TW201725198A

TW201725198A - 一種吡啶衍生物類化合物的製備方法及其中間體和晶型

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Publication number: TW201725198A
Application number: TW106101104A
Authority: TW
Inventors: 黃志剛; 照中丁; 湯東東; 王業鵬; 李自永
Original assignee: 辰欣藥業股份有限公司
Priority date: 2016-01-13
Filing date: 2017-01-13
Publication date: 2017-07-16
Also published as: CN108473428B; CN108473428A; WO2017121323A1; TWI714702B

Abstract

本發明公開了一種高純度(1R, 2S)-1-（5-（4-氯苯基）-2-甲氧基吡啶-3-基）-4-二甲氨基-2-芳基-1-苯基丁-2-醇的鹽的製備方法及其晶型，本發明還公開了製備式（Ⅰ）化合物的中間體化合物及其製備方法。□

Description

一種吡啶衍生物類化合物的製備方法及其中間體和晶型

本發明涉及一種高純度(1R , 2S )-1-（5-（4-氯苯基）-2-甲氧基吡啶-3-基）-4-二甲氨基-2-芳基-1-苯基丁-2-醇的鹽的製備方法及其晶型，本發明還涉及製備式（Ⅰ）化合物的中間體化合物及其製備方法。

結核分枝杆菌是結核病的病原體。作爲一種廣布全球，且可致命的感染性疾病，據世界衛生組織統計，每年約有超過800萬人感染，200萬人死於結核病。在過去十年，結核病病例在世界範圍內以20%的速度增長，該漲幅在貧困地區尤其顯著。如果該趨勢照此發展下去，結核病病例在未來二十年極有可能以41%的漲幅繼續增長。在最初應用化療方法之後的五十年內，結核病一直都是僅次於愛滋病的，致成年人死亡的主要感染病。結核病的併發症引發了許多耐藥菌株的出現，同時與愛滋病達成共生關係。愛滋病病毒測試呈陽性，且同時感染結核病的人群，比起愛滋病病毒測試呈陰性人群有多出30倍幾率發展成激活的結核病。平均來講，每三個死於愛滋病的病人中，就有一人是結核病導致的。

結核病的現有治療應用了多種藥劑的組合。比如，美國公共衛生署推薦的一種配方包括首先使用異煙肼、利福平、吡嗪醯胺和乙胺丁醇組合兩個月，然後再單獨使用異煙肼和利福平組合四個月。對於感染了愛滋病的患者，該種藥物組合的使用需延期至七個月。對於感染了耐多藥結核病的患者，該藥物組合還需添加其餘藥劑，如乙胺丁醇片、鏈黴素、卡那黴素、阿米卡星、卷麯黴素、乙硫異煙胺、環絲氨酸、環丙沙星和氧氟沙星。

爲了患者和供應者的利益，可改善當前治療的新型療法被高度需要，如更短的治療周期，更少需要被監督的治療方式。在接受治療的頭兩個月，混合的四種藥物集中抑制了細菌，從而很大程度上减少了細菌數量，使患者變得不具有傳染性。在接下來的4~6個月，存於患者體內的細菌被消滅，降低復發的可能性。一種可將治療周期縮短至兩個月或更短時間的强效殺菌藥會帶來巨大的益處。同時，該藥物還應需更少的監督。顯然，既縮短治療時間，又可减少監督頻率的藥物可以帶來最大的益處。

傳染性結核病的併發症引起多重耐藥性結核病。世界範圍內，4%的情况都與多重耐藥性結核病有關。多重耐藥性結核病主要耐四種標準治療藥物中的異煙肼和利福平。如無治療，或使用普通的結核病標準療法，多重耐藥性結核病可致命。所以，該疾病的治療需使用二線藥物至兩年時間。這些二線藥物大多數有毒性，價格昂貴，且藥效低微。由於缺少有效的治療，傳染性耐藥結核病患者持續擴散了疾病。因此，對於多重耐藥性結核病，一種具有新型作用機制的新藥被高度需求。

申請號：201410335196.X的專利記載了一類全新的吡啶衍生物及其作爲抗分支杆菌的應用，用於治療肺結核，尤其是多重耐藥性肺結核。其結構如式 (B-1)所示：

本發明提供了式（Ⅰ）化合物的製備方法，其包含如下步驟：其中，R¹ 選自任選被0、1、2或3個R⁰¹ 取代的6～12元芳基、6～12元雜芳基、6～12元芳基-亞烷基和6～12元雜芳基-亞烷基；HX選自有機或無機酸；鹼A選自鹼金屬鹼、鹼土金屬鹼或有機金屬鹼；化合物（Ⅱ）與鹼A的莫耳用量比爲 1: 1 ~5；化合物（Ⅱ）和化合物（Ⅲ）的莫耳用量比爲1: 1 ~2；反應溶劑選自單一醚類溶劑或幾種醚類溶劑的混合溶劑；反應溶劑用量爲化合物（Ⅳ）重量的3~20倍；反應溫度爲-80~0℃；反應時間爲1~24小時；R⁰¹ 選自F、Cl、Br、I、CN、OH、CH(CH₃ )₂ 、C(CH₃ )₃ 、N(CH₃ )₂ 、NH(CH₃ )、NH₂ 、CHO、COOH、C(=O)NH₂ 、S(=O)NH₂ 、S(=O)₂ NH₂ 、CF₃ 、CF₃ O、(NH₂ )CH₂ 、(HO)CH₂ 、CH₃ C(=O)、CH₃ OC(=O)、CH₃ S(=O)₂ 、CH₃ S(=O)；所述“雜”代表雜原子，選自N、O或S；雜原子的數目分別獨立地選自1、2或3。

本發明的一些方案中，上述R¹ 自任選被0、1、2或3個R⁰¹ 取代的萘基或苯基。

本發明的一些方案中，上述R¹ 選自、、或。

本發明的一些方案中，上述鹼金屬鹼選自氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銫、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、碳酸氫鈉和/或碳酸氫鉀。

本發明的一些方案中，上述鹼土金屬鹼選自氫化鈉、氫化鉀或氫化鈣。

本發明的一些方案中，上述有機金屬鹼選自正丁基鋰、二異丙基氨基鋰、2,2,6,6-四甲基呱啶鋰、二(三甲基矽)氨基鋰、甲醇鈉、三級丁醇鋰、三級丁醇鈉、三級丁醇鉀、乙醇鈉和/或異丙醇鋁。

