[表25] 鈣蛋白酶II抑制劑
[表26] 羧基肽酶A/B抑制劑
[表27] 羧基肽酶P抑制劑
[表28] 羧基肽酶Y抑制劑
[表29] 細胞自溶酶B抑制劑
[表30] 細胞自溶酶B抑制劑(接續上表)
[表31] 細胞自溶酶C抑制劑
[表32] 細胞自溶酶D抑制劑
[表33] 細胞自溶酶L抑制劑
[表34] 胰凝乳蛋白酶抑制劑
[表35] 胰凝乳蛋白酶抑制劑(接續上表)
[表36] 梭菌蛋白酶抑制劑
[表37] 膠原蛋白酶抑制劑
[表38] 補體C1r/C1s抑制劑
[表39] 補體D因子/B因子抑制劑
[表40] 二肽基肽酶II抑制劑
[表41] 二肽基肽酶III抑制劑
[表42] 二肽基肽酶IV抑制劑
[表43] 分散酶抑制劑
[表44] 彈性蛋白酶(顆粒球)抑制劑
[表45] 彈性蛋白酶(白血球)抑制劑
[表46] 彈性蛋白酶(胰臟)抑制劑
[表47] 胞內蛋白酶Arg-C抑制劑
[表48] 胞內蛋白酶Glu-C抑制劑
[表49] 胞內蛋白酶Lys-C抑制劑
[表50] 無花果蛋白酶抑制劑
[表51] 顆粒酶B抑制劑
[表52] 激肽釋放酶(組織)抑制劑
[表53] 激肽釋放酶(血漿)抑制劑
[表54] 白胺酸胺基肽酶抑制劑
[表55] 白胺酸胺基肽酶(胞質液(cytosol))抑制劑
[表56] 白胺酸胺基肽酶(胞質液)抑制劑(接續上表)
[表57] 白胺酸胺基肽酶(微粒體)抑制劑
[表58] 基質胺基肽酶抑制劑
[表59] 金屬蛋白酶抑制劑
[表60] 木瓜蛋白酶抑制劑
[表61] 木瓜蛋白酶抑制劑(接續上表)
[表62] 胃蛋白酶抑制劑
[表63] 胞漿素抑制劑
[表64] 胞漿素抑制劑(接續上表)
[表65] 凝血酶抑制劑
[表66] 凝血酶抑制劑(接續上表)
[表67] 嗜熱菌蛋白酶抑制劑
[表68] 胰蛋白酶抑制劑
[表69] 鏈黴蛋白酶E抑制劑
[表70] 半胱天冬酶原3抑制劑
[表71] 蛋白酶K抑制劑
[表72] 腎素抑制劑
[表73] 半胱天冬酶抑制劑
[表74] 半胱天冬酶1抑制劑
[表75] 半胱天冬酶2抑制劑
[表76] 半胱天冬酶3抑制劑
[表77] 半胱天冬酶5抑制劑
[表78] 半胱天冬酶6抑制劑
[表79] 半胱天冬酶7抑制劑
[表80] 半胱天冬酶8抑制劑
[表81] 半胱天冬酶9抑制劑
[表82] 半胱天冬酶13抑制劑
[表83] 細胞質丙胺醯胺基肽酶抑制劑
[表84] 腦啡肽酶抑制劑
[表85] 中性胜肽內切酶
再者，以上的說明中，為了方便，將蛋白酶體抑制劑與除了蛋白酶體抑制劑以外的蛋白酶抑制劑加以區分，但亦已知能夠抑制蛋白酶體與除了蛋白酶體以外的蛋白酶兩者的活性之化合物。因此，藉由使用這種化合物，能夠獲得對於蛋白酶體與除了蛋白酶體以外的蛋白酶兩者具有親和性的蛋白質分解的誘導標記。
能夠抑制蛋白酶體與除了蛋白酶體以外的蛋白酶兩者的活性之化合物的一例，如以下表86所示。但是，能夠抑制蛋白酶體與除了蛋白酶體以外的蛋白酶兩者的活性之化合物，不限定於這些例子。
[表86]
在另一態樣中，作為蛋白質分解的誘導標記，能夠使用蛋白酶體活化劑。蛋白酶體活化劑，是對於蛋白酶體(複合物型蛋白酶)具有親和性並且不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解之化合物，而能夠作為蛋白質的分解標記來使用。
蛋白酶體活化劑的一例，如以下表87～表89所示。但是能夠使用於製造蛋白質的分解標記的蛋白酶體活化劑不限定於這些例子。
[表87] 20S蛋白酶體活化劑
[表88] 19S/11S(PA28)蛋白酶體活化劑
[表89] 19S/11S(PA28)蛋白酶體活化劑(接續上表)
如以上所例示的蛋白質分解的誘導標記中，尤其，較佳是對26S蛋白酶體具有親和性的蛋白質分解的誘導標記。細胞內的蛋白酶體，通常是以26S蛋白酶體的狀態存在，該26S蛋白酶體是2個19S蛋白酶體結合在20S蛋白酶體上而成。因此，藉由使用對26S蛋白酶體具有親和性的蛋白質分解的誘導標記，能夠更有效率地將細胞內的p53蛋白或p53複合物導向分解。
(p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記之共軛物的形式) p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記之共軛物的形式，只要能夠維持p53親和性分子與p53蛋白或p53複合物的親和性、及蛋白質分解的誘導標記與蛋白酶的親和性，並無特別限制。再者，當p53親和性分子和蛋白質分解的誘導標記皆為蛋白質時，能夠合成由兩者融合而成之融合蛋白，但這種融合蛋白不包括在「共軛物」內。
p53分解的誘導分子，能夠設為例如下述結構：連接有至少一個p53親和性分子與至少一個蛋白質分解的誘導標記之結構。p53分解的誘導分子，可以是連接有一個p53親和性分子與一個蛋白質分解的誘導標記之結構，亦可以是連接有一個p53親和性分子與複數個蛋白質分解的誘導標記之結構，亦可以是連接有複數個p53親和性分子與一個蛋白質分解的誘導標記之結構，亦可以是連接有複數個p53親和性分子與複數個蛋白質分解的誘導標記之結構。在其中一態樣中，p53分解的誘導分子是連接有一個p53親和性分子與一個蛋白質分解的誘導標記之結構。
p53親和性分子中的與蛋白質分解的誘導標記連接的位置，只要能夠維持與p53蛋白或p53複合物的親和性，並無特別限制。 另一方面，蛋白質分解的誘導標記中的與p53親和性分子連接的位置，只要能夠維持與蛋白酶的親和性，並無特別限制。例如，如前所述，當蛋白質分解的誘導標記為將蛋白酶抑制劑(例如蛋白酶體抑制劑)的活性部位置換成其他結構部分而得之結構時，能夠在此置換後的其他結構部分來與p53親和性分子連接。具體而言，當將蛋白酶抑制劑的活性部位置換成羧基時，能夠藉由羧基來與p53親和性分子連接。
再者，p53親和性分子和蛋白質分解的誘導標記，可以是能夠互相連接的結構。當難以將p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記直接連接時，亦可考慮對p53親和性分子和蛋白質分解的誘導標記中的至少一方導入能夠互相連接的結構。 例如，作為p53親和性分子，能夠使用對p53蛋白或p53複合物具有親和性的已知分子，但亦能夠假定難以將此已知分子與蛋白質分解的誘導標記直接連接的情況。在這樣的情況下，可對該已知分子導入能夠與蛋白質分解的誘導標記連接的結構，來作為p53親和性分子使用。
＜醫藥組成物＞ 本揭示的醫藥組成物，包含本揭示的p53白分解的誘導分子。如前所述，根據本揭示的p53分解的誘導分子，能夠能夠在不藉由使p53蛋白或p53複合物泛素化的情況下(亦即非泛素依存性地)，將p53蛋白或p53複合物導向藉由蛋白酶(例如蛋白酶體)來實行的分解(knockdown)。因此，包含p53分解的誘導分子之本揭示的醫藥組成物，能夠用於由p53蛋白所媒介的疾病或症狀的預防或治療。根據本揭示，還能夠提供一種由p53蛋白所媒介的疾病或症狀的預防或治療方法，其包含下述步驟：投予包含p53分解的誘導分子之醫藥組成物。
再者，以複合物作為標靶的藥劑大多難以設計，但本揭示的醫藥組成物，在亦能夠以p53複合物作為標靶並加以分解的觀點上非常有用。
作為由p53蛋白所媒介的疾病或症狀，只要藉由分解p53蛋白或p53複合物而能夠期待預防功效或治療功效，並無特別限制。由p53蛋白所媒介的疾病或症狀的一例，如以下表90所示。但是，由p53蛋白所媒介的疾病或症狀不限定於這些例子。
[表90]
在其中一態樣中，本揭示的醫藥組成物是用於細胞老化、脂肪老化、神經疾病(神經細胞死亡)、糖尿病、心臟功能障礙等的預防或治療。
以往已知因端粒(telomere)或DNA損傷，以致抑制細胞增殖，而引起細胞老化。另一方面，在早年衰老症候群(progeria syndrome)的小鼠模型(Zmpste24蛋白酶缺損之小鼠)中存在下述報告：使p53基因缺失後，利用β‐半乳糖苷酶分析法(β‐galactosidase assay)等確認到老化性狀改善，亦確認到壽命延長(Nature, 2005, 437, 564-568)。根據本揭示的醫藥組成物，推測藉由分解p53蛋白或p53複合物，同樣地能夠預防或改善細胞老化、以及延長壽命。
再者，已知細胞老化亦成為心肌梗塞、動脈粥狀硬化症(atherosclerosis)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)等各種疾病的原因(Nature, 2017, 16, 718-735)。根據本揭示的醫藥組成物，推測藉由分解p53蛋白或p53複合物，能夠預防或治療細胞老化相關的疾病或症狀。
