KR20200096664A

KR20200096664A - 안과 질환을 치료하기 위한 대만 프로폴리스의 추출물

Info

Publication number: KR20200096664A
Application number: KR1020207021978A
Authority: KR
Inventors: 치 초우 랴오
Original assignee: 네이처와이즈 바이오테크 & 메디칼스 코포레이션
Priority date: 2015-02-26
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2020-08-12
Also published as: EP3261652B1; AU2016223995B2; JP6874075B2; EP3261652A1; US20160250264A1; CA2977713C; CN107530380B; KR102416666B1; JP6643365B2; CA2977713A1; US9956254B2; KR20210083391A; CN107530380A; AU2016223995A1; TW201713350A; JP2019218390A; KR20170132177A; WO2016134661A1; JP2018506588A; KR20220054889A

Abstract

본 발명은 안과 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 대만 프로폴리스(TP)의 추출물 또는 이의 활성 성분을 투여함을 포함하여 그러한 대상체에서 안과 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 유효량의 TP의 추출물 또는 이의 활성 성분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 안과 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.

Description

안과 질환을 치료하기 위한 대만 프로폴리스의 추출물{EXTRACT OF TAIWANESE PROPOLIS FOR TREATING OCULAR DISEASES}

본 발명은 안과 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

인구가 점점 고령화됨에 따라서, 시각 기능의 저하가 점점 더 분명해지고 심각해지고 있다. 노화와 밀접하게 관련되는 다양한 눈 질환, 예컨대, 녹내장(glaucoma), 연령-관련된 시력 감퇴(AMD), 시신경병증(optic neuropathy), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 및 노년 백내장(senile cataract) 등이 있다. 이들 눈 질환은 노인의 시각 장애 또는 또한 시각 상실을 유발하는 주요 질환이다.

망막 색소 상피 (retinal pigment epithelium: RPE)는 단층의 세포들로 구성되고 망막 광수용기와 광수용기의 기계적 및 대사적 지지에서 중요한 역할을 하는 맥락막 혈관 사이에 자리한다. 또한 기능장애 RPE는 일부 안과 질환, 예컨대, 증식성 유리체망막병증 (proliferative vitreoretinopathy: PVR), 포도막염(uveitis) 및 AMD의 주요 원인이다. AMD 및 다른 질환, 예컨대, 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy: DR)은 아마도 빛 또는 대사 반응으로부터 유도되는 산소 라디칼의 효과와 연관되어 있다.

다른 한편으로, 안혈류(Ocular Blood Flow)는 또한 녹내장, 허혈성 망막병증, 및 연령-관련된 시력 감퇴(AMD)를 포함한 다양한 눈 질환과 밀접하게 관련되어 있다. 따라서, 정상 안혈류의 유지가 상기 언급된 눈 질환을 예방/치료하기에 필수적이다.

연령-관련된 시력 감퇴(AMD)는 미국 및 서유럽의 65세 초과의 사람들의 시각 상실의 주된 원인이다. 두 대륙 모두에 공통된 위험 인자는 연령의 증가, 흡연, 고혈압, 협심증(angina) 및 양성 가족력을 포함한다. AMD는 비-삼출성 및 삼출성 형태 둘 모두로 존재한다. 비-삼출성 형태는 느리고 진행적인 중심시력의 상실을 갖는 중심 망막의 위측증(atrophy)와 연루되어 있다. 삼출성 형태는 망막밑공간(subretinal space)으로의 브루크 막(Bruch's membrane)을 통한 새로운 혈관의 성장, 및 혈관형성 과정을 통한 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization: CNV)의 발생이 특징이다. 혈관형성(angiogenesis)은 흔히 허혈 및 저산소증에 의해서 촉발된다. 황반은 단지 단일 혈액 공급을 갖고 있고, 망막은 신체에서의 가장 높은 산소 흡수를 나타냄에 따라서, 허혈이 AMD 발생과 강하게 연관되어 있다는 것을 관찰하는 것은 놀랍지 않다(Strauss O., Physiol. Res. 200; 85(3):845-881).

상피는 산소 분압의 변화 및 산소 라디칼-연관된 스트레스에 매우 취약하기 때문에, 허혈-관련된 질환 동안에 RPE에서 생성된 반응성 산소종(reactive oxygen species: ROS)이 RPE 세포에 유해할 수 있다. AMD의 중요한 "초기" 사건은 산화성 손상으로 인한 RPE 세포의 상실이다. 산화성 스트레스는 몇 가지 연령-관련된 만성 질환, 예컨대, 암, 당뇨병, 신경변성 및 심혈관 질환의 병인과 연루되는 것으로 인식되어 있다.

