WO2023132333A1 - がんを処置するための医薬組成物 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • This disclosure relates to the field of medicine. More specifically, this disclosure relates to pharmaceutical compositions for treating cancer.
  • the present disclosure relates to methods of analyzing cancer recurrence, metastasis or resistance.
  • the present disclosure relates to methods of identifying substances that damage cancer cells expressing leavelin.
  • the present disclosure relates to methods of identifying factors that affect cancer recurrence, metastasis or resistance.
  • the present disclosure relates to the use of Liebelin as a biomarker for cancer stem cells.
  • CTCs Circulating tumor cells
  • Cancer stem cells have attracted attention as cancer cells involved in cancer recurrence and/or metastasis. Cancer stem cells exist within tumors and can exist in a quiescent phase (G0 phase) out of the self-proliferating phase. In addition, cancer stem cells have the ability to self-proliferate and can divide into cancer stem cells identical to self and differentiated cancer cells. Such splitting is called asymmetric splitting. Cancer stem cells can be refractory to conventional cancer therapies such as chemotherapy due to these characteristics.
  • Fujiwara H, et. al. "Promoting Roles of Embryonic Signals in Embryo Implantation and Placentation in Cooperation with Endocrine and Immune Systems. Int J Mol Sci. 2020 Mar 10;21(5):1885. doi: 10.3390/ijms2105 1885. Horie A, et. al., Laeverin/aminopeptidase Q induces trophoblast invasion during human early placentation. Hum Reprod. 2012 May;27(5):1267-76. doi: 10.1093/humrep/des068. Fujiwara H, et. al., Human extravillous trophoblasts express laeverin, a novel protein that belongs to membrane-bound gluzincin metallopeptidases.
  • One object of the present disclosure is to provide a novel pharmaceutical composition for treating cancer.
  • One object of the present disclosure is to provide a novel method for analyzing cancer recurrence, metastasis or resistance.
  • One object of the present disclosure is to provide a novel method for identifying a substance that damages cancer cells expressing leavelin.
  • One object of the present disclosure is to provide a novel method of identifying factors that affect cancer recurrence, metastasis or resistance.
  • One object of the present disclosure is to provide a novel biomarker for cancer stem cells.
  • CTCs circulating tumor cells
  • Liebelin is not expressed in cancer cells cultured in an anchorage-dependent manner by adhesion culture, but becomes expressed in cancer cells cultured in an anchorage-independent manner by suspension culture, and It was found to be expressed in CTCs derived from biological samples.
  • the present inventors have found that cancer cells expressing leavelin are involved in lymph node metastasis.
  • the present inventors found that cancer cells expressing leavelin express indoleamine 2,3-dioxygenase-1 (IDO1), which is involved in suppressing T cell function and inducing differentiation of regulatory T cells. I found out more. In addition, the present inventors have found that contact with cells expressing leavelin induces the differentiation of monocytes into dendritic cells expressing IDO1. These findings indicate that cancer cells expressing leavelin form a tumor microenvironment (TME) that can evade attack from the immune system. Based on these findings, the present inventors have found that cancer cells expressing leavelin play an important role in recurrence, metastasis, or resistance, and completed the present invention.
  • TAE tumor microenvironment
  • the present inventor found that surviving cancer cells surrounded by necrotic cancer cells inside the primary tumor tissue express turns tolin.
  • cancer cells expressing leavelin can evade attack from the immune system and metastasize within lymphatic vessels, lymph nodes, and blood vessels. Based on these findings, the present inventors have found that cancer cells expressing Liebelin can be cancer stem cells, and completed the present invention.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising a substance that binds to leavelin.
  • the pharmaceutical composition according to Item 1, wherein the substance that binds to leavelin comprises an anti- Kunststofferin antibody.
  • the anti-leavelin antibody is (A) CDR-H1 with amino acid sequence: GYSFTDYI (SEQ ID NO: 1); CDR-H2 with amino acid sequence: INPYHAGI (SEQ ID NO: 2); and CDR-H3 with amino acid sequence: ARGSNYVYYYAMD (SEQ ID NO: 3).
  • CDR-L1 comprising amino acid sequence: SSVSY (SEQ ID NO:4); CDR-L2 comprising amino acid sequence: ATS; and CDR-L3 comprising amino acid sequence: QQWSSNPPT (SEQ ID NO:5) Light Chain Variable Region (B) Amino acid sequence: CDR-H1 containing GYTFTSYW (SEQ ID NO: 11); CDR-H2 containing amino acid sequence: IDPYDSET (SEQ ID NO: 12); and CDR containing amino acid sequence: ARDYGSRYYAMD (SEQ ID NO: 13).
  • CDR-L1 Heavy chain variable region comprising H3, and/or CDR-L1 comprising amino acid sequence: ENVVTY (SEQ ID NO: 14); CDR-L2 comprising amino acid sequence: GAS; and CDR comprising amino acid sequence: GQGYSYP (SEQ ID NO: 15) - a light chain variable region comprising L3, (C) CDR-H1 with amino acid sequence: GYTFTSYW (SEQ ID NO: 11); CDR-H2 with amino acid sequence: IDPYDSET (SEQ ID NO: 12); and CDR-H3 with amino acid sequence: ARDYGSRYYAMD (SEQ ID NO: 13).
  • CDR-L1 comprising the amino acid sequence: STISY (SEQ ID NO: 16); CDR-L2 comprising the amino acid sequence: DTS; and CDR-L3 comprising the amino acid sequence: QQWSSNPP (SEQ ID NO: 17).
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 comprising the amino acid sequence: GYTFTDYY (SEQ ID NO: 18); and CDR-H2 comprising the amino acid sequence: IYPRSGHS (SEQ ID NO: 19), and/or amino acids Item 2, comprising a light chain variable region comprising CDR-L1 comprising sequence: QSLLYSNIQKNY (SEQ ID NO: 20); CDR-L2 comprising amino acid sequence: WAS; and CDR-L3 comprising amino acid sequence: QQYYSYP (SEQ ID NO: 21).
  • the pharmaceutical composition according to .
  • [Item 4] The pharmaceutical composition according to item 2 or item 3, wherein the anti-leavelin antibody has ADCC activity or CDC activity.
  • [Item 5] The pharmaceutical composition according to any one of items 1 to 4, wherein the substance that binds to leavelin comprises a cytotoxic agent.
  • the cytotoxic agent contains at least one selected from the group consisting of radioactive isotopes, chemotherapeutic agents, toxins, and enzymes.
  • the cancer is recurrent cancer, metastatic cancer, or resistant cancer, or choriocarcinoma, placental trophoblastic tumor, ovarian cancer, fallopian tube cancer, or uterine cancer , cervical cancer, breast cancer, mammary adenocarcinoma, glioblastoma, colon cancer, prostate cancer, or leukemia.
  • the pharmaceutical composition according to any one of items 1 to 6, which is for preventing cancer recurrence, metastasis or resistance.
  • [Claim 8] A method for analyzing cancer recurrence, metastasis or resistance, comprising: detecting cancer cells expressing leverin in a biological sample from a subject in need thereof using a substance that binds leverin; and based on the detection results, cancer recurrence, metastasis or resistance
  • a method comprising analyzing the [Claim 9] culturing cancer cells expressing cupboardin under conditions that allow contact with a test substance;
  • a method for identifying a substance that damages leverin-expressing cancer cells comprising identifying a substance that damages leverin-expressing cancer cells.
  • Figures 1a-1c are Liebelin (LVRN) staining images ( Figure 1a), nuclear staining images ( Figure 1b), and superimposed images of phase-contrast and Liebelin staining images in adherently cultured MCF7 cells ( Figure 1c). ).
  • FIGS. 1d-1f are images of Liebelin staining (FIG. 1d), nuclear staining image (FIG. 1e), and superimposed images of phase-contrast and Liebelin staining images of Swan71 cells overexpressing Liebelin in adherent culture. (Fig. 1f).
  • Figures 2a and 2b are respectively images of Lieberin staining and nuclear staining using 5-23 antibody, a monoclonal anti-Liebelin antibody, in MCF7 cell spheroids cultured in suspension.
  • Figures 2c and 2d are Liebelin-stained and nuclear-stained images of MCF7 cell spheroids cultured in suspension using an anti-LVRN antibody, respectively.
  • the bottom right bar in Figures 2a-2d is the scale bar indicating 50 ⁇ m.
  • Figures 3a-3d are phase-contrast images of adherent cultured A375 cells (Fig. 3a), Liebelin-stained images (Fig. 3b), nuclear-stained images (Fig. 3c), and overlays of said images (Fig. 3d). .
  • Figures 3e-3h are phase-contrast images of A375 cell spheroids cultured in suspension (Figure 3e), Liebelin-stained images (Figure 3f), nuclear-stained images ( Figure 3g), and overlays of the Liebelin-stained and nuclear-stained images.
  • a merged image FIG. 3h.
  • Figures 3i-l are phase-contrast images of adherent cultured A2780 cells (Fig. 3i), Liebelin-stained images (Fig. 3j), nuclear-stained images (Fig. 3k), and superimposed images of said images (Fig. 3l). .
  • Figures 3m-3p are phase-contrast images of A2780 cell spheroids cultured in suspension (Figure 3m), Liebelin-stained images (Figure 3n), nuclear-stained images ( Figure 3o), and overlays of the Liebelin-stained and nuclear-stained images.
  • a merged image Fig. 3p).
  • the bottom right bar in FIGS. 3a-3p is the scale bar indicating 50 ⁇ m.
  • FIG. 4a is a bar graph showing the relative amount of Liebelin mRNA transcripts (normalized to 1) in A375 cell line cultured in suspension (Spheroid) relative to transcript levels in A375 cell line cultured in adherence (monolayer). is.
  • FIG. 4b is a bar graph showing the relative abundance of Liebelin mRNA transcripts in the A2780 cell line.
  • Figure 4c is a bar graph showing the relative abundance of Liebelin mRNA transcripts in CaSki cell lines.
  • Figure 4d is a bar graph showing the relative abundance of Liebelin mRNA transcripts in the SiHa cell line.
  • FIG. 5a is a fluorescence image showing spheroids positive for leavelin (white arrows).
  • FIG. 5a is a fluorescence image showing spheroids positive for leavelin (white arrows).
  • FIG. 5b is a fluorescence image showing that the spheroids (white arrows) in FIG. 5a are EpCAM-positive.
  • Figure 5c is a fluorescence image showing that the spheroids (white arrows) in Figure 5a are CD45 negative.
  • FIG. 5d is a superimposed image of the fluorescence images of FIGS. 5a-5c. The images enclosed by white squares in FIGS. 5a-5d are enlarged images of the spheroids indicated by the white arrows.
  • the bottom right bar in Figures 5a-5d is the scale bar indicating 20 ⁇ m.
  • FIG. 6 is a bar graph showing relative transcription levels of Lieberin (LVRN) and IDO1, respectively, in cancer cell spheroids.
  • FIG. 7a is a bar graph showing the relative expression levels of four genes (OAS2, IFIT1, IFIT3 and ISG15) in THP-1 cells cultured under conditions that allowed direct contact with Swan71 cells.
  • FIG. 7b is a bar graph showing the relative expression levels of the genes in THP-1 cells cultured under conditions that do not allow direct contact with Swan71 cells.
  • FIG. 8a is a bar graph showing the relative expression levels of four genes (OAS2, IFIT1, IFIT3 and ISG15) in THP-1 cells cultured in the presence of varying concentrations of recombinant Lieberin (rLVRN).
  • FIG. 8b is a bar graph showing the relative expression levels of the genes in THP-1 cells cultured in the presence of rLVRN-immobilized beads ( ⁇ : rLVRN+beads) or free rLVRN ( ⁇ : rLVRN).
  • Figures 9a-9c show the relative expression levels of ISG15 in THP-1 cells cultured in the presence of INF- ⁇ ( Figure 9a), INF- ⁇ ( Figure 9b), and rLVRN ( Figure 9c), respectively. is a bar graph showing.
  • FIG. 8a is a bar graph showing the relative expression levels of four genes (OAS2, IFIT1, IFIT3 and ISG15) in THP-1 cells cultured in the presence of varying concentrations of recombinant Lieberin (rLVRN).
  • FIGS. 11a-11c are bar graphs showing gene expression in CD14-positive cells (FIG. 11a), PBMCs (FIG. 11b) and THP-1 (FIG. 11c) cultured in the presence of rLVRN.
  • Figure 12a is a CD14 and HLA-DR scattergram for PBMCs cultured in the presence of rLVRN.
  • Figure 12b is a CD83 scattergram for the Q1 fraction of Figure 12a.
  • FIG. 13a is a staining image showing Liebelin expression in melanoma cells A375 (1,000 cells/20 ⁇ L medium drop) cultured by the Hanging Drop method.
  • FIG. 13b is a staining image showing intracellular uptake of anti-LVRN antibody in melanoma cell A375 (10 cells/20 ⁇ L medium drop) cultured by the Hanging Drop method in the presence of pHrodo-conjugated anti-LVRN antibody.
  • FIG. 13a is a staining image showing Liebelin expression in melanoma cells A375 (1,000 cells/20 ⁇ L medium drop) cultured by the Hanging Drop method.
  • FIG. 13b is a staining image showing intracellular uptake of anti-LVRN antibody in melanoma cell A375 (10 cells/20 ⁇ L medium drop
  • FIG. 14a is a propidium iodide (PI) staining image of ovarian cancer cell SKOV3 spheroids cultured in the presence of monomethylauristatin E (MMAE)-conjugated 5-23 antibody.
  • FIG. 14b is a PI-stained image of SKOV3 spheroids cultured in the presence of 5-23 antibody.
  • FIG. 14c is a PI-stained image of SKOV3 spheroids.
  • Figure 14d is an image of SKOV3 spheroids without PI staining.
  • FIG. 15a is a stained image of the initial site of lymph node metastasis.
  • FIG. 15b is an enlarged image of the area enclosed by the solid line marked with * in FIG. 15a.
  • FIG. 15c is an enlarged image of the area enclosed by the solid line with ** in FIG. 15a.
  • FIG. 15d is a stained image of a site where lymph node metastasis was established.
  • FIG. 15e is an enlarged image of the area circled in solid lines in FIG. 15d.
  • FIG. 16a is a lymphatic endothelial staining image of a lymph node near the efferent lymphatic vessel. Lymphatic endothelium was stained with Podoplanin.
  • FIG. 16b is a HE-stained image of a lymph node near the efferent lymphatic vessel.
  • FIG. 16c is a stained image of a lymph node near the efferent lymphatic vessel.
  • FIG. 16d is an enlarged image of the area enclosed by the solid line marked with * in FIG. 16c.
  • FIG. 16e is an enlarged image of the area enclosed by the solid line marked with ** in FIG. 16c.
  • FIG. 17a is a stained image of a necrotic area in the primary tumor.
  • FIG. 17a is a stained image of a necrotic area in the primary tumor.
  • FIG. 17b is an enlarged image of the area enclosed by the solid line marked with * in FIG. 17a.
  • FIG. 17b is an enlarged image of the area enclosed by the solid line marked with ** in FIG. 17a.
  • FIG. 17d is an HE-stained image of a site other than the necrotic area in the primary tumor.
  • FIG. 17e is a stained image of a site other than the necrotic area in the primary tumor.
  • FIG. 18a is a HE-stained image of an ovarian cancer section after application of chemotherapy (TC therapy).
  • FIG. 18b is an immunostaining image using an anti-Liebelin antibody of an ovarian cancer section after application of said chemotherapy.
  • FIG. 18c is a HE-stained image of an ovarian cancer section after application of chemotherapy (DC therapy).
  • FIG. 18d is an immunostaining image using an anti-Liebelin antibody of an ovarian cancer section after application of said chemotherapy.
  • FIG. 19 is a line graph showing tumor sizes in cancer cell-implanted mice.
  • FIG. 20 is a series of bar graphs showing expression levels of Liebelin in spheroids formed in cancer cell lines.
  • compositions for treating cancer comprising agents that bind to leavelin.
  • scherin or "LVRN” means a glycoprotein identified as a cell surface antigen of extravillous trophoblast cells (EVT) of the placenta.
  • the amino acid sequence of Liebelin can be obtained from the site of Debank, which is provided by a public institution. Liebelin is, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 when calculated using default parameters in homology search software (e.g., BLAST, FASTA) % or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater sequence identity.
  • Lieberin includes variants in which natural mutations have been introduced and which are functional. Mutations may be deletions, substitutions or additions or combinations thereof in a given amino acid sequence.
  • Human Lieberin for example, consists essentially of 990 amino acids (SEQ ID NO: 10). Lieberin consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 may include post-translational modifications such as glycosylation.
  • Liebelin has a mutation in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 as long as it has its function, and is at least 85% (preferably 90% or more, more preferably 95%) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. % or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater) sequence identity.
  • sequence identity means the percentage of identical amino acids or nucleotides between two optimally aligned polynucleotide sequences or between two amino acid sequences. Sequence identity can be calculated using commercially or publicly available software such as BLAST+. "Deletion” of an amino acid means that an amino acid residue at any position in a given amino acid sequence is missing. "Addition” of an amino acid means that an amino acid residue is added or inserted at any position in a given amino acid sequence. An amino acid “substitution” means that an amino acid residue at any position in a given amino acid sequence is replaced with another amino acid residue. Amino acid substitutions may be, for example, conservative substitutions.
  • a "substance that binds to leevelin” includes any substance that binds to leevelin with a predetermined binding capacity. ⁇ 10 ⁇ (MGPPSSSGFYVSHAVALLLAGLVAALLLALAVLAALYGHCERVPPSELPGLRDSEAESSPPLRQKPTPTPKPSSARELAVTTTPSNWRPPGPWDQLRLPPWLVPLHYDLELWPQLRPDELPAGSLPFTGRVNITVRCTVATSRLLLHSLFQDCERAEVRGPLSPGTGNATVGRVPVDDVWFALDTEYMVLELSEPLKPGSSYELQLSFSGLVKEDLREGLFLNVYTDQGERRALLASQLEPTFARYVFPCFDEPALKATFNITMIHHPSYVALSNMPKLGQSEKEDVNGSKWTVTTFSTTPHMPTYLVAFVICDYDHVNRTERGKEIRIWARKDAIANGSADFALNITGPIFSFLEDLFNISYSLPKTDIIALSSFDNHAMENWGLMIFDESGLLLEPKDQLTE
  • a substance that binds to leavelin for example, binds to leavelin with a predetermined binding ability, but does not substantially bind to substances other than leavelin.
  • Substances that "substantially do not bind" to substances other than herein include substances that bind to substances other than notedlin with a dissociation constant of 10 -4 M or greater.
  • Substances that do not substantially bind to substances other than herein are, for example, substances that bind to substances other than herein with a dissociation constant of 10 ⁇ 3 M or more or 10 ⁇ 2 M or more.
  • a substance that binds to riebelin has a molecular weight of, for example, 10 kDa or more, 20 kDa or more, 30 kDa or more, 50 kDa or more, 75 kDa or more, 100 kDa or more, 125 kDa or more, 150 kDa or more, 175 kDa or more, or 200 kDa or more.
  • a substance that binds to Liebelin has, for example, a molecular weight of less than 500 kDa, less than 450 kDa, less than 400 kDa, less than 350 kDa, less than 300 kDa, less than 250 kDa, or less than 200 kDa.
  • Substances that bind to rieberin are, for example, low-molecular compounds, proteins (eg, antibodies), DNA, RNA, small interfering RNA, or antisense oligonucleotides.
  • the substance that binds to herein is, for example, an anti-leverin antibody or a receptor to which whenlin binds, or a fragment thereof.
  • a substance that binds to Lieberin is, for example, a monoclonal anti-Lieberin antibody or a polyclonal anti-Lieberin antibody.
  • Anti-Liebelin antibodies are, for example, human or humanized antibodies.
  • a substance that binds to Lieberin is, for example, any antigen-binding portion, or a fusion protein containing an antigen-binding portion, that competes with an anti-Lieberin antibody.
  • antibody refers to a substance capable of binding a target through at least one antigen recognition site located in the variable region of an immunoglobulin molecule.
  • Antibodies are, for example, intact polyclonal or monoclonal antibodies, or chimeric antibodies, or antigen-binding portions thereof. Antigen-binding portions are, for example, Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, fragments containing complementarity determining regions (CDRs), single chain antibodies (scFv), diabodies, triabodies, or tetrabodies. be.
  • Antibodies are antibodies or antigen-binding fragments thereof of any class including, for example, IgG, IgA or IgM.
  • variable region of an antibody refers to the variable region of the antibody light chain (V L ) or the variable region of the antibody heavy chain (V H ).
  • the variable region of an antibody heavy or light chain comprises three complementarity determining regions (CDR) and four framework regions (FR).
  • CDRs can be identified using, for example, IgBLAST of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • the heavy chain variable region of an antibody includes CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3.
  • the light chain variable region of an antibody includes CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3.
  • monoclonal antibody means an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies.
  • a substantially homologous antibody does not exclude an antibody containing natural mutations.
  • Monoclonal antibodies can be prepared according to known methods.
  • humanized antibody is of wholly or partly non-human origin and amino acids within the framework regions of its heavy and light chains of non-human origin are modified to avoid or minimize an immune response in humans.
  • a humanized antibody for example, comprises or consists essentially of human C H and C L domains in the constant domains.
  • Humanized antibodies for example, contain constant domains of human origin.
  • human antibody means an antibody in which both the variable region consisting of the framework and CDR regions and the constant region are of human origin.
  • chimeric antibody refers to an antibody in which amino acids in a constant region or portion thereof originating from a particular species have been replaced with amino acids originating from another species. Chimeric antibodies are, for example, antibodies whose variable regions are of murine origin and whose constant regions are of human origin.
  • Antibodies can be prepared, for example, by isolating from natural sources (eg, vertebrates). Antibodies can be prepared, for example, from mammals such as humans, monkeys, pigs, horses, rabbits, dogs, cats and mice; birds such as chickens; fish such as sharks; or camelids such as llamas. Antibodies can be produced artificially, for example, according to techniques such as genetic engineering techniques. Antibodies can be prepared, for example, by selecting from an antibody library based on their ability to bind to Liebelin. Antibodies can be prepared, for example, using phage display methods.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer preferably comprises an anti-liebelin antibody that exhibits antibody-dependent cytotoxicity (ACDD activity) or complement-dependent cytotoxicity (CDC activity).
  • a pharmaceutical composition for treating cancer preferably comprises a substance that binds to Lieberin, including a cytotoxic agent.
  • ACDD activity means the activity of immune cells of the immune system to damage target cells.
  • ACDD activity is a function of immune cells (e.g., microphages and natural killer cells) that have Fc receptors that bind to the Fc region of antibodies to target cells (e.g., cancers that express Lieberin) bound by antibodies that have an Fc region. It is played by killing cells).
  • target cells e.g., cancers that express Lieberin
  • CDC activity refers to activity that damages target cells by binding complement system proteins. CDC activity is mediated by complement components that bind to the Fc region of antibodies that lyse target cells bound by antibodies having the Fc region (for example, cancer cells expressing dutyin).
  • Fc region means a region corresponding to a fragment obtained by partial digestion of an intact antibody with the protease papain.
  • a substance that binds to Lieberin is, for example, an anti-Lieberin antibody that has ACDD activity or CDC activity.
  • Said anti-leavelin antibody comprises, for example, an Fc region.
  • the anti-leavelin antibody is, for example, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • Substances that bind to Lieberin, including cytotoxic agents include, for example, anti-Lieberin antibodies having ACDD activity or CDC activity, and cytotoxic agents described below.
  • the substance that binds to Lieberin, including a cytotoxic agent is at least selected from the group consisting of, for example, an anti-Lieberin antibody having ACDD activity or CDC activity, a radioisotope, a chemotherapeutic agent, an enzyme or fragment thereof, and a toxin. 1 type.
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, Amino acid sequence: CDR-H1 comprising or consisting of GYSFTDYI (SEQ ID NO: 1); A heavy chain variable region comprising CDR-H3 comprising or consisting of: Amino acid sequence: INPYHAGI (SEQ ID NO:2); and A heavy chain variable region comprising CDR-H3 comprising or consisting of: ARGSNYVYYYAMD (SEQ ID NO:3), and/or Amino acid sequence: SSVSY CDR-L1 comprising or consisting of (SEQ ID NO: 4); Amino acid sequence: CDR-L2 comprising or consisting of ATS; and Amino acid sequence: QQWSSNPPT (SEQ ID NO: 5). , or human antibodies).
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, Amino acid sequence: MSSPQPLKTLTLTMGGSWIFLFLLSGTAGAHSEIQLQQTGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNINPYHAGISYNLKFKGKATLTVDTSSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARGSNYVYYYAM DYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVT CVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFP
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:6 (also referred to as 5-23 antibody HC) includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:3.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7 (also referred to as 5-23 antibody LC) comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4 and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:5.
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, amino acid sequence: CDR-H1 comprising or consisting of GYTFTSYW (SEQ ID NO: 11); A heavy chain variable region comprising CDR-H3 comprising or consisting of: Amino acid sequence: IDPYDSET (SEQ ID NO: 12); and A heavy chain variable region comprising CDR-H3 comprising or consisting of: ARDYGSRYYAMD (SEQ ID NO: 13), and/or Amino acid sequence: ENVVTY.
  • CDR-L1 comprising or consisting of (SEQ ID NO: 14); Amino acid sequence: CDR-L2 comprising or consisting of GAS; and Amino acid sequence: GQGYSYP (SEQ ID NO: 15). , or human antibodies).
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, amino acid sequence: CDR-H1 comprising or consisting of GYTFTSYW (SEQ ID NO: 11); A heavy chain variable region comprising CDR-H3 comprising or consisting of: Amino acid sequence: IDPYDSET (SEQ ID NO: 12); and A heavy chain variable region comprising CDR-H3 comprising or consisting of: ARDYGSRYYAMD (SEQ ID NO: 13), and/or Amino acid sequence: STISY CDR-L1 comprising or consisting of (SEQ ID NO: 16); Amino acid sequence: CDR-L2 comprising or consisting of DTS; and Amino acid sequence: QQWSSNPP (SEQ ID NO: 17). , or human antibodies).
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, A heavy chain variable region comprising a CDR-H2 comprising or consisting of: Amino acid sequence: GYTFTDYY (SEQ ID NO: 18); and A heavy chain variable region comprising CDR-H2 comprising or consisting of: IYPRSGHS (SEQ ID NO: 19); and/or Amino acid sequence: QSLLYSNIQKNY.
  • CDR-L1 comprising or consisting of (SEQ ID NO: 20); Amino acid sequence: CDR-L2 comprising or consisting of WAS; and Amino acid sequence: QQYYSYP (SEQ ID NO: 21). , or human antibodies).
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, Amino acid sequence: MGWSYIILFLLATATCVHSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVRQRPEQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTVHMQLSSLTSEDSAVYHCARDYGSRYYAMDYWGQGTSVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIEPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTTPDIKVTCVVVSKDDPEV QFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQ
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22 (also referred to as 94-2/129-5 antibody HC) includes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13. including.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:23 (also referred to as 94-2 antibody LC) contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:14 and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:15.
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, Amino acid sequence: MGWSYIILFLLATATCVHSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVRQRPEQGLEWIGRIDPYDSETHYNQKFKDKAILTVDKSSSTVHMQLSSLTSEDSAVYHCARDYGSRYYAMDYWGQGTSVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIEPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTTPDIKVTCVVVSKDDPEV QFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQ
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, Amino acid sequence: MEWIWIFLFILSGTAGVHSQVQLQQSGAELAGPGTSVRLSCKASGYTFTDYYIDWVKQRTGQGLEWIGEIYPRSGHSKYNEKFEGKATLTADKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCALYYGSSHWFAYWGQGTLVTVSAA KTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVS EDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVG
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:25 (also referred to as 5-23J antibody HC) contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:18 and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:19.
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:26 (also referred to as 5-23J antibody LC) contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:20 and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:21.
  • Substances that bind to Liebelin are, for example, heavy chain CDR-H1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1), CDR-H2 (comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2). (consisting essentially of) and CDR-H3 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3).
  • Substances that bind to Liebelin are, for example, the light chain CDR-L1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4), CDR-L2 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence ATS).
  • Substances that bind to Liebelin are, for example, heavy chain CDR-H1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1), CDR-H2 (comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2). and CDR-H3 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:3), and CDR-L1 of the light chain (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4).
  • a mouse antibody comprising CDR-L2 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence ATS) and CDR-L3 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5), a humanized antibody or a human antibody (eg, an antigen-binding portion, or Fab, Fab', F(ab') 2 , or Fv).
  • CDR-L2 comprising or consisting essentially of the amino acid sequence ATS
  • CDR-L3 comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5
  • a humanized antibody or a human antibody eg, an antigen-binding portion, or Fab, Fab', F(ab') 2 , or Fv).
  • Substances that bind to Liebelin are, for example, heavy chain CDR-H1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11), CDR-H2 (comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12). (consisting essentially of) and CDR-H3 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13). be.
  • a substance that binds to Liebelin is, for example, a light chain CDR-L1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 or 16), CDR-L2 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence ATS or WAS).
  • a murine, humanized or human antibody e.g., an antigen-binding portion or light chain variable region
  • a CDR-L3 comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15 or 17
  • Substances that bind to Liebelin are, for example, heavy chain CDR-H1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11), CDR-H2 (comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12). and CDR-H3 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13), and CDR-L1 of the light chain (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14).
  • a mouse antibody comprising CDR-L2 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence ATS) and CDR-L3 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15), a humanized antibody or a human antibody (eg, an antigen-binding portion, or Fab, Fab', F(ab') 2 , or Fv).
  • Substances that bind to Liebelin are, for example, heavy chain CDR-H1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11), CDR-H2 (comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12).
  • CDR-H3 comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13
  • CDR-L1 of the light chain comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16
  • a mouse antibody comprising CDR-L2 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence DTS) and CDR-L3 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17)
  • a humanized antibody or a human antibody eg, an antigen-binding portion, or Fab, Fab', F(ab') 2 , or Fv).
  • a substance that binds to Liebelin is, for example, heavy chain CDR-H1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18) and CDR-H2 (comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19).
  • murine, humanized, or human antibodies eg, antigen-binding portions or heavy chain variable regions, including those consisting essentially of antibodies.
  • a substance that binds to Liebelin is, for example, a light chain CDR-L1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20), CDR-L2 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence WAS) and CDR-L3 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:21).
  • a substance that binds to Liebelin is, for example, heavy chain CDR-H1 (comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18) and CDR-H2 (comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19).
  • CDR-L1 comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:20
  • CDR-L2 comprising or consisting essentially of the amino acid sequence WAS
  • CDRs of the light chain - a murine, humanized or human antibody e.g., an antigen-binding portion, or Fab, Fab', F(ab') 2
  • L3 comprising or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:21) , or Fv.