又，已有報告指出在阿茲海默症(AD)、巴金森氏症(PD)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、天使人症候群等神經疾病中，p53蛋白高度表現，而成為誘導神經細胞死亡的主要因子(Biochemical and Biophysical Research Communications, 1997, 17, 418-21；The FASEB Journal, 2005, 19, 255–257；The Journal of Neuroscience, 2006, 26, 6377–6385；The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277, 50980–58984；Journal of Neurochemistry, 2007, 100, 1626–1635；Nature Cell Biology, 2009, 11, 1370–1375；Neurobiology of Disease, 2000, 7, 613–622；Neuron, 1998, 21, 799–811)。又，已有報告指出在在腦中風等缺血性傷害中，因再灌流(reperfusion)後的氧化壓力(oxidative stress)，以致粒線體基質中累積p53蛋白，且該p53蛋白與親環蛋白(cyclophilin)D形成複合體，藉此打開粒線體通透性轉移孔(mitochondrial permeability transition pore)，而誘導神經細胞死亡(Cell, 2012, 149, 1536-1548)。根據本揭示的醫藥組成物，推測藉由分解p53蛋白或p53複合物，能夠預防或治療神經疾病(神經細胞死亡)。
又，在心臟衰竭(heart failure)的失代償期(症狀正在進行的時期)時，因DNA損傷、端粒縮短、低氧等，以致p53基因活化。如果p53基因活化，則缺氧誘導因子(HIF)-1(誘導血管新生因子時重要的轉錄因子)活性和血管新生因子的表現下降，而誘導心臟功能不全。另一方面，關於p53基因剔除小鼠，有報告指出，於藉由橫向主動脈縮窄(TAC)來製作的心臟壓力負荷模型中，血管數增加，而保持心臟功能(Nature, 2007, 446, 444-448)。根據本揭示的醫藥組成物，推測藉由分解p53蛋白或p53複合物，同樣地能夠預防或治療心臟功能障礙。
又，在端粒缺損之小鼠的脂肪組織中，引起脂肪老化(β-半乳糖苷酶陽性)、p53基因活化、增加不好的脂肪激素(TNFα等)產生。如果不好的脂肪激素增加，則變成胰島素抗性，因而血糖值變得不易下降，以致引發糖尿病。另一方面，有報告指出，因脂肪組織的p53基因缺失，以致降低不好的脂肪激素產生，而改善胰島素抗性(Nature Medicine, 2009, 15, 996-997; Nature Medicine, 2009, 15, 1082-1088)。根據本揭示的醫藥組成物，推測藉由分解p53蛋白或p53複合物，同樣地能夠預防或治療糖尿病。
進一步，已知雖然MDM2缺損之小鼠顯示胚胎致死(embryonic lethal)的情形，但能夠藉由p53基因缺損來加以救援(rescue)。例如，p53基因和MDM2基因雙重剔除小鼠能夠正常發育(Nature, 1995, 378, 203-206; Nature, 1995, 378, 206-208)。推測藉由對母體施予本揭示的醫藥組成物來分解p53蛋白或p53複合物，能夠避免MDM2缺損之胎兒的胚胎致死的情形。
作為用於這些用途的本揭示的醫藥組成物，較佳是：包含p53分解的誘導分子之醫藥組成物，該p53分解的誘導分子是對於野生型(正常型)p53蛋白或野生型(正常型)p53複合物具有親和性的p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記之共軛物。
在另一態樣中，本揭示的醫藥組成物，能夠用於預防或治療癌症。
以往，已知p53蛋白為突變型之癌症對於化學療法和放射線治療顯示抗性。又，已知多數的癌症中有p53蛋白突變。p53基因是抑癌基因，因此到目前為止是設計能夠活化野生型p53基因的藥劑。然而，如果p53基因突變，則應該是抑癌基因的p53基因變得有利於癌化。因此，能夠期待分解突變型p53蛋白有助於次世代的癌症治療。 又，已知在癌症的放射線治療時藉由回復野生型p53蛋白的功能，能夠改善治療效果。亦能夠期待藉由合併使用放射線治療與採用本揭示的醫藥組成物來實行的治療，來改善具有突變型p53蛋白之癌症中的放射線治療的效果。
作為用於這些用途的本揭示的醫藥組成物，較佳是：包含p53分解的誘導分子之醫藥組成物，該p53分解的誘導分子是對於突變型p53蛋白或突變型p53複合物具有親和性的p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記之共軛物。再者，作為p53親和性分子，可使用對於突變型p53蛋白或突變型p53複合物的親和性比對於野生型p53蛋白或野生型p53複合物的親和性更高之p53親和性分子。
醫藥組成物，可包含p53分解的誘導分子以外的成分。例如，醫藥組成物，可包含作為製劑材料的慣用的有機載體或無機載體。此載體，在固體製劑中是作為賦形劑、潤滑劑、結合劑、崩散劑等來摻合，在液狀製劑是作為溶劑、助溶劑、懸浮劑、等張劑、緩衝劑等來摻合。又，醫藥組成物，可包含防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等製劑添加物。
醫藥組成物的劑型，並無特別限制。作為醫藥組成物的劑型，可列舉：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、粉劑、口含錠劑(troche)、糖漿劑、乳劑、懸浮劑、膜劑等口服劑；注射劑、點滴劑、外用劑、栓劑(suppository)、小丸劑、經鼻劑、經肺劑(吸入劑)、點眼劑等非口服劑等。
醫藥組成物的投予量，能夠根據投予對象、投予路徑、對象疾病、症狀等來適當決定。 [實施例]
以下，藉由實施例來具體說明本發明，但本發明不限定於這些實施例。在以下實施例和參考例中，室溫表示20℃～30℃。
以下實施例和參考例中使用的化合物等的簡稱如下。 H-Gly-OtBu･HCl：鹽酸L-麩胺酸三級丁酯(L-Glycine t-butyl ester hydrochloride) DMF：N,N-二甲基甲醯胺(N,N-Dimethylformamide) DIPEA：N,N-二異丙基乙基胺(N,N-Diisopropylethylamine) PyBOP：六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧-三(吡咯啶基)鏻(1H-Benzotriazol-1-yloxy-tri(pyrrolidino)phosphonium hexafluorophosphate) TFA：三氟乙酸(Trifluoroacetic acid) H-Leu-OtBu･HCl：鹽酸L-白胺酸三級丁酯(L-Leucine t-butyl ester hydrochloride) D-MEM：杜爾貝科氏改良的伊格爾氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) DMSO：二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide) PBS：磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered saline) EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetraacetic acid) SDS：十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate) PAGE：聚丙烯醯胺膠體電泳(Polyacrylamide gel electrophoresis) BPB：溴酚藍(Bromophenol blue) PVDF：聚偏氟乙烯(Polyvinylidene difluoride) TBS：三羥甲基胺基甲烷緩衝液(Tris buffered