프로폴리스(propolis)는 꿀벌이 나무 눈(tree buds), 과실류, 수액 흐름, 또는 다른 식물 공급원으로부터 채집하는 수지 혼합물이다. 상이한 지역으로부터의 프로폴리스는 상이한 활성 성분을 함유할 수 있다. 그것은 다양한 활성 성분을 함유하며, 항종양(Ahn et al., Cancer Lett. 2007, 252: 235-243.), 항산화(Altug et al., Brain Res. 2008 Mar 27;1201: 135-42.), 항세균(Drago et al., J Appl Microbiol. 2007, 103: 1914-1921.), 항바이러스(Shimizu et al., Antivir Chem Chemother. 2008, 19: 7-13.), 항균(Silici et al., J Pharmacol Sci. 2005, 99: 39-44. ), 및 소염 활성(Grunberger et al., Experientia 1988, 44: 230-232.)을 포함한 광범위한 범위의 생물학적 활성을 나타내는 것으로 보고되었다. 그러나 출원인의 지식에, 프로폴리스의 어떠한 활성 성분이, 아마도 본 기술분야에서 공지된 항종양 활성에 의해서 제안되는 바와 같은 눈에서의 암을 제외한, 안과 질환을 치료하기 위해서 사용될 수 있다는 보고가 없다.

대만 프로폴리스의 추출물이 안과 질환을 치료하는데 효과적임이 예상치 못하게 본 발명에서 밝혀졌다.

따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명은 유효량의 대만 프로폴리스(TP)의 추출물을 안과 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함하여, 그러한 대상체에서 안과 질환을 치료하는 방법을 특징으로 한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 대만 프로폴리스(TP)의 추출물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 안과 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, TP의 추출물(TPE)은 TP의 물 추출물 또는 알코올 추출물, 또는 균등한 또는 적절한 용매 시스템의 추출물이다.

상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 둘 모두는 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며, 발명을 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.

상기 요약뿐만 아니라, 본 발명의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때에 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위해서, 현재 바람직한 실시형태를 도면에 도시한다.
도면에서:
도 1a는 ARPE-19 세포의 증식에 대한 TPE의 효과를 나타내고 있다. ARPE-19 세포는 72시간(h) 동안 TPE와 함께 인큐베이션되었다. 도 1b는 HUVEC의 증식에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. HUVEC는 72시간 동안 TPE와 함께 인큐베이션되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 각각의 군; ^*P < 0.05 및 ^**P < 0.01 TPE 군 vs. 비히클 대조군에서 n=6이다.
도 2a는 ARPE-19 세포에서의 저산소증-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. ARPE-19 세포는 72시간 동안 TPE와 함께 인큐베이션되었다. 도 2b는 HUVEC에서의 저산소증-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. HUVEC는 72시간 동안 TPE와 함께 인큐베이션되었다. 대조군은 표준 조건(5% CO₂ 및 95% 공기)하에 비히클(30% HP-β-CD 용액)으로 72시간 동안 처리되었고; 모델 군은 저산소 조건(1% O₂, 5% CO₂ 및 94% N₂)하에 비히클로 72시간 동안 처리되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 각각의 군; ^*P < 0.05 및 ^**P < 0.01 vs. 모델 군에서 n=6이다.
도 3a는 ARPE-19 세포에서의 NaIO₃-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. ARPE-19 세포는 TPE 및 NaIO₃와 함께 72시간 동안 인큐베이션되었다. 도 3b는 HUVEC에서의 NaIO₃-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. HUVEC는 72시간 동안 TPE 및 NaIO₃와 함께 인큐베이션되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 각각의 군; ^*P < 0.05 및 ^**P < 0.01 vs. 모델 군에서 n=6이다.
도 4a는 ARPE-19 세포에서의 H₂O₂-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. ARPE-19 세포는 TPE 및 H₂O₂와 함께 24시간 동안 인큐베이션되었다. 도 4b는 HUVEC에서의 H₂O₂-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. HUVEC는 24시간 동안 TPE 및 H₂O₂와 함께 인큐베이션되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 각각의 군; ^*P < 0.05 및 ^**P < 0.01 vs. 모델 군에서 n=6이다.
도 5a는 ARPE-19 세포에서의 NaN₃-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. ARPE-19 세포는 TPE 및 NaN₃와 함께 72시간 동안 인큐베이션되었다. 도 5b는 HUVEC에서의 NaN₃-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. HUVEC는 72시간 동안 TPE 및 NaN₃와 함께 인큐베이션되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 각각의 군; ^*P < 0.05 및 ^**P < 0.01 vs. 모델 군에서 n=6이다.
도 6a는 ARPE-19 세포에서의 t-BHP-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. ARPE-19 세포는 TPE 및 t-BHP와 함께 12시간 동안 인큐베이션되었다. 도 6b는 HUVEC에서의 t-BHP-유도된 손상에 대한 TPE의 효과를 나타낸다. HUVEC는 12시간 동안 TPE 및 t-BHP와 함께 인큐베이션되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 각각의 군;^*P < 0.05 및 ^**P < 0.01 vs. 모델 군에서 n=6이다.
도 7a 내지 도 7c는 고안압 래빗(Ocular Hypertensive Rabbit)에서의 안혈류에 대한 1% TPE의 효과를 나타내며, 도 7a는 Qm으로의 홍채의 혈류를 나타내고, 도 7b는 Qm으로의 섬모체의 혈류를 나타내고; 도 7c는 Qm으로의 맥락막의 혈류를 나타낸다.
도 8은 허혈 발작 후의 래트의 망막 기능의 b-파 회복(b-wave recovery)에 대한 TPE의 효과를 나타내고 있다. 별표는 P<0.05 (^*) 및 P<0.01 (^**)에서의 대조군과 처리군 사이의 유의한 차이를 나타내고 있다.
도 9는 레이저 유도된 AMD 래트 모델에 대한 1% TPE의 효과를 나타낸다. 별표는 P<0.05에서의 두 값 사이의 유의한 차이를 나타내고 있다.
도 10은 NaIO₃ 유도된 건성 AMD 래트 모델에 대한 1% TPE의 효과를 나타낸다. 별표는 P<0.05에서의 NaIO₃-처리군과 NaIO₃ + 1% TPE 처리군 사이의 유의한 차이를 나타내고 있다.