  • the substance that binds to Lieberin is, for example, at least 70% (e.g., 75% or more, 80% or more, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6) ), and/or at least 70% (e.g., 75% or more, 80% or more, 85% or more) to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7 a light chain comprising or consisting essentially of an amino acid sequence having a sequence identity of greater than or equal to 90%, more preferably greater than or equal to 95%), said heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or consisting of a CDR-H1 comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2, a CDR-H2 comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2 and the light chain comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4 an anti-Liebelin antibody (
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, Nucleotide sequence: heavy chain variable region encoded in (SEQ ID NO:8), and/or anti-Liebelin antibody (e.g., antigen binding portion, or Fab) comprising nucleotide sequence: light chain variable region encoded in (SEQ ID NO:9) , Fab′, F(ab′) 2 , or Fv).
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:8 encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:6.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:9 encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:7.
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, Nucleotide sequence: heavy chain variable region encoded in (SEQ ID NO:27), and/or anti-Liebelin antibody (e.g., antigen binding portion, or Fab) comprising nucleotide sequence: light chain variable region encoded in (SEQ ID NO:28) , Fab′, F(ab′) 2 , or Fv).
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:27 encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:22.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:28 encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:23.
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, Nucleotide sequence: heavy chain variable region encoded in (SEQ ID NO:27), and/or anti-Liebelin antibody (e.g., antigen binding portion, or Fab) comprising nucleotide sequence: light chain variable region encoded in (SEQ ID NO:29) , Fab′, F(ab′) 2 , or Fv).
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:29 encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:24.
  • Substances that bind to Lieberin are, for example, Nucleotide sequence: heavy chain variable region encoded in (SEQ ID NO:30), and/or anti-Liebelin antibody (e.g., antigen binding portion, or Fab) comprising nucleotide sequence: light chain variable region encoded in (SEQ ID NO:31) , Fab′, F(ab′) 2 , or Fv).
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:30 encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:25.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:31 encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:26.
  • Cytotoxic agent includes substances that can inhibit or arrest the proliferation of, or kill or destroy cells.
  • Cytotoxic agents are, for example, radioactive isotopes (e.g. radioisotopes of At211 , I131 , I125 , Y90, Re186 , Re188 , Sm153 , Bi212 , P32 , Pb212 or Lu);
  • Chemotherapeutic agents e.g., monomethylauristatin E (MMAE), methotrexate, gemcitabine, adriamycin, vinca alkaloids, cisplatin, ifomide, dacarbazine, carboplatin, bleomycin, paclitaxel, carboplatin, vinorelbine, irinotecan (CPT-11), doxorubicin, mel faran, mitomycin C, chlorambucil, daunorubicin, erlotinib or other intercalating agents or growth inhibitors); enzymes such as nuclea
  • a "substance that binds to Lieberin and contains a cytotoxic agent" can be produced, for example, by binding a substance that binds to Lieberin and a cytotoxic agent. Said binding may be, for example, a direct binding or an indirect binding.
  • a direct bond is, for example, a covalent bond.
  • Direct linkages are formed by, for example, the periodate method, the glutaraldehyde method, the maleimide method, and the N-hydroxysuccinimide method.
  • the direct binding of the substance that binds to leavelin and the cytotoxic agent includes, for example, covalent binding of the substance that binds to leavelin and the cytotoxic agent via a linker.
  • Indirect binding is, for example, non-covalent binding. Indirect binding is formed, for example, through biotin-streptavidin binding.
  • the substance that binds to Lieberin, including a cytotoxic agent is, for example, at least one anti-Lieberin antibody, and at least one selected from the group consisting of radioisotopes and chemotherapeutic agents, enzymes or fragments thereof, and toxins ( For example, 1, 2 or 3 or more) cytotoxic agents.
  • the substance that binds to Lieberin containing a cytotoxic agent is, for example, one kind of substance that binds to Lieberin and one kind selected from the group consisting of a radioisotope, a chemotherapeutic agent, an enzyme or a fragment thereof, and a toxin. including cytotoxic agents.
  • Substances that bind to Lieberin, including cytotoxic agents include, for example, anti-Lieberin antibodies and chemotherapeutic agents or radioisotopes or combinations thereof. Substances that bind to Lieberin, including cytotoxic agents, include, for example, anti-Lieberin antibodies and chemotherapeutic agents.
  • a substance that binds to Lieberin containing a cytotoxic agent includes, for example, one substance that binds to Lieberin and at least one (for example, one, two, or three or more) cytotoxic agents.
  • the substance that binds to Lieberin, including a cytotoxic agent is, for example, an anti-Lieberin antibody and one kind of cytotoxic agent selected from the group consisting of a radioisotope, a chemotherapeutic agent, an enzyme or fragment thereof, and a toxin.
  • a plurality of agents include, for example, an anti-Lieberin antibody and multiple chemotherapeutic agents or radioisotopes or combinations thereof.
  • Substances that bind to Lieberin, including cytotoxic agents include, for example, an anti-Lieberin antibody and multiple or one chemotherapeutic agents.
  • cancer cell means a cell that exhibits uncontrolled cell proliferation and/or invasive properties. Cancer cells, for example, grow in an anchorage-dependent or anchorage-independent manner. Cancer cells can form floating cell masses in which multiple cells are gathered. Cancer cells are, for example, circulating tumor cells (CTCs).
  • CTCs circulating tumor cells
  • circulating tumor cells or “CTCs” refers to cancer cells that have separated from primary or metastatic tumor tissue and circulate in the bloodstream. Cancer cells are, for example, cancer cells that express shutt present in blood vessels or lymph vessels.
  • IDO1 or "indoleamine 2,3-dioxygenase-1" means the rate-limiting enzyme of the kynurenine pathway that metabolizes tryptophan to kynurenine (Folia Pharmacol. Jpn.) 142, 85-88 ( 2013)).
  • IDO1 is highly expressed in tumor cells, the proliferation of T cells and NK cells around the tumor cells is suppressed or undergoes apoptosis (Folia Pharmacol. Jpn.) 142, 85-88 (2013). ). IDO1 induces the differentiation of regulatory T cells (Treg).
  • Tregs in the surrounding environment of cancer cells expressing IDO1 promotes the survival of said cancer cells (Liu et al., Targeting the IDO1 pathway in cancer: from bench to bedside. Journal of Hematology & Oncology (2016) 11:100).
  • the subject group in which mRNA encoding IDO1 was detected from CTCs in the blood had a longer overall survival compared to the subject group in which the mRNA was not detected.
  • IDO1 can be measured, for example, by detecting or quantifying mRNA encoding IDO1.
  • the mRNA can be detected or quantified, for example, by quantitative PCR (RT-qPCR) using reverse transcriptase.
  • Examples of the present disclosure show that CTCs expressing Liebelin were present in blood samples from patients with recurrent and/or metastatic cancer.
  • the disclosure also shows that the CTCs expressed indoleamine 2,3-dioxygenase-1 (IDO1).
  • Cancers that can be treated by the pharmaceutical compositions of the present disclosure are, for example, cancers in subjects in which cancer cells (eg, CTCs) expressing leavelin are detected.
  • Cancers that can be treated by the pharmaceutical compositions of the present disclosure are, for example, cancers in subjects in which cancer cells expressing Liebelin and IDO1 (eg, CTCs and floating cancer cells in lymphatics) have been detected.
  • Cancers treated by the pharmaceutical compositions of the present disclosure are, for example, cancers after treatment with chemotherapy and/or radiotherapy.
  • Examples of the present disclosure show that cancer cells expressing tolin are immune by IDO1 expressed by themselves and IDO1 expressed by dendritic cells that can be induced to differentiate from monocytes around the cancer cells. It is suggested that it forms a tumor microenvironment (TME) that can evade attack from the system.
  • TME tumor microenvironment
  • Examples of the present disclosure show that a substance that binds to Liebelin inhibits the expression of IDO1 in said cancer cells, and the conversion of monocytes to dendritic cells expressing IDO1 by contact with said cancer cells. suggesting that differentiation can be blocked.
  • tumors include, for example, lung cancer, prostate cancer, breast cancer, breast cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, rectal cancer, colon cancer, colorectal cancer, cancer of the thyroid, liver cancer, gallbladder cancer, neurological glioma, glioblastoma, uterine cancer, cervical cancer, renal cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer, esophageal cancer, melanoma, sarcoma, blood cancer, basal cell carcinoma, squamous cell Including cancer.
  • Embodiments of the present disclosure show that cancer cells expressing or capable of expressing leavelin (e.g., under hostile conditions such as floating in lymphatics or in the presence of chemotherapeutic agents) , play an important role in cancer metastasis (eg, systemic metastasis) and/or recurrence (eg, local recurrence).
  • cancers that are prevented or treated by the pharmaceutical compositions of the present disclosure are, for example, recurrent, metastatic, or resistant cancers.
  • Examples of the present disclosure show that placental trophoblastic tumors express Liebelin. Examples of the present disclosure also demonstrate that B cells and monocytes among peripheral blood mononuclear cells express Liebelin.
  • Cancers to be prevented or treated by the pharmaceutical composition according to the present disclosure include, for example, choriocarcinoma, placental trophoblastic tumor, ovarian cancer, fallopian tube cancer, uterine cancer, cervical cancer, glioblastoma cancer, colorectal cancer, prostate cancer, or leukemia.
  • the cancer is, for example, choriocarcinoma, placental trophoblastic tumor, ovarian cancer, fallopian tube cancer, uterine cancer, cervical cancer, or leukemia.
  • Said cancer is, for example, choriocarcinoma, placental trophoblastic tumor, ovarian cancer, fallopian tube cancer, uterine cancer, or cervical cancer.
  • Said cancer is, for example, choriocarcinoma or placental trophoblastic tumor.
  • a pharmaceutical composition according to the present disclosure includes, for example, a substance that binds to Lieberin (eg, an MMAE-conjugated anti-Lieberin antibody) that may be conjugated with a cytotoxic agent.
  • Examples of the present disclosure show that the anti-Lieberin antibody itself (without a cytotoxic agent) induces cell death in ovarian cancer cells.
  • the examples of the present disclosure also show that anti-Liebelin antibodies (without a cytotoxic agent) do not induce cell death in breast cancer cell lines and melanomas.
  • Cancers that are prevented or treated by pharmaceutical compositions containing a substance that binds to Lieberin without a cytotoxic agent include, for example, choriocarcinoma, placental trophoblastic tumor, ovarian cancer, fallopian tube cancer, and uterine cancer. cancer, cervical cancer, glioblastoma, colorectal cancer, prostate cancer, or leukemia.
  • Said cancer is, for example, choriocarcinoma, placental trophoblastic tumor, ovarian cancer, fallopian tube cancer, uterine cancer, or cervical cancer.
  • Said cancer is, for example, ovarian cancer, fallopian tube cancer, uterine cancer or cervical cancer.
  • Cancer recurrence or “recurrent cancer” is the growth of cancer cells at either or both the primary site and distant sites after the cancer has responded to treatment, including chemotherapy and/or surgery means that there is, or is likely to occur.
  • Locally recurrent cancer means that cancer cells grow or are likely to grow at the primary site after responding to the treatment.
  • Metalastasis of cancer or “metastatic cancer” refers to the spread or potential for cancer cells to spread from one part of the body (eg the uterus) to another part of the body (eg the lungs). means.
  • a recurrent cancer, or metastatic cancer is a cancer that has been identified as at risk of recurring or metastasizing, or that has recurred or metastasizing, eg, according to known criteria.
  • Metastatic cancer may be cancer after treatment, including surgery, or untreated cancer.
  • Resistant cancer refers to cancer cells proliferating in a subject despite application of cancer therapy, including biologic therapy such as chemotherapy or immunotherapy, or the potential for such It means that there is a gender.
  • Cancer therapy includes therapeutic agents (e.g., radioisotopes and chemotherapeutic agents (including immunotherapeutic agents)), radiation therapy, and surgical treatments, such as surgery, used in the treatment of cancer in mammals. Including intervention.
  • a “pharmaceutical composition” is a mixture containing at least one active ingredient for preventing or treating cancer and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition according to the present disclosure comprises, for example, a substance that binds to Lieberin according to the present disclosure, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may be used in combination with other active ingredients (eg, chemotherapeutic agents) for preventing or treating cancer within the range that does not impair the effect of the substance that binds to Lieberin according to the present disclosure.
  • Concomitant use includes administration of said other active ingredients before, after, or at the same time as administration of the agent that binds to leavelin according to the present disclosure. If the cancer is a resistant cancer, the pharmaceutical compositions of the present disclosure may be administered after or during cancer therapy, such as chemotherapy.
  • the pharmaceutical composition may be in solid or liquid form, for example.
  • Pharmaceutical compositions can be, for example, capsules, tablets, powders, solutions, suspensions, injections, or suppositories.
  • Pharmaceutical compositions can be prepared according to known methods.
  • a pharmaceutical composition can be prepared, for example, by mixing a substance that binds to Lieberin according to the present disclosure and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition according to the present disclosure can be administered to a subject by a known administration method.
  • Known methods of administration include, for example, oral administration and parenteral administration.
  • Parenteral administration includes, for example, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, and subcutaneous administration.
  • Treating means eliminating, reducing or ameliorating at least one symptom in a subject, prolonging overall survival, prolonging the duration of response, slowing disease progression, or Including preventing or delaying the onset of symptoms.
  • Treatment of cancer includes, for example, alleviation of symptoms or complete eradication of cancer.
  • Treatment of cancer includes, for example, prevention or treatment of recurrent, metastatic, or resistant cancer.
  • One embodiment of this aspect provides a pharmaceutical composition for treating recurrent cancer, metastatic cancer, and resistant cancer.
  • cancer in the subject can be treated.
  • One aspect of the present disclosure provides a method of treating cancer comprising administering a pharmaceutical composition of the present disclosure to a subject in need thereof.
  • subjects in need thereof include subjects in need of treating or preventing recurrent, metastatic, or resistant cancer.
  • a subject in need thereof may be, for example, a cancer patient after receiving cancer therapy or a cancer patient before receiving cancer therapy.
  • Another aspect of the present disclosure provides a method of preventing cancer recurrence and/or metastasis comprising administering a pharmaceutical composition of the present disclosure to a subject in need thereof.
  • a pharmaceutical composition according to this aspect comprises a substance that binds to Lieberin according to the present disclosure, preferably the substance that binds to Lieberin comprises a cytotoxic agent according to the present disclosure.
  • pharmaceutically acceptable carrier means any ingredient other than the therapeutic agent according to the present disclosure, which is highly safe and less allergic to subjects.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, aqueous or non-aqueous solvents, solutions (e.g. physiological saline), cryoprotectants (e.g. glycerol), water-soluble polymers (e.g. dextran), or buffers (e.g. phosphate buffer).
  • a "subject” is, for example, a human or a non-human mammal.
  • Non-human mammals include, for example, rodents such as mice, rats, guinea pigs and hamsters; non-human primates such as chimpanzees; artiodactyls such as cattle, goats and sheep; perissodactyla such as horses; rabbits and dogs , cats and other pets.
  • Subjects are, for example, humans or non-human primates (eg, chimpanzees, monkeys, gorillas, gibbons and orangutans). The subject is preferably human.
  • One aspect of the present disclosure is to detect cancer cells expressing leverin in a biological sample derived from a subject in need thereof using a substance that binds to leverin, and based on the detection results, Methods are provided comprising analyzing cancer recurrence, metastasis or resistance.
  • a "subject in need thereof” is, for example, a subject identified as suffering from cancer by a specialist based on specific diagnostic criteria.
  • a subject in need thereof has, for example, stage I, II, III, or IV cancer according to the cancer staging classification (e.g., the TNM classification presented by the Union for International Cancer Control (UICC)). It can be a target.
  • a subject in need thereof is, for example, a subject afflicted with stage II, stage III or stage IV cancer.
  • a subject in need thereof is, for example, a subject afflicted with stage III or stage IV cancer.
  • Bio sample includes any tissue, tissue piece or body fluid collected from a subject.
  • a biological sample is, for example, a tissue, tissue piece or body fluid expected to contain cancer cells expressing leavelin.
  • a biological sample may be, for example, a tissue, tissue piece, or body fluid itself collected from a subject, or may be a sample that has been subjected to preservation treatment or impurity removal treatment.
  • Biological samples include, for example, a portion of primary tumor tissue, a portion of metastatic tumor tissue, lymphatic tissue containing lymph nodes, tissue homogenates, body fluids (e.g., blood, fractions containing blood cell components, lymph, pancreatic juice, bile, ascites).
  • a biological sample is, for example, lymph or lymph tissue.
  • a biological sample is, for example, whole blood or a fraction containing peripheral blood mononuclear cells.
  • a fraction containing peripheral blood mononuclear cells can be prepared, for example, by subjecting whole blood to density gradient centrifugation and specific gravity centrifugation (eg, Ficoll-Paque (registered trademark), Lymphoprep (registered trademark)).
  • the biological sample is preferably a blood sample or lymph, more preferably a blood sample.
  • cancer cells expressing leebelin means cancer cells expressing membrane-bound leebelin.
  • the cancer cell expressing leavelin may be in the state of a single cancer cell, or in the state of a cell cluster (also referred to as "spheroid") containing multiple cancer cells expressing leavelin. There may be.
  • the spheroids may contain, for example, cancer cells that express Lieberin and cancer cells that do not express Lieberin. Said spheroids, for example, consist essentially of cancer cells expressing Liebelin. The spheroids, for example, consist only of cancer cells expressing leavelin.
  • Cancer cells that express Liebelin can proliferate in an anchorage-independent manner.
  • Cancer cells expressing leavelin for example, are viable in the blood. Cancer cells expressing leavelin can survive, for example, in lymphatic vessels or lymph nodes. Cancer cells expressing leavelin can survive in an environment surrounded by dead cells, eg, within tumor tissue. Cancer cells expressing Liebelin can, for example, grow anchorage-independently and anchorage-dependently. Cancer cells expressing leavelin preferably express IDO1. Cancer cells expressing leavelin are, for example, CTCs.
  • Gene expression patterns can be analyzed, for example, using DNA microarrays.
  • the substance that binds to leverin in this embodiment preferably includes a label substance.
  • label substance means a substance that gives a capturable or detectable signal. Labeling agents can be, for example, fluorescent dyes, magnetic particles, or a combination thereof.
  • a capturable signal may be, for example, a magnetic signal.
  • a detectable signal may be, for example, a light signal.
  • fluorescent substance means a substance that absorbs excitation light and emits light (fluorescence) with a wavelength longer than the wavelength of the excitation light.
  • Fluorescent substances can be, for example, fluorescein, rhodamine, Texas Red, tetramethylrhodamine, carboxyrhodamine, phycoerythrin, 6-FAMTM, Alexa Fluor®.
  • magnetic particles includes particles composed of materials that do not have a magnetic field but form a magnetic dipole when exposed to a magnetic field. Magnetic particles have a particle size of, for example, about 1 nm to about 1 ⁇ m, about 1 nm to about 100 nm, about 1 nm to about 10 nm.
  • the magnetic particles consist, for example, of iron hydroxide, iron oxide hydrate, iron oxide, mixed iron oxide, or iron.
  • the magnetic particles are, for example, magnetic particles with a particle size of 2-3 nm.
  • Detection includes qualitatively or quantitatively finding specific substances (eg, proteins, nucleic acids, cells) and/or continuously monitoring already found substances.
  • Detection of cancer cells expressing leverin in a biological sample includes, for example, mixing the biological sample with a substance that binds to leverin, and counting cancer cells to which the substance that binds to leverin is bound.
  • Detection of cancer cells expressing totallin in a biological sample is performed, for example, by mixing the biological sample with a substance that binds to herein to which a label substance that emits a fluorescent signal is bound, subjecting the mixture to FACS, It includes counting cancer cells to which the substance that binds to the leavelin is bound.
  • the detection of cancer cells expressing leavelin in the assay method is performed in vitro.
  • Analysis of recurrence, metastasis or resistance for example, if the detection result indicates the presence of cancer cells expressing Liebelin in the biological sample, the risk of cancer recurrence, metastasis or resistance is analyzed. including doing Analysis of cancer recurrence, metastasis or resistance, for example, when the number of cancer cells expressing leavelin in the biological sample indicated by the detection result is greater than a threshold value, cancer recurrence and / or analyzed as being at risk of metastasis.
  • the threshold is predetermined based on various factors including, for example, cancer type, subject's age, weight, genetic background, and gender.
  • the analysis method according to the present disclosure can be automatically or semi-automatically performed based on the threshold value and the results of detection or measurement of cancer cells expressing Liebelin. Therefore, medical professionals other than physicians (eg, medical information engineers, clinical engineers, or clinical laboratory technologists) can implement the analysis method according to the present disclosure.
  • the analysis method according to the present disclosure does not include, for example, a diagnostic act on humans by a doctor.
  • the analysis method according to the present disclosure which does not include medical treatment by a doctor on humans, is a method of providing information for medical professionals other than doctors to diagnose recurrent cancer, metastatic cancer, or resistant cancer. corresponds to
  • One aspect of the present disclosure provides a method of presenting information for diagnosing a subject with recurrent, metastatic, or resistant cancer.
  • the method according to the above aspect includes detecting cancer cells expressing leverin in a biological sample derived from a subject in need thereof using a substance that binds to leverin, and based on the detection result, detecting cancer cells. including presenting information to diagnose or identify recurrence, metastasis or resistance of
  • a subject analyzed as having a resistant cancer according to this aspect may include administration of a pharmaceutical composition according to the present disclosure after or during the application of cancer therapy such as chemotherapy.
  • a subject analyzed for cancer recurrence and/or metastasis according to this embodiment may be diagnosed or identified as having recurrent and/or metastatic cancer.
  • one aspect of the present disclosure provides methods of diagnosing or identifying whether a subject is suffering from recurrent and/or metastatic cancer.
  • the method according to the aspect includes detecting cancer cells expressing leverin in a biological sample derived from a subject in need thereof using a substance that binds leverin, and based on the detection results, has recurrent and/or metastatic cancer.
  • the detection of cancer cells expressing leavelin in the diagnostic method or identification method is performed in vitro.
  • the cancer cells expressing leavelin are circulating tumor cells (CTCs).
  • CTCs circulating tumor cells
  • one aspect of the present disclosure provides a method of diagnosing or identifying whether a subject has CTCs.
  • a method according to the above aspect comprises treating circulating tumor cells expressing leverin in a blood sample (e.g., whole blood sample, plasma sample or serum sample) from a subject in need thereof with a substance that binds leverin. and diagnosing or identifying whether said subject has CTCs based on the results of the detection.
  • One aspect of the present disclosure provides a method of identifying the presence of cancer stem cells.
  • the method according to the above aspect includes detecting cancer cells expressing leverin in a biological sample derived from a subject in need thereof using a substance that binds to leverin, and based on the detection result, detecting cancer cells. Including identifying if stem cells are present.
  • a subject analyzed as having recurrent cancer, metastatic cancer, or resistant cancer may be subjected to a method for preventing or treating recurrent cancer, metastatic cancer, or resistant cancer. Therefore, one aspect of the present disclosure is to detect cancer cells expressing leverin in a biological sample derived from a subject in need thereof using a substance that binds leverin; analyzing or identifying recurrence, metastasis or resistance in said subject; and treating the subject analyzed or identified as having recurrence, metastasis or resistance of cancer with a pharmaceutical composition according to the present disclosure or cancer
  • a method for preventing or treating cancer recurrence, metastasis or resistance comprising administering a pharmaceutical composition for cancer.
  • the pharmaceutical composition for treating cancer may contain, for example, a known anti-cancer agent, or a known immunotherapeutic agent, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition for treating cancer may comprise a substance that binds to Lieberin.
  • One aspect of the present disclosure is to culture cancer cells expressing forlin under conditions that allow contact with a test substance, and based on the culture results, the test substance is expressed untillin. Methods for identifying a substance that damages cancer cells expressing leavelin, including identifying the substance that damages cancer cells, are provided.
  • test substance is, for example, a low-molecular compound, protein (eg, antibody), DNA, RNA, small interfering RNA, or antisense oligonucleotide.
  • the test substance binds, for example, to Liebelin.
  • the test substance preferably binds to Lieberin with a predetermined binding capacity and has cytotoxic properties.
  • the test substance is, for example, a substance that binds to the lyverin containing cytotoxic agent.
  • a substance that binds to leverin, including a cytotoxic agent, for example, the cytotoxic agent is directly bound to a substance that binds to leverin.
  • Cancer cells expressing Lieberin can be prepared, for example, from cancer cell lines or biological samples.
  • a biological sample is, for example, a body fluid such as blood or lymph from a cancer patient or a tumor tissue or part thereof.
  • Cancer cell lines can be prepared, for example, from biological samples according to known methods. Cancer cell lines, for example, are commercially available.
  • a biological sample can be obtained from a subject using known methods.
  • Cancer cells expressing vacationin can be prepared by, for example, using a substance that binds totownin containing a labeling substance (hereinafter also referred to as a "licherin detection reagent") to detect cancer cells expressing vacationin from a biological sample. including aliquoting.
  • a biological sample and a contextin detection reagent are mixed to form a complex between the cancer cell and the hasslein detection reagent, and a signal derived from the downsidein detection reagent in the complex is used.
  • aliquoting the complex using a Sorting of the complex can be performed using, for example, a single cell/tissue picking device, FACS, or MACS, or a combination thereof.
  • a method for preparing cancer cells expressing leverin includes, for example, removing at least one impurity in a biological sample to enrich cancer cells expressing leverin of interest.
  • a cancer cell expressing leavelin can be, for example, a CTC.
  • CTCs can be obtained from a blood sample (e.g., a whole blood sample, a plasma sample, or a serum sample) collected from a subject by the method for preparing leverin-expressing cancer cells from a biological sample described above or as described in the Examples of the present disclosure. It can be prepared according to the preparation method.
  • Cancer cells expressing Lieberin can be prepared, for example, by floating culture of cancer cell lines.
  • Suspension culture includes, for example, culturing cancer cell lines in low-adsorption culture plates with shaking.
  • Suspension culture involves, for example, culturing a cancer cell line in a low-adsorption tube while rotating.
  • Suspension culture includes, for example, culture by the hanging drop method.
  • Suspension culture of cancer cell lines can be performed under known cell culture conditions.
  • Culturing by the hanging drop method includes culturing for 1 to 3 days, 1 to 2 days, or 1 day under known culture conditions.
  • Known cell culture conditions include, for example, maintaining at 37° C. under 5% CO 2 .
  • the culture temperature is, for example, 37°C.
  • the CO2 concentration is for example 5%.
  • Suspension culture uses, for example, a basal medium or a medium supplemented with additives.
  • a "basal medium” can be prepared according to known protocols or is commercially available.
  • the basal medium is, for example, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Minimum Essential Medium (MEM), or Basic Medium Eagle (BME).
  • Additives include, for example, serum, growth factors or nutrients or combinations thereof.
  • Cultivation of cancer cells expressing Liebelin under conditions that allow contact with the test substance includes, for example, culturing in a medium supplemented with the test substance in a basal medium.
  • the culture is, for example, adherent culture or suspension culture.
  • the culture is, for example, adherent culture.
  • the culture is, for example, suspension culture.
  • Identifying a test substance as a substance that damages cancer cells expressing leavelin means that if the culture results show, for example, the following, the test substance inhibits or halts the growth of cancer cells, or including identifying substances that kill or destroy If the number of cancer cells expressing leaverin is the same before and after culture, the test substance is identified as a substance that can stop the growth of cancer cells expressing leavelin be able to. If the number of cancer cells expressing leaverin is reduced after culturing compared to before culturing, the test substance is identified as a substance capable of killing or destroying cancer cells expressing leavelin can do.
  • the test substance can be identified as a substance that inhibits the growth of cancer cells expressing Lieberin.
  • the proliferation rate is the ratio of the number of cells after culture to the number of cells before culture.
  • One aspect of the present disclosure is to compare a cancer cell that expresses Lieberin with a cancer cell that does not express Lieberin but is of the same origin as said cancer cell, and a genetic or proteinaceous factor Methods of identifying factors that affect cancer recurrence, metastasis or resistance are provided, including identifying differences in .
  • Cancer cells expressing Lieberin can be prepared, for example, from cancer cell lines or biological samples. Lieberin-expressing cancer cells can be prepared, for example, by isolating subsectionin-expressing cancer cells from a biological sample (tumor tissue or tumor tissue fragment) using a currentlylin detection reagent. . Cancer cells expressing leavelin can be prepared, for example, by suspension culture of cancer cell lines.
  • cancer cells that do not express Lieberin means cancer cells that express less than twice the Lieberin expression level in adherent cultured cancer cell lines.
  • Expression level of Lieberin in this context is the amount of mRNA encoding Lieberin.
  • the amount of mRNA encoding Lieberin is measured by RT-qPCR.
  • the amount of mRNA encoding rivelin is a value normalized to mRNA encoding actin, for example.
  • Cancer cells that do not express leavelin are, for example, cancer cells that express an expression level of leavelin that is less than twice the expression level of extravillous trophoblast (EVT)-derived Swan71 cells.
  • Cancer cells that do not express leavelin may be in the form of, for example, single cells, or may be in the form of cell clusters (eg, spheroids).
  • Cancer cells that do not express Lieberin can be prepared, for example, from cancer cell lines or biological samples.
  • the preparation method for example, cancer cell lines can be adherently cultured.
  • the preparation method includes, for example, mixing a biological sample and a living tissue and a living tissue, and a signal derived from the living tissue. Sorting the cancer cells based on non-detection.
  • the preparation method may further comprise fractionating the complex based on detection of a signal from the Liebelin detection reagent in the complex.
  • the fractionation of the complex and the fractionation of cancer cells to which the herein detection reagent is not bound, i.e., cancer cells that do not express thyroid, are each performed by, for example, a single cell/tissue picking device, FACS, or MACS or Combinations thereof can be used.
  • cancer cells that do not express tolin are cancer cells that have the same origin as cancer cells that express tolin.
  • the term "same origin” means that the cancer cells expressing leavelin and the cancer cells not expressing leavelin are derived from the same animal species and from the same primary tumor tissue. means that The same animal species can be, for example, the same individual or different individuals.
  • Cancer cells derived from the same primary tumor tissue for example, both cancer cells that do not express thyroid and cancer cells that express male may be derived from the same primary tumor tissue, or One may be derived from primary tumor tissue and the other from metastatic tumor tissue.
  • Genetic factors include, for example, mutations in gene sequences, the presence or absence or degree of transcription, and chemical modifications such as methylation to DNA.
  • Proteinaceous factors include, for example, chemical modifications to histones such as methylation and ubiquitination, presence or absence or degree of expression, and post-translational modifications such as glycosylation.
  • the identification of genetic or proteinaceous factor differences does not exclude the identification of both genetic and proteinaceous factor differences.
