TW201805627A - 使用尿液生物標記之阿茲海默氏症之輔助診斷方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種阿茲海默氏症(AD)之輔助診斷方法、用於上述方法之檢測試劑及診斷套組、以及診斷系統。
本發明提供一種AD之輔助診斷方法，其包含：對源自從對象採集之尿液的尿試樣中之尿液生物標記之量進行測定的步驟；及基於所測得之尿液生物標記之量，判定上述對象是否罹患AD或其發病風險是否較高之步驟；上述尿液生物標記為選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、IFITM1、IFITM2、IFITM3、NPC1、NPC2、NPC1L1、及MT所組成之群中之至少1種尿蛋白。

Description

使用尿液生物標記之阿茲海默氏症之輔助診斷方法
本發明係關於一種阿茲海默氏症之輔助診斷方法、用於上述方法之檢測試劑及診斷套組、以及診斷系統。
阿茲海默氏症(Alzheimer's disease：AD)係會引起記憶障礙及失智症(Dementia)之進行性神經退化性疾病，於失智症中患者之比例最高。AD不僅會引起記憶障礙亦會破壞患者之人格，使患者喪失社會生活能力，因此AD係不僅給AD患者本人帶來巨大負擔，亦給患者家人帶來巨大負擔之疾病。在向老齡化方向發展之日本，AD及其他失智症之患者數量遽增，成為較大之社會問題。
近年來，作為失智症之前期階段之輕度認知功能障礙(MCI)受到關注。MCI之病因多種多樣，報告有作為亞型之一之健忘型MCI以較高比率向AD轉變。現狀為尚無根治AD之治療方法，為了預防由AD引起之失智症，業界正討論研究在即便無症狀亦有AD病變之階段介入治療之重要性。作為此種討論研究之背景之一，可列舉 藉由生物標記研究而能夠推定AD之腦病理。
於廣泛用於包括AD在內之失智症之診斷的診斷方法中，有基於對受試者問診之改良長谷川式簡易智能評量表(HDS-R)及簡易精神狀態檢查表(Mini-Mental State Examination)(MMSE)。該等問診法係用以篩檢失智症。為了鑑別AD與其他失智症，進而使用有圖像檢查。美國NIA/AA(the National Institute on Aging/Alzheimer's Association，美國國立衰老研究院/阿茲海默氏症協會)於2011年發表了AD之新診斷基準。關於該診斷基準，除基於臨床所見之臨床診斷基準以外，亦採用基於生物標記之診斷基準。
於基於生物標記之AD診斷中，例如有基於神經圖像生物標記(例如根據功能性磁共振成像(fMRI)定量內側顳葉之萎縮)之圖像檢查。於AD診斷中所進行之圖像檢查中，一般使用磁共振成像(MRI)、電腦斷層攝影(CT)、正電子放射斷層攝影(PET)等之攝像裝置。該等攝像裝置由於需要特殊設備，故而能夠進行圖像檢查之設施有限。因此，受檢者為了圖像檢查而必須前往特定醫療機構。另外，檢查會耗費較長時間(約2小時)。如上所述，AD診斷之圖像檢查於地理、時間上之限制較大，並非可簡單地進行之檢查。另外，每次之檢查費用亦會花費數萬日元(非專業文獻1)。
作為用以診斷AD之生化學生物標記，例如可列舉：腦脊髓液(CSF)中之β-澱粉樣蛋白(Aβ)42之降 低或磷酸化tau蛋白之增加。銷售用以測定CSF中之磷酸化tau蛋白之ELISA套組(非專業文獻2)，且CSF中之磷酸化tau蛋白增加係作為生物標記被實用化。然而，該方法於採集CSF時需要使用穿刺針，對於受檢者之身體上之負擔較大(高侵入性)，而不適合於反覆檢查而連續地監測受檢者之狀態之情況。
作為與CSF採集相比侵入性較低之生物體試樣，有血液。關於特定之脂蛋白元之血液中濃度，報告有於AD組與非AD組之間有統計學上之顯著差異(非專業文獻3至6)。然而，該差異並非能夠作為生物標記而實用之程度，另外，採集血液時，對於受試者而言仍然有身體上之負擔。
近年來，細胞外囊泡(extracellular vesicles：EVs)受到關注。細胞外囊泡係自細胞釋放之被脂質雙層膜包圍之奈米尺寸至微米尺寸的囊泡。細胞外囊泡內部不僅保持有細胞內蛋白質，亦保持有於生物體內對於基因表現抑制顯示出重要作用之微RNA(micro RNA)，因此細胞外囊泡作為細胞間之通訊工具受到關注。於血液、尿液、母乳等體液中亦存在之細胞外囊泡係作為用以探索生物標記之生物體試樣而受到關注(非專業文獻7)。
[先前技術文獻] [非專業文獻]
[非專業文獻1]失智症疾病治療準則2010、醫學書院 (監修：日本神經學會)
[非專業文獻2]荒井啟行等、機器‧試劑(2013)36(5)：713-717
[非專業文獻3]Caramelli et al., Acta Neurol Scand(1999)100：61-63
[非專業文獻4]Taddei et al., Neuroscience Letters(1997)223：29-32
[非專業文獻5]Cudaback et al., Journal of Neuroinflammation(2012)9(192)：1-13
[非專業文獻6]Uchida et al., Diagnosis, Assessment & Disease Monitoring(2015)1：270-280
[非專業文獻7]下田麻子等、Drug Delivery System(2014)29-2：108-115
於該領域，業界謀求對受檢者幾乎無身體負擔，且可簡單地實施之AD之輔助診斷方法。
血液中以高濃度存在能夠成為生物標記之多種蛋白質。因此，疾病生物標記之探索通常使用血液。尿中所包含之蛋白質(以下稱為「尿蛋白」)之量與血液中之蛋白質量相比較少。一般認為尿蛋白大多源自腎臟或膀胱等與排尿相關之器官，實際上關於AD，據已知情況，並無著眼於尿液之報告。
本發明者等人對用以AD診斷之生物標記 進行努力研究，令人吃驚的是，於將AD組與非AD組加以比較之情形時，發現尿蛋白之量顯著地變化，從而完成本發明。發明者等人根據此次發現之見解，認為有將血液中之AD相關分子於自血液向尿液排泄之過程中選擇地加以濃縮之可能性，但本發明不受此種假說或推測之任何限定。
本發明係提供以下之阿茲海默氏症之輔助診斷方法、用於上述方法之檢測試劑及診斷套組、以及診斷系統。
本發明之第1態樣係提供一種阿茲海默氏症之輔助診斷方法，其包括如下步驟：(i)對源自從對象採集之尿液的尿試樣中之尿液生物標記之量進行測定的步驟；及(ii)基於所測得之尿液生物標記之量，判定上述對象是否罹患AD或其發病風險是否較高；上述尿液生物標記為選自由脂蛋白元(Apolipoprotein)(以下稱為「Apo」)A-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、干擾素誘導跨膜蛋白(Interferon-induced transmembrane protein)(以下稱為「IFITM」)1、IFITM2、IFITM3、Neimann-Pick C(以下稱為「NPC」)1、NPC2、NPC1L1、及金屬硫蛋白(Metallothionein)(以下稱為「MT」)所組成之群中之至少1種尿蛋白。
於步驟(i)中，例如將可能含有尿液生物標記之尿試樣與針對上述尿液生物標記之檢測試劑加以混 合，而形成上述尿液生物標記與上述檢測試劑之締合體。繼而，例如將上述締合體與未反應之尿液生物標記或檢測試劑進行分離(B/F分離)。於檢測試劑包含螢光物質或發光物質作為標記物質之情形時，從上述締合體檢測到螢光或發光之訊號。於依存(例如成比例)於尿試樣中之尿液生物標記之量而形成上述締合體之情形時，上述訊號之定量參數(例如螢光強度或發光強度)可反映尿試樣中之尿液生物標記之量。根據上述訊號之定量參數，可算出尿試樣中之尿液生物標記之量(例如濃度或含量)。
於步驟(ii)中，基於步驟(i)中所測得之定量參數之測定值或由上述測定值算出之尿液生物標記的濃度或含量，判定所測定之尿試樣之提供者(對象)是否罹患AD或其發病風險是否較高。例如，於將步驟(i)中所測得之尿液生物標記之量、與與該尿液生物標記之量相關之閾值進行比較，而所測得之尿液生物標記之量大於上述閾值之情形時，判定為上述對象罹患AD或其發病風險較高。閾值係例如預先設定之用以判別AD組與非AD組之值。
本發明之第2態樣係提供一種用於第1態樣之方法之檢測試劑。上述檢測試劑包含選自由針對尿液生物標記之抗體、抗體片段、單鏈抗體及適體所組成之群中之至少1種探針，該尿液生物標記為選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、IFITM1、IFITM2、IFITM3、NPC1、NPC2、NPC1L1、及MT所組成之群中之至少1種。檢測試 劑除上述探針以外，亦可進而含有選自由螢光物質、放射性物質及酶所組成之群中之至少1種標記物質。
本發明之第3態樣係提供一種用於第1態樣之方法之診斷套組，其包含第2態樣之檢測試劑。診斷套組進而包含培養盤或珠粒等載體、及/或檢測試劑以外所需之試劑。診斷套組亦可進而包含隨附文書。於隨附文書中例如記載有試劑之使用方法及判定基準。關於判定基準，記載有於例如所測得之尿試樣中之尿液生物標記之量大於與上述尿液生物標記之量相關之閾值之情形時，判定對象罹患AD或其發病風險較高。
本發明之第4態樣係提供一種AD之診斷系統，該系統包含：判定部，其係將源自從對象採集之尿液的尿試樣中之尿液生物標記之量、與關於AD之與上述尿液生物標記之量相關之閾值進行比較，而判定上述對象是否罹患AD或其發病風險是否較高；及顯示部，其顯示上述判定部之判定結果；上述尿液生物標記為選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、IFITM1、IFITM2、IFITM3、NPC1、NPC2、NPC1L1、及MT所組成之群中之至少1種尿蛋白。上述系統可具有資料庫，該資料庫儲存有分別對應於選自上述群中之複數種上述尿液生物標記之上述閾值，上述判定部亦可基於上述源自從對象採集之尿液的尿試樣中之上述尿液生物標記之種類的資訊、以及判定目標疾病是否為AD及心臟疾病中之任一者、或者為兩者之資 訊，自上述資料庫取得對應之上述閾值，並基於上述所取得之閾值進行判定。
本發明之輔助診斷方法由於使用尿液作為生物體試樣，故而於採集尿液時幾乎無身體負擔(非侵入性)。
使用尿試樣之本發明之輔助診斷方法與基於CSF中之生物標記之檢查相比，可非侵入地且簡單地實施。因此，本發明之輔助診斷方法係適合於反覆檢查並連續地監測對象之狀態。本發明之輔助診斷方法與圖像檢查相比，幾乎無地理、時間上之限制，可簡單地實施。另外，由於在試樣採集時無需醫師之處理，且無需昂貴之攝像裝置，故而於費用方面亦有利。
1‧‧‧診斷系統
11‧‧‧測定部
12‧‧‧控制部
13‧‧‧記憶裝置
14‧‧‧資料庫
15‧‧‧判定部
16‧‧‧輸入部
17‧‧‧顯示部