본 발명은 대만 프로폴리스(TP)의 추출물이 안과 질환을 치료하는데 효과적이라는 예상치 못한 발견을 기반으로 하고 있다. 본 발명은 TP의 추출물의 특정의 실무 적용, 즉, 안과 질환을 치료 및/또는 예방하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.

한 가지 양태에서, 본 발명은 유효량의 대만 프로폴리스(TP)의 추출물을 안과 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여함을 포함하여, 그러한 대상체에서 안과 질환을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 특정의 실시형태에서 대만 프로폴리스는 대만 그린 프로폴리스(Taiwanese green propolis)이다.

본원에서 사용된 용어 "프로폴리스"는 벌에 의해서 제조된 생성물을 나타낸다. 프로폴리스는 꿀벌이 나무 눈(tree buds), 수액 흐름, 또는 다른 식물 공급원으로부터 채집하는 수지 혼합물로 공지되어 있고, 벌통에서의 원치않은 개방 공간에 대한 밀봉재로서 사용된다. 본 발명에서, 대만에서의 벌에 의해서 제조된 프로폴리스(대만 프로폴리스)가 사용된다. 프로폴리스는 BC 300년 이래로 전통 의약으로서 사용되어 왔다. 최근, 항암, 항바이러스 및 항미생물을 포함한, 프로폴리스의 다양한 생물학적 성질이 보고되었다. 광범위한 범위의 생물학적 활성 때문에, 프로폴리스는 건강을 개선하고 질환을 치료하기 위해서 식품 및 음료에 사용되었다. 벌들은 조성에 프로폴리스 지역 특성을 부여하는 상이한 온대기후대에서의 상이한 식물로부터 프로폴리스를 모은다. 대만 프로폴리스는 프레닐플라바논(prenylflavanone)의 코어 화학 구조를 갖는 프로폴린(propolin)이 풍부하다. 대만 프로폴리스와 유사한 프로폴리스가 또한 오키나와(Okinawa), 솔로몬 제도(Solomon Islands)에서 발견될 수 있다("Pacific propolis").

본 발명에서 사용되는 TPE는 하기 단계: (i) TP를 제 1 용액으로 12 내지 60시간 동안 추출하여 제 1 추출물을 얻는 단계; (ii) 제 1 추출물의 가용성 분획을 수거하는 단계; 및 (iii) 가용성 분획을 2 내지 10배로 농축시켜 미정제 TPE (cTPE)를 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 제 1 용액은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 수용액 또는 알코올성 용액을 포함한다. 알코올성 용액은 바람직하게는 50 내지 100%의 알코올, 더욱 바람직하게는 80 내지 100%의 알코올, 더욱더 바람직하게는 95%의 알코올을 함유한다. 본 발명의 한 가지 실시형태에서, TPE는 하기 단계: (i) TP를 95% 에탄올로 약 48시간 동안 추출하여 제 1 추출물을 얻는 단계; (ii) 알코올을 여과하고, 제 1 추출물로부터 고형물을 제거하여 가용성 분획을 얻는 단계; 및 (iii) 가용성 분획을 감압하에 약 4배로 농축시켜 cTPE를 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조된다. 단계(i)에서, 추출 온도는 바람직하게는 35 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 40 내지 50℃, 가장 바람직하게는 45℃이다. 단계(iii)에서, 농축 온도는 바람직하게는 35 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 45 내지 50℃이다. 단계(iii)에서, 가용성 분획은 바람직하게는 3 내지 5배, 더욱 바람직하게는 약 4배로 농축된다. 각각의 cTPE는 cTPE의 각각의 그램이 100mg 이상의 프로폴린 C, 80mg 이상의 프로폴린 D, 30mg 이상의 프로폴린 F 및 50mg 이상의 프로폴린 G를 함유하는 사양으로 몇 가지 표준 구성요소의 양에 대해서 분석되었고, 이어서, 그램당 350mg 이상의 프로폴린(프로폴린 C, D, F 및 G, 및 다른 프로폴리스를 포함함)의 사양으로 표준 구성요소의 바람직한 전체 양을 갖는 기준과 부합하는 TP의 최종 추출물(TPE)을 얻기 위해서 배합되었다.