  • Differences in genetic or proteinaceous factors can be identified, for example, by comparing genetic or proteinaceous factor measurements.
  • the measurement results may be electronic data, for example.
  • One aspect of the present disclosure provides measurement results for genetic or protein factors in cancer cells expressing leavelin and cancer cells not expressing leavelin but having the same origin as said cancer cells methods of identifying factors that affect cancer recurrence, metastasis, or resistance, comprising comparing the results of measurements for said factors in , and identifying differences in genetic or proteinaceous factors.
  • Liebelin as a biomarker for cancer stem cells
  • One aspect of the present disclosure provides the use of Liebelin as a biomarker for cancer stem cells.
  • Another aspect of the present disclosure provides a cancer stem cell biomarker consisting of Liebelin.
  • Examples of the present disclosure show that surviving cancer cells surrounded by necrotic cancer cells inside the primary tumor tissue express tolin. It is suggested that these leverin-expressing cancer cells may be able to survive in an environment in which surrounding cancer cells die by, for example, suppressing their own cell growth rate.
  • the embodiments of the present disclosure show that cancer cells expressing leavelin enter lymphatic vessels and blood vessels, circulate in the body while avoiding attack from the immune system, and separate from the primary tumor tissue. Indicates that it can metastasize to organs (eg lymph nodes).
  • the examples of the present disclosure show that cancer cells in metastatic tissue do not express or weakly express colors aslin, and cancer cells separated from metastatic tissue strongly express tolin.
  • examples of the present disclosure demonstrate that cancer cells resistant to chemotherapeutic agents express leavelin. These features are similar to those possessed by cancer stem cells that are thought to cause cancer recurrence and/or metastasis. Liebelin can therefore be used as a biomarker for cancer stem cells.
  • the examples of the present disclosure show that cancer cells expressing leavelin can enter lymphatics or blood vessels and metastasize to organs other than the primary tumor tissue. This feature corresponds to a mechanism of cancer recurrence and/or metastasis. Liebelin can therefore be used as a biomarker for cancer recurrence and/or metastasis.
  • One aspect of the present disclosure provides the use of Liebelin as a biomarker of cancer recurrence and/or metastasis.
  • Another aspect of the present disclosure provides a biomarker of cancer recurrence and/or metastasis consisting of leavelin.
  • cancer stem cell means a cancer cell with quiescence.
  • the term “stationary phase” refers to a period of time during which the viable cell density is approximately constant (ie within measurement error). Cancer stem cells in quiescent phase have, for example, a substantially constant viable cell density for at least 24 hours (eg, 36 hours or longer). Cancer stem cells can divide asymmetrically when they exit the quiescent phase and are in the proliferative phase.
  • the term “asymmetric division” refers to cell division that produces daughter cells that are distinct from each other. Asymmetric division of cancer stem cells can give rise to cancer stem cells and cancer cells differentiated from cancer stem cells.
  • proliferative phase refers to the period during which viable cell density increases. The growth phase can be divided into a DNA synthesis phase (S phase), a division phase (M phase), and a gap phase (G1 phase and G2 phase) between these phases by morphological or biochemical measurements. .
  • biomarker consists of biosubstances such as peptides (including proteins) or nucleic acids (including genes or their transcripts) present in cells, tissues, or body fluids, and the amount and concentration of these biomarkers can indicate disease. It means a substance in a state that can be indicative of its presence, change, progress, degree of therapeutic effect.
  • a biomarker in the present disclosure is Lieberin. Liebelin is used, for example, as a biomarker for metastatic, recurrent or resistant cancer. Liebelin is used, for example, as a biomarker for cancer stem cells.
  • Liebelin as a biomarker is, for example, detecting the presence of specificallylin-expressing cancer cells in a biological sample from a subject in need thereof to identify the presence of cancer stem cells.
  • the use of Lieberin as a biomarker involves detecting the presence of Lieberin-expressing cancer cells in a biological sample from a subject to identify cancer recurrence, metastasis, or resistance to the subject.
  • Cancer cells expressing leavelin can be detected and/or measured according to known immunological methods, particularly the methods described in the present disclosure (eg, the methods described in the Examples).
  • MCF7 cell line MCF7 cell line
  • SKBR3 cell line and BT20 cell line were used as breast adenocarcinoma cells.
  • A375 and SK-MEL28 cell lines were used as melanoma cells.
  • HEC6 and HEC108 cell lines were used as endometrial cancer cells.
  • SKOV3 cell line was used as ovarian cancer cells.
  • Cancer cells were precultured at 37° C. in a culture dish for adherent cells. Cultures were harvested when they reached 90-100% confluence. The collected cultured cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells per well and statically cultured at 37° C. for 24 hours.
  • Pre-cultured cancer cells were seeded at 1-2 ⁇ 10 6 cells per well in a suspension cell culture dish or ultra-low adhesion culture plate, and cultured at 37° C. to form spheroids. . Cultured cells were harvested and transferred to flasks. The flask was incubated at 37° C. for 24-72 hours on a wave shaker.
  • Example 1 shows that cancer cells do not express male and female fetase, but express malelin when they are grown in an anchorage-independent manner by suspension culture.
  • Example 1 shows that cancer cell spheroids express Liebelin.
  • Example 2-1 Expression level of Lieberin in cancer cell spheroid was examined for expression levels (Fig. 3). Liebelin expression was not observed in the A375 (Fig. 3a-d) and A2780 (Fig. 3i-l) cell lines cultured in an anchorage-dependent manner by adherent culture (Figs. 3b and 3j). Liebelin expression was observed in cancer cell spheroids cultured in an anchorage-independent manner in suspension (FIGS. 3e-h and mp) (FIGS. 3f and 3n). These results were the same as those in Example 1.
  • RT-qPCR The A375 and A2780 cell lines were adherently cultured, respectively. Cultured cells were harvested and total RNA was harvested respectively. Similarly, each of the cells was cultured in suspension using a wave shaker to form spheroids. The spheroids were collected and total RNA was collected respectively. Using each total RNA collected, the amount of mRNA encoding Liebelin was measured by RT-qPCR. The amount of said mRNA reflects the expression level of Liebelin. RT-qPCR used a primer set and reverse transcriptase that amplifies the rieberin sequence. In A375 cells, the amount of Liebelin expressed was about 14 times higher in the suspension culture than in the adherent culture (Fig. 4a). Similarly, in the case of A2780 cells, the expression level of Liebelin was about 8 times higher in the suspension culture (Fig. 4b).
  • the CaSki and SiHa cell lines are cervical cancer cell lines infected with human papillomavirus 16 (HPV16), respectively.
  • the cells were adherently cultured, and the cultured cells were collected. Each of the cells was subjected to suspension culture (shaking culture for 24 hours in an ultra-low adhesion culture plate) to form spheroids.
  • the spheroids were harvested. Total RNA was collected from each of the collected adherent cultured cells and suspension cultured cells (spheroids). Total RNA was used to examine the expression level of Liebelin. As a result, the expression level of Liebelin in the cell spheroids was about 3.5 times higher than that in the same cells cultured in adherence (Figs. 4c and 4d).
  • Examples 1 and 2 demonstrate that even cancer cells that do not express ketones, ketones, and others can express ketones, and others expression can be enhanced when grown in a suspension culture in an anchorage-independent manner. show.
  • Example 2-2 (material) A375 cell line was used as melanoma cells.
  • the HCT116 cell line was used as colon cancer cells.
  • HCC38 cell line was used as breast cancer cells.
  • LNCap cell line, DU145 cell line and PC-3 cell line were used as prostate cancer cells.
  • Pre-cultured cancer cells were seeded in an ultra-low adhesion culture plate at 1 ⁇ 10 5 cells per well, and cultured at 37° C. for 3 to 4 days to form spheroids. Cultured cells were harvested and transferred to flasks. The flask was cultured at 37° C. for 7 days on a wave shaker.
  • Example 2-2 shows that spheroid-forming melanoma cells (A375), colon cancer cells (HCT116), breast cancer cells (HCC38) and prostate cancer cells (LNCap, DU145 and PC-3) express Lieberin. I showed that. These results are summarized in the table below.
  • RT-qPCR The expression level of Liebelin in the cancer cells in the suspension-cultured spheroids was measured by RT-qPCR in the same manner as in Example 2. In addition, the expression level of Lieberin in the cancer cells in the adherent cultured monolayer was measured by RT-qPCR. Each expression level was normalized to the expression level of Hprt1 (Fig. 20).
  • FIG. 20 shows that the cancer cells used in Example 2-1 express Lieberin by forming spheroids.
  • the melanoma cell line A375 had approximately 79-fold higher levels of Lieberin expression in spheroids than in monolayers.
  • the colon cancer cell line HCT116 had approximately 33-fold higher expression levels in spheroids.
  • Breast cancer cell line HCC38 had approximately 37-fold higher expression levels in spheroids.
  • the prostate cancer cell lines LNCap, DU145 and PC-3 had ⁇ 7-fold, ⁇ 11-fold and ⁇ 13-fold higher expression levels in spheroids, respectively.
  • Examples 1 and 2-2 demonstrate that cells of various cancers (eg, breast cancer, melanoma, endometrial cancer, ovarian cancer, colon cancer, breast cancer and prostate cancer) form spheroids. This indicates that Lieberin is highly expressed.
  • various cancers eg, breast cancer, melanoma, endometrial cancer, ovarian cancer, colon cancer, breast cancer and prostate cancer
  • CTCs Circulating Tumor Cells
  • peripheral blood mononuclear cells PBMCs
  • the peripheral blood mononuclear cells were mixed with mouse monoclonal anti-LVRN antibody (10 ⁇ g/ml) and rabbit polyclonal anti-EpCAM antibody (10 ⁇ g/ml), and the resulting mixture was incubated at room temperature for 30 minutes.
  • the mixture was mixed with Alexa488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (1:500 dilution) and CF555-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (1:500), and the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes. .
  • the mixture was mixed with anti-CD45 antibody-immobilized magnetic beads, and the resulting mixture was incubated at 4° C. for 15 minutes. After incubation, the mixture was mixed with the BV421-conjugated anti-CD45 antibody and the resulting mixture was incubated at 4° C. for an additional 30 minutes.
  • the mixture after incubation was subjected to a magnetic cell separator (MACS) to exclude CD45-positive cells, thereby concentrating CD45-negative cells.
  • the enriched cells were dispensed into each well of a 96-well cell imaging plate and observed under a fluorescence microscope. Among the observed cells, cells meeting CTC criteria were identified as circulating tumor cells (CTCs).
  • CTC criteria used were LVRN positive and/or EpCAM positive and CD45 negative.
  • the culture medium containing CTCs was collected from the wells showing the presence of CTCs, and droplets of the culture medium were made on 35 mm culture dishes. Cells satisfying CTC criteria were isolated and recovered from the cell population in the droplet using a Unipick (registered trademark) single cell/tissue picking device.
  • Examples A and B Patient A had stage IIIB cervical cancer and multiple lymph node metastases. Patient A had cancer recurrence after receiving concurrent chemoradiation therapy (CCRT). After cancer recurrence, receive therapy using a combination of paclitaxel and carboplatin anticancer agents (TC therapy), then receive therapy using a combination of cisplatin and vinorelbine anticancer agents (NP therapy), and , received therapy with irinotecan (CPT-11). A peripheral blood sample (specimen A) was obtained from patient A after discontinuation of CPT-11 therapy.
  • TC therapy carboplatin anticancer agents
  • NP therapy cisplatin and vinorelbine anticancer agents
  • CPT-11 irinotecan
  • Patient B had stage IIIC endometrial cancer with multiple brain, skin and lymph node metastases.
  • Patient B underwent total abdominal hysterectomy (ATH), bilateral salpingectomy (BSO), omentectomy (OMT), pelvic lymphadenectomy (PLAN) and para-aortic lymphadenectomy (PAN).
  • the cancer recurred and received TC therapy, followed by therapy with a combination of anticancer drugs, doxorubicin and cisplatin (AP therapy).
  • AP therapy a combination of anticancer drugs, doxorubicin and cisplatin
  • a peripheral blood sample was obtained from patient B while receiving best supportive care (BSC) after AP therapy.
  • CTCs in specimen A and specimen B were identified according to the method for identifying circulating tumor cells in the blood described above.
  • cell clusters indicated by white arrows express Lieberin (FIG. 5a), express EpCAM (FIG. 5b), and do not express CD45 (FIG. 5c).
  • FIG. 5 shows that the cell clusters are CTCs expressing leavelin.
  • CTCs were identified according to the CTC criteria described above. As a result, 8 CTCs were identified in sample A, and 15 CTCs were identified in sample B. Of the 8 CTCs identified in Specimen A, 2 formed cell clusters and 6 were present as single cells. Of the 8 CTCs identified in Specimen A, 1 CTC was EpCAM-only positive, 1 LVRN-only CTC, and both EpCAM and LVRN positive. was six. Of the 15 CTCs identified in Specimen B, 2 formed cell clusters and 13 were present as single cells. Of the 15 CTCs identified in specimen B, 4 were EpCAM-only positive, 2 were LVRN-only positive, and both EpCAM and LVRN were positive. was nine. In specimen B, CTC cell masses containing CD45-positive leukocytes were observed. These results are summarized in the table below.
  • Example 4 Lieberin Expression on CTCs in Additional Biological Samples (Specimen C) Patient C had stage IIIB cervical cancer with liver and multiple lymph node metastases. A peripheral blood sample (specimen C) was obtained from patient C after the stage of cervical cancer reached stage IIIB. (Improved method for CTC recovery) CTCs were isolated from Specimen C using a modification of the CTC preparation method of Example 3. In the CTC isolation method of Example 3, CTCs were enriched by excluding PBMCs expressing CD45, but in the improved method, CTCs are enriched by collecting cancer cells expressing EpCAM. .
  • CTC from sample C in the improved method was performed by the following procedure.
  • Peripheral blood was collected from a subject, and peripheral blood mononuclear cells were recovered from the collected peripheral blood.
  • the recovered peripheral blood mononuclear cells were fixed using 2% paraformaldehyde.
  • a sample containing fixed cells was mixed with mouse monoclonal anti-LVRN antibody (10 ⁇ g/ml), Alexa488-conjugated anti-mouse IgG antibody (1:500 dilution) and BV421-conjugated anti-CD45 antibody, resulting in a mixture. was incubated for 30 minutes at 4°C. The mixture was mixed with anti-EpCAM antibody bound to magnetic beads, and the resulting mixture was incubated at 4° C.
  • CTC circulating tumor cells
  • CTCs Five CTCs (lingerin-positive and CD45-negative) were isolated from specimen C. 3 out of 5 CTCs were isolated and recovered. Three CTCs were mixed and total genomic DNA was amplified using the Single Cell Whole Genome Amplification Kit. A DNA fragment was amplified from the amplified genomic DNA using a primer set that amplifies HPV16 (E6/E7). Using the same primer set, the chain length (131 bp) of the DNA amplification product amplified from the peripheral blood sample before CTC isolation matched the chain length (131 bp) of the DNA amplification product amplified from the CTC after isolation. This result indicates that CTCs expressing leavelin are cancer cells infected with HPV16, and that the intended CTCs could be isolated by the improved CTC isolation method.
  • Example D Patient D had stage IVB cervical cancer with multiple lymph node metastases (bone marrow, para-aortic, and supraclavicular lymph nodes), left lower extremity DVT, external maxillary vein thrombosis, left pancreatopathy (ureteral stent placement). ).
  • a cancer tissue piece taken from patient D showed HPV type 16-positive squamous cell carcinoma.
  • Patient D received therapy with a combination of anticancer drugs, cisplatin and paclitaxel (TP therapy), followed by KEYTRUDA® (pembrolizumab).
  • TP therapy a combination of anticancer drugs, cisplatin and paclitaxel
  • KEYTRUDA® pembrolizumab
  • Another improved method was performed using sample D, and from 1 ml of sample D, 56 CD45-negative CTCs were identified. This result indicates that sample D was highly CTC-rich. Three of the 56 CTCs were expressing Liebelin. LVRN-positive CTCs were mixed. Total genomic DNA was amplified from the resulting mixture using the Single Cell Whole Genome Amplification Kit (genomic DNA-p). Five Liebelin-negative CTCs were mixed to prepare an LVRN-negative CTC mixture. Two more LVRN-negative CTC mixtures were prepared. Total genomic DNA was amplified from each of the three LVRN-negative CTC mixtures (genomic DNA-n1, -n2, and -n3) in the same manner as above. A DNA fragment was amplified using a primer set for amplifying HPV16 (E6/E7) from the amplified genomic DNA (genomic DNA-p, -n1, -n2, and -n3).
  • E6/E7 amplifying HPV16
  • CTCs were enriched by excluding PBMCs expressing CD45.
  • 1 CTC (12.5%) expressed only EpCAM.
  • sample B 4 out of 15 CTCs (about 27%) expressed only EpCAM.
  • sample 53 4 out of 56 CTCs, 53 (about 95%) expressed only EpCAM.
  • CTCs were enriched by harvesting cells expressing EpCAM.
  • Examples 3 and 4 demonstrate that single cancer cells or clumps of cancer cells circulating in the blood express Lieberin.
  • sample A 1 out of 8 CTCs (12.5%) did not express Lieberin, and in sample B, 4 out of 15 (approximately 27%).
  • Specimen D had 53 out of 56 (approximately 95%).
  • Subject A, Subject B, and Subject D all had metastatic cancer, subject A had stage IIIB cervical cancer, subject B had stage IIIC endometrial cancer, and subject D had IVB. had staged cervical cancer.
  • Example 5 Effect of Liebelin on immune cell system
  • the CaSki cell line was subjected to shaking culture for 24 hours in an ultra-low adhesion culture plate in the same manner as in Example 1 to form cancer cell spheroids in suspension.
  • the amount of mRNA encoding leverin and indoleamine 2,3-dioxygenase-1 (IDO1) in CaSki cell spheroids was examined by RT-qPCR, respectively (Fig. 6).
  • the expression level of Liebelin (LVRN) was approximately four times higher in suspension culture than in adherent culture of CaSki cells (LVRN, left side of FIG. 6). The results were similar to those of Example 2 (Fig. 4c).
  • the expression level of IDO1 was about 23 times higher in suspension culture than in adherent culture of CaSki cells (IDO1 on the right side of FIG. 6). This result indicates that the expression of IDO1 is enhanced in cancer cell spheroids expressing leavelin.
  • IDO1 expression in tumor cells can induce differentiation of regulatory T cells (Treg) in the peritumoral environment and promote cancer cell survival (Liu et al., Targeting the IDO1 pathway in cancer: from bench to bedside. Journal of Hematology & Oncology (2016) 11:100).
  • IDO1 degrades tryptophan. Tryptophan is essential for T cell function and survival.
  • Tumor cells that highly express IDO1 degrade tryptophan present in their surroundings, so that the activity of T cells is suppressed in the vicinity of said tumor cells. Based on these, Example 5 shows that cancer cells expressing therapeutically or spheroids containing the cancer cells highly express IDO1, thereby inducing Treg differentiation and avoiding attacks from the immune system. suggest that it is possible.
  • Examples 3-5 show that cancer cells expressing onlin can avoid attack from the immune system in the blood due to the expression of IDO1, thereby circulating in the blood and circulating in the primary tumor tissue. suggests that it can grow at different sites. This indicates that cancer cells expressing leavelin play an important role in cancer recurrence and/or metastasis.
  • Example 6 Effect of Lieberin-Expressing Cells on Monocyte-Derived Cells
  • a transformant of Swan71 cells overexpressing Lieberin (Swan71_LVRN) was co-cultured with human monocyte-derived cell line THP-1. Co-culture was performed under conditions that allowed contact between Swan71_LVRN cells and THP-1 cells. Cultured THP-1 cells were harvested and mRNA was extracted. Microarray analysis was performed using the mRNA. Swan71 cells (control) and THP-1 were co-cultured in the same manner as described above, and the cultured THP-1 was subjected to microarray analysis. Expression of multiple genes was increased in THP-1 cells co-cultured with Swan71_LVRN than in THP-1 cells co-cultured with Control.
  • the expression levels of 4 of the above-mentioned multiple genes were examined using RT-qPCR (Fig. 7).
  • the four genes are 2'-5'-Oligoadenylate Synthetase 2 (OAS2), Interferon Induced Protein With Tetratricpeptide Repeats 1 (IFIT1), IFIT3, and the interferon stimulated gene, 15 kDa (ISG15 ) was.
  • Swan71_LVRN cells and THP-1 cells were co-cultured under conditions that allowed contact.
  • Cultured THP-1 cells were harvested and mRNA was extracted.
  • the extracted mRNA was subjected to RT-qPCR to examine the expression level of each gene.
  • the expression levels of the four genes investigated were significantly increased (Fig. 7a).
  • the expression level of each gene was examined in the same manner as described above, except that the Swan71_LVRN cells and THP-1 cells were cultured under conditions that prevented contact between them. In this culture, humoral components, including exosomes, were able to move between compartments containing individual cells. There was no significant difference in the expression levels of the four genes examined (Fig. 7b).
  • Example 6 shows that contact with cells expressing Liebelin increases the expression of specific genes in monocytic cells.
  • THP-1 cells were cultured in the presence of fluorescent dye-labeled rLVRN and observed under a microscope. As a result, rLVRN present in THP-1 cells was observed. This result indicates that Liebelin is taken up by monocytes.
  • rLVRN and beads that bind to the His tag were mixed to prepare rLVRN-immobilized beads.
  • THP-1 cells were cultured in the presence of rLVRN-immobilized beads or free rLVRN.
  • the expression levels of the above four genes in cultured THP-1 cells were measured.
  • the expression levels of the four genes induced by the rLVRN immobilized on the beads ( ⁇ ) were remarkably suppressed compared to the expression levels of the four genes induced by the free rLVRN ( ⁇ ). (Fig. 8b).
  • This result suggests that the induction of expression of the gene in monocyte cells by tolin is not sufficient only by contacting placelin with monocyte cells, but that researchlin needs to be incorporated into the cells.
  • PBMCs Human peripheral blood mononuclear cells
  • IFIT1, IFIT3 and ISG15 were cultured in the presence of rLVRN to detect OAS2, IFIT1, IFIT3 and ISG15.
  • Expression levels of four genes were measured. Expression of the four genes was induced, similar to the results in THP-1 cells.
  • PBMCs were prepared by treating 3 ml of EDTA blood with Ficoll. After culturing the PBMCs in 2 ml of RPMI medium in a dish for floating cells for 24 hours, rLVRN 1.5 ⁇ g/ml, INF- ⁇ 1000 IU/ml or PBS (negative control) was added to the medium. After an additional 24 hours of culture, ISG15 was stained with phycoerythrin (PE). PE-stained PBMCs were subjected to a BD FACS AriaTM Fusion cell sorter and separated into monocyte and lymphocyte fractions.
  • PE phycoerythrin
  • PBMCs were prepared by treating 3 ml of EDTA blood with Ficoll. After culturing the PBMCs in a dish for floating cells using 2 ml of RPMI medium for 12 hours, 1.5 ⁇ g/ml of rLVRN or PBS (negative control) was added to the medium. After further culture for 24 hours, ISG15 was stained with PE, CD14 monocytes were stained with FITC, CD19 as a B cell marker was stained with allophycocyanin (APC), and CD3 was stained with Brilliant Violet 421TM (T cell marker). BV421TM). Stained PBMCs were subjected to a BD FACS AriaTM Fusion cell sorter and separated into CD14-positive monocyte, CD19-positive B-cell and CD3-positive T-cell fractions (CD4 and CD8), respectively.
  • the average fluorescence intensity in the cultured cells supplemented with PBS was 1,622, whereas the average fluorescence intensity in the cultured cells supplemented with rLVRN was 42,287.
  • the mean fluorescence intensity in PBS-supplemented cultures was 478, while the rLVRN-supplemented cultures had a mean fluorescence intensity of 3,031.
  • the mean fluorescence intensity in PBS-supplemented cultures was 372, while the rLVRN-supplemented cultures had a mean fluorescence intensity of 3,678.
  • PBMCs were prepared by treating 3 ml of EDTA blood with Ficoll. The PBMCs were cultured in a suspension cell dish using 2 ml of RPMI medium supplemented with 1.5 ⁇ g/ml of rLVRN. After 24 hours of culture, the cells were harvested and fixed by treatment with 4% paraformaldehyde for 10 minutes. Fixed cells were permeabilized with PBS containing 0.1% Triton for 10 minutes. ISG15 was stained with PE. Mouse or rabbit antibodies against the following markers were used as primary antibodies, and Alexa488-labeled anti-mouse or anti-rabbit antibodies were used as secondary antibodies. CD14 was used as a monocyte lineage marker. CD19 was used as a B cell marker. CD4 was used as a T cell marker. CD8 was used as a T cell marker. Furthermore, cell nuclei were stained with Hoechst.
  • PBMCs were prepared by treating 3 ml of EDTA blood with Ficoll. After the PBMCs were cultured in a floating cell dish using 2 ml of RPMI medium for 24 hours, 1.5 ⁇ g/ml of FITC-labeled rLVRN was added to the medium and cultured for an additional 4 or 24 hours. Cultured cells were harvested and subjected to a BD FACS AriaTM Fusion cell sorter to separate PBMCs into monocyte and lymphocyte fractions.
  • Example 8 suggests that Liebelin induces specific genes such as ISG15 in monocytes and lymphocytes after being taken up by monocytes.
  • PBMCs were prepared by treating 3 ml of EDTA blood with Ficoll.
  • the PBMCs were cultured in a floating cell dish using 10 ml of RPMI medium.
  • the cultured cells were collected, and the obtained cell suspension was mixed with CD14 MicroBeads.
  • the mixture was subjected to Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) to sort CD14-positive cells.
  • the sorted CD14-positive cells were dispensed into culture wells in duplicate, and rLVRN 1.5 ⁇ g/ml or PBS was added to each well. After 24 hours of culture, the cultured cells were observed under a microscope.
  • RNA was extracted from cultured cells and subjected to RT-qPCR to examine the expression levels of four genes, IFIT1, IFIT3, ISG15 and OAS2.
  • the table below shows the relative expression levels of the four genes in CD14-positive cells cultured in the presence of rLVRN with respect to the expression levels of the four genes in CD14-positive cells cultured in the presence of PBS.
  • the table below shows that Liebelin induces the expression of said genes in CD14 positive cells.
  • Dendritic cells are divided into dendritic cells (XCR1 + DC) that present foreign antigens in an MHC class I-dependent manner and dendritic cells (XCR1 + DC) that present antigens in an MHC class II-dependent manner, depending on the mode of antigen presentation.
  • CD11b + DC plasmacytoid dendritic cells (pDC) that produce large amounts of type I IFN during viral infection, and dendritic cells (moDC) differentiated from peripheral blood monocytes during inflammation. obtain.
  • pDC plasmacytoid dendritic cells
  • miDC dendritic cells differentiated from peripheral blood monocytes during inflammation.
  • CD14-positive cells showed decreased CD14 expression levels, increased CD123, CD80 and CD86 expression levels, and no change in CD11c expression levels (Fig. 11a).
  • Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) showed an expression pattern of the specific gene similar to that of CD14-positive cells, but changes in the expression levels of the gene were more pronounced in CD14-positive cells (Fig. 11a and 11b).
  • THP-1 showed changes in the expression levels of said specific genes with a different trend than PBMCs and CD14 positive cells (FIGS. 11a-11c).
  • Example 9 shows that Liebelin differentiates PBMCs-derived CD14-positive cells into dendritic cells, and the dendritic cells have a decreased expression level of CD14 ( ⁇ ) and an increased expression level compared to CD14-positive cells.
  • CD123 ( ⁇ ), CD80 ( ⁇ ) and CD86 ( ⁇ ), and CD11c ( ⁇ ) with unchanged expression levels can be differentiated into dendritic cells. Focusing on CD11c and CD123, the dendritic cells differentiated by Liebelin were CD11c(+)CD123(+).
  • XCR1 + DC, CD11b + DC and moDC are CD11c(+)CD123( ⁇ ), so the dendritic cells induced to differentiate by Liebelin are different from these dendritic cell subsets. considered different. Since pDC is DC11c( ⁇ )CD123(+), dendritic cells differentiated by Liebelin are considered to be different from the pDC subset.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the PBMCs were cultured in a floating cell dish using 2 ml of RPMI medium for 24 hours. 1.5 ⁇ g/ml rLVRN or PBS (control) was added to the culture medium and cultured for an additional 24 hours. Cultured cells were harvested and stained with BV421-labeled anti-CD14 antibody, PE-labeled anti-HLA-DR antibody, and APC-labeled anti-CD83 antibody.
  • CD14 was utilized as a monocyte lineage marker, HLA-DR as an antigen presenting cell (APC) marker and CD83 as a mature dendritic cell marker. Stained cultured cells were subjected to a BD FACS AriaTM Fusion cell sorter.
  • HLA-DR (+) CD14 (-) (Q1 fraction) cell population increased from 12.2% to 19.3% by replacing the additive component PBS with rLVRN.
  • PBMCs from adult male b the same cell population decreased from 15.1% to 6.5%.
  • PBMCs were cultured as above and the cultured cells were subjected to a BD FACS AriaTM Fusion cell sorter. Cultured cells were stained with FITC-labeled anti-CD14 antibody, PE-labeled anti-HLA-DR antibody, APC-labeled anti-CD11c antibody, and BV421-labeled anti-CD123 antibody.
  • CD14 was utilized as a monocyte lineage marker, HLA-DR as an antigen presenting cell (APC) marker, CD11c as a dendritic cell marker (primarily moDC) and CD123 as a dendritic cell marker (primarily pDC).
  • the HLA-DR (+) CD14 (-) (Q1 fraction) cell population increased from 15.2% to 17.3% by replacing the additive component PBS with rLVRN.
  • the CD11c(+)CD123(+) cell population in the Q1 fraction increased significantly from 3.2% to 50.7%.
  • Example 10 shows that PBMCs cultured in the presence of leavelin show an increase in CD83(+) dendritic cells in the CD14(-) cell population.
  • Example 10 shows an increase in CD11c(+)CD123(+) dendritic cells in the monocyte fraction, whether CD14 positive or negative. Focusing on CD123 and CD11c, dendritic cells induced to differentiate from PBMCs cultured in the presence of Liebelin were CD123(+)CD11c(+). As shown in Table 4, XCR1+ DCs, CD11b+ DCs and moDCs are CD11c(+)CD123(-), so dendritic cells induced to differentiate by Liebelin are different from these dendritic cell subsets. Conceivable. Since pDC is DC11c( ⁇ )CD123(+), dendritic cells differentiated by Liebelin are considered to be different from the pDC subset. This result is the same as in Example 9.
  • Example 12 Action of anti-risonerin antibody on cancer cells expressing rieberin An anti-rieberin antibody was applied to cancer cells expressing rieberin. Intracellular uptake of cell surface Lieberin was observed upon application of a monoclonal anti-Lieberin antibody.
