[0002]
隨著人口逐漸老化，視力的惡化越趨明顯及嚴重。有許多與老化密切相關眼疾，例如青光眼、老年性黃斑部病變(AMD)，視神經病變、缺血性視網膜病變、老年性白內障等。這些眼疾是引起視力障礙，甚至老年人失明的主要疾病。[0003]
視網膜色素上皮細胞(RPE)係由單層細胞構成，並位於視網膜感光受器以及脈絡膜血管間，其對於機械性及代謝性支持感光受器上扮演著重要角色。此外，RPE的功能障礙是造成某些眼疾的主因，例如增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、葡萄膜炎以及AMD。AMD及其他疾病，例如糖尿病性視網膜病變(DR)，很可能與由光或代謝反應衍生的氧自由基的效應息息相關。[0004]
另一方面，眼部血流量亦與許多眼疾密切相關，包括青光眼、缺血性視網膜病變、以及老年性黃斑部病變(AMD)。因此，維持正常的眼部血流量對於預防/治療前述眼疾而言是必須的。[0005]
在美國及西歐，超過65歲的人中，老年性黃斑部病變(AMD)是導致眼盲的主要原因。在兩大洲中常見的危險因子包括年齡增加、吸煙、高血壓、心絞痛以及陽性家族史。AMD以非滲出及滲出兩種形式存在。非滲出型涉及中央視網膜萎縮以及中央視力緩慢及漸進的損失。滲出性型的特徵在於，新血管生長穿過布魯赫膜(Bruch’s membrane)而進入視網膜下腔，以及經由血管生成的過程而發展的脈絡膜血管新生(CNV)。血管生成時常由缺血及缺氧所誘發。因為黃斑部僅具有單一的血液供應，而在體內視網膜具有最高的氧氣攝取量，因此，觀察到缺血與AMD的發展有強烈的關聯性並不令人意外(Strauss O., Physiol. Res. 2005; 85(3):845-881)。[0006]
由於上皮在氧氣張力以及與氧氣自由基有關的壓力下極為脆弱，在與缺血有關的疾病過程中，RPE內所產生的活性氧族群(ROS)可能對於RPE細胞造成損傷。AMD的一個重要的“早期”事件為，因為氧化損傷而造成RPE細胞的損失。氧化壓力被確認可涉及數種與老化相關的慢性疾病的病因，例如癌症、糖尿病、神經退化疾病及心血管疾病。[0007]
蜂膠是一種由蜜蜂從樹芽、果實、樹液、或其他植物來源所收集的樹脂混合物。來自不同區域的蜂膠可以含有不同的活性成份。據報導，其具有不同的活性成份，並表現出廣泛的生物學活性，包括抗腫瘤(Ahnet al.
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[0025]
本發明係基臺灣蜂膠(TP)萃取物可有效治療眼疾此不可預期之發現。本發明係關於一種TP萃取物的特定實際應用，亦即其在治療及/或預防眼疾的用途。[0026]
在一方面，本發明提供一種在有需要的個體中治療眼疾的方法，其包含對該個體投予有效量的臺灣蜂膠(TP)萃取物。在特定具體實施例中，所述臺灣蜂膠為臺灣綠蜂膠。[0027]
本文所使用的術語「蜂膠」係指由蜜蜂所製造的產物。已知蜂膠是一種由蜜蜂從樹芽、樹液、或其他植物來源所收集的樹脂混合物，作為蜂巢中不必要空間的密封材料。本發明使用由臺灣蜜蜂所製造的蜂膠(臺灣蜂膠)。自公元前300年開始，蜂膠已被用來作為一種民間用藥。最近，已報導許多蜂膠的生物學性質，包括抗癌、抗病毒、及抗微生物。因為廣泛的生物學活性，蜂膠已被用於食品及飲料中，藉以改善健康及預防疾病。蜜蜂收集來自不同溫帶氣候區的不同植物上的蜂膠，使得蜂膠的成份具有地域性。臺灣蜂膠中含有豐富的蜂膠素(propolin)，其具有異戊烯基二氫黃酮(prenylflavanone)的核心化學結構。與臺灣蜂膠類似的蜂膠也可以在沖繩、所羅門群島中發現(稱為「太平洋蜂膠」)。[0028]
根據本發明，TP萃取物(TPE)為一種TP的水萃取物或酒精萃取物，或者一種等同物或適當溶劑系統的萃取物。[0029]
可藉由包含以下步驟的方法製備本發明所使用的TPE：(i) 以第一溶液萃取TP 12-60小時以獲得一第一萃取物；(ii) 收集該第一萃取物的可溶性部分；以及(iii) 濃縮該可溶性部分2-10次以獲得粗TPE(cTPE)。該第一溶液包括但不限於水或酒精溶液。該酒精溶液較佳含有50-100%的酒精，更佳地為80-100%，又更佳地為95%。在本發明的一具體實施例中，可藉由包含以下步驟的方法製備TPE：(i) 以95%乙醇萃取TP約48小時以獲得一第一萃取物；(ii) 過濾酒精，並從該第一萃取物中移除固體以獲得可溶性部分；以及(iii) 在減壓下濃縮該可溶性部分約4次以獲得cTPE。步驟(i)中，萃取溫度較佳為35-60o