saline) GAPDH：甘油醛3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) PMSF：苯甲基磺醯氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride) DTT：二硫蘇糖醇(Dithiothreitol) DEPC：焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate) SA-β-gal：老化相關β-半乳糖苷酶(Senescence-associated beta-galactosidase) FITC：異硫氰酸螢光素(Fluorescein isothiocyanate) ec：大腸桿菌(Escherichia coli) DHFR：二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase) TMP：甲氧苄啶(Trimethoprim) DMT-MM：水合氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate) AMC：7-胺基-4-甲基香豆素(7-Amino-4-methylcoumarin) HA：血球凝集素(Hemagglutinin) GFP：綠色螢光蛋白(Green fluorescent protein) DsRed：圓盤擬珊瑚海葵紅色螢光蛋白(Discosoma sp. red fluorescent protein) FBS：胎牛血清(Fetal bovine serum)
＜實施例1＞ 實施例1中，藉由將p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記連接，來合成p53分解的誘導分子也就是TIBC-CANDDY_MLN。
作為p53親和性分子，是使用由下式表示的TIBC-NH2 。TIBC-NH2 ，是對由下式表示的TIBC加成H2 N-(CH2 )6 -COOH而得的化合物。TIBC，對於p53/MDM2複合物具有親和性。
作為蛋白質分解的誘導標記，是使用將蛋白酶體抑制劑也就是MLN9708和MLN2238的活性部位(亞硼酸酯部位或亞硼醯基)置換成羧基而得的化合物(CANDDY_MLN)。
TIBC-CANDDY_MLN的合成方法的詳細內容，如以下所述。
(合成CANDDY_MLN) 依照以下合成方案來合成CANDDY_MLN。
首先，將H-Gly-OtBu・HCl(286.8 mg，1.69 mmol，1當量)投入支管茄型燒瓶中，並進行氮氣取代。在氮氣氣流下加入10 mL脫水DMF與5 mL DIPEA，並於室溫進行攪拌。將2,5-二氯苯甲酸(309.3 mg，1.62 mmol，1當量)溶於1 mL脫水DMF和1 mL DIPEA中之後，將其加入反應溶液中，並於室溫進行攪拌20分鐘。將PyBOP(1.02 g，1.96 mmol，1.2當量)溶於1 mL脫水DMF中之後，將其加入反應溶液中，並於室溫進行攪拌3小時。以水和碳酸氫鈉水溶液來稀釋反應溶液，並以乙酸乙酯/己烷(＝4/1)進行2次萃取。以無水硫酸鈉使其乾燥後，減壓餾除溶劑。藉由使用矽膠層析法(己烷/氯仿＝1/1～0/1，梯度)來實行的分離精製處理，來獲得化合物S1(531.0 mg，1.75 mmol，103%)。
繼而，將化合物S1(212.4 mg，0.70 mmol)投入茄型燒瓶中，並加入5 mL二氯甲烷。在室溫進行攪拌5分鐘後，加入5 mL TFA，並於室溫進行攪拌1小時。減壓餾除溶劑後，進行真空乾燥，而獲得化合物S2(190.7 mg，定量產率(quant.))。
繼而，將化合物S2(190.7 mg，0.77 mmol，1當量)和H-Leu-OtBu・HCl(175.8 mg，0.79 mmol，1當量)投入支管茄型燒瓶中，並進行氮氣取代。在氮氣氣流下加入5 mL脫水DMF與5 mL DIPEA，並於室溫進行攪拌20分鐘。將PyBOP(886.7 mg，1.70 mmol，2.2當量)溶於1.5 mL脫水DMF中之後，將其加入反應溶液中，並於室溫進行攪拌3小時。以水和碳酸氫鈉水溶液來稀釋反應溶液，並以乙酸乙酯/己烷(＝4/1)進行2次萃取。以無水硫酸鈉使其乾燥後，減壓餾除溶劑。藉由使用矽膠層析法(己烷/氯仿＝1/1～0/1，梯度)來實行的分離精製處理，來獲得化合物S3(244.2 mg，0.58 mmol，76%)。
繼而，將化合物S3(240.8 mg，0.58 mmol)投入茄型燒瓶中，並加入5 mL二氯甲烷。在室溫進行攪拌5分鐘後，加入5 mL TFA，並於室溫進行攪拌1小時。減壓餾除溶劑後，進行真空乾燥，而獲得CANDDY_MLN(214.7 mg，0.59 mmol，100%)。
(合成TIBC-CANDDY_MLN) 依照以下合成方案來合成TIBC-CANDDY_MLN。
將CANDDY_MLN(21.7 mg，0.06 mmol，1當量)和另外合成的TIBC-NH2 (29.3 mg，0.06 mmol，1當量)投入茄型燒瓶中，並加入5mL脫水DMF。在室溫進行攪拌5分鐘後，加入5mL DIPEA，來使溶液呈中性。在室溫進行攪拌20分鐘後，將PyBOP(46.8 mg，0.09 mmol，1.5當量)直接加入反應溶液中，並於室溫進行攪拌16小時。在冷卻下加入飽和碳酸氫鈉水溶液，將有機層分離後，以乙酸乙酯萃取水層。收集有機層，並以無水硫酸鈉使其乾燥。減壓餾除溶劑後，藉由使用矽膠層析法(氯仿/甲醇＝20/1～4/1，梯度)來實行的分離精製處理，來獲得TIBC-CANDDY_MLN (10.8 mg，0.013 mmol，22%，分離產率(isolated yield))。對所獲得的TIBC-CANDDY_MLN，使用製備型薄層層析(preparative thin layer chromatography，氯仿/甲醇＝10/1)，來進一步實行精製處理。 TIBC-CANDDY_MLN的物性數據如以下所示。 高解析度質譜儀-快速原子撞擊法(HRMS-FAB) (質荷比(m/z)): C37 H42 Cl2 N4 O5 I的由母體與質子所組成之離子([M＋H]＋ )估計值為819.1577；獲得值為819.1577。
＜實施例2＞ 實施例2中，對於添加TIBC-CANDDY_MLN後的HCT116細胞(人類大腸癌細胞)中的內在的野生型p53蛋白和MDM2蛋白的分解(knockdown)，利用西方墨點法分析進行評估。
(接種細胞) 以8×104 個/孔(well)的細胞密度來將HCT116細胞接種於24孔盤後，在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養16小時。
(對HCT116細胞添加TIBC-CANDDY_MLN或TIBC) 從接種細胞起16小時後，用以下的方式進行，來對HCT116細胞添加TIBC-CANDDY_MLN或TIBC。作為培養基，是使用在D-MEM(高濃度D-葡萄糖、酚紅(Phenol Red)、丙酮酸鈉，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加1質量%L-麩醯胺酸溶液(Sigma-Aldrich公司製造)而得之無血清培養基(37℃)。再者，L-麩醯胺酸溶液是在使用前添加。以DMSO濃度成為1體積%的方式將含有TIBC-CANDDY_MLN或TIBC之DMSO溶液與培養基混合，並對各孔添加500μL，然後在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養。作為對照組，是使用DMSO。
(藉由TIBC-CANDDY_MLN實行的內在的野生型p53蛋白和MDM2蛋白分解(knockdown)的評估(西方墨點法分析)) 添加TIBC-CANDDY_MLN或TIBC 48小時後，去除培養基，並添加PBS來清洗細胞。去除PBS後，對各孔添加27μL的細胞裂解緩衝液(Sigma公司製造的CelLytic M)與蛋白酶抑制劑(Roche公司製造的cOmplete Mini，無EDTA)之混合溶液。在4℃靜置15分鐘後，使用吸管尖(pipette tip)在冰上剝下細胞。將細胞溶液回收至1.5mL管中，並以液態氮使其瞬間凍結後，在冰上使其融解。融解後，進行離心分離(13800rpm×20分鐘，4℃)，並回收上清液(細胞萃取物)。
對於所回收的細胞萃取物，實行西方墨點法分析。SDS-PAGE凝膠，是使用TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%( Bio-Rad公司製造)來製作。電泳樣品，是利用6倍SDS-PAGE樣品緩衝液(62.5 mM Tris-HCl pH 6.8、2% SDS、5% 2-巰基乙醇、10% 甘油、0.25% BPB)來製備，並利用加熱器(heat block)以95℃進行加熱4分鐘。電泳，是以160V實行65分鐘(電泳緩衝液：195mM甘胺酸、25mM Tris)。
