TW201718631A - Ａｍｌ抗原及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包括AML細胞之抗原的新穎化合物以及其用途。

Description

AML抗原及其用途
本發明關於生物學、免疫學及醫藥之領域。
急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)為高風險惡性腫瘤，其在低於60歲的患者中具有40%至50%的五年存活率。對於高於65歲的患者，結果甚至更糟，僅低於20%的患者可獲得持久的緩解(remission)。異基因(allogeneic)幹細胞移植頻繁地應用於急性白血病的治療。其起初是設計用於搶救患者免於其他致命性清髓(myeloablative)化療，但隨後由於異體反應性(alloreactive)免疫反應相關併發症(移植物對抗宿主疾病(graft versus host disease)；GvHD)而複雜化。於再輸液(reinfusion)前移植物的T細胞缺乏避免GvHD，但觀察T細胞缺乏的移植物接受者，相似於同卵雙胞胎捐贈者的移植接受者，經歷較高的復發機率，此使得異基因幹細胞移植(SCT)的成功取決於抗白血病免疫反應(移植物抗白血病(graft versus leukemia,GvL))的誘發之論點逐漸清楚。此已導致應用不需清髓性預處理(myeloablative conditioning)(減低強度的幹細胞移植(RIST))之異基因幹細胞移植於降低細胞毒性以及使得異基因SCT可於更多的患者群中應用之策略發展，所述患者群包含年紀較大的患者及經多次治療的患者。 RIST中的預處理方案是以大量消滅接受者的適應性免疫系統以防止移植物排斥為目的，而不用完全移除接受者的骨髓，從而降低早期SCT毒性。在移植後，捐贈者幹細胞逐漸取代接受者的幹細胞，且完全的捐贈者嵌合現象(chimerism)通常在SCT後的三個月內達成。雖然異基因SCT對大多數患者為有療效的且在SCT接受者的支持性照護上已有長足的進步，但仍然有15-30%的患者死於移植相關的併發症，如GvHD及感染性併發症(起因於SCT後緩慢的免疫恢復或GvHD的免疫抑制療法的併發症)。因此，雖然當強烈的移植物抗白血病(GvL)反應被誘發時SCT可能為有療效的，但它的療癒效果受限於造成GvHD的抗宿主免疫反應，其導致高發病率及死亡率。考慮到異基因幹細胞移植後高發生率的GvHD，其造成15-30%的患者死亡，以及對於特定患者而言並非總是有合適的捐贈者的事實，替代性的治療方式將為有助益的。國際專利申請PCT/NL2014/050873提供源自患者、AML特異性(AML-specific)的人類抗體，其可結合完整的AML細胞。重要的是，所述抗體源自曾接受異基因移植且已完全緩解的人類AML患者，顯示所述抗體對於AML為有效的。使用如PCT/NL2014/0508732的AML療法中所揭示之抗體因而為較佳的。
代替利用抗體的被動免疫，免疫療法亦為具吸引力的方式。利用免疫療法，患有疾病的患者被供予疾病特異性抗原，其於所述患者中誘發及/或提升對抗該疾病的免疫反應。預防性或半預防性的使用，其中一個體在疾病開始或(進一步)發展之前被供予疾病特異性抗原以引發免疫反應，亦為 具有吸引力的。例如，利用AML特異性目標分子的免疫作用以引發對抗AML的免疫反應，對曾接受異基因造血幹細胞移植的患者將特別具有吸引力。利用此種目標免疫對於另一群罹患中高風險骨髓造血不良症候群(myelodysplastic syndrome,MDS))的患者亦具有吸引力。這類患者具有中高風險發展為AML，因此預先引發抗AML免疫反應為有益的。MDS患者發展為AML的風險通常是根據國際癒後評分系統(IPSS；例如，請參照Malcovati等人，2013)加以確立。中高風險MDS患者的非限定例子為MDS-RAEB-1及MDS-RAEB-2患者。
特異性地針對AML的免疫療法及疫苗目前尚無法取得，因為缺少合適的AML特異性抗原。
AML特異性抗原亦特別適合用於測定患者的樣本是否包含可特異性地結合AML細胞的抗體及/或免疫細胞。這類資訊，例如，對於AML的診斷或監控AML療法是相當有價值的。
本案之目的為提供包括AML細胞的抗原之新穎胜肽及化合物。較佳地，提供之胜肽及化合物能夠偵測及/或引發免疫反應，較佳地為特異性免疫反應、針對骨髓增生疾病，更佳地為針對AML。
本發明提供一經分離、重組或純化的CD43胜肽，其具有至多100個胺基酸殘基之長度，其中該胜肽包括一胺基酸序列，該胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多51個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置 133及184之間的序列相同。該胜肽較佳地包括一胺基酸序列，該胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多51個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及183之間的序列相同。在一些實施例中，該胺基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基、或至少20個胺基酸殘基、或至少25個胺基酸殘基、或至少30個胺基酸殘基、或至少35個胺基酸殘基、或至少40個胺基酸殘基、或至少45個胺基酸殘基、或至少50個胺基酸殘基、或51個胺基酸殘基。
一些實施例提供一經分離、重組或純化的CD43胜肽，其具有至多100個胺基酸殘基之長度，其中該胜肽包括一胺基酸序列，該胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多33個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及165之間的序列相同。在一些實施例中，該胺基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基、或至少20個胺基酸殘基、或至少25個胺基酸殘基、或至少30個胺基酸殘基、或33個胺基酸殘基。
一些實施例提供一經分離、重組或純化的CD43胜肽，其具有至多100個胺基酸殘基之長度，其中該胜肽包括一 胺基酸序列，該胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多15個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及147之間的序列相同。在一些實施例中，該胺基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或15個胺基酸殘基。
第1圖：AT14-013(2K23-1K13)的序列，包含可變重及輕鏈序列以及抗體的CDR序列。
第2圖：AT14-013對AML細胞系以及來自新確診的患者之新鮮分離的初級AML芽細胞(blast)的結合。FAB：AML的法國-美國-英國分類(French-American-British classification)(Bennett等人，1976)。
第3圖：AT14-013結合至AML細胞系及初級分離的AML細胞。源自患者101之AT14-013對於AML細胞系Kasumi3、SH-2、Molm13及THP-1的結合，以及對於自新確診的患者分離之初級白血病芽細胞的結合(FAB分類M0-M5)之代表性例子。對流行性感冒病毒有特異性的內部(in-house)產生的人類抗體被使用作為負對照組(negative control)(填充灰色的直方圖)。
第4圖：AT14-013亦結合至來自高風險骨髓造血不良症候群(MDS/RAEB I及II)以及芽細胞危象(blast crisis)慢性骨髓 性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)的患者之白血病芽細胞。繪示的為代表性例子；標示為患者辨識碼，除了K562，其為一CML細胞系。針對流行性感冒病毒的內部(in-house)產生的人類抗體被使用作為負對照組(填充灰色的直方圖)。
* BL-060：雙表型(biphenotypic)白血病，對AML治療反應良好。
第5圖：AT14-013未結合至非骨髓細胞。(a)AT14-013未結合至健康的PBMCs、T細胞(CD3+)、B細胞(CD19+)、非活化的單核球細胞(CD14+)或初級分離的胸腺細胞(除了存在於胎兒胸腺中的少部分骨髓細胞以外)。(b)AT14-013亦未結合初級分離的B-或T-ALL細胞、淋巴瘤或多發性骨髓瘤。(c)AT14-013亦未結合結腸癌細胞系或來自具有結腸癌(Colon CA)或健康的結腸或迴腸之患者的初級分離的細胞。
AT14-013確實結合至顆粒球(a)及人類黑色素瘤細胞系(c)。針對流行性感冒病毒的內部產生的人類抗體被使用作為負對照組(填充灰色的直方圖)。
第6圖：CDC及ADCC。蓋黃綠素(Calcein)標記的THP-1細胞與AT14-013及兔子血清補體一起培養。活細胞被鑑定為calcein+、dapi-細胞。以我們的珠粒基礎分析(bead based assay)，死細胞的量可接著被計算為補體依賴性細胞死亡(CDC)的量度。與CD33培養的THP1細胞未誘發CDC(左側)。AT14-013與作為標靶細胞的AML細胞系SH-2或新鮮分離的白血病芽細胞也能夠誘發抗體依賴性細胞毒性(antibody dependent cell cytotoxicity,ADCC)於Jurkat報導系統中(右 側)。
第7圖：AT14-013的標靶鑑定：免疫沉澱(immunoprecipitation,IP)。THP1細胞溶解物與生物素(biotin)標記的(藉由轉肽酶(sortase)標記)AT14-013之IP產生約140kDa的條帶於Imperial Coomassie染色的膠體上。所述條帶具有特異性因為其未見於THP1細胞溶解物的AT10-002 IP中或於Jurkat細胞溶解物的IP中。將條帶從膠體中切除且藉由質譜儀分析鑑定標靶為CD43。
第8圖：AT14-013的標靶確認。THP-1及Molm13細胞溶解物與AT14-013或流行性感冒病毒特異性抗體AT10-002免疫沉澱。以小鼠-抗-CD43(選殖株(clone)Mem59)進行的西方墨點分析確認CD43為AT14-013的結合標靶。
第9圖：AT14-013結合至獨特的CD43抗原決定基(epitope)。(a)將THP-1細胞與商業上可取得的CD43特異性抗體DF-T1、84-3C1、L10及Mem59以及AT14-013一起染色。所有抗體均結合至THP-1細胞的細胞膜。(b)相較於商業上可取得的CD43特異性抗體，AT14-013具有不同的結合輪廓圖(profile)。於Kim ea(Kim等人，2014)中，概述了商業上可取得的CD43抗體YG5、2C8、8E10及DFT-1對多種細胞系的結合。我們比較AT14-013對相同細胞系之結合，發現不同的結合模式。(c)如指示實行AT14-013及商業上可取得的CD43特異性抗體的競爭實驗。簡言之，THP-1細胞與濃度增加的指定抗體一起培養，其後添加可能競爭的抗體(稱為“競爭抗體”)。將細胞與商業上可取得的CD43抗體預先培養未影響 AT14-013對THP-1標靶細胞的結合，而這些商業上可取得的CD43抗體確實抑制彼此對THP-1細胞的結合。其中顯示AT14-013或84-3C1為“競爭抗體”的實驗結果。(d)競爭實驗的摘要。AT14-013未與商業上可取得的CD43抗體競爭結合至THP-1，代表AT14-013結合不同的抗原決定基。
第10圖：THP-1細胞的去糖基化，以神經胺酸酶(neuraminidase)(唾液酸酶)從細胞膜移除唾液酸。“No”表示未經神經胺酸酶處理，“1：20”及“1：200”表示神經胺酸酶的稀釋。於這些細胞的神經胺酸酶處理後，抗體AT14-013、Mem 59、DF-T1及84-3C1喪失對THP-1細胞的結合。選殖株L10未結合至CD43的唾液酸化抗原決定基，同時THP-1細胞的神經胺酸酶處理並未影響此抗體對其標靶細胞的結合。
第11圖：CD43截短(truncated)變異體定位商業上可取得的抗體DF-T1及MEM59的抗原決定基。a)表達CD43的截短變異體之HEK293T細胞的免疫墨點分析(immunoblot)，以針對蛋白質的細胞內C端尾部之抗CD43探測(probe)。b)以CD43特異性抗體MEM59(上方)及DF-T1(下方)免疫染色相同墨點，揭示它們的抗原決定基存在於區域‘C’(胺基酸59-82)。
第12圖：從THP1細胞免疫沉澱的CD43截短變異體鑑定出AT14-013抗原決定基。a)過度表達分選的CD43截短變異體的THP1細胞之輸入細胞溶解物之免疫墨點分析，以抗Flag抗體探測。PonseauS染色證實樣品的等量裝載。所有突變蛋白質均表達。b)THP1變異細胞系的洗提免疫沉澱與AT14-013之抗Flag免疫墨點分析揭示結合至突變體A-F且未結合至突 變體H-J，定義了抗原決定基。c)以抗CD43細胞質尾部結合抗體(Novus)的免疫墨點分析，顯示內生性(endogenous)免疫沉澱CD43在所有樣品以及截短變異體的染色中。
第13圖：CD43的胺基酸序列(genbank CCDS10650.1)。顯示訊號胜肽、AT14-013抗原決定基、跨膜結構域及細胞內及外結構域。
第14圖：AT14-013對其他AML芽細胞的結合。AT14-013對來自新確診的患者之新鮮分離的初級AML芽細胞(CD45dim)的結合。對流行性感冒病毒有特異性的內部產生的人類抗體被使用作為負對照組。對於商業用的小鼠抗CD43抗體，小鼠抗CMV被使用作為對照組。
WHO：Swerdlow S.H.造血及淋巴組織的腫瘤的WHO分類(2008)。CD43+ T細胞及扁桃腺細胞被使用作為分析用的額外的對照組。AT14-013為結合至這些健康的細胞。
(%閘控(gated)=-；<10%,+；10~25%,++；25~50%,+++；50~75%,++++；75~100%)。
第15圖：ADCC及CDC。a)AT14-013(空心正方形)能夠誘發抗體依賴性細胞調節細胞毒性(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)於50：1的效應物標靶比例的AML細胞系SH-2與PBMC中。活細胞被鑑定為calcein+、dapi-細胞。以我們的珠粒基礎分析(bead based assay)，死細胞的量可接著被計算。與AT10-002培養的SH2細胞未誘發ADCC(黑點)。AT14-013之計算的EC50為0,16ug/ml。蓋黃綠素(Calcein)標記的SH-2細胞(b)與AT14-013(空心正方形)或AT10-002 (黑點)及兔子血清補體一起培養。活細胞被鑑定為calcein+、dapi-細胞。與AT10-002培養的SH2細胞或AML芽細胞未誘發CDC(黑點)。AT14-013之計算的EC50為1,86ug/ml。
第16圖：a)THP1變異細胞系的洗提免疫沉澱與AT14-013之抗Flag免疫墨點分析揭示結合至突變體A-F2、較少結合至G且未結合至突變體H-J。b)以抗CD43細胞質尾部結合抗體(Novus)的免疫墨點分析，顯示內生性(endogenous)免疫沉澱CD43在所有樣品以及截短變異體的染色中。此對照組確定在所有顯示的樣品中免疫沉澱為成功的。
第17圖：a)植入SH-2 AML細胞於小鼠的處理產生90.3%的腫瘤生長抑制，犧牲時藉由全身測量所測得(p<0.001，重複單因子變異數分析(ANOVA))。b)AML細胞的數量，藉由每分鐘的光子量(cpm)進行測量，在所有測量的器官中均顯示大幅減少(p=0.0011，重複二因子變異數分析(2way ANOVA))。c)藉由FACS於骨髓及肝評估腫瘤細胞的數量(p=0.0017，二因子變異數分析)。