C，更佳為40-50o
C，最佳為45o
C。步驟(iii)中，濃縮溫度較佳為35-50o
C，更佳為45-50o
C。步驟(iii)中，較佳濃縮該可溶性部分3-5次，更佳為約4次。檢測每個cTPE中多個標準成份的含量，而其規格為，每克的cTPE含有不少於100 mg的蜂膠素C、80 mg的蜂膠素D、30 mg的蜂膠素F以及50 mg的蜂膠素G，然後進行摻混而獲得最終符合標準的TP萃取物(TPE)，其具有所需的標準成份總含量規格為，每克含有不少於350 mg的蜂膠素(包括蜂膠素C、D、F及G，以及其他蜂膠)。[0030]
cTPE以及最終的TPE可用於本發明中。[0031]
本文所使用術語「眼疾」係指一種與眼部相關的疾病，包括但不限於青光眼、老年性黃斑部病變(AMD)、缺血性視網膜病變、視神經病變、糖尿病性視網膜病變(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、葡萄膜炎、以及老年性白內障。眼疾可以是一種與氧化壓力及/或缺氧誘導損傷相關的眼部疾病或病症，更具體地為視網膜色素上皮細胞(RPE)及光細胞，包括但不限於青光眼、AMD、缺血性視網膜病變、視神經病變、DR以及DME。眼疾可以是一種與眼部血流量減少相關的疾病或病症，包括但不限於光眼、缺血性視網膜病變、DR以及AMD。[0032]
如本文所使用的術語「有效量」係指一足夠量的臺灣蜂膠萃取物或其活性成份，其可提供所需的治療效果，或誘導特定的反應。所需的有效量因個體而有所不同，取決於個體的疾病狀態、身理條件、年齡、性別、物種及重量等而定。然而，本領域技術人員僅使用常規的試驗方法即可確認適當的有效量。在本發明的一具體實施例中，所述有效量為可有效提高遭受氧化壓力及/或缺氧誘導損傷的RPE細胞的存活率的量。在一較佳具體實施例中，所述有效量為可有效提高遭受氧化壓力及/或缺氧誘導損傷的RPE細胞的存活率，且同時對人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的存活率影響微小或無影響，或可有效降低HUVECs的存活率的量。在本發明的另一具體實施例中，所述有效量為可有效增加眼部血流量的量。在又一具體實施例中，所述有效量為可有效降低脈絡膜血管新生(CNV)的量。在另一具體實施例中，所述有效量為可有效增強RPE功能的量，藉由至少增強或恢復其c-波振幅（以ERG測量）。舉例而言，可將TPE口服地投予至個體，每天1-3次。針對每次口服給藥，TPE的劑量可為10-200 mg，較佳地為10-120 mg。亦可經由眼科給藥方式將將TPE投予至個體，一次1-10施用量，一天1-10次，較佳地為一次1-5施用量，一天1-4次。舉例而言，每次可使用包含TPE的製劑3滴，一天3次。針對局部眼科給藥，可使用0.01-10%的TPE，較佳可使用0.1-1.0%的TPE。[0033]
在本發明的實例中，證實TPE能有效地治療各式眼疾，例如缺血性損傷後的視網膜功能障礙，以及雷射誘導的AMD。[0034]
因此，可將TPE投予至患有眼疾的個體，其中該眼疾係選自於由青光眼、老年性黃斑部病變(AMD)、缺血性視網膜病變、視神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、葡萄膜炎以及老年性白內障所組成的群組中。在本發明的一實例中，該眼疾為AMD。在一特定具體實施例中，該眼疾為乾性AMD。該眼疾可為或非為一眼癌。[0035]
另一方面，本發明提供一種用於治療眼疾的醫藥組合物，其包含臺灣蜂膠(TP)萃取物，以及一醫藥上可接受之載體。[0036]
本發明之醫藥組合物可藉由習知之方法以一或多種醫藥上可接受之載體來製備。本文所使用的術語「醫藥上可接受之載體」包含任何標準的藥物載體。該類載體包括但不限於：鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、丙二醇，聚氧乙烯蓖麻油、奈米粒子、脂質體、聚合物及其組合。[0037]