電泳後，使用槽式轉漬裝置和轉印緩衝液(25 mM Tris-HCl、195 mM 甘胺酸、0.01% SDS、15%甲醇)，並在100V、2小時的條件下將蛋白質轉印至PVDF膜(Millipore公司製造的Immobion-P)上。轉印後的膜，是藉由下述方式進行阻隔(blocking)：在5%脫脂乳/TBS-T(100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% Tween-20、pH 7.6)中，於室溫進行振盪30分鐘。阻隔後，在5%脫脂乳/TBS-T中實行初級抗體反應。作為初級抗體，是使用抗p53抗體(DO-1，SantaCruz公司製造，1500倍稀釋)、抗MDM2抗體(SMP14，SantaCruz公司製造，500倍稀釋)、及抗GAPDH抗體(6C5，SantaCruz公司製造，20000倍稀釋)。在4℃使其振盪一晚後，以TBS-T來清洗膜5分鐘。再者，清洗是實行3次。初級抗體反應後，在2%脫脂乳/TBS-T中實行二級抗體反應。作為二級抗體，是使用抗小鼠IgG(H＋L)抗體(A90-116P-33，Bethyl公司製造，20000倍稀釋)。在室溫使其振盪45分鐘後，以TBS-T來清洗膜5分鐘。再者，清洗是實行3次。進一步，以TBS(100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.6)來清洗膜5分鐘。然後，以化學發光試藥Immobilon Western(Millipore公司製造)來對膜進行處理後，使用冷光影像分析儀(luminescent image analyzer)LAS-3000(富士軟片股份有限公司製造)來偵測化學發光。
西方墨點法分析結果如第1圖所示。如第1圖所示，當添加了TIBC-CANDDY_MLN時，內在的野生型p53蛋白和MDM2蛋白的量減少。另一方面，當添加了TIBC時，內在的野生型p53蛋白和MDM2蛋白的量未減少。
＜實施例3＞ 實施例3中，對於添加TIBC-CANDDY_MLN後的海拉細胞(人類子宮頸癌細胞)中的內在的野生型p53蛋白的分解的情形，利用西方墨點法分析進行評估。同時評估藉由蛋白酶體抑制劑(MLN2238)來實行的p53蛋白分解的救援。
(接種細胞) 以4×104 個/孔的細胞密度來將海拉細胞接種於24孔盤後，在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養16小時。
(對海拉細胞添加TIBC-CANDDY_MLN) 從接種細胞起16小時後，用以下的方式進行，來對海拉細胞添加TIBC-CANDDY_MLN。作為培養基，是使用在D-MEM(高濃度D-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加1質量%L-麩醯胺酸溶液(Sigma-Aldrich公司製造)而得之無血清培養基(37℃)。再者，L-麩醯胺酸溶液是在使用前添加。以DMSO濃度成為1體積%的方式將含有TIBC-CANDDY_MLN之DMSO溶液與培養基混合，並對各孔添加500μL，然後在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養。作為對照組，是使用DMSO。又，除了添加含有TIBC-CANDDY_MLN之DMSO溶液的實驗組以外，亦準備了添加含有TIBC-CANDDY_MLN和MLN2238兩方之DMSO溶液的實驗組、或添加含有MLN2238之DMSO溶液的實驗組。
(藉由TIBC-CANDDY_MLN實行的內在的野生型p53蛋白分解(knockdown)的評估(西方墨點法分析)) 添加TIBC-CANDDY_MLN或MLN2238 24小時後，去除培養基，並添加PBS來清洗細胞。去除PBS後，對各孔添加27μL的細胞裂解緩衝液(Sigma公司製造的CelLytic M)與蛋白酶抑制劑(Roche公司製造的cOmplete Mini，無EDTA)之混合溶液。在4℃靜置15分鐘後，使用吸管尖在冰上剝下細胞。將細胞溶液回收至1.5mL管中，並以液態氮使其瞬間凍結後，在冰上使其融解。融解後，進行離心分離(13800rpm×20分鐘，4℃)，並回收上清液(細胞萃取物)。
對於所回收的細胞萃取物，實行西方墨點法分析。SDS-PAGE凝膠，是使用TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%( Bio-Rad公司製造)來製作。電泳樣品，是利用6倍SDS-PAGE樣品緩衝液(62.5 mM Tris-HCl pH 6.8、2% SDS、5% 2-巰基乙醇、10% 甘油、0.25% BPB)來製備，並利用加熱器(heat block)以95℃進行加熱4分鐘。電泳，是以160V實行65分鐘(電泳緩衝液：195mM甘胺酸、25mM Tris)。
電泳後，使用槽式轉漬裝置和轉印緩衝液(25 mM Tris-HCl、195 mM 甘胺酸、0.01% SDS、15%甲醇)，並在100V、2小時的條件下將蛋白質轉印至PVDF膜(Millipore公司製造的Immobion-P)上。轉印後的膜，是藉由下述方式進行阻隔(blocking)：在5%脫脂乳/TBS-T(100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% Tween-20、pH 7.6)中，於室溫進行振盪30分鐘。阻隔後，在5%脫脂乳/TBS-T中實行初級抗體反應。作為初級抗體，是使用抗p53抗體(DO-1，SantaCruz公司製造，1000倍稀釋)、及抗GAPDH抗體(6C5，SantaCruz公司製造，1000倍稀釋)。在4℃使其振盪一晚後，以TBS-T來清洗膜5分鐘。再者，清洗是實行3次。初級抗體反應後，在2%脫脂乳/TBS-T中實行二級抗體反應。作為二級抗體，是使用抗小鼠IgG(H＋L)抗體(A90-116P-33，Bethyl公司製造，10000倍稀釋)。在室溫使其振盪30分鐘後，以TBS-T來清洗膜5分鐘。再者，清洗是實行3次。進一步，以TBS(100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.6)來清洗膜5分鐘。然後，以化學發光試藥Immobilon Western(Millipore公司製造)來對膜進行處理後，使用冷光影像分析儀LAS-3000(富士軟片股份有限公司製造)來偵測化學發光。
西方墨點法分析結果如第2圖所示。如第2圖所示，當添加了TIBC-CANDDY_MLN時，內在的野生型p53蛋白的量減少。又，當添加了TIBC-CANDDY_MLN和MLN2238兩方時，野生型p53蛋白的量比對照組(DMSO)更增加。此結果，印證了野生型p53蛋白被TIBC-CANDDY_MLN導向藉由蛋白酶體來實行的分解。
＜實施例4＞ 實施例4中，對於在投予TIBC-CANDDY_MLN後的小鼠個體中的內在的野生型p53蛋白和MDM2蛋白的分解(knockdown)，利用西方墨點法分析進行評估。
(對小鼠投予TIBC-CANDDY_MLN) 在投予前將TIBC-CANDDY_MLN溶於DMSO中之後，以DMS的濃度成為10體積%的方式溶於玉米油(型號25606-55，Nacalai Tesque公司製造)中，並以50mg/kg體重或100mg/kg體重的投予量，來對C57BL/6J野生型小鼠(7～8週齡，雄性)(日本CLEA股份有限公司)進行腹腔內投予(n＝3)。作為對照組，是使用注射液的載體(含有10體積%DMSO之玉米油)。小鼠是在能夠自由攝取飼料和水的環境下進行飼養。投予48小時後，在藉由戊巴比妥(Somnopentyl，共立製藥故份有限公製造)來實行的深度麻醉下解剖小鼠。剖腹後摘取肝臟，並以液態氮使其瞬間凍結。以液態氮凍結後的組織，保管於－80℃的低溫冷凍器中。