cTPE 및 최종 TPE가 본 발명에서 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "안과 질환"은 녹내장, 연령-관련된 시력 감퇴 (AMD), 허혈성 망막병증, 시신경병증, 당뇨병성 망막병증(DR), 당뇨병성 황반 부종(DME), 포도막염, 및 노년 백내장을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는, 눈과 관련된 질환을 나타낸다. 안과 질환은 녹내장, AMD, 허혈성 망막병증, 시신경병증, DR 및 DME를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아닌, 눈, 또는 더욱 특히, 망막 색소 상피(RPE) 및 광 세포에 대한 산화성 스트레스 및/또는 저산소증-유도된 손상과 연관된 질환 또는 질병일 수 있다. 안과 질환은 녹내장, 허혈성 망막병증, DR 및 AMD를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아닌, 감소된 안혈류와 연관된 질환 또는 질병일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "유효량"은 요망되는 치료 효과, 또는 특정 유형의 반응의 유도를 제공하기 위한 대만 프로폴리스의 추출물 또는 이의 활성성분의 충분한 양을 나타낸다. 요망되는 유효량은 대상체의 질환 상태, 물리적인 상태, 연령, 성별, 종 및 체중 등에 따라서 대상체 마다 다르다. 그러나, 적절한 유효량은 단일의 통상의 실험을 이용하여 당업자에 의해서 결정될 수 있다. 본 발명의 한 가지 실시형태에서, 유효량은 산화성 스트레스 및/또는 저산소증-유도된 손상이 있는 RPE 세포의 생존율을 향상시키기에 효과적인 양이다. 한 가지 실시형태에서, 유효량은 산화성 스트레스 및/또는 저산소증-유도된 손상이 있는 RPE 세포의 생존율을 향상시키기에 효과적이고, 동시에, 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)의 생존율에 효과가 없거나 거의 없거나, HUVEC의 생존율을 감소시키기에 효과적인 양이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 유효량은 안혈류를 향상시키기에 효과적인 양이다. 한 가지 추가의 실시형태에서, 유효량은 맥락막 혈관신생 (CNV)을 감소시키기에 효과적인 양이다. 또 다른 실시형태에서, 유효량은 RPE 기능을 향상시키는데, 적어도 ERG에 의해서 측정된 이의 c-파 진폭을 향상시키거나 회복시킴으로써, RPE 기능을 향상시키기에 효과적인 양이다. 예를 들어, TPE는 대상체에게 일일 1 내지 3회 경구로 투여될 수 있다. 각각의 경구 투여의 경우에, TPE의 양은 10 내지 200mg, 바람직하게는 10 내지 120mg일 수 있다. TPE는 또한 안과학적 투여를 통해서 한 번에 1 내지 10회 적용, 일일 1 내지 10회, 바람직하게는 한 번에 1내지 5회 적용, 일일 1 내지 4회로 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 일일 3회 매번 TPE를 포함하는 제제 3 방울이 사용될 수 있다. 국소 안과학적 투여의 경우에, 0.01 내지 10% TPE가 사용될 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 1.0% TPE가 사용될 수 있다.

본 발명의 실시예에서, TPE는 다양한 안과 질환, 예컨대, 허혈 발작 후의 망막 기능장애 및 레이저 유도된 AMD에서의 치료에 효과적이었다는 것이 입증된다.

따라서, TPE는 녹내장, 연령-관련된 시력 감퇴(AMD), 허혈성 망막병증, 시신경병증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 포도막염, 및 노년 백내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 안과 질환을 앓고 있는 대상체에 투여될 수 있다. 본 발명의 한 가지 실시예에서, 안과 질환은 AMD이다. 한 가지 특정의 실시형태에서, 안과 질환은 건성 AMD이다. 안과 질환은 눈 암일 수 있거나 눈 암이 아닐 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상의 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 표준 약제학적 담체 중 어떠한 담체를 포함한다. 그러한 담체는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 크레모포어(cremophor), 나노입자, 리포좀, 폴리머, 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 선택되는 투여 방식에 적합한 어떠한 형태로 구성될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 조성물은 고체 형태, 예컨대, 환제, 캡슐, 과립, 정제, 및 분말, 및 액체 형태, 예컨대, 용액, 시럽, 엘릭시르(elixir), 및 현탁액을 포함한다. 국소 투여에 유용한 형태는 크림, 연고, 겔, 현탁액, 점적제(drop), 에멀젼, 피부 패치(skin patch)를 포함한다.

표준 담체에 추가로, 본 발명의 경구 약제학적 조성물에는 경구 제형에 일반적으로 사용되는 하나 이상의 부형제, 예컨대, 계면활성제, 흡입제, 가용화제, 안정화제, 유화제, 증량제(thickener), 착색제, 감미제(sweetening agent), 향미제(flavoring agent), 및 보존제가 보충될 수 있다. 그러한 부형제는 당업자에게는 잘 공지되어 있다.