本發明之醫藥組合物可調制為適用於所選擇的任何給藥模式的形式。舉例而言，適合於口服給藥的組合物包括固體形式，如丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑及粉劑，以及液體形式，如溶液、糖漿、酏劑及懸浮劑。用於局部給藥的形式包括乳膏、軟膏、凝膠、懸浮液、滴劑、乳劑、經皮貼片。[0038]
除了標準載體外，本發明的口服用醫藥組合物可輔以一或多種賦形劑，其係通常用於口服製劑中，如界面活性劑、吸入劑、增溶劑、穩定劑、乳化劑、增稠劑、著色劑、甜味劑、調味劑及防腐劑。此類賦形劑係本領域中的技藝人士所習知。[0039]
根據本發明，該醫藥組合物可經由例如口服給藥、胃腸外注射、眼注射(例如，玻璃體內注射)、經皮貼片、或對眼睛局部給藥的任何途徑進行給藥。用於局部給藥的醫藥組合物可配製為眼膏劑、眼膠劑、眼霜劑或眼藥水的形式。[0040]
通過以下實例進一步說明本發明，該等實例係以示例之目提供，而非限制之目的。[0041] 實例 [0042] 實例 1 ： TPE 對於抗氧化作用的影響 [0043]
本研究探討了TP對於因氧化壓力及缺氧誘導而造成視網膜色素上皮(ARPE-19)細胞損傷的影響，以及ROS參與此影響的情況。[0044]
眾所周知，從氧化反應產生的自由基與血管及神經元細胞的病理表現以及在自體免疫性糖尿病中胰島功能障礙及/或破壞密切相關(J. Lancaster, Jr., Nitric Oxide, Principles and Actions, Academic Press, 1996)。血管功能障礙可能導致眼部青光眼、AMD、以及視網膜缺血，而神經元障礙則可能會導致青光眼和視神經病變。至於免疫性糖尿病，其可能會造成糖尿病性視網膜病變(DR)以及糖尿病性黃斑水腫(DME)。因此，抗氧化劑對於預防/緩解上述眼疾非常有用。[0045] 材料與方法 [0046]
1. 材料[0047]
在實驗室中製備TP萃取物 (TPE)。在45o
C加熱及攪拌下，以95%乙醇(6 L)萃取臺灣蜂膠或臺灣綠蜂膠(1 kg) 48小時。將酒精濾除並移除不純物後，在減壓下濃縮液體萃取物4次，而產生臺灣蜂膠粗萃取物(cTPE)，其萃取率約50% w/w。因為各cTPE的組成每批皆不同，因而檢測每個cTPE中許多標準成份的含量，而其規格為，每克的cTPE含有不少於100 mg的蜂膠素C、80 mg的蜂膠素D、30 mg的蜂膠素F以及50 mg的蜂膠素G，然後進行摻混而獲得最終符合標準的TP萃取物(TPE)，其具有所需的標準成份總含量規格為，每克含有不少於350 mg的蜂膠素。[0048]
溴化噻唑藍四氮唑(Thiazolyl blue tetrazolium bromide)(MTT，純度 ≥ 97.5%)、杜氏磷酸鹽緩衝液(Dulbecco’s phosphate buffered saline；DPBS)、過氧化氫(H2
O2
，50 wt.%水溶液)、叔丁基过氧化氫 (t-BHP，70 wt.%水溶液)、碘酸鈉(NaIO3
，純度≥99.5%)、疊氮化鈉(NaN3
，純度≥99.5%)以及Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s F12 (DMEM /F12，1：1)全部係購自Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。人類視網膜色素上皮(ARPE-19)細胞、人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)、胎牛血清(FBS)、血管細胞基礎培養基和內皮細胞生長套組係購自ATCC (Manassas, VA, USA)。[0049]
人類視網膜色素上皮(RPE)細胞是為位於光細胞與脈絡膜層之間的關鍵/獨特細胞，以提供養分予光細胞，並將代謝廢棄物從光細胞處移除以維持正常/良好的視覺功能/活性。另一方面，HUVECs係位於全身的脈管中，包括脈絡膜及視網膜血管。藉由脈絡膜血管新生而使其特別有礙於視覺功能。以VEGF抑制劑抑制血管新生為降低血管生成/血管新生而用於治療濕性AMD的主要機制。因此，可促進RPE細胞增生/生長，但對於HUVECs細胞生長無效果或呈抑制作用的藥劑可能有用於預防/治療AMD。[0050]
