KR20190087461A - p53 분해 유도 분자 및 의약 조성물 - Google Patents

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에츠코 미야모토
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갓코호우징 도쿄리카다이가쿠
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Abstract

p53 단백질 또는 p53 복합체에 대해 친화성을 갖는 p53 친화성 분자와, 프로테아제에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 단백질 분해 유도 태그의 컨쥬게이트이며, 상기 p53 단백질 또는 p53 복합체의 분해를 유도 가능한 p53 분해 유도 분자, 및 그 p53 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.

Description

p53 분해 유도 분자 및 의약 조성물
본 개시는 p53 분해 유도 분자 및 의약 조성물에 관한 것이다.
p53 단백질은 세포 노화, 세포 주기의 정지, 아포토시스의 유도 등에 관련되는 단백질이며, DNA 손상을 일으키는 스트레스(활성 산소, 방사선 등) 등에 응답하여 활성화된다.
종래, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 신경 질환, 또는 뇌졸중 등의 허혈성 장해에 있어서, p53 단백질의 발현이 항진하여, 신경세포사가 유도되는 것이 알려져 있다. 또한, p53 단백질의 발현 항진이 심장에서의 혈관 신생능을 저하시키는 것 등으로 인해, 심기능 장해의 발증을 촉진하는 것이 알려져 있다. 또한, p53 단백질의 발현 항진이 췌장 β세포에서의 미토콘드리아 기능을 저하시키는 것 등으로 인해, 인슐린 분비능을 저하시켜 당뇨병의 발증을 촉진하는 것이 알려져 있다.
또한, 재생 의료에서 이용되는 다능성 줄기세포(예를 들어 iPS 세포(induced Pluripotent Stem Cell))의 제작에 있어서, p53 유전자의 발현을 억제할 필요가 있는 것이 알려져 있다.
때문에, 다양한 질환의 치료 및 재생 의료에 있어서, p53 단백질의 양(발현)을 감소시키는 방법론이 검토되고 있다.
또한, p53 단백질이 활성화함으로써 암화(癌化)된 세포의 증식 억제 및 아포토시스의 유도가 야기되어, 암이 억제되는 것으로 생각되고 있다. 그러나, 인간의 암에서는 50% 이상의 비율로 p53 단백질이 변이되고 있어, 암 세포의 증식 억제 및 아포토시스의 유도와 같은 기능이 저하되고 있는 것이 알려져 있다.
때문에, 암 치료에 있어서 변이형 p53 단백질의 양(발현)을 감소시키는 방법론이 검토되고 있다.
지금까지 표적 단백질의 양을 RNA 레벨에서 조작하는 기술로서, siRNA(small interfering RNA)를 이용하여 표적 단백질의 mRNA를 분해하는 RNAi(RNA interference) 기술이 알려져 있다.
또한, 표적 단백질의 양을 단백질 레벨에서 조작하는 기술로서, 표적 단백질에 결합하는 분자와 유비퀴틴 리가아제(E3)에 결합하는 분자를 연결한 복합체를 이용하는 기술이 알려져 있다(예를 들어, 특허문헌 1~2, 비특허문헌 1~3 참조). 이 기술은 상기 복합체를 통해 표적 단백질과 유비퀴틴 리가아제를 결부시켜, 표적 단백질을 특이적으로 유비퀴틴화하여 프로테아솜에 의한 분해로 유도하는 것이다. 상기 복합체는 SNIPER(Specific and Nongenetic IAP-dependent Protein ERaser), PROTAC(PROteolysis TArgeting Chimera) 등으로 칭해지는 경우도 있다.
특허문헌 1: 일본 특허 공개 공보 제2013-056837호 특허문헌 2: 미국 특허 명세서 제7208157호
비특허문헌 1: Itoh, Y. et al., "Development of target protein-selective degradation inducer for protein knockdown.", Bioorg. Med. Chem., 2011, 19, 3229-3241 비특허문헌 2: Demizu, Y. et al., "Design and synthesis of estrogen receptor degradation inducer based on a protein knockdown strategy.", Bioorg. Med. Chem. Lett., 2012, 15, 1793-1796 비특허문헌 3: Hines, J. et al., "Posttranslational protein knockdown coupled to receptor tyrosine kinase activation with phosphoPROTACs.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2013, 110(22), 8942-8947
그러나, RNAi 기술은 오프 타겟 효과의 문제가 있으며, 표적 단백질의 양을 특이적으로 컨트롤하는 것은 어렵다. 또한, RNAi 기술은 siRNA의 딜리버리가 어려워, 의약으로의 응용에는 과제가 많다.
한편, 표적 단백질에 결합하는 분자와 유비퀴틴 리가아제에 결합하는 분자를 연결한 복합체를 이용하는 기술은 RNAi 기술에 비해 의약으로의 응용이 용이하다. 그러나, 표적 단백질을 유비퀴틴화하는 방법에는, 하기와 같은 문제점이 있다.
(1) 유비퀴틴 리가아제에는 다수의 종류가 있으며, 표적 특이성이 있다. 때문에, 특정한 표적 단백질을 유비퀴틴화하기 위해서는, 예를 들어 표적 단백질에 맞추어 분자를 설계하는 등, 개개에 대응할 필요가 있다.
(2) 유비퀴틴화 시그널의 컨트롤이 어렵다. 예를 들어, 단백질의 유비퀴틴화는 단백질의 분해 이외에, 분화, 암화 등의 시그널과 관련되는 것이 알려져 있다. 또한, 단백질의 유비퀴틴화에는 조직 특이성 및 시간 특이성이 있는 것이 알려져 있다. 때문에, 표적 단백질의 유비퀴틴화가 표적 단백질의 분해가 아니라, 그 외 시그널이 되는 케이스가 있을 것으로 추정된다.
(3) 유비퀴틴 또는 유비퀴틴화 효소에 불량이 있는 케이스가 있다. 예를 들어, 변이 등에 의해 유비퀴틴이나 유비퀴틴화 효소가 정상적으로 기능하지 않는(기능 불량(malfunction)이 됨) 경우가 있으며, 이것이 질환의 원인인 경우도 많다. 때문에, 표적 단백질의 유비퀴틴화가 표적 단백질의 분해를 유도하지 않는 케이스가 있을 것으로 추정된다.
현재, 일반적으로는 의약품으로서 저해제, 활성화제 등이 설계된다. 그러나, p53 단백질은 언드러거블 타겟(undruggable target)으로 유명한 전사 인자이며, 여전히 신약 개발에 이르지 못했다.
본 개시는 상기와 같은 사정에 비추어, p53 단백질 또는 p53 복합체의 분해를 유도 가능한 p53 분해 유도 분자, 및 그 p53 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 구체적인 수단에는 이하의 실시 양태가 포함된다.
<1> p53 단백질 또는 p53 복합체에 대해 친화성을 갖는 p53 친화성 분자와, 프로테아제에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 단백질 분해 유도 태그의 컨쥬게이트이며, 상기 p53 단백질 또는 p53 복합체의 분해를 유도 가능한 p53 분해 유도 분자.
<2> 유비퀴틴 비의존적으로 상기 p53 단백질 또는 p53 복합체의 분해를 유도 가능한 <1>에 기재된 p53 분해 유도 분자.
<3> 상기 단백질 분해 유도 태그가 프로테아제 저해제의 프로테아제 저해 활성을 실활(失活)시킨 구조를 갖는 <1> 또는 <2>에 기재된 p53 분해 유도 분자.
<4> 상기 프로테아제가 프로테아솜인 <1>~<3> 중 어느 한 항에 기재된 p53 분해 유도 분자.
<5> 상기 단백질 분해 유도 태그가 프로테아솜 저해제의 프로테아솜 저해 활성을 실활시킨 구조를 갖는 <4>에 기재된 p53 분해 유도 분자.
<6> 상기 프로테아솜 저해 활성이 카스파제 유사 활성, 트립신 유사 활성 및 키모트립신 유사 활성에서 선택되는 적어도 1종에 대한 저해 활성인 <5>에 기재된 p53 분해 유도 분자.
<7> <1>~<6> 중 어느 한 항에 기재된 p53 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물.
<8> p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상의 예방 또는 치료에 이용되는 <7>에 기재된 의약 조성물.
<9> 상기 p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상이 암, 세포 노화, 신경 질환, 신경세포사, 당뇨병, 또는 심기능 장해인 <8>에 기재된 의약 조성물.
<10> 상기 p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상이 세포 노화인 <9>에 기재된 의약 조성물.
본 개시에 의하면, p53 단백질 또는 p53 복합체의 분해를 유도 가능한 p53 분해 유도 분자, 및 그 p53 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 TIBC-CANDDY_MLN을 첨가한 HCT116 세포에서의 내재 야생형 p53 단백질 및 MDM2 단백질의 분해(녹다운)에 대해, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 TIBC-CANDDY_MLN을 첨가한 HeLa 세포에서의 내재 야생형 p53 단백질의 분해(녹다운)에 대해, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 마우스 개체에 TIBC-CANDDY_MLN을 투여한 경우의 간장에서의 야생형 p53 단백질 및 MDM2 단백질의 분해(녹다운)에 대해, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 TIBC-CANDDY_MLN을 첨가한 노화 관련 산성 β-갈락토시다아제(SA-β-gal) 유도 TIG3 세포에서의 항노화 작용에 대해, FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 해석에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5a는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β1에 대한, TMP-CANDDY_DMT 및 MG-132의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 5b는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β2에 대한, TMP-CANDDY_DMT 및 MG-132의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 5c는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β5에 대한, TMP-CANDDY_DMT 및 MG-132의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 6은 HeLa 세포에서 강제 발현시킨 ecDHFR 단백질의 TMP-CANDDY_DMT를 통한 분해(녹다운)에 대해, FACS 해석에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7a는 HeLa 세포에서 강제 발현시킨 ecDHFR 단백질의 TMP-CANDDY_DMT를 통한 분해(녹다운)에 대해, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7b는 HeLa 세포에서 강제 발현시킨 ecDHFR 단백질의 TMP-CANDDY_DMT를 통한 분해(녹다운)에 대해, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8a는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β1에 대한, TMP-CANDDY_ALLN 및 ALLN의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 8b는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β2에 대한, TMP-CANDDY_ALLN 및 ALLN의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 8c는 프로테아솜의 촉매 서브유닛 β5에 대한, TMP-CANDDY_ALLN 및 ALLN의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 9는 HeLa 세포에서 강제 발현시킨 ecDHFR 단백질의 TMP-CANDDY_ALLN을 통한 분해(녹다운)에 대해, FACS 해석에 의해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해 상세히 설명한다. 단, 본 발명이 이하의 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 '~'를 이용하여 나타난 수치 범위는 '~'의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.
본 명세서에 있어서 아미노산은 본 기술 분야에서 주지의 1문자 표기(예를 들어 글리신이면 'G') 또는 3문자 표기(예를 들어 글리신이면 'Gly')로 표기한다.
<p53 분해 유도 분자>
본 개시의 p53 분해 유도 분자는 p53 단백질 또는 p53 복합체에 대해 친화성을 갖는 p53 친화성 분자와, 프로테아제에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 단백질 분해 유도 태그의 컨쥬게이트이며, p53 단백질 또는 p53 복합체의 분해를 유도 가능하다. 본 개시의 p53 분해 유도 분자에 의하면, p53 단백질 또는 p53 복합체의 유비퀴틴화를 통하지 않고(즉, 유비퀴틴 비의존적으로), p53 단백질 또는 p53 복합체를 프로테아제(예를 들어 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능해진다.
아울러, 테트라유비퀴틴쇄(Ub4) 등의 폴리유비퀴틴쇄 또는 유비퀴틴 유사 도메인(UbL)은 단백질 분해 유도 태그로서 기능할 가능성이 있는데, 폴리유비퀴틴쇄 또는 유비퀴틴 유사 도메인을 단백질 분해 유도 태그로 한 경우, p53 친화성 분자를 통해 p53 단백질 또는 p53 복합체가 간접적으로 유비퀴틴화되게 된다. 본 명세서에서는, 이러한 p53 단백질 또는 p53 복합체의 간접적인 유비퀴틴화도 p53 단백질 또는 p53 복합체의 유비퀴틴화에 포함되는 것으로 한다.