第1圖係表示源自從阿茲海默氏症(AD)組、心臟疾病(coronary heart disease：CHD)組、健康人(healthy subject：HS)組採集之尿液之尿試樣中之尿蛋白(a)ApoB-100、(b)ApoE、(c)ApoC-I、(d)ApoA-I、(e)IFITM2/3、(f)NPC1、及(g)MT之濃度之比較的點圖。
第2圖係表示利用選自(a)ApoB-100、(b)ApoE、(c)IFITM2/3及(d)MT中之2種尿液生物標記之組合的輔助診斷方法的柱圖。
第3圖係表示肌酸酐修正對於尿蛋白量之變動之影響 的摺線圖。
第4圖係表示尿試樣製備中之富集(濃縮)處理之影響的摺線圖。
第5圖係表示於尿試樣製備中進行提取處理(鹼法或冷凍法)之情形及未進行提取處理之情形(未處理)時對尿蛋白(a)ApoB-100、(b)IFITM2/3及(c)MT之回收量之影響的摺線圖。
第6圖係表示將2種尿液生物標記(上：ApoB-100及ApoE、下：ApoB-100及ApoC-I)之共同局部存在設為指標之輔助診斷方法的柱圖。
第7圖係表示診斷系統整體之概略構成之方塊圖。
第8圖係表示診斷系統中之AD之診斷流程之流程圖。
第9圖係表示儲存於資料庫中之關於AD之閾值之資料之例的表。
第10圖係表示診斷系統中之心臟疾病之診斷流程之流程圖。
第11圖係表示儲存於資料庫中之關於心臟疾病之閾值之資料之例的表。
AD係會引起失智症之進行性神經退化性疾病。於本說明書中，AD有視其病狀而分為「由AD引起之失智症」與「由AD引起之輕度認知障礙」之情形。由AD引起之失智症或輕度認知障礙係表示基於公知之臨床診斷基準而診斷為失智症或輕度認知障礙，且基於生物標記之 診斷基準而診斷為AD之病狀。
「對象」可例示哺乳類，例如狗、牛、羊、非人靈長類及人類。對象較佳為人類。於一實施形態中，對象係基於臨床診斷基準而診斷為AD之人類、或者診斷為輕度認知障礙之人類。於另一實施形態中，對象係特別是未見失智症之前兆之人類。於又一實施形態中，對象係診斷為由AD引起之失智症之人類或診斷為由AD引起之輕度認知障礙之人類。
於本說明書及申請專利範圍中，「尿試樣」係指設為測定對象之試樣。尿試樣可為從對象採集之尿液，亦可為進行自下述之含有尿蛋白之複合體(包含細胞外囊泡)提取尿蛋白之提取處理所獲得之試樣。另外，尿試樣亦可為富集了存在於上述複合體中之尿蛋白及/或游離形態之尿蛋白的試樣。尿液之採集方法並無特別限制。尿液可為1天之蓄尿，亦可為隨取尿。於使用隨取尿之情形時，亦可修正隨取尿中之尿蛋白量之變動。作為修正尿蛋白量之變動之方法，並無限定，可列舉尿中肌酸酐修正。於一實施形態中，尿試樣係隨取尿或由隨取尿製備之試樣。源自從對象採集之尿液的尿試樣亦可於不會特別對尿蛋白之測定產生阻礙之範圍內包含添加物。此種添加物並無限定，例如可列舉：緩衝劑、蛋白酶抑制劑、pH值調整劑、界面活性劑、及螯合劑。
「尿蛋白」意指於從對象採集之尿中發現之蛋白質，而並非根據其狀態加以區別者。例如，尿蛋白 於從對象採集之尿中可以游離形態存在，或者亦可與脂質或其他蛋白質形成複合體。
「游離形態之尿蛋白」係表示蛋白質分子單獨或以包含非蛋白質性之分子作為輔因子之全蛋白質之形式可能存在於尿液或尿試樣中之尿蛋白。「含有尿蛋白之複合體」或「含尿蛋白複合體」係表示尿蛋白與其他成分之複合體，並無限定，可列舉：特定之尿蛋白與其他尿蛋白之締合體、尿蛋白與磷脂質之複合體(脂蛋白)、及含有尿蛋白之細胞外囊泡。上述複合體並無限定，有存在至少1種、例如1種、2種或3種或者3種以上之尿蛋白之情形。於本說明書及申請專利範圍內，於1個上述複合體中存在2種以上之尿蛋白之情形時，係指尿液生物標記「共同局部存在」於上述複合體。
「細胞外囊泡」意指脂質雙層膜所包圍之粒子，而非根據其產生機制或尺寸進行區別者。含有至少1種尿蛋白之細胞外囊泡並無限定，但視尿蛋白之種類或對象之狀態，為於脂質雙層膜內部內包有尿蛋白者、或於脂質雙層膜上包含尿蛋白者、或者上述兩者。
「尿液生物標記」係關於AD，其含量或濃度可能發生變化之尿蛋白或其部分肽，表示脂蛋白元、膽固醇輸送相關蛋白質或金屬硫蛋白。
將本發明之脂蛋白元之種類、其等之合成器官及主要之局部存在部分示於表1。
Figure TW201805627AD00001
 HDL：高密度脂蛋白、VLDL：超低密度脂蛋白、LDL：低密度脂蛋白
脂蛋白元係特異性地存在於血漿脂蛋白上之蛋白質。對於脂蛋白元，可見較多之共通結構，根據脂蛋白元基因之觀察而指出其起源之同一性。表1所記載之脂蛋白元於有複數種脂蛋白元中係合成器官及局部存在相同之家族蛋白質。
將本發明之膽固醇輸送相關蛋白質之種類、其等之表現組織、功能、及於AD中之表現變化示於表2。
Figure TW201805627AD00002
IFITM2或IFITM3(本說明書中亦稱為「IFITM2/3」)係於細胞膜及內質網膜中表現之細胞內膽固醇輸送相關蛋白質，於人類體內，除其等以外，亦存在3種同功異型物(IFITM-1、5及10)。IFITM1、2及3分別因由病毒感染所誘導之干擾素γ(IFNγ)而表現亢進。報告有若表現亢進，則IFITM1、2及3於內質網上與膽固醇輸送體相拮抗，而阻礙膽固醇輸送。另外，報告有根據AD患者死後腦之RNA表現解析，IFITM1、2及3之表現上升(Molecular Neurodegeneration(2009)4(5)：1-14、及IUBMB Life(2004)56(6)：349-354)。如此，IFITM1、2及3於表現部位、IFNγ及AD中之表現變化傾向方面共通。另一方面，IFITM5及10並非由IFNγ所誘導，且其等之功能目 前尚不明確(J.Biol.Chem.(2015)290：25946-25959)。
NPC1係尼曼-匹克C型病之原因基因，且已知與膽固醇輸送相關。關於NPC1，根據使用AD患者死後腦之RNA表現解析，報告有於海馬區NPC1之表現亢進(Biochimica et Biophysica Acta(2010)1801：831-838)。關於尼曼-匹克C型病之原因基因，除NPC1以外，亦有NPC2。NPC1及NPC2兩者均無處不在地表現，且具有細胞內膽固醇輸送功能(Neurobiology of Disease(2014)72：37-47)。如上所述，NPC1及NPC2於蛋白質之表現部位及功能方面共通。關於NPC1，NPC1-L1相對於人類NPC1，具有42%之胺基酸同源性(Genebank Accession No.AF002020)。
MT係作為會與鋅、銅、鎘等重金屬進行螯合之蛋白質而為人所知。於人類體內，已知MT存在9種同功異型物MT-1A、MT-1B、MT-1E、MT-1F、MT-1G、MT-1H、MT-1X、MT-2A、MT-3。表3係表示本發明之MT之同功異型物、及其等之表現組織。
Figure TW201805627AD00003
於一實施形態中，尿液生物標記為選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、IFITM1、IFITM2、IFITM3、NPC1、NPC2、NPC1L1、及MT所組成之群中之至少1種(例如1種、2種、3種或3種以上之組合)或者選自上述群中之至少2種(例如2種、3種或3種以上之組合)之尿蛋白。
於一實施形態中，尿液生物標記係選自由ApoA-I、ApoB-100、ApoC-I、ApoD、ApoE、IFITM2、IFITM3、NPC1、及MT所組成之群中之至少1種、例如1種、2種、3種或3種以上之尿蛋白的組合。於另一實施形態中，尿液生物標記係選自由ApoA-I、ApoB-100、ApoC-I、ApoD、ApoE、IFITM2、及IFITM3所組成之群中之至少1種、例 如1種、2種、3種或3種以上之尿蛋白的組合。
於一實施形態中，尿液生物標記係選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、及ApoE所組成之群中之至少1種(例如1種、2種、3種或3種以上之組合)或者選自上述群中之至少2種(例如2種、3種或3種以上之組合)之尿蛋白。
於一實施形態中，尿液生物標記係選自由IFITM1、IFITM2、IFITM3、NPC1、NPC2及NPC1L1所組成之群中之至少1種(例如1種、2種、3種或3種以上之組合)或者選自上述群中之至少2種(例如2種、3種或3種以上之組合)之尿蛋白。
於一實施形態中，尿液生物標記係選自由MT-1A、MT-1B、MT-1E、MT-1F、MT-1G、MT-1H、MT-1X、MT-2A及MT-3所組成之群中之至少1種(例如，1種、2種、3種或3種以上之組合)或者選自上述群中之至少2種(例如2種、3種或3種以上之組合)之尿蛋白。
「尿液生物標記之量」係例如尿試樣中之尿液生物標記之含量及濃度。其等之值係藉由能夠定量地測定蛋白質或部分肽之方法而測定。作為此種方法，例如可列舉：應用抗原抗體反應或經組合之ELISA、西方墨點法、質譜法、及流動式細胞測量術，但並不限定於其等。
於另一例中，尿液生物標記之量亦可為藉由測定方法所獲得之參數之測定值(相對值)。作為一例， 於測定方法使用螢光ELISA之情形時，尿液生物標記之量亦可為螢光ELISA之結果所獲得之螢光強度。於對源自從對象採集之尿液的尿試樣中之尿液生物標記之量進行螢光ELISA測定時，亦可實施包含濃度已知之上述尿液生物標記的標準試樣之螢光ELISA測定。於該情形時，下述之判定步驟亦可將尿試樣之螢光強度與標準試樣之螢光強度(閾值)進行比較。
於另一例中，於使用如流動式細胞測量術般可計測粒子數量之測定方法之情形時，亦可將含有尿液生物標記之複合體(例如細胞外囊泡)之數量設為尿液生物標記之量。
於本發明中，「判定」可不依據醫生或檢查技術人員等具有專門知識者之判斷，而自動/機械地進行。於一實施形態中，判定係藉由將所測得之尿液生物標記之量(測定值)、與關於該尿液生物標記之量之「閾值」進行比較，而自動/機械地進行。例如若依據預先設定為於測定值大於上述閾值之情形時判定為該對象罹患AD或其發病風險較高之判定基準，則即便並非具有專門知識者，亦可基於測定值與閾值之大小而進行判定。於該例中，對測定值大於閾值之情形進行了說明，但並不限定於此。根據尿液生物標記之種類，亦可於測定值小於閾值之情形時，判定為罹患AD或其發病風險較高。
與尿液生物標記之量相關之閾值「閾值」係為了基於尿液生物標記之量，判定是否罹患AD或其發 病風險是否存在而設定之值。作為一例，閾值係用以基於尿液生物標記之量來判別AD組與非AD組之值(診斷閾值)。上述閾值係例如對AD組之尿液生物標記之量、及非AD組之上述尿液生物標記之量進行測定，並考慮偽陰性率、偽陽性率、成本及患病率而設定。於上述閾值之設定中，可使用ROC曲線(Receiver Operator Characteristic Curve)。
作為另一例，閾值亦可為用以判別如下情況之值，即，基於尿液生物標記之量而預測AD之發病風險較高，從而根據預防醫學之觀點判別是否要求一定之應對(預防醫學閾值)。上述閾值係例如根據藉由世代研究(cohort study)所獲得之特定之尿液生物標記之量與AD發病率之關係而設定。作為另一例，閾值例如可根據實驗規則而設定。