本發明的一些方案中，上述化合物（II）與鹼A的莫耳用量比爲1：1.2~2。

本發明的一些方案中，上述反應溫度爲-80~-60℃。

本發明的一些方案中，上述反應時間爲2~12小時。

本發明的一些方案中，上述反應時間爲4~8小時。

本發明的一些方案中，上述反應溶劑選自四氫呋喃、乙醚和/或異異丙醚。

本發明的一些方案中，上述反應溶劑用量爲化合物（Ⅳ）重量的5~10倍。

本發明的一些方案中，上述製備方法還包含如下反應步驟：。

本發明的一些方案中，上述製備方法還包含如下反應步驟：，其中，鹼B選自氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銫、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、甲醇鈉、三級丁醇鋰、三級丁醇鈉、三級丁醇鉀、乙醇鈉、異丙醇鋁；反應溶劑選自酮類、醇類或者酯類溶劑和極性非質子性溶劑的混合溶劑；手性酸與化合物（Ⅳ）的莫耳比爲0.5~1.5；手性酸選自α-羥基丙酸、α-羥基丁二酸、α、β-二羥基丁二酸、α-羥基苯乙酸、β-羥基酸、化合物（Ⅵ）；，n爲0、1或2；R² 、R⁴ 分別獨立地選自H、F、Cl、Br、I，或選自任選被0、1、2或3個R⁰¹ 取代的：C_1-8 烷氧基、C_1-8 烷基、Si(Ph)₃ 、6～12 元芳基；R³ 、R⁵ 分別獨立地選自H、F、Cl、Br、I、NO₂ 、OH，或選自任選被0、1、2或3個R⁰¹ 取代的：C_1-8 烷氧基、C_1-8 烷基、6～12元芳基；任選地，位置13和位置14取代的R³ 或在位置14和位置15取代的R³ 可連接在一起，形成一個6～12 元芳基環；任選地，位置8和位置9取代的R⁵ 或在位置9和位置10取代的R⁵ 可連接在一起，形成一個6～12 元芳基環。

本發明的一些方案中，上述手性酸與化合物（Ⅳ）的莫耳比爲0.8~1.2。

本發明的一些方案中，上述手性酸與化合物（Ⅳ）的莫耳比爲1.0。

本發明的一些方案中，上述製備化合物（Ⅴ）的方法，反應溶劑中，酮類溶劑選自丙酮和/或甲基乙基酮。

本發明的一些方案中，上述製備化合物（Ⅴ）的方法，反應溶劑中，醇類溶劑選自乙醇、甲醇、異丙醇和/或三級丁醇。

本發明的一些方案中，上述製備化合物（Ⅴ）的方法，反應溶劑中，酯類溶劑選自乙酸乙酯和/或乙酸三級丁酯。

本發明的一些方案中，上述製備化合物（Ⅴ）的方法，反應溶劑中，極性非質子溶劑選自DMF、DMSO，DMA和/或NMP。

本發明的一些方案中，上述製備化合物（Ⅴ）的方法，其中，混合溶劑組合爲乙醇與DMF的混合溶劑或者乙醇與DMSO的混合溶劑。

本發明的一些方案中，由化合物（Ⅳ）製備化合物（Ⅴ）的溶劑選自：丙酮、甲基乙基酮、乙醇、甲醇、異丙醇、三級丁醇、乙酸乙酯、乙酸三級丁酯、DMF、DMSO，DMA和/或NMP，中的一種單一溶劑或幾種溶劑的混合溶劑。

本發明的一些方案中，上述製備化合物（Ⅴ）的方法，其中酮類、醇類或者酯類溶劑與極性非質子性溶劑的體積比爲1：0.03~0.1。

本發明的一些方案中，上述製備化合（Ⅴ）的方法，其中，溶劑用量爲化合物（Ⅳ）重量的15~50倍。

本發明的一些方案中，上述R³ 、R⁵ 分別獨立地選自H。

本發明的一些方案中，上述R² 取代在2位。

本發明的一些方案中，上述R⁴ 取代在6位。

本發明的一些方案中，上述R² 、R⁴ 分別獨立地選自：H、Si(Ph)₃ 、、、。

本發明的一些方案中，上述化合物（Ⅵ）選自、、、、、、、、、。

本發明的一些方案中，上述製備方法還包含如下反應路徑：，其中，HX選自有機或無機酸。

本發明的一些方案中，上述HX選自鹽酸、硫酸、磷酸、草酸、檸檬酸、馬來酸或富馬酸。

本發明的一些方案中，上述製備方法還包含如下反應步驟：；

本發明提供了作爲製備化學式（Ⅰ）化合物中間體的下式化合物：。

本發明還提供了下化學式所示化合物Ⅰ-1，。

本發明提供了化合物Ⅰ-1的Ⅰ晶型，其XRPD圖譜如圖1所示。

本發明的一些方案中，Ⅰ晶型的XRPD圖譜解析數據如表一所示。表一 Ⅰ晶型XRPD圖譜解析數據

本發明提供了化合物Ⅰ-1的Ⅱ晶型，其XRPD圖譜如圖4所示。

本發明的一些方案中，上述Ⅱ晶型的XRPD圖譜解析數據如表二所示。表二 Ⅱ晶型的XRPD圖譜解析數據

本發明提供了化合物Ⅰ-1的Ⅲ晶型，其XRPD圖譜如圖7所示。

本發明的一些方案中，上述Ⅲ晶型的XRPD圖譜解析數據如表三所示。表三 Ⅲ晶型的XRPD圖譜解析數據

本發明提供了上述Ⅰ晶型的製備方法，包括將任意一種形式的化合物Ⅰ-1加入到溶劑中結晶製得，其中，溶劑選自醇類、酮類溶劑或者醇類溶劑與酮類溶劑的混合溶劑；溶劑用量爲化合物Ⅰ-1重量的3~50倍。

本發明的一些方案中，上述Ⅰ晶型的製備方法中，醇類溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇和/或正丁醇。

本發明的一些方案中，上述Ⅰ晶型的製備方法中，酮類溶劑選自丙酮和/或甲基乙基酮。

本發明的一些方案中，上述Ⅰ晶型的製備方法中，混合溶劑爲甲醇與丙酮的混合溶劑。

本發明的一些方案中，上述Ⅰ晶型的製備方法中，甲醇與丙酮的混合溶劑的體積比爲1：5~30。

定義和說明：除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在含有下列含義。一個特定的短語或術語在沒有特別定義的情况下不應該被認爲是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文出現商品名時，旨在指代其對應的商品或其活性成分。

本發明的中間體化合物可以通過本領域技術人員所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術上人員所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明具體實施方式的化學反應是在合適的溶劑中完成的，所述的溶劑須適合於本發明的化學變化及其所需的試劑和物料。爲了獲得本發明的化合物，有時需要本領域技術人員在已有實施方式的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。

下面會通過實施例具體描述本發明，這些實施例並不意味著對本發明的任何限制。

本發明所使用的所有溶劑是市售的，無需進一步純化即可使用。反應一般是在惰性氮氣下、無水溶劑中進行的。質子核磁共振數據記錄在Bruker Avance III 400（400 MHz）分光儀上，化學位移以四甲基矽烷低場處的（ppm）表示。質譜是在安捷倫1200系列加6110（&1956A）上測定。 LC/ MS或Shimadzu MS包含一個DAD：SPD-M20A（LC）和Shimadzu Micromass 2020檢測器。質譜儀配備有一個正或負模式下操作的電噴霧離子源（ESI）。

本發明採用下述縮略詞：DMF 代表N,N-二甲基甲醯胺；DMA代表N,N-二甲基乙醯胺；DMSO代表二甲亞碸；NMP代表N-甲基吡咯烷酮；Pd(OAc)₂ 代表醋酸鈀；Pd(dppf)Cl₂ 代表[1,1'-雙(二苯基磷)二茂鐵]二氯化鈀；Pd₂ (dba)₃ 代表三（二亞苄基丙酮）二鈀；Pd(PPh₃ )₄ 代表四三苯基膦吧；Pd(PPh₃ )₂ Cl₂ 代表二氯二三苯基膦鈀；Et₃ N代表三乙胺；DIPEA代表二異丙基乙基胺；DBU代表1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯；AcOH代表冰乙酸；Na₂ SO₃ 代表亞硫酸鈉；MeOH代表甲醇；TMP代表2,2,6,6-四甲基呱啶；pH代表氫離子濃度指數。