第18圖：AT14-013結合至胎兒CD34+造血幹細胞(HSC)但未結合至胎兒CD34+CD38+先驅細胞或胎兒CD34-CD38-成熟細胞之代表性例子。填充灰色的直方圖：針對流行性感冒病毒的對照抗體(control antibody)AT10-002，如WO 2013/081463中所述)。
第19圖：AT14-013與自體(autologous)白血病幹細胞反應。捐贈者#101的AML芽細胞(與取得產生AT14-013的B細胞之捐贈者相同)與AT14-013及與對CD34及CD38具特異性 的抗體、以及與針對CD45的抗體(BD，cat 348815)一起被染色以辨別骨髓中的整體芽細胞族群(CD45 dim)及健康的細胞，並藉由流式細胞儀分析。
本案發明人出人意外地發現針對AML的特異性免疫反應可利用本發明之CD43胜肽加以偵測及/或引發。此發現是令人意外的，因為CD43存在於大多數種類(非惡性)的白血球的表面上，也存在許多非造血腫瘤細胞上，例如人類結腸癌細胞、人類子宮頸癌細胞、人類肺癌細胞及人類乳腺癌細胞等。有鑑於CD43的此種大量存在，在本發明之前，不認為CD43為用以提供AML特異性之合適化合物。然而，如實施例所示，AML特異性抗體AT14-013結合本發明之CD43胜肽。此外，抗體AT14-013結合至多種不同的CD43+ AML細胞(第2及3圖)，但未結合至CD43+ PBMC、活化及非活化T細胞、B細胞、非活化單核球細胞、胸腺細胞、ALL細胞、結腸癌細胞、非惡性結腸細胞、Jurkat細胞、Ramos細胞或正常骨髓細胞(如第5圖所示)。因此，抗體AT14-013，其特異性地針對如申請專利範圍所定義之CD43胜肽，結合CD43+ AML細胞，卻未結合多種其他種類的CD43+細胞。有趣地，抗體AT14-013未結合其他種類的非AML、CD43+造血幹細胞或淋巴系的較成熟細胞。實施例亦顯示抗體AT14-013能夠結合CD43的癌胎(oncofetal)抗原決定基、抗體AT14-013能夠結合自體白血病幹細胞、以及抗體AT14-013能夠對抗AML體內(in vivo)成長。本發明從而提供AML細胞的CD43抗原。
CD43，其亦被稱為白唾液酸蛋白(leukosialin)、載唾液酸蛋白(sialophorin)、半乳糖醣蛋白(galactoglycoprotein)、白血球唾液酸醣蛋白或gp115，為糖基化類黏蛋白(mucin-like)型I跨膜蛋白，其存在於大多造血細胞的表面上，除了紅血球細胞以外。CD43，由一外顯子(exon)編碼，扮演細胞-細胞交互作用的角色。它具有235個胺基酸的高度糖基化(glycosylated)的細胞外區域。已有兩種CD43糖型(glycoform)被描述，其中一糖型主要包含四碳糖類，而另一糖型具有主要分支的六碳糖類。兩種糖型都可被表達於一細胞的表面上。CD43例如為Shelley等人(1989)及Schmid等人(1992)中所述。人類CD43的序列，如第13圖所示，存在於Genbank CCDS資料庫之登錄號CCDS10650.1。
如本文中所使用，用詞“本發明之CD43胜肽”是指具有至多100個胺基酸殘基的長度的胺基酸鏈，其中所述胺基酸鏈包括一序列，具有至少3個胺基酸殘基及至多51個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及184之間的序列相同，或其中所述胺基酸鏈包括一序列，具有至少3個胺基酸殘基及至多51個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及183之間的序列相同，或其中所述胺基酸鏈包括一序列，具有至少3個胺基酸殘基及至多33個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及165之間的序列相同，或其中所述胺基酸鏈包括一序列，具有至少3個胺基酸殘基及至多15個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖 所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及147之間的序列相同。
如實施例中的詳細解釋，本發明提供人類CD43蛋白的位置133及184之間的胺基酸序列包括特異性地被抗體AT14-013結合之AML抗原決定基的見解。所述AML抗原決定基包括一或多個胺基酸殘基，其存在於如第13圖所示之胺基酸序列位置133及165之間。所述AML抗原決定基，其存在於不同AML細胞系及AML芽細胞上且其未存在或暴露於許多其他CD43+細胞上，因而特別地適合用於引發或偵測AML特異性免疫反應。在一些實施例中，發明之CD43胜肽包括胺基酸序列GTITTNSPETSSRTS。在一些實施例中，發明之CD43胜肽包括胺基酸序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTS。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽包括胺基酸序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTSGPPLTMATVSLETSKGTSG。
在一些實施例中，本發明之CD43胜肽具有至多90個胺基酸殘基的長度。在一些實施例中，本發明之CD43胜肽具有至多85個胺基酸殘基、或至多75個胺基酸殘基、或至多70個胺基酸殘基的長度。在一些實施例中，本發明之CD43胜肽具有至多65個胺基酸殘基、或至多60個胺基酸殘基、或至多55個胺基酸殘基、或至多50個胺基酸殘基、或至多45個胺基酸殘基、或至多40個胺基酸殘基、或至多35個胺基酸殘基的長度。在一些實施例中，本發明所述之CD43胜肽具有至多52個胺基酸殘基、或至多51個胺基酸殘基、或至多33 個胺基酸殘基、或至多30個胺基酸殘基、或至多25個胺基酸殘基、或至多20個胺基酸殘基、或至多15個胺基酸殘基的長度。在一些實施例中，本發明之CD43胜肽具有至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基的長度。
在一些實施例中，本發明所述之CD43胜肽具有至少52個胺基酸殘基或至少51個胺基酸殘基的長度，其中所述胜肽包括一胺基酸序列，其與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及184之間的序列相同。在一些實施例中，本發明所述之CD43胜肽具有至少51個胺基酸殘基的長度，其中所述胺基酸殘基與如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及183之間的胺基酸相同。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽具有至少33個胺基酸殘基的長度且包括一胺基酸序列，其與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及165之間的序列相同。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽具有至少15個胺基酸殘基的長度且包括一胺基酸序列，其與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及147之間的序列相同。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽由序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTSGPPLTMATVSL ETSK GTSG所組成。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽由序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTS所組成。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽由序列GTITTNSPETSSRTS所組成。
如本文中所使用，措辭“位在如第13圖所示之胺基酸位置X及Y之間的序列”、“位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置X及Y之間的序列”、“其中所述胺基酸殘基與如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置X及Y之間的胺基酸相同”以及“一胺基酸序列，其與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置X及Y之間的序列相同”涵蓋位在列舉的位置之間且包含位置X及/或Y的胺基酸之序列。此外，該用詞包含位在列舉的位置之間且不含位置X及/或Y的胺基酸之序列。換言之，在一些實施例中，列舉的位置X及/或Y的胺基酸存在於本發明的CD43胜肽中，而在其他一些實施例中，列舉的位置X及/或Y的胺基酸不存在。
除了位在與如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及184之間的序列、或在胺基酸位置133及183之間的序列、或在胺基酸位置133及165之間的序列、或在胺基酸位置133及147之間的序列相同之列舉的胺基酸序列以外，本發明之CD43胜肽可進一步包括其他胺基酸殘基。在一些實施例中，所述其他胺基酸殘基不是衍生自CD43序列。所述其他胺基酸殘基，於本文中亦稱作“非CD43胺基酸殘基”，例如可作用以增強穩定性、及/或增強免疫源性(immunogenicity)、 及/或連接(couple)CD43胜肽至另一部分(moiety)，例如分子支架(scaffold)或載體。此類支架或載體的非限定例子為鑰孔帽貝血藍素(keyhole limpet hemocyanin)及CLIPS支架(例如，二(溴甲基)苯、三(溴甲基)苯及四(溴甲基)苯，如WO 2004/077062中所述)。一些實施例從而提供一分離、重組或純化的胜肽，其具有至多100個胺基酸殘基之長度，其中所述胜肽包括一胺基酸序列，所述胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多52個胺基酸殘基或至多51個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及184之間的序列相同，且其中所述胜肽亦包括至少1個、或至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少10個、或至少20個、或至少30個、或至少40個、或至少50個、或至少60個、或至少70個、或至少80個非CD43胺基酸殘基，其中所述非CD43胺基酸殘基的全長序列未存在於如第13圖所示之人類CD43中。
一些實施例提供一分離、重組或純化的胜肽，其具有至多100個胺基酸殘基之長度，其中所述胜肽包括一胺基酸序列，所述胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多51個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及183之間的序列相同，且其中所述胜肽亦包括至少1個、或至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少10個、或至少20個、或至少30個、或至少40個、或至少50個、或至少60個、或至少70個、或至少80個非CD43胺基酸殘基，其中所述非CD43胺基酸殘基的全長序列未存在於如第13圖所示之人類CD43中。在一些實施例中，所述胺 基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基、或至少20個胺基酸殘基、或至少25個胺基酸殘基、或至少30個胺基酸殘基、或至少35個胺基酸殘基、或至少40個胺基酸殘基、或至少45個胺基酸殘基、或至少50個胺基酸殘基、或至少51個胺基酸殘基。
一些實施例提供一分離、重組或純化的胜肽，其具有至多100個胺基酸殘基之長度，其中所述胜肽包括一胺基酸序列，所述胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多33個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及165之間的序列相同，且其中所述胜肽亦包括至少1個、或至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少10個、或至少20個、或至少30個、或至少40個、或至少50個、或至少60個、或至少70個、或至少80個非CD43胺基酸殘基，其中所述非CD43胺基酸殘基的全長序列未存在於如第13圖所示之人類CD43中。在一些實施例中，所述胺基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基、或至少20個胺基酸殘基、或至少25個胺基酸殘基、或至少30個胺基酸殘基、或至少33個胺基酸殘基。
一些實施例提供一分離、重組或純化的胜肽，其具有至多100個胺基酸殘基之長度，其中所述胜肽包括一胺基酸序列，所述胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多15個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及147之間的序列相同，且其中所述胜肽亦包括至少1個、或至少2個、或至少3個、或至少4個、或至少5個、或至少10個、或至少20個、或至少30個、或至少40個、或至少50個、或至少60個、或至少70個、或至少80個非CD43胺基酸殘基，其中所述非CD43胺基酸殘基的全長序列未存在於如第13圖所示之人類CD43中。在一些實施例中，所述胺基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基。
上述胜肽亦包含於用詞“本發明之CD43胜肽”中。
一些實施例提供一化合物，包括本發明之CD43胜肽。一些實施例提供一免疫化合物，包括本發明之CD43胜肽。在一些實施例中，所述CD43胜肽連接至醫藥上可接受之載體或支架。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽為截短的(truncated)CD43分子，其具有至多100個胺基酸殘基的長度。較佳地，所述截短的CD43分子缺少野生型(wild type)人類CD43的胞內區域。在較佳的實施例中，所述截短的CD43分子缺少野生型人類CD43的胞內區域以及跨膜區域兩者。在更 佳的實施例中，本發明所述之CD43胜肽為截短的CD43胞外區域，其具有至多90個胺基酸殘基、或至多80個胺基酸殘基、或至多70個胺基酸殘基、或至多60個胺基酸殘基、或至多52個胺基酸殘基、或至多51個胺基酸殘基、或至多50個胺基酸殘基、或至多45個胺基酸殘基、或至多40個胺基酸殘基、或至多35個胺基酸殘基、或至多33個胺基酸殘基、或至多30個胺基酸殘基、或至多25個胺基酸殘基、或至多20個胺基酸殘基的長度，所述截短的CD43胞外區域包括一胺基酸序列，其具有至少3個胺基酸殘基及至多52個胺基酸殘基或至多51個胺基酸殘基的長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及184之間的序列相同。在一些實施例中，所述胺基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基、或至少20個胺基酸殘基、或至少25個胺基酸殘基、或至少30個胺基酸殘基、或至少35個胺基酸殘基、或至少40個胺基酸殘基、或至少45個胺基酸殘基、或至少50個胺基酸殘基、或至少51個胺基酸殘基。