作為一例，於使用1種尿液生物標記之情形時，閾值亦可對於該尿液生物標記設定1個。作為另一例，於使用2種以上之尿液生物標記之組合之情形時，閾值可針對各尿液生物標記設定1個閾值，亦可使用合計2個閾值。於該例中，關於判定，只要為例如一尿液生物標記之量(第1測定值)大於與該尿液生物標記之量相關之閾值(第1閾值)之情形及另一尿液生物標記之量(第2測定值)大於與該尿液生物標記之量相關之閾值(第2閾值)的情形中之任一種情形，則判定為罹患AD或其發病風險較高。
作為另一例，於使用2種以上之尿液生物標 記之組合之情形時，亦可對該組合設定1個閾值。於上述2種以上之尿液生物標記共同局部存在於1個含尿蛋白複合體之情形時，關於判定，於上述2種尿液生物標記所共同局部存在之含尿蛋白複合體之量大於與上述含尿蛋白複合體之量相關之閾值之情形時，可判定為罹患AD或其發病風險較高。於該情形時，尿液生物標記之量係與至少2種尿液生物標記所共同局部存在之含尿蛋白複合體之量(例如，複合體之數量)含義相同，與尿液生物標記之量相關之閾值係與和上述含尿蛋白複合體之量(例如，複合體之數量)相關之閾值含義相同。
於以上之例中，對預先設定閾值之值進行了說明，但本發明之輔助診斷方法並不限定於此。例如，閾值可為對包含特定濃度之尿液生物標記之標準試劑進行測定而獲得之尿液生物標記之量。標準試劑中之尿液生物標記之濃度例如亦可為相當於上述診斷閾值之濃度。
「AD組」係表示罹患AD之對象之組。「非AD組」係表示未罹患AD之對象之組。非AD組例如亦可為健康人組、其他失智症(例如血管性失智症)之患者組或於AD中以高頻度出現之併發症(例如糖尿病、心臟疾病)之患者組。「健康人組」係表示設置一定淘汰標準，從健康人中進行篩選後之對象之組。關於一定淘汰標準，例如可為未見與失智症相關之前兆。組之規模係考慮診斷之靈敏度、特異度、成本等要素而由從業者適當地設定。
AD組及非AD組例如亦可基於對象之特徵 (例如年齡、性別及病狀)而分成次組(subgroup)。於該情形時，閾值係為了對各次組判別AD組與非AD組而設定。例如，將AD組及非AD組基於對象之年齡(例如，“未達18歲至65歲”與“65歲以上”)而分成次組。於該例中，閾值可為了對各次組(例如，青年性AD組與青年性非AD組)判別AD組與非AD組而設定。
於上述例中，作為判定，係設為「罹患AD或其發病風險較高」，但本發明之輔助診斷方法並不限定於此，可適當地設定。作為一例，判定亦可為「對象罹患AD之可能性較高」或者「尿試樣源自AD患者」。
作為另一例，判定可根據測定對象之病狀而適當地設定。例如於對象為於其他臨床診斷方法中已診斷為1)輕度認知障礙或2)失智症之患者之情形時，判定可為1)由AD引起之輕度認知障礙或2)由AD引起之失智症。
於對象為未特別發現失智症之前兆者之情形時，判定可為有AD發病之風險或建議進一步檢查。於該情形時，與尿液生物標記之量相關之閾值可為於健康人組中對尿液生物標記之量進行測定而獲得之測定值的中央95%可靠區間(基準範圍)之上下限值，或者亦可為上述測定值之平均值±2標準偏差。作為一例，閾值可為與該尿液生物標記之量相關之基準範圍之上限值。
於本發明之第1態樣之一實施形態中，對源自從對象採集之尿液的尿試樣中之生物標記的量進行測定的步驟包括：形成上述尿液生物標記與針對其之檢測試劑 之締合體，並檢測源自上述締合體之反映尿液生物標記之量的訊號。於另一實施形態中，上述測定步驟進而包括：由所檢測到之訊號算出尿液生物標記之量。
對於尿液生物標記之「檢測試劑」包含可特異性地結合於目標尿液生物標記之「探針」。探針例如可列舉針對尿液生物標記之抗體及化合物。抗體並無限定，可列舉完整抗體(例如，單株抗體、多株抗體)、抗體片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2)、合成抗體(例如，單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、人源化抗體)。抗體可藉由公知之方法、例如免疫學方法、噬菌體呈現(Phage display)法、核糖體呈現法而製備。抗體亦可直接使用市售之抗體作為探針。作為該化合物，例示有可特異性地結合於尿液生物標記之物質、例如適體。
探針可以游離形態存在，或者亦可固相化於珠粒等載體。作為載體，例如可列舉珠粒或培養盤。珠粒或培養盤之材質並無特別限制，例如可為樹脂。珠粒並無限定，可為金屬製粒子、樹脂製粒子及半導體粒子。珠粒亦可帶有磁性。珠粒亦可包含螢光性物質，亦可為珠粒本身具有螢光性者、例如量子點。培養盤並無限定，可為樹脂製或包含玻璃之底面之樹脂製微量滴定盤。
將尿試樣中之尿液生物標記與針對其之包含探針之檢測試劑於如兩者能夠接觸之條件下進行放置，藉此形成尿液生物標記與檢測試劑之「締合體」。締合體之形成係例如於溶液環境下進行。於一例中，於使抗體固相 化於微量滴定盤之情形時，藉由將溶液形態之尿試樣加入至上述微量滴定盤中，已固相化之抗體與尿試樣中之尿液生物標記(抗原)於溶液環境下接觸。藉由其等之抗原抗體反應，可形成免疫複合體。於形成締合體後，亦可將上述締合體與未反應之尿液生物標記或檢測試劑進行分離(B/F分離)。
尿液生物標記與檢測試劑之締合體之形成可藉由將尿中之尿液生物標記進行濃縮或純化而促進。作為一例，尿試樣可為為了提高尿中之尿蛋白或含尿蛋白複合體之濃度或含量使尿蛋白或含尿蛋白複合體富集而獲得者。
尿蛋白之「富集」處理例如可無特別限制地使用將公知之蛋白質或肽進行濃縮或純化之方法。於含尿蛋白複合體之「富集」處理中，例如可無特別限制地使用用以將脂質雙層膜之囊泡、例如細胞外囊泡進行濃縮或純化之公知方法。作為細胞外囊泡之富集處理，並無限定，可列舉離心分離法、微濾法、及表面抗原親和層析法。作為一例，游離形態之尿蛋白之「富集」處理例如包括：對從對象採集之尿液進行離心分離，而回收包含游離形態之尿蛋白之組分(例如其上清液)。作為另一例，游離形態之尿蛋白之「富集」處理例如包括：對富集了含尿蛋白複合體之尿試樣進行下述之提取處理。藉由游離形態或存在於複合體中之尿蛋白之富集處理，而減少尿試樣中之包含夾雜蛋白質之夾雜物質，結果可將尿蛋白或含尿蛋白複合體 部分純化。
於將內包於細胞外囊泡中或存在於其脂質雙層膜上之尿液生物標記設為測定對象之情形時，以針對尿液生物標記之檢測試劑能夠接觸或容易接觸尿液生物標記之方式對尿液實施提取處理。上述提取處理係表示將尿液生物標記自細胞外囊泡之脂質雙層膜內部或自脂質雙層膜進行回收。於尿液生物標記存在於細胞外囊泡之脂質雙層膜上且檢測試劑能夠接觸上述尿液生物標記上之對應之結合面之情形時，亦可不進行提取處理。即便於該情形時，就促進尿液生物標記與檢測試劑之締合體之形成之觀點而言，亦可進行提取處理。
從含尿蛋白複合體(例如細胞外囊泡)之尿液生物標記之「提取」處理可無特別限制地使用用以將蛋白質或部分肽從脂質雙層膜之囊泡、例如細胞外囊泡進行回收之公知方法。作為提取處理，並無限定，可列舉：使用鹼性溶液進行提取之方法(以下稱為「鹼提取法」)、藉由冷凍融化進行提取之方法(以下稱為「冷凍融化提取法」)及使用界面活性劑進行提取之方法(以下稱為「界面活性劑提取法」)。
從含尿蛋白複合體(例如細胞外囊泡)提取之尿液生物標記於尿試樣中通常為游離形態，但亦可固相化於培養盤等載體。
關於尿試樣，例如就促進尿液生物標記與針對其之檢測試劑之締合體形成之觀點而言，亦可為實施 過含尿蛋白複合體之富集處理及提取處理者。一實施形態係包含使用從對象採集之尿液而製備尿試樣之步驟，上述尿試樣製備步驟可包含含尿蛋白複合體(例如細胞外囊泡)之富集處理及/或提取處理。於未進行提取處理之情形時，尿試樣可包含含有源自上述尿液之尿液生物標記之含尿蛋白複合體(例如細胞外囊泡)。於該情形時之一實施形態中，尿液生物標記較佳為選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD及ApoE所組成之群中之至少1種、例如1種、2種、3種或3種以上之尿蛋白的組合。
於將含尿蛋白複合體(例如細胞外囊泡)中之2種以上之尿液生物標記之共同局部存在設為指標之情形時，亦可進行細胞外囊泡之富集處理，但通常不進行提取處理。
檢測試劑除探針以外，亦可進而包含會發出訊號之「標記物質」。作為標記物質，例如可列舉螢光物質、放射性物質及酶。螢光物質、放射性物質及酶可無特別限制地使用公知之物質，其等可以商業方式獲取。螢光物質及酶例如亦可藉由公知方法而製造。於使用酶作為標記物質之情形時，檢測試劑包含對應於上述酶之受質。作為受質，例如可列舉：顯色受質、化學螢光受質及化學發光受質。
標記物質亦可預先結合於探針，而以經標記化之狀態存在。關於標記化，可使標記物質直接結合於探針，亦可經由至少1個其他物質而間接地連結於探針。 於對尿液生物標記之探針結合有生物素之情形時，標記物質係結合於抗生物素蛋白類(例如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素)。於該情形時，標記物質係經由生物素與抗生物素蛋白類之結合而間接地結合於上述探針。
於檢測試劑包含標記物質之情形時，可從尿液生物標記與上述檢測試劑之締合體之該標記物質發出反映尿液生物標記之量的訊號。於例如依存(例如成比例)於尿試樣中之尿液生物標記之量而形成上述締合體之情形時，上述訊號之強度可反映尿試樣中之尿液生物標記之量。基於所獲得之訊號強度(相對值)，可判定所測定之尿試樣之提供者(對象)是否罹患AD或其發病風險是否較高。或者，可使用從已知濃度之標準試樣獲得之訊號強度，根據從尿試樣獲得之訊號強度算出尿試樣中之尿液生物標記之濃度或含量，並基於所算出之值，而判定所測定之尿試樣之提供者(對象)是否罹患AD或其發病風險是否較高。
訊號之種類例如根據所使用之標記物質之種類而變化。訊號之檢測方法及檢測裝置可根據訊號之種類而由從業者適當設定。例如於使用螢光物質作為標記物質之情形時，可檢測螢光訊號。螢光訊號可使用公知之檢測裝置、例如螢光分光計、顯微鏡、流式細胞儀、微盤讀取器進行檢測。於使用放射性物質作為標記物質之情形時，可檢測放射線訊號。放射線訊號可使用公知之檢測裝置、例如閃爍計數器進行檢測。
於使用酶作為標記物質之情形時，可根據 對應於上述酶之受質而檢測顏色訊號、螢光訊號或發光訊號。例如於使用酶與顯色受質之情形時，檢測顯色或顏色變化作為訊號，其可藉由公知檢測裝置或肉眼進行檢測。例如於使用酶與化學螢光受質或化學發光受質之情形時，檢測螢光或發光作為訊號，其可使用公知檢測裝置進行檢測。
關於尿蛋白之量，亦可藉由應用抗原抗體反應之質譜法(亦稱為免疫質譜法(immuno-MS法)或mass-linked immune-selective analysis(MALISA))進行測定。於該情形時，訊號為質荷比，標記物質並非必須。於使用質譜法作為測定方法之情形時，可將會因置換1個胺基酸而產生之同功異型物或糖鏈修飾等轉譯後修飾加以區別而測定。