본 발명에 따르면, 약제학적 조성물은 어떠한 경로, 예컨대, 경구 투어, 비경구 주입, 눈 주입(예, 유리체내 주입), 피부 패치, 또는 눈에의 국소 적용을 통해서 대상체에 투여될 수 있다. 국소 투여를 위한 약제학적 조성물은 안연고(eye ointment), 아이 겔(eye gel), 아이 크림(eye cream), 또는 점안제(eye drop)의 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명이 제한이 아닌 입증을 위해서 제공되는 하기 실시예에 의해서 추가로 예시된다.

실시예

실시예 1: 항산화에 대한 TPE의 효과

본 연구에서는, 망막 색소 상피(ARPE-19) 세포에 대한 산화성 스트레스 및 저산소증-유도된 손상에 대한 TP의 효과 및 이러한 효과에서의 ROS의 관여를 조사하였다.

산화 반응으로부터 생성되는 자유 라디칼은 혈관 및 신경 세포의 병적 징후뿐만 아니라, 자가면역 당뇨병에서의 섬 기능장애 및/또는 파괴(islet dysfunction and/or destruction)와 밀접하게 관련되는 것으로 잘 공지되어 있다(J. Lancaster, Jr., Nitric Oxide, Principles and Actions, Academic Press, 1996). 혈관 기능장애는 눈에서의 녹내장, AMD, 및 허혈성 망막병증을 유도할 수 있는 반면에, 신경 질병은 녹내장 및 시신경병증을 유발시킬 수 있다. 면역 당뇨병에서의 섬 파괴에 관련하여, 그것은 당뇨병성 망막병증(DR) 및 당뇨병성 황반 부종(DME)의 발생을 유도할 것이다. 따라서, 항산화제는 상기 언급된 눈 질환을 방지/완화시키기에 매우 유용하다.

재료 및 방법

1. 재료

TP의 추출물(TPE)을 실험실에서 제조하였다. 대만 프로폴리스 또는 대만 그린 프로폴리스(1g)을 교반 및 45℃에서의 가열하에 약 48시간 동안 95% 에탄올(6L)로 추출하였다. 알코올의 여과 및 불순물의 제거 후에, 액체 추출물을 감압하에 약 4배로 농축시켜, 약 50% w/w 추출율의 미정제 대만 프로폴리스 추출물(cTPE)을 생성시켰다. 각각의 cTPE의 조성이 배치(batch)마다 다르기 때문에, cTPE의 각각의 그램이 100mg 이상의 프로폴린 C, 80mg 이상의 프로폴린 D, 30mg 이상의 프로폴린 F 및 50mg 이상의 프로폴린 G를 함유하는 사양으로 몇 가지 표준 구성요소의 양에 대해서 각각의 cTPE를 분석되었고, 이어서, 그램당 350mg 이상의 프로폴린의 사양으로 표준 구성요소의 바람직한 전체 양을 갖는 기준과 부합하는 TP의 최종 추출물(TPE)을 얻기 위해서 배합하였다.

티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT, 순도 ≥ 97.5%), 둘베코 포스페이트 완충된 염수(Dulbecco's phosphate buffered saline: DPBS), 과산화수소 (H₂O₂, 물 중의 50 중량% 용액), 3차-부틸 하이드로퍼옥사이드(t-BHP, 물 중의 70 중량%), 요오드산 나트륨(NaIO₃, 순도≥99.5%), 소듐 아지드(NaN₃, 순도 ≥ 99.5%) 및 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)/햄 F12(Ham's F12)(DMEM/F12, 1:1)를 모두 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다. 인간 망막 색소 상피(ARPE-19) 세포, 인간 제대 동맥 내피 세포(HUVEC), 소 태아 혈청(FBS), 혈관 세포 기본 배지 및 내피 세포 성장 키트를 ATCC(Manassas, VA, USA)로부터 구매하였다.

인간 망막 색소 상피(RPE) 세포는 정상적인/우수한 시각 기능/활성을 유지시키기 위해서 광세포에 영양소를 공급할 뿐만 아니라 광세포로부터 대사 폐기물을 제거하도록 광세포와 맥락막층 사에에 위치되는 중요한/독특한 세포이다. 다른 한편으로는, HUVEC는 맥락막 및 망막 혈관을 포함한 신체의 전체에 걸친 맥관구조상에 위치된다. 이들은 특히 맥락막 혈관신생을 통한 시각 기능에 좋지 않다. VEGF 억제제에 의한 혈관신생의 억제는 습성 AMD의 치료를 위한 혈관형성/혈관신생을 감소시키기 위한 주요 기전이다. 따라서, 세포 증식/RPE의 성장을 증가시킬 수 있지만 HUVEC의 세포 성장에 효과가 없고 이를 억제하는 약물이 AMD를 예방/치료하는데 유용할 것이다.

2. 세포 배양

ARPE-19 세포를 10% FBS, 100 단위/ml 페니실린 G, 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 설페이트가 보충된 DMEM/F12 배지에서 성장시켰다. HUVEC를 내피 세포 성장 키트가 보충된 혈관 세포 기본 배지에서 성장시켰다. 세포를 5% CO₂ 및 95% 공기 하에 37℃에서 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.