化合物經手工或者ChemDraw®軟件命名，市售化合物采用供應商目錄名稱。

粉末X-射綫衍射（X-ray powder diffractometer, XRPD）。

儀器型號：布魯克D8 advance X-射綫衍射儀。

測試條件：詳細的XRPD 參數如下。

X-ray發生器：Cu, kα, (λ=1.54056Ǻ) 。

管電壓：40 kV，管電流：40 mA. 。

發射狹縫：1 deg. 。

限高狹縫：10 mm。

散射狹縫：1 deg. 。

接受狹縫：0.15 mm。

單色器：固定的單色器。

掃描範圍：4-40 deg. 。

掃描速度：10 deg/min 。

差熱分析（Differential Scanning Calorimeter, DSC）。

儀器型號：TA Q2000差示掃描量熱儀。

測試條件：取樣品（~ 1 mg）置於DSC鋁鍋內進行測試，方法爲：25°C - 300°C，升溫速率爲10 °C/min。

熱重分析（Thermal Gravimetric Analyzer, TGA）。

儀器型號：TA Q5000IR熱重分析儀。

測試條件：取樣品（2 ~ 5 mg）置於TGA鉑金鍋內進行測試，方法爲：室溫 - 300°C，升溫速率爲10 °C/min。

有益效果：本發明所提供的化合物Ⅰ-1的Ⅰ晶型、Ⅱ晶型和Ⅲ晶型性質穩定、溶解度好、引濕性好，具有良好的成藥前景。

本發明產生的合成化合物Ⅰ-1及其中間體的技術克服現有技術中起始原料價格昂貴，所用試劑毒害大，反應條件苛刻，分離純化困難，不易工業化等缺點。

具體地：（1）本發明製備化合物Ⅰ-1方法原料爲常規或常見試劑，在市場上容易獲得且價格低廉，（2）中間體化合物（Ⅱ）可由化合物（b）經過兩步常規反應以較高總回收率得到，後處理簡單，無需任何柱層析純化，（3）採用有機酸對化合物（IV）進行動力學分離，得到的化合物(Ⅰ)具有高的光學純度，（4）各步驟反應中所使用試劑均爲小分子，易於純化，將金屬鈀催化交叉偶聯放在比較靠前的步驟，有利於控制最終産物中金屬鈀殘留。

爲了更好的理解本發明的內容，下面結合具體實施例來做進一步的說明，但具體的實施方式並不是對本發明的內容所做的限制。

化合物1-（5-（4-氯苯基）-2-甲氧基吡啶-3-基）-4-（二甲基氨基）-2-（萘-1-基）-1-苯基丁-2-醇具有如下結構：。

該化合物具有兩個手性中心，如式（IV-1）中*標注，因而具有四個立體異構體，分別是(1R ，2S )1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲基氨基)-2-(萘-1-基)-1-苯基丁-2-醇，(1S ，2R )1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲基氨基)-2-(萘-1-基)-1-苯基丁-2-醇，(1R ，2R )1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲基氨基)-2-(萘-1-基)-1-苯基丁-2-醇和(1S ，2S )1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲基氨基)-2-(萘-1-基)-1-苯基丁-2-醇。這四個立體異構體是由兩組非對映異構體組成，其中外消旋體混合物(1R ，2S )1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲基氨基)-2-(萘-1-基)-1-苯基丁-2-醇和(1S ，2R )1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲基氨基)-2-(萘-1-基)-1-苯基丁-2-醇在後續實施例部分將被標爲"A"；而外消旋體混合物(1R ，2R )1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲基氨基)-2-(萘-1-基)-1-苯基丁-2-醇和(1S ，2S )1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲基氨基)-2-(萘-1-基)-1-苯基丁-2-醇在後續實施例部分將被標爲"B"。

下文闡述的實例都是通過此處說明的方法進行製備，分離及描述特徵的。下文的實例僅僅只是本發明範圍內具有代表性的一部分，而非發明全部。本文已經詳細地描述了本發明，其中也公開了其具體實施例方式，對本領域的技術人員而言，在不脫離本發明精神和範圍的情况下針對本發明具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。

實施例1：化合物Ⅰ-1的製備。

流程1：。

步驟1：5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶的合成。。

在攪拌下，依次將碳酸鉀（5.51千克，39.89莫耳，1.5當量）和Pd(dppf)Cl₂ （48.64克，66.48毫莫耳，0.0025當量）加入到5-溴-2-甲氧基吡啶（5.0千克，26.59莫耳，1.0當量）和4-氯苯硼酸（4.49千克，28.72莫耳，1.08當量）的二氧六環（25 升）和水（5 升）的混合溶液中，氮氣置換三次，然後將反應體系加熱到95~100 °C，在此溫度下回流反應16 小時。HPLC檢測5-溴-2-甲氧基吡啶消耗完後即停止反應，將反應液冷至25~30 °C，經减壓濃縮除去二氧六環，殘留物用乙酸乙酯萃取兩次（10升×2），合併有機相，用飽和食鹽水洗滌（5升×2），35~40 °C溫度下减壓濃縮得到5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶的粗品（6.5 kg，冷却後爲深棕色針狀固體），粗品直接用於下一步反應。¹ H NMR（400 MHz, CDCl₃ ）δ:8.37（d,J = 2.1 Hz, 1H），7.75（dd,J = 8.6, 2.6 Hz, 1H），7.48-7.39（m, 4H），6.83（d,J = 8.6 Hz, 1H），4.00（s, 3H）。

步驟2：3-溴-5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶的合成。。

在25^o C下，將5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶（6.5千克，29.59莫耳，1.00當量）溶解在DMF（21升）中，歷經4~5小時，緩慢滴加到液溴（11.82 kg，73.97 mol，2.50eq ）的AcOH（7升）溶液中。滴加完畢後，反應混合物在25^o C下攪拌72小時，TLC（石油醚）檢測約20%原料剩餘，繼續向反應體系中補加液溴（2.5千克，0.5當量），繼續攪拌48小時，HPLC檢測仍有少量的原料（大約7-9%）沒有反應完全。停止反應，將反應液在攪拌下慢慢加到飽和Na₂ SO₃ （6千克）水溶液中，淬滅過程控制溫度在30°C以下。有大量的淺黃色固體析出，過濾，濾餅用水（20升×2~）洗滌兩次，得到的粗品用MeOH（15升×2）混合兩次，過濾，濾餅經真空乾燥（50°C）得到3-溴-5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶（6.7千克，白色固體，兩步總回收率84%）。¹ H NMR（400 MHz, CDCl₃ ）δ：8.28（d,J = 2.3 Hz, 1H），8.00（d,J = 2.3 Hz, 1H），7.43（s, 4H），4.06（s, 3H）。

步驟3：3-苄基-5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶的合成。。

苄基鋅試劑製備：在氮氣保護下，將鋅粉（2.85千克，43.56莫耳，2.00當量）懸浮在無水四氫呋喃（21.78升）中，在室溫下，一次性加入1,2-二溴乙烷（33毫升，0.02當量），然後加熱到回流，緩慢加入三甲基氯矽烷（28毫升，0.01當量）（注：加入後需觀察到有大量的氣泡産生，並使回流劇烈，如果沒有觀察到氣泡産生，需補加三甲基氯矽烷），在66 °C下回流30分鐘。然後將反應液冷却至25 °C，將苄溴（3.73千克，2.59升，21.78莫耳，1.00當量）緩慢滴加到反應中（注：滴加速度使反應的溫度不超過30 °C ），在該溫度下繼續攪拌3小時，即可得到苄基鋅試劑的四氫呋喃溶液（濃度：1莫耳／升），直接用於下一步反應。