在一些實施例中，發明所述之CD43胜肽為截短的CD43胞外區域，其具有至多90個胺基酸殘基、或至多80個胺基酸殘基、或至多70個胺基酸殘基、或至多60個胺基酸殘基、或至多51個胺基酸殘基、或至多50個胺基酸殘基、或至多45個胺基酸殘基、或至多40個胺基酸殘基、或至多35個胺基酸殘基、或至多33個胺基酸殘基、或至多30個胺基酸殘 基、或至多25個胺基酸殘基、或至多20個胺基酸殘基的長度，所述截短的CD43胞外區域包括一胺基酸序列，其具有至少3個胺基酸殘基及至多51個胺基酸殘基的長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及183之間的序列相同。在一些實施例中，所述胺基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基、或至少20個胺基酸殘基、或至少25個胺基酸殘基、或至少30個胺基酸殘基、或至少35個胺基酸殘基、或至少40個胺基酸殘基、或至少45個胺基酸殘基、或至少50個胺基酸殘基、或至少51個胺基酸殘基。
在一些實施例中，發明所述之CD43胜肽為截短的CD43胞外區域，其具有至多90個胺基酸殘基、或至多80個胺基酸殘基、或至多70個胺基酸殘基、或至多60個胺基酸殘基、或至多51個胺基酸殘基、或至多50個胺基酸殘基、或至多45個胺基酸殘基、或至多40個胺基酸殘基、或至多35個胺基酸殘基、或至多33個胺基酸殘基、或至多30個胺基酸殘基、或至多25個胺基酸殘基、或至多20個胺基酸殘基的長度，所述截短的CD43胞外區域包括一胺基酸序列，其具有至少3個胺基酸殘基及至多33個胺基酸殘基的長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及165之間的序列相同。在一些實施例中，所述胺基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個 胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基、或至少20個胺基酸殘基、或至少25個胺基酸殘基、或至少30個胺基酸殘基、或至少33個胺基酸殘基。
在一些實施例中，發明所述之CD43胜肽為截短的CD43胞外區域，其具有至多90個胺基酸殘基、或至多80個胺基酸殘基、或至多70個胺基酸殘基、或至多60個胺基酸殘基、或至多51個胺基酸殘基、或至多50個胺基酸殘基、或至多45個胺基酸殘基、或至多40個胺基酸殘基、或至多35個胺基酸殘基、或至多33個胺基酸殘基、或至多30個胺基酸殘基、或至多25個胺基酸殘基、或至多20個胺基酸殘基的長度，所述截短的CD43胞外區域包括一胺基酸序列，其具有至少3個胺基酸殘基及至多15個胺基酸殘基的長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及147之間的序列相同。在一些實施例中，所述胺基酸序列的長度為至少5個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基。
一些實施例提供一根據發明之CD43胜肽，其為截短的CD43胞外區域，具有至多90個胺基酸殘基、或至多80個胺基酸殘基、或至多70個胺基酸殘基、或至多60個胺基酸殘基、或至多52個胺基酸殘基、或至多51個胺基酸殘基、或至多50個胺基酸殘基、或至多45個胺基酸殘基、或至多40個胺基酸殘基、或至多35個胺基酸殘基、或至多33個胺基酸 殘基、或至多30個胺基酸殘基、或至多25個胺基酸殘基、或至多20個胺基酸殘基、或至多15個胺基酸殘基的長度。
如同技術人員已知的，一旦免疫序列已經提供，在一定程度上改變序列變得可能，因而較佳地可最適化產生的免疫原之免疫源性及/或穩定性。此例如可藉由突變誘發步驟進行，其中產生的化合物之穩定性及/或免疫源性較佳地經測試之後，選擇改善之AML特異性抗原化合物。技術人員充分地能夠由特定的胺基酸序列起始，產生抗原變異體。例如，應用保守胺基酸取代。保守胺基酸的例子包含取代一疏水性殘基，如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸，成另一疏水性殘基，以及取代一極性殘基成另一極性殘基，如取代精胺酸成賴胺酸、取代麩胺酸成天冬胺酸、或取代麩胺醯胺酸成天冬醯胺酸。在一些實施例中，實行取代淨分析(replacement net analysis)，其涉及一或多個胺基酸殘基被任一其他胺基酸殘基取代，並測試產生的化合物。
一些實施例因此提供一經分離、重組或純化的CD43胜肽，具有至多100個胺基酸殘基之長度，其包括或大致上由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多52個胺基酸殘基或51個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及184之間的序列具有至少80%、較佳至少85%、較佳至少90%、較佳至少95%、較佳至少96%、較佳至少97%、較佳至少98%、較佳至少99%的序列相同性。一些實施例提供一經分離、重組或純化的CD43胜肽，其包括一胺基酸序列，具有51個胺基酸殘基 的長度，所述胺基酸序列與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及183之間的序列具有至少80%、較佳至少85%、較佳至少90%、較佳至少95%、較佳至少96%、較佳至少97%、較佳至少98%、較佳至少99%的序列相同性。
一些實施例提供一經分離、重組或純化的CD43胜肽，具有至多100個胺基酸殘基之長度，其包括或大致上由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列具有33個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及165之間的序列具有至少80%、較佳至少85%、較佳至少90%、較佳至少95%、較佳至少96%、較佳至少97%、較佳至少98%、較佳至少99%的序列相同性。
一些實施例提供一經分離、重組或純化的CD43胜肽，具有至多100個胺基酸殘基之長度，其包括或大致上由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列具有15個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之人類CD43蛋白的胺基酸位置133及147之間的序列具有至少80%、較佳至少85%、較佳至少90%、較佳至少95%、較佳至少96%、較佳至少97%、較佳至少98%、較佳至少99%的序列相同性。
用詞“%序列相同性”於本文中定義為在校準(align)候選胺基酸序列及參考序列兩種序列及在必要時引入缺口(gap)以達到最大的百分比相同性之後，候選胺基酸序列中與參考序列中的殘基相同之殘基的百分比。用於校準的方法及電腦程式已為所屬技術領域所熟知。用於測定候選序列是否落入此定義的一種可用或適宜的電腦程式為“Align 2”，由Genentech, Inc.編寫，其已於1991年12月10日隨用戶文件提交美國版權辦公室，Washington D.C.,20559。
本文所定義之經分離、重組或純化的CD43胜肽亦稱為“發明之CD43胜肽”或“發明之CD43抗原”。在一些實施例中，發明之CD43胜肽的胺基酸殘基是選自於天然存在於真核細胞中的20種胺基酸殘基，其亦稱作為“標準”或“典範”胺基酸。可選地，發明之CD43胜肽包含非天然的胺基酸殘基，例如D-胺基酸(即，胺基酸的D-立體異構物)或N-甲基胺基酸。
發明之CD43胜肽較佳為糖基化的。此類胜肽較準確地反映於體內天然的AML抗原，由於天然的CD43蛋白於細胞表面上為高度糖基化的。在一些較佳的實施例中，本案所述之CD43胜肽包括唾液酸殘基(亦稱作α-N-乙醯基神經胺酸(α-N-acetylneuraminic acid))。於體內，人類CD43為高度唾液酸化的。神經胺酸酶的處理切割來自CD43糖蛋白之唾液酸殘基。在一些實施例中，因此，發明之CD43胜肽為神經胺酸酶敏感的(neuramidase-sensitive)。一些實施例提供本發明之CD43胜肽，其是經癌-唾液酸化的(onco-sialylated)，代表所述CD43胜肽具有腫瘤特異性唾液酸化形式。如本文中所使用，具有“腫瘤特異性唾液酸化形式”之發明的CD43胜肽涵蓋具有腫瘤細胞產生之唾液酸化形式之發明的CD43胜肽、或具有與腫瘤細胞產生之唾液酸化形式相同、或至少90%、或至少95%、或至少97%相似之唾液酸化形式之發明的CD43胜肽。
一些實施例提供本發明之CD43胜肽，其由AML細胞生產。一些實施例提供本發明之CD43胜肽，其是由衍生 自AML細胞的細胞系之細胞所產生。此類CD43胜肽將具有一糖基化形式，其非常相似於AML患者體內AML細胞的糖基化形式。在一些實施例中，發明所述之CD43胜肽由THP-1細胞所產生。在一些實施例中，發明所述之CD43胜肽由Kasumi 3細胞、或由HL60細胞、或由KG1a細胞、或由SH2細胞、或由MonoMac6細胞、或由Molm13細胞、或由CML K562細胞所產生。
如本文中所使用，發明之CD43胜肽具有之糖基化形式，其相似或相同於表達所述CD43胜肽於AML細胞中(如於AML芽細胞或AML細胞系中)所產生之醣基化形式，發明之CD43胜肽被稱為具有AML特異性糖基化形式。一些實施例因而提供本發明之CD43胜肽，其具有AML特異性糖基化形式。
一些實施例提供本發明之CD43胜肽，其由MDS細胞所產生。一些實施例提供本發明之CD43胜肽，其由衍生自MDS細胞的細胞系之細胞所產生。此類CD43胜肽將具有一糖基化形式，其非常相似於MDS患者體內MDS細胞的糖基化形式。
一些實施例提供發明之CD43胜肽，其具有MDS特異性糖基化形式。這些胜肽具有一糖基化形式，其相似或相同於表達發明之CD43胜肽於MDS細胞中(如於MDS芽細胞或MDS細胞系中)所產生之醣基化形式。
在另一些實施例中，提供本發明之CD43胜肽，其由宿主細胞、利用體內糖工程(glycoengineering)(例如根據Roche Diagnostics GmbH)所產生。根據這些實施例，提供宿主 細胞具有酵素α-2,6-唾液酸轉移酶及/或α-2,3-唾液酸轉移酶，使得發明之CD43胜肽生產後，胜肽將被唾液酸化。因此本發明更進一步提供一CD43胜肽，其由包含α-2,6-唾液酸轉移酶及/或α-2,3-唾液酸轉移酶的細胞所產生。在一些實施例中，所述α-2,6-唾液酸轉移酶及/或α-2,3-唾液酸轉移酶包括外生性(exogenous)α-2,6-唾液酸轉移酶及/或α-2,3-唾液酸轉移酶，表示所述酵素已經重組地導入宿主細胞中(或至當前宿主細胞起源之親本宿主細胞中)。一些實施例提供本發明之CD43胜肽，其由包含編碼為α-2,6-唾液酸轉移酶及/或α-2,3-唾液酸轉移酶之外生性核酸序列的宿主細胞所產生。
抗CD43抗體已知於所屬技術領域。然而，這些抗體辨識不同的抗原決定基為清楚的。例如，如Kim等人(2014)的表1所示，抗CD43單株抗體(mAbs)YG5、2C8、8E10及DFT-1確實結合AML細胞，但許多其他非AML細胞，包含CEM7、Jurkat、IM9、Ramos、Raji、Daudi、Reh、正常骨髓及PBL細胞，亦被這些已知抗體的一些或全部所結合(Kim等人，2014)。因此，抗體YG5、2C8、8E10及DFT-1對於AML並分全然具有特異性。反之，抗體AT14-013，其特異性結合本發明之CD43，未結合Jurkat細胞、Ramos細胞、正常骨髓細胞或PBL細胞/PBMC(第5及9b圖)。抗體YG5、2C8、8E10及DFT-1因而結合另一CD43抗原決定基。
抗體UN1(Tuccillo等人，2014a以及Tuccillo等人，2014b)辨識一CD43抗原決定基，其包含GalNac-O-連接的單糖，對應於O多糖的Tn抗原。得到的結論為此抗原決定 基的核心蛋白質包含CD43胺基酸64至83。此抗原由人類胸腺細胞、由白血病細胞系HPB-ALL、H9及Molt-4所表達，且表達於周邊血液CD4+ T淋巴球的次族群(subpopulation)中。抗體AT14-013，然而，未結合人類胸腺細胞，表示本發明提供不同的AML抗原。
國際專利申請WO 2007/146172描述抗體5F1、51-41及138-10，其辨識存在於人類結腸直腸癌(colorectal adenocarcinoma)細胞系Colo205以及人類胃癌細胞系NCI-N87的表面之CD43。AML未於WO 2007/146172中被提及。抗體AT14-013，其特異性的結合本發明之AML特異性CD43胜肽，並未結合Colo205，如實施例所示。抗體5F1、51-41及138-10因而結合不同的CD43抗原決定基。
國際專利申請WO 2006/121240描述能夠辨識CD43的未糖基化(unglycosylated)區域之抗體EB-1、EB-2及EB-3，其由CD43胺基酸73至81所組成。此抗原存在於胸腺細胞上、於骨髓中的一些造血前驅物上、於AML細胞上、於急性淋巴性白血病(acute lymphogenous leukemia,ALL)細胞上以及於慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)細胞上。EB-1於經唾液酸酶處理及未經唾液酸酶處理的CD43分子中均辨識它的抗原。反之，在以唾液酸酶(神經胺酸酶)處理後，本發明之糖基化CD43不再被抗體AT14-013所辨識，這代表本發明提供一AML抗原，其為神經胺酸酶敏感的，與EB-1、EB-2及EB-3的抗原相反。此外，抗體AT14-013未結合ALL細胞或胸腺細胞，與抗體EB-1、EB-2及EB-3相反。 再者，本發明之CD43胜肽包括一胺基酸序列，其具有至少3個胺基酸至少3個胺基酸殘基及至多51個胺基酸殘基的長度與位在CD43的胺基酸殘基133及184內的序列相同，其結構域(domain)與抗體EB-1、EB-2及EB-3所辨識之CD43胺基酸殘基位置73至81不同。抗體EB-1、EB-2及EB-3因而亦結合另一CD43抗原決定基。
總言之，本發明提供一新穎的AML特異性抗原。
發明之CD43胜肽較佳地具有至多100個胺基酸殘基及至少3個胺基酸殘基、較佳地至少5個胺基酸殘基、或至少6個胺基酸殘基、或至少7個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少9個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基、之長度，或至少11個胺基酸殘基、或至少12個胺基酸殘基、或至少13個胺基酸殘基、或至少14個胺基酸殘基、或至少15個胺基酸殘基之長度。在一些實施例中，所述長度為至少20個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述長度為至少25個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述長度為至少30個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述長度為至少33個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述長度為至少35個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述長度為至少40個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述長度為至少45個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述長度為至少50個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述長度為至少51個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述長度為至少52個胺基酸殘基。