本發明之檢測試劑例如可根據尿液生物標記之測定方法，由從業者適當地設定。作為一例，於使用三明治ELISA作為測定方法之情形時，檢測試劑例如包含：固相化於微量滴定盤之針對尿液生物標記之第1抗體、與和第1抗體所結合之尿液生物標記上之抗原決定基不同之抗原決定基結合之第2抗體、利用針對第2抗體之酶進行標記化之第3抗體、對應於上述酶之受質。作為ELISA之實施形態，並不限定於三明治ELISA，可使用其他形態(直接吸附法、競爭法(直接競爭ELISA法))。
關於一實施形態，係對使用ELISA之直接螢光抗體法作為測定方法之輔助診斷方法進行說明。檢測 試劑例如包含預先經螢光物質標記化之針對尿液生物標記之抗體(以下亦稱為「螢光標記化抗體」)。標準試樣包含特定濃度(閾值)之游離形態之純化尿液生物標記。
將溶液形態之尿試樣分注於微量滴定盤，使微量滴定盤吸附尿試樣中之尿液生物標記。將尿試樣去除(B/F分離)，進行阻斷處理。將包含螢光標記化抗體之溶液分注於微量滴定盤，而形成已吸附(固相)之尿液生物標記與螢光標記化抗體之免疫複合體。對收容於微量滴定盤中之包含上述複合體之試樣照射激發光，對源自上述免疫複合體之螢光訊號進行測定。將所測得之螢光訊號與藉由相同方式測得之標準試樣之螢光訊號進行比較，而判定是否罹患AD或其發病風險是否較高。
於上述實施形態中，使用螢光物質作為標記物質，但並不限定於此，亦可為放射性物質或酶。
亦可使用使針對複數個尿液生物標記之各抗體或適體整齊排列(陣列)地固相化於載體(基板)上所獲得之微陣列(微晶片)代替ELISA中之微量滴定盤。
於檢測試劑包含針對2種以上尿液生物標記的探針之情形時，本發明之輔助診斷方法可為將2種尿液生物標記之量(2個測定值)與2個閾值分別進行比較而進行判定的診斷。於該情形時，關於判定，亦可於任一個測定值大於對應於其之閾值之情形時，判定罹患AD或其發病風險較高。根據使用至少2種尿液生物標記之輔助診斷方法，可實現與使用1種尿液生物標記之輔助診斷方法 相比靈敏度更高之診斷。
本發明之輔助診斷方法亦可將含尿蛋白複合體中之2種以上之尿液生物標記的共同局部存在設為指標。於該情形時，尿試樣亦可使用源自從對象採集之尿液的富集了含尿蛋白複合體之試樣，但並無限定。根據該實施形態，可如以下之實施例中所示，實現靈敏度較高之AD診斷。進而，根據該實施形態，亦可提供靈敏度較高之心臟疾病之輔助診斷方法。
因此，本發明之另一態樣係提供一種基於含尿蛋白複合體中之至少2種尿液生物標記之共同局部存在的AD及/或心臟疾病之輔助診斷方法。
該態樣之一實施形態係提供一種AD及/或心臟疾病之輔助診斷方法，其包括如下步驟：對源自從對象採集之尿液的尿試樣中之包含至少2種尿液生物標記之含尿蛋白複合體之量進行測定的步驟；及基於所測得之上述複合體之量，判定上述對象是否患阿茲海默氏症及/或心臟疾病或者其發病風險是否較高之步驟；上述尿液生物標記為選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、IFITM1、IFITM2、IFITM3、NPC1、NPC2、NPC1L1、及MT所組成之群中之至少2種、例如2種、3種或3種以上之尿蛋白的組合。
於該態樣之實施形態中，作為檢測方法，例如可使用ELISA法及流動式細胞測量術。
作為一例，對使用三明治ELISA之情形進 行說明。檢測試劑例如包含：固相化於培養盤之針對第1尿液生物標記之第1探針、與預先經標記物質標記化之針對第2尿液生物標記之第2探針。於該例中，將可能含有源自從對象採集之尿液的含尿蛋白複合體(包含細胞外囊泡)之尿試樣分注於上述培養盤。藉此，包含第1尿液生物標記之上述含尿蛋白複合體經由第1探針而固相化於培養盤上。B/F分離後，將第2探針分注於培養盤。藉此，第2探針結合於亦包含第2尿液生物標記之含尿蛋白複合體。於培養盤上固相化有第1探針、第2探針、及第1尿液生物標記、第2尿液生物標記所共同局部存在之複合體之三者締合體。B/F分離後，對上述三者締合體之量進行測定。將其測定值與閾值進行比較，可判定是否罹患AD及/或心臟疾病。
作為另一例，對例如使用流動式細胞測量術之情形進行說明。檢測試劑例如包含：固相化於第1量子點(第1標記物質)之針對第1尿液生物標記之第1探針、及固相化於第2量子點(第2標記物質)之針對第2尿液生物標記之第2探針。於該例中，第1、第2量子點係由λ 1激發，第1量子點發出峰值波長λ 2之螢光，第2量子點發出峰值波長λ 3之螢光。使可能含有源自從對象採集之尿液的含尿蛋白複合體之尿試樣與檢測試劑接觸，藉此形成於第1、第2尿液生物標記所共同局部存在之上述複合體結合有上述第1探針與上述第2探針之三者締合體。
將利用第1探針及第2探針進行雙重染色之 上述三者締合體導入至流式細胞儀而測定訊號。流式細胞儀係對流體力學地集束而成之流體流動照射特定波長之光線(例如雷射光線)，基於自上述流體所包含之各粒子產生之光學資訊，對各粒子之物理及化學特徵進行解析的裝置。於該例中，對包含各締合體之流體流照射λ 1激發光，藉此可自各締合體測定螢光(峰值波長：λ 2及λ 3)。可計數發出峰值波長λ 2及λ 3之締合體作為第1、第2尿液生物標記所共同局部存在之含尿蛋白複合體。將計數所獲得之值(測定值)與和含尿蛋白複合體相關之閾值進行比較，可判定是否罹患AD及/或心臟疾病。
於一實施形態中，閾值例如為適合於判別心臟疾病組與非心臟疾病(例如健康人)組之值(診斷閾值)。於判定步驟中，例如於測定值大於上述閾值之情形時，可判定對象罹患心臟疾病或其發病風險較高。該實施形態例如包括判定上述對象是否罹患心臟疾病或其發病風險是否較高之步驟以代替判定上述對象是否罹患AD或其發病風險是否較高。因此，本發明之另一態樣係提供一種心臟疾病之輔助診斷方法，其係基於含尿蛋白複合體中之至少2種尿液生物標記之共同局部存在。於一實施形態中，上述實施形態中之心臟疾病為心臟肥大症。
於一實施形態中，尿液生物標記為選自由ApoA-I、ApoB-100、ApoC-I、ApoD、ApoE、IFITM2、IFITM3、NPC1、及MT所組成之群中之至少2種、例如2種、3種或3種以上之尿蛋白的組合。於一實施形態中，尿液生物 標記較佳為選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD及ApoE所組成之群中之至少2種、例如2種、3種或3種以上之尿蛋白的組合。
本發明之第2態樣係提供一種用於第1態樣之輔助診斷方法之檢測試劑。檢測試劑包含本說明書所記載之針對尿液生物標記之探針，且視情形進而包含標記物質。檢測試劑中之探針並無限定，可為液體或固體之形態，或者亦可以游離形態存在，或者亦可固相化於微量滴定盤及珠粒等載體。檢測試劑中之標記物質可單獨地存在，或者亦可預先對上述探針標記化。關於本說明書中所記載之探針及標記物質等要素之特徵亦適用於該態樣之相應要素。
本發明之第3態樣係提供一種用於第1態樣之輔助診斷方法之診斷套組。診斷套組包含第2態樣之檢測試劑，進而，雖然並無限定，但亦可包含液體形態或固體形態之緩衝用、洗淨用、阻斷用、及反應停止用之試劑、以及培養盤及珠粒等載體。與本說明書中所記載之探針、標記物質、載體、閾值及判定等要素相關之特徵亦適用於該態樣之相應要素。
診斷套組例如可含有包含特定濃度或特定量之尿液生物標記等標準物質之標準試樣。於診斷套組中，可將各試劑分別個別地收容於試劑容器中，即便共存亦不會對尿液生物標記之測定產生問題之試劑亦可收容於 同一試劑容器中。進而，診斷套組可包含隨附文書。於隨附文書中例如可記載試劑之使用方法、標準試劑之使用方法、標準曲線之製作方法、根據標準曲線算出尿液生物標記之量之方法、及判定基準等資訊。作為判定基準，例如記載有於所算出之尿試樣中之尿液生物標記之值大於或小於與上述尿液生物標記之量相關之閾值之情形時，判定為罹患AD或其發病風險較高。
本發明之第4態樣係提供一種AD之診斷系統。上述診斷系統包含判定部與顯示部，上述判定部係將源自從對象採集之尿液的尿試樣中之尿液生物標記之量、與關於AD之與上述尿液生物標記之量相關之閾值進行比較，而判定上述對象是否罹患AD，上述顯示部係顯示判定部之判定結果。與本說明書中所記載之尿液生物標記、尿液生物標記之量、與尿液生物標記之量相關之閾值及判定等要素相關之特徵亦適用於該態樣之相應要素。
第7圖係表示一實施形態之診斷系統1之概略構成之方塊圖。診斷系統1具備：測定部11、控制部12、輸入部16、及顯示部17。控制部12具備儲存有資料庫14之記憶裝置13、與判定部15。
測定部11係由能夠定量地測定蛋白質之方法所使用之裝置所構成。測定部11例如可為ELISA所使用之微盤讀取器或使用CCD(Charge Coupled Device，電荷耦合器件)進行攝像之成像裝置、應用西方墨點法或微陣列(微晶片)之方法所使用之成像裝置、質譜法所使用之質譜 分析裝置、及流動式細胞測量術所使用之流式細胞儀。測定部11具有將測定資料向控制部12輸出之功能。
控制部12具備：對應於CPU等處理器之處理電路、記憶體(主記憶裝置)、及記憶裝置13。控制部12例如可使用電腦。控制部12之處理器係執行已載入至記憶體中之電腦程式。
記憶裝置13係輔助記憶裝置，例如可為硬碟驅動器(HDD)或固態驅動器(SSD)。記憶裝置13中例如儲存有電腦程式。電腦程式係載入至記憶體中並由處理器執行。上述電腦程式包含作業系統及應用程式。上述應用程式包含取得儲存於資料庫14中之與尿液生物標記之量相關之閾值的閾值取得程式、使下述之判定功能發揮功能之判定程式、及顯示判定結果等之顯示程式。於該例中，記憶裝置13中儲存有資料庫14。
資料庫14中儲存有與尿液生物標記之量相關之閾值之資料。關於閾值之資料，例如包含複數個用以判別AD組與非AD組之對應於本說明書所記載之各種尿液生物標記之閾值的資料。閾值之資料可包含複數個在基於對象之特徵(例如年齡、性別及病狀)而分成次組時用以對該次組判別AD組與非AD組之對應於上述各種尿液生物標記之閾值的資料。閾值之資料可包含複數個與健康人組中之對應於各種尿液生物標記之基準範圍之上下限值相關之閾值之資料。於資料庫14中，亦可進而儲存利用測定部11所獲得之測定資料等。此處，關於閾值之資料，對作 為目標疾病之AD進行了說明，但本發明之診斷系統並不限定於此，例如閾值之資料包含用以判別心臟疾病組與非心臟疾病組之關於本說明書所記載之各種尿液生物標記之有關心臟疾病之閾值的資料。於一實施形態中，提供如下診斷系統，其判定部係將關於心臟疾病之閾值、與尿試樣中之至少2種尿液生物標記所共同局部存在之含尿蛋白複合體之量進行比較，進而判定上述對象是否罹患心臟疾病或其發病風險是否較高。於另一實施形態中，提供如下診斷系統，其判定部係以與心臟疾病相關之閾值代替與AD相關之閾值，並將其與尿試樣中之至少2種尿液生物標記所共同局部存在之含尿蛋白複合體之量進行比較，而判定上述對象是否罹患心臟疾病或其發病風險是否較高。
