JP6532650B2 - 癌の検査方法 - Google Patents
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Description
本実施形態に係る癌の検査方法は、被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、処理尿中のα1−AT52量を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で定量する定量工程と、得られた定量値が予め設定された閾値を上回る場合に、被験者が癌に罹患している、又は被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定する判定工程と、を備える。
一実施形態において、前処理は、α1−AT52と、分子量52KDaよりも小さい所定の分子量(以下、「設定分子量」ともいう。)以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、被験者から採取された尿を分子量分画するステップと、α1−AT52が分画される画分を処理尿として回収するステップと、を含む。
定量工程では、処理尿中のα1−AT52量を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で定量する。
判定工程では、定量工程で得られた定量値が予め設定された閾値を上回る場合に、被験者が癌に罹患している、又は被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定する。
本実施形態に係るデータを収集する方法(以下、「データ収集方法」ともいう。)は、被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、処理尿中の分子量52KDaのα1−アンチトリプシン量を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で定量する定量工程と、を備える。前処理工程及び定量工程は、上述したとおりである。
ELISAによるα1−アンチトリプシン検出系(以下、「ELISA検出系」ともいう。)を構築した。
予め癌に罹患しているか否かを診断された被験者から採取された尿をサンプルとし、構築したELISA検出系による尿中のα1−アンチトリプシンの定量によって、癌の検査が可能か否かを検証した。ELISAに供する尿サンプルの前処理について、実施例1では限外ろ過処理のみを行い、実施例2ではタンパク質変性処理及び限外ろ過処理を行い、比較例1では前処理を行わなかった。
<測定試料調製>
被験者より尿を採取し、採尿後直ちに遠心分離(3,000×g、4℃、10分間)を行い、その上清を小分けして、−80℃の冷凍庫で保存した。ELISA法による測定を実施する当日に解凍し、直ちに遠心分離(2,800×g,4℃、10分間)した。得られた上清のうち50μlを分取し、等量の25mM Tris−HCl緩衝液(pH6.8)を混和後、限外ろ過装置(ミリポア社製、Microcon 10)のメンブレン上に添加して遠心分離(13,200×g、4℃、60分間)した。遠心分離後、メンブレン上に25mM Tris−HCl緩衝液(pH6.8)100μlを添加して更に遠心分離操作(13,200×g、4℃、60分間)する工程を計4回繰り返した。最終的に限外ろ過装置のメンブレンを逆転させ、メンブレン上に25mM Tris−HCl緩衝液(pH6.8)を50μl添加して遠心分離操作(13,200×g、4℃、10分間)を行い、得られた溶液を測定試料とし、ELISAによるα1−アンチトリプシン量の測定に供した。
−80℃の冷凍庫で保存した尿を、クレアチニン量を測定する当日に解凍し、直ちに遠心分離(2,800×g,4℃、10分間)した。得られた上清を用い、Creatinine Assay Kit(Cayman社製、カタログNo.500701)によってクレアチニン量を測定した。
測定試料に0.1%ウシ血清アルブミン及び0.05%Tween20を含有するD−PBS(−)を添加して様々な濃度の希釈系列を調製し、構築したELISA法による検出系で測定を行った。同一濃度につき2つのウェルを使用して各ウェルへ100μ1ずつ添加し(duplicate添加)、4℃にて一昼夜反応させた。反応後、0.05%Tween20を含有するD−PBS(−)で各ウェルを5回洗浄し、0.1%ウシ血清アルブミン及び0.05%Tween20を含有するD−PBS(−)で10ng/100μlに調製したHRP標識抗α1−アンチトリプシンポリクローナル抗体(BETHYL社)を各ウェルへ100μlずつ添加し、遮光下で、室温にて1時間反応させた。反応後、0.05%Tween20を含有するD−PBS(−)で各ウェルを5回洗浄した。TMB溶液(SIGMA社製)を各ウェルへ100μlずつ添加し、遮光下で、室温にて15分間反応させた。反応後、1N硫酸を各ウェルへ100μlずつ添加し、室温にて15分間反応させた。反応後、プレートリーダー(モレキュラーデバイス社製、SPECTRAMAX250)を用いて450nmの吸光度を測定した。