在一些實施例中，所述長度為至多90個胺基酸殘 基、或至多85個胺基酸殘基、或至多75個胺基酸殘基、或至多70個胺基酸殘基、或至多65個胺基酸殘基、或至多60個胺基酸殘基、或至多55個胺基酸殘基、或至多52個胺基酸殘基、或至多51個胺基酸殘基、或至多50個胺基酸殘基、或至多45個胺基酸殘基、或至多40個胺基酸殘基、或至多35個胺基酸殘基、或至多30個胺基酸殘基、或至多25個胺基酸殘基、或至多20個胺基酸殘基。在一些實施例中，所述胜肽具有至多52個胺基酸殘基及至少3個胺基酸殘基、較佳至少5個胺基酸殘基、或至少6個胺基酸殘基、或至少7個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少9個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基之長度。在一些實施例中，所述胜肽具有至多51個胺基酸殘基及至少3個胺基酸殘基、較佳至少5個胺基酸殘基、或至少6個胺基酸殘基、或至少7個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少9個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基之長度。在一些實施例中，所述胜肽具有至多33個胺基酸殘基及至少3個胺基酸殘基、較佳至少5個胺基酸殘基、或至少6個胺基酸殘基、或至少7個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少9個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基之長度。在一些實施例中，所述胜肽具有至多15個胺基酸殘基及至少3個胺基酸殘基、較佳至少5個胺基酸殘基、或至少6個胺基酸殘基、或至少7個胺基酸殘基、或至少8個胺基酸殘基、或至少9個胺基酸殘基、或至少10個胺基酸殘基之長度。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少3個胺基酸殘基及至多51個胺基酸殘基 或至多51個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及183之間的序列相同。在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少5個胺基酸殘基及至多40個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及183之間的序列相同。在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少5個胺基酸殘基及至多33個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及183之間的序列相同。在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少5個胺基酸殘基及至多20個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及183之間的序列相同。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少5個胺基酸殘基及至多33個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及165之間的序列相同。在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少5個胺基酸殘基及至多30個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及165之間的序列相同。在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少5個胺基酸殘基及至多20個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及165之間的序列相同。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少5個胺基酸殘基及至多15個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及147 之間的序列相同。在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少8個胺基酸殘基及至多15個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及147之間的序列相同。在一些實施例中，發明之CD43胜肽由一胺基酸序列所組成，其具有至少10胺基酸殘基及至多15個胺基酸殘基之長度與如第13圖所示之位在CD43胺基酸位置133及147之間的序列相同。
在一些實施例中，上述胜肽為糖基化的，較佳包括唾液酸殘基，為了更好的模擬天然AML特異性抗原。在一些實施例中，上述胜肽為癌-唾液酸化的(onco-sialylated)。在一些實施例中，上述胜肽由AML細胞或AML細胞系所產生，較佳為THP-1細胞。在一些實施例中，上述胜肽由MDS細胞或MDS細胞系所產生。
本發明亦涵蓋編碼為發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物(functional equivalents)。因此更進一步提供編碼為發明之CD43胜肽的經分離、合成或重組的核酸分子或其功能等效物。如本文中所使用，發明之核酸分子或核酸序列較佳地包括核苷酸鏈、更佳為DNA、cDNA或RNA。在另一些實施例中，發明之核酸分子或核酸序列包括其他種類的核酸結構，例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)及/或核糖酵素(ribozyme)。此類其他核酸結構被稱為核酸序列的功能等效物。用詞“核酸分子的功能等效物”因此涵蓋包括展現與天然核苷酸相同功能之非天然核苷酸、經修飾的核苷酸及/或非核苷酸結構單元(building block)的鏈。
一些實施例提供發明之核酸分子或其功能等效物，其中人類核酸序列已就非人類細胞進行密碼子最適化，例如就，非人類生產者細胞如E.coli、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO細胞(其為小鼠骨髓瘤)或293(T)細胞。這代表來自所述人類核酸序列的一或多個密碼子已被所述非人類細胞優選的一或多個密碼子所取代。
如本文中所使用，編碼為發明之CD43胜肽的經分離、合成或重組的核酸分子或其功能等效物亦稱為“發明之核酸分子或功能等效物”。
由於發明已提供包括新穎AML特異性抗原的CD43胜肽，許多應用變成可能的。例如，在一些實施例中，發明之CD43胜肽被用於誘發、分離及/或取得免疫細胞及/抗體、或其功能性部份或功能衍生物，其可特異性地結合淋巴球增生及/或骨髓增生細胞。以發明之CD43胜肽誘發、分離及/或取得之免疫細胞及/或抗體、或其功能性部份或功能衍生物特別地適合用於治療或預防骨髓增生或淋巴球增生疾病。更進一步地，有鑑於抗體AT14-013，其為對於本發明之CD43胜肽具特異性之抗體，亦標靶白血病幹細胞，所述白血病幹細胞已知較有治療抗性且常為治療後的疾病復發之原因。在一些實施例中，發明之CD43胜肽用於誘發及/或取得AML特異性免疫細胞及/或AML特異性抗體。例如，以一或多個本發明之CD43胜肽、或以包括本發明之CD43胜肽的免疫化合物、或以編碼為發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物、或以包括發明之核酸分子或功能等效物的載體，使非人類動物免疫，且較 佳地接續一或多次的加強施用(booster administration)。接著，從所述非人類動物收集對於淋巴球增生及/或骨髓增生細胞具特異性，較佳地為對AML具特異性，的免疫細胞及/或抗體。在一些實施例中，所述免疫細胞包括T細胞，例如，自然殺手細胞(NK細胞)或輔助性T細胞。
在一些實施例中，從所述經免疫的非人類動物所收集之所述免疫細胞包括B細胞，例如，AML特異性B細胞特別地適合用於AML特異性抗體的生產。從所述經免疫的非人類動物所收集之AML特異性B細胞，例如，可用於融合瘤(hybridoma)的產生，而AML特異性抗體從所述融合瘤取得。在另一些實施例中，以Bcl-6及Bcl-xL核酸轉導(transduce)由所述經免疫的動物所收集之B細胞，並長期體外(ex vivo)培養於B細胞培養物中，例如，如歐洲專利號1974017及美國專利US 9,127,251中所述。於此，製造長期複製B細胞的培養物，其中B細胞複製並產生抗體。在一些實施例中，所述融合瘤或此類B細胞培養物所產生的AML特異性抗體經收集且，例如，用於抗AML治療，為了減少副作用，較佳是在抗體的人源化(humanization)之後。在一些實施例中，測試由所述非人類動物所取得的抗體及/或B細胞與抗體AT14-013對CD43結合的競爭。此例如是將AML細胞與由所述非人類動物所取得之所述抗體或B細胞一起培養，且接著加入抗體AT14-013加以進行。作為對照組，AML細胞較佳地與抗體AT14-013一起培養，在不存在任何其他抗體或B細胞的情況下。若AML細胞與由所述非人類動物所取得的抗體或B細胞的預培養似乎影響 AT14-013對所述AML細胞的結合，則得到的結論為由所述非人類動物所取得的所述抗體或B細胞與抗體AT14-013競爭對CD43的結合。
在一些實施例中，定序編碼來自所述非人類動物的B細胞的核酸序列之可變域(variable domain)以取得AML特異性可變域的核酸序列，其在一或多個包括這些序列的核酸序列導入生產者細胞，如E.coli、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO細胞或293(T)細胞之後，用於產生AML特異性抗體。所述一或多個核酸序列較佳地就所述生產者細胞進行密碼子最適化。如本文中所使用，用詞“密碼子”代表三個一組的核苷酸(或其功能等效物)，其編碼出特定的胺基酸殘基。用詞“密碼子最適化(codon optimized)”表示來自原始的、動物核酸序列的一或多個密碼子被來自另一物種的細胞(例如特定的生產者細胞)優選之一或多個密碼子所取代。這些取代密碼子較佳地編碼出與被取代之原始動物密碼子相同的胺基酸殘基。
在一些實施例中，由所述非人類動物或由所述非人類動物的免疫細胞所取得的CD43-特異性抗體是經人源化的，其代表動物胺基酸序列的至少一部分、較佳為框架序列(framework sequence)的至少一部份或全部，被人類序列取代以減少於人類中的不良副作用。
含適合的施用步驟及佐劑之動物免疫流程、由此種經免疫的動物取得及純化抗體及/或免疫細胞的步驟、競爭實驗及非人類抗體的人源化步驟已為所屬技術領域所熟知。例如Hanly等人(1995)可作為參考。
在一些實施例中，使用本發明之CD43胜肽或包括本發明之CD43胜肽的化合物於篩選噬菌體展示庫(phage display library)，以辨識及/或分離AML特異性免疫球蛋白(通常為Fab片段)。在一些實施例中，使用初始(naïve)噬菌體展示庫。在較佳的實施例中，使用衍生自一或多個AML患者的噬菌體展示庫，使得展示庫將已傾向AML。在一些實施例中，測試由所述噬菌體展示庫所取得之AML特異性免疫球蛋白與抗體AT14-013對CD43結合的競爭。此例如利用於本文中所述之競爭測試進行。
因此進一步提供使用發明之CD43胜肽、或使用發明之免疫化合物、或使用編碼出發明之CD43胜肽的CD43胜肽、或使用包括發明之核酸分子或功能等效物之載體於誘發、分離及/或取得免疫細胞或抗體、或其功能性部分或功能衍生物如Fab片段之用途。所述免疫細胞、或抗體、或其功能性部分或功能等效物較佳地能夠特異性結合淋巴球增生細胞及/或骨髓增生細胞。較佳地，所述骨髓增生細胞為AML細胞、MDS細胞及/或CML細胞，最佳為AML細胞。在一些實施例中，使用發明之CD43胜肽、或發明之免疫化合物、或發明之核酸分子或功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物之載體於誘發及/或取得能夠誘發抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)之抗體。此類抗體的非限定例子為AT14-013，如實施例所示。發明之CD43胜肽、或發明之免疫化合物能夠誘發及/或取得具有ADCC及/或CDC誘發活性之抗體的事實代表可被誘發或取得的抗體於體內(in vivo)為有作用 的。
本文亦提供發明之CD43胜肽或化合物作為免疫原(immunogen)之用途，以及發明之核酸分子或功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物之載體作為免疫原之用途。
一些實施例提供一種用於產生免疫細胞及/或抗體之方法，所述免疫細胞及/或抗體能夠特異性地結合淋巴球增生細胞及/或骨髓增生細胞，例如AML特異性免疫細胞或AML特異性抗體，所述方法包括以本發明之CD43胜肽、或以發明之化合物、或以發明之核酸分子或功能等效物、或以包括發明之核酸分子或功能等效物之載體使非人類動物免疫。所述方法較佳地更包括由所述非人類動物收集能夠特異性地結合淋巴球增生細胞及/或骨髓增生細胞的免疫細胞及/或抗體。在一些實施例中，由所述非人類動物收集AML特異性免疫細胞及/或AML特異性抗體。在一些實施例中，測試由非人類動物取得之B細胞及/或抗體與抗體AT14-013對CD43結合的競爭。本文中亦提供可藉由本發明之方法取得之可特異性地結合淋巴球增生細胞及/或骨髓增生細胞的免疫細胞及/或抗體。一些實施例提供可藉由本發明之用於產生AML特異性免疫細胞或AML特異性抗體的方法所取得之AML特異性抗體或AML特異性免疫細胞。此種AML特異性抗體較佳地與抗體AT14-013競爭結合至CD43。
所述非人類動物較佳地包括哺乳動物，如囓齒動物或牛。在一些實施例中，所述非人類動物包括小鼠、大鼠、兔子、美洲駝(llama)、駱駝、豬、家禽、牛、山羊、馬、猿及 /或大猩猩。
有鑑於抗體AT14-013特異性地結合本發明之CD43胜肽的事實，以發明之CD43胜肽所取得、產生或選擇之其他抗體一般將與抗體AT14-013競爭結合至CD43。反之，所屬技術領域已知的現存CD43抗體並未與抗體AT14-013競爭，而這些已知抗體確實彼此競爭，如第9圖所示。故這些所屬技術領域已知的其他抗體確實地結合一抗原決定基，其不同於AT14-013的抗原決定基。因此，更進一步提供的是，與抗體AT14-013競爭結合至CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物。所述經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物，較佳地與抗體AT14-013競爭結合至如第13圖所示之位在CD43序列的胺基酸133及184之間的抗原決定基的至少一部份。所述經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物一般與抗體AT14-013競爭結合至本發明之CD43胜肽。