於資料庫14儲存於磁碟、光碟、光磁碟、或快閃記憶體等記憶介質中之情形時，記憶裝置13亦可由將資訊向記憶介質進行讀取/寫入之驅動裝置、與該記憶介質所構成。
判定部15具有如下功能：將源自從對象採集之尿液的尿試樣中之尿液生物標記之量、與關於AD及/或心臟疾病之與上述尿液生物標記之量相關之閾值進行比較，而判定對象是否罹患AD及/或心臟疾病或其發病風險是否較高。判定部15之功能係藉由如下方式實現：利用包含控制部12之處理器之處理電路執行載入至控制部12之記憶體中之包含上述閾值取得程式及判定程式之應用程式。
輸入部16係由用以供使用者將所需之資訊(識別資訊)及指示輸入至控制部12之機器或裝置所構成。輸入部16例如可為鍵盤、滑鼠、及聲音識別裝置。使用者所輸入之識別資訊例如包含與尿液生物標記之種類、疾病之種類、對象之性別及年齡相關之資訊。
顯示部17係由能夠令使用者知道判定部15之判定結果等之裝置所構成，例如可為顯示器、顯示燈、揚聲器及印表機。
第7圖中，將測定部11與判定部15連接之實線係由收發機所構成，該收發機包含使其等要素間之利用有線或無線之資料及訊號之收發發揮功能的介面。第7圖中，將其等以外之各要素連接之實線亦相同。
上述例中，資料庫14係儲存於控制部12內部之記憶裝置13中，但本發明之診斷系統並不限定於此。資料庫14例如亦可儲存於存在於診斷系統之外部之記憶裝置中。此種記憶裝置例如可由光碟等記憶介質之全部或一部分所構成，亦可於藉由網路與本發明之診斷系統連接之伺服器中設置記憶裝置。
上述例中，診斷系統包含測定部11，但本發明之診斷系統並不限定於此。例如亦可將使用存在於診斷系統之外部之測定裝置所獲得之測定資料讀入至控制部12，例如儲存於記憶裝置13中。或者，於外部獲得之測定資料例如可如上述般儲存於診斷系統外部之記憶裝置中。
使用第7圖及第8圖，對本發明之AD之診 斷系統(實施形態1)之流程進行說明。
使用者使用輸入部16，輸入對於控制部12之指示及所需之資訊(識別資訊)。於該例中，識別資訊包含以下之資訊：測定試樣係2個(試樣1及2)；目標疾病係AD；尿液生物標記之種類全部為ApoC-I；及對象之年齡係試樣1為60歲及試樣2為70歲。控制部12之處理器於有經由輸入部16而來自使用者之指示及識別資訊之輸入後，進行閾值之取得(S11)。
於閾值取得階段(S11)中，處理器係執行自記憶裝置13載入至記憶體中之閾值取得程式。所執行之閾值取得程式係參照使用者所輸入之識別資訊，從儲存於資料庫14中之閾值之資料取得對應之閾值。第9圖係表示儲存於資料庫14中之閾值之資料之例。於該閾值之資料中，AD組及非AD組係基於對象之年齡(“18歲至未達65歲”與“65歲以上”)而分成次組。閾值之資料包含關於各次組，5種尿液生物標記(ApoA-1、ApoB-100、ApoC-I、NPC1及MT)各自所對應之判別阿茲海默氏症(AD)組與健康人(HS)組之閾值(a1至e1及a2至e2)。
該例中，首先藉由所執行之閾值取得程式，依據與試樣1相關之識別資訊(目標疾病：AD、尿液生物標記：ApoC-I、年齡：60歲)而取得閾值c1。
控制部12之處理器於取得閾值後，向測定部11傳送測定開始訊號。測定部11於接收來自控制部12之測定開始訊號後，開始測定(S12)。於測定階段(S12)，利 用測定部11測定源自從上述對象採集之尿液的尿試樣(1)，而生成關於上述尿試樣所包含之尿液生物標記(ApoC-I)之量之資料(測定資料(1))。測定部11係將所生成之測定資料(1)向控制部12進行傳送。所生成之測定資料(1)包含與上述對象之尿液生物標記(ApoC-I)之量相關之值(測定值)。
控制部12於接收來自測定部11之測定資料(1)後，進行判定(S13)。於判定階段(S13)，控制部12之處理器係執行自記憶裝置13載入至記憶體中之判定程式。所執行之判定程式係將自測定部11接收到之測定資料(1)所包含之測定值、與閾值取得階段中所取得之閾值c1進行比較。藉由判定程式，於上述測定值大於閾值c1之情形時判定為罹患AD(YES)，於上述測定值為閾值c1以下之情形時判定為未罹患AD(NO)，並生成包含該判定結果之判定資料(1)。
控制部12之處理器生成判定資料(1)後，於顯示部17顯示判定結果(S14)。於判定結果顯示階段(S14)，處理器係執行自記憶裝置13載入至記憶體中之顯示程式，將視判定結果之影像訊號向顯示部17(例如顯示器)輸出。顯示器係將所輸入之影像訊號與判定結果一併顯示。
控制部12之處理器進行測定結束之判定(S15)。於該時間點，2個試樣(1及2)中試樣(2)之測定未結束，因此於測定結束之判定階段(S15)判定為(NO)，而重複進行S11至S14。
具體而言，於閾值取得階段(S11)，依據關於試樣2之識別資訊(目標疾病：AD、尿液生物標記：ApoC-I、年齡：70歲)，從閾值之資料取得閾值c2。於測定階段(S12)，於測定部11生成與源自從上述對象採集之尿液之尿試樣(2)中之尿液生物標記(ApoC-I)之量相關之測定資料(2)。於判定階段(S13)，進行閾值取得階段(S11)中所取得之閾值c2、與測定資料(2)所包含之測定值的比較，而生成判定資料(2)。於判定結果顯示階段(S14)，將其判定結果顯示於顯示部17。
其後，控制部12之處理器進行測定已結束之判定(YES)，而測定結束。
使用第7圖及第10圖，對另一實施形態之心臟疾病之診斷系統(實施形態2)的流程進行說明。
使用者使用輸入部16輸入對控制部12之指示及所需之資訊(識別資訊)。該例中，識別資訊包含以下之資訊：測定試樣係2個(試樣1'及2')；目標疾病係心臟疾病；尿液生物標記之種類全部為ApoB與ApoC-I之組合；及對象之年齡係試樣1'為60歲及試樣2'為70歲。控制部12之處理器若經由輸入部16有來自使用者之指示及識別資訊之輸入，則進行閾值之取得(S21)。
於閾值取得階段(S21)，處理器係執行自記憶裝置13載入至記憶體中之閾值取得程式。所執行之閾值取得程式係參照使用者所輸入之識別資訊，從儲存於資料庫14中之閾值之資料取得對應之閾值。第11圖係表示儲 存於資料庫14中之閾值之資料之例。於該閾值之資料中，心臟疾病組及非心臟疾病組係基於對象之年齡(“18歲至未達65歲”與“65歲以上”)而分成次組。閾值之資料包含關於各次組，4種尿液生物標記之組合各自對應之判別心臟疾病組與健康人(HS)組之閾值(f1至i1及f2至i2)。
該例中，首先藉由所執行之閾值取得程式，依據關於試樣1'之識別資訊(目標疾病：心臟疾病、尿液生物標記：ApoB與ApoC-I之組合、年齡：60歲)而取得閾值g1。
控制部12之處理器於取得閾值後，向測定部11傳送測定開始訊號。測定部11於接收來自控制部12之測定開始訊號後，開始測定(S22)。於測定階段(S22)，藉由測定部11測定源自從上述對象採集之尿液之尿試樣(1')，而生成與上述尿試樣所包含之尿液生物標記(ApoB與ApoC-I之共同局部存在)之量相關之資料(測定資料(1'))。測定部11係將所生成之測定資料(1')向控制部12進行傳送。所生成之測定資料(1')包含與上述對象之尿液生物標記(ApoB與ApoC-I之共同局部存在)之量相關之值(測定值)。
控制部12於接收來自測定部11之測定資料(1')後，進行判定(S23)。於判定階段(S23)，控制部12之處理器係執行自記憶裝置13載入至記憶體中之判定程式。所執行之判定程式係將從測定部11接收到之測定資料(1')所包含之測定值、與閾值取得階段中所取得之閾值g1進行比較。藉由判定程式，於上述測定值大於閾值g1之情形時判定為罹患心臟疾病(YES)，於上述測定值為閾值g1以下之 情形時判定為未罹患心臟疾病(NO)，並生成包含該判定結果之判定資料(1')。
控制部12之處理器生成判定資料(1')後，於顯示部17顯示判定結果(S24)。於判定結果顯示階段(S24)，處理器係執行自記憶裝置13載入至記憶體中之顯示程式，而將根據判定結果之影像訊號向顯示部17(例如顯示器)輸出。顯示器係將所輸入之影像訊號與判定結果一併顯示。
控制部12之處理器進行測定結束之判定(S25)。於該時間點，2個試樣(1'及2')中試樣(2')之測定未結束，因此於測定結束之判定階段(S25)判定為(NO)，而重複進行S21至S24。
具體而言，於閾值取得階段(S21)，依據關於試樣2'之識別資訊(目標疾病：心臟疾病、尿液生物標記：ApoB與ApoC-I之組合、年齡：70歲)，從閾值之資料取得閾值g2。於測定階段(S22)，利用測定部11生成與源自從上述對象採集之尿液之尿試樣(2')中之尿液生物標記(ApoB與ApoC-I之共同局部存在)之量相關之測定資料(2')。於判定階段(S23)，進行閾值取得階段(S21)中所取得之閾值g2、與測定資料(2')所包含之測定值之比較，而生成判定資料(2')。於判定結果顯示階段(S24)，將該判定結果顯示於顯示部17。
其後，控制部12之處理器進行測定已結束之判定(YES)，而測定結束。
上述例中，閾值取得階段(S11、S21)係先於測定階段(S12、S22)執行，但本發明之診斷系統並不限定於此。例如，於本發明之診斷系統中，於執行判定階段(S13、S23)之前進行閾值取得階段(S11、S21)及測定階段(S12、S22)即可。因此，閾值取得階段(S11、S21)可與測定階段(S12、S22)同時進行，亦可於測定階段(S12、S22)之後進行。
上述例中，針對1個尿試樣(試樣1、試樣1')進行S11至S14、S21至S24，對剩餘之尿試樣(試樣2、試樣2')重複進行S11至S14、S21至S24，但本發明之診斷系統並不限定於此。例如，亦可依據使用者所輸入之識別資訊，一次性取得供判定之全部尿試樣之閾值(S11、S21)，對全部尿試樣中之尿液生物標記之量進行測定(S12、S22)，針對各尿試樣分別進行是否罹患AD、心臟疾病之判定(S13、S23)，顯示全部之判定結果(S14、S24)。
上述例中，判定結果顯示階段(S14、S24)係先於測定結束之判定階段(S15、S25)而實施，但本發明之診斷系統並不限定於此。例如，亦可依據使用者所輸入之識別資訊，於所指定之尿試樣之全部判定結束後(S15、S25)，顯示其判定結果(S14、S24)。
上述例中，閾值取得係使用預先儲存於資料庫中之閾值之資料，但本發明之診斷系統並不限定於此。例如，使用者輸入關於標準試樣(包含已知濃度之尿液生物標記ApoC-I或已知量之含有尿液生物標記之組合的 複合體)之資訊(識別資訊)。利用測定部11生成與上述標準試樣中之尿液生物標記之量相關之測定資料(包含測定值)(S12、S22)。將所生成之上述測定資料從測定部11向控制部12進行傳送，並儲存於記憶裝置13中。繼而，控制部12之處理器執行載入至記憶體中之閾值取得程式(S11、S21)。所執行之閾值取得程式係依據使用者所輸入之識別資訊，從儲存於記憶裝置13中之閾值之資料取得測定階段(S12、S22)中所獲得之測定資料所包含之測定值作為閾值。其後之判定階段(S13、S23)、判定結果顯示階段(S14、S24)及測定結束判定階段(S15、S25)亦可藉由上述方式進行。