(小鼠組織的西方墨點法分析) 分別將凍結後的組織(0.04g)粉碎後，加入980μL 1倍TKM組織溶解緩衝液(50mM三乙醇胺(pH7.8)、50 mM KCl、5 mM MgCl2 、0.25 M蔗糖、1 mM PMSF、蛋白酶抑制劑混合物-無EDTA(protease inhibitors cocktail-EDTA free，型號03969-21，Nacalai Tesque公司製造)、1 mM DTT、5ul/ml重組核糖核酸酶抑制劑(Recombinant RNase inhibitor，40 U/μL，型號2313A，批號K8402DA，Takara Bio公司製造）)，並旋轉15分鐘來使其溶解。然後，進行離心分離(3000rpm×15分鐘，4℃)，然後回收上清液(組織萃取物)。將組織萃取物利用DEPC處理水稀釋20倍後來使用，並以分光光度計來定量組織萃取物中的蛋白質濃度。
對於所回收的組織萃取物，實行西方墨點法分析。SDS-PAGE凝膠，是使用TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%( Bio-Rad公司製造)來製作。電泳樣品，是利用6倍SDS-PAGE樣品緩衝液(62.5 mM Tris-HCl pH 6.8、2% SDS、5% 2-巰基乙醇、10% 甘油、0.25% BPB)來製備，並利用加熱器以95℃進行加熱5分鐘。所製備的電泳，在用於偵測GAPDH時是採用各50μg/孔，在用於偵測除了GAPDH以外的蛋白質時是採用各100μg/孔。電泳，是以160V實行60分鐘(電泳緩衝液：195mM甘胺酸、25mM Tris)。
電泳後，使用槽式轉漬裝置和轉印緩衝液(25 mM Tris-HCl、195 mM 甘胺酸、0.01% SDS、15%甲醇)，並在100V、1.5小時的條件下將蛋白質轉印至PVDF膜(Millipore公司製造的Immobion-P)上。轉印後的膜，是藉由下述方式進行阻隔：在5%脫脂乳/TBS-T(100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% Tween-20、pH 7.6)中，於室溫進行振盪30分鐘。阻隔後，阻隔後，在5%脫脂乳/TBS-T中實行初級抗體反應。作為初級抗體，是使用抗p53抗體(MAB1355，R&D Systems, Inc.製造，500倍稀釋)、抗MDM2抗體(sc-965，SantaCruz公司製造，500倍稀釋)、及抗GAPDH抗體(sc-32233，SantaCruz公司製造，20000倍稀釋)、及抗GAPDH抗體(6C5，SantaCruz公司製造，20000倍稀釋)。在室溫使其振盪60分鐘後，以TBS-T來清洗膜5分鐘。再者，清洗是實行3次。初級抗體反應後，在1%脫脂乳/TBS-T中實行二級抗體反應。在室溫使其振盪30分鐘後，以TBS-T來清洗膜5分鐘。再者，清洗是實行3次。進一步，以TBS(100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.6)來清洗膜10分鐘。然後，以化學發光試藥Immobilon Western(Millipore公司製造)來對膜進行處理後，使用冷光影像分析儀LAS-3000(富士軟片股份有限公司製造)來偵測化學發光。所偵測出的條帶(band)的定量，是使用圖像處理軟體ImageJ(NIH公司製作)。
西方墨點法分析結果如第3圖所示。如第3圖所示，當以50mg/kg體重或100mg/kg體重來對小鼠投予TIBC-CANDDY_MLN時，投予48小時後的肝臟中的內在的野生型p53蛋白和MDM2蛋白的量減少。
＜實施例5＞ 實施例5中，對於添加TIBC-CANDDY_MLN後的老化相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)誘導的TIG3細胞(人類胎兒纖維母細胞)中的抗老化作用，利用螢光活化細胞分類(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)分析進行評估。
(接種細胞) 以8×104 個/孔的細胞密度來將正常細胞也就是TIG3細胞接種於24孔盤後，在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養16小時。
(藉由對TIG3細胞添加多柔比星(doxorubicin)來誘導SA-β-gal) 從接種細胞起16小時後，以成為150nM的方式對各孔添加多柔比星，來誘導細胞老化。作為培養基，是使用在D-MEM(高濃度D-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加1質量%L-麩醯胺酸溶液(Sigma-Aldrich公司製造)而得之無血清培養基(37℃)。再者，L-麩醯胺酸溶液是在使用前添加。添加多柔比星後，在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養24小時。
(對誘導老化後的TIG3細胞添加TIBC-CANDDY_MLN) 從誘導老化起24小時後，用以下的方式進行，來對TIG3細胞添加TIBC-CANDDY_MLN。作為培養基，是使用在D-MEM(高濃度D-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加1質量%L-麩醯胺酸溶液(Sigma-Aldrich公司製造)而得之無血清培養基(37℃)。再者，L-麩醯胺酸溶液是在使用前添加。以DMSO濃度成為1體積%的方式將含有TIBC-CANDDY_MLN之DMSO溶液與培養基混合，並對各孔添加500μL，然後在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養48小時。作為對照組，是使用DMSO。
(藉由TIBC-CANDDY_MLN實行的老化抑制作用的評估(FACS分析)) 老化標識也就是SA-β-gal的定量，是使用市售的套組(Cellular Senescence Detection Kit-SPiDER-βGal(同仁化學研究所股份有限公司製造))。
添加TIBC-CANDDY_MLN48小時後，去除培養基，並添加1mL D-MEM(高濃度D-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉，和光純藥工業股份有限公司製造)來清洗細胞。對各孔添加20μL的套組中附帶的巴佛洛黴素A1操作溶液(Bafilomycin A1 working solution)，並在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養1小時。繼而，對各孔添加200μL的套組中附帶的SPiDER-βGal操作溶液，並在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養30分鐘。去除溶液後，添加1mL D-MEM(高濃度D-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉，和光純藥工業股份有限公司製造)來清洗細胞。去除培養基，並對各孔添加200μL 37℃的胰蛋白酶(含酚紅的0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na溶液，和光純藥工業股份有限公司製造)，然後在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養1分鐘。培養後，對各孔添加300μL培養基，來進行懸浮，並將細胞溶液回收至15mL管中，該培養基是在D-MEM(低濃度D-葡萄糖、L-麩醯胺酸、酚紅，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加10質量%FBS和1質量% PenStrep(100 U/mL青黴素G鈉(Sodium Penicillin G)和100 μg/mL硫酸鏈黴素(Streptomycin Sulfate)，和光純藥工業股份有限公司製造)而得。
流式細胞分析(flow cytometry)中，是使用BD FACSCanto II(BD Biosciences公司製造)，來偵測標示有FITC的SA-β-gal。在FACS分析前，使細胞溶液通過孔徑32μm的網篩，並轉移至FACS管中。利用分析軟體FlowJo(TOMY DIGITAL BIOLOGY股份有限公司製作)來作FITC強度的直方圖，並由直方圖的位移來評估藉由TIBC-CANDDY_MLN實行的老化抑制作用。
FACS分析結果如第4圖所示。如第4圖所示，與未添加多柔比星的情況相比，當添加了多柔比星(150nM)時，觀察到圖形向SA-β-gal陽性(老化標識)位移。另一方面，當在添加多柔比星後(150nM)添加了TIBC-CANDDY_MLN(50μM)時，幾乎沒有觀察到圖形向SA-β-gal陽性(老化標識)位移。由此結果可確認TIBC-CANDDY_MLN的細胞老化抑制作用(約80%)。