在氮氣保護下，將3-溴-5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶（5千克，16.75莫耳，1.00當量）的四氫呋喃溶液（16升）在室溫下歷經30~45分鐘加入到上面新製備的苄基鋅試劑四氫呋喃溶液（1莫耳/升，21.78升，1.3當量）中，然後加入Pd(PPh₃ )₂ Cl₂ （59克， 83.75毫莫耳，0.005當量），反應液在氮氣氛圍中室溫攪拌16小時（反應體系自身放熱，溫度最高升至50°C，然後慢慢降溫，反應液變成灰黑色）。TLC（石油醚/乙酸乙酯=20/1）檢測反應完成，反應液用矽藻土和矽膠過濾，濾液旋乾得到深棕色油狀物，然後粗品用乙酸乙酯萃取 (15升×2)，懸浮的有機相再次過濾，濾液用飽和食鹽水（10升×2）洗滌兩次，無水硫酸鈉乾燥，過濾，35~40 °C溫度下减壓濃縮得到棕色油狀物，然後粗品在劇烈攪拌下慢慢倒入到甲醇中（10升），有大量的白色沉澱析出，過濾，濾餅用甲醇打漿 (2升×2) 得到3-苄基-5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶（3.0千克，白色固體，回收率爲58%）。¹ H NMR（400 MHz, CDCl₃ ）δ：8.23（d,J = 2.4 Hz, 1H），7.47（d,J = 2.4 Hz, 1H），7.42-7.35（m, 4H）， 7.35-7.29（m, 2H），7.27-7.21（m, 3H），4.02（s, 3H），3.98（s, 2H）。

流程2：。

步驟4：3-二甲氨基-1-（萘-1-基）丙-1-酮·草酸鹽的合成。。

在20-30°C下，將多聚甲醛（2.67千克，29.67莫耳），二甲胺鹽酸鹽（4.00千克，49.06莫耳）依次加入到1-萘乙酮 (5.00千克，29.38莫耳) 的乙醇（25升）溶液中，加入催化量的鹽酸 (139.23克，3.82莫耳，136.5毫升)，將反應混合物加熱至78-80^o C回流反應48小時，HPLC檢測1-萘乙酮基本反應完全（含量小於5%）。將反應液减壓濃縮除去乙醇，然後將殘留物溶解在水中（25升），用乙酸乙酯萃取兩次（5升×2），水相用1莫耳/升的氫氧化鈉水溶液調節pH 值至9~10，然後用乙酸乙酯萃取兩次（15升×2），合併第二次萃取的有機相，用飽和食鹽水洗滌 (10升×2)，减壓濃縮得到粗品3-(二甲胺基)-1-(1-萘基) 丙-1-酮(7.41公斤，黃色油狀物)。將上述粗品溶解在乙酸乙酯（25升）中，然後將二水合草酸（4.2公斤，33.3莫耳）的乙醇溶液（20 L）滴加到上面的溶液中，室溫攪拌1小時，有大量的白色固體形成，然後過濾，用乙酸乙酯（5升×2）洗滌兩次，得到3-(二甲胺基)-1-(1-萘基) 丙-1-酮的草酸鹽（6.5千克， 22.18莫耳，回收率56%，白色固體）。¹ H NMR（400MHz，CDCl₃ ）δ：8.59（d,J =8.5 Hz, 1H）, 8.00（d,J =8.3 Hz, 1H），7.89（d,J =7.3 Hz, 2H），7.64-7.48 （m, 3H），3.25（t,J =7.3 Hz, 2H），2.83（t,J =7.3 Hz, 2H），2.31（s, 6H）。

步驟5：3-二甲氨基-1-（萘-1-基）丙-1-酮的合成。。

攪拌下，將3-(二甲胺基)-1-(萘-1-基)丙基-1-酮草酸鹽（6.5千克， 20.4莫耳）加入到水（20升）中。保持溫度0-10ºC，轉速160~190轉/分鐘，得到白色懸濁液。將冷却的氫氧化鈉（1.8千克， 45.0莫耳）水（10升）溶液緩慢加入到上述懸濁液中，保持溫度0~10 ºC。可觀察到白色懸濁液逐漸溶解，黃色油狀物生成。氫氧化鈉溶液加完後繼續攪拌1小時。反應液用乙酸乙酯（15升）萃取，水相用乙酸乙酯（10升）萃取，合併有機相用飽和食鹽水（20升）洗滌。有機相减壓濃縮至恒重得到3-(二甲胺基)-1-(萘-1-基)丙基-1-酮（3.4千克，黃色油狀物，回收率爲70%）。¹ H NMR（400 MHz, CDCl₃ ）δ：8.59（d,J = 8.8 Hz, 1H），8.00（d,J = 8.4 Hz, 1H），7.90（d,J = 8.4 Hz, 2H），7.60-7.28（m, 3H），3.26（t,J = 7.2 Hz，2H），2.83（t,J = 7.2 Hz, 2H），2.31（s, 6H）。

流程3。。

步驟5：1-（5-（4-氯苯基）-2-甲氧基吡啶-3-基）-4-（二甲基氨基）-2-（萘-1-基）-1-苯基丁-2-醇的合成。。

正丁基鋰滴定：氮氣保護下，取二苯基乙酸（1.00克，Alfa，4.71毫莫耳）加入到四氫呋喃（10毫升）中形成無色透明溶液。用注射器取丁基鋰的正己烷溶液緩慢滴加到上述溶液中。觀察現象，滴加過程中溶液局部呈黃色但迅速消失。當滴加一滴形成黃色溶液且半分鐘內不褪色即爲終點，記下正丁基鋰體積（兩次分別爲：1.927毫升和1.985毫升，平均體積爲1.95毫升），故所使用的正丁基鋰正己烷溶液濃度爲2.42莫耳/升。