被験者より尿を採取し、採尿後直ちに遠心分離(3,000×g、4℃、10分間)を行い、その上清を小分けして、−80℃の冷凍庫で保存した。ELISA法による測定を実施する当日に解凍し、直ちに遠心分離(2,800×g,4℃、10分間)した。得られた上清のうち50μlを分取し、4.3%SDS及び10%2−メルカプトエタノール(β−ME)を含有する125mM Tris−HCl緩衝液(pH6.8)50μ1を添加して混和後、100℃、5分間煮沸してタンパク質変性処理を行った。タンパク質変性処理を行った尿試料に等量の25mM Tris−HCl緩衝液(pH6.8)を混和後、限外ろ過装置(ミリポア社製、Microcon 10)のメンブレン上に添加して遠心分離(13,200×g、4℃、60分間)した。遠心分離後、メンブレン上に25mM Tris−HCl緩衝液(pH6.8)100μlを添加して更に遠心分離操作(13,200×g、4℃、60分間)する工程を計4回繰り返した。最終的に限外ろ過装置のメンブレンを逆転させ、メンブレン上に25mM Tris−HCl緩衝液(pH6.8)を50μl添加して遠心分離操作(13,200×g、4℃、10分間)を行い、得られた溶液を測定試料とし、ELISAによるα1−アンチトリプシン量の測定及びクレアチニン量の測定に供した。ELISAによるα1−アンチトリプシン量の測定及びクレアチニン量の測定は、実施例1と同手順で行った。測定結果を表1〜3に示した。
被験者より尿を採取し、採尿後直ちに遠心分離(3,000×g、4℃、10分間)を行い、その上清を小分けして、−80℃の冷凍庫で保存した。ELISA法による測定を実施する当日に解凍し、直ちに遠心分離(2,800×g,4℃、10分間)した。得られた溶液を測定試料とし、ELISAによるα1−アンチトリプシン量の測定及びクレアチニン量の測定に供した。ELISAによるα1−アンチトリプシン量の測定及びクレアチニン量の測定は、実施例1と同手順で行った。測定結果を表1〜3に示した。
表1〜3に示した結果からROC曲線を作成した。図2は、実施例1〜2及び比較例1に係る癌の検査方法のROC曲線を示すグラフである。また、ROC曲線下面積の値を表4に示した。
Claims (11)
- 被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、
前記処理尿中の分子量52KDaのα1−アンチトリプシン量を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で定量する定量工程と、を備え、
得られた定量値が予め設定された閾値を上回ることが、前記被験者が癌に罹患している、又は前記被験者が癌に罹患しているおそれがあることを示し、
前記前処理が、
分子量52KDaのα1−アンチトリプシンと、分子量52KDaよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、前記尿を分子量分画するステップと、
分子量52KDaのα1−アンチトリプシンが分画される画分を前記処理尿として回収するステップと、を含む、
癌の検査方法。 - 前記前処理が、
前記尿にタンパク質変性処理を施し、変性尿を得るステップと、
分子量52KDaのα1−アンチトリプシンと、分子量52KDaよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、前記変性尿を分子量分画するステップと、
分子量52KDaのα1−アンチトリプシンが分画される画分を前記処理尿として回収するステップと、を含む、請求項1に記載の検査方法。 - 前記分子量分画が、限外ろ過又は逆浸透である、請求項1又は2に記載の検査方法。
- 前記分子量52KDaよりも小さい所定の分子量が、10KDaである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の検査方法。
- 前記予め設定された閾値が、ROC曲線に基づいて設定された閾値である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の検査方法。
- 前記癌が、固形癌である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の検査方法。
- 被験者から採取された尿を前処理して処理尿を得る前処理工程と、
前記処理尿中の分子量52KDaのα1−アンチトリプシン量を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で定量する定量工程と、を備え、
前記前処理が、
分子量52KDaのα1−アンチトリプシンと、分子量52KDaよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、前記尿を分子量分画するステップと、
分子量52KDaのα1−アンチトリプシンが分画される画分を前記処理尿として回収するステップと、を含む、
前記被験者が癌に罹患している、又は前記被験者が癌に罹患しているおそれがあると判定するためのデータを収集する方法。 - 前記前処理が、
前記尿にタンパク質変性処理を施し、変性尿を得るステップと、
分子量52KDaのα1−アンチトリプシンと、分子量52KDaよりも小さい所定の分子量以下の分子量を有する溶質とが異なる画分に分画されるように、前記変性尿を分子量分画するステップと、
分子量52KDaのα1−アンチトリプシンが分画される画分を前記処理尿として回収するステップと、を含む、請求項7に記載の方法。 - 前記分子量分画が、限外ろ過又は逆浸透である、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記分子量52KDaよりも小さい所定の分子量が、10KDaである、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、固形癌である、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。
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