＜參考例1＞ 參考例1中，藉由將蛋白質親和性分子與蛋白質分解的誘導標記連接，來合成蛋白質分解的誘導分子也就是TMP-CANDDY_DMT。
作為蛋白質親和性分子，是使用對TMP導入包含胺基的官能基而得之TMP衍生物(TMP-NH2 )，該TMP是能夠與ecDHFR蛋白結合的二氫葉酸還原酶抑制劑。 又，作為蛋白質分解的誘導分子，是使用前述式(I)中將R1 和R2 皆設為甲氧基而得之化合物(DMT)。DMT，是一種非源自蛋白酶體抑制劑但對於蛋白酶體具有親和性的化合物。
TMP-CANDDY_DMT的合成方法的詳細內容，如以下合成方案所述。
將TMP-NH2 (Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637)( 31.7 mg, 0.073 mmol)投入茄型燒瓶中，並加入0.3 mL脫水DMF。在室溫進行攪拌10分鐘後，加入0.1 mL DIPEA，並在室溫進行攪拌10分鐘。將DMT-MM(33.6 mg，0.12 mmol，1.6當量，和光純藥工業股份有限公司製造)直接加入反應溶液中，並於室溫進行攪拌18小時。以水和碳酸氫鈉水溶液來稀釋反應溶液，並以氯仿進行5次萃取。以無水硫酸鈉使其乾燥後，減壓餾除溶劑。藉由使用矽膠層析法(氯仿/甲醇＝92/8)來實行的分離精製處理，來獲得TMP-CANDDY_DMT(25.8 mg，0.045 mmol，62%，分離產率)。
＜參考例2＞ 參考例2中，評估TMP-CANDDY_DMT的蛋白酶體抑制活性和與蛋白酶體的親和性。作為陽性對照組(positive control)，是使用蛋白酶體抑制劑也就是MG-132。
評估中，是使用20S Proteasome StressXpress Assay Kit Gold(Bioscience公司製造)，並利用多功能微孔盤光譜分析儀(Multi-Detection Microplate Reader，型號Synergy HT，BIO-TEK公司製造)來測定藉由切斷AMC結合蛋白酶體螢光基質的C末端所生成的AMC，該AMC結合蛋白酶體螢光基質對20S蛋白酶體的β5(類胰凝乳蛋白酶活性)、β2(類胰蛋白酶活性)及β1(類半胱天冬酶活性)的各β次單元具特異性。測定波長，是將激發光(Ex.)設為360nm，並將螢光(Em.)設為460nm。
β1(類半胱天冬酶活性)、β2(類胰蛋白酶活性)及β5(類胰凝乳蛋白酶活性)的各蛋白酶體活性如第5圖A～第5圖C所示。 如第5圖A～第5圖C所示，確認到與MG-132相比，TMP-CANDDY_DMT的蛋白酶體抑制活性明顯較低。又，對於β1、β2及β5中的任一種，TMP-CANDDY_DMT的抑制活性皆濃度依存性地提高，由此教示TMP-CANDDY_DMT與蛋白酶體具有平穩的親和性。亦即，DMT評估為與蛋白酶體具有親和性，但不會抑制分解。
＜參考例3＞ 參考例3中，對於在海拉細胞中強制表現的ecDHFR蛋白藉由TMP-CANDDY_DMT來分解(knockdown)的情形，利用FACS分析進行評估。
(準備質體) 以大腸桿菌來擴增用以表現ecDHFR蛋白的質體(pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)後，以Miniprep Kit(QIAGEN公司製造)來進行精製。
(對海拉細胞導入質體以及接種細胞) 藉由對海拉細胞導入質體，來使細胞內暫時地過度表現標靶蛋白也就是ecDHFR蛋白(詳細而言，是隔著HA標記的ecDHFR蛋白與GFP之融合蛋白)或比較用的DsRed蛋白。
對海拉細胞導入質體，是使用轉染試藥也就是ScreenFectA(和光純藥工業股份有限公司製造)，並藉由常規方法來實行。以6×104 個/孔的細胞密度來將導入質體後的海拉細胞接種於24孔盤後，在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養40小時。
(對海拉細胞添加TMP-CANDDY_DMT) 在導入質體然後培養40小時後，用以下方式進行，來對海拉細胞添加TMP-CANDDY_DMT。作為培養基，是使用在D-MEM(高濃度D-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加1質量%L-麩醯胺酸溶液(Sigma-Aldrich公司製造)而得之無血清培養基(37℃)，並對各孔添加297μL。再者，L-麩醯胺酸溶液是在使用前添加。對各孔添加3μL含有TMP-CANDDY_DMT之DMSO溶液，並在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養。作為對照組，是使用含有TMP之DMSO溶液、或DMSO。
(藉由TMP-CANDDY_DMT實行的ecDHFR蛋白分解(knockdown)的評估(FACS分析)) 添加TMP-CANDDY_DMT 24小時後，去除培養基，並添加PBS來清洗細胞。去除PBS後，對各孔添加300μL的37℃的胰蛋白酶(含酚紅的0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na溶液，和光純藥工業股份有限公司製造)，並在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養1分鐘。培養後，對各孔添加500μL培養基，來進行懸浮，並將細胞溶液回收至15mL管中，該培養基是在D-MEM(低濃度D-葡萄糖、L-麩醯胺酸、酚紅，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加10質量%FBS和1質量% PenStrep(100 U/mL青黴素G鈉和100 μg/mL硫酸鏈黴素，和光純藥工業股份有限公司製造)而得。
對所回收的細胞溶液進行離心分離(1000rpm×5分鐘，4℃)，並將上清液去除後，利用2mL PBS(37℃)來進行懸浮。對懸浮後的細胞溶液進行離心分離(1000rpm×5分鐘，4℃)，並將上清液去除後，添加500μL 4℃的FACS緩衝液(1質量%FBS/PBS)，並靜置於冰上。
流式細胞分析中，是使用BD FACSCanto II(BD Biosciences公司製造)，來定量細胞中的GFP和DsRed蛋白表現。在FACS分析前，使細胞溶液通過孔徑32μm的網篩，並轉移至FACS管中。利用分析軟體FlowJo(TOMY DIGITAL BIOLOGY股份有限公司製作)來計算每個細胞的GFP/DsRed比，並由圖形的位移來確認藉由TMP-CANDDY_DMT實行的ecDHFR蛋白分解(knockdown)。
FACS分析結果如第6圖所示。如第6圖所示，當添加了TMP-CANDDY_DMT時，確認到圖形濃度依存性地向左位移，因而由TMP-CANDDY_DMT誘導了ecDHFR蛋白分解。另一方面，當添加了TMP時，確認到圖形與對照組(DMSO)重疊，因而ecDHFR蛋白未被分解。
＜參考例4＞ 參考例4中，對於在海拉細胞中強制表現的ecDHFR蛋白藉由TMP-CANDDY_DMT來分解(knockdown)的情形，利用西方墨點法分析進行評估
(準備質體) 與參考例3同樣地進行，來製作用以表現ecDHFR蛋白的質體。
(對海拉細胞導入質體以及接種細胞) 與參考例3同樣地進行，藉由對海拉細胞導入質體，來使細胞內暫時地過度表現ecDHFR蛋白或比較用的DsRed蛋白。以4×104 個/孔的細胞密度來將導入質體後的海拉細胞接種於24孔盤後，在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養40小時。
(對海拉細胞添加TMP-CANDDY_DMT) 在導入質體然後培養40小時後，用以下方式進行，來對海拉細胞添加TMP-CANDDY_DMT。作為培養基，是使用在D-MEM(高濃度D-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加1質量%L-麩醯胺酸溶液(Sigma-Aldrich公司製造)而得之無血清培養基(37℃)。再者，L-麩醯胺酸溶液是在使用前添加。以DMSO濃度成為1體積%的方式將含有TMP-CANDDY_DMT之DMSO溶液與培養基混合，並對各孔添加300μL，然後在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養。又，除了添加含有TMP-CANDDY_DMT之DMSO溶液的實驗組以外，亦準備了添加含有TMP-CANDDY_DMT和硼替佐米(Bortezomib)兩方之DMSO溶液的實驗組。添加TMP-CANDDY_DMT 12小時後，以成為50μg/mL的濃度的方式將蛋白質合成抑制劑也就是放線菌酮(cycloheximide)添加至培養基中。再者，作為對照組，是使用含有TMP之DMSO溶液、或DMSO。