(p53 친화성 분자)
본 개시의 p53 분해 유도 분자를 구성하는 p53 친화성 분자는 p53 단백질 또는 p53 복합체에 대해 친화성을 갖는 분자이다.
p53 복합체로서는 p53/MDM2 복합체(p53 단백질과 MDM2 단백질의 복합체. 이하 동일), p53/E6 복합체, p53/HDM2 복합체, p53/AICD 복합체, p53/RUNX2 복합체, p53/RUNX3 복합체 등의, p53 단백질과 상호 작용하는 것이 알려져 있는 공지의 분자와의 복합체를 특별히 제한없이 들 수 있다.
여기서, p53 복합체에 대해 친화성을 갖는 분자에는, p53 단백질과 복합체를 형성하는 분자(MDM2 단백질 등)에 대해 친화성을 갖는 분자, 및 형성된 복합체에 대해 친화성을 갖는 분자가 포함된다.
p53 단백질은 야생형일 수도 변이형일 수도 있다. 변이형으로서는, 예를 들어 R175H 변이형(N말단으로부터 175번째 아미노산 잔기의 아르기닌(R)으로부터 히스티딘(H)으로의 변이. 이하 동일), R110L 및 R248W 변이형, V157F 변이형, S166Y 변이형, L194F 변이형, R213Q 및 M237H 변이형, G245V 변이형, G245S 변이형, R248Q 변이형, R248W 변이형, I254D 변이형, L264L 변이형, R273H 및 P309S 변이형, R273C 변이형, R280K 변이형, R282W 변이형, R273H 변이형, S176Y 및 R248W 변이형, V173A 변이형, R249S 변이형, Y220C 변이형, V272M 변이형, G266Q 변이형, G175E 변이형, S241F 변이형 등을 들 수 있다.
종래, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 신경 질환, 또는 뇌졸중 등의 허혈성 장해에 있어서, p53 단백질의 발현이 항진하여 신경세포사가 유도되는 것이 알려져 있다.
또한, 심기능 장해, 당뇨병 등의 질환에 있어서, 심조직, 췌장 조직 등에서의 p53 단백질의 발현량이 증가하고 있는 것이 알려져 있으며, 이들 질환은 p53 단백질에 대한 저해제의 투여에 의해 개선하는 것이 알려져 있다.
또한, p53 단백질은, 노화 인자로서 생활 습관병에서 기인하는 동맥 경화, 대사 이상 등과의 관련도 지적되고 있다.
또한, 재생 의료에서 이용되는 다능성 줄기세포(예를 들어 iPS 세포)의 제작에 있어서, p53 유전자의 발현을 억제할 필요가 있는 것이 알려져 있다.
이에, 바람직한 p53 친화성 분자의 일 예로서는, 야생형(정상형) p53 단백질 또는 야생형(정상형) p53 복합체(야생형 p53 단백질과 야생형 p53 단백질에 친화성을 갖는 분자의 복합체)에 친화성을 갖는 것을 들 수 있다. p53 친화성 분자가 야생형 p53 단백질 또는 야생형 p53 복합체에 친화성을 가짐으로써, 이 야생형 p53 단백질 또는 야생형 p53 복합체를 프로테아제(예를 들어 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능해진다. 결과적으로, 야생형 p53 단백질 또는 야생형 p53 복합체에 친화성을 갖는 p53 친화성 분자를 포함하는 p53 분해 유도 분자는 신경 질환(뇌졸중 등에 의한 신경세포사를 포함함), 심기능 장해, 당뇨병 등의 다양한 질환의 예방 또는 치료, 및 상술한 다능성 줄기세포의 제작에 유용할 것으로 생각된다.
또한, 인간의 암에서는 p53 단백질이 높은 빈도로 변이되고 있으며, 변이형 p53 단백질이 야생형 p53 단백질의 작용을 저해하여, 야생형 p53 단백에 의한 암 세포의 증식 억제 및 아포토시스의 유도를 저해하는 것이 알려져 있다.
이에, 바람직한 p53 친화성 분자의 다른 예로서는, 변이형 p53 단백질 또는 변이형 p53 복합체(변이형 p53 단백질과 변이형 p53 단백질에 친화성을 갖는 분자의 복합체)에 친화성을 갖는 것을 들 수 있다. p53 친화성 분자가 변이형 p53 단백질 또는 변이형 p53 복합체에 친화성을 가짐으로써, 이 변이형 p53 단백질 또는 변이형 p53 복합체를 프로테아제(예를 들어 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능해진다. 결과적으로, 변이형 p53 단백질 또는 변이형 p53 복합체에 친화성을 갖는 p53 친화성 분자를 포함하는 p53 분해 유도 분자는 암 등의 다양한 질환의 예방 또는 치료에 유용할 것으로 생각된다.
아울러, 상술한 표적 단백질을 유비퀴틴화하는 방법에서는, p53 복합체를 구성하는 1개의 단백질만이 유비퀴틴화되고, p53 복합체가 각 단백질로 나누어진 후에, 유비퀴틴화된 단백질만이 분해되는 것으로 생각된다. 이에 반해, p53 복합체에 친화성을 갖는 p53 친화성 분자를 포함하는 p53 분해 유도 분자는 p53 복합체 자체를 분해 가능하다는 점에서 매우 유용하다.
본 명세서에 있어서 'p53 단백질 또는 p53 복합체에 대해 친화성을 갖는다'란, 예를 들어 p53 단백질 또는 p53 복합체에 대해 공유 결합, 수소 결합, 소수 결합, 반데르발스 힘 등에 의해 결합 가능한 것을 의미한다. p53 단백질 또는 p53 복합체와 상호 작용하는 것이 알려져 있는 다른 분자(단백질, 펩타이드, 항체, DNA, RNA, 대사물, 저분자 화합물 등)와 p53 단백질 또는 p53 복합체의 상호 작용이, 어떤 분자에 의해 농도 의존적으로 영향을 받는 경우, 그 분자는 p53 단백질 또는 p53 복합체에 대해 친화성을 갖는다고 판단할 수 있다.
p53 친화성 분자로서는 저분자 화합물, 천연물, 펩타이드, 항체 등을 들 수 있다. 아울러, 본 개시에 있어서, 항체에는 2개의 H쇄와 2개의 L쇄를 포함하는 이른바 면역 글로불린(Ig) 이외에, Ig의 Fab 프래그먼트, F(ab') 프래그먼트 등의 항체에서의 가변 부위를 포함하는 프래그먼트 등이 포함된다. p53 친화성 분자의 분자량은, 저분자 화합물에서는 예를 들어 50~5000의 범위가 바람직하다.
p53 친화성 분자의 구조는 p53 단백질 또는 p53 복합체에 대해 친화성을 갖는 한, 특별히 제한되지 않는다. p53 친화성 분자로서는, p53 단백질에 대해 친화성을 갖는 p53 저해제 또는 p53 활성화제, p53/MDM2 복합체에 대해 친화성을 갖는 MDM2 저해제, p53/MDM2 복합체의 PPI(단백질간 상호 작용) 저해제 등을 사용할 수 있다. 또한, p53 친화성 분자는 후보 분자 중에서 스크리닝에 의해 얻을 수도 있다.
p53 친화성 분자의 일 예를 이하의 표 1~표 7에 나타낸다. 단, 본 개시의 p53 분해 유도 분자에 사용 가능한 p53 친화성 분자가 이들 예로 한정되는 것은 아니다. p53 친화성 분자에 대해서는, 필요에 따라 기존의 데이터베이스(Binding DB(https://www.bindingdb.org/bind/index.jsp), PCI DB(http://www.tanpaku.org/pci/pci_home.html), ProtChemSI(http://pcidb.russelllab.org/) 등)의 정보를 참조할 수 있다.
No. 화합물명 구조식 분자량 표적 게재 논문
1 PRIMA-1MET
(a.k.a. APR-246)
Figure pct00001
 199.3 ·TP53(R175H) ·Oncogene . 2005, 24(21):3484-3491.
·Cancer Cell 2009, 15(5):376-388.
·J. Clin. Oncol. 2012, 30(29):3633-3639.
·Cell Death Dis. 2013, 4:e881.
2 PRIMA-1
Figure pct00002
 185.2 ·TP53(wt)
·TP53(null)
·TP53(R110L/R248W)
·TP53(V157F)
·TP53(S166Y)
·TP53(R175H)
·TP53(L194F)
·TP53(R213Q/M237H)
·TP53(G245V)
·TP53(R248Q)
·TP53(I254D)
·TP53(L264L)
·TP53(R273H/P309S)
·TP53(R273C)
·TP53(R280K)
·TP53(R282W)		 ·Nat . Med. 2002, 8(3):282-288.
·Cancer Cell 2009, 15(5):376-388.
3 MIRA-1
Figure pct00003
 183.2 ·TP53(R175H)
·TP53(R248Q)
·TP53(R273H)
·TP53(R280K)
·TP53(R282W)
·TP53(S176Y/R248W)		 ·J. Biol. Chem. 2005, 280(34):30384-30391.
4 CP-31398
Figure pct00004
 362.5 ·TP53(V173A)
·TP53(R273H)		 ·Science 1999, 286(5449):2507-2510.
·Oncogene 2002, 21(14):2119-2129.
5 STIMA-1
Figure pct00005
 172.2 ·TP53(R175H)
·TP53(R273H)		 ·Mol . Oncol. 2008, 2(1):70-80.
No. 화합물명 구조식 분자량 표적 게재 논문
6 PhiKan083
Figure pct00006
 238.3 ·TP53(Y220C) ·Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 2008, 105(30):10360-10365.
7 NSC319726
Figure pct00007
 234.3 ·TP53(R175H) ·Cancer Cell 2012, 21(5):614-25.
8 WR1065
Figure pct00008
 134.2 ·TP53(wt)
·TP53(V272M)		 ·Mol . Carcinog . 2002, 33(3):181-188.
·Oncogene 2005, 24(24):3964-3975.
·J. Biol . Chem . 2003, 278(14):11879-87.
9 Ellipticine
Figure pct00009
 246.3 ·TP53(R175H)
·TP53(R249S)
·TP53(R273H)		 ·Oncogene 2003, 22(29):4478-4487.
10 PK7088
Figure pct00010
 223.3 ·TP53(Y220C) ·Nucleic Acids Res . 2013, ;41(12):6034-44.
11 Stictic acid
Figure pct00011
 386.3 ·TP53(R175H)
·TP53(G245S)		 ·Nat . Commun . 2013, 4:1407.
No. 화합물명 구조식 분자량 표적 게재 논문
12 SCH529074
Figure pct00012
 563.6 ·TP53(wt)
·TP53(R175H)
·TP53(L194F)
·TP53(S241F)
·TP53(R248W)
·TP53(R273H)		 ·J . Biol . Chem . 2010, 285(14):10198-10212.
13 RETRA
Figure pct00013
 269.3 ·TP53(R273H)
·TP53(R248W)
·TP53(R280K)
·TP53(G266Q)		 ·Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 2008, 105(17):6302-6307.
14 RITA
Figure pct00014
 292.4 ·TP53 ·Nat . Med . 2004, 10(12):1321-1328.
·Nat. Med . 2005, 11(11):1135-1136.
·PLoS One 2012, 7(1):e30215.
·BMC Cancer 2014, 14:437.
15 Gambogic acid
Figure pct00015
 628.8 ·TP53(wt)
·TP53(R175H)
·TP53(G175E)
·TP53(R273H)
·TP53(R280K)		 ·Mol . Cancer Ther . 2008 Oct;7(10):3298-305.
·J. Cell Biochem . 2011 Feb;112(2):509-19.
16 P53R3
Figure pct00016
 592.6 ·TP53(R175H)
·TP53(R248W)
·TP53(R273H)		 ·Cell Death Differ . 2008 Apr;15(4):718-29.
17 RG7112
Figure pct00017
 727.8 ·MDM2 ·Cancer Res . 2013, 73(8):2587-97.
No. 화합물명 구조식 분자량 표적 게재 논문
18 RG7388
Figure pct00018
 616.5 ·MDM2 ·Oncotarget 2015, 6(12):10207-10221.
19 Ro-2443
Figure pct00019
 401.8 ·MDM2 ·Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A. 2012, 109(29):11788-93.
20 Nutlin-3a
Figure pct00020
 581.5 ·MDM2 ·Science 2004, 303(5659):844-848.
21 SAR405838
(a.k.a. MI-77301)
Figure pct00021
 562.5 ·MDM2 ·Cancer Res . 2014 Oct 15;74(20):5855-65.
22 Calcones
Figure pct00022
 351.2 ·MDM2 ·Biochemistry 2001 Jan 16;40(2):336-44.
No. 화합물명 구조식 분자량 표적 게재 논문
23 MI-219
Figure pct00023
 552.5 ·MDM2 ·Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A. 2008 Mar 11;105(10):3933-8.