於另一實施形態中之診斷系統(實施形態3)中，進行AD診斷流程、與心臟疾病診斷流程。使用第7圖、第8圖及第10圖，對在AD診斷流程後實施心臟疾病診斷流程的診斷系統之流程進行說明。
使用者使用輸入部16輸入對控制部12之指示及所需之資訊(識別資訊)。該例中，識別資訊包含以下之資訊：測定試樣係2個(試樣1"及2")；目標疾病係試樣1"為AD，試樣2"為心臟疾病；尿液生物標記之種類係試樣1"為ApoC-I，試樣2"為ApoB與ApoC-I之組合；及對象之年齡係試樣1"為60歲及試樣2"為70歲。
控制部12之處理器於有經由輸入部16而來自使用者之指示及識別資訊之輸入後，如上所述，處理器對試樣1"進行閾值之取得(第8圖S11、第9圖(c1))、測定 (第8圖S12)、測定值與閾值之比較(第8圖S13)、判定結果之顯示(第8圖S14)、測定結束之判斷(第8圖S15)。試樣1"之測定結束後，控制部12之處理器對試樣2"進行閾值之取得(第10圖S21、第11圖(g2))、測定(第10圖S22)、測定值與閾值之比較(第10圖S23)、判定結果之顯示(第10圖S24)、測定結束之判斷(第10圖S25)。
上述例中，係繼AD診斷流程之後實施心臟疾病診斷流程，但本發明之診斷系統並不限定於此。例如，可繼心臟疾病診斷流程之後實施AD診斷流程，或者亦可同時實施心臟疾病診斷流程及AD診斷流程。關於AD診斷流程及心臟疾病診斷流程中之任一者先實施之情形時之階段(S11至S15、S21至S25)順序，於該實施形態中亦適用關於實施形態1、2中所述之階段順序的特徵。
同時實施AD診斷流程及心臟疾病診斷流程之情形時之各階段只要於執行判定階段(S13、S23)之前進行閾值取得階段(S11、S21)及測定階段(S12、S22)即可。因此，閾值取得階段(S11、S21)可與測定階段(S12、S22)同時進行，亦可於測定階段(S12、S22)之後進行。例如，亦可依據使用者所輸入之識別資訊，一次性取得供判定之全部尿試樣之閾值(S11、S21)，對全部尿試樣中之尿液生物標記之量進行測定(S12、S22)，針對各尿試樣分別進行是否罹患AD、心臟疾病之判定(S13、S23)，顯示全部之判定結果(S14、S24)。
判定結果顯示階段(S14、S24)與判定階段 (S15、S25)例如亦可依據使用者所輸入之識別資訊，於所指定之尿試樣之全部判定結束後(S15、S25)，顯示其判定結果(S14、S24)。此外，於該實施形態中亦適用關於實施形態1、2中所述之閾值之特徵。
以下，記載實施例作為本發明之實施形態，但其等無論如何都並非對隨附之申請專利範圍所記載之發明加以限定者。
[實施例] <尿試樣製備> (1)富集處理(濃縮及部分純化)
尿中之蛋白質係基本上依據Kidney International(2010)77：736-742所記載之方法進行濃縮。
將從受檢對象採集之尿液25ml進行離心分離(17,000g、25℃、10分鐘)，回收上清液(SN1)。向沈澱物添加緩衝液(10mM之三羥甲基胺基甲烷溶液(pH值7.6)、200mg/ml之二硫蘇糖醇、250mM之蔗糖)250μl而使沈澱物懸浮，於37℃下靜置10分鐘。將懸浮液進行離心分離(17,000g、25℃、10分鐘)，回收上清液(SN2)。將上清液(SN1)與上清液(SN2)進行混合，添加總外泌體分離(Total Exosome Isolation)試劑(ThermoFisher SCIENTIFIC公司)25ml並加以混合，於室溫下靜置1小時。將該混合液進行離心分離(10,000g、4℃、60分鐘)，將沈澱物再懸浮於D-PBS(-)100μl中，而獲得尿蛋白部分純化組分。將所獲得之部分純 化組分進行離心分離(10,000g、4℃、15分鐘)，回收上清液(SN3)。利用D-PBS(-)將上清液(SN3)稀釋2倍，並裝入凝膠過濾管柱(Sephacryl S-300)中。回收孔隙溶出組分，進行離心分離(10,000g、4℃、15分鐘)。使用超濾器(30K MWCO)，將該上清液(SN4)濃縮至50μl。
(2)提取處理
藉由上述富集處理所獲得之尿蛋白可能存在於包含細胞外囊泡之含尿蛋白複合體中。為了從含尿蛋白複合體(包含細胞外囊泡)提取尿蛋白，而使用鹼提取法或冷凍融化提取法。
鹼提取法：向源自尿液之試樣液50μl添加5μl之5% TritonX-305、5μl之4N NaOH，並於冰上靜置20分鐘。其後，添加5μl之4N HCl/1M HEPES溶液而進行中和。
冷凍融化提取法：將源自尿液之試樣液50μl於-25℃下進行冷凍並保存2週。向已冷凍之試樣添加5μl之5% TritonX-305，進而添加5μl之10% TritonX-100，於冰上靜置20分鐘而使之融化。
<三明治ELISA> (3)抗體之固相
將針對尿蛋白之抗體(以下稱為「捕捉用抗體」)固相化於96孔微量滴定盤。
使用D-PBS(-)，將捕捉用抗體設為濃度50μg/ml。將 捕捉用抗體溶液100μl分注至各孔中，於4℃下培養一晚而進行固相化。利用洗淨液(包含0.05% Tween20之D-PBS(-))洗淨1次後，添加阻斷液(包含1%牛血清白蛋白(BSA)之D-PBS(-))300μl而進行阻斷。去除阻斷液後，將96孔微量滴定盤於25℃之培養箱中進行乾燥，而獲得抗體固相培養盤。抗體固相培養盤係於4℃下進行保存直至使用為止。
(4)檢測用抗體之標記
對於不同於捕捉用抗體之與尿蛋白上之抗原決定基結合之抗體(以下稱為「檢測用抗體」)，經由生物素-抗生蛋白鏈菌素複合體，利用辣根過氧化酶(HRP)進行標記。
基本上依據生物素標記套組-NH2(Biotin-Labeling Kit-NH2)(同仁化學研究所)隨附之使用說明書，利用生物素對檢測用抗體50μg進行標記，而獲得生物素標記抗體。生物素標記抗體係藉由在ELISA測定之期間與經HRP標記之抗生蛋白鏈菌素進行反應，而製成經HRP標記化之檢測用抗體。
(5)ELISA測定
將含有尿蛋白之尿試樣及該尿蛋白之純化物(標準試樣)添加至抗體固相培養盤中，於25℃下進行1小時振盪而進行反應(一次反應)。將試樣液去除(B/F分離)，利用洗淨液將培養盤洗淨3次。將預先利用ELISA緩衝液(ELISA buffer)(包含1% BSA、0.05% Tween20、0.05% ProClin300 之D-PBS(-))稀釋為0.1至0.25μg/ml之生物素標記抗體的稀釋液100μl添加至培養盤中，於25℃下進行1小時振盪而進行反應(二次反應)。將上述稀釋液去除，利用洗淨液將培養盤洗淨3次。添加預先使用ELISA緩衝液(ELISA buffer)稀釋過之HRP標記抗生蛋白鏈菌素溶液100μl，於25℃下進行1小時振盪而進行反應(三次反應)。將HRP標記抗生蛋白鏈菌素溶液去除，利用洗淨液將培養盤洗淨3次。將3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)溶液添加至培養盤中，於室溫下進行15分鐘顯色反應，添加100μl之1N硫酸而使反應停止。利用微盤讀取器測定培養盤之各孔之吸光度450nm(參照波長650nm)。
[實施例1] <AD相關尿蛋白之探索>
從3名AD患者採集尿液。另外，從30至60多歲之4名健康人採集尿液。依據上述(1)富集處理，將AD組(n=3)及健康人組(n=4)之各尿液25ml分別進行濃縮及部分純化，依據上述(2)提取處理提取尿蛋白，分別製備尿試樣。所製備之尿試樣之蛋白質濃度係使用Micro BCA(商標)蛋白質定量(Protein Assay)套組(ThermoFisher SCIENTIFIC公司)，藉由BCA(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)法進行定量。
蛋白質組研究(Proteomics)解析係由Medical Proteo Research股份有限公司(橫浜市金澤區福浦3-9橫浜市立大學 尖端醫科學研究棟)實施。向含有相當於0.4至1 μg之蛋白質之尿試樣添加三氯乙酸(最終濃度10%)，使蛋白質沈澱。對沈澱之蛋白質添加溶解液(包含8M脲)而使之溶解後，添加胰蛋白酶而將尿蛋白分解為肽。使用LTQ-Orbitrap Velos質譜分析儀及Ultimate 3000液相層析儀，對所獲得之肽溶液進行LC/MS/MS。所獲得之LC/MS/MS資料係使用Mascot軟體第2.4版進行分析，藉此鑑定出1200種尿蛋白。使用Scaffold軟體3.0將AD組之肽分析資料、與非AD組之肽分析資料進行比較，藉此特定出對AD具有特異性之23種尿蛋白作為用以AD診斷之生物標記之候補物質。
<AD相關尿蛋白之特定(1)> (尿液之採集)
從AD患者(n=5)採集尿液。該等AD患者為高齡，且多數患有併發症(缺血性心臟疾病及高血壓)(n=3)。作為標準試樣，除了各年齡段之健康人(n=12)以外，亦使用從高齡且患有高血壓，進而患有與缺血性心臟疾病類似之心臟疾病(CHD)之心臟肥大患者(n=3)及不穩定心絞痛患者(n=3)採集之尿液。表4係表示尿試樣之提供者清單。
Figure TW201805627AD00004
 AD患者(n=5、平均年齡77.2)；CHD患者(HT患者及Ang患者)(n=6、平均年齡76.8)；HS(n=12、平均年齡48.6)。AD患者之MMSE得分為14至18。
(尿試樣之製備)
基本上依據上述(1)富集處理，將從AD組(n=5)、健康人組(n=12)及CHD組(HT患者及Ang患者)(n=6)採集之各尿液500μl進行10倍濃縮及部分純化，依據上述(2)提取處理(鹼提取法)提取尿蛋白，分別製備尿試樣。將所製備之試樣50μl、與ELISA緩衝液(ELISA buffer)(包含1% BSA、0.05% Tween20、0.05% ProClin300之D-PBS(-))50μl進行混合，而製備ELISA用之尿試樣。
(ELISA測定)
針對在蛋白質組研究解析中特定出之23種尿蛋白中除ApoD以外之22種尿蛋白，依據上述“三明治ELISA”所記載之方法，測定尿試樣中之各因子之濃度。其中，對於22種尿蛋白中市售有ELISA測定套組者，依據套組所附屬之使用說明書進行測定。
(肌酸酐修正)
為了修正隨取尿中之尿蛋白濃度之變動，而進行尿中肌酸酐修正。尿中肌酸酐量係使用尿肌酐檢測套組(Urinary Creatinine detection kit)(CELL BIOLABS,INC.)進行測定。基於每天之總肌酸酐量(1g)而修正尿蛋白之測定結果(濃度)。
(分析)
使用Welch之t檢驗，檢驗AD組與健康人組或CHD組之間之統計學上之顯著差異。其結果為，關於7種尿蛋白，於AD組之結果與健康人組之結果之間有顯著差異或有顯著差異傾向(第1圖)。