(藉由TMP-CANDDY_DMT實行的ecDHFR蛋白分解(knockdown)的評估(西方墨點法分析)) 添加TMP-CANDDY_DMT 24小時後，去除培養基，並添加PBS來清洗細胞。去除PBS後，對各孔添加55μL的細胞裂解緩衝液(Sigma公司製造的CelLytic M)與蛋白酶抑制劑(Roche公司製造的cOmplete Mini，無EDTA)之混合溶液。在4℃靜置15分鐘後，使用吸管尖在冰上剝下細胞。將細胞溶液回收至1.5mL管中，並以液態氮使其瞬間凍結後，在冰上使其融解。重覆3次凍結、融解後，進行離心分離(13000rpm×20分鐘，4℃)，並回收上清液(細胞萃取物)。
對於所回收的細胞萃取物，實行西方墨點法分析。SDS-PAGE凝膠，是使用TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%( Bio-Rad公司製造)來製作。電泳樣品，是利用6倍SDS-PAGE樣品緩衝液(62.5 mM Tris-HCl pH 6.8、2% SDS、5% 2-巰基乙醇、10% 甘油、0.25% BPB)來製備，並利用加熱器以95℃進行加熱4分鐘。電泳，是以150V實行50分鐘(電泳緩衝液：195mM甘胺酸、25mM Tris)。
電泳後，使用槽式轉漬裝置和轉印緩衝液(25 mM Tris-HCl、195 mM 甘胺酸、0.01% SDS、15%甲醇)，並在100V、40分鐘的條件下將蛋白質轉印至PVDF膜(Millipore公司製造的Immobion-P)上。轉印後的膜，是藉由下述方式進行阻隔：在5%脫脂乳/高鹽TBS-T(100 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、0.2% Tween-20、pH 7.6)中，於室溫進行振盪30分鐘。阻隔後，以高鹽TBS-T來淋洗膜，並在1%脫脂乳/高鹽TBS-T中實行抗體反應。作為抗體，是將抗HA-過氧化酶高親和性3F10大鼠單株抗體(Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity(3F10)Rat monoclonal antibody，25 U/mL，Roche公司製造)稀釋1000倍來使用。在室溫使其振盪1小時後，以高鹽TBS-T來清洗膜5分鐘。再者，清洗是實行3次。進一步，以高鹽TBS-T(100 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、pH 7.6)來清洗膜5分鐘。然後，以化學發光試藥Immobilon Western(Millipore公司製造)來對膜進行處理後，使用冷光影像分析儀LAS-3000(富士軟片股份有限公司製造)來偵測化學發光。
繼而，使用同一片膜，來實行對照組也就是GAPDH的偵測反應。以TBS-T(100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% Tween-20、pH 7.6)來清洗膜，並藉由下述方式進行阻隔：在5%脫脂乳/TBS-T中，於室溫進行振盪30分鐘。阻隔後，在5%脫脂乳/TBS-T中實行初級抗體反應。作為初級抗體，是使用抗GAPDH抗體(6C5，SantaCruz公司製造，20000倍稀釋)。在室溫使其振盪60分鐘後，以TBS-T來清洗膜5分鐘。再者，清洗是實行3次。初級抗體反應後，在2%脫脂乳/TBS-T中實行二級抗體反應。作為二級抗體，是將抗小鼠IgG(H＋L)抗體(A90-116P-33，Bethyl公司製造)稀釋20000倍來使用。在室溫使其振盪30分鐘後，以TBS-T來清洗膜5分鐘。再者，清洗是實行3次。進一步，以TBS(100 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.6)來清洗膜5分鐘。然後，以化學發光試藥Immobilon Western(Millipore公司製造)來對膜進行處理後，使用冷光影像分析儀LAS-3000(富士軟片股份有限公司製造)來偵測化學發光。所偵測出的條帶的定量，是使用圖像處理軟體ImageJ(NIH公司製作)。
西方墨點法分析結果如第7圖A和第7圖B所示。如第7圖A和第7圖B所示，當添加了TMP-CANDDY_DMT時，ecDHFR蛋白的量減少，但當添加了TMP時，ecDHFR蛋白的量未減少。又，與添加了TMP-CANDDY_DMT的情況相比，當添加了TMP-CANDDY_DMT和硼替佐米兩方時，抑制了ecDHFR蛋白分解。此結果，印證了ecDHFR蛋白被TMP-CANDDY_DMT導向藉由蛋白酶體來實行的分解。
＜參考例5＞ 參考例5中，藉由將蛋白質親和性分子與蛋白質分解的誘導標記連接，來合成蛋白質分解的誘導分子也就是TMP-CANDDY_ALLN。
作為蛋白質親和性分子，與參考例1同樣地使用TMP-NH2 。 又，作為蛋白質分解的誘導標記，是使用將蛋白酶體抑制劑也就是ALLN的活性部位(醛基)置換成羧基而得之化合物(CANNDY_ALLN)。
TMP-CANDDY_ ALLN的合成方法的詳細內容，如以下合成方案所述。
(合成CANDDY_ALLN) 將ALLN(87.2 mg，0.23 mmol，1當量，型號07036-24，Nacalai Tesque股份有限公司製造)投入茄型燒瓶中，並加入2mL脫水DMF。在室溫進行攪拌5分鐘後，將過一硫酸氫鉀(Oxone，212.1 mg，0.69 mmol，3當量，型號228036，Sigma-Aldrich公司製造的商品名)直接加入反應溶液中，並於室溫進行攪拌5小時。以水來稀釋反應溶液後，以氯仿進行3次萃取。以無水硫酸鈉使其乾燥後，減壓餾除溶劑。藉由使用矽膠層析法(型號30511-35，Nacalai Tesque股份有限公司製造，氯仿/甲醇＝20/1～10/1，梯度)來實行的分離精製處理，來獲得CANDDY_ALLN(27.0 mg，0.068 mmol，30%)。
(合成TMP-CANDDY_ALLN) 將CANDDY_ALLN(26.8 mg，0.067 mmol，1當量)和另外合成的TMP-NH2 (Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637)( 26.0 mg，0.060 mmol，0.9當量)投入茄型燒瓶中，並加入2 mL脫水DMF。在室溫進行攪拌5分鐘後，加入0.1 mL DIPEA，使溶液呈中性。在室溫進行攪拌5分鐘後，將DMT-MM(30.0 mg，0.11 mmol，1.6當量，型號329-53751，和光純藥工業股份有限公司製造)直接加入反應溶液中，並在室溫進行攪拌2小時。在冷卻下加入10mL的10質量%食鹽水/0.1N鹽酸水溶液，並以乙酸乙酯進行3次萃取。以0.5N鹽酸水溶液進行洗淨，繼而以食鹽水進行洗淨後，以無水硫酸鈉使其乾燥。減壓餾除溶劑後，藉由使用矽膠層析法(型號30511-35，Nacalai Tesque股份有限公司製造，氯仿/甲醇＝10/1)來實行的分離精製處理，來獲得TMP-CANDDY_ALLN(8.2 mg，0.010 mmol，15%，分離產率)。
＜參考例6＞ 參考例6中，與參考例2同樣地進行，來評估TMP-CANDDY_ALLN的蛋白酶體抑制活性和與蛋白酶體的親和性。
β1(類半胱天冬酶活性)、β2(類胰蛋白酶活性)及β5(類胰凝乳蛋白酶活性)的各蛋白酶體活性如第8圖A～第8圖C所示。 如第8圖A～第8圖C所示，確認到對於β2和β5的活性，與單獨ALLN的情形相比，TMP-CANDDY_ALLN的抑制活性變弱，且ALLN的抑制活性去活化。對於β1，已有報告指出ALLN不大會被抑制(Kaiser, M. et al., Chem. Bio. Chem., 2004, 5, 1256-1266)，因而是與此報告相符的結果。 又，對於β1、β2及β5中的任一種，TMP-CANDDY_ALLN的抑制活性皆濃度依存性地提高，由此確認到TMP-CANDDY_ALLN與蛋白酶體的親和性。
＜參考例7＞ 參考例7中，對於在海拉細胞中強制表現的ecDHFR蛋白藉由TMP-CANDDY_ALLN來分解(knockdown)的情形，利用FACS分析進行評估。