2. 細胞培養[0051]
使ARPE-19細胞生長於補充了10% FBS、100 units/ml青黴素G、以及100 µg/ml 硫酸鏈黴素的DMEM/F12培養基中。使HUVECs生長於補充了內皮細胞生長套組的血管細胞基礎培養基中。將細胞培養於37ºC下含5% CO2
及95%空氣的增濕培養箱中。[0052]
3. ARPE-19細胞及HUVECs的存活率[0053]
使用MTT檢測法量測 ARPE-19細胞或HUVECs的存活率。將1×105
個細胞播種於96-孔培養盤中 (100 µl/孔)，並使其生長過夜。藉由添加不含細胞的100 µl培養基，作為陰性對照組。接著，以含有TP萃取物(TPE) (0.1、0.3、1、3及10 µg/ml)及/或氧化劑(NaIO3
、H2
O2
、t-BHP及NaN3
)的新鮮培養基處理細胞12、24、或72 hours (200 µl/孔)。載體控制組係以載體處理(30% HP-β-CD，HP-β-CD在細胞中的最終濃度小於0.3%)。在培養孔中添加20 µl MTT (5 mg/ml)，並另外培養4小時。經培養後，移除培養基並加入100 µl DMSO使由存活細胞中MTT所產生的三苯基甲臢(formazan)溶解。使用微量盤分析儀(Bio-Rad Laboratories, Inc., CA測量在570 nm的吸光值。根據以下公式計算細胞存活率：細胞存活率(%) = (測試樣本的吸光值 – 陰性對照組的吸光值)/(載體對照組的吸光值 – 陰性對照組的吸光值) × 100%。[0054]
4. 缺氧處理[0055]
使細胞貼附過夜，然後在缺氧環境下使其暴露於TPE或載體中72小時。使用搭配O2
及CO2
控制器且具有N2
及CO2
氣體來源的可控制溫度及濕度環境的C-腔室(Proox Model 110 and Pro CO2
Model 120, Bio Spherix Ltd., Redfield, NY, USA)維持缺氧環境(1% O2
、5% CO2
及94% N2
)。[0056]
5. 統計分析[0057]
所有數據以平均值 ± S.E.M表示. 使用學生t檢定進行統計分析。 P ＜ 0.05 被認為具有統計顯著性。[0058] 結果 [0059]
1. ARPE-19細胞及HUVECs的細胞毒性[0060]
結果顯示，在0.03、0.1、0.3、1及10 µg/ml的濃度下，TP萃取物(TPE)並不會影響ARPE-19細胞的增生效果。然而，在3 µg/ml的濃度下， ARPE-19細胞的增生效果提高21%(P
＜ 0.05，圖 1A
)。另一方面，在0.3及10 µg/ml的濃度下，TPE分別顯著地抑制HUVECs的增生效果達18%及99% (圖1B
)。[0061]
2. TPE對於ARPE-19細胞及HUVECs中缺氧誘導損傷的影響[0062]
在缺氧環境下，從0.03 µg/ml至10 µg/ml的TPE對於ARPE-19細胞的存活率無影響(圖 2A
)。在缺氧環境下，濃度為0.1 µg/ml的TPE可顯著地提高HUVECs的存活率(P ＜ 0.05，圖 2B
)。然而，在10 µg/ml的濃度下，TPE可顯著地降低HUVECs的存活率達96% (P ＜ 0.01)。[0063]
3. TPE對於ARPE-19細胞及HUVECs中NaIO3
誘導損傷的影響[0064]
NaIO3
誘導損傷是一種乾性AMD的模型。從0.03 µg/ml至3 µg/ml， TPE對於因NaIO3
所誘導損傷的ARPE-19細胞或HUVECs存活率無影響。在10 µg/ml的濃度下，TPE可反轉因30及100 µg/ml的NaIO3
所誘導損傷的ARPE-19細胞存活率(P＜0.05，圖 3A
)，然而，增強因NaIO3
所誘導的HUVECs損傷(P＜0.01，圖 3B
)。[0065]
4. TPE對於ARPE-19細胞及HUVECs中H2
O2
誘導損傷的影響[0066]
H2
O2
誘導損傷是一種氧化損傷的模型。從0.03 µg/ml至10 µg/ml， TPE可反轉因200 µM的H2
O2