3. ARPE-19 세포 및 HUVEC의 생존율

MTT 분석을 이용하여 ARPE-19 세포 및 HUVEC의 생존율을 측정하였다. 1x10⁵ 세포를 96-웰 플레이트(100 μl/웰)에 씨딩하고 밤새 성장시켰다. 음성 대조군을 세포 없이 100 μl 배지를 첨가함으로써 제조하였다. 이어서, 세포를 TP의 추출물(TPE) (0.1, 0.3, 1, 3 및 10 μg/ml) 및/또는 산화제 (NaIO₃, H₂O₂, t-BHP 및 NaN₃)을 함유한 새로운 배지로 12, 24, 또는 72시간 동안 처리하였다(200 μl/well). 비히클 대조군을 비히클(30% HP-β-CD, 세포 내의 HP-β-CD의 최종 농도는 0.3% 미만이다)로 처리하였다. 20 μl MTT(5 mg/ml)를 웰에 첨가하고, 추가의 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 배지를 버리고, 100 μl DMSO를 첨가하여 생존 세포에 의해서 MTT로부터 생성된 포르마잔을 가용화시켰다. 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad Laboratories, Inc., CA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 식에 따라서 세포 생존율을 계산하였다: 세포의 생존율(%) = 시험된 샘플에서의 흡광도 - 음성 대조군에서의 흡광도)/(비히클 대조군에서의 흡광도 - 음성 대조군에서의 흡광도) x 100%.

4. 저산소증 치료

세포를 밤새 부착시키고, 이어서, 저산소 조건하에 72시간 동안 TPE 또는 비히클에 노출시켰다. N₂ 및 CO₂ 가스 공급원을 갖춘 O₂ 및 CO₂ 조절기(Proox Model 110 및 Pro CO₂ model 120, Biospherix Ltd., Redfield, NY, USA)에 의해서 온도 및 습도 조절된 환경 C-챔버를 사용함으로써 저산소 조건(1% O₂, 5% CO₂ 및 94% N₂)을 유지시켰다.

5. 통계학적 분석

모든 데이터를 평균 ± S.E.M으로서 표현하였다. 통계학적 분석을 스튜던트 t-시험(Student's t-test)을 이용하여 수행하였다. P<0.05의 p-값이 통계학적으로 유의한 것으로 여겨진다.

결과

1. ARPE-19 세포 및 HUVEC에서의 세포독성

결과는 TP의 추출물(TPE)이 0.03, 0.1, 0.3, 1 및 10 μg/ml의 농도에서 ARPE-19 세포에서의 세포 성장에 영향을 주지 않았음을 나타낸다. 그러나, ARPE-19 세포의 증식은 3 μg/ml의 농도에서 21%까지 유의하게 증가되었다(P < 0.05, 도 1a). 다른 한편으로, TPE는 각각 0.3 및 10 μg/ml의 농도에서 18% 및 99%까지 HUVEC의 증식을 유의하게 억제시켰다(도 1b).

2. ARPE-19 세포 및 HUVEC에서의 저산소증-유도된 손상에 대한 TPE의 효과

TPE는 0.03 μg/ml 내지 10 μg/ml에서 저산소 조건에서의 ARPE-19 세포의 생존율에 효과가 없었다(도 2a). TPE는 0.1 μg/ml의 농도에서 저산소 조건에서의 HUVEC의 생존율을 8%까지 유의하게 증가시켰다(P < 0.05, 도 2b). 그러나 10 μg/ml의 농도에서, TPE는 HUVEC의 생존율을 96%까지 유의하게 감소시켰다(P < 0.01).

3. ARPE-19 세포 및 HUVEC에서의 NaIO ₃ -유도된 손상에 대한 TPE의 효과

NaIO₃-유도된 손상은 건성 AMD의 모델이다. TPE는 0.03 μg/ml 내지 3 μg/ml에서 ARPE-19 세포 또는 HUVEC에서의 NaIO₃-유도된 손상에 영향을 주지 않았다. 10 μg/ml의 농도에서는, TPE는 ARPE-19 세포에서의 30 및 100 μg/ml NaIO₃-유도된 손상의 생존율을 유의하게 역전시켰지만(P<0.05, 도 3a), HUVEC에서의 NaIO₃-유도된 손상을 향상시켰다(P<0.01, 도 3b).

4. ARPE-19 세포 및 HUVEC에서의 H ₂ O ₂ -유도된 손상에 대한 TPE의 효과

H₂O₂-유도된 손상은 산화성 손상에 대한 모델이다. 0.03 μg/ml 내지 10 μg/ml에서, TPE는 ARPE-19 세포에서의 200 μM H₂O₂-유도된 손상을 역전시켰다. 특히, 10 μg/ml의 농도에서, TPE는 ARPE-19 세포에서의 200 μM H₂O₂-유도된 손상을 60%까지 역전시켰다(P<0.01, 도 4a). 다른 한편으로는, TPE는 0.03 μg/ml 내지 3 μg/ml에서 HUVEC에서의 H₂O₂-유도된 손상에 효과가 없었다. 그러나 10 μg/ml TPE는 HUVEC에서의 200, 400 및 600 μM H₂O₂-유도된 손상을 각각 93%, 86% 및 58%까지 향상시켰다(도 4b).