24 MI-713
Figure pct00024
 592.5 ·MDM2
25 MI-888
Figure pct00025
 548.5 ·MDM2 ·J. Med Chem . 2013 Jul 11;56(13):5553-61.
26 TDP521252
Figure pct00026
 549.4 ·MDM2 ·Mol . Cancer Ther. 2006 Jan;5(1):160-169.
27 AM-8553
Figure pct00027
 478.4 ·MDM2 ·J. Med . Chem . 2012 Jun 14;55(11):4936-54.
No. 화합물명 구조식 분자량 표적 게재 논문
28 Pyrazoles, imidazoles
Figure pct00028
 439 ·MDM2 ·Angew . Chem . Int. Ed . Engl . 2010 Jul 19;49(31):5352-6.
29 Isoindolinone 74a
Figure pct00029
 478.9 ·MDM2 ·J . Med . Chem . 2011 Mar 10;54(5):1233-43.
30 Naturally derived prenylated xanthones
Figure pct00030
 296.3 ·MDM2 ·Biochem . Pharmacol . 2013 May 1;85(9):1234-45.
31 PXN822
Figure pct00031
 668.6 ·MDM2 ·Br . J. Pharmacol . 2012 Jan;165(2):328-44.
·Int. J. Cancer 2013 May 15;132(10):2248-57.
32 NSC-279287
Figure pct00032
 597.6 ·MDM2 ·J . Med . Chem . 2004 Aug 12;47(17):4163-5.
No. 화합물명 구조식 분자량 표적 게재 논문
33 SAH-8 (stapled peptides)
Figure pct00033
 2068 ·MDM2 ·J . Am . Chem . Soc. 2007 Mar 7;129(9):2456-7.
·Cancer Cell . 2010 Nov 16;18(5):411-22.
34 ATSP-7041 (stapled peptide)
Figure pct00034
 1745 ·MDM2 ·Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 2013 Sep 3;110(36):E3445-54.
35 Spiroligomer (alpha-helix mimic)
Figure pct00035
 ·MDM2 ·PLoS One . 2012;7(10):e45948.
(단백질 분해 유도 태그)
본 개시의 p53 분해 유도 분자를 구성하는 단백질 분해 유도 태그는 프로테아제에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 분자이다. 이하에서는, 이 단백질 분해 유도 태그를 CiKD(Chemical interactions and KnockDown) 태그 또는 CANDDY(Chemical AffiNities and Degradation DYnamics) 태그라고도 칭한다.
프로테아제로서는 특별히 제한되지 않으며, 프로테아제 활성을 갖는 모든 분자를 들 수 있다. 예를 들어, 프로테아솜과 같은 복합체형 프로테아제일 수도 있고, 프로테아솜 이외의 프로테아제일 수도 있다. 또한, 프로테아제 활성을 갖는 한, 프로테아솜의 일부분일 수도 있다.
프로테아솜으로서는 예를 들어 26S 프로테아솜, 면역 프로테아솜, 및 흉선 프로테아솜을 들 수 있다.
26S 프로테아솜은 20S 프로테아솜에 19S 프로테아솜이 2개 결합한 것이다. 20S 프로테아솜은 α1~α7의 7개의 서브유닛으로 구성되는 α링과, β1~β7의 7개의 서브유닛으로 구성되는 β링이 αββα의 순으로 겹쳐 쌓인 통 형상 구조를 하고 있으며, β1, β2 및 β5가 각각 카스파제 유사 활성, 트립신 유사 활성 및 키모트립신 유사 활성이라는 촉매 활성을 발휘한다.
면역 프로테아솜은 촉매 서브유닛 β1, β2 및 β5가 각각 β1i, β2i 및 β5i로 치환된 것이다(Science, 1994, 265, 1234-1237).
흉선 프로테아솜은 β1i 및 β2i와 함께, 흉선 피질 상피 세포(cTEC) 특이적으로 발현하는 β5t가 삽입된 것이다(Science, 2007, 316, 1349-1353).
또한, 프로테아솜 이외의 프로테아제로서는 β-세크레타아제, γ-세크레타아제, 아미노펩티다아제, 안지오텐신 변환 효소, 브로멜라인, 카르파인 I, 카르파인 II, 카복시펩티다아제 A, 카복시펩티다아제 B, 카복시펩티다아제 P, 카복시펩티다아제 Y, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 13, 카텝신 B, 카텝신 C, 카텝신 D, 카텝신 G, 카텝신 L, 키모트립신, 클로스트리파인, 콜라게나아제, 보체 C1r, 보체 C1s, 보체 B인자, 보체 D인자, 디펩티딜펩티다아제 I, 디펩티딜펩티다아제 II, 디펩티딜펩티다아제 IV, 디스파제, 엘라스타아제, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Glu-C, 엔도프로테이나제 Lys-C, 피신, 그란자임 B, 칼리크레인, 류신아미노펩티다아제, 매트릭스 메탈로프로테아제, 메탈로프로테아제, 파파인, 펩신, 플라스민, 프로카스파제 3, 프로나아제 E, 프로테이나제 K, 레닌, 서몰리신, 트롬빈, 트립신, 세포질 알라닐아미노펩티다아제, 엔케팔리나아제, 네프릴리신 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 '프로테아제에 대해 친화성을 갖는다'란, 예를 들어 프로테아제에 대해 공유 결합, 수소 결합, 소수 결합, 반데르발스 힘 등에 의해 결합 가능한 것을 의미한다. 어떤 분자의 존재하에서 프로테아제의 열안정성이 변화하는 경우, 그 분자는 프로테아제에 대해 친화성을 갖는다고 판단할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 '프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는다'란, 예를 들어 프로테아제의 분해 활성 사이트에 공유 결합하지 않는 것을 의미한다. 어떤 분자의 존재하에서도 프로테아제에 의해 단백질이 분해되고, 추가로 프로테아제 저해제를 공존시키면 단백질의 분해가 저해되는 경우, 그 분자는 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는다고 판단할 수 있다.
단백질 분해 유도 태그로서는 저분자 화합물, 천연물, 펩타이드, 항체 등을 들 수 있다. 단백질 분해 유도 태그의 분자량은 예를 들어 50~200000의 범위가 바람직하다. 단백질 분해 유도 태그가 저분자 화합물인 경우, 단백질 분해 유도 태그의 분자량은 예를 들어 50~5000의 범위가 바람직하다.
단백질 분해 유도 태그의 구조는 프로테아제에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 것인 한, 특별히 제한되지 않는다. 단백질 분해 유도 태그는 예를 들어 후보 분자 중에서 스크리닝에 의해 얻을 수 있다. 또한, 프로테아제 저해제(예를 들어 프로테아솜 저해제)의 프로테아제 저해 활성(예를 들어 프로테아솜 저해 활성)을 실활시킴으로써 제조할 수도 있다.
어떤 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는 예를 들어 하기 식 (I)으로 표시되는 구조로 할 수 있다. 하기 식 (I)으로 표시되는 화합물은 프로테아제에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 것이 확인되었다(예를 들어 후술하는 참고예 1~4를 참조).
[화학식 1]
Figure pct00036
식 (I)에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 1~20의 탄화수소기, 탄소수 1~20의 알콕시기, 탄소수 6~20의 아릴옥시기, 하이드록시기, 카복시기, 아미노기 또는 할로게노기(halogeno group)를 나타낸다.
탄화수소기로서는 알킬기, 알케닐기, 아릴기, 이들의 조합 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 메틸기, 에틸기 등의 탄소수 1~20의 알킬기; 비닐기, 알릴기 등의 탄소수 2~20의 알케닐기; 페닐기, 나프틸기 등의 탄소수 6~20의 아릴기; 벤질기, 페네틸기 등의 탄소수 7~20의 아릴알킬기; 톨릴기, 자일릴기 등의 탄소수 7~20의 알킬아릴기; 등을 들 수 있다.
할로게노기로서는 플루오로기, 클로로기, 브로모기 등을 들 수 있다.
다른 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는 프로테아솜 저해제의 프로테아솜 저해 활성을 실활시킨 구조로 할 수 있다. 프로테아솜 저해 활성으로서는 보다 구체적으로는, 카스파제 유사 활성, 트립신 유사 활성 및 키모트립신 유사 활성에서 선택되는 적어도 1종에 대한 저해 활성을 들 수 있다.
여기서, '프로테아솜 저해 활성을 실활시킨 구조'에는, 프로테아솜 저해 활성을 완전히 소실시킨 구조뿐 아니라, 프로테아솜 저해 활성을 감약(減弱)시킨 구조도 포함된다. 어떤 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는 카스파제 유사 활성, 트립신 유사 활성 및 키모트립신 유사 활성에서 선택되는 적어도 1종에 대한 50% 저해 농도(IC50)가 원래의 프로테아솜 저해제의 50% 저해 농도(IC50)의 2배 이상이다.
프로테아솜 저해제로서는, 프로테아솜 저해 활성을 갖는 모든 화합물을 사용할 수 있다. 프로테아솜 저해제는 프로테아솜(복합체형 프로테아제)에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아솜에 의한 단백질의 분해를 저해하는 화합물이다. 따라서, 프로테아솜 저해제의 활성 부위를 다른 구조 부분으로 치환하여 프로테아솜 저해 활성을 실활시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
프로테아솜 저해제는 항암제 등으로 연구가 진행되고 있으며, 의약품으로서 인가가 완료된 화합물 및 임상시험 중인 화합물이 많이 존재한다. 또한, 프로테아솜 저해제는 분자량이 비교적 작고, 소수성이 낮은 것이 많아, 세포막 투과성, 세포 독성 등의 문제도 생기기 어렵다. 때문에, 프로테아솜 저해제를 바탕으로 단백질 분해 유도 태그를 합성하는 것은 매우 합리적이면서도 효율적이다.
프로테아솜 저해제의 일 예를 이하의 표 8 및 표 9에 나타낸다. 표 8 및 표 9에 나타내는 프로테아솜 저해제는, 모두 20S 프로테아솜의 활성 중심부에 대해 친화성을 갖는 20S 프로테아솜 저해제이다. 또한, 표 8 및 표 9에 나타내는 프로테아솜 저해제는 당연히 26S 프로테아솜에 대해서도 친화성을 갖는다. 단, 단백질 분해 유도 태그의 제조에 사용 가능한 프로테아솜 저해제가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00037
Figure pct00038
예를 들어, 보론산형 프로테아솜 저해제인 보르테조밉(Bortezomib)은 하기 식에 나타내는 바와 같이, 활성 부위인 보로닐기(boronyl group)가 20S 프로테아솜의 분해 활성 사이트와 공유 결합함으로써, 프로테아솜 활성을 저해하는 것이 알려져 있다(Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115).
[화학식 2]
Figure pct00039
또한, 보론산형 프로테아솜 저해제인 MLN9708 및 MLN2238은 하기 식에 나타내는 바와 같이, 활성 부위인 보론산 에스테르 부위 또는 보로닐기가 20S 프로테아솜의 분해 활성 사이트와 공유 결합함으로써, 프로테아솜 활성을 저해하는 것이 알려져 있다(Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115).
[화학식 3]
Figure pct00040
때문에, 보르테조밉, MLN9708 및 MLN2238의 활성 부위인 보로닐기 또는 보론산 에스테르 부위를 다른 구조 부분(카복시기, 알킬기, 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등)으로 치환하여 프로테아솜 저해 활성을 실활시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
아울러, CEP-18770 등의 다른 보론산형 프로테아솜 저해제에 대해서도, 활성 부위를 다른 구조 부분(카복시기, 알킬기, 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등)으로 치환함으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
또한, 알데히드형 프로테아솜 저해제인 ALLN은 하기 식에 나타내는 바와 같이, 활성 부위인 포르밀기가 20S 프로테아솜의 분해 활성 사이트와 공유 결합함으로써, 프로테아솜 활성을 저해하는 것이 알려져 있다(Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115).
[화학식 4]
Figure pct00041
때문에, ALLN의 활성 부위인 포르밀기를 다른 구조 부분(카복시기, 알킬기, 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등)으로 치환하여 프로테아솜 저해 활성을 실활시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
아울러, MG-132, BSc-2118, PSI 등의 다른 알데히드형 프로테아솜 저해제에 대해서도, 활성 부위인 포르밀기를 다른 구조 부분(카복시기, 알킬기, 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등)으로 치환함으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
프로테아솜 저해제의 프로테아솜 저해 활성을 실활시킨 구조를 갖는 단백질 분해 유도 태그의 일 예를 이하의 표 10 및 표 11에 나타낸다. 표에서의 R로 표시되는 1가의 기로서는, 카복시기, 탄소수 1~20의 알킬기, 탄소수 6~20의 아릴기, 아미노기, 하이드록시기 등을 들 수 있다.