將TMP（2.74千克，19.3莫耳）溶解在無水四氫呋喃（12升）中，乾冰丙酮浴冷却反應溫度至-65 ºC開始滴加正丁基鋰（8升，19.3莫耳，2.42莫耳/升的正己烷溶液）。控制溫度在-20 ºC~-78 ºC之間，可觀察到反應體系顔色由淺黃色逐漸變紅至深紅色最後形成黃色懸濁液，繼續在此溫度下攪拌30分鐘。然後降低反應溫度將至-75 ºC~-80ºC開始歷經4~6小時慢慢滴加3-苄基-5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶（4.08千克，12.9莫耳）的無水四氫呋喃（6升）溶液。保持溫度-65ºC~-78ºC，可觀察到放熱不劇烈顔色呈深紅色。滴加完成後，開始歷經2~4小時慢慢滴加3-(二甲胺基)-1-(萘-1-基)丙基-1-酮（3.26千克，12.9莫耳，90%純度）的無水四氫呋喃（2.0升）溶液，反應放熱明顯，控制流速保持溫度-65ºC~-78ºC。滴加完全後維持-65ºC~-78ºC繼續攪拌半小時。HPLC檢測3-苄基-5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶的含量小於10%，將反應液慢慢加入到飽和氯化銨溶液（40升）中淬滅，分液，水相用乙酸乙酯（30升）萃取。合併有機相用飽和食鹽水（30升）洗滌分液，有機相在40~50 ºC下减壓濃縮得到黃色油狀粗品（13.5 千克），粗品經乙酸乙酯/正庚烷（4升，1/4）混合溶劑在5ºC~15ºC下攪拌16小時析出白色固體。過濾，濾餅用乙醇混合（4升×2），過濾，濾餅經真空乾燥烘至恒重（50ºC，24~48小時）得到目標化合物1-（5-（4-氯苯基）-2-甲氧基吡啶-3-基）-4-（二甲基氨基）-2-（萘-1-基）-1-苯基丁-2-醇（1.83千克，收率23.23%），爲白色固體，HPLC鑒定異構體A含量爲88.3%，異構體B含量爲4.8%。¹ H NMR（400MHz, CDCl₃ ）δ：8.85（d,J = 2.3 Hz, 1H），8.64（d,J = 8.7 Hz, 1H），8.32（d,J = 2.4 Hz, 1H），7.98-7.86（m, 2H），7.72-7.61（m, 2H），7.57（d,J = 8.4 Hz, 2H），7.54-7.43（m, 3H），7.33（t,J = 7.8 Hz, 1H），7.20-7.17（m, 2H），6.95-6.87（m, 3H），5.85（s, 1H），4.17（s, 3H），2.60-2.51 （m, 1H），2.19-2.04（m, 2H），2.01-1.97（m, 7H）。

步驟6：(1R ,2S )-1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲基氨基)-2-(萘-1-基)-1-苯基丁-2-醇化合物Ⅰ-2的合成。。

方法1：兩平行批次投料：將R -(-)-聯萘酚磷酸酯（519.3克， 1.49莫耳）懸浮在DMSO（1.0升）中，加熱至50ºC攪拌溶解至澄清。將1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲胺基)-2-(萘甲醇-1-基)-1-苯基丁基-2-醇（910克，1.49莫耳, 異構體A含量爲88.3%）加入到乙醇（24升）溶液中，在攪拌情况下（轉速196轉/分鐘）歷時1~2小時滴加上述製備的R -(-)-聯萘酚磷酸酯的DMSO（1.0升）溶液。可觀察到不溶解的顆粒化合物開始溶解，但有更粘稠的乳濁液形成。加畢，反應液在15~35ºC下繼續攪拌16小時。反應液用油浴加熱至回流併繼續回流1小時，停止加熱，將反應液冷却至15~35ºC併繼續攪拌16小時。將反應液過濾（兩批次合併處理），固體粘稠度大，過濾較慢，濾餅用乙醇（20升）打漿三次。合併有機相濃縮至恒重，得到黃色油狀物（5千克），向此粗品中加如水（10升）和乙酸乙酯（5升），反應用10%的冷氫氧化鈉水溶液調節pH值至11，繼續攪拌1小時，然後進行分液，反應中有大量固體析出，過濾得到的固體爲異構體A（350克，純度爲97%，白色固體）。濾液在50ºC下减壓濃縮至恒重，加入乙醇（1.0 升）在15-35ºC下攪拌16小時，過濾，濾餅用乙醇（400毫升）洗滌三次，得到白色固體經真空乾燥烘至恒重（50ºC，24~48小時）得到化合物Ⅰ-2（400克，純度95%，ee值大於99.5%，回收率24%），白色固體。¹ H NMR（400MHz, CDCl₃ ）δ：8.85（d,J = 2.3 Hz, 1H），8.64（d,J = 8.7 Hz, 1H），8.32（d,J = 2.4 Hz, 1H），7.98-7.86（m, 2H），7.72-7.61（m, 2H），7.57（d,J = 8.4 Hz, 2H），7.54-7.43（m, 3H），7.33（t,J = 7.8 Hz, 1H），7.20-7.17（m, 2H），6.95-6.87（m, 3H），5.85（s, 1H），4.17（s, 3H），2.60-2.51（m, 1H），2.19-2.04（m, 2H），2.01-1.97（m, 7H）。

方法2：將S -聯萘酚磷酸酯（473克，1.35莫耳）懸浮在DMSO（1.1升）中，加熱至50ºC攪拌溶解至澄清。將1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲胺基)-2-(萘甲醇-1-基)-1-苯基丁基-2-醇（780克，1.35莫耳，異構體A含量93.5%）懸浮在乙醇（22升）溶液中。在攪拌情况下（轉速196轉/分鐘）歷時1小時滴加上述製備的S -聯萘酚磷酸酯的DMSO（1.1升）溶液。可觀察到不溶解的顆粒化合物開始溶解，但有更粘稠的乳濁液形成。加畢，反應液在15-35ºC下繼續攪拌16小時。反應液用油浴加熱至回流併繼續回流1小時。停止加熱反應液冷却至15~35ºC並繼續攪拌16小時。將反應液過濾，由於固體粘稠度大，過濾較慢。濾餅用乙醇（20升×2）混合兩次，過濾得到白色固體，將此固體混合在水（3升）和乙酸乙酯（3 升）中，加入10%的氫氧化鈉水溶液調節反應pH至10~11，繼續攪拌1小時，分液，有機相濃縮至恒重，加入乙醇（1升）並攪拌一小時，過濾，得到的固體在乙醇（8升）中重結晶（加熱至80ºC繼續攪拌至澄清冷却至15-35ºC繼續攪拌16小時），冷却過濾，得到的白色固體經真空乾燥烘至恒重（50ºC，24~48小時）得到化合物Ⅰ-2（280克，純度99.2%，ee值99.1%，收率38%，白色固體）。¹ H NMR（400MHz, CDCl₃ ）δ：8.85（d,J = 2.3 Hz, 1H），8.64（d,J = 8.7 Hz, 1H），8.32（d,J = 2.4 Hz, 1H），7.98-7.86（m, 2H），7.72-7.61（m, 2H），7.57（d,J = 8.4 Hz, 2H），7.54-7.43（m, 3H），7.33（t,J = 7.8 Hz, 1H），7.20-7.17（m, 2H），6.95-6.87（m, 3H），5.85（s, 1H），4.17（s, 3H），2.60-2.51（m, 1H），2.19-2.04（m, 2H），2.01-1.97（m, 7H）。

步驟7：(1R ,2S )-1-(5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲胺基)-2-(萘甲醇-1-基)-1-苯基丁基-2-醇富馬酸鹽化合物Ⅰ-1。。

將化合物Ⅰ-2（395克，0.735莫耳）歷經1~2小時加入到富馬酸（89.6克，0.772莫耳）的異丙醇（7升）溶液中，然後加入活性炭（10克）與異丙醇（1.0升）。加熱至回流並繼續回流0.5~1小時，固體溶解至澄清。熱過濾得到無色澄清溶液加熱至回流並保持回流1小時，停止加熱緩慢冷却到60ºC，開始有固體析出，保持溫度不變繼續攪拌2小時然後歷時4~6小時降溫至15-35ºC，並繼續攪拌16小時，有大量固體析出。將反應液過濾，濾餅經真空乾燥烘至恒重（50ºC，24~48小時）得到目標化合物(1R ,2S )-1- (5-(4-氯苯基)-2-甲氧基吡啶-3-基)-4-(二甲胺基)-2-(萘甲醇-1-基)-1-苯基丁基-2-醇富馬酸鹽即化合物Ⅰ-1（398克，純度98.8%，ee值大於99.5%，收率82.9%，白色固體）。¹ H NMR（400MHz, DMSO-d ⁶ ）δ：8.61（d,J =8.2 Hz, 1H），8.50（br. s., 1H），8.40（br. s, 1H），7.91（br. s., 2H），7.71（d,J =8.0 Hz, 2H），7.66（d,J =8.5 Hz, 2H），7.56-7.54（m, 3H），7.35（t,J =7.7 Hz, 1H），7.17（d,J = 6.3 Hz, 2H），6.92-6.80（m, 3H），6.53（s, 2H），5.73（s, 1H），4.13（s, 3H），2.37（m, 1H），2.13（m, 7H），2.07-1.97（m, 1H），1.90（d,J =8.9 Hz, 1H）。