5. ARPE-19 세포 및 HUVEC에서의 NaN ₃ -유도된 손상에 대한 TPE의 효과

NaN₃-유도된 손상은 산화성 손상에 대한 또 다른 모델이다. TPE는 0.03 μg/ml 내지 1 μg/ml에서 ARPE-19 세포에서의 NaN₃-유도된 손상에 영향을 주지 않았다. 3 및 10 μg/ml의 농도에서, TPE는 ARPE-19 세포에서의 NaN₃-유도된 손상을 유의하게 역전시켰다(P<0.01, 도 5a). 0.03, 0.1 및 1 μg/ml의 농도에서, TPE는 HUVEC에서의 0.3 mM NaN₃-유도된 손상을 유의하게 역전시켰다. 그러나 10 μg/ml는 HUVEC에서의 0.3 mM NaN₃-유도된 손상을 향상시켰다(P<0.01, 도 5b). 비록, TPE는 0.03, 0.3 및 3 μg/ml에서 HUVEC에서의 1mM NaN₃-유도된 손상을 역전시켰지만, 10 μg/ml은 HUVEC에서의 1mM NaN₃-유도된 손상을 75%까지 향상시켰다(P<0.01, 도 5b).

6. ARPE-19 세포 및 HUVEC에서의 t-BHP-유도된 손상에 대한 TPE의 효과

t-BHP-유도된 손상은 산화성 손상에 대한 또 다른 모델이다. 3 및 10 μg/ml의 농도에서, TPE는 ARPE-19 세포에서의 50 및 100 μM t-BHP 유도된 손상을 유의하게 역전시켰다(P<0.01, 도 6a). 0.03 μg/ml 내지 10 μg/ml에서, TPE는 ARPE-19 세포에서의 200 μM t-BHP-유도된 손상을 역전시켰다(도 6a). 특히, 10 μg/ml의 농도에서, TPE는 ARPE-19 세포에서 200 μM t-BHP-유도된 손상을 105%까지 역전시켰다(P<0.01, 도 4a). 그러나 10 μg/ml TPE는 ARPE-19 세포에서의 50 및 100 μM t-BHP 유도된 손상을 각각 77% 및 73%까지 향상시켰다(P<0.01, 도 6a). 도 6b는 HUVEC에 대한 TPE의 효과를 나타낸다.

실시예 2: 안혈류(OBF)의 향상

안혈류는 녹내장, 허혈성 망막병증, 당뇨병성 망막병증 및 연령-관련된 시력 감퇴(AMD)를 포함하는 다양한 눈 질환과 밀접하게 관련되어 있다. 따라서, 정상 안혈류의 유지는 상기 언급된 눈 질환을 예방/치료하기에 필수적이다.

재료 및 방법

1. 재료

0.5% 알카인(alcaine)을 상업적으로 구매하였다. 20% 무균 고장성 염수 용액을 실험실에서 제조하였다. 착색된 마이크로스피머(microsphere)를 E-Z Trac (Los Angeles, CA)로부터 구매하였다. 착색된 마이크로스피어를 0.01% (v/v)의 Tween 80을 함유하는 염수로 희석시켜 마이크로스피어가 함께 들러붙는 것을 방지하였다. 0.4ml 내의 2백만개의 마이크로스피어를 각각의 시점에서 주입시켰다.

2.0 내지 3.0 kg 중량의 자성의 뉴질랜드 화이트 래빗(New Zealand white rabbit)을 상업적으로 구매하였다. 동물 케어 및 치료는 제도상의 지침에 따랐다. TP의 추출물(TPE)을 실시예 1에 따라서 제조하였다.

2. 방법

래빗을 35mg/kg 케타민 및 5mg/kg 자일라진(xylazine)을 근육내 주입하여 마취시켰다. 초기 도즈의 절반이 그 후에 1시간 마다 주어졌다. 착색된 마이크로스피어의 주입을 위해서 우측 경동맥을 통해서 좌심실에 캐뉼러를 삽입하였고, 혈액 샘플의 채집을 위해서 대퇴동맥(femoral artery)에 캐뉼러를 삽입하였다. 외쪽 눈을 한 방울의 염산 푸로파라카인 안과 용액(proparacaine hydrochloride ophthalmic solution)(Bausch & Lomb, Inc., Tampa, FL, USA)으로 처리하였다. 바늘을 왼쪽 눈의 전방(anterior chamber)내로 직접 삽입시켰고, 이는 40mmHg 염수 나노미터(saline manometer)에 연결되었다. 안구 고혈압 모델은 안혈류를 정상치의 대략 1/3로 감소시켰다. 안구 고혈압 모델이 생성된 30분 후에 50μl의 10g/l 플라본(flavone) 또는 비피클(30% HP-β-CD 용액)을 왼쪽 눈에 국소 주입하였다. 안혈류를 TPE 또는 비히클에 의한 처리 0, 30, 60 및 120분 후에 착색된 마이크로스피어에 의해서 측정하였다. 각각의 시점에서, 2 백만개의 마이크로스피어를 기준으로서 주입하였고, 마이크로스피어의 주입 후에 정확히 1분 동안 대퇴 동맥으로부터 혈액 샘플을 채집하였다. 혈액 샘플을 헤파린 첨가된 튜브에 채집하였고, 부피를 기록하였다. 래빗을 마지막 혈액 샘플링 후에 100 mg/kg의 펜토바르비탈 소듐(pentobarbital sodium)의 주입에 의해서 안락사시켰다. 왼쪽 눈을 적출하고, 홍채, 섬모체, 망막 및 맥락막으로 절개하였다. 모든 조직을 칭량하였다.