Figure pct00042
Figure pct00043
프로테아솜 저해제의 다른 예를 이하의 표 12~표 17에 나타낸다. 이들 프로테아솜 저해제에 대해서도, 상기와 동일하게 하여 프로테아솜 저해 활성을 실활시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
다른 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는 프로테아제 저해제(상술한 프로테아솜 저해제를 제외함)의 프로테아제 저해 활성을 실활시킨 구조로 할 수 있다.
여기서, '프로테아제 저해 활성을 실활시킨 구조'에는, 프로테아제 저해 활성을 완전히 소실시킨 구조뿐 아니라, 프로테아제 저해 활성을 감약시킨 구조도 포함된다. 어떤 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그는, 프로테아제 저해제의 저해 대상이 되는 프로테아제에 대한 50% 저해 농도(IC50)가 원래의 프로테아제 저해제의 50% 저해 농도(IC50)의 2배 이상이다.
프로테아제 저해제로서는 프로테아제 저해 활성을 갖는 모든 화합물을 사용할 수 있다. 프로테아제 저해제는 프로테아제에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하는 화합물이다. 따라서, 프로테아제 저해제의 활성 부위를 다른 구조 부분으로 치환하여 프로테아제 저해 활성을 실활시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
프로테아제 저해제의 일 예를 이하의 표 18~표 85에 나타낸다. 이들 프로테아제 저해제의 활성 부위를 다른 구조 부분으로 치환하여 프로테아제 저해 활성을 실활시킴으로써, 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다. 단, 단백질 분해 유도 태그의 제조에 사용 가능한 프로테아제 저해제가 이들 예로 한정되는 것은 아니다. 프로테아제 및 프로테아제 저해제에 대해서는, 필요에 따라 기존의 데이터베이스(MEROPS-the peptidase database(http://merops.sanger.ac.uk/index.shtml) 등)의 정보를 참조할 수 있다.
Figure pct00050
Figure pct00051
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Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
아울러, 이상의 설명에서는, 편의상, 프로테아솜 저해제와 프로테아솜 저해제 이외의 프로테아제 저해제를 구별했으나, 프로테아솜과 프로테아솜 이외의 프로테아제의 양자의 활성을 저해 가능한 화합물도 알려져 있다. 따라서, 이러한 화합물을 이용함으로써, 프로테아솜과 프로테아솜 이외의 프로테아제의 양자에 대해 친화성을 갖는 단백질 분해 유도 태그를 얻을 수 있다.
프로테아솜과 프로테아솜 이외의 프로테아제의 양자의 활성을 저해 가능한 화합물의 일 예를 이하의 표 86에 나타낸다. 단, 프로테아솜과 프로테아솜 이외의 프로테아제의 양자의 활성을 저해 가능한 화합물이 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00118
다른 양태에서는, 단백질 분해 유도 태그로서 프로테아솜 활성화제를 사용할 수 있다. 프로테아솜 활성화제는 프로테아솜(복합체형 프로테아제)에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아솜에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 화합물이며, 단백질 분해 유도 태그로서 사용할 수 있다.
프로테아솜 활성화제의 일 예를 이하의 표 87~표 89에 나타낸다. 단, 단백질 분해 유도 태그의 제조에 사용 가능한 프로테아솜 활성화제가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
이상과 같이 예시한 단백질 분해 유도 태그 중에서도, 특히 26S 프로테아솜에 친화성을 갖는 것이 바람직하다. 세포 내의 프로테아솜은 통상적으로 20S 프로테아솜에 19S 프로테아솜이 2개 결합한 26S 프로테아솜 상태로 존재한다. 때문에, 26S 프로테아솜에 친화성을 갖는 단백질 분해 유도 태그를 이용함으로써, 세포 내의 p53 단백질 또는 p53 복합체를 보다 효율적으로 분해로 유도하는 것이 가능해진다.
(p53 친화성 분자와 단백질 분해 유도 태그의 컨쥬게이트의 양식)
p53 친화성 분자와 단백질 분해 유도 태그의 컨쥬게이트의 양식은 p53 친화성 분자의 p53 단백질 또는 p53 복합체와의 친화성, 및 단백질 분해 유도 태그의 프로테아제와의 친화성이 유지되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 아울러, p53 친화성 분자 및 단백질 분해 유도 태그가 모두 단백질인 경우, 양자를 융합한 융합 단백질을 합성하는 것이 가능한데, 이러한 융합 단백질은 '컨쥬게이트'에는 포함되지 않는다.
p53 분해 유도 분자는 예를 들어 적어도 1개의 p53 친화성 분자와 적어도 1개의 단백질 분해 유도 태그가 연결된 구조로 할 수 있다. p53 분해 유도 분자는 1개의 p53 친화성 분자와 1개의 단백질 분해 유도 태그가 연결된 구조일 수도 있고, 1개의 p53 친화성 분자와 복수의 단백질 분해 유도 태그가 연결된 구조일 수도 있고, 복수의 p53 친화성 분자와 1개의 단백질 분해 유도 태그가 연결된 구조일 수도 있고, 복수의 p53 친화성 분자와 복수의 단백질 분해 유도 태그가 연결된 구조일 수도 있다. 어떤 양태에서는, p53 분해 유도 분자는 1개의 p53 친화성 분자와 1개의 단백질 분해 유도 태그가 연결된 구조이다.
p53 친화성 분자에서의 단백질 분해 유도 태그와의 연결 위치는 p53 단백질 또는 p53 복합체와의 친화성이 유지되는 한, 특별히 제한되지 않는다.
한편, 단백질 분해 유도 태그에서의 p53 친화성 분자와의 연결 위치는 프로테아제와의 친화성이 유지되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 단백질 분해 유도 태그가 상술한 바와 같이, 프로테아제 저해제(예를 들어 프로테아솜 저해제)의 활성 부위를 다른 구조 부분으로 치환한 구조인 경우, 이 치환한 다른 구조 부분에서 p53 친화성 분자와 연결할 수 있다. 구체적으로, 프로테아제 저해제의 활성 부위를 카복시기로 치환한 경우, 카복시기를 통해 p53 친화성 분자와 연결할 수 있다.
아울러, p53 친화성 분자 및 단백질 분해 유도 태그는 서로 연결 가능한 구조일 수도 있다. p53 친화성 분자와 단백질 분해 유도 태그를 직접 연결하는 것이 어려운 경우에는, 서로 연결 가능하도록 하는 구조를 p53 친화성 분자 및 단백질 분해 유도 태그 중 적어도 한쪽에 도입하는 것도 생각할 수 있다.
예를 들어, p53 친화성 분자로서는 p53 단백질 또는 p53 복합체에 친화성을 갖는 이미 알려진 분자를 사용할 수 있지만, 이 이미 알려진 분자와 단백질 분해 유도 태그를 직접 연결하는 것이 어려운 경우도 가정할 수 있다. 이러한 경우에는, 단백질 분해 유도 태그와 연결 가능한 구조를 상기 이미 알려진 분자에 도입하여, p53 친화성 분자로서 사용할 수도 있다.
<의약 조성물>
본 개시의 의약 조성물은 본 개시의 p53 분해 유도 분자를 포함하는 것이다. 상술한 바와 같이, 본 개시의 p53 분해 유도 분자에 의하면, p53 단백질 또는 p53 복합체의 유비퀴틴화를 통하지 않고(즉, 유비퀴틴 비의존적으로), p53 단백질 또는 p53 복합체를 프로테아제(예를 들어 프로테아솜)에 의한 분해(녹다운)로 유도하는 것이 가능해진다. 따라서, p53 분해 유도 분자를 포함하는 본 개시의 의약 조성물은 p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다. 본 개시에 의하면, p53 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상의 예방 또는 치료 방법도 또한 제공된다.
아울러, 복합체를 표적으로 한 약제의 설계는 어려운 경우가 많은데, 본 개시의 의약 조성물은 p53 복합체를 표적으로 하여 분해할 수도 있다는 점에서 매우 유용하다.
p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상으로서는, p53 단백질 또는 p53 복합체의 분해에 의해 예방 효과 또는 치료 효과를 기대할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상의 일 예를 이하의 표 90에 나타낸다. 단, p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상이 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
질환 또는 증상 참고 문헌
암
(변이형 p53)		 Li-Fraumeni 증후군 ·Molecular Diagnosis & Therapy vol. 17, pp. 31-47 (2013)
난소암 ·Cold Spring Harbor Perspectives in Biology vol. 2, a001008 (2010)
대장암
식도암
두경부암
인두암
폐암
피부암
췌장암
위암
간암
뇌종양
방광암
유방암
자궁암
연부조직암
전립선암
골육종
경부암
노화 세포 노화 ·Nature vol. 437, pp. 564-568 (2005)
·Nature vol. 16, pp. 718-735 (2017)
지방 노화 ·Nature Medicine vol. 15, pp. 1082-1088 (2009)
신경질환
(신경세포사)		 알츠하이머병
(AD)		 ·Biochemical and Biophysical Research Communications vol. 17, pp. 418-421 (1997)
·The FASEB Journal vol. 19, pp. 255-257 (2005)
·The Journal of Neuroscience, vol. 26, pp. 6377-6385 (2006)
파킨슨병
(PD)		 ·The Journal of Biological Chemistry vol. 277, pp. 50980-58984 (2002)
·Journal of Neurochemistry, vol. 100, pp. 1626-1635 (2007)
·Nature Cell Biology vol. 11, pp. 1370-1375 (2009)
근위축성 측색경화증(ALS) ·Neurobiology of Disease vol. 7, pp. 613-622 (2000)
Angelman 증후군 ·Neuron vol. 21, pp. 799-811 (1998)
뇌졸중 ·Cell vol. 149, pp. 1536-1548 (2012)
기타 당뇨병 ·Nature Medicine vol. 15, pp. 996-997 (2009)
심기능 장해 ·Nature vol. 446, pp. 444-448 (2007)
어떤 양태에서는, 본 개시의 의약 조성물은 세포 노화, 지방 노화, 신경 질환(신경세포사), 당뇨병, 심기능 장해 등의 예방 또는 치료에 이용된다.
종래, 텔로미어(telomere) 단축 또는 DNA 손상에 의해, 세포 증식이 억제되어 세포 노화가 일어나는 것이 알려져 있다. 한편, 조로 증후군의 마우스 모델(Zmpste24 프로테아제 결손 마우스)에서 p53 유전자를 결실시켰더니, β-갈락토시다아제 어세이 등에 의해 노화 형질의 개선이 확인되고, 수명의 연장도 확인된 취지의 보고가 있다(Nature, 2005, 437, 564-568). 본 개시의 의약 조성물에 의하면, p53 단백질 또는 p53 복합체를 분해함으로써, 마찬가지로 세포 노화의 예방 또는 개선 및 수명의 연장이 가능해질 것으로 추측된다.
아울러, 세포 노화는 심근경색, 아테롬성 동맥경화증, 만성 폐색성 폐질환 등의 다양한 질환의 원인이 되는 것도 알려져 있다(Nature, 2017, 16, 718-735). 본 개시의 의약 조성물에 의하면, p53 단백질 또는 p53 복합체를 분해함으로써, 세포 노화가 관계하는 질환 또는 증상의 예방 또는 치료가 가능해질 것으로 추측된다.
또한, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 근위축성 측색경화증(ALS), Angelman 증후군 등의 신경 질환에서는, p53 단백질이 고발현되어 있으며, 신경세포사를 유도하는 주요한 인자가 되고 있다는 것이 보고되었다(Biochemical and Biophysical Research Communications, 1997, 17, 418-21; The FASEB Journal, 2005, 19, 255-257; The Journal of Neuroscience, 2006, 26, 6377-6385; The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277, 50980-58984; Journal of Neurochemistry, 2007, 100, 1626-1635; Nature Cell Biology, 2009, 11, 1370-1375; Neurobiology of Disease, 2000, 7, 613-622; Neuron, 1998, 21, 799-811). 또한, 뇌졸중 등의 허혈성 장해에서는, 재관류 후의 산화 스트레스로 인해 미토콘드리아 매트릭스에 p53 단백질이 축적되고, 그 p53 단백질이 사이클로필린 D(cyclophilin D)와 복합체를 형성함으로써 미토콘드리아 막투과성 천이공(遷移孔)이 개구되어, 신경세포사가 유도되는 것이 보고되었다(Cell, 2012, 149, 1536-1548). 본 개시의 의약 조성물에 의하면, p53 단백질 또는 p53 복합체를 분해함으로써, 신경 질환(신경세포사)의 예방 또는 치료가 가능해질 것으로 추측된다.