所誘導的ARPE-19損傷。特別是在10 µg/ml 的濃度下，TPE可反轉因200 µM的H2
O2
所誘導的ARPE-19損傷達60%(P＜0.01，圖 4A
)。另一方面，從0.03 µg/ml至3 µg/ml 的TPE對於因H2
O2
所誘導的HUVECs損傷無影響。然而，10 µg/ml 的TPE可分別增強因200、400及600 µM的H2
O2
所誘導的HUVECs損傷達93%、86%及58%(圖 4B
)。[0067]
5. TPE對於ARPE-19細胞及HUVECs中NaN3
誘導損傷的影響[0068]
NaN3
誘導損傷是另一種氧化損傷的模型。從0.03 µg/ml至1 µg/ml 的TPE對於因NaN3
所誘導的ARPE-19細胞損傷無影響。在3及10 µg/ml的濃度下，TPE可顯著地反轉因NaN3
所誘導的ARPE-19損傷(P＜0.01，圖 5A
)。在0.03、0.1及1 µg/ml的濃度下，TPE可顯著地反轉因0.3 mM的NaN3
所誘導的HUVECs損傷。然而，10 µg/ml可增強因0.3 mM的NaN3
所誘導的HUVECs損傷達84% (P＜0.01，圖 5B
)。雖然0.03、0.3及3 µg/ml 的TPE反轉了因1 mM的NaN3
所誘導的HUVECs損傷，而10 µg/ml則增強因1 mM的NaN3
所誘導的HUVECs損傷達75% (P＜0.01，圖 5B
)。[0069]
6. TPE對於ARPE-19細胞及HUVECs中t-BHP誘導損傷的影響[0070]
t-BHP誘導損傷亦是另一種氧化損傷的模型。在3及10 µg/ml的濃度下，TPE可顯著地反轉因50及100 µM的t-BHP所誘導的ARPE-19細胞損傷(P＜0.01，圖 6A
)。從0.03 µg/ml至10 µg/ml 的TPE可反轉因200 µM的t-BHP所誘導的ARPE-19細胞損傷(圖 6A
)。特別是在10 µg/ml的濃度下，TPE反轉了因200 µM的t-BHP所誘導的ARPE-19細胞損傷達105% (P＜0.01，圖 6A
)。然而，10 µg/ml的TPE則分別增強因50及100 µM的t-BHP所誘導的ARPE-19細胞損傷達77%及73%(P＜0.01，圖 6A
)。圖 6B
顯示TPE對於HUVECs的影響。[0071] 實例 2 ：眼球血流量 (OBF) 的增強 [0072]
眼部血流量係緊密地關聯於多種眼部疾病，包括青光眼、缺血性視網膜病變、糖尿病性視網膜病變及老年性黃斑部病變(AMD)。因此，維持正常的眼球血流量對於預防/治療前述眼部疾病而言是必要的。[0073] 材料與方法 [0074]
1. 材料[0075]
採購0.5%的愛爾卡因(Alcaine)市售品。於實驗室製備20%滅菌的高張鹽水溶液。由E-Z Trac (Los Angeles, CA)採購有色微球體。以含有0.01% (v/v) Tween 80的鹽水稀釋有色微球體以防止其互相黏聚。在每個時間點下以注射每0.4 ml含2百萬個微球體的溶液。[0076]
重量為2-3.0公斤的紐西蘭雌兔由市售購得。動物照護及處理係依照相關制度的指導準則進行。根據實例 1
製備TP萃取物 (TPE)。[0077]
2. 方法[0078]
以35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg甲苯噻嗪藉由肌內注射麻醉兔子。在之後，每一小時給藥初始劑量的一半。經由右頸動脈插管至左心室，以進行有色微球體的注射，而在股動脈上插管以收集血液樣本。在左眼處以一滴鹽酸丙美卡因眼藥水(Bausch & Lomb, Inc., Tampa, FL, USA)處理。針直接插入左眼的前室中，並使其連接於40 mmHg的食鹽水壓力計上。高眼壓模型使眼球血流量降低至約正常值的三分之一。在建立高眼壓模型後30分鐘，取10g/l的黃酮或載體(30% HP-β-CD溶液)50µl局部灌輸於左眼。以TPE或載體處理並經0、30、60及120分鐘後以有色微球體測量眼球血流量。在每個時間點，注射2百萬個微球體作為對照，在微球體注射剛好一分鐘後，從股動脈收集血液樣本。將血液樣本收集在肝素化的試管中，並記錄體積。於最終血液取樣後，注射100 mg/kg戊巴比妥鈉使兔子安樂死。摘除左眼，並解剖成虹膜、睫狀體、視網膜及脈絡膜。秤重所有組織。[0079]