(準備質體) 與參考例3同樣地進行，來準備用以表現ecDHFR蛋白的質體(pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA- GFP)。
(對海拉細胞導入質體以及接種細胞) 與參考例3同樣地進行，藉由對海拉細胞導入質體，來使細胞內暫時地過度表現ecDHFR蛋白或比較用的DsRed蛋白。以4×104 個/孔的細胞密度來將導入質體後的海拉細胞接種於24孔盤後，在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養40小時。
(對海拉細胞添加TMP-CANDDY_ALLN) 在導入質體然後培養40小時後，用以下方式進行，來對海拉細胞添加TMP-CANDDY_ALLN。作為培養基，是使用在D-MEM(高濃度D-葡萄糖、酚紅、丙酮酸鈉，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加1質量%L-麩醯胺酸溶液(Sigma-Aldrich公司製造)而得之無血清培養基(37℃)，並對各孔添加300μL。再者，L-麩醯胺酸溶液是在使用前添加。對各孔添加3μL含有TMP-CANDDY_ALLN之DMSO溶液，並在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養。作為對照組，是使用含有TMP之DMSO溶液、或DMSO。
(藉由TMP-CANDDY_ALLN實行的ecDHFR蛋白分解(knockdown)的評估(FACS分析)) 添加TMP-CANDDY_ALLN 24小時後，去除培養基，並添加PBS來清洗細胞。去除PBS後，對各孔添加200μL的37℃的胰蛋白酶(含酚紅的0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na溶液，和光純藥工業股份有限公司製造)，並在37℃、5體積%CO2 的條件下進行培養1分鐘。培養後，對各孔添加300μL培養基，來進行懸浮，並將細胞溶液回收至15mL管中，該培養基是在D-MEM(低濃度D-葡萄糖、L-麩醯胺酸、酚紅，和光純藥工業股份有限公司製造)中添加10質量%FBS和1質量% PenStrep(100 U/mL青黴素G鈉和100 μg/mL硫酸鏈黴素，和光純藥工業股份有限公司製造)而得。
對所回收的細胞溶液進行離心分離(1000rpm×5分鐘，4℃)，並將上清液去除後，利用2mL PBS(37℃)來進行懸浮。對懸浮後的細胞溶液進行離心分離(1000rpm×5分鐘，4℃)，並將上清液去除後，添加500μL 4℃的FACS緩衝液(1質量%FBS/PBS)，並靜置於冰上。
流式細胞分析中，是使用BD FACSCanto II(BD Biosciences公司製造)，來定量細胞中的GFP和DsRed蛋白表現。在FACS分析前，使細胞溶液通過孔徑32μm的網篩，並轉移至FACS管中。利用分析軟體FlowJo(TOMY DIGITAL BIOLOGY股份有限公司製作)來計算每個細胞的GFP/DsRed比，並由圖形的位移來確認藉由TMP-CANDDY_ALLN實行的ecDHFR蛋白分解(knockdown)。
FACS分析結果如第9圖所示。如第9圖所示，與對照組(DMSO)相比，當添加了TMP-CANDDY_ALLN時，確認到圖形大幅向左位移，因而由TMP-CANDDY_ALLN誘導了ecDHFR蛋白分解。另一方面，當添加了TMP時，確認到圖形與對照組(DMSO)重疊，因而ecDHFR蛋白未被分解。
2016年11月15日申請的日本專利申請案第2016-222681號所揭示內容全文，是以參照來納入本說明書中。 又，本說明書所記載之所有文獻、專利申請案及技術規格，是以等同於具體且個別記述以參照來納入各文獻、專利申請案、及技術規格的方式，而以參照來納入本說明書中。
無
第1圖是表示對於添加TIBC-CANDDY_MLN後的HCT116細胞中的內在的野生型p53蛋白和MDM2蛋白的分解(knockdown)，利用西方墨點法分析進行評估的結果的圖。 第2圖是表示對於添加TIBC-CANDDY_MLN後的海拉細胞(HeLa cell)中的內在的野生型p53蛋白的分解的情形，利用西方墨點法分析進行評估的結果的圖。 第3圖是表示對於在對小鼠個體投予TIBC-CANDDY_MLN的情況下，肝臟中的野生型p53蛋白和MDM2蛋白的分解(knockdown)，利用西方墨點法分析進行評估的結果的圖。 第4圖是表示對於添加TIBC-CANDDY_MLN後的老化相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)誘導的TIG3細胞中的抗老化作用，利用螢光活化細胞分類(Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS)分析進行評估的結果的圖。 第5圖A是表示TMP-CANDDY_DMT和MG-132對於蛋白酶體的催化次單元β1的抑制活性的圖。 第5圖B是表示TMP-CANDDY_DMT和MG-132對於蛋白酶體的催化次單元β2的抑制活性的圖。 第5圖C是表示TMP-CANDDY_DMT和MG-132對於蛋白酶體的催化次單元β5的抑制活性的圖。 第6圖是表示對於在海拉細胞中強制表現的大腸桿菌二氫葉酸還原酶(ecDHFR)蛋白藉由TMP-CANDDY_DMT實行分解(knockdown)的情形，利用FACS分析進行評估的結果的圖。 第7圖A是表示對於在海拉細胞中強制表現的ecDHFR蛋白藉由TMP-CANDDY_DMT實行分解(knockdown)的情形，利用西方墨點法分析進行評估的結果的圖。 第7圖B是表示對於在海拉細胞中強制表現的ecDHFR蛋白藉由TMP-CANDDY_DMT實行分解(knockdown)的情形，利用西方墨點法分析進行評估的結果的圖。 第8圖A是表示TMP-CANDDY_ALLN和ALLN對於蛋白酶體的催化次單元β1的抑制活性的圖。 第8圖B是表示TMP-CANDDY_ALLN和ALLN對於蛋白酶體的催化次單元β2的抑制活性的圖。 第8圖C是表示TMP-CANDDY_ALLN和ALLN對於蛋白酶體的催化次單元β5的抑制活性的圖。 第9圖是表示對於在海拉細胞中強制表現的ecDHFR蛋白藉由TMP-CANDDY_ALLN實行分解(knockdown)的情形，利用FACS分析進行評估的結果的圖。
國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無
國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (10)

  1. 一種p53分解的誘導分子，其是p53親和性分子與蛋白質分解的誘導標記之共軛物，且能夠誘導p53蛋白或p53複合物分解，該p53親和性分子對於前述p53蛋白或p53複合物具有親和性，該蛋白質分解的誘導標記對於蛋白酶具有親和性並且不會抑制藉由蛋白酶來實行的蛋白質分解。
  2. 如請求項1所述之p53分解的誘導分子，其中，該p53分解的誘導分子能夠非泛素依存性地誘導前述p53蛋白或p53複合物分解。
  3. 如請求項1或2所述之p53分解的誘導分子，其中，前述蛋白質分解的誘導標記具有蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制活性去活化後的結構。
  4. 如請求項1或2所述之p53分解的誘導分子，其中，前述蛋白酶是蛋白酶體。
  5. 如請求項4所述之p53分解的誘導分子，其中，前述蛋白質分解的誘導標記具有蛋白酶體抑制劑的蛋白酶體抑制活性去活化後的結構。
  6. 如請求項5所述之p53分解的誘導分子，其中，前述蛋白酶體抑制活性是對於選自類半胱天冬酶活性、類胰蛋白酶活性、及類胰凝乳蛋白酶活性中的至少一種的抑制活性。
  7. 一種醫藥組成物，其包含請求項1～6中任一項所述之p53分解的誘導分子。
  8. 如請求項7所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物用於預防或治療由p53蛋白所媒介的疾病或症狀。
  9. 如請求項8所述之醫藥組成物，其中，前述由p53蛋白所媒介的疾病或症狀為癌症、細胞老化、神經疾病、神經細胞死亡、糖尿病、或心臟功能障礙。
  10. 如請求項9所述之醫藥組成物，其中，前述由p53蛋白所媒介的疾病或症狀為細胞老化。
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