  • Melanoma cells A375 1,000 cells in 20 ⁇ L of culture solution drop) were cultured for 1 day by the hanging drop method. Cultured A375 cells formed cell clusters. A375 cells expressing Liebelin were observed in the A375 cell cluster (Fig. 13a).
  • Melanoma cells A375 (10 cells in 20 ⁇ L culture drop) were cultured for 1 day by the hanging drop method in the presence of pHrodo-conjugated anti-LVRN antibody.
  • the cultured A375 cells formed 2 to 3 cell clusters, and A375 cells expressing leavelin were observed.
  • Intracellular uptake of the pHrodo-conjugated anti-LVRN antibody was observed in A375 cells that expressed leavelin (Fig. 13b).
  • Intracellular uptake of cell membrane Lieberin by anti-Lieberin antibody was observed with all three types of antibodies (including 5-23 antibody) used in this example.
  • Decreased cell surface Liebelin suggests that the differentiation of monocytes into IDO1-expressing dendritic cells may not be sufficiently induced, thereby exposing the cancer cells to attack from the immune system. This result suggests that anti- Kunststofferin antibodies can effectively treat recurrent and/or metastatic cancers identified for the presence of cancer cells expressing deficitin.
  • the ovarian cancer cell line SKOV3 was cultured in suspension to form spheroids (Fig. 14a upper).
  • An MMAE conjugated 5-23 antibody was prepared in which the cytotoxic agent monomethylauristatin E (MMAE) was conjugated to the monoclonal anti-leavelin antibody 5-23 antibody.
  • the cancer cell spheroids were cultured for 7 days in the presence of MMAE-conjugated 5-23 antibody. Subsequently, the cancer cell spheroids were stained with propidium iodide (PI). Propidium iodide (PI)-stained cells (ie cell death) were observed (Fig. 14a middle panel). This result suggests that anti-Lieberin antibodies containing cytotoxic agents can effectively treat recurrent and/or metastatic cancers in which the presence of Lieberin-expressing cancer cells has been identified.
  • PI propidium iodide
  • cancer cell spheroids were formed and cultured in the presence of the MMAE conjugated 5-23 antibody in the same manner as for SKOV3.
  • PI-stained cells ie cell death
  • the middle panel of Figure 14b shows that there were PI-stained cells (ie cell death) in ovarian cancer cell spheroids cultured in the presence of MMAE unconjugated 5-23 antibody alone.
  • This result suggests that the anti-leavelin antibody itself (without a cytotoxic agent conjugate) can treat recurrent and/or metastatic cancer.
  • Cell death-inducing action by the anti-leavelin antibody itself was not observed in breast cancer cell line SKBR3 and melanoma SK-MEL28.
  • FIG. 15 shows an immunostaining image of a lymph node near the afferent lymphatic vessel.
  • FIG. 16 shows an immunostaining image of a lymph node near the efferent lymphatic vessel.
  • Figure 15b shows the presence of floating cancer cell masses within the afferent lymphatics.
  • FIG. 15c shows that cancer cells composing the cell mass express Lieberin.
  • Figures 15d and 15e show the presence of low expression levels of leavelin-expressing cancer cells at tumor sites within metastatic lymph nodes.
  • Figures 16a and 16b show the presence of cancer cell masses in the efferent lymphatics that have dislodged from the tumor site in the metastatic lymph nodes.
  • Figures 16c to 16e show that cancer cells forming cancer cell clusters present in efferent lymphatic vessels express colors.
  • FIG. 16c shows that cancer cells present in metastatic foci within lymph nodes do not express Liebelin.
  • Example 13 shows that cancer cells expressing spiritualin that have escaped from the primary tumor site of ovarian cancer can reach lymph nodes through afferent lymphatic vessels, and that cancer cells expressing fatein that have reached lymph nodes proliferates in lymph nodes to form metastatic tumor tissue (including cancer cells with low levels of designlin and cancer cells that do not express metrolin), and elsewherein-expressing cancers that have left the metastatic tumor tissue We show that the cells can further metastasize through the efferent lymphatics.
  • Example 13 shows that cancer cells involved in lymph node metastasis strongly express Liebelin under severe conditions for cell survival such as floating in lymph vessels, and adhere like metastatic foci. It shows weak or no expression of Liebelin under viable conditions.
  • Immune cells are concentrated in lymphatic vessels and lymph nodes, and their immune function is high. Examples of the present specification show that cancer cells expressing tolin can avoid attack from the immune system by expressing IDO1 themselves, and monocytes that come into contact with tolin are transformed into dendritic cells expressing IDO1. It was shown that the induction of differentiation into cells makes it possible to avoid attacks from the immune system. These findings indicate that cancer cells expressing or capable of expressing leebelin may play an important role in cancer metastasis and/or recurrence, including lymph node metastasis, particularly in systemic metastasis.
  • Example 14 Surviving cancer cells surrounded by necrotic cells inside the primary tumor tissue
  • the primary tumor tissue of an ovarian cancer patient with metastatic cancer contained extensive necrotic areas (Fig. 17a). ). Residual tumor was found in areas surrounded by necrotic areas within the primary tumor tissue. The residual tumor expressed leavelin (Fig. 17b). No Liebelin expression was observed in necrotic areas (Fig. 17c). No Liebelin expression was observed in areas containing cancer cells surviving outside the necrotic area (Figs. 17d and 17e).
  • Example 14 shows that cancer cells expressing leavelin can survive even under severe conditions such as necrosis of cancer cells, or that cancer cells expressing leavelin can survive under such severe conditions. , indicating that cancer cells capable of expressing Lieberin express Lieberin and remain viable.
  • the results of Examples 13 and 14 suggest that cancer cells capable of expressing Lieberin express Lieberin and remain viable when subjected to conditions that are hostile to cell survival.
  • blood vessels were present around the cancer cells expressing leavelin. This result suggests that cancer cells expressing leavelin, which may play an important role in cancer recurrence and/or metastasis, can be treated by anticancer agents infused into the blood.
  • necrotic tumor tissue and residual small tumor tissue were observed (Fig. 18a). Most of the remaining tumor tissue is surrounded by necrotic tumor tissue. The remaining tumor tissue consisted of cancer cells expressing leavelin (Fig. 18b).
  • Example F Patients with stage IIIC ovarian cancer received doxetaxel and carboplatin combination therapy (DC therapy) as NAC followed by ATH, BSO, OMT and low anterior rectal resection as IDS. The patient received DC therapy after IDS. The patient relapsed with peritoneal seeding one year after the DC therapy. Specimen F was an ovary removed by IDS. Sections of excised ovaries were prepared and immunostained with HE staining and anti-Liebelin antibody.
  • DC therapy carboplatin combination therapy
  • Fig. 18c In the ovarian cancer after DC therapy, some cancer cells were observed separately in the necrotic major tissue (Fig. 18c). The cancer cells are surrounded by necrotic tumor tissue. The cancer cells expressed leavelin (Fig. 18d).
  • Example 15 shows that chemotherapy-resistant cancer cells express Liebelin. This result suggests that cancer cells expressing or capable of expressing leavelin are resistant to cancer therapies, including chemotherapy, and are susceptible to cancer recurrence and/or metastasis, particularly local recurrence. Show that it can play an important role.
  • Ovarian cancer cell line A2780 was transformed to express Lieberin to generate A2780 LVRN.
  • A2780 was transfected with an empty vector CAG to generate A2780 CAG (control).
  • Female Balb/c nu/nu mice (6-8 weeks old) were injected with 5 ⁇ 10 6 cells/100 ⁇ LA2780 LVRN in two sites on the right side.
  • Cancer cell-transplanted mice were prepared by injecting LA2780 CAG at 5 ⁇ 10 6 cells/100 ⁇ per site into two sites on the left side of the mouse. Ten cancer cell-transplanted mice were produced.
  • MMAE-conjugated 5-23 antibody (10 mg/kg) was intra-tail injected into 5 cancer cell-implanted mice, and tumor size was measured.
  • Two days and eight days after A2780 injection the remaining 5 cancer cell-implanted mice were injected with PBS via the tail, and the tumor size was measured.
  • Fifteen days after A2780 injection the tumor size of 10 cancer cell-implanted mice was measured.
  • FIG. 19 shows that administration of PBS to A2780 LVRN-implanted mice resulted in a tumor size of approximately 300 mm 3 15 days after A2780 LVRN injection. 15 shows that when A2780 LVRN-implanted mice were administered MMAE-conjugated 5-23 antibody, no tumors were visually observed 15 days after A2780 LVRN injection.
  • Example 16 shows that tumors formed in vivo by cancer cells that express Lieberin are treated with anti-Lieberin antibodies containing chemotherapeutic agents.
  • Example 17 Cancers Expressing Liebelin PSTT tissue was collected from each of three patients with placental trophoblastic tumors (PSTT). Frozen sections were prepared from the PSTT tissue. The frozen sections were immunostained with 5-23 antibody. The immunostaining revealed that Liebelin was expressed throughout the tumor tissue.
  • Example 17 demonstrates that pharmaceutical compositions comprising anti- Kunststofferin antibodies can treat tumors that express wealthin (eg, PSTT).

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Abstract

リーベリンに結合する物質を含む、がんを処置するための医薬組成物；がんの再発および／または転移を特定する方法；リーベリンを発現するがん細胞を障害する物質の特定方法；がんの再発および／または転移に影響を及ぼす因子を特定する方法；並びにがん幹細胞のバイオマーカーとしてのリーベリンの使用。

Description

がんを処置するための医薬組成物
　本開示は、医薬の分野に関する。より具体的には、本開示は、がんを処置するための医薬組成物に関する。本開示は、がんの再発、転移または抵抗性を分析する方法に関する。本開示は、リーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質を特定する方法に関する。本開示は、がんの再発、転移または抵抗性に影響を及ぼす因子を特定する方法に関する。本開示は、がん幹細胞のバイオマーカーとしてのリーベリンの使用に関する。
　がんを早期に発見し、適切な処置を受けることで、がん患者の生存率は向上する。がん細胞は、腫瘍組織から離れて血管中に入り、他の組織に転移することがある。血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、がんの転移および再発の要因と考えられている。
　リーベリンは、胎盤の絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）で発現されるユニークな糖タンパク質である（特許文献１および非特許文献１～６）。
　多くの手術不能ながんは、化学療法および放射線療法で治療される。しかし、これらの療法でがん細胞を完全に排除することは困難である。これらの療法に抵抗性のがん細胞が、がんの再発および／または転移に関与し得る。がんの再発および／または転移に関与するがん細胞として、がん幹細胞が注目されている。がん幹細胞は、腫瘍内に存在し、自己増殖期から外れた静止期（Ｇ０期）で存在し得る。また、がん幹細胞は、自己増殖能を有し、自己と同じがん幹細胞と、分化したがん細胞とに分裂し得る。このような分裂は、非対称分裂と呼ばれる。がん幹細胞は、これらの特徴を有するため、化学療法などの通常のがん療法に抵抗性であり得る。
特開２００５－１６０４７３号公報
Fujiwara H, et. al., "Promoting Roles of Embryonic Signals in Embryo Implantation and Placentation in Cooperation with Endocrine and Immune Systems. Int J Mol Sci. 2020 Mar 10;21(5):1885. doi: 10.3390/ijms21051885. Horie A, et. al., Laeverin/aminopeptidase Q induces trophoblast invasion during human early placentation. Hum Reprod. 2012 May;27(5):1267-76. doi: 10.1093/humrep/des068. Fujiwara H, et. al., Human extravillous trophoblasts express laeverin, a novel protein that belongs to membrane-bound gluzincin metallopeptidases. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 23;313(4):962-8. Maruyama M, et. al., Histidine 379 of human laeverin/aminopeptidase Q, a nonconserved residue within the exopeptidase motif, defines its distinctive enzymatic properties. J Biol Chem. 2009 Dec 11;284(50):34692-702. doi: 10.1074/jbc.M109.066712. Maruyama M, et. al., Laeverin/aminopeptidase Q, a novel bestatin-sensitive leucine aminopeptidase belonging to the M1 family of aminopeptidases. J Biol Chem. 2007 Jul 13;282(28):20088-96. doi: 10.1074/jbc.M702650200. Imakawa K, et. al., Interferon-like sequence of ovine trophoblast protein secreted by embryonic trophectoderm. Nature. 1987 Nov 26-Dec 2;330(6146):377-9. doi: 10.1038/330377a0.
　本開示は、がんを処置するための新規医薬組成物を提供することを１つの目的とする。本開示は、がんの再発、転移または抵抗性を分析する新規方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、リーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質を特定する新規方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、がんの再発、転移または抵抗性に影響を及ぼす因子を特定する新規方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、がん幹細胞の新規バイオマーカーを提供することを１つの目的とする。
　本発明者は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）に重要な役割を果たす遺伝子を探索するために、足場非依存的に増殖可能ながん細胞で発現レベルが変化する遺伝子に着目した。本発明者は、リーベリンが、接着培養により足場依存的に培養したがん細胞では発現されていないが、浮遊培養により足場非依存的に培養したがん細胞で発現されるようになること、および生体試料由来のＣＴＣで発現していることを見出した。本発明者は、リーベリンを発現するがん細胞が、リンパ節転移に関与することを見出した。本発明者は、リーベリンを発現しているがん細胞が、Ｔ細胞の機能抑制および制御性Ｔ細胞の分化誘導に関与するインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１（ＩＤＯ１）を発現していることを更に見出した。また、本発明者は、リーベリンを発現している細胞との接触により、単球がＩＤＯ１を発現する樹状細胞に分化誘導されることを見出した。これらの知見は、リーベリンを発現しているがん細胞が、免疫系からの攻撃を回避し得る腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を形成することを示す。本発明者は、これらの知見に基づき、リーベリンを発現しているがん細胞が再発、転移または抵抗性に重要な役割を果たすことを見出し、本発明を完成させた。
　本発明者は、更に、原発巣腫瘍組織の内部で、壊死したがん細胞に囲まれて生存するがん細胞がリーベリンを発現することを見出した。本発明者は、これらのリーベリンを発現するがん細胞は、自らの細胞増殖速度を抑制する等して、周囲のがん細胞が死滅するような環境下での生存可能となると考えた。この特性は、がん幹細胞の特性と類似している。上記したように、リーベリンを発現するがん細胞は、リンパ管およびリンパ節、並びに血管内で免疫系からの攻撃を回避して転移可能であることが示された。これらの知見に基づき、本発明者は、リーベリンを発現するがん細胞が、がん幹細胞であり得ることを見出し、本発明を完成させた。
　本開示は、下記する発明を提供する。
［項１］　リーベリンに結合する物質を含む、がんを処置するための医薬組成物。
［項２］　前記リーベリンに結合する物質が、抗リーベリン抗体を含む、項１に記載の医薬組成物。
［項３］　前記抗リーベリン抗体が、
（Ａ）　アミノ酸配列：ＧＹＳＦＴＤＹＩ（配列番号１）を含むＣＤＲ－Ｈ１；　アミノ酸配列：ＩＮＰＹＨＡＧＩ（配列番号２）を含むＣＤＲ－Ｈ２；および　アミノ酸配列：ＡＲＧＳＮＹＶＹＹＹＡＭＤ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または　アミノ酸配列：ＳＳＶＳＹ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｌ１；　アミノ酸配列：ＡＴＳを含むＣＤＲ－Ｌ２；および　アミノ酸配列：ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
（Ｂ）　アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｈ１；　アミノ酸配列：ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ２；および　アミノ酸配列：ＡＲＤＹＧＳＲＹＹＡＭＤ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または　アミノ酸配列：ＥＮＶＶＴＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｌ１；　アミノ酸配列：ＧＡＳを含むＣＤＲ－Ｌ２；および　アミノ酸配列：ＧＱＧＹＳＹＰ（配列番号１５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、
（Ｃ）　アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｈ１；　アミノ酸配列：ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ２；および　アミノ酸配列：ＡＲＤＹＧＳＲＹＹＡＭＤ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または　アミノ酸配列：ＳＴＩＳＹ（配列番号１６）を含むＣＤＲ－Ｌ１；　アミノ酸配列：ＤＴＳを含むＣＤＲ－Ｌ２；および　アミノ酸配列：ＱＱＷＳＳＮＰＰ（配列番号１７）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、あるいは
（Ｄ）　アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号１８）を含むＣＤＲ－Ｈ１；および　アミノ酸配列：ＩＹＰＲＳＧＨＳ（配列番号１９）を含むＣＤＲ－Ｈ２を含む重鎖可変領域、および／または　アミノ酸配列：ＱＳＬＬＹＳＮＩＱＫＮＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲ－Ｌ１；　アミノ酸配列：ＷＡＳを含むＣＤＲ－Ｌ２；および　アミノ酸配列：ＱＱＹＹＳＹＰ（配列番号２１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む、項２に記載の医薬組成物。
［項４］　前記抗リーベリン抗体が、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を有する、項２または項３に記載の医薬組成物。
［項５］　前記リーベリンに結合する物質が、細胞傷害剤を含む、項１～項４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項６］　前記細胞傷害剤が、放射性同位体、化学療法剤、毒素、および酵素からなる群より選択される少なくとも１種を含む、項５に記載の医薬組成物。
［項７－１］　前記がんが、再発がん、転移性のがん、または抵抗性がん、あるいは絨毛がん、胎盤部トロフォブラスト腫瘍、卵巣がん、卵管がん、子宮がん、子宮頸がん、乳がん、乳腺がん、膠芽腫、大腸がん、前立腺がん、または白血病である、項１～項６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項７－２］　がんの再発、転移または抵抗性を予防するための、項１～項６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項８］　がんの再発、転移または抵抗性を分析する方法であって、
　その必要のある対象由来の生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞を、リーベリンに結合する物質を用いて検出すること、および
　検出結果に基づいて、がんの再発、転移または抵抗性を分析することを含む、方法。
［項９］　被験物質と接触可能な条件下でリーベリンを発現しているがん細胞を培養すること、および
　培養結果に基づいて、前記被験物質を、リーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質と特定することを含む、リーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質の特定方法。
［項１０］　リーベリンを発現しているがん細胞と、リーベリンを発現していないが、前記がん細胞と起源が同じがん細胞とを比較し、遺伝的因子またはタンパク質性因子の相違を特定することを含む、がんの再発、転移または抵抗性に影響を及ぼす因子を特定する方法。
［項１１］　がん幹細胞のバイオマーカーとしての、リーベリンの使用。
図１ａ～図１ｃは、接着培養したＭＣＦ７細胞におけるリーベリン（ＬＶＲＮ）染色画像（図１ａ）、核染色画像（図１ｂ）、および位相差画像とリーベリン染色画像との重ね合わせ画像である（図１ｃ）。図１ｄ～図１ｆは、接着培養した、リーベリンを過剰発現するＳｗａｎ７１細胞におけるリーベリン染色画像（図１ｄ）、核染色画像（図１ｅ）、および位相差画像とリーベリン染色画像との重ね合わせ画像である（図１ｆ）。 図２ａおよび図２ｂはそれぞれ、浮遊培養したＭＣＦ７細胞スフェロイドにおけるモノクローナル抗リーベリン抗体である５－２３抗体を用いたリーベリン染色画像および核染色画像である。図２ｃおよび図２ｄはそれぞれ、浮遊培養したＭＣＦ７細胞スフェロイドにおける抗ＬＶＲＮ抗体を用いたリーベリン染色画像および核染色画像である。図２ａ～図２ｄの右下のバーは、５０μｍを示すスケールバーである。 図３ａ～図３ｄは、接着培養したＡ３７５細胞の位相差画像（図３ａ）、リーベリン染色画像（図３ｂ）、核染色画像（図３ｃ）、および前記画像の重ね合わせ画像である（図３ｄ）。図３ｅ～図３ｈは、浮遊培養したＡ３７５細胞スフェロイドの位相差画像（図３ｅ）、リーベリン染色画像（図３ｆ）、核染色画像（図３ｇ）、および前記リーベリン染色画像と核染色画像との重ね合わせ画像である（図３ｈ）。図３ｉ～図３ｌは、接着培養したＡ２７８０細胞の位相差画像（図３ｉ）、リーベリン染色画像（図３ｊ）、核染色画像（図３ｋ）、および前記画像の重ね合わせ画像である（図３ｌ）。図３ｍ～図３ｐは、浮遊培養したＡ２７８０細胞スフェロイドの位相差画像（図３ｍ）、リーベリン染色画像（図３ｎ）、核染色画像（図３о）、および前記リーベリン染色画像と核染色画像との重ね合わせ画像である（図３ｐ）。図３ａ～図３ｐの右下のバーは、５０μｍを示すスケールバーである。
図４ａは、接着培養したＡ３７５細胞株（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）でのリーベリンｍＲＮＡの転写産物量（１に規格化）に対する、浮遊培養したＡ３７５細胞株（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）での前記ｍＲＮＡ転写産物の相対量を示す棒グラフである。図４ｂは、Ａ２７８０細胞株でのリーベリンｍＲＮＡ転写産物の相対量を示す棒グラフである。図４ｃは、ＣａＳｋｉ細胞株でのリーベリンｍＲＮＡ転写産物の相対量を示す棒グラフである。図４ｄは、ＳｉＨａ細胞株でのリーベリンｍＲＮＡ転写産物の相対量を示す棒グラフである。 図５ａは、リーベリン陽性のスフェロイド（白矢印）を示す蛍光画像である。図５ｂは、図５ａのスフェロイド（白矢印）がＥｐＣＡＭ陽性であることを示す蛍光画像である。図５ｃは、図５ａのスフェロイド（白矢印）がＣＤ４５陰性であることを示す蛍光画像である。図５ｄは、図５ａ～５ｃの蛍光画像の重ね合わせた画像である。図５ａ～図５ｄにおける白四角で囲った画像は、白矢印で示したスフェロイドの拡大画像である。図５ａ～図５ｄの右下のバーは、２０μｍを示すスケールバーである。 図６は、がん細胞スフェロイドでのリーベリン（ＬＶＲＮ）およびＩＤＯ１のそれぞれ相対的な転写レベルを示す棒グラフである。 図７ａは、Ｓｗａｎ７１細胞と直接的な接触が可能な条件下で培養したＴＨＰ－１細胞中の４種の遺伝子（ＯＡＳ２、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３およびＩＳＧ１５）の相対的な発現レベルを示す棒グラフである。図７ｂは、Ｓｗａｎ７１細胞と直接的な接触ができない条件下で培養したＴＨＰ－１細胞中の前記遺伝子の相対的な発現レベルを示す棒グラフである。