由E-Z Trac (Los Angeles, CA, USA)提供所有樣本處理及微球體計數的操作細節。簡言之，加入血液溶血試劑至含有血液樣本的微量離心管中，然後震盪混合並在6000 rpm下離心30分鐘。 移除上清液，然後添加組織/血液消化試劑I及II。在試管上加蓋，然後震盪混合並離心30分鐘。移除上清液，添加計數試劑，震盪混合後離心15分鐘。移除上清液，以精確體積的計數試劑重新懸浮微球體。在顯微鏡下以血球計數器計算微球體的數目。將組織/血液消化試劑I加入含有組織樣本的微量離心管中，密封並在95º C下加熱15分鐘。然後，震盪混合試管30秒，再加熱並再震盪混合，直到組織樣本完全溶解。在組織樣本仍處於高溫下，加入組織/血液消化試劑II，然後在試管上加蓋、震盪混合並離心30分鐘。其後的操作程序與處理血液樣本一樣，並進行微球體計數。[0080]
根據以下公式計算在某個時間點下每個組織的血流量：Qm = (Cm x Qr)/Cr。Qm是組織的血流量，單位為µl/min/mg，Cm是組織中微球體的數量，Qr是血液樣本的流速，單位為µl/min，而Cr則為在對照血液樣本中的微球體數量。[0081] 結果 [0082]
在灌輸藥物120分鐘後，1%的TPE可使虹膜、睫狀體及脈絡膜的血液流量顯著提高(圖 7A-7C
)。[0083] 實例 3 ：缺血性損傷後視網膜功能的促進 [0084]
單獨量測眼內壓(IOP)不應該是診斷青光眼的唯一決定因素，單獨降低IOP不應該是新藥開發的唯一評估法(Chiouet al.
, Ophthalmic Res.
18:265-269, 1986)。理想的抗青光眼藥劑應該能降低IOP，並可改善眼部血流量(Honget al.
, J. Ocular Pharmacol. 9:117-124, 1993)。在眼睛不同部位的血流量研究不僅會提供對於藥物作用機制的理解，亦可有利於更安全的抗青光眼藥物的開發(Chiouet al.
,Ophthalmic Res.
18:265-269, 1986)。此外，僅次於青光眼，視網膜退化是導致失明的主要原因(Lierman, Mary Ann Liebert, Inc., New York, NY, 1987)。大多數視網膜病變是由缺血性退化所造成，即便已經試驗了多種藥劑，包括血管舒張劑、抗凝血劑及血液減粘劑，仍是難以治療此病症(O’Connor, Medcom, Inc., New York, NY, 1974)。迄今為止，這些試劑中並沒有似乎可用於缺血性視網膜病變(LaVailet al.
,Alan R. Liss, Inc., New York, NY, 1985)。因此，開發一種可用於治療缺血性視網膜退化的新藥劑是重要的。缺血後視網膜功能的恢復可以藉由視網膜電流圖中的b波振幅的回復來確定。除了青光眼外，這些可促進視網膜功能恢復的藥劑亦可有利於治療AMD、DR及DME。[0085] 材料與方法 [0086]
1. 材料[0087]
根據實例 1
製備TP萃取物 (TPE)。[0088]
2. 方法[089]
先前文獻已說明視網膜缺血試驗(Chiou et al., J. Ocular Pharmacol. 9:179-185, 1993, and Chiou et al., J. Ocular Pharmacol. 10:493-498, 1994)。進行視網膜電流圖(ERG)評估在缺血損傷前後的視網膜功能。使用與角膜接觸的Ag/AgCl電極紀錄ERG。將一根不銹鋼針頭插入兩眼間的皮下處當作參考電極，另一根針則插入頸部皮下處作為接地電極。使用光刺激器(Grass PS22 Flash)在離眼睛5英吋處產生閃光，以波動掃描器紀錄ERG電位。ERG系統係購自LKC Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD)。使用白光刺激的單道閃光(10毫秒)引起ERG的a-及b-波。由a-波的波谷至b-波的波峰處測量b-波的波峰振幅。[090]