如本文中所使用之用詞“抗體”是指包括兩條彼此結合的重鏈的免疫球蛋白，其中每一重鏈亦與一輕鏈配對。
本文中“抗體的功能性部分”定義為與所述抗體在性質上而不一定在數量上具有至少一共享特徵的部分。所述功能性部分能夠與所述抗體結合相同的抗原，儘管不一定以相同的程度。抗體的功能性部分較佳地包括至少一重鏈可變域(VH)及一輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，抗體的功能性部分包括至少一重鏈可變域(VH)。抗體的功能性部分之非限定例子為單域抗體、單鏈抗體、奈米抗體(nanobody)、單抗體(unibody)、 單鏈可變片段(scFv)、雙專一性T細胞銜接者(bi-specific T-cell engager,BiTE)、Fab片段及F(ab')2片段。
本文中“抗體的功能等效物”定義為人工的結合化合物，其包括抗體的至少一CDR序列，較佳為一重鏈CDR3序列。所述功能等效物較佳地包括抗體的重鏈CDR3序列以及所述抗體的輕鏈CDR3序列。更佳地，所述功能等效物包括抗體的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列以及所述抗體的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。抗體的功能等效物的產生，例如，是藉由改變抗體使得產生之化合物的至少一抗原結合特徵在性質上而不一定在數量上實質地相同。其可以許多方式進行，例如藉由保守胺基酸取代，其中一胺基酸殘基被具有大致上相似特徵(尺寸、疏水性等)的另一殘基取代，使得所述抗體的整體作用實質上不受影響。抗體的功能等效物的非限定例子為具有經修飾的Fc尾部的抗體，其中Fc尾部例如經胺基酸取代及/或糖基化改變進行修飾。
如技術人員所熟知的，抗體的重鏈為組成免疫球蛋白分子的兩種類型的鏈之較大者。重鏈包括恆定域及可變域，其中可變域涉及抗原結合。抗體的輕鏈為組成免疫球蛋白分子的兩種類型的鏈之較小者。輕鏈包括恆定域及可變域。可變域通常、但並非總是與重鏈的可變域一起參與抗原結合。
互補決定區(CDRs)為存在於重鏈可變域及輕鏈變域中的高度變異(hypervariable)區。在整個抗體的情況下，重鏈的CDRs 1-3及連接之輕鏈的CDRs 1-3一起形成抗原結合位。
如本文中所使用，免疫細胞、抗體、或其功能性部 分或功能等效物對AML具“特異性”，若其能夠以高於不相關的對照抗體(control antibody)或對照免疫細胞對所述AML細胞之結合親和性(其中對照抗體或對照免疫細胞對所述AML細胞不具特異性)至少兩倍的結合親和性結合AML細胞。例如，AML特異性抗體、B細胞或T細胞的AML結合一般分別藉由抗體、B細胞受體(BCR)或T細胞受體(TCR)進行調節。AML抗原及抗體或BCR或TCR兩者的可變域的特定三維結構均使得這兩種結構結合在一起(類似於鎖及鑰匙的相互作用)，其與抗體或BCR或TCR的任意、非特異性的黏附相反。然而，對於其他類型細胞的一些反應性包含用詞“AML特異性”之中。由於抗體或BCR或TCR一般辨識抗原的抗原決定基，且由於這類抗原決定基可能也存在於其他細胞上，AML特異性抗體、B細胞或T細胞於是可能辨識其他細胞。這類其他細胞的非限定例子為MDS及CML細胞。黑色素瘤細胞及黑色素細胞似乎也被AML特異性抗體AT14-013結合，儘管在較小程度上。因此，用詞“AML特異性”並未排除抗體或B細胞或T細胞對包含相同抗原決定基的至少一部分之另一細胞的結合。然而，實施例中顯示許多CD43+細胞，包含CD43+造血細胞如PBMC、(先驅)T細胞及B細胞，並未包含本發明提供之AML抗原。
本發明之CD43胜肽特別地適合用於檢測生物樣本中AML特異性結合化合物，例如AML特異性抗體或AML特亦性免疫細胞(如B細胞或T細胞)的存在。例如，將來自一個體的樣品、或此種樣品包括抗體、B細胞及/或T細胞的級分(fraction)與本發明之CD43、或包括發明之CD43的化合物 一起培養，以檢查AML特異性抗體及/或AML特異性免疫細胞的存在。若這類抗體或免疫細胞顯示存在於所述樣品或所述樣品級分中並結合本發明所述之CD43胜肽，所述樣品被分類為對AML特異性結合化合物(即，抗體及/或免疫細胞)呈陽性。所述樣品例如包括血液樣品、或骨髓樣品、或生物檢體如髓樣肉瘤(myeloid sarcoma)(亦稱為綠色瘤)。
AML特異性抗體或AML特異性免疫細胞，例如，是使用免疫分析法(immunoassay)進行偵測及/或定量，例如西方墨點分析、(捕捉)ELISA或RIA。這些分析已為所屬技術領域所熟知。將經標記之發明的CD43胜肽，例如與血液樣品或骨髓樣品、或與生物檢體如髓樣肉瘤、或與這類樣品中包括抗體、B細胞及/或T細胞的級分一起培養，其後將未結合的結合化合物清洗掉。接著，測定發明之CD43胜肽是否被AML特異性抗體或免疫細胞結合。在一些實施例中，將未經標記之發明的CD43胜肽、或未經標記之包括發明之CD43胜肽的化合物與包括抗體及/或免疫細胞的樣品接觸，所述樣品例如為血液樣品、或骨髓樣品、或生物檢體如髓樣肉瘤、或這類樣品中包括抗體、B細胞及/或T細胞的級分。培養後，較佳地實行一或多個清洗步驟以移除非結合抗體及未結合的免疫細胞。接著，測試抗體或免疫細胞是否已結合發明之CD43胜肽，例如可使用特異性地針對人類抗體或人類免疫細胞並與標記連接之抗體，所述標記例如為螢光化合物或山葵過氧化氫酶(horseradish peroxidase)或鹼性磷酸酶。於進一步的清洗步驟後，測定是否已結合第二抗體，例如藉由測量發射光或添加山 葵過氧化氫酶或鹼性磷酸酶的受質。這些偵測技術已為所屬技術領域所熟知。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽、或包括發明之CD43胜肽的化合物與已富含抗體及/或免疫細胞的樣品的級分接觸。在一些實施例中，所述級分為B細胞體外(in vitro)培養物或T細胞體外培養物。在一些實施例中，發明之CD43胜肽或包括發明之CD43胜肽的化合物與已從生物樣品大致純化之抗體及/或免疫細胞接觸，例如藉由挑選CD19陽性細胞所取得之純化的B細胞級分及/或利用抗Ig抗體或蛋白質A或G純化方法所純化之抗體/B細胞級分。蛋白質A或G純化方法已為所屬技術領域所熟知，且方法流程及試劑為商業上可取得的。如本文中所使用，用詞“已從樣品大致純化之免疫細胞”代表產生的級分之至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%或至少95%的細胞由免疫細胞所組成。用詞“已從樣品大致純化之抗體”代表產生的級分之至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%或至少95%的質量由抗體所組成。
因此更進一步提供發明之CD43胜肽、或包括發明之CD43胜肽的化合物於結合及/或偵測免疫細胞、及/或抗體、或其功能性部分或功能等效物之用途。所述免疫細胞、及/或抗體、或其功能性部分或功能等效物較佳地能夠特異性結合淋巴球增生細胞及/或骨髓增生細胞。較佳地，所述淋巴球增生細胞為AML細胞、或MDS細胞、或CML細胞，較佳為AML細胞。本文中亦提供發明之CD43胜肽、或包括發明之CD43胜肽的化合物作為AML特異性結合化合物的偵測部分(moiety) 之用途，所述AML特異性結合化合物如抗體及/或免疫細胞，以及提供用於測定樣品是否包括AML特異性抗體及/或AML特異性免疫細胞之方法，所述方法包括將發明之CD43胜肽、或包括發明之CD43胜肽的化合物與所述樣品、或所述樣品中包括抗體及/或免疫細胞的級分一起培養，且接著測定發明所述之CD43胜肽是否被AML特異性抗體及/或AML特異性免疫細胞結合、或包括發明所述之CD43胜肽的所述化合物是否被AML特異性抗體及/或免疫細胞結合。若偵測到這類結合，則得到的結論為所述樣品包括AML特異性抗體及/或AML特異性免疫細胞。
亦提供用於測定樣品是否包括AML特異性抗體及/或AML特異性免疫細胞之方法，所述方法包括將發明之CD43胜肽、或包括發明之CD43胜肽的化合物與已從所述樣品大致純化之抗體及/或免疫細胞一起培養，且接著測定發明所述之CD43胜肽是否被AML特異性抗體及/或AML特異性免疫細胞結合、或包括發明所述之CD43胜肽的所述化合物是否被AML特異性抗體及/或免疫細胞結合。
在一些實施例中，使用如上述之偵測測試的結果於測定個體是否具有AML。若來自個體的樣品顯示包含AML特異性免疫細胞及/或AML特異性抗體，則得到的結論為所述個體為AML患者。因此，本文亦提供發明之CD43胜肽作為診斷試劑之用途，以及包括發明之CD43胜肽的化合物作為診斷試劑之用途。進一步提供發明之CD43胜肽用於診斷AML的用途，以及包括發明之CD43胜肽的化合物用於診斷AML 的用途。更進一步提供一診斷套組，包括：- 發明之CD43胜肽、或包括發明之CD43胜肽的化合物，以及- 用於偵測結合CD43胜肽的抗體或結合CD43胜肽的免疫細胞之工具。
此類工具例如涵蓋經標記的抗體，其為特異性地針對人類抗體或人類免疫細胞。在一些實施例中，所述經標記的抗體與山葵過氧化氫酶或鹼性磷酸酶接合(conjugate)。
一些實施例提供一診斷套組包括：- 發明之CD43胜肽、或包括發明之CD43胜肽的化合物，以及- 用於偵測抗體或免疫細胞之工具。
此類工具例如涵蓋經標記的抗體，其為特異性地針對人類抗體或人類免疫細胞。在一些實施例中，所述經標記的抗體與山葵過氧化氫酶或鹼性磷酸酶接合(conjugate)。
一些實施例提供一用於分類包含抗體的樣品或包含免疫細胞的樣品之方法，所述方法包括將發明之CD43胜肽(可選地於MHC複合物的環境下以偵測T細胞)、或包括發明所述之CD43胜肽的化合物與所述樣品的抗體及/或免疫細胞接觸，以及測定發明所述之CD43胜肽、或發明所述之化合物是否被所述樣品的抗體及/或免疫細胞的至少一者結合。若發明所述之CD43胜肽或所述化合物被樣品的抗體及/或免疫細胞結合，則所述樣品被分類為包括CD43特異性抗體及/或免疫細胞。
一些實施例提供一用於測定個體是否具有骨髓增 生或淋巴球增生疾病，較佳為AML，所述方法包括將發明之CD43胜肽(可選地於MHC複合物的環境下以偵測T細胞)、或包括發明所述之CD43胜肽的化合物與所述個體的抗體及/或免疫細胞接觸，以及測定發明所述之CD43胜肽、或發明所述之化合物是否被所述個體的所述抗體及/或免疫細胞的至少一者結合。若發明所述之CD43胜肽或所述化合物被所述個體的抗體及/或免疫細胞結合，則得到的結論為所述個體具有淋巴球增生或骨髓增生疾病，如AML。在一些實施例中，發明所述之CD43胜肽、或包括發明所述之CD43胜肽的所述化合物與包括所述個體之抗體及/或免疫細胞的樣品接觸，所述樣品例如為血液樣品、或骨髓樣品、或生物檢體如髓樣肉瘤。在另一些實施例中，發明所述之CD43胜肽或化合物與來自所述個體的樣品的級分接觸，其中所述級分包括免疫細胞及/或抗體。在一些實施例中，發明所述之CD43胜肽或化合物與已從所述樣品大致純化之抗體及/或免疫細胞接觸，例如藉由挑選CD19陽性細胞所取得之純化的B細胞級分及/或利用抗Ig抗體或蛋白質A或G純化方法所純化之抗體/B細胞級分。
在一些實施例中，使用發明之偵測測試的結果於測定個體是否展現針對骨髓增生或淋巴球增生疾病(如AML)之可偵測的免疫反應。例如，此較佳是用於測定已接受藥物治療之患有骨髓增生疾病的患者是否具有GvL反應，所述患者例如為已接受針對AML治療的AML患者、例如已接受免疫療法如幹細胞移植或捐贈者-淋巴球輸液(infusion)的AML患者。至今，並未有測試受治療的患者受否有強烈GvL反應的存在之診 斷工具。這類診斷工具是被極度需要的，因為：1)它將允許高風險復發的異基因SCT接受者的早期辨識，於復發發生之前的時點，因而得以早期干預(intervention)，如免疫抑制劑的減少或捐贈者-淋巴球輸液；2)它將允許滴定這類捐贈者淋巴球輸一直到抗白血病抗體確實出現；以及3)當強烈GvL反應的存在可被驗證時，它將給予往往受許多SCT相關併發症所苦之異基因SCT接受者希望。現在的患者必須等待並觀察復發是否發生，且並沒有預測疾病復發的方式存在。因此，測定患者是否具有抗AML免疫反應的測試之可獲性將大幅改善SCT患者的臨床護理，影響預後(prognosis)及生活品質。
一些實施例因而提供一用於測定個體是否展現針對骨髓增生或淋巴球增生疾病(較佳為AML)之免疫反應的方法，所述方法包括將發明之CD43胜肽，可選地於MHC複合物的環境下、或包括發明所述之CD43胜肽的化合物與所述個體的抗體及/或免疫細胞接觸，以及測定發明所述之CD43胜肽、或包括發明所述CD43胜肽的所述化合物是否被所述個體的所述抗體及/或免疫細胞的至少一者結合。若發明所述之CD43胜肽或所述化合物顯示被結合，其代表所述個體針對所述骨髓增生或淋巴球增生疾病(較佳為AML)展現免疫反應。在一些實施例中，測定所述個體之抗體或B細胞是否與抗體AT14-013競爭對於CD43的結合。競爭抗體針對骨髓增生或淋巴球增生疾病(較佳為AML)將特別地有效。
在一些實施例中，與抗體AT14-013競爭結合CD43之抗體、或其功能性部分或功能等效物被使用於偵測樣品中的 骨髓增生細胞。因而進一步提供使用與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物於測定樣品是否包括骨髓增生細胞之用途，所述骨髓增生細胞較佳為AML或MDS或CML細胞。本文中亦提供與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物，其使用於淋巴球增生或骨髓增生疾病(較佳為AML或MDS或CML)的診斷，以及與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物於診斷AML的用途。亦提供與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物於製備淋巴球增生或骨髓增生細胞(較佳為AML或MDS或CML細胞)的診斷試劑之用途。一些實施例提供一診斷套組，包括與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物，以及用於偵測抗體-細胞複合物的工具。所述工具例如包括針對AML細胞之另一抗體，如AT14-013。在一些實施例中，所述工具包括針對骨髓細胞的另一細胞表面成分之經標記的抗體。在一些實施例中，所述工具包括經標記的抗體，其針對與抗體AT14-013競爭的所述抗體或功能性部分或功能等效物。
亦提供與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物作為診斷試劑之用途。一些實施例提供用於測定骨髓增生細胞是否存在於樣品中的方法，其包括： - 使所述樣品與和抗體AT14-013競爭結合CD43之經分 離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物接觸，以及- 允許所述抗體或功能性部分或功能等效物結合骨髓增生細胞，若其存在，以及- 測定骨髓增生細胞是否結合至所述抗體或功能性部分或功能等效物，從而測定骨髓增生細胞是否存在於所述樣品中。在一些實施例中，所述骨髓增生細胞為AML或MDS或CML細胞。