図８ａは、様々な濃度の組換えリーベリン（ｒＬＶＲＮ）の存在下で培養したＴＨＰ－１細胞中の４種の遺伝子（ＯＡＳ２、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３およびＩＳＧ１５）の相対的な発現レベルを示す棒グラフである。図８ｂは、ｒＬＶＲＮ固定化ビーズ（◆：ｒＬＶＲＮ＋ｂｅａｄｓ）または遊離型ｒＬＶＲＮ（■：ｒＬＶＲＮ）の存在下で培養したＴＨＰ－１細胞中の前記遺伝子の相対的な発現レベルを示す棒グラフである。 図９ａ～図９ｃは、ＩＮＦ－β（図９ａ）、ＩＮＦ－γ（図９ｂ）、およびｒＬＶＲＮ（図９ｃ）の存在下で培養したＴＨＰ－１細胞でのＩＳＧ１５の相対的な発現レベルをそれぞれ示す棒グラフである。 図１０ａ上図および下図は、それぞれＰＢＳおよびｒＬＶＲＮを添加した培地中で培養した被験者Ａ由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）由来のＣＤ１４陽性細胞の顕微鏡写真である。図１０ｂ上図および下図は、それぞれＰＢＳおよびｒＬＶＲＮを添加した培地中で培養した被験者Ｂ由来のＰＢＭＣｓ由来のＣＤ１４陽性細胞の顕微鏡写真である。 図１１ａ～図１１ｃは、ｒＬＶＲＮ存在下で培養したＣＤ１４陽性細胞（図１１ａ）、ＰＢＭＣｓ（図１１ｂ）、ＴＨＰ－１（図１１ｃ）での遺伝子発現を示した棒グラフである。
図１２ａは、ｒＬＶＲＮ存在下で培養したＰＢＭＣｓに関するＣＤ１４およびＨＬＡ－ＤＲのスキャッタグラムである。図１２ｂは、図１２ａのＱ１分画に関するＣＤ８３のスキャッタグラムである。 図１３ａは、Ｈａｎｇｉｎｇ　Ｄｒｏｐ法によって培養したメラノーマ細胞Ａ３７５（１，０００細胞／培地ドロップ２０μＬ）でのリーベリン発現を示す染色画像である。図１３ｂは、ｐＨｒｏｄｏコンジュゲート抗ＬＶＲＮ抗体の存在下、Ｈａｎｇｉｎｇ　Ｄｒｏｐ法で培養したメラノーマ細胞Ａ３７５（１０細胞／培地ドロップ２０μＬ）での抗ＬＶＲＮ抗体の細胞内取込みを示す染色画像である。 図１４ａは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）をコンジュゲートさせた５－２３抗体の存在下で培養した、卵巣がん細胞ＳＫＯＶ３のスフェロイドのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色画像である。図１４ｂは、５－２３抗体の存在下で培養した、ＳＫＯＶ３スフェロイドのＰＩ染色画像である。図１４ｃは、ＳＫＯＶ３スフェロイドのＰＩ染色画像である。図１４ｄは、ＰＩ染色を行っていないＳＫＯＶ３スフェロイドの画像である。 図１５ａは、リンパ節転移初期部位の染色画像である。図１５ｂは、図１５ａ中の＊を付した実線で囲った領域の拡大画像である。図１５ｃは、図１５ａ中の＊＊を付した実線で囲った領域の拡大画像である。図１５ｄは、リンパ節転移が成立した部位の染色画像である。図１５ｅは、図１５ｄ中で実線で囲った領域の拡大画像である。
図１６ａは、輸出リンパ管付近のリンパ節のリンパ管内皮染色画像である。リンパ管内皮はＰｏｄｏｐｌａｎｉｎにより染色した。図１６ｂは、輸出リンパ管付近のリンパ節のＨＥ染色画像である。図１６ｃは、輸出リンパ管付近のリンパ節の染色画像である。図１６ｄは、図１６ｃ中の＊を付した実線で囲った領域の拡大画像である。図１６ｅは、図１６ｃ中の＊＊を付した実線で囲った領域の拡大画像である。 図１７ａは、原発巣腫瘍中の壊死部分の染色画像である。図１７ｂは、図１７ａ中の＊を付した実線で囲った領域の拡大画像である。図１７ｂは、図１７ａ中の＊＊で付した実線で囲った領域の拡大画像である。図１７ｄは、原発巣腫瘍中の壊死部分以外の部位のＨＥ染色画像である。図１７ｅは、原発巣腫瘍中の壊死部分以外の部位の染色画像である。 図１８ａは、化学療法（ＴＣ療法）適用後の卵巣がん切片のＨＥ染色画像である。図１８ｂは、前記化学療法適用後の卵巣がん切片の抗リーベリン抗体を用いた免疫染色画像である。図１８ｃは、化学療法（ＤＣ療法）適用後の卵巣がん切片のＨＥ染色画像である。図１８ｄは、前記化学療法適用後の卵巣がん切片の抗リーベリン抗体を用いた免疫染色画像である。 図１９は、がん細胞移植マウスでの腫瘍サイズを示す折れ線グラフである。 図２０は、がん細胞株で形成されたスフェロイドにおけるリーベリンの発現レベルを示す一連の棒グラフである。
（医薬組成物）
　本開示の１つの態様は、リーベリンに結合する物質を含む、がんを処置するための医薬組成物に関する。
　用語「リーベリン」または「ＬＶＲＮ」は、胎盤の絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）の細胞表面抗原として同定された糖タンパク質を意味する。リーベリンのアミノ酸配列は、公的機関が提供するデーバンクのサイトから入手することができる。リーベリンは、例えば、相同性検索ソフトウェア（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）にてデフォルトのパラメータを用いて計算した場合に、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するタンパク質を包含する。リーベリンは、天然の突然変異が導入され、かつその機能を有する変異体を含む。突然変異は、所定のアミノ酸配列における欠失、置換または付加若しくはそれらの組合せであってよい。
　ヒトのリーベリンは、例えば、９９０アミノ酸（配列番号１０）から本質的になる。配列番号１０に記載のアミノ酸配列から本質的になるリーベリンは、例えば、糖鎖付加などの翻訳後修飾を含んでよい。リーベリンは、例えば、その機能を有する限り、配列番号１０に記載のアミノ酸配列において突然変異を有し、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでよい。
　用語「配列同一性」は、最適にアライメント（整列）された２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間で一致するアミノ酸又はヌクレオチドの割合を意味する。配列同一性は、商業的又は公的に入手可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ＋を用いて算出できる。アミノ酸の「欠失」は、所定のアミノ酸配列における任意の位置のアミノ酸残基が失われていること意味する。アミノ酸の「付加」は、所定のアミノ酸配列における任意の位置にアミノ酸残基が追加または挿入されていることを意味する。アミノ酸の「置換」は、所定のアミノ酸配列における任意の位置のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味する。アミノ酸の置換は、例えば保存的置換であってよい。
　「リーベリンに結合する物質」は、所定の結合能でもってリーベリンに結合する任意の物質を含む。リーベリンに結合する物質は、例えば、配列番号１０に記載のアミノ酸配列（ＭＧＰＰＳＳＳＧＦＹＶＳＨＡＶＡＬＬＬＡＧＬＶＡＡＬＬＬＡＬＡＶＬＡＡＬＹＧＨＣＥＲＶＰＰＳＥＬＰＧＬＲＤＳＥＡＥＳＳＰＰＬＲＱＫＰＴＰＴＰＫＰＳＳＡＲＥＬＡＶＴＴＴＰＳＮＷＲＰＰＧＰＷＤＱＬＲＬＰＰＷＬＶＰＬＨＹＤＬＥＬＷＰＱＬＲＰＤＥＬＰＡＧＳＬＰＦＴＧＲＶＮＩＴＶＲＣＴＶＡＴＳＲＬＬＬＨＳＬＦＱＤＣＥＲＡＥＶＲＧＰＬＳＰＧＴＧＮＡＴＶＧＲＶＰＶＤＤＶＷＦＡＬＤＴＥＹＭＶＬＥＬＳＥＰＬＫＰＧＳＳＹＥＬＱＬＳＦＳＧＬＶＫＥＤＬＲＥＧＬＦＬＮＶＹＴＤＱＧＥＲＲＡＬＬＡＳＱＬＥＰＴＦＡＲＹＶＦＰＣＦＤＥＰＡＬＫＡＴＦＮＩＴＭＩＨＨＰＳＹＶＡＬＳＮＭＰＫＬＧＱＳＥＫＥＤＶＮＧＳＫＷＴＶＴＴＦＳＴＴＰＨＭＰＴＹＬＶＡＦＶＩＣＤＹＤＨＶＮＲＴＥＲＧＫＥＩＲＩＷＡＲＫＤＡＩＡＮＧＳＡＤＦＡＬＮＩＴＧＰＩＦＳＦＬＥＤＬＦＮＩＳＹＳＬＰＫＴＤＩＩＡＬＳＳＦＤＮＨＡＭＥＮＷＧＬＭＩＦＤＥＳＧＬＬＬＥＰＫＤＱＬＴＥＫＫＴＬＩＳＹＶＶＳＨＥＩＧＨＱＷＦＧＮＬＶＴＭＮＷＷＮＮＩＷＬＮＥＧＦＡＳＹＦＥＦＥＶＩＮＹＦＮＰＫＬＰＲＮＥＩＦＦＳＮＩＬＨＮＩＬＲＥＤＨＡＬＶＴＲＡＶＡＭＫＶＥＮＦＫＴＳＥＩＱＥＬＦＤＩＦＴＹＳＫＧＡＳＭＡＲＭＬＳＣＦＬＮＥＨＬＦＶＳＡＬＫＳＹＬＫＴＦＳＹＳＮＡＥＱＤＤＬＷＲＨＦＱＭＡＩＤＤＱＳＴＶＩＬＰＡＴＩＫＮＩＭＤＳＷＴＨＱＳＧＦＰＶＩＴＬＮＶＳＴＧＶＭＫＱＥＰＦＹＬＥＮＩＫＮＲＴＬＬＴＳＮＤＴＷＩＶＰＩＬＷＩＫＮＧＴＴＱＰＬＶＷＬＤＱＳＳＫＶＦＰＥＭＱＶＳＤＳＤＨＤＷＶＩＬＮＬＮＭＴＧＹＹＲＶＮＹＤＫＬＧＷＫＫＬＮＱＱＬＥＫＤＰＫＡＩＰＶＩＨＲＬＱＬＩＤＤＡＦＳＬＳＫＮＮＹＩＥＩＥＴＡＬＥＬＴＫＹＬＡＥＥＤＥＩＩＶＷＨＴＶＬＶＮＬＶＴＲＤＬＶＳＥＶＮＩＹＤＩＹＳＬＬＫＲＹＬＬＫＲＬＮＬＩＷＮＩＹＳＴＩＩＲＥＮＶＬＡＬＱＤＤＹＬＡＬＩＳＬＥＫＬＦＶＴＡＣＷＬＧＬＥＤＣＬＱＬＳＫＥＬＦＡＫＷＶＤＨＰＥＮＥＩＰＹＰＩＫＤＶＶＬＣＹＧＩＡＬＧＳＤＫＥＷＤＩＬＬＮＴＹＴＮＴＴＮＫＥＥＫＩＱＬＡＹＡＭＳＣＳＫＤＰＷＩＬＮＲＹＭＥＹＡＩＳＴＳＰＦＴＳＮＥＴＮＩＩＥＶＶＡＳＳＥＶＧＲＹＶＡＫＤＦＬＶＮＮＷＱＡＶＳＫＲＹＧＴＱＳＬＩＮＬＩＹＴＩＧＲＴＶＴＴＤＬＱＩＶＥＬＱＱＦＦＳＮＭＬＥＥＨＱＰＩＲＶＨＡＮＬＱＴＩＫＮＥＮＬＫＮＫＫＬＳＡＲＩＡＡＷＬＲＲＮＴ）からなるリーベリンに、１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、または１０－１０Ｍ以下の解離定数でもって結合する。リーベリンに結合する物質は、例えば、リーベリンに所定の結合能でもって結合するが、リーベリン以外の物質に実質的に結合しない。リーベリン以外の物質に「実質的に結合しない」物質は、リーベリン以外の物質に、１０－４Ｍ以上の解離定数でもって結合する物質を含む。リーベリン以外の物質に実質的に結合しない物質は、例えば、リーベリン以外の物質に、１０－３Ｍ以上または１０－２Ｍ以上の解離定数でもって結合する物質である。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、７５ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１２５ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上、１７５ｋＤａ以上、または２００ｋＤａ以上の分子量を有する。リーベリンに結合する物質は、例えば、５００ｋＤａ未満、４５０ｋＤａ未満、４００ｋＤａ未満、３５０ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、２５０ｋＤａ未満、または２００ｋＤａ未満の分子量を有する。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、低分子化合物、タンパク質（例えば抗体）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。リーベリンに結合する物質は、例えば、抗リーベリン抗体またはリーベリンが結合する受容体もしくはそれらの断片である。リーベリンに結合する物質は、例えば、モノクローナル抗リーベリン抗体またはポリクローナル抗リーベリン抗体である。抗リーベリン抗体は、例えば、ヒト抗体またはヒト化抗体である。リーベリンに結合する物質は、例えば、抗リーベリン抗体と競合する、任意の抗原結合部分、または抗原結合部分を含む融合タンパク質である。
　用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的に結合できる物質を意味する。抗体は、例えば、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、あるいはキメラ抗体、もしくはそれらの抗原結合部分である。抗原結合部分は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディである。抗体は、例えばＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭを含む任意のクラスの抗体またはその抗原結合断片である。抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖（ＶＬ）の可変領域または抗体重鎖（ＶＨ）の可変領域を意味する。抗体重鎖または抗体軽鎖の可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
　ＣＤＲは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＩｇＢＬＡＳＴを用いて同定することができる。抗体の重鎖可変領域は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。抗体の軽鎖可変領域は、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含む。
　用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する。実質的に同種の抗体は、天然の突然変異を含む抗体を排除しない。モノクローナル抗体は、公知の方法に従って調製することができる。
　用語「ヒト化抗体」は、全体的または部分的に非ヒト起源であり、ヒトにおける免疫応答を回避または最小化するために、その非ヒト起源の重鎖および軽鎖のフレームワーク領域内のアミノ酸を置換した抗体を意味する。ヒト化抗体は、例えば、定常ドメインにおいてヒトＣＨドメインおよびＣＬドメインを含む、またはから本質的になる。ヒト化抗体は、例えば、ヒト起源の定常ドメインを含む。
　用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域からなる可変領域ならびに定常領域がともにヒト起源である抗体を意味する。用語「キメラ抗体」は、特定の種起源の定常領域またはその一部分のアミノ酸が、別の種起源のアミノ酸に置き換えられた抗体を意味する。キメラ抗体は、例えば、可変領域がマウスを起源とし、定常領域がヒトを起源とする抗体である。
　抗体は、例えば、天然源（例えば脊椎動物）から単離することで調製することができる。抗体は、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコおよびマウスなどの哺乳動物；ニワトリなどの鳥類；サメなどの魚類；またはラマなどのラクダ科動物から調製することができる。抗体は、例えば、遺伝子工学技術などの技術に従って、人工的に作製することができる。抗体は、例えば、抗体ライブラリーから、リーベリンに対する結合能に基づいて選抜することで調製できる。抗体は、例えば、ファージディスプレイ法を用いて調製できる。
　細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、効率的に、リーベリンを発現しているがん細胞の増殖を抑制または停止、または前記がん細胞を死滅もしくは破壊することができるため、好ましい。がんを処置するための医薬組成物は、好ましくは、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＣＤＤ活性）または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を示す抗リーベリン抗体を含む。がんを処置するための医薬組成物は、好ましくは、細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質を含む。
　用語「抗体依存性細胞傷害活性（ＡＣＤＤ活性）」は、標的細胞を免疫系の免疫細胞が障害する活性を意味する。ＡＣＤＤ活性は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体を有する免疫細胞（例えばマイクロファージおよびナチュラルキーラ細胞）が、Ｆｃ領域を有する抗体が結合した標的細胞（例えば、リーベリンを発現しているがん細胞）を殺傷することで奏される。用語「補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）」は、補体系タンパク質と結合することで、標的細胞を障害する活性を意味する。ＣＤＣ活性は、抗体のＦｃ領域に結合する補体成分が、Ｆｃ領域を有する抗体が結合した標的細胞（例えば、リーベリンを発現しているがん細胞）を溶解させることで奏される。用語「Ｆｃ領域」は、インタクトな抗体をタンパク質分解酵素であるパパインで部分分解して得られるフラグメントに対応する領域を意味する。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、ＡＣＤＤ活性またはＣＤＣ活性を有する抗リーベリン抗体である。前記抗リーベリン抗体は、例えば、Ｆｃ領域を含む。前記抗リーベリン抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、ＡＣＤＤ活性またはＣＤＣ活性を有する抗リーベリン抗体と、後述する細胞傷害剤とを含む。細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、ＡＣＤＤ活性またはＣＤＣ活性を有する抗リーベリン抗体と、放射性同位体、化学療法剤、酵素またはそれらの断片、および毒素からなる群より選択される少なくとも１種とを含む。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　アミノ酸配列：ＧＹＳＦＴＤＹＩ（配列番号１）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ１；
　アミノ酸配列：ＩＮＰＹＨＡＧＩ（配列番号２）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ２；および
　アミノ酸配列：ＡＲＧＳＮＹＶＹＹＹＡＭＤ（配列番号３）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または
　アミノ酸配列：ＳＳＶＳＹ（配列番号４）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ１；
　アミノ酸配列：ＡＴＳを含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ２；および
　アミノ酸配列：ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号５）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗リーベリン抗体（例えばマウス抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体）である。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　アミノ酸配列：ＭＳＳＰＱＰＬＫＴＬＴＬＴＭＧＧＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＴＡＧＡＨＳＥＩＱＬＱＱＴＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＤＹＩＭＬＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＮＩＮＰＹＨＡＧＩＳＹＮＬＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＳＮＹＶＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号６）を含む又はから本質的になる重鎖可変領域、および／または
　アミノ酸配列：ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＦＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号７）を含む又はからなる軽鎖可変領域
を含む、抗リーベリン抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。配列番号６に記載のアミノ酸配列（５－２３抗体ＨＣとも称する）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、および配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。配列番号７に記載のアミノ酸配列（５－２３抗体ＬＣとも称する）は、配列番号４に記載のアミノ酸配列および配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１１）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ１；
　アミノ酸配列：ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号１２）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ２；および
　アミノ酸配列：ＡＲＤＹＧＳＲＹＹＡＭＤ（配列番号１３）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または
　アミノ酸配列：ＥＮＶＶＴＹ（配列番号１４）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ１；
　アミノ酸配列：ＧＡＳを含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ２；および
　アミノ酸配列：ＧＱＧＹＳＹＰ（配列番号１５）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗リーベリン抗体（例えばマウス抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体）である。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１１）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ１；
　アミノ酸配列：ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号１２）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ２；および
　アミノ酸配列：ＡＲＤＹＧＳＲＹＹＡＭＤ（配列番号１３）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または
　アミノ酸配列：ＳＴＩＳＹ（配列番号１６）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ１；
　アミノ酸配列：ＤＴＳを含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ２；および
　アミノ酸配列：ＱＱＷＳＳＮＰＰ（配列番号１７）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗リーベリン抗体（例えばマウス抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体）である。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号１８）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ１；および
　アミノ酸配列：ＩＹＰＲＳＧＨＳ（配列番号１９）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ２を含む重鎖可変領域、および／または
　アミノ酸配列：ＱＳＬＬＹＳＮＩＱＫＮＹ（配列番号２０）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ１；
　アミノ酸配列：ＷＡＳを含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ２；および
　アミノ酸配列：ＱＱＹＹＳＹＰ（配列番号２１）を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗リーベリン抗体（例えばマウス抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体）である。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　アミノ酸配列：ＭＧＷＳＹＩＩＬＦＬＬＡＴＡＴＣＶＨＳＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＮＷＶＲＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＹＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＫＤＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＶＨＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＨＣＡＲＤＹＧＳＲＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号２２）を含む又はから本質的になる重鎖可変領域、および／または
　アミノ酸配列：ＭＧＩＫＭＥＳＱＴＬＶＦＩＳＩＬＬＷＬＹＧＡＤＧＮＩＶＭＴＱＳＰＫＳＭＳＭＳＶＧＥＲＶＴＬＴＣＫＡＳＥＮＶＶＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＥＱＳＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＡＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＤＹＨＣＧＱＧＹＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号２３）を含む又はからなる軽鎖可変領域
を含む、抗リーベリン抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。配列番号２２に記載のアミノ酸配列（９４－２／１２９－５抗体ＨＣとも称する）は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列、配列番号１２に記載のアミノ酸配列、および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む。配列番号２３に記載のアミノ酸配列（９４－２抗体ＬＣとも称する）は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　アミノ酸配列：ＭＧＷＳＹＩＩＬＦＬＬＡＴＡＴＣＶＨＳＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＮＷＶＲＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＹＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＫＤＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＶＨＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＨＣＡＲＤＹＧＳＲＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＤＴＤＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ（配列番号２２）を含む又はから本質的になる重鎖可変領域、および／または
　アミノ酸配列：ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＩＳＲＧＱＩＶＬＴＱＳＰＴＩＭＳＶＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＴＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＴＳＭＧＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号２４）を含む又はからなる軽鎖可変領域
を含む、抗リーベリン抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。配列番号２４に記載のアミノ酸配列（１２９－５抗体ＬＣとも称する）は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列および配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　アミノ酸配列：ＭＥＷＩＷＩＦＬＦＩＬＳＧＴＡＧＶＨＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＧＰＧＴＳＶＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＩＤＷＶＫＱＲＴＧＱＧＬＥＷＩＧＥＩＹＰＲＳＧＨＳＫＹＮＥＫＦＥＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＬＹＹＹＧＳＳＨＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＴＶＤＫＫＬＥＰＳＧＰＩＳＴＩＮＰＣＰＰＣＫＥＣＨＫＣＰＡＰＮＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＩＫＧＬＶＲＡＰＱＶＹＩＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号２５）を含む又はから本質的になる重鎖可変領域、および／または
　アミノ酸配列：ＭＤＳＱＡＱＶＬＭＬＬＬＬＷＶＳＧＴＣＧＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＴＶＳＶＧＥＲＶＴＭＳＣＲＳＳＱＳＬＬＹＳＮＩＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号２６）を含む又はからなる軽鎖可変領域
を含む、抗リーベリン抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。配列番号２５に記載のアミノ酸配列（５－２３Ｊ抗体ＨＣとも称する）は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列および配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む。配列番号２６に記載のアミノ酸配列（５－２３Ｊ抗体ＬＣとも称する）は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列および配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、重鎖のＣＤＲ－Ｈ１（配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｈ３（配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば抗原結合部分または重鎖可変領域）である。リーベリンに結合する物質は、例えば、軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１（配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｌ２（アミノ酸配列ＡＴＳを含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｌ３（配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば抗原結合部分または軽鎖可変領域）である。リーベリンに結合する物質は、例えば、重鎖のＣＤＲ－Ｈ１（配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｈ３（配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、および軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１（配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｌ２（アミノ酸配列ＡＴＳを含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｌ３（配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、重鎖のＣＤＲ－Ｈ１（配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｈ３（配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば抗原結合部分または重鎖可変領域）である。リーベリンに結合する物質は、例えば、軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１（配列番号１４又は１６に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｌ２（アミノ酸配列ＡＴＳ又はＷＡＳを含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｌ３（配列番号１５又は１７に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば抗原結合部分または軽鎖可変領域）である。リーベリンに結合する物質は、例えば、重鎖のＣＤＲ－Ｈ１（配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｈ３（配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、および軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１（配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｌ２（アミノ酸配列ＡＴＳを含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｌ３（配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。リーベリンに結合する物質は、例えば、重鎖のＣＤＲ－Ｈ１（配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｈ３（配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、および軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１（配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｌ２（アミノ酸配列ＤＴＳを含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｌ３（配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、重鎖のＣＤＲ－Ｈ１（配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｈ２（配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば抗原結合部分または重鎖可変領域）である。リーベリンに結合する物質は、例えば、軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１（配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｌ２（アミノ酸配列ＷＡＳを含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｌ３（配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば抗原結合部分または軽鎖可変領域）である。リーベリンに結合する物質は、例えば、重鎖のＣＤＲ－Ｈ１（配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｈ２（配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、および軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１（配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）、ＣＤＲ－Ｌ２（アミノ酸配列ＷＡＳを含む又はから本質的になる）およびＣＤＲ－Ｌ３（配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む又はから本質的になる）を含むマウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はから本質的になる重鎖、および／または配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はから本質的になる軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｈ２および配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む若しくはからなり、および前記軽鎖が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＡＴＳを含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号５に記載のアミノ酸を含む若しくはからなるＣＤＲ－Ｌ３を含む、抗リーベリン抗体（例えば、マウス抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体）である。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　ヌクレオチド配列：ATGTCCTCTCCACAGCCCCTGAAGACACTGACTCTAACCATGGGAGGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGCCCACTCTGAGATCCAGCTGCAGCAGACTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCCGGTTATTCATTCACTGACTACATCATGCTCTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTTACCATGCTGGTATTAGCTACAATCTGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCTTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGGAGTAATTACGTCTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCCAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA（配列番号８）にコードされた重鎖可変領域、および／または