또한, 심부전의 비대상기(증상이 진행되고 있는 시기)에서는, DNA 손상, 텔로미어 단축, 저산소 등에 의해 p53 유전자가 활성화한다. p53 유전자가 활성화하면, HIF-1(혈관 신생 인자의 유도에 중요한 전사 인자) 활성 및 혈관 신생 인자의 발현이 저하되어, 심기능 부전이 유도된다. 한편, p53 녹아웃 마우스에서는, 횡대동맥 협착(Transverse Aortic Constriction, TAC)에 의해 제작한 심장압 부가 모델에서 혈관수가 증가하고, 심기능이 유지되었다는 보고가 있다(Nature, 2007, 446, 444-448). 본 개시의 의약 조성물에 의하면, p53 단백질 또는 p53 복합체를 분해함으로써, 마찬가지로 심기능 장해의 예방 또는 치료가 가능해질 것으로 추측된다.
또한, 텔로머레이즈(telomerase) 결손 마우스의 지방 조직에서는, 지방의 노화(β-갈락토시다아제 양성), p53 유전자의 활성화, 나쁜 아디포카인(TNFα 등) 산생(産生)의 증가가 일어난다. 나쁜 아디포카인이 증가하면 인슐린 저항성이 되어, 혈당치가 내려가기 어려워짐으로써 당뇨병이 발증한다. 한편, 지방 조직의 p53 유전자의 결실에 의해 나쁜 아디포카인의 산생이 저하되어, 인슐린 저항성이 개선되었다는 보고가 있다(Nature Medicine, 2009, 15, 996-997; Nature Medicine, 2009, 15, 1082-1088). 본 개시의 의약 조성물에 의하면, p53 단백질 또는 p53 복합체를 분해함으로써, 마찬가지로 당뇨병의 예방 또는 치료가 가능해질 것으로 추측된다.
또한, MDM2 결손 마우스는 태생 치사(embryonic lethal)를 나타내는데, p53 유전자의 결손에 의해 구제 가능한 것이 알려져 있다. 예를 들어, p53 유전자 및 MDM2 유전자의 더블 녹아웃 마우스는 정상적으로 발생한다(Nature, 1995, 378, 203-206; Nature, 1995, 378, 206-208). 본 개시의 의약 조성물을 모체에 부여하고 p53 단백질 또는 p53 복합체를 분해함으로써, MDM2가 결손한 태아의 태생 치사를 회피할 수 있을 것으로 추측된다.
이들 용도에 이용하기 위한 본 개시의 의약 조성물로서는 야생형(정상형) p53 단백질 또는 야생형(정상형) p53 복합체에 대해 친화성을 갖는 p53 친화성 분자와 단백질 분해 유도 태그의 컨쥬게이트인 p53 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물이 바람직하다.
다른 양태에서는, 본 개시의 의약 조성물은 암의 예방 또는 치료에 이용된다.
종래, p53 단백질이 변이형인 암은, 화학 요법 및 방사선 치료에 대해 저항성을 나타내는 것이 알려져 있다. 또한, 많은 암에서 p53 단백질의 변이가 알려져 있다. p53 유전자는 암 억제 유전자이기 때문에, 지금까지 야생형 p53 유전자를 활성화하는 약제의 설계가 이루어져 왔다. 그러나, p53 유전자가 변이되면, 암 억제 유전자여야할 p53 유전자가 암화에 유리하게 된다. 따라서, 변이형 p53 단백질을 분해하는 것은, 차세대 암의 치료에 기여하는 것을 기대할 수 있다.
또한, 암의 방사선 치료 시에 야생형 p53 단백질의 기능을 회복함으로써, 치료 효과가 개선되는 것이 알려져 있다. 방사선 치료와 본 개시의 의약 조성물을 이용한 치료를 병용함으로써, 변이형 p53 단백질을 갖는 암에서의 방사선 치료의 효과가 개선되는 것도 기대할 수 있다.
이들 용도에 이용하기 위한 본 개시의 의약 조성물로서는, 변이형 p53 단백질 또는 변이형 p53 복합체에 대해 친화성을 갖는 p53 친화성 분자와 단백질 분해 유도 태그의 컨쥬게이트인 p53 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물이 바람직하다. 아울러, p53 친화성 분자로서는, 야생형 p53 단백질 또는 야생형 p53 복합체보다 변이형 p53 단백질 또는 변이형 p53 복합체에 대한 친화성이 높은 것을 이용할 수도 있다.
의약 조성물은 p53 분해 유도 분자 이외의 성분을 포함하고 있을 수도 있다. 예를 들어, 의약 조성물은 제재 소재로서 관용의 유기 또는 무기 담체를 포함하고 있을 수도 있다. 이 담체는 고형 제재에서는 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제 등으로서, 액상 제재에서는 용제, 용해 보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제 등으로서 배합된다. 또한, 의약 조성물은 방부제, 항산화제, 착색제, 감미제 등의 제재 첨가물을 포함하고 있을 수도 있다.
의약 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않는다. 의약 조성물의 제형으로서는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 트로키제, 시럽제, 유제, 현탁제, 필름제 등의 경구제; 주사제, 점적제, 외용제, 좌제, 펠렛, 경비(經鼻)제, 경폐제(흡입제), 점안제 등의 비경구제; 등을 들 수 있다.
의약 조성물의 투여량은 투여 대상, 투여 경로, 대상 질환, 증상 등에 따라 적절히 결정된다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다. 이하의 실시예 및 참고예에서, 실온이란 20℃~30℃의 범위를 나타낸다.
이하의 실시예 및 참고예에서 사용되는 화합물 등의 약칭은 이하와 같다.
H-Gly-OtBu·HCl: L-Glycine t-butyl ester hydrochloride
DMF: N, N-Dimethylformamide
DIPEA: N, N-Diisopropylethylamine
PyBOP: 1H-Benzotriazol-1-yloxy-tri(pyrrolidino)phosphonium hexafluorophosphate
TFA: Trifluoroacetic acid
H-Leu-OtBu·HCl: L-Leucine t-butyl ester hydrochloride
D-MEM: Dulbecco's modified eagle's medium
DMSO: Dimethyl sulfoxide
PBS: Phosphate buffered saline
EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid
SDS: Sodium dodecyl sulfate
PAGE: Polyacrylamide gel ectrophoresis
BPB: Bromophenol blue
PVDF: Polyvinylidene difluoride
TBS: Tris buffered saline
GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride
DTT: Dithiothreitol
DEPC: Diethylpyrocarbonate
SA-β-gal: Senescence-associated beta-galactosidase
FITC: Fluorescein isothiocyanate
ec: Escherichia coli
DHFR: Dihydrofolate reductase
TMP: Trimethoprim
DMT-MM: 4-(4, 6-Dimethoxy-1, 3, 5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate
AMC: 7-Amino-4-methylcoumarin
HA: Hemagglutinin
GFP: Green fluorescent protein
DsRed: Discosoma sp. red fluorescent protein
FBS: Fetal bovine serum
<실시예 1>
실시예 1에서는, p53 친화성 분자와 단백질 분해 유도 태그를 연결함으로써, p53 분해 유도 분자인 TIBC-CANDDY_MLN을 합성했다.
p53 친화성 분자로서는, 하기 식으로 표시되는 TIBC-NH2를 이용했다. TIBC-NH2는 하기 식으로 표시되는 TIBC에 H2N-(CH2)6-COOH를 부가시킨 화합물이다. TIBC는 p53/MDM2 복합체에 대해 친화성을 갖는다.
[화학식 5]
Figure pct00122
단백질 분해 유도 태그로서는, 프로테아솜 저해제인 MLN9708 및 MLN2238의 활성 부위(보론산 에스테르 부위 또는 보로닐기)를 카복시기로 치환한 화합물(CANDDY_MLN)을 이용했다.
TIBC-CANDDY_MLN의 합성 방법의 상세는 이하와 같다.
(CANDDY_MLN의 합성)
하기 합성 스킴에 따라 CANDDY_MLN을 합성했다.
[화학식 6]
Figure pct00123
우선, 가지(side arm) 달린 가지(eggplant)형 플라스크에 H-Gly-OtBu·HCl(286.8mg, 1.69mmol, 1eq)을 넣고, 질소 치환했다. 질소 기류하에서 탈수 DMF 10mL와 DIPEA 5mL를 가하고, 실온에서 교반했다. 2, 5-디클로로 안식향산(309.3mg, 1.62mmol, 1eq)을 1mL의 탈수 DMF 및 1mL의 DIPEA에 용해한 후, 반응 용액에 가하고, 실온에서 20분간 교반했다. PyBOP(1.02g, 1.96mmol, 1.2eq)를 1mL의 탈수 DMF에 용해한 후, 반응 용액에 가하고, 실온에서 3시간 교반했다. 반응 용액을 물 및 탄산수소나트륨 수용액으로 희석하고, 아세트산에틸/헥산(=4/1)으로 2회 추출했다. 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거했다. 실리카 겔 크로마토그래피(헥산/클로로포름=1/1~0/1, gradient)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 S1(531.0mg, 1.75mmol, 103%)을 얻었다.
그 다음, 가지형 플라스크에 화합물 S1(212.4mg, 0.70mmol)을 넣고, 디클로로메탄을 5mL 가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, TFA를 5mL 가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 진공 건조하여, 화합물 S2(190.7mg, quant.)를 얻었다.
그 다음, 가지 달린 가지형 플라스크에 화합물 S2(190.7mg, 0.77mmol, 1eq) 및 H-Leu-OtBu·HCl(175.8mg, 0.79mmol, 1eq)을 넣고, 질소 치환했다. 질소 기류하에서 탈수 DMF 5mL와 DIPEA 5mL를 가하고, 실온에서 20분간 교반했다. PyBOP(886.7mg, 1.70mmol, 2.2eq)를 1.5mL의 탈수 DMF에 용해한 후, 반응 용액에 가하고, 실온에서 3시간 교반했다. 반응 용액을 물 및 탄산수소나트륨 수용액으로 희석하고, 아세트산에틸/헥산(=4/1)으로 2회 추출했다. 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거했다. 실리카 겔 크로마토그래피(헥산/클로로포름=1/1~0/1, gradient)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, 화합물 S3(244.2mg, 0.58mmol, 76%)을 얻었다.
그 다음, 가지형 플라스크에 화합물 S3(240.8mg, 0.58mmol)을 넣고, 디클로로메탄을 5mL 가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, TFA를 5mL 가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 진공 건조하여, CANDDY_MLN(214.7mg, 0.59mmol, 100%)을 얻었다.
(TIBC-CANDDY_MLN의 합성)
하기 합성 스킴에 따라 TIBC-CANDDY_MLN을 합성했다.
[화학식 7]
Figure pct00124
가지형 플라스크에 CANDDY_MLN(21.7mg, 0.06mmol, 1eq) 및 별도 합성한 TIBC-NH2(29.3mg, 0.06mmol, 1eq)를 넣고, 탈수 DMF를 5mL 가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, DIPEA를 5mL 가하여, 용액을 중성으로 했다. 실온에서 20분간 교반한 후, PyBOP(46.8mg, 0.09mmol, 1.5eq)를 반응 용액에 직접 가하고, 실온에서 16시간 교반했다. 냉각하에서 포화 탄산수소나트륨 수용액을 가하고, 유기층을 분리한 후, 물층을 아세트산에틸로 추출했다. 유기층을 모아 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 실리카 겔 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=20/1~4/1, gradient)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, TIBC-CANDDY_MLN(10.8mg, 0.013mmol, 22%, isolated yield)을 얻었다. 얻어진 TIBC-CANDDY_MLN은 분취용 박층 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=10/1)를 이용하여 다시 정제 처리를 수행했다.
TIBC-CANDDY_MLN의 물성 데이터를 이하에 나타낸다.
HRMS-FAB(m/z): [M+H]+ calcd for C37H42Cl2N4O5I, 819.1577; found, 819.1577.
<실시예 2>
실시예 2에서는, TIBC-CANDDY_MLN을 첨가한 HCT116 세포(인간 대장암 세포)에서의 내재 야생형 p53 단백질 및 MDM2 단백질의 분해(녹다운)에 대해, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가했다.