使Long-Evans大鼠(200-250 g)於暗處適應至少2小時，接著以肌肉內注射氯胺酮(35 mg/kg)加上甲苯噻嗪(5mg/kg)進行麻醉。每間隔一小時給藥初始劑量的一半以維持適當的麻醉狀態。以1%的托吡卡胺(50 µl)使瞳孔擴張，以利進行ERG試驗。使用置於視神經及睫狀後動脈附近的縛線使中央視網膜與睫狀後動脈閉塞而產生視網膜缺血。使用微量移液器尖管將放置於眼球窩底部的縛線綁緊，以閉塞視網膜血管30分鐘。在30分鐘的視網膜缺血後，放開縛線，使視網膜動脈再次流通。其後30、60、90、120、180及240分鐘，測量ERG。在閉塞中央視網膜動脈前，進行化合物及載體的局部給藥。[091]
3. 統計分析[092]
所有數據以平均值 ± SEM表示。使用學生t檢定分析試驗結果的顯著性。在所有試驗中，概率值(P) ＜0.05被認為是具有顯著性。[093] 結果 [094]
當將中央視網膜及睫狀後動脈綁住時，流至這些血管的血液被迫停止，使得ERG的b-波迅速降至零。當鬆綁時，血流恢復往常，而b-波振幅僅回復至起始值的20%。然而，當灌輸1%的TPE時，b-波振幅回復至起始值的約40%，且藥物的作用可在施用藥物後持續至少240分鐘(圖8)。[095] 實例 4 ：雷射誘導 AMD 的抑制 [096]
老年性黃斑部病變(AMD)是在西方國家中超過50歲視力障礙患者的主要疾病。AMD的發病率隨著年齡而增加，因此75歲及以上人士中有三分之一患有某種形式的AMD。由於AMD對人口老化的巨大衝擊，在過去十年中，很多公眾關注及研究一直專注這種病症。[097]
AMD最初係發生於視網膜色素上皮細胞(RPE)產生病理性變化以及玻璃膜疣形成的“乾燥”型態，其可能發展成具有脈絡膜血管新生(CNV)的地圖樣萎縮及/或“濕潤”型態的AMD(Klein, Ophthalmology 1997; 104:7-21)。在脫離的RPE之下的布魯赫膜(Bruch’s membrane)的破壞，可做為新生及未成熟的脈絡膜血管長入視網膜下腔的入口，而導致CNV的形成。CNV可使視網膜下腔處滲漏出體液以及出血，進而導致視力模糊、視覺扭曲及視力突然喪失。如果不及時治療，這些病變將會發展成一個規則的纖維瘢痕，稱為盤狀疤痕，其通常會導致不可逆的中心視力喪失。[098] 材料與方法 [099]
根據實例 1
製備TP萃取物 (TPE)。將大鼠隨機分成2組。對照組以載體(30% HP-β-CD溶液)進行灌輸。 試驗組以5 mg/ml的TPE滴眼液進行灌輸。在雷射誘導損傷前1週以及損傷後4週，每天3次，在所有大鼠的兩眼上灌輸1滴滴眼液。整體過程中，以肌肉內注射氯胺酮(35 mg/kg)及甲苯噻嗪(5 mg/kg)進行大鼠的麻醉。使用10 mg/ml的阿托品及25 mg/ml的苯腎上腺素各一滴使瞳孔擴張。以VOLK super Pupil XL Biomicroscopy Lens (Keeler Instruments Inc., Broomall, PA, USA)觀看眼底。使用532波長的雙頻Nd:YAG雷射(Laserex LP3532; Lumenis Inc., Salt Lake City, UT, USA)。雷射參數為光斑尺寸100µm，曝光0.15秒，功率150-200 mw。將五個雷射光斑投射在圍繞視神經大致等距的眼底處。急性的汽泡說明布魯赫膜的破裂。只有泡沫形成的雷射光斑被包含於本研究中。視網膜下出血的病變被排除。在雷射處理2及4週後，以數位眼底照相機(TRC-50EX; TOPCON, Tokyo, Japan)進行螢光素血管造影術(FA)。經由舌下靜脈注射100 mg/ml的螢光素鈉鹽(0.5 ml/kg)。擷取早期(低於2分鐘)及晚期(超過7分鐘)螢光素期影像。在注射3滴螢光素鈉鹽後，經由舌下靜脈注射100 mg/ml的異硫氰酸螢光素-葡聚醣(1.4mg/kg)。在20分鐘內擷取螢光素影像。藉由Imagenet2000 digital imaging system (Topcon Medical Systems, Inc., Paramus, NJ. USA)選擇最清晰的圖片測量CNV形成的面積。[0100] 結果 [0101]
當以雷射光使大鼠眼睛的布魯赫膜破裂時，以螢光素血管造影術測量螢光素的滲漏。以電腦定量地測量CNV形成的面積，並以mm2
表示。如圖 9
所示，對照組眼睛會產生約2.5 mm2