　ヌクレオチド配列：ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATTCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTTTGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT（配列番号９）にコードされた軽鎖可変領域
を含む抗リーベリン抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。配列番号８に記載のヌクレオチド配列は、配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする。配列番号９に記載のヌクレオチド配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　ヌクレオチド配列：ATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTCTTGTTAGCAACAGCTACATGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACGTTCACCAGCTACTGGATGAACTGGGTTAGGCAGAGGCCTGAGCAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTTACGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCATTTTGACTGTAGACAAATCCTCCAGTACAGTCCACATGCAACTAAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATCACTGTGCAAGAGACTACGGTAGTAGGTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCCAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA（配列番号２７）にコードされた重鎖可変領域、および／または
　ヌクレオチド配列：ATGGGCATCAAGATGGAATCACAGACTCTGGTCTTCATATCCATACTGCTCTGGTTATATGGAGCTGATGGGAACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACCTTGACCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGTTACTTATGTTTCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGGGTTACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG（配列番号２８）にコードされた軽鎖可変領域
を含む抗リーベリン抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。配列番号２７に記載のヌクレオチド配列は配列番号２２に記載のアミノ酸配列をコードする。配列番号２８に記載のヌクレオチド配列は配列番号２３に記載のアミノ酸配列をコードする。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　ヌクレオチド配列：ATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTCTTGTTAGCAACAGCTACATGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACGTTCACCAGCTACTGGATGAACTGGGTTAGGCAGAGGCCTGAGCAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTTACGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCATTTTGACTGTAGACAAATCCTCCAGTACAGTCCACATGCAACTAAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATCACTGTGCAAGAGACTACGGTAGTAGGTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCCAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA（配列番号２７）にコードされた重鎖可変領域、および／または
　ヌクレオチド配列：ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAACAATCATGTCTGTATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAACTATAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCACCAGCATGGGGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG（配列番号２９）にコードされた軽鎖可変領域
を含む抗リーベリン抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。配列番号２９に記載のヌクレオチド配列は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列をコードする。
　リーベリンに結合する物質は、例えば、
　ヌクレオチド配列：ATGGAATGGATCTGGATCTTTCTCTTCATCCTCTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGGGGCCCGGGACTTCAGTGAGGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTACTACATAGACTGGGTGAAGCAGAGGACTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTATCCTAGAAGTGGTCATTCTAAGTACAACGAGAAGTTCGAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCCCTCTATTACTACGGCAGTAGTCACTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCACGGTGGACAAAAAACTTGAGCCCAGCGGGCCCATTTCAACAATCAACCCCTGTCCTCCATGCAAGGAGTGTCACAAATGCCCAGCTCCTAACCTCGAGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAATATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGACACCCAAGGTCACGTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGACGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTATCCGGGTGGTCAGCACCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCATCACCCATCGAGAGAACCATCTCAAAAATTAAAGGGCTAGTCAGAGCTCCACAAGTATACATCTTGCCGCCACCAGCAGAGCAGTTGTCCAGGAAAGATGTCAGTCTCACTTGCCTGGTCGTGGGCTTCAACCCTGGAGACATCAGTGTGGAGTGGACCAGCAACGGGCATACAGAGGAGAACTACAAGGACACCGCACCAGTCCTGGACTCTGACGGTTCTTACTTCATATATAGCAAGCTCAATATGAAAACAAGCAAGTGGGAGAAAACAGATTCCTTCTCATGCAACGTGAGACACGAGGGTCTGAAAAATTACTACCTGAAGAAGACCATCTCCCGGTCTCCGGGTAAATGA（配列番号３０）にコードされた重鎖可変領域、および／または
　ヌクレオチド配列：ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAACTGTGTCAGTTGGAGAGAGGGTTACTATGAGCTGCAGGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAACATTCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCGGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG（配列番号３１）にコードされた軽鎖可変領域
を含む抗リーベリン抗体（例えば、抗原結合部分、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ）である。配列番号３０に記載のヌクレオチド配列は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列をコードする。配列番号３１に記載のヌクレオチド配列は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列をコードする。
　「細胞傷害剤」は、細胞の増殖を抑制または停止すること、または細胞を死滅もしくは破壊し得る物質を含む。細胞傷害剤は、例えば、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２またはＬｕの放射性同位体）；化学療法剤（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メトトレキサート、ゲムシタビン、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド、シスプラチン、イフォマイド、ダカルバジンン、カルボプラチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、カルボプラチン、ビノレルビン、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、エルロチニブまたは他のインターカレート剤、あるいは成長阻害剤）；核酸分解酵素などの酵素、またはその断片；毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素、若しくはそれらの断片および／または変異体を含む）；もしくはそれらの組合せであってよい。
　「細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質」は、例えば、リーベリンに結合する物質と、細胞傷害剤とを結合させることで製造できる。前記結合は、例えば、直接的な結合または間接的な結合であってよい。直接的な結合は、例えば共有結合である。直接的な結合は、例えば、過ヨウ素酸法、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド法によって形成される。リーベリンに結合する物質と、細胞傷害剤との直接的な結合は、例えば、リーベリンに結合する物質と、細胞傷害剤とがリンカーを介して共有結合で結合することを含む。間接的な結合は、例えば非共有結である。間接的な結合は、例えば、ビオチン－ストレプトアビジンの結合を介して形成される。
　細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、少なくとも１種の抗リーベリン抗体と、放射性同位体および化学療法剤、酵素またはそれらの断片、および毒素からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種または３種以上）の細胞傷害剤とを含む。細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、１種のリーベリンに結合する物質と、放射性同位体、化学療法剤、酵素またはそれらの断片、および毒素からなる群より選択される１種の細胞傷害剤とを含む。細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、抗リーベリン抗体と、化学療法剤または放射性同位体もしくはそれらの組合せとを含む。細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、抗リーベリン抗体と、化学療法剤とを含む。
　細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、１個のリーベリンに結合する物質と、少なくとも１個（例えば、１個、２個または３個以上）の細胞傷害剤とを含む。細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、１個の抗リーベリン抗体と、放射性同位体、化学療法剤、酵素またはそれらの断片、および毒素からなる群より選択される１種の細胞傷害剤の複数個とを含む。細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、１個の抗リーベリン抗体と、複数個の化学療法剤または放射性同位体もしくはそれらの組合せとを含む。細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、１個の抗リーベリン抗体と、複数個又は１個の化学療法剤とを含む。
　用語「がん細胞」は、制御されていない細胞増殖および／または侵襲的特性を示す細胞を意味する。がん細胞は、例えば、足場依存的または足場非依存的に増殖する。がん細胞は、複数個の細胞が集まった浮遊細胞塊を形成し得る。がん細胞は、例えば、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である。用語「血中循環腫瘍細胞」または「ＣＴＣ」は、原発巣腫瘍組織または転移腫瘍組織から分離しており、血流中を循環するがん細胞を意味する。がん細胞は、例えば、血管内またはリンパ管内に存在するリーベリンを発現するがん細胞である。
　用語「ＩＤＯ１」または「インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１」は、トリプトファンをキヌレニンに代謝するキヌレニン経路の律速酵素を意味する（日薬理誌（Ｆｏｌｉａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）１４２，８５－８８（２０１３）参照）。腫瘍細胞においてＩＤＯ１が高発現すると、前記腫瘍細胞周辺のＴ細胞およびＮＫ細胞は、その増殖が抑制され、またはアポトーシスする（日薬理誌(Ｆｏｌｉａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）１４２，８５－８８（２０１３）参照）。ＩＤＯ１により、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化が誘導される。ＴｒｅｇがＩＤＯ１を発現するがん細胞の周辺環境に集積することで、前記がん細胞の生存が助長される（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ＩＤＯ１　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ：ｆｒｏｍ　ｂｅｎｃｈ　ｔｏ　ｂｅｄｓｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　＆　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１８）１１：１００）。頭頸部扁平上皮がんの治療を受けた対象集団において、血液中のＣＴＣからＩＤＯ１をコードするｍＲＮＡが検出された対象グループは、当該ｍＲＮＡが検出されなかった対象グループに比べて、全生存期間が短かった（Economopoulou P, et. al., Prognostic impact of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 <i>(IDO1)</i> mRNA expression on circulating tumour cells of patients with head and neck squamous cell carcinoma. ESMO Open. 2020 May;5(3):e000646. doi: 10.1136/esmoopen-2019-000646. PMID: 32414944; PMCID: PMC7232623.）。ＩＤＯ１は、例えば、ＩＤＯ１をコードするｍＲＮＡを検出または定量することで、測定できる。前記ｍＲＮＡは、例えば、逆転写酵素を用いた定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）にて検出または定量できる。
　本開示の実施例は、再発および／または転移がん患者由来の血液試料中に、リーベリンを発現するＣＴＣが存在したことを示す。本開示はまた、前記ＣＴＣがインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１（ＩＤＯ１）を発現したことを示す。本開示の医薬組成物により処置され得るがんは、例えば、リーベリンを発現しているがん細胞（例えばＣＴＣ）が検出された対象におけるがんである。本開示の医薬組成物により処置され得るがんは、例えば、リーベリンおよびＩＤＯ１を発現しているがん細胞（例えばＣＴＣおよびリンパ管内を浮遊するがん細胞）が検出された対象におけるがんである。本開示の医薬組成物により処置されるがんは、例えば、化学療法および／または放射線療法で処置された後のがんである。
　本開示の実施例は、リーベリンを発現しているがん細胞が、自身が発現しているＩＤＯ１および前記がん細胞周辺で単球から分化誘導され得る樹状細胞で発現されるＩＤＯ１により、免疫系からの攻撃を回避できるような腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を形成することを示唆する。本開示の実施例は、リーベリンに結合する物質が、前記がん細胞においてＩＤＯ１が発現されることを阻害し、および前記がん細胞との接触による単球からＩＤＯ１を発現する樹状細胞への分化を阻止し得ることを示唆する。リーベリンに結合する物質ががん細胞の細胞膜上のリーベリンと結合することで、例えばその結合による立体障害によって、前記がん細胞が免疫系からの攻撃を回避可能となるＴＭＥの形成が阻害され、前記がん細胞が免疫系からの攻撃を受けるようにし得る。したがって、リーベリンに結合する物質は、がんを処置するための医薬組成物の製造に利用することができる。
　用語「がん」は、広い範囲の腫瘍を意味する。腫瘍は、例えば、肺がん、前立腺がん、乳がん、乳腺がん、膵臓がん、胃がん、直腸がん、結腸がん、結腸直腸がん、甲状腺のがん、肝臓がん、胆がん、神経膠腫、神経膠芽腫、子宮がん、子宮頸がん、腎臓がん、卵巣がん、卵管がん、食道がん、メラノーマ、肉腫、血液がん、基底細胞がん、扁平上皮細胞がんを含む。本開示の実施例は、リーベリンを発現する又は発現することができる（例えば、リンパ管内を浮遊している等の細胞の生存に過酷な状況下又は化学療法剤の存在下で）がん細胞は、がんの転移（例えば全身転移）および／または再発（例えば局所的な再発）に重要な役割を果たすことを示す。本開示の医薬組成物により予防または処置されるがんは、例えば、再発がん、転移性がん、または抵抗性がんである。
　本開示の実施例は、胎盤部トロフォブラスト腫瘍がリーベリンを発現することを示す。また、本開示の実施例は、末梢血単核球のうちＢ細胞および単球がリーベリンを発現することを示す。本開示に係る医薬組成物により予防または処置されるがんは、例えば、絨毛がん、胎盤部トロフォブラスト腫瘍、卵巣がん、卵管がん、子宮がん、子宮頸がん、膠芽腫、大腸がん、前立腺がん、または白血病である。前記がんは、例えば、絨毛がん、胎盤部トロフォブラスト腫瘍、卵巣がん、卵管がん、子宮がん、子宮頸がん、または白血病である。前記がんは、例えば、絨毛がん、胎盤部トロフォブラスト腫瘍、卵巣がん、卵管がん、子宮がん、または子宮頸がんである。前記がんは、例えば、絨毛がんまたは胎盤部トロフォブラスト腫瘍である。本開示に係る医薬組成物は、例えば、細胞傷害剤がコンジュゲートされていてよいリーベリンに結合する物質（例えば、ＭＭＡＥコンジュゲート抗リーベリン抗体）を含む。
　本開示の実施例は、抗リーベリン抗体自体（細胞傷害剤を含まない）が、卵巣がん細胞に細胞死を誘導することを示す。また、本開示の実施例は、抗リーベリン抗体（細胞傷害剤を含まない）が、乳がん細胞株およびメラノーマでは細胞死に細胞死を誘導しないことを示す。細胞傷害剤を含まないリーベリンに結合する物質を含む医薬組成物により予防または処置されるがんは、例えば、絨毛がん、胎盤部トロフォブラスト腫瘍、卵巣がん、卵管がん、子宮がん、子宮頸がん、膠芽腫、大腸がん、前立腺がん、または白血病である。前記がんは、例えば、絨毛がん、胎盤部トロフォブラスト腫瘍、卵巣がん、卵管がん、子宮がん、または子宮頸がんである。前記がんは、例えば、卵巣がん、卵管がん、子宮がん、または子宮頸がんである。
　「がんの再発」または「再発がん」は、がんが化学療法および／または外科手術を含む処置に応答した後に、がん細胞が原発部位または遠位部位のいずれかもしくはその両方で増殖すること、またはその可能性があることを意味する。局所的再発がんは、前記処置への応答後に原発部位でがん細胞が増殖すること、またはその可能性があることを意味する。「がんの転移」または「転移がん」は、がん細胞が、体の１つの部分（例えば子宮）から体の別の部分（例えば肺）に広がること、またはその可能性があることを意味する。再発がん、または転移がんは、例えば、公知の基準に照らして、再発または転移する危険性があると特定されたがん、または再発もしくは転移したがんである。転移がんは、外科手術を含む処置が行われた後のがんであっても、未処置のがんであってもよい。
　「抵抗性がん」は、化学療法または免疫療法などの生物学的療法を含むがん療法が対象に適用されているにもかかわらず、前記対象においてがん細胞が増殖すること、またはその可能性があることを意味する。「がん療法」は、哺乳動物におけるがんの治療で使用される、治療剤（例えば、放射性同位体および化学療法剤（免疫療法剤を含む））、放射線療法、および外科手術などの外科的介入を含む。
　「医薬組成物」は、がんを予防又は処置するための少なくとも１種の有効成分、および医薬上許容される担体を含む、混合物である。本開示に係る医薬組成物は、例えば、本開示に係るリーベリンに結合する物質、および医薬上許容される担体を含む。医薬組成物は、本開示に係るリーベリンに結合する物質の効果を損なわない範囲で、がんを予防又は処置するための他の有効成分（例えば化学療法剤）を併用してもよい。併用は、本開示に係るリーベリンに結合する物質を投与する前に、後に、または同時に、前記他の有効成分を投与することを含む。がんが抵抗性のがんである場合、本開示に係る医薬組成物は、化学療法などのがん療法の適用後または適用中に投与してよい。
　医薬組成物は、例えば、固体形態または液体形態であってよい。医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、粉剤、液剤、懸濁剤、注射剤、または坐剤であってよい。医薬組成物は、公知の方法に従って調製することができる。医薬組成物は、例えば、本開示に係るリーベリンに結合する物質と、医薬上許容される担体とを混合することにより調製することができる。本開示に係る医薬組成物は、公知の投与方法により対象に投与することができる。公知の投与方法は、例えば、経口投与および非経口投与を含む。非経口投与は、例えば、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈注射、および皮下投与を含む。
　「処置する」または「処置」は、対象において少なくとも１種の症状を除去、軽減または緩和すること、全生存期間を延長すること、応答持続期間を延長すること、疾患の進行を遅らせること、或いは症状の発症を防もしくは遅らせることを含む。がんの処置は、例えば、がんの症状の軽減、または完全な根絶を含む。がんの処置は、例えば、再発がん、転移がん、または抵抗性がんの予防または処置を含む。
　本態様の１つの実施形態は、再発がん、転移がん、抵抗性がんを処置するための医薬組成物を提供する。本開示に係る医薬組成物を、がんを患う対象に投与することで、前記対象におけるがんを処置することができる。本開示の１つの態様は、その必要のある対象に、本開示に係る医薬組成物を投与することを含む、がんの処置方法を提供する。本態様において、その必要のある対象は、再発がん、転移がん、または抵抗性がんを処置または予防する必要がある対象を含む。その必要のある対象は、例えば、がん療法を受けた後のがん患者であっても、受ける前のがん患者であってもよい。本開示の他の態様は、その必要のある対象に、本開示に係る医薬組成物を投与することを含む、がんの再発および／または転移を予防する方法を提供する。本態様に係る医薬組成物は、本開示に係るリーベリンに結合する物質を含み、好ましくは、前記リーベリンに結合する物質は本開示に係る細胞傷害剤を含む。
　用語「医薬上許容される担体」は、対象において安全性が高く、アレルギー反応性が小さい、本開示に係る治療剤以外の任意の成分を意味する。医薬上許容される担体は、例えば、医薬投与に適した水性若しくは非水性溶媒、溶液（例えば生理食塩水）、凍結防止剤（例えばグリセロール）、水溶性高分子（例えばデキストラン）、または緩衝剤（例えばリン酸緩衝液）を含む。
　「対象」は、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物である。ヒト以外の哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類；チンパンジーなどの非ヒト霊長類；牛、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目；ウマなどの奇蹄目；ウサギ、イヌ、ネコなどの愛玩動物である。対象は、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、サル、ゴリラ、テナガザルおよびオラウータン）である。対象は、好ましくはヒトである。
（がんの再発、転移または抵抗性を分析する方法）
　本開示の１つの態様は、その必要のある対象由来の生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞を、リーベリンに結合する物質を用いて検出すること、および検出結果に基づいて、がんの再発、転移または抵抗性を分析することを含む、方法を提供する。
　「その必要のある対象」は、例えば、特定の診断基準に基づいて専門家により、がんに罹患していると特定された対象である。その必要のある対象は、例えば、がんのステージ分類（例えば国際対がん連合（ＵＩＣＣ）が提示するＴＮＭ分類）において、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、またはＩＶ期のがんに罹患している対象であってよい。その必要のある対象は、例えば、ＩＩ期、ＩＩＩ期またはＩＶ期のがんに罹患している対象である。その必要のある対象は、例えば、ＩＩＩ期またはＩＶ期のがんに罹患している対象である。
　「生体試料」は、対象から採取された任意の組織、組織片または体液を含む。生体試料は、例えば、リーベリンを発現しているがん細胞を含むことが期待される組織、組織片または体液である。生体試料は、例えば、対象から採取された組織、組織片または体液自体であってよく、それらに保存処理または不純物の除去処理を施した試料であってよい。生体試料は、例えば、原発巣腫瘍組織の一部、転移腫瘍組織の一部、リンパ節を含むリンパ組織、組織ホモジネート、体液（例えば、血液、血球成分を含む分画、リンパ液、膵液、胆汁、腹水）である。生体試料は、例えば、リンパ液またはリンパ組織である。生体試料は、例えば、全血または末梢血単核球を含む画分である。末梢血単核球を含む画分は、例えば、全血を密度勾配遠心分離および比重遠心（例：Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標））に供して調製することができる。生体試料は、好ましくは血液試料またはリンパ液、より好ましくは血液試料である。
　用語「リーベリンを発現しているがん細胞」は、膜結合型のリーベリンを発現しているがん細胞を意味する。リーベリンを発現しているがん細胞は、単一のがん細胞の状態であってよく、または複数のリーベリンを発現しているがん細胞を含む細胞塊（「スフェロイド」とも称する）の状態であってもよい。前記スフェロイドは、例えば、リーベリンを発現しているがん細胞およびリーベリンを発現していないがん細胞を含んでよい。前記スフェロイドは、例えば、リーベリンを発現しているがん細胞から本質的になる。前記スフェロイドは、例えば、リーベリンを発現しているがん細胞のみからなる。
　リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、足場非依存的に増殖可能である。リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、血中で生存可能である。リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、リンパ管またはリンパ節内で生存可能である。リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、腫瘍組織内部で、死んだ細胞に囲まれた環境下で生存可能である。リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、足場非依存的に増殖可能であり、かつ足場依存的に増殖可能である。リーベリンを発現しているがん細胞は、好ましくはＩＤＯ１を発現する。リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、ＣＴＣである。リーベリンを発現しているがん細胞は、リーベリンを発現していないがん細胞と遺伝子発現パターンを比較して、がんの再発および／または転移に関与する遺伝子を特定するための材料として利用することができる。遺伝子発現パターンは、例えばＤＮＡマイクロアレイを用いて解析することができる。
　本態様におけるリーベリンに結合する物質は、好ましくは、ラベル物質を含む。用語「ラベル物質」は、捕捉可能なまたは検出可能なシグナルを与える物質を意味する。ラベル物質は、例えば、蛍光色素、磁性粒子、またはそれらの組合せであってよい。捕捉可能なシグナルは、例えば磁気シグナルであってよい。検出可能なシグナルは、例えば光シグナルであってよい。
　用語「蛍光物質」は、励起光を吸収して、励起光の波長よりも長波長側の波長の光（蛍光）を発する物質を意味する。蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、フィコエリトリン、６－ＦＡＭ（商標）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）であってよい。用語「磁性粒子」は、磁場を有さないが、磁場に曝露されると磁気双極子を形成する材料で構成された粒子を含む。磁性粒子は、例えば、約１ｎｍ～約１μｍ、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約１０ｎｍの粒径を有する。磁性粒子は、例えば、水酸化鉄、酸化鉄水和物、酸化鉄、混合酸化鉄、または鉄からなる。磁性粒子は、例えば、粒径２～３ｎｍの磁性粒子である。
　「検出」は、定性的にまたは定量的に特定の物質（例えば、タンパク質、核酸、細胞）を見つけ出すこと、および／または既に見つけ出した物質を継続的にモニタリングすることを含む。生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞の検出は、例えば、前記生体試料にリーベリンに結合する物質を混合し、前記リーベリンに結合する物質が結合したがん細胞を計数することを含む。生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞の検出は、例えば、前記生体試料に、蛍光シグナルを発するラベル物質が結合したリーベリンに結合する物質を混合し、前記混合液をＦＡＣＳに供し、前記リーベリンに結合する物質が結合したがん細胞を計数することを含む。前記分析方法におけるリーベリンを発現しているがん細胞の検出は、インビトロで行われる。
　再発、転移または抵抗性の分析は、例えば、検出結果が生体試料中にリーベリンを発現しているがん細胞の存在を示す場合、がんの再発、転移または抵抗性の危険性があると分析することを含む。がんの再発、転移または抵抗性の分析は、例えば、検出結果で示される生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞の個数が、閾値よりも多い場合に、がんの再発および／または転移の危険性があると分析することを含む。閾値は、例えば、がんのタイプ、対象の年齢、体重、遺伝的背景、および性別を含むさまざまな因子に基づいて予め決定される。
　本開示に係る分析方法は、閾値とリーベリンを発現するがん細胞の検出結果または測定結果とに基づいて、自動的または半自動的に実施することができる。したがって、医師以外の医療従事者（例えば医療情報技師、臨床工学技士または臨床検査技師）が、本開示に係る分析方法を実施することができる。本開示に係る分析方法は、例えば、ヒトに対する医師による診断行為を含まない。ヒトに対する医師による医療行為を含まない本開示に係る分析方法は、医師以外の医療従事者が、再発がん、転移がん、または抵抗性がんであると医師が診断するための情報を提供する方法に相当する。
　本開示の１つの態様は、対象が再発がん、転移がん、または抵抗性がんと診断するための情報を提示する方法を提供する。前記態様に係る方法は、その必要のある対象由来の生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞を、リーベリンに結合する物質を用いて検出すること、および検出結果に基づいて、がんの再発、転移または抵抗性を診断または特定するための情報を提示することを含む。
　本態様により抵抗性がんと分析された対象は、化学療法などのがん療法の適用後または適用中に、本開示に係る医薬組成物を投与することを含んでよい。本態様によりがんの再発および／または転移と分析された対象は、再発がんおよび／または転移がんに罹患していると診断または特定されてよい。したがって、本開示の１つの態様は、対象が再発がんおよび／または転移がんに罹患しているかを診断または特定する方法を提供する。前記態様に係る方法は、その必要のある対象由来の生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞を、リーベリンに結合する物質を用いて検出すること、および検出結果に基づいて、前記対象が再発がんおよび／または転移がんに罹患しているかを診断または特定することを含む。前記診断方法または特定方法におけるリーベリンを発現しているがん細胞の検出は、インビトロで行われる。
　１つの実施形態において、前記生体試料が血液試料（例えば全血試料、血漿試料または血清試料）である場合、リーベリンを発現しているがん細胞は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である。したがって、本開示の１つの態様は、対象がＣＴＣを有するかを診断または特定する方法を提供する。前記態様に係る方法は、その必要がある対象由来の血液試料（例えば、全血試料、血漿試料または血清試料）中のリーベリンを発現している血中循環腫瘍細胞を、リーベリンに結合する物質を用いて検出すること、および検出結果に基づいて、前記対象がＣＴＣを有するかを診断または特定することを含む。
　本開示の１つの態様は、がん幹細胞が存在するかを特定する方法を提供する。前記態様に係る方法は、その必要のある対象由来の生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞を、リーベリンに結合する物質を用いて検出すること、および検出結果に基づいて、がん幹細胞が存在するかを特定することを含む。
　本態様により再発がん、転移がん、または抵抗性がんと分析された対象は、再発がん、転移がん、または抵抗性がんを予防または治療する方法が施されてよい。したがって、本開示の１つの態様は、その必要のある対象由来の生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞を、リーベリンに結合する物質を用いて検出すること；検出結果に基づいて、前記対象が再発、転移または抵抗性を分析または特定すること；およびがんの再発、転移または抵抗性であると分析または特定された対象に、本開示に係る医薬組成物またはがんを処置するための医薬組成物を投与することを含む、がんの再発、転移または抵抗性を予防または治療する方法を提供する。前記がんを処置するための医薬組成物は、例えば、公知の抗がん剤、または公知の免疫療法剤、もしくはそれらの組合せ剤を含んでよい。前記がんを処置するための医薬組成物は、リーベリンに結合する物質を含んでよい。
（リーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質を特定する方法）
　本開示の１つの態様は、被験物質と接触可能な条件下でリーベリンを発現しているがん細胞を培養すること、および培養結果に基づいて、前記被験物質を、リーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質と特定することを含む、リーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質を特定する方法を提供する。
　「被験物質」は、例えば、低分子化合物、タンパク質（例えば抗体）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。被験物質は、例えば、リーベリンに結合する。被験物質は、好ましくは、所定の結合能でもってリーベリンに結合し、かつ細胞傷害性の特性を有する。被験物質は、例えば、細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質である。細胞傷害剤を含むリーベリンに結合する物質は、例えば、細胞傷害剤がリーベリンに結合する物質に直接的に結合している。
　リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、がん細胞株または生体試料から調製できる。生体試料は、例えば、がん患者由来の血液またはリンパ液などの体液または腫瘍組織またはその一部である。がん細胞株は、例えば、生体試料から公知の方法に従って調製することができる。がん細胞株は、例えば、商業的に入手可能である。生体試料は、公知の方法を用いて、対象から得ることができる。