實施例2：化合物Ⅰ-1的Ⅰ晶型的製備。

取365克上述步驟7中所得化合物Ⅰ-1懸浮在丙酮/甲醇（20/1，730毫升）的混合溶劑中，在15-35ºC下打漿攪拌16~20小時，過濾，濾餅經真空乾燥烘至恒重（50ºC，24~48小時）得到化合物Ⅰ-1的I晶型（265克，純度99.7%，ee值大於99.5%，回收率72.6%，白色固體）。

實施例3：化合物Ⅰ-1的Ⅱ晶型的製備。

取大約50mg 的化合物Ⅰ-1的Ⅰ晶型，加入0.1 mL 四氫呋喃成懸濁液。懸濁液樣品置於恒溫均勻儀上（40°C）振搖2天（避光）。殘留的固體物離心分離，並在40ºC 真空乾燥箱中乾燥過夜得到化合物Ⅰ-1的Ⅱ晶型。

實施例4：化合物Ⅰ-1的Ⅲ晶型的製備。

Ⅲ晶型的製備過程同Ⅱ晶型，僅把溶劑四氫呋喃變爲0.2 mL丙酮-水(2:1)。

實施例5：化合物2的製備。。

步驟11：1-（3，5-二氯苯基）-3-（二甲基胺基）丙烷-1-酮。。

室溫下將3,5-二氯苯乙酮（25.0克，132.25毫莫耳）、二甲胺鹽酸鹽（43.13克，529毫莫耳）和多聚甲醛（15.49克，171.93毫莫耳）混合在乙醇（300毫升）中，加入濃鹽酸（4.73毫升），將反應混合物加熱到80 ℃，繼續攪拌48~52小時。將反應液减壓條濃縮得到黃色固體，將該黃色固體用水（500毫升）溶解，然後用二氯甲烷（300毫升×3）萃取。水相用10 %的氫氧化鈉水溶液調節pH值至~12，然後用二氯甲烷（200毫升×3）萃取，合併第二次萃取的有機相並用無水硫酸鈉乾燥，過濾，减壓濃縮得到目標化合物1-（3，5-二氯苯基）-3-（二甲基胺基）丙烷-1-酮（24 克，純度83 %），爲黃色油狀液體。

步驟12：1-（5-（4-氯苯基）-2-吡啶基）-2-（3,5-二氯苯基）-4-（二甲基氨基）-1-苯基-丁烷-2-醇。。

常溫攪拌下將TMP（16.41克，116.2毫莫耳）溶解在四氫呋喃（200毫升）中，置換氮氣保護，用乾冰-丙酮浴降溫至-78℃，緩慢滴加正丁基鋰（46.48 毫升，116.2毫莫耳，2.5莫耳/升的正己烷溶液），維持溫度在-78~-20℃繼續攪拌30分鐘。將反應體系溫度降至-78~-65℃，加入3-苯基-5-（4-氯苯基）-2-甲氧基-吡啶（24.0克，77.4毫莫耳）的四氫呋喃（200毫升）溶液，滴加完畢後繼續攪拌10分鐘，再將1-（3,5-二氯苯基）-3-（二甲基氨基）丙烷-1-酮（23.84克，77.47毫莫耳）的四氫呋喃（100 毫莫耳）溶液慢慢滴加至反應體系中，加畢，反應液繼續在-78~-65℃攪拌20 分鐘。用飽和氯化銨水溶液（100毫升）淬滅，然後用乙酸乙酯（150毫升×2）萃取，合併有機相並用飽和食鹽水（150毫升×2）洗滌、無水硫酸鈉乾燥、减壓濃縮得到粗品産物。粗品産物經柱層析（石油醚/乙酸乙酯=10/1至1/1）得到目標化合物（1R ,2S ）-1-（5-（4-氯苯基）-2-吡啶基）-2-（3,5-二氯苯基）-4-（二甲基氨基）-1-苯基-丁烷-2-醇和（1S ,2R ）-1-（5-（4-氯苯基）-2-吡啶基）-2-（3,5-二氯苯基）-4-（二甲基氨基）-1-苯基-丁烷-2-醇的混合物（5.0克，純度99%，收率11.5%，白色固體）。¹ H NMR（400 MHz, CDCl₃ ）δ：8.66（d,J = 2.51 Hz, 1H），8.39（br. s., 1H），8.25（d,J = 2.51 Hz, 1H），7.50-7.48（m, 2H），7.42-7.40（m, 2H），7.40-7.30（m, 4H），7.11-7.02（m, 4H），4.76（s, 1H），4.06（s, 3H），2.26-2.23（m, 1H），2.12-2.04（m, 8H），1.73-1.70（m, 1H）。

步驟13：(1R ,2S )-1-（5-（4-氯苯基）-2-吡啶基）-2-（3,5-二氯苯基）-4-（二甲基氨基）-1-苯基-丁烷-2-醇。。

在0℃下將步驟10中製得的對應異構體（1R ,2S ）-1-（5-（4-氯苯基）-2-吡啶基）-2-（3,5-二氟苯基）-4-（二甲基氨基）-1-苯基-丁烷-2-醇和（1S ,2R ）-1-（5-（4-氯苯基）-2-吡啶基）-2-（3,5-二氟苯基）-4-（二甲基氨基）-1-苯基-丁烷-2-醇（8.0克，14.39毫莫耳）懸浮在乙醇（240毫升）中，然後將R -(-)-聯萘酚磷酸酯（5.01克，14.39毫莫耳）的二甲基亞碸（24毫升）溶液緩慢滴加至底物溶液中，反應液在20 ℃下攪拌8小時。然後將反應液加熱至80℃並攪拌1小時，緩慢降溫（2~4小時）至20℃並繼續攪拌16小時。將反應液過濾，濾液减壓濃縮，然後溶解於乙酸乙酯（40 毫升）中，用10%的氫氧化鈉調節至鹼性（pH大於12），分液，將有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得粗品産物。將粗品産物加入到乙醇（100毫升）中，在20~30℃下攪拌1~2小時，過濾，濾餅經真空乾燥烘至恒重（50ºC，24~48小時）得到目標産物（1R ,2S ）-1-（5-（4-氯苯基）-2-吡啶基）-2-（3,5-二氯苯基）-4-（二甲基氨基）-1-苯基-丁烷-2-醇（3.1 克，純度98.9%，ee值98.1%，回收率38.8%，白色固體）。¹ H NMR（400 MHz, CDCl₃ ）δ：8.66（d,J = 2.51 Hz, 1H），8.39（br. s., 1H），8.25（d,J = 2.51 Hz, 1H），7.50-7.48（m, 2H），7.42-7.40（m, 2H），7.40-7.30（m, 4H），7.11-7.02（m, 4H），4.76（s, 1H），4.06（s, 3H），2.26-2.23（m, 1H），2.12-2.04（m, 8H），1.73-1.70（m, 1H）。