的CNV面積，其係顯著地被1%的TPE灌輸所抑制。[0102] 實例 5 ： NaIO3 誘導乾性 AMD 的降低 [0103]
2004年的分析報告指出，在年紀超過40歲的美國人中的1.47%人口，至少有一個存在AMD及/或黃斑部出現地圖樣萎縮，亦即1.75百萬個人患有AMD。AMD的發病率隨著年齡急劇增加，有15%年長超過80歲的白人婦女具有新生血管型AMD及/或地圖樣萎縮。超過700萬的個體具有發展成AMD的實質風險。由於快速老化的人口，2020年時，患有AMD的人口數目將增加50%至2.95百萬人。在另一個研究中，在美國高加索人口裡所有眼盲案例中有54%是因AMD所造成。該研究預測，至2020年，在美國盲人的人數可能高達70%。本研究係為了觀察TPE對於經碘酸鈉(NaIO3
)誘導的視網膜色素上皮細胞(RPE)退化的影響。[0104] 材料與方法 [0105]
根據實例 1
製備TP萃取物 (TPE)。將總數30隻8週大的雄性布朗挪威(Brown-Norway；BN)大鼠隨機分成3組，10隻大鼠在正常組別，10隻大鼠在NaIO3
組別，而10隻大鼠在TPE + NaIO3
組別。對照組係單獨灌輸溶劑(2-羥丙基-β-環糊精，Sigma-Aldrich)，而不進行NaIO3
注射。NaIO3
組係經由舌下靜脈以溶劑灌輸，再加上35 mg/kg的NaIO3
注射；而TPE + NaIO3
組則以1%的TPE低眼液灌輸，再加上35 mg/kg的NaIO3
注射。經NaIO3
注射前1週以及注射後4週，每天3次，在所有大鼠的眼睛中灌輸1滴。在2及4週末，以ERG的c-波測量RPE的功能。[0106]
讓BN大鼠在暗處適應2小時，之後以肌肉內注射35 mg/kg氯胺酮加上5 mg/kg甲苯噻嗪進行麻醉。在之後，每一小時給藥初始劑量的一半。使用1%的阿托品及2.5%的苯腎上腺素各一滴使所有大鼠的瞳孔擴張。在記錄前，給予一滴0.5%丁卡因進行表面麻醉。進行ERG測量時，保持所有大鼠溫暖。接著進行由Peachey 發展的DC-ERG紀錄方法。簡言之，使用內徑1 mm帶有纖維的玻璃毛細管(Sutter Instruments, Novato, CA)，在其中充填Hanks平衡鹽水溶液(Invitrogen, Carlsbad, CA)，並與附有連接器的Ag/AgCl導線電極進行連接。將電極放置於角膜表面。使應答放大(dc-100 Hz；增益 = 1000X；DP-31, Warner Instruments, Hamden, CT)，並在10Hz或1000Hz下使其數位化。以iWORX LabScribe Data Recording Software (iWorxOCB Sciences, Dover, NH)分析數據。使用Fiber-lite高強度照明器(Dolan-Jenner Industries, Inc. MA)，由光通道獲得光刺激，並將中性密度濾光片(Oriel, Stratford, CT)放置於光徑中以調整刺激的亮度。本試驗所使用的刺激亮度為3.22 log cd/m2
，進行刺激4分鐘。使用Minolta (Ramsey, NJ) LS-110光度計，聚焦於光纖束位於大鼠眼睛上的輸出端，以進行亮度校正。[0107] 結果 [0108]
當以NaIO3
處理大鼠時，會專一地引起RPE細胞的退化。因此，NaIO3
係被使用於發展出乾性AMD的動物模型，而已ERG的c-波震幅測量受損的細胞功能。如圖 10
所示，NaIO3
顯著地抑制對照組ERG的c-波。然而，以1%的TPE處理經NaIO3
處理的大鼠可顯著地反轉其ERG的c-波。NaIO3
是一種可使RPE細胞專一性地眼睛退化的強力毒素。因此，在經NaIO3
處理的眼睛中，ERG的c-波被完全地抑制(圖 10
)。必須注意的是，由NaIO3
誘導而產生的乾性AMD模型可藉由1%的TPE反轉3次(圖 10
)。由於乾性AMD是一種會導致眼盲的可怕疾病，任何可預防/處理乾性AMD的藥物是很有價值的。[0109]
本領域技術人員應理解在不脫離本發明的廣義發明性構思的情況下，可針對上述具體實施例進行改變。因此，可理解的是，本發明並不局限於其所揭示的特定具體實施例，其旨在於涵蓋由所附申請專利範圍所定義的本發明精神及範圍內的修飾。