　リーベリンを発現しているがん細胞の調製は、例えば、ラベル物質を含むリーベリンに結合する物質（以下「リーベリン検出試薬」とも称する）を用いて、生体試料からリーベリンを発現しているがん細胞を分取することを含む。前記調製方法は、例えば、生体試料とリーベリン検出試薬とを混合して、前記がん細胞と前記リーベリン検出試薬との複合体を形成させ、前記複合体中の前記リーベリン検出試薬由来のシグナルに基づいて前記複合体を分取することを含む。前記複合体の分取は、例えば、一細胞・組織ピッキング装置、ＦＡＣＳ、またはＭＡＣＳもしくはそれらの組合せを用いて行うことができる。リーベリンを発現しているがん細胞の調製方法は、例えば、生体試料中の少なくとも１つの不純物を除去して、目的とするリーベリンを発現しているがん細胞を濃縮することを含む。リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、ＣＴＣであってよい。ＣＴＣは、対象から採取した血液試料（例えば、全血試料、血漿試料または血清試料）から、前記した生体試料からリーベリンを発現しているがん細胞の調製方法または本開示の実施例に記載の調製方法に従って、調製することができる。
　リーベリンを発現しているがん細胞の調製は、例えば、がん細胞株を浮遊培養することにより調製することができる。浮遊培養は、例えば、がん細胞株を低吸着性の培養プレート中で振盪しながら培養することを含む。浮遊培養は、例えばがん細胞株を低吸着性のチューブ中で回転させながら培養することを含む。浮遊培養は、例えば、Ｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐ法による培養を含む。がん細胞株の浮遊培養は、公知の細胞培養条件下で実施することができる。Ｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐ法での培養は、公知の培養条件下で１日～３日、１日～２日または１日培養することを含む。
　公知の細胞培養条件は、例えば３７℃で５％ＣＯ２下にて維持することを含む。培養温度は、例えば３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば５％である。浮遊培養は、例えば、基本培地又は添加剤を添加した培地を用いる。「基本培地」は、公知のプロトコルに従って調製することができ、又は商業的に入手できる。基本培地は、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、または基本培地イーグル（ＢＭＥ）である。添加剤は、例えば、血清、成長因子又は栄養素もしくはそれらの組合せを含む。
　被験物質と接触可能な条件下でのリーベリンを発現しているがん細胞の培養は、例えば、基本培地に被験物質を添加した培地中で、培養することを含む。前記培養は、例えば接着培養または浮遊培養である。前記培養は、例えば接着培養である。前記培養は、例えば浮遊培養である。
　被験物質をリーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質と特定することは、培養結果が、例えば以下で示す場合、被験物質をがん細胞の増殖を抑制もしくは停止する、またはがん細胞を死滅もしくは破壊させる物質と特定することを含む。
　リーベリンを発現しているがん細胞の数が、培養前と培養後とで同一である場合、被験物質を、リーベリンを発現しているがん細胞の増殖を停止させることができる物質と特定することができる。リーベリンを発現しているがん細胞の数が、培養前に比べて培養後に減少している場合、被験物質を、リーベリンを発現しているがん細胞を死滅または破壊することができる物質と特定することができる。被験物質が添加された培地中で培養したリーベリンを発現しているがん細胞の増殖率に比べて、被験物質を含まない培地中で培養したリーベリンを発現しているがん細胞（陰性対照）の増殖率が小さい場合、被験物質を、リーベリンを発現しているがん細胞の増殖を抑制する物質と特定することができる。増殖率は、培養前の細胞数に対する培養後の細胞数の割合である。
（がんの再発、転移または抵抗性に影響を及ぼす因子を特定する方法）
　本開示の１つの態様は、リーベリンを発現しているがん細胞と、リーベリンを発現していないが、前記がん細胞と起源が同じがん細胞とを比較し、遺伝的因子またはタンパク質性因子の相違を特定することを含む、がんの再発、転移または抵抗性に影響を及ぼす因子を特定する方法を提供する。
　リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、がん細胞株または生体試料から調製することができる。リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、生体試料（腫瘍組織または腫瘍組織片）からリーベリン検出試薬を用いてリーベリンを発現しているがん細胞を分取することによって調製することができる。リーベリンを発現しているがん細胞は、例えば、がん細胞株を浮遊培養することにより調製することができる。
　用語「リーベリンを発現していないがん細胞」は、接着培養したがん細胞株でのリーベリンの発現量の２倍未満の発現量を示すがん細胞を意味する。この文脈におけるリーベリンの発現量は、リーベリンをコードするｍＲＮＡの量である。リーベリンをコードするｍＲＮＡ量は、ＲＴ－ｑＰＣＲにより測定される。リーベリンをコードするｍＲＮＡ量は、例えばアクチン等をコードするｍＲＮＡに対して規格化された値である。リーベリンを発現していないがん細胞は、例えば、絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）由来のＳｗａｎ７１細胞でのリーベリンの発現量の２倍未満の発現量を示すがん細胞である。リーベリンを発現していないがん細胞、例えば、単一細胞の状態であってよく、または細胞塊（例えばスフェロイド）の状態であってよい。
　リーベリンを発現していないがん細胞は、例えば、がん細胞株または生体試料から調製することができる。前記調製方法は、例えば、がん細胞株を接着培養することで調製することができる。前記調製方法は、例えば、生体試料とリーベリン検出試薬とを混合して、前記がん細胞と前記リーベリン検出試薬との複合体を形成させること、およびがん細胞から前記リーベリン検出試薬由来のシグナルが検出されないことに基づいて、前記がん細胞を分取することを含む。前記調製方法は、さらに、前記複合体中の前記リーベリン検出試薬由来のシグナルが検出されることに基づいて前記複合体を分取することを含んでよい。前記複合体の分取、およびリーベリン検出試薬が結合してないがん細胞、即ちリーベリンを発現していないがん細胞の分取はそれぞれ、例えば、一細胞・組織ピッキング装置、ＦＡＣＳ、またはＭＡＣＳもしくはそれらの組合せを用いて行うことができる。
　本態様において、リーベリンを発現していないがん細胞は、リーベリンを発現しているがん細胞と起源が同じがん細胞である。この文脈において用語「同じ起源」は、リーベリンを発現しているがん細胞と、リーベリンを発現していないがん細胞とが、同じ動物種に由来し、且つ、同じ原発巣腫瘍組織に由来することを意味する。同じ動物種は、例えば、同じ個体であってよく、または異なる個体であってよい。同じ原発巣腫瘍組織に由来するがん細胞は、例えば、リーベリンを発現していないがん細胞とリーベリンを発現しているがん細胞とが共に、同じ原発巣腫瘍組織に由来してよく、あるいは一方が原発巣腫瘍組織に由来し、他方が転移腫瘍組織に由来してもよい。
　遺伝的因子は、例えば、遺伝子配列における突然変異、転写の有無またはその程度、およびＤＮＡに対するメチル化などの化学修飾を含む。タンパク質性因子は、例えば、ヒストンに対しるメチル化およびユビキチンかなどの化学修飾、発現の有無またはその程度、および糖鎖付加などの翻訳後修飾を含む。
　遺伝的因子またはタンパク質性因子の相違の特定は、遺伝的因子の相違およびタンパク質性因子の相違の両方を特定することを排除しない。遺伝的因子またはタンパク質性因子の相違の特定は、例えば、遺伝的因子の測定結果またはタンパク質性因子の測定結果を比較することで行うことができる。測定結果は、例えば、電子的なデータであってよい。本開示の１つの態様は、リーベリンを発現しているがん細胞における遺伝的因子またはタンパク質性因子についての測定結果と、リーベリンを発現していないが、前記がん細胞と起源が同じがん細胞における前記因子についての測定結果とを比較し、遺伝的因子またはタンパク質性因子の相違を特定することを含む、がんの再発、転移または抵抗性に影響を及ぼす因子を特定する方法を提供する。
（がん幹細胞のバイオマーカーとしてのリーベリンの使用）
　本開示の１つの態様は、がん幹細胞のバイオマーカーとしての、リーベリンの使用を提供する。本開示の他の態様は、リーベリンからなる、がん幹細胞のバイオマーカーを提供する。
　本開示の実施例は、原発巣腫瘍組織の内部で、壊死したがん細胞に囲まれて生存するがん細胞が、リーベリンを発現することを示す。これらのリーベリンを発現するがん細胞は、自らの細胞増殖速度を抑制する等して、周囲のがん細胞が死滅するような環境下での生存可能となり得ることが示唆される。また、本開示の実施例は、リーベリンを発現するがん細胞は、リンパ管および血管内に入り、免疫系からの攻撃を回避しつつ、体内を循環して、原発巣腫瘍組織とは別の臓器（例えばリンパ節）に転移し得ることを示す。さらに本開示の実施例は、転移組織内のがん細胞は、リーベリンが発現していない又は弱く発現すること、更に転移組織から離脱したがん細胞はリーベリンを強く発現することを示す。さらに、本開示の実施例は、化学療法剤に対して抵抗性のがん細胞が、リーベリンを発現することを示す。これらの特徴は、がんの再発および／または転移の原因となると考えられる、がん幹細胞が備える特徴と似ている。したがって、リーベリンは、がん幹細胞のバイオマーカーとして利用し得る。
　上述のとおり、本開示の実施例は、リーベリンを発現するがん細胞が、リンパ管または血管内に入り、原発巣腫瘍組織とは別の臓器に転移し得ることを示す。この特徴は、がんの再発および／または転移の機序に対応する。したがって、リーベリンは、がんの再発および／または転移のバイオマーカーとして利用し得る。本開示の１つの態様は、がんの再発および／または転移のバイオマーカーとしてのリーベリンの使用を提供する。本開示の他の態様は、リーベリンからなる、がんの再発および／または転移のバイオマーカーを提供する。
　用語「がん幹細胞」は、静止期を有するがん細胞を意味する。用語「静止期」は、生存細胞密度がほぼ一定（すなわち測定誤差内）である期間を意味する。静止期にあるがん幹細胞は、例えば、少なくとも２４時間（例えば、３６時間以上）、生存細胞密度がほぼ一定である。がん幹細胞は、静止期を脱して増殖期にあるときに、非対称分裂し得る。用語「非対称分裂」は、互いに異なる娘細胞を生じる細胞分裂を意味する。がん幹細胞の非対称分裂では、がん幹細胞とがん幹細胞から分化したがん細胞とが生じ得る。用語「増殖期」は、生存細胞密度が増加する期間を意味する。増殖期は、形態的測定または生化学的測定により、ＤＮＡの合成期（Ｓ期）、分裂期（Ｍ期）、及びそれらの期の間にＧａｐ期（Ｇ１期及びＧ２期）に分けられ得る。
　用語「バイオマーカー」は、細胞、組織、又は体液中に存在するペプチド(タンパク質を含む)又は核酸（遺伝子又はその転写産物を含む）等の生体内物質からなり、その存在量や濃度によって疾患の存在、変化、進行度、治療効果の程度の指標となり得る状態にある物質を意味する。本開示におけるバイオマーカーは、リーベリンである。リーベリンは、例えば、転移がん、再発がんまたは抵抗性がんのバイオマーカーとして利用される。リーベリンは、例えば、がん幹細胞のバイオマーカーとして利用される。
　バイオマーカーとしてのリーベリンの使用は、例えば、がん幹細胞が存在するかを特定するために、その必要のある対象由来の生体試料中にリーベリンを発現するがん細胞が存在するかを検出することを含む。バイオマーカーとしてのリーベリンの使用は、対象ががんの再発、転移または抵抗性を特定するために、前記対象由来の生体試料中にリーベリンを発現するがん細胞が存在するかを検出することを含む。リーベリンを発現するがん細胞は、公知の免疫学的方法、特に本開示に記載の方法（例えば実施例に記載の方法）に従って、検出および／または測定することができる。
　本明細書における用語「含む」は、列挙される要素および／またはステップが存在し、その他の要素および／またはステップが追加されてもよいことを意味する。本明細書における用語「からなる」は、列挙される要素および／またはステップが存在し、その他の要素および／またはステップを排除することを意味する。本明細書における用語「から本質的になる」は、列挙される要素および／またはステップが存在し、その他の要素および／またはステップが、医薬組成物、および特定方法の新規な技術的特徴に影響を与えない範囲で追加されていてよいことを意味する。本明細書中における用語「実質的に含まない」は、「完全に含まない」を排除しない。
　本開示に係る特定の態様における実施形態の説明および用語の説明は、特に言及がない限り、本開示中の他の態様での実施形態および用語にも適宜適用される。
　以下、具体的な実施例を記載するが、それらは本開示の好ましい実施形態を示すものであり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
［実施例１］　がん細胞スフェロイドでのリーベリン発現
（材料）
　乳腺がん細胞として、ＭＣＦ７細胞株、ＳＫＢＲ３細胞株およびＢＴ２０細胞株を用いた。メラノーマ細胞として、Ａ３７５細胞株およびＳＫ－ＭＥＬ２８細胞株を用いた。子宮体がん細胞として、ＨＥＣ６細胞株およびＨＥＣ１０８細胞株を用いた。卵巣がん細胞として、ＳＫＯＶ３細胞株を用いた。
（接着培養）
　がん細胞を接着細胞用培養皿にて３７℃で前培養した。９０～１００％コンフルエントに達した場合に培養細胞を回収した。回収した培養細胞を、１ウェルあたり１×１０５細胞となるように播種し、３７℃で２４時間静置培養した。
（浮遊培養）
　予め培養したがん細胞を、浮遊細胞用培養皿または超低接着培養プレートにて１ウェルあたり１～２×１０６細胞となるように播種し、３７℃にて培養してスフェロイドを形成させた。培養細胞を回収して、フラスコに移した。前記フラスコを波動式シェーカーにて３７℃で２４～７２時間培養した。
（蛍光免疫染色法）
　接着培養または浮遊培養した細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。固定した細胞でのリーベリン発現を、抗リーベリン抗体（具体的にはモノクローナル５－２３抗体（１０μｇ／ｍｌ）または抗ＬＶＲＮ抗体を用いた）およびＡｌｅｘａ４８８でコンジュゲートしたヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて調べた。核染色はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた。上記した各がん細胞株を接着培養した（比較例１～８）。陽性対照として、絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）由来のＳｗａｎ７１細胞であって、リーベリンを過剰発現するＳｗａｎ７１　ＬＶＲＮを用いた。
　接着培養したＭＣＦ７細胞（比較例１）はリーベリンを発現しなかった（図１ａ）。接着培養した陽性対照はリーベリンを発現した（図１ｄ）。同様の試験を、他の細胞株でも行った（比較例２～８）。接着培養した他の細胞株もリーベリンを発現しなかった。リーベリンの免疫染色には５－２３抗体を用いた。これらの結果を下記の表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

ＮＯ：　　リーベリンの発現は確認できなかった
ＹＥＳ：　リーベリンの発現が確認できた
　上記がん細胞株をそれぞれ浮遊培養して、スフェロイドを形成させた（試験例１～８）。ＭＣＦ７細胞スフェロイド（試験例１）はリーベリンを発現した（図２ａおよび図２ｃ）。同様の試験を、他の細胞株についても行った（試験例２～８）。浮遊培養によりスフェロイドを形成させた細胞株はすべてリーベリンを発現した。リーベリンの免疫染色は５－２３抗体または抗ＬＶＲＮ抗体を用いた。これらの結果を上記の表にまとめた。
　実施例１は、がん細胞は、接着培養により足場依存的に増殖させた場合はリーベリンを発現しないが、浮遊培養により足場非依存的に増殖させた場合、リーベリンを発現することを示す。実施例１は、がん細胞のスフェロイド（細胞塊）はリーベリンを発現することを示す。
［実施例２－１］　がん細胞スフェロイドでのリーベリンの発現量
　各培養細胞を、実施例１と同様にして接着培養または浮遊培養（７２時間の振盪培養）し、培養がん細胞中のリーベリンの発現レベルを調べた（図３）。接着培養により足場依存的に培養させたＡ３７５細胞株（図３ａ～ｄ）およびＡ２７８０細胞株（図３ｉ～ｌ）では、リーベリンの発現は観察されなかった（図３ｂおよび図３ｊ）。浮遊状態により足場非依存的に培養させたがん細胞スフェロイドでは（図３ｅ～ｈおよびｍ～ｐ）、リーベリンの発現が観察された（図３ｆおよび図３ｎ）。これらの結果は、実施例１での結果と同じであった。
（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
　Ａ３７５細胞株およびＡ２７８０細胞株をそれぞれ接着培養した。培養細胞を回収して、全ＲＮＡをそれぞれ回収した。同様にして、前記細胞をそれぞれ波動式シェーカーを用いて浮遊培養し、スフェロイドを形成させた。前記スフェロイドを回収して、全ＲＮＡをそれぞれ回収した。回収した各全ＲＮＡを用いて、リーベリンをコードするｍＲＮＡの量をＲＴ－ｑＰＣＲにて測定した。前記ｍＲＮＡの量は、リーベリンの発現レベルを反映する。ＲＴ－ｑＰＣＲでは、リーベリン配列を増幅するプライマーセットおよび逆転写酵素を用いた。Ａ３７５細胞では、接着培養した場合よりも浮遊培養した場合の方がリーベリンの発現量が約１４倍多かった（図４ａ）。Ａ２７８０細胞の場合も同様に、浮遊培養した場合の方がリーベリンの発現量は約８倍多かった（図４ｂ）。
　ＣａＳｋｉ細胞株およびＳｉＨａ細胞株はそれぞれ、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）に感染した子宮頸がん細胞株である。前記細胞をそれぞれ接着培養し、培養細胞を回収した。前記細胞をそれぞれ、浮遊培養（超低接着培養プレートで２４時間の振盪培養）し、スフェロイドを形成させた。前記スフェロイドを回収した。回収した接着培養細胞および浮遊培養細胞（スフェロイド）から、全ＲＮＡをそれぞれ回収した。全ＲＮＡを用いて、リーベリンの発現レベルを調べた。その結果、前記細胞スフェロイドでのリーベリンの発現量が、接着培養した同細胞での発現量よりも約３．５倍多かった（図４ｃおよび図４ｄ）。
　実施例１および実施例２は、リーベリンを発現しないがん細胞であっても、浮遊培養によって足場非依存的に増殖させると、リーベリンを発現するようになる、またはその発現が亢進されることを示す。
［実施例２－２］
（材料）
　メラノーマ細胞としてＡ３７５細胞株を用いた。結腸がん細胞として、ＨＣＴ１１６細胞株を用いた。乳がん細胞として、ＨＣＣ３８細胞株を用いた。前立腺癌細胞として、ＬＮＣａｐ細胞株、ＤＵ１４５細胞株およびＰＣ－３細胞株を用いた。
（スフェロイド形成）
　予め培養したがん細胞を、超低接着培養プレートにて１ウェルあたり１×１０5細胞となるように播種し、３７℃にて３～４日培養してスフェロイドを形成させた。培養細胞を回収して、フラスコに移した。前記フラスコを波動式シェーカーにて３７℃で７日培養した。
（蛍光免疫染色法）
　形成されたスフェロイドを、実施例１と同様の方法で蛍光免疫染色法に供して、該スフェロイドがリーベリンを発現しているかについて試験した。リーベリンの免疫染色には５－２３抗体を用いた。
　実施例２－２は、スフェロイドを形成したメラノーマ細胞（Ａ３７５）、結腸がん細胞（ＨＣＴ１１６）、乳がん細胞（ＨＣＣ３８）および前立腺がん細胞（ＬＮＣａｐ、ＤＵ１４５およびＰＣ－３）が、リーベリンを発現すること示した。これらの結果を以下の表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

ＮＯ：　　リーベリンの発現は確認できなかった
ＹＥＳ：　リーベリンの発現が確認できた
（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
　浮遊培養したスフェロイドでの前記がん細胞におけるリーベリンの発現レベルを、実施例２と同様の方法でＲＴ－ｑＰＣＲにて測定した。また、接着培養した単層での前記がん細胞におけるリーベリンの発現量をＲＴ－ｑＰＣＲにて測定した。各発現レベルはＨｐｒｔ１の発現レベルに対して規格化した（図２０）。
　図２０は、実施例２－１で用いたがん細胞が、スフェロイドを形成することで、リーベリンを発現するようになることを示す。具体的には、メラノーマ細胞株Ａ３７５は、単層でのリーベリン発現レベルよりもスフェロイドでのリーベリン発現ベルの方が約７９倍多かった。同様に、結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６は、スフェロイドでの発現レベルの方が約３３倍多かった。乳がん細胞株ＨＣＣ３８は、スフェロイドでの発現レベルの方が約３７倍多かった。前立腺癌細胞株ＬＮＣａｐ、ＤＵ１４５およびＰＣ－３は、それぞれ、スフェロイドでの発現レベルの方が約７倍、約１１倍および約１３倍多かった。
　実施例１および実施例２－２は、様々ながん（例えば、乳腺がん、メラノーマ、子宮体がん、卵巣がん、結腸がん、乳がんおよび前立腺がん）の細胞がスフェロイドを形成することでリーベリンを高発現するようになることを示す。
［実施例３］　血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）でのリーベリン発現
（ＣＴＣを分離する方法）
　被験者由来の末梢血試料から末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を含む画分を回収した。前記画分からＣＤ４５を発現しているＰＢＭＣｓを除外して、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を濃縮した血液試料を調製した。前記血液試料から、リーベリンおよびＥｐＣＡＭを共発現しているＣＴＣを特定した。特定したＣＴＣを分離することで、ＣＴＣを調製した。
　より具体的には、ＣＴＣの分離は以下の手順で行った。
　被験者から抹消血７ｍｌを採取し、採取した全血をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）を用いた密度勾配遠心分離および比重遠心に供して、全血から末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を調製した。前記末梢血単核球と、マウス・モノクローナル抗ＬＶＲＮ抗体（１０μｇ／ｍｌ）およびラビット・ポリクローナル抗ＥｐＣＡＭ抗体（１０μｇ／ｍｌ）とを混合し、得られた混合液を室温で３０分間インキュベートした。前記混合液と、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート・ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：５００希釈）およびＣＦ５５５コンジュゲート・ヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体（１：５００）とを混合し、前記混合液を室温で３０分間インキュベートした。前記混合液と、抗ＣＤ４５抗体を固定化した磁気ビーズとを混合し、得られた混合液を４℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後に、前記混合液と、ＢＶ４２１コンジュゲート抗ＣＤ４５抗体とを混合し、得られた混合液を４℃でさらに３０分間インキュベートした。
　インキュベート後の前記混合液を、磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）に供し、ＣＤ４５陽性細胞を除外することで、ＣＤ４５陰性細胞を濃縮した。濃縮した細胞を、９６ウェルの細胞イメージングプレートの各ウェルに分注し、蛍光顕微鏡にて観察した。観察した細胞のうち、ＣＴＣ基準を満たす細胞を、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と特定した。
　用いたＣＴＣ基準は、ＬＶＲＮ陽性および／またはＥｐＣＡＭ陽性であって、ＣＤ４５陰性である。ＣＴＣの存在が示されたウェルからＣＴＣを含む培養液を回収し、前記培養液の液滴を３５ｍｍ培養皿上に作製した。前記液滴中の細胞集団の中から、Ｕｎｉｐｉｃｋ（登録商標）一細胞・組織ピッキング装置を用いて、ＣＴＣ基準を満たす細胞を分離および回収した。
（検体Ａ及びＢ）
　患者Ａは、ＩＩＩＢ期の子宮頸がんに罹患し、多発性リンパ節転移を有した。患者Ａは、同時化学放射線療法（ＣＣＲＴ）を受けた後に、がんが再発した。がん再発後、パクリタキセルとカルボプラチンの抗がん剤の組合せを用いた療法（ＴＣ療法）を受け、次いで、シスプラチンとビノレルビンの抗がん剤の組合せを用いた療法（ＮＰ療法）を受け、更に、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）を用いた療法を受けた。ＣＰＴ－１１療法中止後に、患者Ａから末梢血試料（検体Ａ）を採取した。
　患者Ｂは、ＩＩＩＣ期の子宮体がんに罹患し、多発性脳転移、皮膚転移およびリンパ節転移を有した。患者Ｂは、腹式子宮単純全摘術（ＡＴＨ）、両側付属器摘出術（ＢＳＯ）、大網切除術（ＯＭＴ）、骨盤内リンパ節郭清（ＰＬＡＮ）および傍大動脈リンパ節郭清（ＰＡＮ）を受けた後に、がんを再発し、ＴＣ療法を受け、次いでドキソルビシンとシスプラチンの抗がん剤の組合せを用いた療法（ＡＰ療法）を受けた。ＡＰ療法後ベスト・サポーティブ・ケア（ＢＳＣ）を受けている間に、患者Ｂから末梢血試料（検体Ｂ）を採取した。
　前記した血中循環腫瘍細胞を特定する方法に従って、検体Ａおよび検体Ｂ中のＣＴＣを特定した。図５中、白矢印で示した細胞塊は、リーベリンを発現し（図５ａ）、ＥｐＣＡＭを発現し（図５ｂ）、かつＣＤ４５を発現していない（図５ｃ）。図５は、前記細胞塊が、リーベリンを発現しているＣＴＣであることを示す。
　検体Ａおよび検体Ｂについて、前記したＣＴＣ基準に従ってＣＴＣを特定した。その結果、検体Ａでは８個のＣＴＣが特定され、検体Ｂでは１５個のＣＴＣが特定された。検体Ａで特定された８個のＣＴＣのうち、２個が細胞塊を形成し、６個が単一細胞として存在した。検体Ａで特定された８個のＣＴＣのうち、ＥｐＣＡＭのみ陽性であったＣＴＣは１個であり、ＬＶＲＮのみ陽性であったＣＴＣは１個であり、ＥｐＣＡＭとＬＶＲＮの両方が陽性であったＣＴＣは６個であった。検体Ｂで特定された１５個のＣＴＣのうち、２個が細胞塊を形成し、１３個が単一細胞として存在した。検体Ｂで特定された１５個のＣＴＣのうち、ＥｐＣＡＭのみ陽性であったＣＴＣは４個であり、ＬＶＲＮのみ陽性であったＣＴＣは２個であり、ＥｐＣＡＭとＬＶＲＮの両方が陽性であったＣＴＣは９個であった。検体Ｂでは、ＣＤ４５が陽性の白血球を含むＣＴＣ細胞塊が観察された。これらの結果を下記の表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例４］　追加の生体試料中のＣＴＣでのリーベリン発現
（検体Ｃ）
　患者Ｃは、ＩＩＩＢ期の子宮頸がんに罹患し、肝転移および多発性リンパ節転移を有した。子宮頸がんのステージがＩＩＩＢ期となった後に、患者Ｃから末梢血試料（検体Ｃ）を採取した。
（ＣＴＣ回収のための改良方法）
　検体Ｃから、実施例３のＣＴＣ調製方法の改良方法を用いてＣＴＣを分離した。実施例３のＣＴＣの分離方法では、ＣＤ４５を発現しているＰＢＭＣｓを除外することでＣＴＣを濃縮したが、改良方法では、ＥｐＣＡＭを発現しているがん細胞を回収することでＣＴＣを濃縮する。
　改良方法での検体ＣからＣＴＣの分離は以下の手順で行った。
　被験者から末梢血を採取し、採取した抹消血から末梢血単核球を回収した。回収した末梢血単核球を、２％パラホルムアルデヒドを用いて細胞固定した。固定した細胞を含む試料と、マウス・モノクローナル抗ＬＶＲＮ抗体（１０μｇ／ｍｌ）、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体（１：５００希釈）およびＢＶ４２１コンジュゲート抗ＣＤ４５抗体とを混合し、得られた混合液を４℃にて３０分間インキュベートした。前記混合液と、磁気ビーズに結合した抗ＥｐＣＡＭ抗体とを混合し、得られた混合液を４℃にて３０分間インキュベートした。前記混合液を磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）に供し、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を濃縮した。濃縮した細胞を含む培養液１０μＬの液滴を、流動パラフィンでコートしたガラスボトムディッシュに滴下し、１４個の液滴を形成させた。蛍光顕微鏡にて液滴中の細胞を観察し、ＬＶＲＮ陽性かつＣＤ４５陰性である細胞を血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と特定した。ＣＴＣの存在が示された液滴から、Ｕｎｉｐｉｃｋ（登録商標）一細胞・組織ピッキング装置を用いて、ＣＴＣを分離および回収した。
　検体Ｃから５個のＣＴＣ（リーベリン陽性かつＣＤ４５陰性）を分離した。５個のＣＴＣのうち３個のＣＴＣを分離および回収した。３個のＣＴＣを混合し、Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｗｈｏｌｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて全ゲノムＤＮＡを増幅した。増幅したゲノムＤＮＡから、ＨＰＶ１６（Ｅ６／Ｅ７）を増幅するプライマーセットを用いて、ＤＮＡ断片を増幅した。同じプライマーセットを用いて、ＣＴＣ分離前の末梢血試料から増幅したＤＮＡ増幅産物の鎖長（１３１ｂｐ）と、分離後のＣＴＣから増幅したＤＮＡ増幅産物の鎖長（１３１ｂｐ）とは一致した。この結果は、リーベリンを発現しているＣＴＣが、ＨＰＶ１６に感染したがん細胞であり、ＣＴＣ分離の改良方法により、目的とするＣＴＣが分離できたことを示す。
（別の改良方法）
　上記した改良方法では、２％パラホルムアルデヒドで細胞を固定化した後に、抗ＬＶＲＮ抗体と抗ＣＤ４５抗体とを用いて、リーベリンを発現し、かつＣＤ４５を発現していない細胞を分離した。別の改良方法では、２％パラホルムアルデヒドで細胞を固定化した後に、抗ＬＶＲＮ抗体と抗ＣＤ４５抗体とＨｏｅｈｓｔとを用いて、リーベリンを発現し、かつＣＤ４５を発現していない細胞を分離する。
　別の改良方法では、被験者由来の末梢血試料から末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を含む画分を回収した。前記画分中の細胞を、２％パラホルムアルデヒドを用いて固定化した。固定化した細胞からＥｐＣＡＭを発現している細胞を回収して、ＣＴＣを濃縮した血液試料を調製した。前記血液試料から、リーベリンを発現し、ＣＤ４５を発現せず、かつＨｏｅｃｈｓｔで染色されたＣＴＣを特定した。特定したＣＴＣを分離することで、ＣＴＣを調製した。
（検体Ｄ）
　患者Ｄは、ＩＶＢ期の子宮頸がんに罹患し、多発性リンパ節転移（骨髄、傍大動脈、および鎖骨上リンパ節）、左下肢ＤＶＴ、外顎静脈血栓、左膵臓症（尿管ステント留置）を有した。患者Ｄから採取されたがん組織片は、ＨＰＶ１６型陽性の扁平上皮がんであることを示した。患者Ｄは、シスプラチンとパクリタキセルの抗がん剤の組合せを用いた療法（ＴＰ療法）を受け、次いで、キイトルーダ（登録商標）（ペムブロリズマブ）を受けた。キイトルーダを受けた後に、患者Ｄから末梢血試料（検体Ｄ）を採取した。
　検体Ｄを用いて別の改良方法を実施し、１ｍｌの検体Ｄから、ＣＤ４５陰性のＣＴＣ５６個を特定した。この結果は、検体Ｄが非常にＣＴＣに富んでいたことを示す。前記５６個のＣＴＣのうちリーベリンを発現している細胞は３個であった。ＬＶＲＮ陽性のＣＴＣを混合した。得られた混合物からＳｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｗｈｏｌｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて全ゲノムＤＮＡを増幅した（ゲノムＤＮＡ－ｐ）。リーベリン陰性のＣＴＣ５個を混ぜ、ＬＶＲＮ陰性のＣＴＣ混合物を調製した。ＬＶＲＮ陰性のＣＴＣ混合物を、さらに２つ調製した。３つのＬＶＲＮ陰性のＣＴＣ混合物から、上記と同様にして、全ゲノムＤＮＡをそれぞれ増幅した（ゲノムＤＮＡ－ｎ１、－ｎ２、および－ｎ３）。増幅したゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ－ｐ、－ｎ１、－ｎ２、および－ｎ３）からＨＰＶ１６（Ｅ６／Ｅ７）を増幅するプライマーセットを用いて、ＤＮＡ断片を増幅した。
　同じプライマーセットを用いて、ＣＴＣ分離前の末梢血試料から増幅したＤＮＡ増幅産物の鎖長（１３１ｂｐ）と、分離後のＣＴＣ混合物から抽出した全ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ－ｐ、－ｎ１、－ｎ２、および－ｎ３）から増幅したＤＮＡ増幅産物の鎖長（１３１ｂｐ）とは一致した。この結果は、ＣＴＣ分離の別の改良方法で分離したＣＴＣは、リーベリンを発現していても発現していなくても、ＨＰＶ１６が感染したがん細胞であることを示す。
　実施例３のＣＴＣの分離方法では、ＣＤ４５を発現しているＰＢＭＣｓを除外することで、ＣＴＣを濃縮した。実施例３のＣＴＣの分離方法で特定された検体Ａ中の８個のＣＴＣのうち、ＥｐＣＡＭのみを発現していたＣＴＣは１個（１２．５％）であった。また、検体Ｂでは、１５個のＣＴＣのうちＥｐＣＡＭのみを発現していたＣＴＣは４個（約２７％）であった。実施例４の別の改良方法では、５６個のＣＴＣのうち、ＥｐＣＡＭのみを発現していたＣＴＣは５３個（約９５％）であった。改良方法および別の改良方法では、ＥｐＣＡＭを発現している細胞を回収することで、ＣＴＣを濃縮した。これらの結果は、実施例３のＣＴＣの分離方法では、ＥｐＣＡＭ陽性のＣＴＣをロスしていた可能性を示唆する。さらに、これらの結果は、ＣＴＣを濃縮する工程において、リーベリンを発現している細胞を回収することによって、リーベリンを発現しているＣＴＣをより効率的に回収できる可能性を示唆する。
　実施例３および４は、血中を循環する単一がん細胞またはがん細胞塊がリーベリンを発現していることを示す。
　検体Ａでは、８個のＣＴＣのうちリーベリンを発現していなかったＣＴＣは１個（１２．５％）であり、検体Ｂでは、１５個中４個（約２７％）であった。検体Ｄでは、５６個中５３個（約９５％）であった。対象Ａ、対象Ｂおよび対象Ｄはいずれも転移がんを有し、対象ＡはＩＩＩＢ期の子宮頸がんに罹患し、対象ＢはＩＩＩＣ期の子宮体がんに罹患し、対象ＤはＩＶＢ期の子宮頸がんに罹患していた。これらを考慮すると、より後期のステージのがんでは、リーベリンを発現していないがん細胞であっても、血中を循環可能であることを示唆する。反対に、より初期のステージのがんでは、リーベリンを発現したがん細胞は血中を循環可能であるが、リーベリンを発現していないがん細胞は血中を循環することが困難であることを示唆する。
［実施例５］　免疫細胞系に対するリーベリンの作用
　ＣａＳｋｉ細胞株を、実施例１と同様にして、超低接着培養プレートにて２４時間の振盪培養を行って、浮遊状態のがん細胞スフェロイドを形成させた。ＣａＳｋｉ細胞スフェロイドでのリーベリンおよびインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１（ＩＤＯ１）をコードするｍＲＮＡの量をＲＴ－ｑＰＣＲによりそれぞれ調べた（図６）。リーベリン（ＬＶＲＮ）の発現レベルは、ＣａＳｋｉ細胞を接着培養した場合よりも、浮遊培養した方が約４倍多かった（図６左側ＬＶＲＮ）。この結果は、実施例２の結果（図４ｃ）と同様であった。ＩＤＯ１の発現レベルは、ＣａＳｋｉ細胞を接着培養した場合よりも、浮遊培養した方が約２３倍多かった（図６右側ＩＤＯ１）。この結果は、リーベリンを発現しているがん細胞スフェロイドでは、ＩＤＯ１の発現が亢進されていることを示す。
　腫瘍細胞でのＩＤＯ１発現は、腫瘍周辺環境下での制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化を誘導し、がん細胞の生存を助長し得る（Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ＩＤＯ１　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ：ｆｒｏｍ　ｂｅｎｃｈ　ｔｏ　ｂｅｄｓｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　＆　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１８）１１：１００）。ＩＤＯ１はトリプトファンを分解する。トリプトファンはＴ細胞の機能および生存に必須である。ＩＤＯ１を高発現する腫瘍細胞は、その周辺に存在するトリプトファンを分解するため、Ｔ細胞は前記腫瘍細胞周辺でその活性が抑制される。これらを踏まえると、実施例５は、リーベリンを発現しているがん細胞または前記がん細胞を含むスフェロイドは、ＩＤＯ１を高発現する結果、Ｔｒｅｇの分化を誘導し、免疫系からの攻撃を回避し得ることを示唆する。
　実施例３～５は、リーベリンを発現しているがん細胞は、ＩＤＯ１を発現するために血中の免疫系からの攻撃を回避でき、それによって、血中を循環して原発巣腫瘍組織とは異なる部位で増殖できることを示唆する。これは、リーベリンを発現しているがん細胞が、がんの再発および／または転移に重要な役割を果たすことを示す。
［実施例６］　単球由来細胞に対するリーベリン発現細胞の作用
　リーベリンを過剰発現するＳｗａｎ７１細胞の形質転換体（Ｓｗａｎ７１＿ＬＶＲＮ）と、ヒト単球由来細胞株ＴＨＰ－１とを共培養した。共培養は、Ｓｗａｎ７１＿ＬＶＲＮ細胞とＴＨＰ－１細胞とが接触可能な条件下で行った。培養したＴＨＰ－１細胞を回収して、ｍＲＮＡを抽出した。前記ｍＲＮＡを用いてマイクロアレイ解析を行った。前記と同様にして、Ｓｗａｎ７１細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とＴＨＰ－１とを共培養し、培養したＴＨＰ－１についてマイクロアレイ解析を行った。Ｓｗａｎ７１＿ＬＶＲＮと共培養したＴＨＰ－１細胞では、Ｃｏｎｔｒｏｌと共培養したＴＨＰ－１細胞よりも、複数種の遺伝子で発現が増加していた。
　前記複数種の遺伝子のうち、４つの遺伝子について、その発現量をＲＴ－ｑＰＣＲを用いて調べた（図７）。前記４つの遺伝子は、２’－５’－Ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ　Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　２（ＯＡＳ２）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｗｉｔｈ　Ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｐｅａｔｓ　１（ＩＦＩＴ１）、ＩＦＩＴ３、およびｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ，１５ｋＤａ（ＩＳＧ１５）であった。