ApoA-I、ApoB100、ApoC-I及ApoE係已知為血液中之膽固醇輸送體之脂蛋白元。於將AD組與HS組加以比較之情形時，ApoA-I、ApoB100、ApoC-I及ApoE於尿試樣中之濃度均於AD組中顯示出顯著之高值(第1圖(a至d))。於將AD組及CHD組加以比較之情形時，ApoB100及ApoE於尿試樣中之濃度於AD組中顯示出顯著之高值(第1圖(a及b))。
ApoA-I、ApoB100、ApoC-I及ApoE均係產生於肝臟或小腸中，且包含於HDL、乳糜微粒(chylomicron)、VLDL、LDL等中之脂蛋白元。該等脂蛋白元中存在合成器官及局部存在共通之家族蛋白質(表1)。
關於ApoB-100、ApoE、ApoC-I及ApoA-I，有其等之血中濃度於AD組中產生變化之報告(非專業文獻3至6)。非專業文獻3至6中揭示有：於將AD組與非AD組加以比較之情形時，ApoB-100、ApoE、ApoC-I及ApoA-I之血中濃度於AD組中為顯著之高值，但該差異並非能夠作為生物標記而於臨床上使用之程度。另一方面，於實施例1中，於使用尿試樣中之ApoB-100、ApoE、ApoC-I或ApoA-I作為生物標記之情形時，證實了即便濃度差較大，亦能夠測定其等(第1圖(a至d))。
IFITM2/3係細胞內膽固醇輸送相關蛋白質。IFITM2/3於將AD組與HS組加以比較之情形時及將AD組與CHD組加以比較之情形時，於AD組中顯示出顯著之高值(第1圖(e))。另外，已知NPC1亦為細胞內膽固醇輸送相關蛋白質。NPC1於將AD組與HS組加以比較之情形時，於AD組中顯示出高值(第1圖(f))。
已知IFITM2/3及NPC1於AD死後腦中使RNA表現增加(表2)，但由於在該解析方法中需要腦樣品之生檢，故而無法用於存活時之診斷。另外，該等蛋白質由於通常局部存在於細胞內之內質網，故而難以認為該等蛋白質會從腦內之細胞釋放並通過腦血管障壁。實際上據已知情況，如為了監測腦內之狀態，而著眼於細胞外之體液中之細胞內膽固醇輸送相關蛋白質的報告例尚不存在。實施例1出乎預料地確認到，IFITM2/3及NPC1之含量於細胞外之體液、及尿中，與AD相關地產生顯著變化，從而證實了尿中之細胞內之膽固醇輸送相關蛋白質對於AD診斷有用。
MT係作為與鋅、銅、鎘等重金屬發生螯合之蛋白質而為人所知。MT於將AD組與HS組加以比較之情形時於AD組中顯示出高值(第1圖(g))。
關於MT1，報告有其於AD死後腦中表現增加之情況(J.Chem.Neuroanat.(1998)15：21-26)。然而，該解析方法由於需要腦樣品之生檢，故而無法應用於存活時之診斷。另外，報告有如下情況：針對血液中之MT濃度， 將AD組與非AD組進行比較，結果血液中之MT濃度於兩組中幾乎未變化(Brain Research(2010)1319：118-1130)。實施例1出乎預料地確認到，尿中之MT量與AD相關地產生顯著變化，從而證實了尿中之MT對於AD診斷有用。
表5係表示針對各尿蛋白，將AD組與HS組加以比較之情形時之結果。另外，表5係表示對各尿蛋白進行ELISA測定時所使用之抗體或套組及標準試樣。
Figure TW201805627AD00005
[實施例2] <利用尿液生物標記之組合之輔助診斷方法>
於實施例2中，基本上藉由與實施例1相同之方式測定尿試樣中之IFITM2/3、ApoB-100、ApoE及MT之濃度(第2圖)。
(2-1)IFITM2/3、與ApoB-100之組合：
第1診斷係使用尿液生物標記IFITM2/3，第1閾值係設為3.5[μg/gCr]。第2診斷係使用尿液生物標記ApoB-100，第2閾值係設為1.0[mg/gCr]。
判定基準設為如下：(判定1)於測定值大於第1閾值之情形時，罹患AD(陽性)；(判定2)於測定值大於第2閾值之情形時，罹患AD(陽性)；及(最終判定)於判定1及判定2中之任一者為陽性之情形時，罹患AD(陽性)。
於使用尿液生物標記IFITM2/3之第1輔助診斷方法中，HS組及CHD組之測定值均為第1閾值以下(第2圖(c))。於AD組中，AD患者1至4之測定值大於第1閾值而判定為陽性(第2圖(c)、表6)。於使用尿液生物標記ApoB-100之第2輔助診斷方法中，HS組及CHD組之測定值均為第2閾值以下(第2圖(a))。於AD組中，AD患者2至5之測定值大於第2閾值而判定為陽性(第2圖(a)、表6)。
依據上述判定基準，AD組最終均判定為陽性(表6)。
Figure TW201805627AD00006
(2-2)IFITM2/3、與ApoE之組合：
第1診斷係使用尿液生物標記IFITM2/3，第1閾值係設為3.5[μg/gCr]。第2診斷係使用尿液生物標記ApoE，第2閾值係設為25[μg/gCr]。判定基準係使用與實施例2-1相同者。
第1輔助診斷方法之判定1之結果係參照實施例2-1。於使用尿液生物標記ApoE之第2輔助診斷方法中，HS組及CHD組之測定值均為第2閾值以下(第2圖(b))。於AD組中，AD患者2至5之測定值大於第2閾值而判定為陽性(第2圖(b)、表7)。
依據判定基準，AD組最終均判定為陽性(表7)。
Figure TW201805627AD00007
(2-3)IFITM2/3、與MT之組合：
第1診斷係使用尿液生物標記IFITM2/3，第1閾值係設為3.5[μg/gCr]。第2診斷係使用尿液生物標記MT，第2閾值係設為80[ng/gCr]。判定基準係使用與實施例2-1相同者。
第1輔助診斷方法之判定1之結果係參照實施例2-1。於使用尿液生物標記MT之第2輔助診斷方法中，HS組及CHD組之測定值均為第2閾值以下(第2圖(d))。於AD組中，AD患者1、2及5之測定值大於第2閾值而判定為陽性(第2圖(d)、表8)。
依據判定基準，AD組最終均判定為陽性(表8)。
Figure TW201805627AD00008
(2-4)MT、與ApoB-100之組合：
第1診斷係使用尿液生物標記MT，第1閾值係設為80[ng/gCr]。第2診斷係使用尿液生物標記ApoB-100，第2閾值係設為1.0[mg/gCr]。判定基準係使用與實施例2-1相同者。
於使用尿液生物標記MT之第1輔助診斷方法中，HS 組及CHD組之測定值均為第1閾值以下(第2圖(d))。於AD組中，AD患者1、2及5之測定值大於第1閾值而判定為陽性(第2圖(d)、表9)。於使用尿液生物標記ApoB-100之第2輔助診斷方法中，HS組及CHD組之測定值均為第2閾值以下(第2圖(a))。於AD組中，AD患者2至5之測定值大於第2閾值而判定為陽性(第2圖(a)、表9)。
依據判定基準，AD組最終均判定為陽性(表9)。
Figure TW201805627AD00009
(2-5)MT、與ApoE之組合：
第1診斷係使用尿液生物標記MT，第1閾值係設為80[ng/gCr]。第2診斷係使用尿液生物標記ApoE，第2閾值係設為25[μg/gCr]。判定基準係使用與實施例2-1相同者。
第1輔助診斷方法之判定1之結果係參照實施例2-4。於使用尿液生物標記ApoE之第2輔助診斷方法中，HS組及CHD組之測定值均為第2閾值以下(第2圖(b))。於AD組中，AD患者2至5之測定值大於第2閾值而判定為陽性(第2圖(b)、表10)。
依據判定基準，AD組最終均判定為陽性(表10)。
Figure TW201805627AD00010
根據使用2種尿液生物標記之輔助診斷方法，可實現與使用1種尿液生物標記之輔助診斷方法相比，靈敏度更良好之AD診斷。於實施例2中，使用2種尿液生物標記之輔助診斷方法之靈敏度為100%。
[實施例3] <尿蛋白量之變動之影響>
於實施例1及2中，為了修正隨取尿中之尿蛋白濃度之變動，而進行尿中肌酸酐修正。調查隨取尿中之尿蛋白量之變動對尿液生物標記測定所產生之影響。
針對從AD組及非AD組採集之隨取尿，基本上藉由與實施例1相同之方法進行尿試樣之製備及ELISA測定，而測得ApoB-100之濃度(無修正)。進而，使用與實施例1相同之方法，進行尿中肌酸酐修正，而算出ApoB-100濃度(有修正)。將其等之結果示於第3圖。如第3圖中所示，於有無肌酸酐修正之情況下，幾乎未見對AD組及非AD組之測定結果產生影響。
針對ApoB-100以外之實施例1中所特定出之尿液生物標記，亦藉由相同之方式針對有無肌酸酐修正進行研究，但均幾乎未見對測定結果產生影響(未揭示資料)。因此，於使用本發明之尿液生物標記之輔助診斷方法中，即便使用隨取尿作為尿試樣，亦無需進行尿中肌酸酐修正，可簡單地實施。
[實施例4] <尿試樣之製備：富集處理之影響>
基本上依據上述(1)富集處理，將從AD組及非AD組採集之尿液(各500μl)分別進行10倍濃縮，使用所獲得之尿試樣(有濃縮)、及直接用作尿試樣之從各對象採集之尿液(各50μl)(無濃縮)，不進行肌酸酐修正，除此以外，基本上藉由與實施例1相同之方法分別測定ApoB-100濃度(第4圖)。無論有無富集處理，ApoB-100均顯示出與非AD組相比，於AD組中特異性地增加之傾向。顯示出尿蛋白ApoB-100無論有無富集處理均能夠測定到。
[實施例5] <尿試樣之製備：提取處理之影響>
基本上依據上述(1)富集處理，將從AD組及非AD組採集之尿液進行濃縮。不對經濃縮之試樣進行上述(2)提取處理而直接設為尿試樣(未處理)，另外，藉由鹼提取法進行提取處理而製備尿試樣(鹼法)，及藉由冷凍融化法進行 提取處理而製備尿試樣(冷凍法)。不對所製備之尿試樣進行肌酸酐修正，除此以外，基本上使用與實施例1相同之方法而測定ApoB-100、IFITM2/3及MT之濃度(第5圖)。
於對尿中之脂蛋白元ApoB-100進行測定之情形時(第5圖(a))，對於未進行提取處理之尿試樣(未處理)與進行過鹼提取法之尿試樣(鹼法)，幾乎未見測定結果有差異。另外，對於尿試樣(未處理)與進行過冷凍融化法之試樣(冷凍法)，亦同樣地幾乎未見測定結果有差異。因此，於使用尿中之脂蛋白元ApoB-100作為尿液生物標記之輔助診斷方法之情形時，尿試樣可進行提取處理，亦可不進行提取處理。
於對尿中之膽固醇輸送相關因子IFITM2/3進行測定之情形時(第5圖(b))，對於未進行提取處理之尿試樣(未處理)與進行過提取處理之尿試樣(鹼法/冷凍法)，測定結果有較大變化。對於尿試樣(未處理)，於ELISA測定時幾乎未獲得訊號(吸光度)。另一方面，對於進行過提取處理之尿試樣，獲得了訊號。所獲得之訊號於鹼提取法與冷凍融化法中幾乎未見差異。因此，於將尿中之膽固醇輸送相關因子IFITM2/3設為測定對象，並使用抗人類IFITM2/IFITM3抗體及多株山羊IgG(AF4834)之組合，對IFITM2/3進行測定之情形時，尿試樣較佳為進行過提取處理之試樣。
於對尿中之MT進行測定之情形時(第5圖(c))，對於未進行提取處理之尿試樣(未處理)與進行過提取 處理之尿試樣(冷凍法)，測定結果有較大變化。對於尿試樣(未處理)，於ELISA測定時幾乎未獲得訊號(吸光度)。另一方面，於進行過提取處理之尿試樣中，獲得了訊號。因此，於將尿中之MT設為測定對象，並使用人類金屬硫蛋白三明治ELISA套組(LS-F10296)，對MT進行測定之情形時，尿試樣較佳為進行過提取處理之試樣。