實施例6：Ⅰ晶型在不用溶劑中的穩定性試驗。

取適量的Ⅰ晶型多份，分別加入0.1 - 0.3 mL的下表中的單一或混合溶劑，40ºC條件下攪拌2天後離心。收集所有樣品中的固體，於真空乾燥箱中（40ºC）乾燥過夜，XRPD檢測其晶型狀態。結果見表四。表四 Ⅰ晶型在不用溶劑中的穩定性實驗

實施例7：Ⅰ晶型在高溫、高濕及强光照條件下的固體穩定性試驗。

秤取Ⅰ晶型樣品約10 mg，置於玻璃樣品瓶的底部，攤成薄薄一層。60°C及92.5%RH條件下放置的樣品用鋁箔紙封瓶口，並在鋁箔紙上扎些小孔，保證樣品能與環境空氣充分接觸；强光照（5 Klux）條件下放置的樣品用螺紋瓶蓋密封。不同條件下放置的樣品於第5天，10天取樣檢測，檢測結果與0天的初始檢測結果進行比較，試驗結果見表五。表五 Ⅰ晶型的固體穩定性試驗

藥理學部分。

第一部分：使用耻垢分枝杆菌菌株ATCC19420測試抗肺結核分枝杆菌化合物體外藥效。

測試當天，溶解化合物於純DMSO(Sigma 276855-2L)中至濃度12.8mg/ml作爲化合物母液。在V底96孔板（Axygen-wipp02280）的所有孔中加入30 µl DMSO。在第1列孔中加入30 µl化合物母液，吹打混勻後從第1列孔取30 µl加入第2列孔並吹打混勻。以此操作至第11列。第12列不加藥，只含30 µl DMSO。此爲化合物“母板”。從第1列到第12列，對應化合物濃度爲6.4， 3.2， 1.6， 0.8， 0.4， 0.2， 0.1， 0.05， 0.025， 0.0125， 0.00625， 0 mg/ml。對於藥效好的化合物，適當降低測試濃度。以U底96孔板（Costar 3788）作爲“子板”。在所有子板的孔內加入98 µl含0.02%吐溫80的CA-MHB（BD-212322）培養基。從母板中吸取2 µl化合物加入對應位置的子板中。

提前兩天將細菌接種於羅氏改良斜面培養基（Difco-244420）上，於37°C培養箱培養48小時。測試當天從培養基斜面上收取細菌菌落並懸浮於含0.02%吐溫80的無菌生理鹽水中。在菌液中加入7-10個直徑爲3 mm的無菌玻璃珠，使用渦旋儀在最大轉速打散細菌。使用西門子濁度儀（Siemens MicroScan turbidity meter）調節菌液濁度至0.10，對應細菌濃度爲~1.5×10⁸ cfu/ml。用CA-MHB+0.02%吐溫80培養基先稀釋此菌液20倍，後再稀釋25倍（共500倍）。稀釋後的菌液將用來接種子板。

在子板的每一孔中加入100 µl菌液。每孔中將含：~3.0×10⁴ cfu 細菌，1% DMSO，以及梯度稀釋的化合物於200µl CA-MHB+0.02%吐溫80培養基中。將完成後的子板放置於30°C培養箱培養。72小時後讀取最小抑菌濃度（MIC）。

閱讀MIC的標準參照CLSI方法M7-A7定義爲：完全或顯著抑制細菌增長的藥物最低濃度。化合物檢測結果列於表六。表六體外篩選結果註：ATCC：美國型培養菌種集；MABA：微孔板阿爾瑪藍顯色測試；LORA：厭氧條件下恢復測試；Vero Cell：非洲綠猴腎細胞；IC50：半數抑制濃度；Hela：人宮頸癌細胞；CC50：半數細胞毒性濃度。

第二部分：使用H37Rv菌株測試抗結核分枝杆菌化合物體外藥效。

測試當天，溶解化合物於純DMSO（Sigma 276855-2L）中至濃度10 mg/ml作爲化合物母液。在V底96孔板（Axygen-wipp02280）的第2列至第11列孔內加入30 µl DMSO。加30 µl化合物母液於第2列孔，混勻後從第2列孔取30 µl加入第3列孔並吹打混勻。以此操作至第10列。第11列不加藥，只含30 µl DMSO。此爲化合物“母板”。從第2列到第11列，對應化合物濃度爲5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156, 0.078, 0.039, 0.02, 0 mg/ml。對於藥效好的化合物，適當降低測試濃度。以平底96孔板（Greiner 655090）作爲“子板”。在所有子板的孔內加入98 µl 7H9（Sigma M0178）培養基。從母板中吸取2 µl化合物加入對應位置的子板中。子板A和H行，第1和第12列只含7H9培養基。

將甘油凍存管中的H37Rv菌株接種於含0.05%吐溫80的7H9培養基中，於37°C,200轉每分鐘的搖床內培養4個星期。將菌液用含0.05%吐溫80的7H9培養基洗滌兩次並重懸浮於相同培養基內。使用同樣的培養基將菌液的吸光度調爲OD₅₅₀ =0.4-0.5之間。分裝此菌液於微型離心管中並儲存於-80°C。儲存時間不超過1個月。在測試當天，將分裝的菌液化凍。用7H9培養基將化凍菌液稀釋20倍後再稀釋50倍，共1000倍稀釋，此菌液將用於接種子板。將100 µl菌液接種於子板的每一孔中，第12列加100 µl 7H9培養基，不加菌液。

將測試子板放於37°C培養箱內培養，濕度維持在＞80%。一個星期之後開始，每天向一含細菌的第1列孔和一不含細菌的第12列孔內加入12.5 µl含20%吐溫80的7H9培養基和20 µl Alamar藍（Invitrogen DAL1100），並繼續培養24小時後觀察。當第1列孔內的菌液能將所加入的Alamar藍於24小時內還原爲粉色時，加含20%吐溫80的7H9培養基和Alamar藍於測試板上的所有孔內，37°C繼續陪養24小時後測量螢光值。

最小抑菌濃度（MIC）定義爲：通過肉眼觀察能够完全抑制Alamar藍變色的最小藥物濃度，或通過熒光計測量能够抑制超過90%還原型Alamar藍生成的最小藥物濃度。化合物檢測結果列於表六。表六體外篩選結果。註：ATCC：美國型培養菌種集；MABA：微孔板阿爾瑪藍顯色測試；LORA：厭氧條件下恢復測試；Vero Cell：非洲綠猴腎細胞；IC50：半數抑制濃度；Hela：人宮頸癌細胞；CC50：半數細胞毒性濃度。

結果分析：化合物Ⅰ-2對耻垢分枝杆菌具有很好的抑制活性，化合物Ⅰ-2無論在有氧（MABA）還是厭氧（LORA）條件下對結核分支杆菌的抑制活性都優於或者等同於已上市的抗結核藥物貝達喹啉。並且，化合物Ⅰ-2對Vero和Hela細胞都沒有明顯的細胞毒性。