更進一步提供抗體AT14-013、或其功能性部分或功能等效物用於測定樣品是否包括AML或MDS或CML細胞之用途。本文中亦提供抗體AT14-013、或其功能性部分或功能等效物在AML或MDS或CML的診斷之用途，以及抗體AT14-013、或其功能性部分或功能等效物用於診斷AML或MDS或CML之用途。亦提供抗體AT14-013、或其功能性部分或功能等效物於製備用於AML或MDS或CML的診斷試劑之用途。
本發明之新穎的CD43胜肽以及核酸分子或從而編碼出的功能等效物的其他有趣應用為預防性(prophylactic)或半預防性的應用及免疫療法。如本文中所使用，半預防性應用代表一個體已經具有疾病，但所述疾病的進一步進展至少為暫時延遲或被防止的。例如，本發明之CD43胜肽、或核酸分子或從而編碼出的功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物的載體可半預防性地(semi-prophylactically)施用於患有中高風險骨髓造血不良症候群(MDS)的個體。如前述，此類患者具有中高風險發展為AML，因此預先引發抗AML免疫反 應於所述患者為有益的，可利用發明之CD43胜肽或化合物或核酸分子或功能等效物或載體於MDS進展為AML之前。本發明之CD43胜肽、或發明之化合物或核酸分子或功能等效物或載體的半預防性應用之另一例子為，其於接受異基因造血幹細胞移植(HSCT)的AML、MDS或CML患者的用途。此類異基因HSCT的目標為引起異基因移植物抗白血病/MDS反應，但目前並未有能夠確認這類反應的發展之方式。本發明提供發明之CD43胜肽、或核酸分子或從而編碼出的功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物之載體、或包括發明之CD43胜肽之化合物，作為誘發針對表達CD43的惡性細胞的異體反應性(alloreactive)免疫反應(移植物對抗腫瘤反應，例如，針對MDS、AML或CML)之預防性或半預防性試劑之用途。本發明之CD43胜肽、或發明之化合物或核酸分子或功能等效物或載體的預防性或半預防性應用的另一例子為，其用於CML患者之用途。目前，CML於許多患者中良好地被控制，其利用酪胺酸激酶抑制劑，如Imatinib。然而，患者可能發展對於一或多種酪胺酸激酶抑制劑的抗性。此外，酪胺酸激酶抑制劑的使用有時候涉及不良副作用，像是水腫、皮膚疹、疲勞、噁心及骨髓抑制。酪胺酸激酶抑制劑亦為昂貴的。本發明提供發明之CD43胜肽、或核酸分子或從而編碼出的功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物之載體、或包括發明之CD43胜肽之化合物，作為預防性或半預防性試劑之用途，其延緩或防止CML進展為AML。在一些實施例中，使用發明所述之CD43胜肽或化合物或核酸分子或功能等效物或載體代替酪胺酸激 酶抑制劑，例如，為了降低副作用及/或花費。在另一些實施例中，發明所述之CD43胜肽或化合物或核酸分子或功能等效物或載體與一或多種酪胺酸激酶抑制劑一起使用。因此，本文中亦提供發明之CD43胜肽、或包括發明之CD43胜肽的化合物、或編碼出發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物的載體，作為預防性或半預防性試劑的用途。亦提供發明之CD43胜肽、或包括發明之CD43胜肽的化合物、或編碼出發明之CD43胜肽的核酸分子或功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物的載體，用於製備針對AML的預防性或半預防性試劑之用途，例如，用於已接受異基因HSCT的AML患者。在一些實施例中，所述半預防性試劑是用於MDS或CML患者，如前文所解釋。所述預防性或半預防性試劑較佳地包括疫苗。如本文中所使用，用詞“預防性試劑”亦包含半預防性試劑。
在一些實施例中，發明之CD43胜肽或化合物或核酸分子或功能等效物或載體是用於治療骨髓增生或淋巴球增生疾病，較佳為AML。如本文中所使用，“治療”包含緩和至少一症狀及/或延緩或甚至暫停疾病的進展，至少暫時地。在一較佳實施例中，發明之CD43胜肽，可選地在MHC複合物的環境下、或核酸分子或從而編碼出的功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物的載體、或包括發明所述之CD43胜肽的化合物，被施用於AML患者以加強他/她的免疫系統，導致增強的免疫反應。在一些實施例中，體外(ex vivo)培養來自AML患者的初始(naïve)T細胞或B細胞並與發明之CD43胜肽 或化合物一起培養，在T細胞培養物的情況可選地在MHC複合物的環境下，以取得AML特異性T細胞或B細胞，之後施用於患者，可選地在體外擴增之後。在一些實施例中，測定來自所述AML患者的AML特異性B細胞是否與抗體AT14-013競爭結合CD43，因為競爭B細胞對AML將特別地有效，尤其是考慮到AT14-013亦標靶白血病幹細胞的事實，其已知較具治療抗性且常為治療後的疾病復發之原因。
在一些實施例中，使用細胞輸入療法(adoptive cell therapy)。在一些實施例中，利用在MHC複合物的環境下之發明的CD43胜肽、或利用在MHC複合物的環境下之包括發明的CD43胜肽的化合物測試來自AML患者的T細胞之結合或活化，且辨識所述CD43胜肽的T細胞較佳地經體外(ex vivo)擴增並接著施用於患者，其將導致抗AML之T細胞反應。
在一些實施例中，使用捐贈者淋巴球的細胞輸入療法。捐贈者T細胞分離自已接受異基因HSCT的AML患者、或分離自HSCT捐贈者，較佳地利用在MHC複合物環境下之發明的CD43胜肽、或利用在MHC複合物的環境下之包括發明的CD43胜肽的化合物測試其結合或活化，且辨識所述CD43胜肽的捐贈者T細胞較佳地經體外(ex vivo)擴增並接著施用於患者，其將導致抗AML異基因T細胞反應。
在一些實施例中，T細胞經修飾以提供它們AML特異性結合部分(moiety)。所述T細胞較佳地衍生自AML患者或MDS患者或CML患者或HSCT捐贈者。在一些實施例中，產生嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)T細胞。這些 為具有經修飾之T細胞受體的T細胞，其已被提供具有感興趣者之結合特異性，較佳地衍生自抗體。一般而言，CAR T細胞是藉由融合衍生自單株抗體的單鏈可變域(scFv)至CD3-ζ(zeta)跨膜域加以產生，使得ζ訊號將於scFv辨識標靶時被引發。
根據一些實施例，發明之CD43胜肽、或核酸分子或從而編碼出的功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物的載體、或包括發明之CD43胜肽的化合物被使用以生產及/或分離CD43特異性B細胞及/或抗體，其進而用於經修飾的T細胞的生產。例如，使用所述CD43胜肽或化合物或核酸分子或功能等效物或載體以引發、偵測及/或分離AML特異性抗體或AML特異性B細胞。接著，在一些實施例中，提供所述抗體或B細胞的重鏈及/或輕鏈可變域於T細胞，藉此生產具AML特異性之經修飾的T細胞。在一些實施例中，這些經修飾的T細胞接著被施用於AML患者，其將導致AML特異性T細胞反應。在一些實施例中，所述經修飾的T細胞為CAR T細胞。在一些實施例中，測試所述AML特異性抗體或AML特異性B細胞與抗體AT14-013對CD43結合的競爭，於提供所述抗體或B細胞的重鏈及/或輕鏈可變域於T細胞之前。此類競爭抗體較佳地經選擇以用於生產具AML特異性之經修飾的T細胞。
因而更進一步提供發明之CD43胜肽，可選地在MHC複合物的環境下、或包括發明所述之CD43胜肽的化合物、或編碼出發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物的載體，作為藥物之用途。亦提供發明之CD43胜肽，可選地在MHC複合物的環境 下、或包括發明所述之CD43胜肽的化合物、或編碼出發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物、或包括發明之核酸分子或功能等效物的載體，用於產生AML特異性T細胞之用途。一些實施例提供一用於產生經修飾的T細胞之方法，所述方法包括將包含來自AML患者的樣品之抗體或包含來自AML患者的樣品之B細胞與發明之CD43胜肽或化合物接觸，產生針對AML之結合的抗體或B細胞，且接著取得來自所述AML患者的AML特異性抗體或來自AML特異性B細胞之一或多個AML特異性結構域，且提供所述一或多個結構域於T細胞。一些實施例提供一用於產生經修飾的T細胞之方法，所述方法包括以發明之CD43胜肽或化合物或核酸分子或功能等效物或載體使非人類動物免疫，從而引發針對AML的免疫反應，且接著取得來自所述非人類動物的AML特異性抗體或AML特異性B細胞之一或多個AML特異性結構域、或取得編碼為所述一或多個AML特異性結構域的一或多個核酸序列，可選地在測定所述AML特異性抗體或AML特異性B細胞是否與抗體AT14-013競爭對於CD43的結合之後，以及提供所述一或多個結構域、或所述一或多個核酸序列於T細胞。本文亦提供發明之CD43胜肽或化合物用於免疫療法之用途，以及在MHC複合物的環境下發明之CD43胜肽用於免疫療法之用途，以及編碼出發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物用於免疫療法之用途。一些實施例提供一載體，包括發明之核酸分子或功能等效物用於免疫療法之用途。更進一步提供發明之CD43胜肽的用途、或包括發明之CD43胜肽的化合物之用途、或編碼 出發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物的用途、或包括發明之核酸分子或功能等效物的載體之用途，其用於製備針對骨髓增生或淋巴球增生疾病的藥物，較佳為AML。
亦提供一免疫組合物，包括發明之CD43胜肽、及/或包括包含發明之CD43胜肽的化合物、及/或包括編碼出發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物、及/或包括包含發明之核酸分子或功能等效物的載體。所述免疫組合物較佳地更包括生物相容添加物，例如，載體、稀釋劑、賦形劑或填充劑。一些實施例提供一疫苗，包括發明之CD43胜肽，可選地在MHC複合物的環境下。一些實施例提供一疫苗，包括包含發明所述之CD43胜肽的化合物，以及一疫苗，包括編碼出發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物，以及一疫苗，包括包含發明之核酸分子或功能等效物的載體。其他實施例提供一組合物，包括發明之CD43胜肽、或一組合物，包括包含發明之CD43胜肽的化合物、或一組合物，包括編碼出發明之CD43胜肽的核酸分子或其功能等效物、或一組合物，包括包含發明之核酸分子或功能等效物的載體，其中所述組合物為醫藥組合物，其更包括醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑。
在一些實施例中，與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物被使用於骨髓增生或淋巴球增生疾病的治療，較佳為AML。如WO 2015/093949中所述，抗體AT14-013由完全緩解的AML患者所取得，顯示AT14--013對於AML為有效的。此外，AT14-013亦標靶白血病幹細胞，其已知較具治療抗性且常為 治療後的疾病復發之原因。與AT14-013競爭結合CD43的抗體從而針對骨髓增生疾病(像是AML)亦將非常有效。因此，施用此類抗體於AML患者將有效地抵消及/或殺死AML細胞。一些實施例從而提供與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物，作為藥物之用途。一些實施例提供與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物之用途，其用於藥物的製備。
亦提供與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物，於一方法中的用途，所述方法用於至少一部分治療或預防骨髓造血不良(myelodysplastic)或骨髓增生或淋巴球增生疾病，以及與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物，用於製備針對骨髓增生或淋巴球增生疾病的藥物之用途。所述骨髓增生疾病較佳地包括AML。又一些實施例提供一組合物，包括與抗體AT14-013競爭結合CD43之經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物。所述組合物較佳地為醫藥組合物，其包括醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑。
如前文所述，一些實施例提供一經分離、合成或重組的核酸分子、或其功能等效物，其編碼出發明之CD43胜肽。此類核酸分子或功能等效物例如有用於發明之CD43胜肽的產生，其利用核酸表達系統，例如宿主細胞。在一些實施例中，AML細胞被使用作為宿主細胞。在一些實施例中，THP-1 細胞被使用作為宿主細胞。在一些實施例中，擇自於Kasumi 3細胞、HL60細胞、KG1a細胞、SH2細胞、MonoMac6細胞、Molm13細胞及CML K562細胞所組成之群組的細胞被使用作為宿主細胞。
發明所述之核酸分子或功能等效物亦有用於引發免疫反應。例如，發明之核酸分子或功能等效物被施用於AML患者，以誘發或增強AML特異性免疫反應(免疫療法)。在一些實施例中，發明之核酸分子或功能等效物被施用於MDS或CML患者，以延緩或防止MDS或CML進展為AML(預防性或半預防性應用)。在一些實施例中，發明之核酸分子或功能等效物被施用於非人類動物，以引發抗AML免疫反應，其後可從所述動物收集AML特異性抗體及/或AML特異性免疫細胞。或者，定序編碼來自所述非人類動物的AML特異性B細胞之核酸序列的可變域，以取得AML特異性可變域的一或多個核酸序列，其後導入包括AML特異性可變域序列的一或多個核酸分子於生產者細胞，用於AML特異性抗體的產生。
在一些實施例中，發明之核酸分子或功能等效物存在於基因輸送載具(gene delivery vehicle)中，其促進所述核酸分子或功能等效物導入於感興趣的細胞中。因此，進一步提供一基因輸送載具，較佳為載體，其包括發明之核酸分子或功能等效物。本文中亦提供一宿主細胞，包括發明之核酸分子或功能等效物及/或包括發明之基因輸送載具或載體。
雖然目前之申請可能將特徵描述作為相同實施例的部分或作為分開的實施例的部分，本申請的範圍亦包含一些 實施例，其包括本文所述之所有或一些特徵。
更進一步解釋本發明於下列實施例中。這些實施例並未限定發明之範圍，而僅是用於闡明本發明。
實施例
實施例1
材料與方法
患者及健康人類材料
研究實驗流程已經過學術醫學中心的醫學倫理委員會核准。所有參與者簽署知情同意書。包含健康的個體及具有血液腫瘤(hematologic malignancies)的患者之參與者由我們的診所招募，其捐贈周邊血液及/或骨髓。
AML特異性選殖株AT14-013的生產