　Ｓｗａｎ７１＿ＬＶＲＮ細胞と、ＴＨＰ－１細胞との接触が可能な条件下で共培養した。培養したＴＨＰ－１細胞を回収し、ｍＲＮＡを抽出した。抽出したｍＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲに供して、各遺伝子の発現量を調べた。調べた４つの遺伝子の発現量が有意に増加した（図７ａ）。Ｓｗａｎ７１＿ＬＶＲＮ細胞と、ＴＨＰ－１細胞とが接触できない条件下で培養したことを除いて、前記と同様にして、各遺伝子の発現量を調べた。この培養では、エキソソームを含む液性成分は、各細胞を含む画分の間を移動可能であった。調べた４つの遺伝子の発現量に有意な差はなかった（図７ｂ）。
　実施例６は、リーベリンを発現している細胞との接触によって、単球細胞で特定の遺伝子の発現が増加することを示す。
［実施例７］　単球由来細胞に対する可溶性リーベリンの作用
　リーベリンには、膜結合型のリーベリンと、分泌型のリーベリンとがある。分泌型のリーベリンとＨｉｓタグとを融合させた組換えリーベリン（ｒＬＶＲＮ）を調製した。ｒＬＶＲＮを添加した培地を用いて、ＴＨＰ－１細胞を培養した。培養したＨＴＰ－１細胞での前記４種の遺伝子の発現レベルを測定した。その結果、測定した遺伝子の発現レベルは、ｒＬＶＲＮの添加量が増加するにしたがって増加したことを示す（図８ａ）。また、前記遺伝子の発現レベルは、ｒＬＶＲＮを添加して培養した時間の増加に伴って（４時間、８時間および１２時間）、増加した。
　ＴＨＰ－１細胞を、蛍光色素で標識したｒＬＶＲＮの存在下で培養して、顕微鏡下で観察した。その結果、ＴＨＰ－１細胞内に存在するｒＬＶＲＮが観察された。この結果は、リーベリンが単球に取り込まれることを示す。
　ｒＬＶＲＮとＨｉｓタグと結合するビーズとを混合して、ｒＬＶＲＮを固定化したビーズを調製した。ＴＨＰ－１細胞をｒＬＶＲＮ固定化ビーズまたは遊離型のｒＬＶＲＮの存在下で培養した。培養ＴＨＰ－１細胞での前記した４種の遺伝子の発現レベルを測定した。遊離型ｒＬＶＲＮにより誘導される前記４種の遺伝子の発現レベル（■）に比べて、ビーズに固定化されたｒＬＶＲＮにより誘導される前記４種の遺伝子の発現レベル（◆）が顕著に抑制された（図８ｂ）。この結果は、リーベリンによる単球細胞での前記遺伝子の発現誘導は、リーベリンと単球細胞との接触だけでは十分ではなく、リーベリンが細胞内に取り込まれることが必要であることを示唆する。
　実施例６および７の結果は、単球細胞は、リーベリンを取り込むことで特定の遺伝子を高発現することを示す。
［実施例８］　ヒト末梢血単核球に対する可溶性リーベリンの作用
　リンパ球および単球を含むヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を、ｒＬＶＲＮの存在下で培養し、ＯＡＳ２、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３およびＩＳＧ１５の４種の遺伝子の発現レベルを測定した。ＴＨＰ－１細胞での結果と同様、前記４種の遺伝子の発現が誘導された。
　リーベリンがＰＭＢＣｓのどの細胞タイプでＩＳＧ１５の発現を誘導するかを調べた。
　３ｍｌのＥＤＴＡ血をＦｉｃｏｌｌにて処理してＰＢＭＣｓを調製した。前記ＰＢＭＣｓを２ｍｌのＲＰＭＩ培地を用いて浮遊細胞用Ｄｉｓｈにて２４時間培養した後に、ｒＬＶＲＮ１．５μｇ／ｍｌ、ＩＮＦ－β１０００ＩＵ／ｍｌまたはＰＢＳ（陰性対照）を培地に添加した。さらに２４時間培養し、ＩＳＧ１５をフィコエリトリン（ＰＥ）で染色した。ＰＥ染色したＰＢＭＣｓを、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎセルソーターに供し、単球分画およびリンパ球分画に分けた。
　単球分画での測定は、ＰＢＳを添加した培養細胞において１３．４％の単球がＩＳＧ１５を発現したことを示した。ｒＬＶＲＮでは９５．０％およびＩＮＦβでは９５．４％の単球がＩＳＧ１５を発現したことをそれぞれ示した。リンパ球分画での測定は、ＰＢＳでは２９．４％、ｒＬＶＲＮでは９１．８％、およびＩＮＦβでは９２．６％のリンパ球がＩＳＧ１５を発現したことをそれぞれ示した。これらの結果は、リーベリンが単球分画とリンパ球分画との両方でＩＳＧ１５の発現を誘導すること、およびリーベリンとＩＮＦβとの間には、単球分画およびリンパ球分画でのＩＳＧ１５の発現誘導に差がないことを示す。
　リーベリンがＢ細胞、Ｔ細胞、およびＣＤ１４陽性単球のいずれにおいてＩＳＧ１５の発現を誘導するかを調べた。
　３ｍｌのＥＤＴＡ血をＦｉｃｏｌｌにて処理してＰＢＭＣｓを調製した。前記ＰＢＭＣｓを、２ｍｌのＲＰＭＩ培地を用いて浮遊細胞用Ｄｉｓｈにて１２時間培養した後に、ｒＬＶＲＮ１．５μｇ／ｍｌまたはＰＢＳ（陰性対照）を培地に添加した。さらに２４時間培養し、ＩＳＧ１５をＰＥで染色し、ＣＤ１４単球をＦＩＴＣで染色し、Ｂ細胞マーカーとしてのＣＤ１９をアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で染色し、Ｔ細胞マーカーとしてＣＤ３をＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ４２１（商標）（ＢＶ４２１（商標））で染色した。染色したＰＢＭＣｓを、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎセルソーターに供し、ＣＤ１４陽性単球分画、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞分画およびＣＤ３陽性Ｔ細胞分画（ＣＤ４およびＣＤ８）にそれぞれ分けた。
　ＣＤ１４陽性単球分画に関して、ＰＢＳを添加した培養細胞での平均蛍光強度は１，６２２であったのに対して、ｒＬＶＲＮを添加した培養細胞での平均蛍光強度は４２，２８７であった。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞分画に関して、ＰＢＳを添加した培養細胞での平均蛍光強度は４７８であったのに対して、ｒＬＶＲＮを添加した培養細胞での平均蛍光強度は３，０３１であった。ＣＤ３陽性Ｔ細胞分画に関して、ＰＢＳを添加した培養細胞での平均蛍光強度は３７２であったのに対して、ｒＬＶＲＮを添加した培養細胞での平均蛍光強度は３，６７８であった。これらの結果は、リーベリンは、ＣＤ１４陽性単球分画、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞分画およびＣＤ３陽性Ｔ細胞分画のいずれでもＩＳＧ１５の発現を誘導することを示し、ＣＤ１４陽性単球分画でのＩＳＧ１５の発現誘導が顕著であったことを示す。
　ｒＬＶＲＮがＩＳＧ１５の発現を誘導する細胞をさらに特定するために、細胞免疫染色を行った。
　３ｍｌのＥＤＴＡ血をＦｉｃｏｌｌにて処理してＰＢＭＣｓを調製した。前記ＰＢＭＣｓを、ｒＬＶＲＮ１．５μｇ／ｍｌを添加した２ｍｌのＲＰＭＩ培地を用いて浮遊細胞用Ｄｉｓｈにて培養した。培養２４時間後に細胞を回収し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間処理して固定化した。固定した細胞を、０．１％トリトンを含むＰＢＳを用いて１０分間の膜透過処理を施した。ＩＳＧ１５はＰＥで染色した。以下のマーカーに対するマウスまたはラビット抗体を一次抗体として用い、Ａｌｅｘａ４８８で標識化した抗マウスまたは抗ラビット抗体を二次抗体として用いた。ＣＤ１４を単球系マーカーとして用いた。ＣＤ１９をＢ細胞マーカーとして用いた。ＣＤ４をＴ細胞マーカーとして用いた。ＣＤ８をＴ細胞マーカーとして用いた。さらに細胞核をヘキストで染色した。
　細胞染色後の試料を蛍光顕微鏡で観察した。リーベリンは、ＣＤ１４陽性単球、ＣＤ１９陽性細胞Ｂ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞のすべてでＩＧＳ１５の発現を誘導したことが観察された。
　ｒＬＶＲＮが、どの細胞タイプに取り込まれてＩＳＧ１５の発現を誘導するかについて調べた。また、ｒＬＶＲＮによるＩＳＧ１５の発現誘導が時間依存的に変化するかについて調べた。
　３ｍｌのＥＤＴＡ血をＦｉｃｏｌｌにて処理してＰＢＭＣｓを調製した。前記ＰＢＭＣｓを２ｍｌのＲＰＭＩ培地を用いて浮遊細胞用Ｄｉｓｈにて２４培養した後に、ＦＩＴＣで標識化したｒＬＶＲＮ１．５μｇ／ｍｌを培地に添加し、さらに４時間または２４時間培養した。培養細胞を回収し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎセルソーターに供し、ＰＢＭＣｓを単球分画およびリンパ球分画に分けた。
　リンパ球分画では、ＦＩＴＣ標識化ｒＬＶＲＮを取り込んだ細胞は、ｒＬＶＲＮ添加４時間後は０．７％であり、添加２４時間後は０．６％であった。単球分画では、ＦＩＴＣ標識化ｒＬＶＲＮを取り込んだ細胞は、ｒＬＶＲＮ添加４時間後は２５．４％であり、添加２４時間後は９６．６％であった。これらの結果は、リーベリンは、単球に取り込まれるが、リンパ球には取り込まれないことを示す。また、リーベリンは単球に時間依存的に取り込まれることを示す。
　実施例８は、リーベリンが、単球に取り込まれた後、単球とリンパ球とでＩＳＧ１５などの特定の遺伝子を誘導することを示唆する。
［実施例９］　リーベリンによる単核から樹状細胞への分化誘導
　リーベリンを取り込んだ単核において、どのような作用が生じるかを調べた。
　３ｍｌのＥＤＴＡ血をＦｉｃｏｌｌにて処理してＰＢＭＣｓを調製した。前記ＰＢＭＣｓを１０ｍｌのＲＰＭＩ培地を用いて浮遊細胞用Ｄｉｓｈにて培養した。培養細胞を回収し、得られた細胞懸濁液にＣＤ１４ Ｍｉｃｒｏ　Ｂｅａｄｓを混合した。前記混合液を、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）に供して、ＣＤ１４陽性細胞を分取した。分取したＣＤ１４陽性細胞を培養ウェルに２重に分注し、各ウェルにｒＬＶＲＮ１．５μｇ／ｍｌまたはＰＢＳを添加した。培養２４時間後に、培養細胞を顕微鏡観察した。培養細胞からＲＮＡを抽出し、前記ＲＮＡをＲＴ－ｑＰＣＲに供し、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ３、ＩＳＧ１５およびＯＡＳ２の４種の遺伝子の発現レベルを調べた。
　ヒト末梢血単核球由来のＣＤ１４陽性細胞をｒＬＶＲＮの存在下で培養すると（図１０ａおよび１０ｂの下図）、ＰＢＳ存在下で培養した場合と比較して（図１０ａおよびｂの上図）、クラスター形成などの形態的変化が観察された。これらの顕微鏡写真は、単球が樹状細胞に分化したことを示唆する。
　下の表は、ＰＢＳ存在下で培養したＣＤ１４陽性細胞での前記４種の遺伝子の発現レベルに対する、ｒＬＶＲＮの存在下で培養したＣＤ１４陽性細胞での前記遺伝子の相対的な発現レベルを示す。下記表は、リーベリンによってＣＤ１４陽性細胞で前記遺伝子の発現が誘導されることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　顕微鏡観察とＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、リーベリンによって単球が樹状細胞に分化し、分化した樹状細胞にて前記４種の遺伝子の発現が誘導され可能性を示唆する。被験者Ｃでは、リーベリンによる前記４種の遺伝子の発現誘導の影響が小さかった。被験者Ｃは不妊治療中であった。
　樹状細胞（ＤＣ）は、抗原提示の様式に応じて、ＭＨＣクラスＩ依存的に外来抗原を提示する樹状細胞（ＸＣＲ１＋　ＤＣ）、ＭＨＣクラスＩＩ依存的に抗原を提示する樹状細胞（ＣＤ１１ｂ＋　ＤＣ）、ウイルス感染時に大量のＩ型ＩＦＮ産生を行う形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、および炎症時に末梢血液中の単球から分化した樹状細胞（ｍｏＤＣ）の４種類に分類され得る。ヒトおよびマウスで共通する各樹状細胞マーカーを以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　リーベリンによって分化した樹状細胞がどのタイプの樹状細胞であるかを調べた。
　ＰＢＭＣｓ由来のＣＤ１４陽性細胞をｒＬＶＲＮの存在下で培養し、培養ＣＤ１４陽性細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを用いて、特定の遺伝子（ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ８０およびＣＤ８６）についてＲＴ－ｑＰＣＲを行った（図１１ａ）。ｒＬＶＲＮの存在下で培養したＰＢＭＣｓ、およびｒＬＶＲＮの存在下で培養したＴＨＰ－１についても、同様に、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った（図１１ｂおよび１１ｃ）。
　ＣＤ１４陽性細胞ではＣＤ１４の発現レベルが低下し、ＣＤ１２３、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルが上昇し、ならびにＣＤ１１ｃの発現レベルに変化がなかったことを示す（図１１ａ）。末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）では、ＣＤ１４陽性細胞と類似した前記特定の遺伝子の発現パターンを示したが、前記遺伝子の発現レベルの変化はＣＤ１４陽性細胞の方が顕著であった（図１１ａおよび１１ｂ）。ＴＨＰ－１では、ＰＢＭＣｓおよびＣＤ１４陽性細胞と異なる傾向の前記特定の遺伝子の発現レベルの変化を示した（図１１ａ～１１ｃ）。
　実施例９は、リーベリンが、ＰＢＭＣｓ由来のＣＤ１４陽性細胞を樹状細胞へと分化させ、前記樹状細胞は、ＣＤ１４陽性細胞と比べて、発現レベルが低下したＣＤ１４（↓）、発現レベルが増加したＣＤ１２３（↑）、ＣＤ８０（↑）およびＣＤ８６（↑）、並びに発現レベルが変化しないＣＤ１１ｃ（→）を特徴とする樹状細胞へと分化させ得ることを示す。
　ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３に着目すると、リーベリンによって分化誘導された樹状細胞は、ＣＤ１１ｃ（＋）ＣＤ１２３（＋）であった。表４で示されるように、ＸＣＲ１＋ ＤＣ、ＣＤ１１ｂ＋ ＤＣおよびｍｏＤＣは、ＣＤ１１ｃ（＋）ＣＤ１２３（－）であるから、リーベリンによって分化誘導された樹状細胞は、これらの樹状細胞サブセットとは異なると考えられる。ｐＤＣは、ＤＣ１１ｃ（－）ＣＤ１２３（＋）であるから、リーベリンによって分化誘導された樹状細胞は、ｐＤＣサブセットとは異なると考えられる。
［実施例１０］　リーベリンによってＰＢＭＣｓから分化誘導された樹状細胞
　リーベリンによってヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）から分化誘導された樹状細胞の細胞マーカーを調べる。
　３ｍｌのＥＤＴＡ血をＦｉｃｏｌｌにて処理してＰＢＭＣｓを調製した。前記ＰＢＭＣｓを２ｍｌのＲＰＭＩ培地を用いて浮遊細胞用Ｄｉｓｈにて２４時間培養した。ｒＬＶＲＮ１．５μｇ／ｍｌまたはＰＢＳ（対照）を培養液に添加して、さらに２４時間培養した。培養細胞を回収し、ＢＶ４２１で標識化した抗ＣＤ１４抗体、ＰＥで標識化した抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体、およびＡＰＣで標識化した抗ＣＤ８３抗体を用いて染色した。ＣＤ１４は単球系マーカーとして、ＨＬＡ－ＤＲは抗原提示細胞（ＡＰＣ）マーカーとして、およびＣＤ８３は成熟樹状細胞マーカーとして利用した。染色した培養細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎセルソーターに供した。
　ｒＬＶＲＮを添加した培地中で培養した成人女性ａ由来のＰＢＭＣｓは、ＨＬＡ－ＤＲを高発現し、かつＣＤ１４を発現していない又は低発現している分画（Ｑ１：ＨＬＡ－ＤＲ（＋）ＣＤ１４（－））に１９．３％の細胞集団を含んだ（図１２ａ）。Ｑ１分画中でＣＤ８３を高発現している細胞集団（ＣＤ８３（＋））は２２．６％であった（図１２ｂ）。ＰＢＳを添加した培養液中で培養した成人女性ａ由来のＰＢＭＣｓは、Ｑ１分画に１２．２％の細胞集団を含み、Ｑ１分画中でＣＤ８３を高発現している細胞集団は６．５％であった。前記と同様の試験を、成人男性ｂ由来のＰＢＭＣｓについても行った。これらの結果を以下の表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　成人女性ａ由来のＰＢＭＣｓでは、添加成分ＰＢＳをｒＬＶＲＮに代えることで、ＨＬＡ－ＤＲ（＋）ＣＤ１４（－）（Ｑ１分画）の細胞集団は１２．２％から１９．３％に増加した。成人男性ｂ由来のＰＢＭＣｓでは、同細胞集団は１５．１％から６．５％に減少した。これらの結果は、ｒＬＶＲＮにより、ＨＬＡ－ＤＲ（＋）ＣＤ１４（－）の細胞集団は必ずしも増加するものではないことを示す。
　成人女性ａ来のＰＢＭＣｓでは、添加成分ＰＢＳをｒＬＶＲＮに代えることで、Ｑ１分画中のＣＤ８３（＋）の細胞集団は６．５％から２６．６％に増加した。成人男性ｂ由来のＰＢＭＣｓでは、同細胞集団は６．８％から２１．４％に増加した。これらの結果は、ＰＢＭＣｓからリーベリンによって誘導される細胞が、成熟樹状細胞マーカーを発現している樹状細胞であることを示唆する。
　リーベリンによってＰＢＭＣｓから分化誘導された樹状細胞の追加の細胞マーカーを調べる。
　上記と同様に、ＰＢＭＣｓを培養し、培養細胞をＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎセルソーターに供した。培養細胞は、ＦＩＴＣで標識化した抗ＣＤ１４抗体、ＰＥで標識化した抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体、ＡＰＣで標識化した抗ＣＤ１１ｃ抗体、およびＢＶ４２１で標識化した抗ＣＤ１２３抗体を用いて染色した。ＣＤ１４は単球系マーカーとして、ＨＬＡ－ＤＲは抗原提示細胞（ＡＰＣ）マーカーとして、ＣＤ１１ｃは樹状細胞マーカー（主としてｍｏＤＣ）として、およびＣＤ１２３は樹状細胞マーカー（主としてｐＤＣ）として利用した。
　ｒＬＶＲＮを添加した培地中で培養した成人女性ｃ由来のＰＢＭＣｓは、Ｑ１分画（ＨＬＡ－ＤＲ（＋）ＣＤ１４（－））に１７．３％の細胞集団を含んだ。Ｑ１分画中でＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３を高発現している細胞集団（ＣＤ１１ｃ（＋）ＣＤ１２３（＋））は５０．７％であった。ＰＢＳを添加した培養液中で培養した成人女性ｃ由来のＰＢＭＣｓは、Ｑ１分画に１５．２％の細胞集団を含み、Ｑ１分画中でＣＤ１１ｃおよびＣＤ１２３を高発現している細胞集団は３．２％であった。これらの結果を以下の表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　成人女性ｃ由来のＰＢＭＣｓでは、添加成分ＰＢＳをｒＬＶＲＮに代えることで、ＨＬＡ－ＤＲ（＋）ＣＤ１４（－）（Ｑ１分画）の細胞集団は１５．２％から１７．３％に増加した。Ｑ１分画中のＣＤ１１ｃ（＋）ＣＤ１２３（＋）の細胞集団は３．２％から５０．７％に顕著に増加した。
　ＦＡＣＳ解析は、ｒＬＶＲＮ存在下で培養することで、単球分画全体からみて、ＣＤ１１ｃ（＋）分画でＣＤ１２３（＋）の細胞集団が増加したことを示した。増加したＣＤ１１ｃ（＋）ＣＤ１２３（＋）細胞集団において、ＣＤ１４（＋）ＨＬＡ－ＤＲ（＋）を示す細胞集団は約９０％であった。これらの結果は、試料間の変動はあるが、ｒＬＶＲＮによりＣＤ１１ｃ（＋）分画でＣＤ１２３（＋）細胞集団が増加することを示す。
　実施例１０は、リーベリン存在下で培養したＰＢＭＣｓではＣＤ１４（－）細胞集団中、ＣＤ８３（＋）の樹状細胞が増加することを示す。実施例１０は、ＣＤ１４陽性細胞であっても陰性細胞であっても、単球分画中でＣＤ１１ｃ（＋）ＣＤ１２３（＋）の樹状細胞が増加することを示す。
　ＣＤ１２３およびＣＤ１１ｃに着目すると、リーベリン存在下で培養したＰＢＭＣｓから分化誘導された樹状細胞は、ＣＤ１２３（＋）ＣＤ１１ｃ（＋）であった。表４で示されるように、ＸＣＲ１＋ ＤＣ、ＣＤ１１ｂ＋ ＤＣおよびｍｏＤＣは、ＣＤ１１ｃ（＋）ＣＤ１２３（－）であるから、リーベリンによって分化誘導された樹状細胞は、これらの樹状細胞サブセットとは異なると考えられる。ｐＤＣは、ＤＣ１１ｃ（－）ＣＤ１２３（＋）であるから、リーベリンによって分化誘導された樹状細胞は、ｐＤＣサブセットとは異なると考えられる。この結果は、実施例９と同じ結果である。
［実施例１１］　分化誘導された樹状細胞でのＩＤＯ１の発現レベル
　被験者由来のＰＢＭＣｓをｒＬＶＲＮの存在下で培養し、培養細胞中のインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１（ＩＤＯ１）の発現量をＲＴ－ｑＰＣＲにより調べた。ＰＢＭＣｓから分取したＣＤ１４陽性細胞をｒＬＶＲＮの存在下で培養し、上記と同様にして、培養細胞中のＩＤＯ１の発現量を調べた（ｎ＝２）。ｒＬＶＲＮに代えてＰＢＳを添加した培地を用いて培養したＰＢＭＣｓ（陰性対照）中のＩＤＯ１の発現量も調べた。陰性対照に対する、各培養条件での培養細胞でのＩＤＯ１の相対的な発現レベルを算出した（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ＰＢＭＣｓをリーベリンの存在下で培養すると、ＩＤＯ１の発現レベルに顕著な増加が観察された。ＣＤ１４陽性細胞をリーベリンの存在下で培養すると、ＩＤＯ１の発現レベルに顕著な増加が観察された。
　実施例９および１１は、ＣＤ１４陽性細胞はリーベリンを取り込むことで、ＩＤＯ１を高発現する樹状細胞に分化し得ることを示唆する。
［実施例１２］　リーベリンを発現するがん細胞に対する抗リーベリン抗体の作用
　リーベリンを発現するがん細胞に、抗リーベリン抗体を適用した。モノクローナル抗リーベリン抗体の適用によって、細胞表面のリーベリンの細胞内への取り込みが観察された。メラノーマ細胞Ａ３７５（培養液ドロップ２０μＬ中に１，０００細胞）をｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐ法により１日培養した。培養したＡ３７５細胞は細胞塊を形成した。Ａ３７５細胞塊にリーベリンを発現したＡ３７５細胞が観察された（図１３ａ）。メラノーマ細胞Ａ３７５（培養液ドロップ２０μＬ中に１０細胞）を、ｐＨｒｏｄｏコンジュゲート抗ＬＶＲＮ抗体の存在下でｈａｎｇｉｎｇ　ｄｒｏｐ法により１日培養した。培養したＡ３７５細胞は２～３個の細胞塊を形成し、リーベリンを発現するＡ３７５細胞が観察された。リーベリンを発現したＡ３７５細胞において、ｐＨｒｏｄｏコンジュゲート抗ＬＶＲＮ抗体の細胞内取込みが観察された（図１３ｂ）。抗リーベリン抗体による細胞膜リーベリンの細胞内への取り込みは、本実施例で用いた３種類の抗体（５－２３抗体を含む）すべてで観察された。
　細胞表面のリーベリンの減少は、単球からＩＤＯ１を発現する樹状細胞への分化を十分に誘導できず、それによって、前記がん細胞が免疫系からの攻撃に曝されることを示唆する。この結果は、抗リーベリン抗体が、リーベリンを発現するがん細胞の存在が特定された再発がんおよび／または転移がんを有効に処置し得ることを示唆する。
　リーベリンを過剰発現するＳｗａｎ７１細胞の形質転換体（Ｓｗａｎ７１＿ＬＶＲＮ）と、５－２３抗体を適用した前記形質転換体とで、遺伝子発現パターンの相違を、マイクロアレイにより調べた。５－２３抗体の適用は、Ｓｗａｎ７１－ＬＶＲＮでの特定の４種の遺伝子およびＩＤＯ１遺伝子の発現量の減少をもたらした。抗リーベリン抗体によるがん細胞でのＩＤＯ１遺伝子発現の減少は、前記がん細胞による免疫系からの攻撃の回避を十分に誘導できず、それによって、前記がん細胞が免疫系からの攻撃に曝されることを示唆する。この結果は、抗リーベリン抗体が、リーベリンを発現するがん細胞の存在が特定された再発がんおよび／または転移がんを効果的に処置し得ることを示唆する。
　卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を浮遊培養し、スフェロイドを形成させた（図１４ａ上段）。細胞傷害剤であるモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）をモノクローナル抗リーベリン抗体である５－２３抗体にコンジュゲートしたＭＭＡＥコンジュゲート５－２３抗体を調製した。前記がん細胞スフェロイドを、ＭＭＡＥコンジュゲート５－２３抗体の存在下で７日間培養した。続いて、前記がん細胞スフェロイドを、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色された細胞（即ち細胞死）が観察された（図１４ａ中段）。この結果は、細胞傷害剤を含む抗リーベリン抗体が、リーベリンを発現するがん細胞の存在が特定された再発がんおよび／または転移がんを効果的に処置し得ることを示唆する。
　乳がん細胞株ＳＫＢＲ３およびメラノーマＳＫ－ＭＥＬ２８についても、ＳＫＯＶ３と同様にして、がん細胞スフェロイドを形成させ、ＭＭＡＥコンジュゲート５－２３抗体の存在下で培養した。この結果、両方のがん細胞スフェロイドで、ＰＩ染色された細胞（即ち細胞死）が観察された。これらの結果は、細胞傷害剤を含む抗リーベリン抗体による再発がんおよび／または転移がんの処置が、様々な種類のがんで有効であることを示唆する。
　図１４ｂ中段は、ＭＭＡＥ非コンジュゲート５－２３抗体単独の存在下で培養した卵巣がん細胞スフェロイドにおいて、ＰＩ染色された細胞（即ち細胞死）が存在したことを示す。この結果は、抗リーベリン抗体自体（細胞傷害剤とのコンジュゲートなし）が再発がんおよび／または転移がんを処置し得ることを示唆する。抗リーベリン抗体自体による細胞死誘導作用は、乳がん細胞株ＳＫＢＲ３、メラノーマＳＫ－ＭＥＬ２８では観察されなかった。これらの結果は、がんの種類によっては、抗リーベリン抗体自体に、リーベリンを発現するがん細胞において細胞死を誘導する作用があることを示唆する。
［実施例１３］　リンパ節転移に関与するリーベリンを発現するがん細胞
　転移がんを有する卵巣がん患者のリンパ節周辺の組織を採取し、免疫染色した。図１５は、輸入リンパ管付近のリンパ節の免疫染色画像を示す。図１６は、輸出リンパ管付近のリンパ節の免疫染色画像を示す。図１５ｂは、輸入リンパ管内に浮遊がん細胞塊が存在することを示す。図１５ｃは、前記細胞塊を構成するがん細胞がリーベリンを発現することを示す。図１５ｄおよび図１５ｅは、転移したリンパ節内の腫瘍部位に、発現量が小さいリーベリン発現がん細胞が存在することを示す。図１６ａおよび図１６ｂは、転移したリンパ節内の腫瘍部位から離脱したがん細胞塊が輸出リンパ管内に存在することを示す。図１６ｃ～図１６ｅは、輸出リンパ管内に存在するがん細胞塊を構成するがん細胞がリーベリンを発現することを示す。図１６ｃは、リンパ節内の転移巣に存在するがん細胞が、リーベリンを発現していないことを示す。
　実施例１３は、原発巣である卵巣がん腫瘍部位から離脱したリーベリンを発現するがん細胞が、輸入リンパ管を通じてリンパ節に到達し得ること、リンパ節に到達したリーベリンを発現するがん細胞はリンパ節内で増殖して転移腫瘍組織（リーベリンの発現レベルが低いがん細胞およびリーベリンを発現しないがん細胞を含む）を形成すること、および転移腫瘍組織から離脱したリーベリンを発現するがん細胞が輸出リンパ管を通じて更に転移し得ることを示す。また、実施例１３は、リンパ節転移に関与したがん細胞は、リンパ管内を浮遊している等の細胞の生存に過酷な状況下でリーベリンを強く発現し、転移巣のように接着して生存できる状況下ではリーベリンを弱く発現するか又は発現しないことを示す。
　リンパ管およびリンパ節には、免疫細胞が集まっており、その免疫機能は高い。本明細書の実施例は、リーベリンを発現するがん細胞は、がん細胞自身がＩＤＯ１を発現することにより免疫系からの攻撃を回避でき、リーベリンと接触した単球をＩＤＯ１を発現する樹状細胞に分化誘導することにより更に免疫系からの攻撃を回避できるようになることを示した。これらの知見は、リーベリンを発現する又はリーベリンを発現できるがん細胞が、リンパ節転移を含む、がんの転移および／または再発に、特に全身転移に重要な役割を果たし得ることを示す。
［実施例１４］　原発巣腫瘍組織の内部で、壊死細胞に囲まれて生存するがん細胞
　転移がんを有する卵巣がん患者の原発巣腫瘍組織は、広範囲の壊死部分を含んだ（図１７ａ）。残存腫瘍が、原発巣腫瘍組織の内部で壊死部分に囲まれた領域に見つかった。前記残存腫瘍は、リーベリンを発現していた（図１７ｂ）。壊死部分では、リーベリンの発現は観察されなかった（図１７ｃ）。壊死部分の外側で生存するがん細胞を含む領域では、リーベリンの発現は観察されなかった（図１７ｄおよび図１７ｅ）。
　原発巣腫瘍組織の内部で壊死細胞に囲まれた残存腫瘍部分に、血管が観察された。壊死部分では血管は観察されなかった。
　実施例１４は、がん細胞が壊死するような細胞の生存に過酷な状況下であっても、リーベリンを発現するがん細胞は生存可能であること、またはそのような過酷な状況下になると、リーベリンを発現できるがん細胞はリーベリンを発現して生存を維持することを示す。実施例１３および１４の結果は、リーベリンを発現できるがん細胞が、細胞の生存に過酷な状況下になると、リーベリンを発現して生存を維持することを示唆する。実施例１４は、リーベリンを発現するがん細胞の周辺には血管が存在した。この結果は、血液に注入された抗がん剤によって、がんの再発および／または転移に重要な役割を果たし得るリーベリンを発現するがん細胞を処置可能であることを示唆する。
［実施例１５］　化学療法抵抗性のがん細胞におけるリーベリン
（検体Ｅ）
　卵巣がんＩＩＩＣ期の患者は、ネオアジュバント療法（ＮＡＣ）としてＴＣ療法を受けた後、腫瘍縮小出術（ＩＤＳ）として腹式子宮単純全摘術（ＡＴＨ）、両側付属器摘出術（ＢＳＯ）および大網切除術（ＯＭＴ）を受けた。前記患者は、ＩＤＳ後にＴＣ療法を受けた。ＩＤＳにて摘出した卵巣を検体Ｅとした。摘出した卵巣の切片を準備し、ＨＥ染色および抗リーベリン抗体を用いて免疫染色した。
　ＴＣ療法後の卵巣がんにおいて、壊死した腫瘍組織と残存する小さな腫瘍組織とが観察された（図１８ａ）。前記残存する腫瘍組織の大部分が壊死した腫瘍組織に囲まれている。残存する腫瘍組織は、リーベリンを発現するがん細胞で構成されていた（図１８ｂ）。
（検体Ｆ）
　卵巣がんＩＩＩＣ期の患者は、ＮＡＣとしてドキセタキセルとカルボプラチンの組合せ療法（ＤＣ療法）を受けた後、ＩＤＳとしてＡＴＨ、ＢＳＯ、ＯＭＴおよび直腸低位前方切除術を受けた。前記患者は、ＩＤＳ後にＤＣ療法を受けた。前記患者は、前記ＤＣ療法の１年後に、腹膜播種を再発した。ＩＤＳにて摘出した卵巣を検体Ｆとした。摘出した卵巣の切片を準備し、ＨＥ染色および抗リーベリン抗体を用いて免疫染色した。
　ＤＣ療法後の卵巣がんにおいて、壊死した主要組織内に分離して存在する幾つかのがん細胞が観察された（図１８ｃ）。前記がん細胞は、壊死した腫瘍組織に囲まれている。前記がん細胞は、リーベリンを発現した（図１８ｄ）。
　実施例１５は、化学療法抵抗性のがん細胞がリーベリンを発現することを示す。この結果は、リーベリンを発現するがん細胞またはリーベリンを発現できるがん細胞が、化学療法を含むがん療法に抵抗性であり、がんの再発および／または転移に、特に局所的な再発に重要な役割を果たし得ることを示す。
［実施例１６］　がん細胞移植マウスにおける抗リーベリン抗体の作用
　リーベリンを発現するように卵巣がん細胞株Ａ２７８０を形質転換して、Ａ２７８０　ＬＶＲＮを作製した。コントロールとして、Ａ２７８０に空ベクターＣＡＧをトランスフェクトして、Ａ２７８０　ＣＡＧ（コントロール）を作製した。
　メスのＢａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス（６～８週齢）の右側の２カ所に、１カ所あたり５×１０６細胞／１００μのＬＡ２７８０　ＬＶＲＮを注入した。同マウスの左側の２カ所に、１カ所あたり５×１０６細胞／１００μのＬＡ２７８０　ＣＡＧを注入し、がん細胞移植マウスを作製した。がん細胞移植マウスは１０匹作製した。
　Ａ２７８０を注入した２日および８日後に、がん細胞移植マウス５匹にＭＭＡＥコンジュゲート５－２３抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を経尾注入し、腫瘍サイズを測定した。Ａ２７８０を注入した２日および８日後に、残りのがん細胞移植マウス５匹にＰＢＳを経尾注入し、腫瘍サイズを測定した。
　Ａ２７８０注入の１５日後に、がん細胞移植マウス１０匹の腫瘍サイズを測定した。
　図１９は、Ａ２７８０　ＬＶＲＮ移植マウスにＰＢＳを投与した場合、Ａ２７８０　ＬＶＲＮ注入後１５日目の腫瘍サイズが約３００ｍｍ３となったことを示す。Ａ２７８０　ＬＶＲＮ移植マウスにＭＭＡＥコンジュゲート５－２３抗体を投与した場合、Ａ２７８０　ＬＶＲＮ注入後１５日目に腫瘍は目視では観察されなかったことを示す。
　実施例１６は、ｉｎ　ｖｉｖｏにてリーベリンを発現するがん細胞で形成される腫瘍が、化学療法剤を含む抗リーベリン抗体によって処置されることを示す。
［実施例１７］　リーベリンを発現するがん
　胎盤部トロフォブラスト腫瘍（ＰＳＴＴ）を患う３名の患者から、ＰＳＴＴ組織をそれぞれ採取した。前記ＰＳＴＴ組織から凍結切片を調製した。前記凍結切片を、５－２３抗体を用いて免疫染色した。前記免疫染色は、腫瘍組織全体でリーベリンが発現されていることを明らかにした。
　実施例１７は、抗リーベリン抗体を含む医薬組成物が、リーベリンを発現する腫瘍（例えば、ＰＳＴＴ）を処置できることを示す。

Claims (11)

  1. 　リーベリンに結合する物質を含む、がんを処置するための医薬組成物。
  2. 　前記リーベリンに結合する物質が、抗リーベリン抗体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記抗リーベリン抗体が、
    （Ａ）
    　アミノ酸配列：ＧＹＳＦＴＤＹＩ（配列番号１）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    　アミノ酸配列：ＩＮＰＹＨＡＧＩ（配列番号２）を含むＣＤＲ－Ｈ２；および
    　アミノ酸配列：ＡＲＧＳＮＹＶＹＹＹＡＭＤ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または
    　アミノ酸配列：ＳＳＶＳＹ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    　アミノ酸配列：ＡＴＳを含むＣＤＲ－Ｌ２；および
    　アミノ酸配列：ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、
    （Ｂ）
    　アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    　アミノ酸配列：ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ２；および
    　アミノ酸配列：ＡＲＤＹＧＳＲＹＹＡＭＤ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または
    　アミノ酸配列：ＥＮＶＶＴＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    　アミノ酸配列：ＧＡＳを含むＣＤＲ－Ｌ２；および
    　アミノ酸配列：ＧＱＧＹＳＹＰ（配列番号１５）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、
    （Ｃ）
    　アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１１）を含むＣＤＲ－Ｈ１；
    　アミノ酸配列：ＩＤＰＹＤＳＥＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ－Ｈ２；および
    　アミノ酸配列：ＡＲＤＹＧＳＲＹＹＡＭＤ（配列番号１３）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または
    　アミノ酸配列：ＳＴＩＳＹ（配列番号１６）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    　アミノ酸配列：ＤＴＳを含むＣＤＲ－Ｌ２；および
    　アミノ酸配列：ＱＱＷＳＳＮＰＰ（配列番号１７）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、あるいは
    （Ｄ）
    　アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号１８）を含むＣＤＲ－Ｈ１；および
    　アミノ酸配列：ＩＹＰＲＳＧＨＳ（配列番号１９）を含むＣＤＲ－Ｈ２を含む重鎖可変領域、および／または
    　アミノ酸配列：ＱＳＬＬＹＳＮＩＱＫＮＹ（配列番号２０）を含むＣＤＲ－Ｌ１；
    　アミノ酸配列：ＷＡＳを含むＣＤＲ－Ｌ２；および
    　アミノ酸配列：ＱＱＹＹＳＹＰ（配列番号２１）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記抗リーベリン抗体が、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を有する、請求項２または３に記載の医薬組成物。
  5. 　前記リーベリンに結合する物質が、細胞傷害剤を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 　前記細胞傷害剤が、放射性同位体、化学療法剤、毒素、および酵素からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　前記がんが、再発がん、転移がん、または抵抗性がん、あるいは絨毛がん、胎盤部トロフォブラスト腫瘍、卵巣がん、卵管がん、子宮がん、子宮頸がん、乳がん、乳腺がん、膠芽腫、大腸がん、前立腺がん、または白血病である、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 　がんの再発、転移または抵抗性を分析する方法であって、
    　その必要のある対象由来の生体試料中のリーベリンを発現しているがん細胞を、リーベリンに結合する物質を用いて検出すること、および
    　検出結果に基づいて、がんの再発、転移または抵抗性を分析することを含む、方法。
  9. 　被験物質と接触可能な条件下でリーベリンを発現しているがん細胞を培養すること、および
    　培養結果に基づいて、前記被験物質を、リーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質と特定することを含む、リーベリンを発現しているがん細胞を障害する物質の特定方法。
  10. 　リーベリンを発現しているがん細胞と、リーベリンを発現していないが、前記がん細胞と起源が同じがん細胞とを比較し、遺伝的因子またはタンパク質性因子の相違を特定することを含む、がんの再発、転移または抵抗性に影響を及ぼす因子を特定する方法。
  11. 　がん幹細胞のバイオマーカーとしての、リーベリンの使用。
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