(세포 파종)
HCT116 세포를 8×104개/웰의 세포 밀도로 24 웰 플레이트에 파종한 후, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 16시간 배양했다.
(HCT116 세포로의 TIBC-CANDDY_MLN 또는 TIBC의 첨가)
세포 파종으로부터 16시간 후, 이하와 같이 하여, HCT116 세포에 TIBC-CANDDY_MLN 또는 TIBC를 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(와코쥰야쿠코교(주)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.))에 1질량% L-글루타민 용액(Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용했다. 아울러, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. TIBC-CANDDY_MLN 또는 TIBC를 함유하는 DMSO 용액을 DMSO 농도가 1부피%가 되도록 배지와 혼합하여, 각 웰당 500μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 배양했다. 컨트롤로서는 DMSO를 이용했다.
(TIBC-CANDDY_MLN을 통한 내재 야생형 p53 단백질 및 MDM2 단백질의 분해(녹다운)의 평가(웨스턴 블롯 해석))
TIBC-CANDDY_MLN 또는 TIBC 첨가 48시간 후, 배지를 제거하고, PBS를 첨가하여 세포를 세정했다. PBS 제거 후, 세포 용해 버퍼(CelLytic M, Sigma)와 프로테아제 저해제(cOmplete Mini, EDTA-free, Roche)의 혼합 용액을 각 웰당 27μL 첨가했다. 4℃에서 15분간 정치한 후, 피펫 팁을 이용하여 얼음 위에서 세포를 박리했다. 세포 용액을 1.5mL 튜브에 회수하고, 액체 질소로 순간 동결한 후, 얼음 위에서 융해시켰다. 융해 후, 원심분리(13800rpm×20분간, 4℃)하여 상청(세포 추출물)을 회수했다.
회수한 세포 추출물에 대해 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔은 TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 4분간 히트 블록(heat block)했다. 전기 영동은 160V로 65분간 수행했다(영동 버퍼; 195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 2시간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은 5% 탈지유/TBS-T(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6) 내, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 5% 탈지유/TBS-T 내에서 1차 항체 반응을 수행했다. 1차 항체로서는, 항p53 항체(DO-1, SantaCruz, 1500배 희석), 항MDM2 항체(SMP14, SantaCruz, 500배 희석), 및 항GAPDH 항체(6C5, SantaCruz, 20000배 희석)를 이용했다. 4℃에서 하룻밤 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 아울러, 세정은 3회 수행했다. 1차 항체 반응 후, 2% 탈지유/TBS-T 내에서 2차 항체 반응을 수행했다. 2차 항체로서는, 항마우스 IgG(H+L) 항체(A90-116P-33, Bethyl, 20000배 희석)를 이용했다. 실온에서 45분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 아울러, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 TBS(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노 이미지 애널라이저 LAS-3000(후지필름(주)(FUJIFILM Corporation))을 이용하여 검출했다.
웨스턴 블롯 해석 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에 나타내는 바와 같이, TIBC-CANDDY_MLN을 첨가한 경우에는, 내재 야생형 p53 단백질 및 MDM2 단백질의 양이 감소했다. 한편, TIBC를 첨가한 경우에는, 내재 야생형 p53 단백질 및 MDM2 단백질의 양이 감소하지 않았다.
<실시예 3>
실시예 3에서는, TIBC-CANDDY_MLN을 첨가한 HeLa 세포(인간 자궁경암 세포)에서의 내재 야생형 p53 단백질의 분해(녹다운)에 대해, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가했다. 동시에, 프로테아솜 저해제(MLN2238)에 의한 p53 단백질 분해의 구제를 평가했다.
(세포 파종)
HeLa 세포를 4×104개/웰의 세포 밀도로 24 웰 플레이트에 파종한 후, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 16시간 배양했다.
(HeLa 세포로의 TIBC-CANDDY_MLN의 첨가)
세포 파종으로부터 16시간 후, 이하와 같이 하여 HeLa 세포에 TIBC-CANDDY_MLN을 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(와코쥰야쿠코교(주))에 1질량% L-글루타민 용액(Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용했다. 아울러, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. TIBC-CANDDY_MLN을 함유하는 DMSO 용액을 DMSO 농도가 1부피%가 되도록 배지와 혼합하여, 각 웰당 500μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 배양했다. 컨트롤로서는 DMSO를 이용했다. 또한, TIBC-CANDDY_MLN을 함유하는 DMSO 용액을 첨가하는 실험군 외에, TIBC-CANDDY_MLN 및 MLN2238을 둘다, 또는 MLN2238을 함유하는 DMSO 용액을 첨가하는 실험군도 준비했다.
(TIBC-CANDDY_MLN을 통한 내재 야생형 p53 단백질의 분해(녹다운)의 평가(웨스턴 블롯 해석))
TIBC-CANDDY_MLN 또는 MLN2238 첨가 24시간 후, 배지를 제거하고, PBS를 첨가하여 세포를 세정했다. PBS 제거 후, 세포 용해 버퍼(CelLytic M, Sigma)와 프로테아제 저해제(cOmplete Mini, EDTA-free, Roche)의 혼합 용액을 각 웰당 27μL 첨가했다. 4℃에서 15분간 정치한 후, 피펫 팁을 이용하여 얼음 위에서 세포를 박리했다. 세포 용액을 1.5mL 튜브에 회수하고, 액체 질소로 순간 동결한 후, 얼음 위에서 융해시켰다. 융해 후, 원심분리(13800rpm×20분간, 4℃)하여 상청(세포 추출물)을 회수했다.
회수한 세포 추출물에 대해 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔은 TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 4분간 히트 블록했다. 전기 영동은 160V로 65분간 수행했다(영동 버퍼; 195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 2시간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은 5% 탈지유/TBS-T(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6) 내, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 5% 탈지유/TBS-T 내에서 1차 항체 반응을 수행했다. 1차 항체로서는, 항p53 항체(DO-1, SantaCruz, 1000배 희석), 및 항GAPDH 항체(6C5, SantaCruz, 10000배 희석)를 이용했다. 4℃에서 하룻밤 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 아울러, 세정은 3회 수행했다. 1차 항체 반응 후, 2% 탈지유/TBS-T 내에서 2차 항체 반응을 수행했다. 2차 항체로서는, 항마우스 IgG(H+L) 항체(A90-116P-33, Bethyl, 10000배 희석)를 이용했다. 실온에서 30분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 아울러, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 TBS(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노 이미지 애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다.
웨스턴 블롯 해석 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 나타내는 바와 같이, TIBC-CANDDY_MLN을 첨가한 경우에는, 내재 야생형 p53 단백질의 양이 감소했다. 또한, TIBC-CANDDY_MLN 및 MLN2238을 둘다 첨가한 경우에는, 컨트롤(DMSO)보다 야생형 p53 단백질의 양이 증가했다. 이 결과는, TIBC-CANDDY_MLN에 의해, 야생형 p53 단백질이 프로테아솜에 의한 분해로 유도되고 있는 것을 증명하는 것이다.
<실시예 4>
실시예 4에서는, TIBC-CANDDY_MLN을 투여한 마우스 개체에서의 내재 야생형 p53 단백질 및 MDM2 단백질의 분해(녹다운)에 대해, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가했다.
(마우스에의 TIBC-CANDDY_MLN의 투여)
투여 직전에, TIBC-CANDDY_MLN을 DMSO에 용해한 후, DMSO의 농도가 10부피%가 되도록 옥수수유(Code No. 25606-55, Nacalai Tesque)에 용해하고, 50mg/kg 체중 또는 100mg/kg 체중의 투여량으로 C57BL/6J 야생형 마우스(7~8주령, 수컷)(일본 클레아(주)(CLEA Japan, Inc.))에 복강내 투여했다(n=3). 컨트롤로서는, 주사액의 담체(10부피% DMSO를 함유하는 옥수수유)를 이용했다. 마우스는 먹이 및 물을 자유 섭취할 수 있는 환경하에서 사육했다. 투여 48시간 후, 솜노펜틸(somnopentyl, 교리츠 세이야쿠(주)(KYORITSU SEIYAKU CORPORATION))에 의한 심마취하에서 마우스를 해부했다. 개복하고 나서 간장을 적출하고, 액체 질소로 순간 동결시켰다. 액체 질소로 동결 후의 조직은 -80℃의 딥 프리져에서 보관했다.
(마우스 조직의 웨스턴 블롯 해석)
동결한 조직(0.04g)을 분쇄한 후, 980μL의 1×TKM 조직 용해 버퍼(50mM 트리에탄올아민(pH 7.8), 50mM KCl, 5mM MgCl2, 0.25M sucrose, 1mM PMSF, protein inhibitors cocktail-EDTA free(Code No. 03969-21, Nacalai Tesque), 1mM DTT, Recombinant RNase inhibitor 5ul/ml (40U/μl, Cat No. 2313A, Lot No. K8402DA, TAKARA Bio))를 가하고, 15분간 회전(1rpm, 25℃)하여 용해시켰다. 그 후, 원심분리(3000rpm×15분간, 4℃)하여 상청(조직 추출물)을 회수했다. 조직 추출물을 DEPC 처리수에 의해 20배 희석한 것을 이용하여, 분광 광도계로 조직 추출물에서의 단백질 농도를 정량했다.
회수한 조직 추출물에 대해 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔은 TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 5분간 히트 블록했다. 조제한 영동 샘플은 GAPDH 검출용에서는 50μg/웰씩 어플라이하고, 그 이외 검출용에서는 100μg/웰씩 어플라이했다. 전기 영동은 160V로 60분간 수행했다(영동 버퍼; 195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 1.5시간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은 5% 탈지유/TBS-T(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6) 내, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 5% 탈지유/TBS-T 내에서 1차 항체 반응을 수행했다. 1차 항체로서는, 항p53 항체(MAB1355, R&D Systems, Inc., 500배 희석), 항MDM2 항체(sc-965, SantaCruz, 500배 희석) 및 항GAPDH 항체(sc-32233, SantaCruz, 20000배 희석)를 이용했다. 실온에서 60분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 아울러, 세정은 3회 수행했다. 1차 항체 반응 후, 1% 탈지유/TBS-T 내에서 2차 항체 반응을 수행했다. 실온에서 30분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 아울러, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 TBS(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.6)로 10분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노 이미지 애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다. 검출된 밴드의 정량에는, 화상 처리 소프트웨어 ImageJ(NIH)를 이용했다.
웨스턴 블롯 해석 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 나타내는 바와 같이, TIBC-CANDDY_MLN을 50mg/kg 체중 또는 100mg/kg 체중으로 마우스에 투여한 경우에는, 투여 48시간 후의 간장에서의 내재 야생형 p53 단백질 및 MDM2 단백질의 양이 감소했다.
<실시예 5>
실시예 5에서는, TIBC-CANDDY_MLN을 첨가한 노화 관련 산성 β-갈락토시다아제(SA-β-gal) 유도 TIG3 세포(인간 태아 섬유아세포)에서의 항노화 작용에 대해, FACS 해석에 의해 평가했다.
(세포 파종)
정상 세포인 TIG3 세포를 8×104개/웰의 세포 밀도로 24 웰 플레이트에 파종한 후, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 16시간 배양했다.
(TIG3 세포로의 독소루비신(doxorubicin)의 첨가에 의한 SA-β-gal의 유도)
세포 파종으로부터 16시간 후, 독소루비신을 각 웰당 150nM이 되도록 첨가하여, 세포 노화를 유도했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(와코쥰야쿠코교(주))에 1질량% L-글루타민 용액(Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용했다. 아울러, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. 독소루비신 첨가 후, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 24시간 배양했다.
(노화 유도한 TIG3 세포로의 TIBC-CANDDY_MLN의 첨가)
노화 유도로부터 24시간 후, 이하와 같이 하여 TIG3 세포에 TIBC-CANDDY_MLN을 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(와코쥰야쿠코교(주))에 1질량% L-글루타민 용액(Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용했다. 아울러, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. TIBC-CANDDY_MLN을 함유하는 DMSO 용액을 DMSO 농도가 1부피%가 되도록 배지와 혼합하여, 각 웰당 500μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 48시간 배양했다. 컨트롤로서는 DMSO를 이용했다.
(TIBC-CANDDY_MLN에 의한 노화 억제 작용의 평가(FACS 해석))
노화 마커인 SA-β-gal의 정량에는, 시판 키트(Cellular Senescence Detection Kit-SPiDER-βGal((주) 도진카가쿠겐큐쇼)(DOJINDO LABORATORIES))를 이용했다.