如WO 2015/093949的實施例2所述，AML患者101的經轉導的(transduced)初始及記憶IgG B細胞，其如前述藉由Bcl6及Bcl-xL的導入永生化(immortalized)(Kwakkenbos等人，Nat Med 2010以及WO 2015/093949的實施例1)，以20或40個細胞每井(well)的濃度(此後稱微培養物(microculture))接種(seed)並以IL-21及CD40L擴增。接著篩選擴增的B細胞微培養物的上清液中結合AML細胞系(THP-1、MonoMac6等等)以及結合肝及結腸細胞系的抗體，藉由FACS，利用人類IgG H+L AF647(Life Technologies)或人類-IgG-PE(Southern Biotech)作為二級抗體。許多內部(in-house)產生的抗體被使用作為負對照抗體，例如，抗CD30(表達於活化的B及T淋巴細胞上)、抗CD33(表達於單核球細胞、骨髓先驅細胞及骨髓白血病上)、 D25(針對RSV；如WO 2008/147196中所述)及AT10-002(針對流行性感冒病毒；如WO 2013/081463中所述)。選擇結合AML細胞系但未結合肝及結腸細胞系的微培養物，並以1細胞/井的濃度接種，且再次測試它們的上清液對於AML細胞系的特異性。選擇上清液特異性地結合AML細胞系且未結合肝或結腸細胞系、或健康的PBMC及骨髓之選殖株用於定序。在正常培養條件下於FBS IgG低血清(Hyclone)的存在下擴增選殖株，且從這些培養物的上清液純化之抗體如下述用於重組的抗體。接著再次測試重組抗體的特異性結合。取得的AML特異性抗體之一為AT14-013。額外地測試發現的AT14-013抗體對新確診的AML患者之新鮮分離的芽細胞(FAB M0-M5)的結合，使用人類IgG H+L AF647(Life Technologies)作為二級抗體。
AML特異性抗體AT14-013的選殖
如WO 2015/093949的實施例1所述，為了產生重組抗體，我們以RNeasy®迷你套組(Qiagen)分離總RNA(total RNA)、產生cDNA、實行PCR以及選殖重及輕鏈可變區域至pCR2.1 TA選殖載體(Invitrogen)中。為了排除反向轉錄酶或DNA聚合酶誘發的突變，我們實行多個獨立的選殖實驗。為了產生重組的mAb，我們將每一抗體的重及輕可變區域框架內(in frame)與人類IgG1及κ(Kappa)恆定區一起選殖於pcDNA3.1(Invitrogen)基載體之中，且短暫地轉染(transfect)293T細胞。我們從培養物上清液純化重組的抗體，以Protein A或G，其取決於選殖株的Ig亞型(subtype)。
CDC及ADCC
為了量化AML特異性抗體AT14-013誘發之標靶細胞的補體依賴性細胞死亡(CDC)，我們使用FACS基(FACS-based)白血病細胞溶解分析。以2μM Calcein AM(Becton Dickinson)於37℃培養THP-1細胞30分鐘。將Calcein標記的THP-1細胞與抗體及兔子血清補體於37℃一起培養4小時。以50/50的比例添加FACS校正珠粒(Accudrop Fluorescent Beads,BD Biosciences)於細胞，其後以FACS取得珠粒(beads)的標準量。由於相等的分析體積已藉由校正珠粒確定，死亡細胞的量可被計算為：100-((Dapi陰性，各個處理中的Calcein AM陽性細胞/Dapi陰性，對照組中的Calcein AM陽性細胞)×100)。對於抗體依賴性細胞調節細胞毒性(ADCC)，我們以Jurkat細胞生產讀出系統，所述Jurkat細胞是以NFAT(6x)-IL2(最小啟動子)-GFP及CD16a(FcR-IIIa)穩定地轉導。於此系統中由結合的抗體活化之CD16a受體活化NFAT，其誘發GFP表達，所述GFP表達接著被用作讀出(read-out)，以量化效應細胞(effector cell)活化。將AML細胞(標靶細胞)與抗體一起培養，並與以前述Calcein AM染色之Jurkat細胞(效應細胞)混合。效應物(effector)：標靶的比例為1：1。
AT14-013標靶辨識及確認
以無關的抗體(內部產生的RSV抗體D25)、Protein-G及鏈黴親合素(Streptavidin)珠粒(Pierce)溶解(以蛋白酶及磷酸酶抑制劑(Roche)補充的0,5% Triton X114(Sigma)、150mM NaCl、10mM Tris-HCL pH7.4、1,5mM MgCl2)及預清除(preclear)THP-1細胞，以去除非特異性結合的蛋白 質。接著將預清除的細胞溶解物與結合珠粒的AML特異性抗體或與作為負對照組的流行性感冒病毒特異性抗體AT10-002一起培養(於4℃進行3小時)。於以0,5%脫氧膽酸鈉(Deoxycholate)及0,1% SDS補充的細胞溶解緩衝液中清洗經抗體培養的珠粒5次，從珠粒洗提(elute)結合的蛋白質(0,1M甘胺酸pH10,5、150mM NaCl、1% Triton X100、1mM EDTA)，且接著於SDS-PAGE上進行電泳。85%的IP樣品於SDS-PAGE膠上進行電泳並以Imperial蛋白質染劑(Pierce)進行染色以對總蛋白質染色，並將特定條帶切除用於質譜儀分析。將剩餘的IP樣品於SDS-PAGE上進行電泳，並轉移至PVDF膜(Bio-RAD)用於免疫墨點分析。墨點經由Ponseau S染色以揭示總蛋白質，並以BSA進行阻斷(block)，接著與小鼠-抗CD43(選殖株MEM-59,Abcam)一起培養，用於西方墨點分析。
抗原決定基定位：競爭
將THP-1細胞與AT14-013及商業上可取得的CD43抗體：小鼠抗人類CD43 PE(Ebioscience；選殖株84-3C1)、小鼠抗人類CD43 FITC(Invitrogen；選殖株L10)、小鼠抗人類CD43 FITC(Abcam；選殖株MEM-59)、小鼠抗人類CD43未標記(Abcam；選殖株MEM-59)、小鼠抗人類CD43未標記(Thermo Scientific：選殖株DF-T1)，於冰上預培養60分鐘。最大阻斷抗體濃度為10ug/ml。之後，以1ug/ml的終濃度添加競爭抗體。藉由此步驟，阻斷抗體的終濃度為2ug/ml。於冰上培養細胞30分鐘，其後添加dapi(Sigma)以從分析中排除死亡細胞。藉由流式細胞儀分析樣品。
抗原決定基定位：去糖基化
將THP-1細胞與神經胺酸酶(Roche；稀釋1：20或1：200)於37℃培養60分鐘，以從CD43去除唾液酸(de Laurentiis等人，2011)。接著清洗細胞、於60%正常山羊血清中阻斷並與AT14-013及如上述商業上可取得的CD43抗體DF-T1、84-3C1、L10及MEM-59一起培養。為了能夠比較以不同螢光染料染色之細胞，對未經處理的細胞(沒有神經胺酸酶)之結合設定為1。第10圖所示為對於經神經胺酸酶處理的細胞之結合增加/減少的倍數。
抗原決定基定位：CD43截短變異體
從Geneart(Life Technologies)取得CD43 cDNA並修改為(adapted to)包含3xFLAG標記於框架內(in-frame)於C或N端任一者上(C端於訊號胜肽，包括CD43的前19個胺基酸)。將cDNA選殖於包含CD43 cDNA的IRES-GFP 3’之pHEF-TIG第三代慢病毒載體中；產生VSV-G慢病毒顆粒HEK293T細胞中。在retronectin存在的情況下，以這些病毒轉導THP1、MOLM及其他細胞，並分選GFP以取得過度表達CD43的細胞之單純族群。藉由CD43 C端FLAG標記的cDNA之PCR-選殖建立截短的CD43變異體，以包含訊號胜肽(AA 1-19)接續為野生型全長胞外序列(變異體A：S20-P400，接續為3xFLAG：DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)或截短的胞外序列(變異體B-J)。B：31-400；C：59-40；D：82-400；E：112-400；F：133-400；G：166-400；H：184-400；I：202-400；J：220-400(跨膜域開始於AA 255)。藉由慢病毒轉導及GFP分選，將這些變 異體表達於THP1細胞中。將經分選的細胞溶解(lyse)並與前述之AT14-013及對照組免疫沉澱。將洗提的IP樣品於SDS-PAGE上進行電泳，並以抗-FLAG-HRP(Sigma)進行免疫墨點分析，以揭示結合。
結果
AT14-013特異性結合AML細胞
於此實施例中，我們辨識出AML特異性抗體AT14-013的標靶，抗體AT14-013為我們實驗室最近所開發(WO 2015/093949及第1圖)。此抗體衍生自稱為患者101之患者。他在49歲時被診斷出具有中度風險的AML(沒有細胞遺傳或分子異常；FAB分類AML-M5)。他接受兩個療程的化療(阿糖胞苷(cytarabine)、伊達比星(idarubicine)、安吖啶(amsacrine))以及一個療程的鞏固性化療(白消安(busulphan)、環磷醯胺)接著為自體造血幹細胞移植(HSCT)，因為沒有可得之HLA符合的親族幹細胞捐贈者。在初次診斷後的14個月，他的疾病復發。在一個周期的高劑量阿糖胞苷之後他獲得完全的緩解，其後他接受相符、非親屬捐贈者之降低強度的異基因HSCT(RIST-MUD)。6周後他發展出皮膚、肝臟及腸道的急性GvHD(階段1；程度II)，其對皮質類固醇治療反應良好。有鑑於此患者維持無疾病5年至今，儘管他的疾病之高風險性，此患者可被視為已產生有效的移植物對抗AML反應，其為選擇他作為對有效AML特異性抗體反應之研究的原因。從此名HSCT後38個月的患者取得之放血(phlebotomy)產物分離B細胞，其如前述藉由Bcl6及Bcl-xL的導入永生化(immortalized) (Kwakkenbos等人，Nat Med 2010)，且以20或40個細胞/井(well)的濃度培養。篩選這些微培養物的上清液中結合AML細胞系的，且以1個細胞/井的濃度次選殖(subclone)對AML具特異性的微培養物。透過此流程辨識出的抗體之一為AT14-013，為IgG1 κ(kappa)，高度體細胞超突變抗體。
AT14-013特異性地結合至多種AML細胞系及初級AML細胞，涵蓋所有AML FAB分類，如第2圖所示。於第3圖中，顯示AT14-013結合Kasumi3、SH-2、Molm13及THP-1以及自新確診的患者分離之初級白血病芽細胞的一些代表性例子。此外，AT14-013結合至其他骨髓惡性腫瘤，如來自高風險骨髓造血不良症候群(MDS/RAEB I/II)的AML或芽細胞危象慢性骨髓性白血病(CML)及CML細胞系K562(第4圖)。AT14-013對顆粒球確實顯示一部分的結合，但並未結合淋巴系的健康周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓、胸腺細胞、血液惡性腫瘤或肝臟及結腸的健康或惡性細胞。AT14-013確實結合培養的黑色素細胞及黑色素瘤細胞系(第5圖)。
AT14-013誘發標靶細胞的CDC及ADCC
AT14-013可誘發AML細胞系及初級分離的AML芽細胞之補體依賴性細胞毒性及抗體依賴性細胞毒性(第6圖)。
AT14-013的標靶為CD43的獨特抗原決定基
我們接著辨識AT14-013的標靶。將THP-1細胞溶解物的免疫沉澱(IP)與生物素標記的(biotin-labeled)分選酶標籤之(sortase-tagged)AT14-013一起培養產生~140kDa的條帶。所述條帶具有特異性，由於其未見於THP1細胞溶解物的 AT10-002 IP或Jurkat細胞溶解物IP中(第7圖)。免疫沉澱條帶的質譜儀分析揭示CD43為標靶蛋白質。辨識出3個預期的胞內胜肽，得到7%的蛋白質覆蓋率，未辨識到胞外胜肽由於這些為高度糖基化的。AT14-013結合CD43由西方墨點分析加以確認。簡言之，THP-1及Molm13細胞溶解物與AT14-013或流行性感冒病毒特異性抗體AT10-002免疫沉澱。小鼠-抗CD43(選殖株Mem59)的西方墨點分析確認CD43為AT14-013的結合標靶(第8圖)。
CD43廣泛地表達於健康及惡性細胞上。CD43特異性抗體已被生產且為商業上可取得的，例如，DF-T1、84-3C1、L10及MEM-59。藉由這些抗體，我們確認THP-1細胞的CD43表達(第9a圖)。AT14-013未結合非骨髓細胞，以及相較於其他CD43抗體，AT14-013對各種細胞及細胞系之不同的結合輪廓圖(profile)(第9b圖)之觀察顯示相較其他的CD43抗體，AT14-013辨識不同的CD43抗原決定基。確實地，當我們實行競爭實驗時，THP-1細胞與商業上可取得的CD43抗體及AT14-013一起培養，我們發現這些CD43抗體彼此競爭對THP-1的結合，但未與AT14-013競爭(第9c及9d圖)。值得注意的是，CD43選殖株L10及84-3C1已被描述與彼此競爭(L.Borche等人，2005)；此亦於我們的實驗中證實。
CD43蛋白為高度糖基化的蛋白質(de Laurentiis等人，2011)。CD43抗體Mem59、DF-T1及84-3C1(但沒有L10)結合至唾液酸化的抗原決定基，由於以神經胺酸酶預處理標靶細胞之後，其移除α-N-乙醯神經胺酸(唾液酸)，這些抗體喪失 對CD43的結合(US2010/0234562A1)。於第10圖中，我們證實AT14-013對THP-1細胞的結合在以神經胺酸酶預培養THP-1細胞後亦喪失，顯示AT14-013特異性地結合至CD43之唾液酸化的抗原決定基。
為了更具體地辨識出AT14-013的結合抗原決定基，我們生產10個CD43的Flag標記的胞外截短變異體，其表達於HEK及THP1細胞中。與Mem59或DF-T1一起培養的這些細胞的細胞溶解物的西方墨點分析證實這些抗體結合至位於胺基酸59-82之間相似的抗原決定基(第11a及11b圖)。我們藉由以這些截短變異體轉導之THP1細胞的免疫沉澱測試AT14-013的結合。AT14-013與變異體A-F強烈地反應，與變異體G較小程度地反應，且未與變異體H-J反應，如IP的抗Flag免疫墨點分析所示(第12a及12b圖)。於第12c圖中，我們以抗C端的CD43抗體確認AT14-013的IP。內生性CD43存在於所有樣品中，然而截短的CD43僅存在直到變異體G。因此，我們得到的結論為AT14-013的抗原決定基位在胺基酸133及184之間。
實施例2：對AML芽細胞的結合
材料及方法
使用如實施例1標題“AML特異性選殖株AT14-013的生產”下所述之方法，測試抗體AT14-013對不同細胞的結合。在分析之前，以抗人類CD45(BD)將患者樣品染色。AML細胞被定義為CD45dim。健康的PBMC與抗人類CD3(biolegend)一起染色。藉由ficol密度梯度分離衍生自扁桃腺的多形核細胞。
結果
AT14-013特異性地結合至多種AML細胞系及初級AML細胞，涵蓋所有AML FAB分類，如實施例1及第4圖所示。此外，我們以更廣泛的AML芽細胞測試抗體。其顯示結合至目前測試的所有AML芽細胞，且通常比商業的抗CD43抗體更佳。有趣地，與唾液酸無關(sialic acid independent)的L10抗體於幾乎所有的樣品中結合地最少。此外，以健康的表達CD43的T細胞及衍生自扁桃腺的細胞測試抗體。於此，僅商業的抗體顯示被染色。結果統整於第14圖中。
實施例：ADCC及CDC
除了實施例1及第6圖，進一步實行另一ADCC及CDC實驗。
材料及方法
為了量化AML特異性抗體AT14-013誘發之標靶細胞的抗體依賴性細胞調節細胞毒性(ADCC)以及補體依賴性細胞死亡(CDC)，我們使用FACS基(FACS-based)白血病細胞溶解分析。以10nM的Calcein AM(Becton Dickinson)於37℃培養SH2細胞30分鐘。將Calcein標記的細胞與抗體及健康的周邊血液單核細胞(PBMC；效應物：標靶為50：1)一起培養4小時、或與兔子血清補體於37℃培養1小時。以50/50的比例添加FACS校正珠粒(Accudrop Fluorescent Beads,BD Biosciences)於細胞，其後以FACS取得珠粒(beads)的標準量。由於相等的分析體積已藉由校正珠粒確定，死亡細胞的量可被計算為：100-((Dapi陰性，各個處理中的Calcein AM陽性細 胞/Dapi陰性，對照組中的Calcein AM陽性細胞)×100)。