[實施例6] <利用尿液生物標記之共同局部存在所進行之輔助診斷方法>
基本上依據上述(1)富集處理，對從AD組、HT患者組、Ang患者組及HS組採集之尿液進行濃縮及部分純化，將所獲得之試樣設為尿試樣。再者，未進行上述(2)提取處理。將抗ApoE抗體(抗人類ApoE抗體，單株小鼠IgG(WUE-4 NB110 60531))及抗ApoC-I抗體(抗ApoC1兔多株抗體(ab207931))分別依據上述(3)抗體之固相化而固相化於96孔微量滴定盤上。依據上述(4)檢測用抗體之標記，對抗ApoB-100小鼠單株抗體((JIH))進行生物素標記。
使用所製備之尿試樣、固相化有抗ApoE抗體之96孔微量滴定盤、及生物素標記化抗ApoB-100抗體，依據上述(5)ELISA測定，利用三明治ELISA對包含ApoB-100與ApoE之複合體(以下亦稱為「ApoB-100/ApoE複合體」)進行測定。將其測定結果(吸光度：A450)示於第6圖。檢測到該三明治ELISA中之吸光度訊號之情況提示，於所製 備之尿試樣中存在ApoB-100與ApoE共同局部存在之含尿蛋白複合體。關於ApoB-100/ApoE複合體，於將AD組與HS組加以比較之情形時，AD組為顯著之高值(P=0.001)。根據該尿液生物標記之組合之共同局部存在測定，可實現與基於1種尿液生物標記之測定(例如，第1圖)之AD診斷相比，另外與基於2種尿液生物標記之依序測定(例如，第2圖)之AD診斷相比，靈敏度更高之AD診斷。
如第6圖所示，於CHD組(HT組及Ang組)中之HT組中亦測定到ApoB-100/ApoE複合體。另一方面，於Ang組中未測定到ApoB-100/ApoE複合體。ApoB-100/ApoE複合體亦可能係對HT組具有特異性之生物標記。因此，該尿液生物標記之組合之共同局部存在測定可能對AD與HT之診斷有用。
使用所製備之尿試樣、固相化有抗ApoC-I抗體之96孔微量滴定盤、及生物素標記化抗ApoB-100抗體，依據上述(5)ELISA測定，利用三明治ELISA對包含ApoB-100與ApoC-I之複合體(以下亦稱為「ApoB-100/ApoCI複合體」)進行測定。將其測定結果(吸光度：A450)示於第6圖。檢測到該三明治ELISA中之吸光度訊號之情況提示，於所製備之尿試樣中存在ApoB-100與ApoC-I共同局部存在之含尿蛋白複合體。關於ApoB-100/ApoCI複合體，於將AD組與HS組加以比較之情形時，AD組為顯著之高值(P=0.029)。根據該尿液生物標記之組合之共同局部存在測定，可實現與基於1種尿液生物標記之測定，另外與2種 尿液生物標記之依序測定之AD診斷相比，靈敏度更高之AD診斷。
如第6圖所示，於CHD組中亦測定到ApoB-100/ApoCI複合體。ApoB-100/ApoCI複合體亦可能係對CHD組具有特異性之生物標記。因此，該尿液生物標記之組合之共同局部存在測定可能對AD與CHD之診斷有用。
根據基於至少2種尿液生物標記、尤其是至少2種脂蛋白元之共同局部存在之輔助診斷方法，變得能夠實現與基於1種尿液生物標記之輔助診斷方法相比，另外與分別使用至少2種尿液生物標記之輔助診斷方法相比，靈敏度更高之診斷。
根據基於至少2種尿液生物標記、尤其是至少2種脂蛋白元之共同局部存在之輔助診斷方法，能夠診斷包括心臟肥大(HT)及不穩定心絞痛(Ang)在內之心臟疾病(CHD)。
因此，本發明之另一態樣係提供一種基於含尿蛋白複合體中之至少2種尿液生物標記之共同局部存在的AD及/或心臟疾病之輔助診斷方法。本發明之一實施形態可藉由與基於MMSE等診斷基準之認知功能檢查及腦圖像檢查進行組合，而提供AD之特異性之輔助診斷方法。本發明之一實施形態可藉由與心臟圖像檢查等輔助診斷方法進行組合，而提供心臟疾病之特異性之輔助診斷方法。
由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (20)

  1. 一種阿茲海默氏症(AD)之輔助診斷方法，其包括如下步驟：對源自從對象採集之尿液的尿試樣中之尿液生物標記之量進行測定的步驟；及基於所測得之尿液生物標記之量，判定上述對象是否罹患AD或其發病風險是否較高之步驟；上述尿液生物標記為選自由脂蛋白元(Apolipoprotein)(以下記為「Apo」)A-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、干擾素誘導跨膜蛋白(Interferon-induced transmembrane protein)(以下記為「IFITM」)1、IFITM2、IFITM3、尼曼匹克氏症蛋白(Neimann-Pick C)(以下記為「NPC」)1、NPC2、NPC1L1、及金屬硫蛋白(Metallothionein)(以下記為「MT」)所組成之群中之至少1種尿蛋白。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中上述判定步驟包括將所測得之尿液生物標記之量與和上述尿液生物標記之量相關之閾值進行比較，於上述所測得之尿液生物標記之量大於上述閾值之情形時，判定為上述對象罹患AD或其發病風險較高。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中上述尿液生物標記為選自由ApoA-I、ApoB-100、ApoC-I、ApoD、ApoE、IFITM2、IFITM3、NPC1、及MT所組成之群中 之至少1種尿蛋白。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，其中AD之病狀為由AD引起之失智症或由AD引起之輕度認知障礙。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之方法，其包括使用從對象採集之尿液而製備尿試樣之步驟，上述尿試樣製備步驟包括將源自尿液之含尿蛋白複合體進行富集之步驟。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之方法，其包括使用從對象採集之尿液而製備尿試樣之步驟，上述尿試樣製備步驟包括從上述源自尿液之含尿蛋白複合體提取尿液生物標記之步驟。
  7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之方法，其中上述測定步驟包括對游離形態之尿液生物標記進行測定的步驟。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之方法，其中上述尿液生物標記為選自上述群中之至少2種尿蛋白。
  9. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之方法，其中上述尿液生物標記為選自上述群中之至少2種尿蛋白，上述尿試樣包含上述源自尿液之含尿蛋白複合體，上述至少2種尿液生物標記共同局部存在於上述複合體。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中上述測定步驟 為對上述含尿蛋白複合體之量進行測定的步驟，上述判定步驟進而包括判定該對象是否罹患心臟疾病或其發病風險是否較高。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之方法，其中上述測定步驟包括：形成上述尿液生物標記與針對其之檢測試劑之締合體，對源自上述締合體之反映尿液生物標記之量之訊號進行檢測。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中上述檢測試劑包含選自由針對尿液生物標記之抗體、抗體片段、單鏈抗體及適體所組成之群中之至少1種探針。
  13. 如申請專利範圍第11或12項所述之方法，其中上述檢測試劑進而包含選自由螢光物質、放射性物質及酶所組成之群中之至少1種標記物質。
  14. 一種試劑，其係用於如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之方法之檢測試劑，並且包含選自由針對尿液生物標記之抗體、抗體片段、單鏈抗體及適體所組成之群中之至少1種探針，該尿液生物標記為選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、IFITM1、IFITM2、IFITM3、NPC1、NPC2、NPC1L1、及MT所組成之群中之至少1種。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之試劑，其進而包含選自由螢光物質、放射性物質及酶所組成之群中之至少1種標記物質。
  16. 一種用於如申請專利範圍第1至13項中任一項所述之方法之診斷套組，其包含如申請專利範圍第14或15項所述之檢測試劑。
  17. 一種診斷系統，其包含：判定部，其係將源自從對象採集之尿液的尿試樣中之尿液生物標記之量、與關於AD之與上述尿液生物標記之量相關之閾值進行比較，而判定上述對象是否罹患AD或其發病風險是否較高；及顯示部，其係顯示上述判定部之判定結果；上述尿液生物標記為選自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoB-100、ApoB-48、ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III、ApoD、ApoE、IFITM1、IFITM2、IFITM3、NPC1、NPC2、NPC1L1、及MT所組成之群中之至少1種尿蛋白。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之診斷系統，其中上述系統具有資料庫，該資料庫儲存有分別對應於選自上述群中之複數種上述尿液生物標記之上述閾值，上述判定部係基於包含上述源自從對象採集之尿液的尿試樣中之上述尿液生物標記之種類的資訊，自上述資料庫取得對應之上述閾值，並基於上述所取得之閾值進行判定。
  19. 如申請專利範圍第17或18項所述之診斷系統，其中上述尿試樣中之尿液生物標記之量為上述尿試樣中之至少2種尿液生物標記所共同局部存在之含尿蛋白複合 體之量，上述閾值係與上述至少2種尿液生物標記所共同局部存在之含尿蛋白複合體之量相關之閾值。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之診斷系統，其中上述判定部係將上述尿試樣中之至少2種尿液生物標記所共同局部存在之含尿蛋白複合體之量、與關於心臟疾病之與上述至少2種尿液生物標記所共同局部存在之含尿蛋白複合體之量相關之閾值進行比較，進而判定上述對象是否罹患心臟疾病或其發病風險是否較高。
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