TIBC-CANDDY_MLN 첨가 48시간 후, 배지를 제거하고, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(와코쥰야쿠코교(주))을 1mL 첨가하여 세포를 세정했다. 키트에 부속된 Bafilomycin A1 working solution을 각 웰당 200μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 1시간 배양했다. 그 다음, 키트에 부속된 SPiDER-βGal working solution을 각 웰당 200μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 30분간 배양했다. 용액의 제거 후, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(와코쥰야쿠코교(주))을 1mL 첨가하여 세포를 세정했다. 배지를 제거하고, 37℃의 트립신(0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red)(와코쥰야쿠코교(주))을 각 웰당 200μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 1분간 배양했다. 배양 후, D-MEM(Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red)(와코쥰야쿠코교(주))에 10질량% FBS 및 1질량% PenStrep(100U/mL Sodium Penicillin G and 100μg/mL Streptomycin Sulfate)(와코쥰야쿠코교(주))을 첨가한 배지를 각 웰당 300μL 첨가하여 현탁하고, 15mL 튜브에 세포 용액을 회수했다.
유세포 분석(flow cytometry)에는 BD FACSCanto II(BD Biosciences)를 이용하여 FITC 표지된 SA-β-gal을 검출했다. FACS 해석 직전에, 세포 용액을 구멍 지름 32μm의 메쉬에 통과시켜, FACS 튜브로 옮겼다. 해석 소프트 FlowJo(토미 디지털 바이올로지(주)(TOMY DIGITAL BIOLOGY CO., LTD.))에 의해 FITC 강도의 히스토그램을 작성하고, 히스토그램의 쉬프트로부터 TIBC-CANDDY_MLN에 의한 노화 억제 작용을 평가했다.
FACS 해석 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 독소루비신(150nM)을 첨가한 경우에는, 독소루비신을 첨가하지 않는 경우와 비교해 SA-β-gal(노화 마커) 양성으로의 쉬프트가 관찰되었다. 한편, 독소루비신(150nM)을 첨가한 후, TIBC-CANDDY_MLN(50μM)을 첨가한 경우에는, SA-β-gal(노화 마커) 양성으로의 쉬프트가 거의 관찰되지 않았다. 이 결과로부터, TIBC-CANDDY_MLN의 세포 노화 억제 작용(약 80%)을 확인할 수 있었다.
<참고예 1>
참고예 1에서는, 단백질 친화성 분자와 단백질 분해 유도 태그를 연결함으로써, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CANDDY_DMT를 합성했다.
단백질 친화성 분자로서는, ecDHFR 단백질과 결합하는 디히드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase) 저해제인 TMP에 아미노기를 포함하는 관능기를 도입한 TMP 유도체(TMP-NH2)를 이용했다.
또한, 단백질 분해 유도 태그로서는, 상술한 식 (I)에서 R1 및 R2를 모두 메톡시기로 한 화합물(DMT)을 이용했다. DMT는 프로테아솜 저해제에서 유래하지 않지만, 프로테아솜에 대해 친화성을 갖는 화합물이다.
TMP-CANDDY_DMT의 합성 방법의 상세는 하기 합성 스킴과 같다.
[화학식 8]
Figure pct00125
가지형 플라스크에 TMP-NH2(Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637)(31.7mg, 0.073mmol)를 넣고, 탈수 DMF를 0.3mL 가했다. 실온에서 10분간 교반한 후, DIPEA를 0.1mL 가하고, 실온에서 10분간 교반했다. DMT-MM(33.6mg, 0.12mmol, 1.6eq, 와코쥰야쿠코교(주))을 반응 용액에 직접 가하고, 실온에서 18시간 교반했다. 반응 용액을 물 및 탄산수소나트륨 수용액으로 희석하고, 클로로포름으로 5회 추출했다. 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거했다. 실리카 겔 크로마토그래피(클로로포름/메탄올=92/8)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, TMP-CANDDY_DMT(25.8mg, 0.045mmol, 62%, isolated yield)를 얻었다.
<참고예 2>
참고예 2에서는, TMP-CANDDY_DMT의 프로테아솜 저해 활성 및 프로테아솜과의 친화성을 평가했다. 포지티브 컨트롤로서는, 프로테아솜 저해제인 MG-132를 이용했다.
평가에는, 20S Proteasome StressXpress Assay Kit Gold(Bioscience)를 이용하여, 20S 프로테아솜의 β5(키모트립신 유사 활성), β2(트립신 유사 활성) 및 β1(카스파제 유사 활성)의 각 β서브유닛에 특이적인 AMC 결합 프로테아솜 형광 기질의 C말단이 절단됨으로써 생성되는 AMC를 Multi-Detection Microplate Reader(Synergy HT, BIO-TEK)에 의해 측정했다. 측정 파장은 여기광(Ex.)을 360nm, 형광(Em.)을 460nm로 했다.
β1(카스파제 유사 활성), β2(트립신 유사 활성) 및 β5(키모트립신 유사 활성)의 각 프로테아솜 활성을 도 5a~도 5c에 나타낸다.
도 5a~도 5c에 나타내는 바와 같이, TMP-CANDDY_DMT는 MG-132와 비교하여, 프로테아솜 저해 활성이 현저히 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, β1, β2 및 β5 모두에 대해, TMP-CANDDY_DMT의 농도 의존적으로 저해 활성이 높아지는 것으로부터, TMP-CANDDY_DMT가 프로테아솜과 온화한 친화성을 가지고 있는 것이 시사되었다. 즉, DMT는 프로테아솜과 친화성을 가지지만, 분해를 저해하지 않는 것으로 평가되었다.
<참고예 3>
참고예 3에서는, HeLa 세포에서 강제 발현시킨 ecDHFR 단백질의 TMP-CANDDY_DMT를 통한 분해(녹다운)에 대해, FACS 해석에 의해 평가했다.
(플라스미드의 준비)
ecDHFR 단백질을 발현하는 플라스미드(pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)를 대장균에서 증폭한 후, Miniprep Kit(QIAGEN)로 정제했다.
(HeLa 세포로의 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
HeLa 세포에 플라스미드를 도입함으로써, 세포 내에 표적 단백질인 ecDHFR 단백질(상세하게는, HA태그를 통한 ecDHFR 단백질과 GFP의 융합 단백질) 또는 비교용 DsRed 단백질을 일시적으로 과잉 발현시켰다.
HeLa 세포로의 플라스미드 도입은 트랜스펙션 시약인 ScreenFectA(와코쥰야쿠코교(주))를 이용해 통상의 방법에 의해 수행했다. 플라스미드 도입 후의 HeLa 세포를 6×104개/웰의 세포 밀도로 24 웰 플레이트에 파종한 후, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 40시간 배양했다.
(HeLa 세포로의 TMP-CANDDY_DMT의 첨가)
플라스미드를 도입하고 나서 40시간 배양한 후, 이하와 같이 하여 HeLa 세포에 TMP-CANDDY_DMT를 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(와코쥰야쿠코교(주))에 1질량% L-글루타민 용액(Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용하여 각 웰당 297μL 첨가했다. 아울러, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. TMP-CANDDY_DMT를 함유하는 DMSO 용액을 각 웰당 3μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 배양했다. 컨트롤로서는, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(TMP-CANDDY_DMT를 통한 ecDHFR 단백질의 분해(녹다운)의 평가(FACS 해석))
TMP-CANDDY_DMT 첨가 24시간 후, 배지를 제거하고, PBS를 첨가하여 세포를 세정했다. PBS 제거 후, 37℃의 트립신(0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red)(와코쥰야쿠코교(주))을 각 웰당 300μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 1분간 배양했다. 배양 후, D-MEM(Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red)(와코쥰야쿠코교(주))에 10질량% FBS 및 1질량% PenStrep(100U/mL Sodium Penicillin G and 100μg/mL Streptomycin Sulfate)(와코쥰야쿠코교(주))을 첨가한 배지를 각 웰당 500μL 첨가하여 현탁하고, 15mL 튜브에 세포 용액을 회수했다.
회수한 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여 상청을 제거한 후, 2mL의 PBS(37℃)에 의해 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여 상청을 제거한 후, 4℃의 FACS 버퍼(1질량% FBS/PBS)를 500μL 첨가하고, 얼음 위에 정치했다.
유세포 분석에는 BD FACSCanto II(BD Biosciences)를 이용하여 세포 내에서의 GFP 및 DsRed 단백질의 발현을 정량했다. FACS 해석 직전에, 세포 용액을 구멍 지름 32μm의 메쉬에 통과시켜, FACS 튜브로 옮겼다. 해석 소프트 FlowJo(토미 디지털 바이올로지(주))에 의해 세포 1개당 GFP/DsRed 비를 산출하고, 그래프의 쉬프트로부터, TMP-CANDDY_DMT에 의한 ecDHFR 단백질의 분해(녹다운)를 확인했다.
FACS 해석 결과를 도 6에 나타낸다. 도 6에 나타내는 바와 같이, TMP-CANDDY_DMT를 첨가한 경우에는, 농도 의존적으로 그래프가 왼쪽으로 쉬프트하고 있어, TMP-CANDDY_DMT에 의해 ecDHFR 단백질의 분해가 유도되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 한편, TMP를 첨가한 경우에는, 컨트롤(DMSO)과 그래프가 겹쳐 있어, ecDHFR 단백질이 분해되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
<참고예 4>
참고예 4에서는, HeLa 세포에서 강제 발현시킨 ecDHFR 단백질의 TMP-CANDDY_DMT를 통한 분해(녹다운)에 대해, 웨스턴 블롯 해석에 의해 평가했다.
(플라스미드의 준비)
참고예 3과 동일하게 하여, ecDHFR 단백질을 발현하는 플라스미드를 제작했다.
(HeLa 세포로의 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
참고예 3과 동일하게 하여, HeLa 세포에 플라스미드를 도입함으로써, 세포 내에 ecDHFR 단백질 또는 비교용 DsRed 단백질을 일시적으로 과잉 발현시켰다. 플라스미드 도입 후의 HeLa 세포는 4×104개/웰의 세포 밀도로 24 웰 플레이트에 파종한 후, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 40시간 배양했다.
(HeLa 세포로의 TMP-CANDDY_DMT의 첨가)
플라스미드를 도입하고 나서 40시간 배양한 후, 이하와 같이 하여 HeLa 세포에 TMP-CANDDY_DMT를 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(와코쥰야쿠코교(주))에 1질량% L-글루타민 용액(Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용했다. 아울러, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. TMP-CANDDY_DMT를 함유하는 DMSO 용액을 DMSO 농도가 1부피%가 되도록 배지와 혼합하여, 각 웰당 300μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 배양했다. 또한, TMP-CANDDY_DMT를 함유하는 DMSO 용액을 첨가하는 실험군 외에, TMP-CANDDY_DMT 및 보르테조밉(Bortezomib)을 함유하는 DMSO 용액을 첨가하는 실험군도 준비했다. TMP-CANDDY_DMT 첨가 12시간 후, 단백질 합성 저해제인 시클로헥시미드를 50μg/mL의 농도가 되도록 배지 내에 첨가했다. 아울러, 컨트롤로서는, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(TMP-CANDDY_DMT를 통한 ecDHFR 단백질의 분해(녹다운)의 평가(웨스턴 블롯 해석))
TMP-CANDDY_DMT 첨가 24시간 후, 배지를 제거하고, PBS를 첨가하여 세포를 세정했다. PBS 제거 후, 세포 용해 버퍼(CelLytic M, Sigma)와 프로테아제 저해제(cOmplete Mini, EDTA-free, Roche)의 혼합 용액을 각 웰당 55μL 첨가했다. 4℃에서 15분간 정치한 후, 피펫 팁을 이용하여 얼음 위에서 세포를 박리했다. 세포 용액을 1.5mL 튜브에 회수하고, 액체 질소로 순간 동결한 후, 얼음 위에서 융해시켰다. 동결 융해를 3회 반복한 후, 원심분리(13000rpm×20분간, 4℃)하여 상청(세포 추출물)을 회수했다.
회수한 세포 추출물에 대해 웨스턴 블롯 해석을 수행했다. SDS-PAGE 겔은 TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%(Bio-Rad)를 이용하여 제작했다. 영동 샘플은 6×SDS-PAGE sample buffer(62.5mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% 2-메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.25% BPB)에 의해 조제하고, 95℃에서 4분간 히트 블록했다. 전기 영동은 150V로 50분간 수행했다(영동 버퍼; 195mM 글리신, 25mM Tris).