結果
AT14-013誘發標靶細胞的CDC及ADCC
AT14-013可誘發AML細胞系及初級分離的AML芽細胞之抗體依賴性細胞調節細胞毒性(第15A圖)以及誘發補體依賴性細胞毒性(第15B圖)。
實施例4：抗原決定基定位：CD43截短變異體
除了實施例1及第12圖以外，進一步研究AT14-013的結合抗原決定基。
材料及方法
使用與實施例1相同之方法。從Geneart(Life Technologies)取得CD43 cDNA並修改為(adapted to)包含3xFLAG標記於框架內(in-frame)於C或N端任一者上(C端至訊號胜肽，包括CD43的前19個胺基酸)。將cDNA選殖於包含CD43 cDNA的IRES-GFP 3’之pHEF-TIG第三代慢病毒載體中；產生VSV-G慢病毒顆粒HEK293T細胞中。在retronectin存在的情況下，以這些病毒轉導THP1、MOLM及其他細胞，並分選GFP以取得CD43轉導的細胞之單純族群。藉由CD43的C端FLAG標記的cDNA之PCR-選殖建立截短的CD43變異體，以包含訊號胜肽(AA 1-19)接續為野生型全長胞外序列(變異體A：S20-P400，接續為3xFLAG：DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)或截短的胞外序列(變異體B-J)。B：31-400；C：59-400；D：82-400；E：112-400；F：133-400；F2：148-400；G：166-400；H：184-400；I：202-400；J：220-400(跨膜域開始於AA 255)。 藉由慢病毒轉導及GFP分選，這些變異體表達於THP1細胞中。將經分選的細胞溶解(lyse)並與前述之AT14-013及對照組免疫沉澱。將洗提的IP樣品於SDS-PAGE上進行電泳，並以抗-FLAG-HRP(Sigma)進行免疫墨點分析，以揭示結合。
結果
AT14-013的標靶為CD43的獨特抗原決定基
為了更具體地辨識出AT14-013的結合抗原決定基，我們生產11個CD43的Flag標記的胞外截短變異體，其表達於HEK及THP1細胞中。我們藉由以這些截短變異體轉導之THP1細胞的免疫沉澱測試AT14-013的結合。AT14-013與變異體A-F強烈地反應，與變異體F2較小程度地反應，與變異體G較小程度地反應，且未與變異體H-J反應，如IP的抗Flag免疫墨點分析所示(第16a及16b圖)。於第16b圖中，我們以抗C端的CD43抗體確認AT14-013的IP。內生性CD43存在於所有樣品中，然而截短的CD43僅存在直到變異體F2。因此，我們得到的結論為AT14-013的抗原決定基包括一或多個胺基酸殘基，其存在胺基酸133及165之間。有鑑於AT14-013與變異體F2較小程度地反應(開始於胺基酸位置148，如第13圖所示)，我們亦得到AT14-013的抗原決定基包括一或多個胺基酸殘基，其存在胺基酸133及147之間的結論。
實施例5：AT14-013抑制AML體內(in vivo)
目前已知的實驗流程，例如，如Miller等人，Blood(2013),Vol.121,No.5,e1-e4中所述。
為了評估AT14-013於體內(in vivo)對抗AML之效 率，處理以人類造血細胞重建(reconstitute)及以SH2細胞異種移植(xenograft)之人源化小鼠。藉由注射50 000 CD34+CD38-造血幹細胞於尚不致命地輻射新生兒(sublethaly irradiated newborn)(1-5天大)的肝臟中，人源化6隻雌性NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtm1Wj1/SzJ(NSG，The Jackson Laboratory)。於8星期時，將小鼠放血以評估它們血液中人類造血細胞的植入(engraftment)。於此實驗中，僅使用具有高於20%的人類嵌合現象(chimerism)於周邊血液中的小鼠。6隻小鼠中的5隻符合此標準，且在d0靜脈內地接種10x106表達螢光素酶及GFP之SH-2細胞。於d14，以螢光素(150mg/kg)IP注射小鼠並藉由體內生物螢光偵測腫瘤的植入。依據此測量，小鼠隨機地被分為2組且接著藉由iv接種AT14-013或抗體AT10-002(針對流行性感冒病毒，如WO 2013/081463中所述，作為對照組)(375μg)一周兩次給藥。每星期測量生物螢光，如前述。於d39，在深度麻醉下藉由頸椎脫位犧牲小鼠，且使器官暴露並定量生物螢光。取得肝臟及骨髓的單細胞懸浮液，且藉由FACS定量SH-2 GFP+細胞的存在。以SH-2 AML細胞植入老鼠的處理造成90.3%的腫瘤生長抑制，其於犧牲時藉由全身測量進行量測(p<0.001，重複ANOVA，第17A圖)。AML細胞的數量，其是藉由每分鐘的光子量(cpm)進行測量，在所有測量的器官中均顯示大幅減少(p=0.0011，重複二因子ANOVA，第17B圖)。藉由FACS於骨髓及肝臟評估腫瘤細胞的數量證實此觀察(p=0.0017，二因子ANOVA，第17C圖)。
因此，對於本發明之CD43胜肽具特異性之抗子特 別地適合用於骨髓增生或淋巴球增生疾病(如AML)的體內治療或預防。
實施例6
材料及方法
從位於AMC的His Mouse Facility(根據荷蘭法律：Wet Foetaal Weefsel)取得懷孕期第16及21周之間的胎兒肝臟、骨髓及胸腺組織。藉由全器官的Stomacher細胞製備接續密度梯度離心及磁珠分離，以取得富含CD34的單核細胞懸浮液。藉由密度梯度離心及磁珠分離製備胎兒骨髓之富含CD34的單核細胞懸浮液。
藉由流式細胞儀測量抗體AT14-013對來自胎兒肝臟、胎兒胸腺及胎兒骨髓之細胞的結合，使用商業上可取得的CD34(BD,cat.343516)及CD38(BD,cat.303522)抗體以區分出這些樣品中不同的子集(subset)。
結果
AT14-013特異性結合CD43的癌胎(oncofetal)抗原決定基
如前文所述，AT14-013為CD43特異性抗體，其辨識主要由AML及MDS芽細胞所表達之獨特、癌-唾液酸化的(onco-sialylated)腫瘤抗原。腫瘤抗原不是具有腫瘤特異性表達的異常蛋白質就是異常表達的正常細胞，例如癌胎抗原，其正常地為僅在個體發育時由胎兒組織所表達之抗原。
細胞的腫瘤轉化(neoplastic transformation)通常與癌胎抗原的表達相關。我們發現從胎兒肝臟及胎兒骨髓取得之CD34+ CD38-骨髓幹細胞表達CD43的AT14-013抗原決定基， 但從胎兒肝臟及胎兒骨髓取得之CD34+ CD38+先驅細胞或CD34- CD38-成熟細胞不表達(第18圖)。這些結果顯示AT14-013能夠結合CD43的癌-唾液酸化的抗原決定基，其在成人中廣泛地由AML及MDS所表達。
實施例7
捐贈者#101(與取得產生AT14-013的B細胞之捐贈者相同)的AML芽細胞與AT14-013及與對CD34及CD38具特異性的抗體(與實施例6的步驟相同)、以及與針對CD45的抗體(BD，cat 348815)一起被染色以辨別骨髓中的整體芽細胞族群(CD45 dim)及健康的細胞，並藉由流式細胞儀分析(第19圖)。此顯示AT14-013結合患者的白血病芽細胞，其被發現於，包含白血病幹細胞中，定義為CD34+CD38-芽細胞。
從而得到的結論為，抗體AT14-013與自體白血病幹細胞反應，使得AT14-013特別地適合用於骨髓增生或淋巴球增生疾病的治療或預防，因為它亦標靶白血病幹細胞，其已知較具治療抗性且常為治療後的疾病復發之原因。
於此，接續為另一抗體，其對發明之CD43胜肽具有特異性，例如，與抗體AT14-013競爭結合CD43之抗體，亦特別地適合用於骨髓增生或淋巴球增生疾病的治療或預防。
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美國專利申請號9,005,974

Claims (28)

  1. 一種經分離、重組或純化的CD43胜肽，其具有至多100個胺基酸殘基之長度，其中該胜肽包括一胺基酸序列，該胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多51個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及184之間的序列相同。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之經分離、重組或純化的一CD43胜肽，其中該胜肽包括一胺基酸序列，該胺基酸序列具有至少3個胺基酸殘基及至多33個胺基酸殘基之長度與位在如第13圖所示之CD43胺基酸位置133及165之間的序列相同。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之一CD43胜肽，其中該胜肽包括胺基酸序列GTITTNSPETSSRTSGAPVTTAASSLETSRGTS。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之一CD43胜肽，其為經糖基化的。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之一CD43胜肽，其包括唾液酸殘基。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之經糖基化的一CD43，其為神經胺酸酶敏感的(neuramidase-sensitive)。
  7. 一種化合物，包括如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽。
  8. 一種經分離、合成或重組的核酸分子或其功能等效物，其編碼出如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽。
  9. 一種載體，包括如申請專利範圍第8項所述之核酸分子或功能等效物。
  10. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽、或如申請專利範圍第7項所述之化合物、或如申請專利範圍第8項所述之核酸分子或功能等效物、或如申請專利範圍第9項所述之載體的用途，其係用於產生、結合、偵測及/或取得一免疫細胞及/或一抗體、或其功能性部分或功能等效物。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其係用於產生、結合、偵測及/或取得能夠特異性地結合骨髓增生或淋巴球增生細胞之一免疫細胞及/或一抗體、或其功能性部分或功能等效物。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中所述骨髓增生細胞為急性骨髓性白血病(AML)細胞、或骨髓造血不良症候群(MDS)細胞、或慢性骨髓性白血病(CML)細胞。
  13. 如申請專利範圍第10至12項中任一項所述之用途，其中所述抗體具有抗體依賴性細胞調節細胞毒性(ADCC)誘發活性及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
  14. 一種經分離、重組或純化的抗體、或其功能性部分或功能等效物，其與抗體AT14-013競爭結合CD43。
  15. 一種免疫組合物，包括如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽、或如申請專利範圍第7項所述之化合物、或如申請專利範圍第8項所述之核酸分子或功能等效物、或如申請專利範圍第9項所述之載體。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之一免疫組合物，其中所述組合物為一醫藥組成物，其亦包括一醫藥上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑。
  17. 一種診斷套組，包括如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽、或如申請專利範圍第7項所述之化合物，以及一用於偵測抗體或免疫細胞之工具。
  18. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽、或如申請專利範圍第7項所述之化合物、或如申請專利範圍第8項所述之核酸分子或功能等效物、或如申請專利範圍第9項所述之載體作為藥品、或預防性試劑、或半預防性試劑之用途。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之一CD43胜肽、或一化合物、或一核酸分子、或功能等效物、或載體之用途，其中所述預防性試劑或半預防性試劑是用於MDS、AML或CML患者。
  20. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽、或如申請專利範圍第7項所述之化合物、或如申請專利範圍第8項所述之核酸分子或功能等效物、或如申請專利範圍第9項所述之載體用於免疫療法之用途。
  21. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽、或如申請專利範圍第7項所述之化合物作為診斷試劑之用途。
  22. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽、或如申請專利範圍第7項所述之化合物用於診斷AML 之用途。
  23. 一種用於測定一個體是否具有AML之方法，該方法包括使如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽、或如申請專利範圍第7項所述之化合物與所述個體之抗體及/或免疫細胞接觸，以及測定所述CD43胜肽或所述化合物是否被所述個體之抗體及/或免疫細胞的至少一者結合。
  24. 一種用於產生一免疫細胞及/或抗體之方法，所述免疫細胞及/或抗體能夠特異性地結合淋巴球增生細胞及/或骨髓增生細胞，較佳為AML特異性免疫細胞或AML特異性抗體，該方法包括以如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之CD43胜肽、或如申請專利範圍第7項所述之化合物、或如申請專利範圍第8項所述之核酸分子或功能等效物、或如申請專利範圍第9項所述之載體使一非人類動物免疫。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之一方法，更包括從所述非人類動物收集一免疫細胞及/或抗體，其能夠特異性地結合淋巴球增生細胞及/或骨髓增生細胞，較佳為AML特異性免疫細胞或AML特異性抗體。
  26. 一種抗體或免疫細胞，其可藉由如申請專利範圍第24或25項所述之方法取得。
  27. 一種基因輸送載具，包括如申請專利範圍第8項所述之核酸分子或功能等效物。
  28. 一種宿主細胞，包括如申請專利範圍第8項所述之核酸分子或功能等效物、或如申請專利範圍第9項所述之載體、或如申請專利範圍第27項所述之基因輸送載具。
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