第三部分：化合物對耐藥結核分枝杆菌體外藥效評估。

我們利用第二部分提到的相同方法，選用藥敏和耐藥結核分枝杆菌菌株對化合物Ⅰ-2進行了活性測試，結果顯示在表七中。表七部分測試化合物對藥敏和耐藥結核分枝杆菌活性MIC（uM）註：MIC：最小抑制濃度；MABA：微孔板阿爾瑪藍顯色測試；vs：對，相對；H37Rv：野生型H37Rv菌株；rRMP：對利福平耐藥的結核分枝杆菌菌株；rINH：對異煙肼抗藥的結核分枝杆菌菌株。

結果分析：化合物Ⅰ-2不僅對野生型結核分枝杆菌H37Rv有較好的抑制作用，對耐利福平和耐異煙肼的菌株也表現出了較好的抑制作用，其中化合物Ⅰ-2對所測三種菌株的抑制活性都與已上市的抗結核藥物貝達喹啉相當。

圖1爲化合物Ⅰ-1的Ⅰ晶型Cu-Kα輻射的XRPD譜圖；圖2爲化合物Ⅰ-1的Ⅰ晶型的DSC譜圖；圖3爲化合物Ⅰ-1的Ⅰ晶型的TGA圖譜；圖4爲化合物Ⅰ-1的Ⅱ晶型Cu-Kα輻射的XRPD譜圖；圖5爲化合物Ⅰ-1的Ⅱ晶型的DSC譜圖；圖6爲化合物Ⅰ-1的Ⅱ晶型的TGA圖譜；圖7爲化合物Ⅰ-1的Ⅲ晶型Cu-Kα輻射的XRPD譜圖；圖8爲化合物Ⅰ-1的Ⅲ晶型的DSC譜圖；以及圖9爲化合物Ⅰ-1的Ⅲ晶型的TGA圖譜。

Claims

式（Ⅰ）化合物的製備方法，其包含如下步驟：；其中， R¹ 選自任選被0、1、2或3個R⁰¹ 取代的6～12元芳基、6～12元雜芳基、6～12元芳基-亞烷基和6～12元雜芳基-亞烷基； HX選自有機或無機酸；鹼A選自鹼金屬鹼、鹼土金屬鹼或有機金屬鹼；化合物（Ⅱ）與鹼A的莫耳用量比爲 1: 1 ~5；化合物（Ⅱ）和化合物（Ⅲ）的莫耳用量比爲1: 1 ~2；反應溶劑選自單一醚類溶劑或幾種醚類溶劑的混合溶劑；反應溶劑用量爲化合物（Ⅳ）重量的3~20倍；反應溫度爲-80~0℃；反應時間爲1~24小時； R⁰¹ 選自F、Cl、Br、I、CN、OH、CH(CH₃ )₂ 、C(CH₃ )₃ 、N(CH₃ )₂ 、NH(CH₃ )、NH₂ 、CHO、COOH、C(=O)NH₂ 、S(=O)NH₂ 、S(=O)₂ NH₂ 、CF₃ 、CF₃ O、(NH₂ )CH₂ 、(HO)CH₂ 、CH₃ C(=O)、CH₃ OC(=O)、CH₃ S(=O)₂ 、CH₃ S(=O)；所述“雜”代表雜原子，選自N、O或S；以及雜原子的數目分別獨立地選自1、2或3。
如申請專利範圍第1項所述的製備方法，其中，R¹ 自選被0、1、2或3個R⁰¹ 取代的萘基或苯基；具體地，R¹ 選自、、或。
如申請專利範圍第1項所述製備方法，其中，所述鹼金屬鹼選自氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銫、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、碳酸氫鈉和/或碳酸氫鉀；以及有機金屬鹼選自正丁基鋰、二異丙基氨基鋰、2,2,6,6-四甲基呱啶鋰、二(三甲基矽)氨基鋰、甲醇鈉、三級丁醇鋰、三級丁醇鈉、三級丁醇鉀、乙醇鈉和/或異丙醇鋁。
如申請專利範圍第1項所述製備方法，其中，化合物（II）與鹼A的莫耳用量比爲1: 1.2~2；反應溫度爲-80~-60℃；反應時間爲2~12小時；具體地，反應時間爲4~8小時；反應溶劑選自四氫呋喃、乙醚和/或異丙醚；以及所述反應溶劑用量爲化合物（Ⅳ）重量的5~10倍。
如申請專利範圍第1~4項中任一項所述的製備方法，其包含如下反應步驟：；；；或；其中，鹼B選自氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銫、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、甲醇鈉、三級丁醇鋰、三級丁醇鈉、三級丁醇鉀、乙醇鈉或異丙醇鋁；手性酸選自α-羥基丙酸、α-羥基丁二酸、α、β-二羥基丁二酸、α-羥基苯乙酸、β-羥基酸、化合物（Ⅵ）；， n爲0、1或2； R² 、R⁴ 分別獨立地選自H、F、Cl、Br、I，或選自任選被0、1、2或3個R⁰¹ 取代的：C_1-8 烷氧基、C_1-8 烷基、Si(Ph)₃ 、6～12 元芳基； R³ 、R⁵ 分別獨立地選自H、F、Cl、Br、I、NO₂ 、OH，或選自任選被0、1、2或3個R⁰¹ 取代的：C_1-8 烷氧基、C_1-8 烷基、6～12元芳基；任選地，位置13和位置14取代的R³ 或在位置14和位置15取代的R³ 可連接在一起，形成一個6～12 元芳基環；任選地，位置8和位置9取代的R⁵ 或在位置9和位置10取代的R⁵ 可連接在一起，形成一個6～12 元芳基環；具體地， R³ 、R⁵ 分別獨立地選自H； R² 取代在2位； R⁴ 取代在6位； R² 、R⁴ 分別獨立地選自：H、Si(Ph)₃ 、、、；由化合物（Ⅳ）製備化合物（Ⅴ）的溶劑選自：丙酮、甲基乙基酮、乙醇、甲醇、異丙醇、三級丁醇、乙酸乙酯、乙酸三級丁酯、DMF、DMSO，DMA和/或NMP，中的一種單一溶劑或幾種溶劑的混合溶劑；手性酸與化合物（Ⅳ）的莫耳比爲0.5~1.5；具體地，手性酸與化合物（Ⅳ）的莫耳比爲0.8~1.2；更具體地，手性酸與化合物（Ⅳ）的莫耳比爲1.0；以及 HX選自鹽酸、硫酸、磷酸、草酸、檸檬酸、馬來酸或富馬酸。
如申請專利範圍第5項所述的製備方法，其中，化合物（Ⅵ）選自、、、、、、、、、。
作爲製備式（Ⅰ）化合物中間體的下式化合物：。
下式所示化合物Ⅰ-1：。
化合物Ⅰ-1的Ⅰ晶型、Ⅱ晶型和Ⅲ晶型，其XRPD圖譜分別如圖1、圖4和圖7所示。
如申請專利範圍第9項所述Ⅰ晶型的製備方法，包含將任意一種形式的化合物I-1加入到溶劑中結晶製得，其中，溶劑選自醇類、酮類溶劑或者醇類溶劑與酮類溶劑的混合溶劑；以及溶劑用量爲化合物Ⅰ-1重量的3~50倍；具體地，所述醇類溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇和/或正丁醇；所述酮類溶劑選自丙酮和/或甲基乙基酮；所述混合溶劑爲甲醇與丙酮的混合溶劑；或所述甲醇與丙酮的混合溶劑的體積比爲1:5~30。