전기 영동 후, 탱크식 블롯 장치 및 전사 버퍼(25mM Tris-HCl, 195mM 글리신, 0.01% SDS, 15% 메탄올)를 이용하여, 100V, 40분간의 조건에서 PVDF 멤브레인(Immobion-P, Millipore)에 단백질을 전사했다. 전사 후의 멤브레인은 5% 탈지유/High-salt TBS-T(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6) 내, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 린스하고, 1% 탈지유/High-salt TBS-T 내에서 항체 반응을 수행했다. 항체로서는 Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity(3F10) Rat monoclonal antibody(25U/mL)(Roche)를 1000배 희석하여 이용했다. 실온에서 1시간 진탕시킨 후, 멤브레인을 High-salt TBS-T로 5분간 세정했다. 아울러, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 High-salt TBS(100mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노 이미지 애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다.
그 다음, 동일한 멤브레인을 이용하여, 컨트롤인 GAPDH의 검출 반응을 수행했다. 멤브레인을 TBS-T(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6)로 세정하고, 5% 탈지유/TBS-T 내, 실온에서 30분간 진탕함으로써 블로킹했다. 블로킹 후, 5% 탈지유/TBS-T 내에서 1차 항체 반응을 수행했다. 1차 항체로서는, 항GAPDH 항체(6C5, SantaCruz, 20000배 희석)를 이용했다. 실온에서 60분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 아울러, 세정은 3회 수행했다. 1차 항체 반응 후, 2% 탈지유/TBS-T 내에서 2차 항체 반응을 수행했다. 2차 항체로서는, 항마우스 IgG(H+L) 항체(A90-116P-33, Bethyl)를 20000배 희석하여 이용했다. 실온에서 30분간 진탕시킨 후, 멤브레인을 TBS-T로 5분간 세정했다. 아울러, 세정은 3회 수행했다. 또한, 멤브레인을 TBS(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.6)로 5분간 세정했다. 그리고, 멤브레인을 화학 발광 시약 Immobilon Western(Millipore)으로 처리한 후, 화학 발광을 루미노 이미지 애널라이저 LAS-3000(후지필름(주))을 이용하여 검출했다. 검출된 밴드의 정량에는 화상 처리 소프트웨어 ImageJ(NIH)를 이용했다.
웨스턴 블롯 해석 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타낸다. 도 7a 및 도 7b에 나타내는 바와 같이, TMP-CANDDY_DMT를 첨가한 경우에는 ecDHFR 단백질의 양이 감소했지만, TMP를 첨가한 경우에는 ecDHFR 단백질의 양이 감소하지 않았다. 또한, TMP-CANDDY_DMT 및 보르테조밉을 둘다 첨가한 경우에는, TMP-CANDDY_DMT를 첨가한 경우와 비교해 ecDHFR 단백질의 분해가 저해되었다. 이 결과는, TMP-CANDDY_DMT에 의해 ecDHFR 단백질이 프로테아솜에 의한 분해로 유도되고 있는 것을 증명하는 것이다.
<참고예 5>
참고예 5에서는, 단백질 친화성 분자와 단백질 분해 유도 태그를 연결함으로써, 단백질 분해 유도 분자인 TMP-CANDDY_ALLN을 합성했다.
단백질 친화성 분자로서는, 참고예 1과 마찬가지로 TMP-NH2를 이용했다.
또한, 단백질 분해 유도 태그로서는, 프로테아솜 저해제인 ALLN의 활성 부위(포르밀기)를 카복시기로 치환한 화합물(CANDDY_ALLN)을 이용했다.
TMP-CANDDY_ALLN의 합성 방법의 상세는 하기 합성 스킴과 같다.
[화학식 9]
Figure pct00126
(CANDDY_ALLN의 합성)
가지형 플라스크에 ALLN(87.2mg, 0.23mmol, 1eq, Code No. 07036-24, 나칼라이테스크(주)(NACALAI TESQUE, INC.))을 넣고, 탈수 DMF를 2mL 가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, Oxone(212.1mg, 0.69mmol, 3eq, Code No. 228036, Sigma-Aldrich)을 반응 용액에 직접 가하고, 실온에서 5시간 교반했다. 반응 용액을 물로 희석한 후, 클로로포름으로 3회 추출했다. 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 감압 증류 제거했다. 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나칼라이테스크(주))(클로로포름/메탄올=20/1~10/1, gradient)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, CANDDY_ALLN(27.0mg, 0.068mmol, 30%)을 얻었다.
(TMP-CANDDY_ALLN의 합성)
가지형 플라스크에 CANDDY_ALLN(26.8mg, 0.067mmol, 1eq) 및 별도 합성한 TMP-NH2(Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637)(26.0mg, 0.060mmol, 0.9eq)를 넣고, 탈수 DMF를 2mL 가했다. 실온에서 5분간 교반한 후, DIPEA를 0.1mL 가하여 용액을 중성으로 했다. 실온에서 5분간 교반한 후, DMT-MM(30.0mg, 0.11mmol, 1.6eq, Code No. 329-53751, 와코쥰야쿠코교(주))을 반응 용액에 직접 가하고, 실온에서 2시간 교반했다. 냉각하에서 10mL의 10질량% 식염수/0.1N 염산 수용액을 가하고, 아세트산에틸로 3회 추출했다. 0.5N 염산 수용액, 이어서 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 실리카 겔 크로마토그래피(Code No. 30511-35, 나칼라이테스크(주))(클로로포름/메탄올=10/1)를 이용한 분리 정제 처리에 의해, TMP-CANDDY_ALLN(8.2mg, 0.010mmol, 15%, isolated yield)을 얻었다.
<참고예 6>
참고예 6에서는, 참고예 2와 동일하게 하여, TMP-CANDDY_ALLN의 프로테아솜 저해 활성 및 프로테아솜과의 친화성을 평가했다.
β1(카스파제 유사 활성), β2(트립신 유사 활성) 및 β5(키모트립신 유사 활성)의 각 프로테아솜 활성을 도 8a~도 8c에 나타낸다.
도 8a~도 8c에 나타내는 바와 같이, β2 및 β5의 활성에 대해, TMP-CANDDY_ALLN에서는 ALLN 단독과 비교해 저해 활성이 약해져, ALLN의 저해 활성이 실활되어 있는 것을 확인할 수 있었다. β1에 대해서는, ALLN에서는 그다지 저해되지 않는 것이 보고되었으며(Kaiser, M. et al., Chem. Bio. Chem., 2004, 5, 1256-1266), 이 보고와 모순되지 않는 결과였다.
또한, β1, β2 및 β5 모두에 대해, TMP-CANDDY_ALLN의 농도 의존적으로 저해 활성이 높아지는 것으로부터, TMP-CANDDY_ALLN과 프로테아솜의 친화성이 확인되었다.
<참고예 7>
참고예 7에서는, HeLa 세포에서 강제 발현시킨 ecDHFR 단백질의 TMP-CANDDY_ALLN을 통한 분해(녹다운)에 대해, FACS 해석에 의해 평가했다.
(플라스미드의 준비)
참고예 3과 동일하게 하여, ecDHFR 단백질을 발현하는 플라스미드(pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP)를 준비했다.
(HeLa 세포로의 플라스미드의 도입 및 세포 파종)
참고예 3과 동일하게 하여, HeLa 세포에 플라스미드를 도입함으로써, 세포 내에 ecDHFR 단백질 또는 비교용 DsRed 단백질을 일시적으로 과잉 발현시켰다. 플라스미드 도입 후의 HeLa 세포는 4×104개/웰의 세포 밀도로 24 웰 플레이트에 파종한 후, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 40시간 배양했다.
(HeLa 세포로의 TMP-CANDDY_ALLN의 첨가)
플라스미드를 도입하고 나서 40시간 배양한 후, 이하와 같이 하여 HeLa 세포에 TMP-CANDDY_ALLN을 첨가했다. 배지로서는, D-MEM(High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate)(와코쥰야쿠코교(주))에 1질량% L-글루타민 용액(Sigma-Aldrich)을 첨가한 무혈청 배지(37℃)를 이용하여, 각 웰당 300μL 첨가했다. 아울러, L-글루타민 용액은 사용 직전에 첨가했다. TMP-CANDDY_ALLN을 함유하는 DMSO 용액을 각 웰당 3μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 배양했다. 컨트롤로서는, TMP를 함유하는 DMSO 용액 또는 DMSO를 이용했다.
(TMP-CANDDY_ALLN을 통한 ecDHFR 단백질의 분해(녹다운)의 평가(FACS 해석))
TMP-CANDDY_ALLN 첨가 24시간 후, 배지를 제거하고, PBS를 첨가하여 세포를 세정했다. PBS 제거 후, 37℃의 트립신(0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red)(와코쥰야쿠코교(주))을 각 웰당 200μL 첨가하고, 37℃, 5부피% CO2의 조건하에서 1분간 배양했다. 배양 후, D-MEM(Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red)(와코쥰야쿠코교(주))에 10질량% FBS 및 1질량% PenStrep(100U/mL Sodium Penicillin G and 100μg/mL Streptomycin Sulfate)(와코쥰야쿠코교(주))을 첨가한 배지를 각 웰당 300μL 첨가하여 현탁하고, 15mL 튜브에 세포 용액을 회수했다.
회수한 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여 상청을 제거한 후, 2mL의 PBS(37℃)에 의해 현탁했다. 현탁 후의 세포 용액을 원심분리(1000rpm×5분간, 4℃)하여 상청을 제거한 후, 4℃의 FACS 버퍼(1질량% FBS/PBS)를 500μL 첨가하고, 얼음 위에 정치했다.
유세포 분석에는 BD FACSCanto II(BD Biosciences)를 이용하여 세포 내에서의 GFP 및 DsRed 단백질의 발현을 정량했다. FACS 해석 직전에, 세포 용액을 구멍 지름 32μm의 메쉬에 통과시켜, FACS 튜브로 옮겼다. 해석 소프트 FlowJo(토미 디지털 바이올로지(주))에 의해 세포 1개당 GFP/DsRed 비를 산출하고, 그래프의 쉬프트로부터, TMP-CANDDY_ALLN에 의한 ecDHFR 단백질의 분해(녹다운)를 확인했다.
FACS 해석 결과를 도 9에 나타낸다. 도 9에 나타내는 바와 같이, TMP-CANDDY_ALLN을 첨가한 경우에는, 컨트롤(DMSO)과 비교해 그래프가 크게 왼쪽으로 쉬프트하고 있어, TMP-CANDDY_ALLN에 의해 ecDHFR 단백질의 분해가 유도되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 한편, TMP를 첨가한 경우에는, 컨트롤(DMSO)과 그래프가 겹쳐 있어, ecDHFR 단백질이 분해되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
2016년 11월 15일에 출원된 일본 출원 2016-222681의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원 및 기술 규격은 개개의 문헌, 특허 출원 및 기술 규격이 참조에 의해 포함되는 것이 구체적 및 개별적으로 기재된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 내에 참조에 의해 포함된다.

Claims (10)

  1. p53 단백질 또는 p53 복합체에 대해 친화성을 갖는 p53 친화성 분자와, 프로테아제에 대해 친화성을 갖는 동시에, 프로테아제에 의한 단백질의 분해를 저해하지 않는 단백질 분해 유도 태그의 컨쥬게이트이며, 상기 p53 단백질 또는 p53 복합체의 분해를 유도 가능한 p53 분해 유도 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    유비퀴틴 비의존적으로 상기 p53 단백질 또는 p53 복합체의 분해를 유도 가능한 p53 분해 유도 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단백질 분해 유도 태그가 프로테아제 저해제의 프로테아제 저해 활성을 실활시킨 구조를 갖는 p53 분해 유도 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로테아제가 프로테아솜인 p53 분해 유도 분자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단백질 분해 유도 태그가 프로테아솜 저해제의 프로테아솜 저해 활성을 실활시킨 구조를 갖는 p53 분해 유도 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 프로테아솜 저해 활성이 카스파제 유사 활성, 트립신 유사 활성 및 키모트립신 유사 활성에서 선택되는 적어도 1종에 대한 저해 활성인 p53 분해 유도 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 p53 분해 유도 분자를 포함하는 의약 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상의 예방 또는 치료에 이용되는 의약 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상이 암, 세포 노화, 신경 질환, 신경세포사, 당뇨병, 또는 심기능 장해인 의약 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 p53 단백질이 중개하는 질환 또는 증상이 세포 노화인 의약 조성물.
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