샘플 처리 및 마이크로스피어 계수에 대한 상세사항이 E-Z Trac(Los Angeles, CA, USA)에 의해서 제공되었다. 요약하면, 혈액 용혈 시약을 혈액 샘플을 함유한 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)에 첨가하였고, 와동시키고, 6000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 이어서, 조직/혈액 분해 시약 I 및 II을 첨가하였다. 튜브를 캡핑하고, 와동시키고, 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 계수 시약(counting reagent)을 첨가하고, 와동시키고, 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 마이크로스피어를 정확한 부피의 계수 시약 중에 재현탁시켰다. 마이크로스피어의 수를 현미경 하에 혈구계에 의해서 계수하였다. 조직/혈액 분해 시약 I을 조직 샘플을 함유한 마이크로퓨즈 튜브에 첨가하고, 밀봉하고, 95℃에서 15분 동안 가열하였다. 이어서, 튜브를 30초 동안 와동시키고, 재가열하고, 모든 조직 샘플이 용해될 때까지 다시 와동시켰다. 조직 샘플이 여전히 뜨거운 동안에, 조직/혈액 분해 시약 II를 첨가하였고, 이어서, 튜브를 캡핑하고, 와동시키고, 30분 동안 원심분리하였다. 그 후에 원안은 혈액 샘플을 처리하기 위해서 사용된 것과 동일하였고, 마이크로스피어를 계수하였다.

특정의 시점에서 각각의 조직의 혈류를 하기 식에 따라서 계산하였다: Qm = (Cm x Qr)/Cr. Qm은 μl/min/mg로의 조직의 혈류이고, Cm은 μl/min으로의 혈액 샘플의 흐름 속도이고, Cr은 기준 혈액 샘플에서의 마이크로스피어의 수이다.

결과

홍체, 섬모체 및 맥락막에서의 혈액 흐름은 약물 투여 120분 후에 1% TPE에 의해서 유의하게 증가되었다(도 7a 내지 도 7c).

실시예 3: 허혈 발작 후의 망막 기능의 촉진

안압(intraocular pressure: IOP) 측정의 단독이 녹내장의 진단을 위한 유일한 결정자일 것이고, IOP 감소의 단독은 새로운 약물 개발에서의 유일한 평가인자가 아닐 것이다(Chiou et al., Ophthalmic Res. 18:265-269, 1986). 이상적인 항녹내장제는 IOP를 낮출 수 있고, 또한 안혈류를 개선시킬 수 있다(Hong et al., J. Ocular Pharmacol. 9:117-124, 1993). 눈의 다양한 부분에서의 혈류에 대한 연구는 약물의 작용 기전의 이해를 유도할 뿐만 아니라, 안전한 항녹내장 약물의 개발을 유도할 것이다(Chiou et al., Ophthalmic Res. 18:265-269, 1986). 또한, 망막 퇴행은, 녹내장에 버금가는, 시각상실의 주된 원인이다(Lierman, Mary Ann Liebert, Inc., New York, NY, 1987). 대부분의 망막병은 허혈 퇴행에 의해서 유발되며, 비록, 혈관확장제, 항응고제 및 혈액 점도 감소제를 포함한 다양한 작용제가 시도되었지만, 치료하기가 어렵다(O'Connor, Medcom, Inc., New York, NY, 1974). 지금까지, 이들 작용제중 어느 것도 허혈성 망막병증에 유익한 듯하지 않았다(LaVail et al.,Alan R. Liss, Inc., New York, NY, 1985.). 따라서, 허혈성 망막 퇴행을 치료하기 위해서 사용될 수 있는 새로운 작용제를 개발하는 것이 중요하다. 허혈 후의 망막 기능의 회복은 망막전위도검사(electroretinography)에서의 b-파 진폭의 회복에 의해서 측정될 수 있다. 녹내장에 추가로, AMD, DR 및 DME가 또한 망막 기능 회복을 촉진할 수 있는 이들 약물에 의해서 이익을 얻을 수 있다.

재료 및 방법

1. 재료

TP의 추출물(TPE)을 실시예 1에 따라서 제조하였다.

2. 방법

망막 허혈 실험이 앞서 기재되었다(Chiou et al., J. Ocular Pharmacol. 9:179-185, 1993, 및 Chiou et al., J. Ocular Pharmacol. 10:493-498, 1994). 망막전도(electroretinogram: ERG)를 허혈 발작 전후에 망막 기능을 분석하기 위해서 수행하였다. 각막과 접촉되어 위치된 Ag/AgCl 전극을 사용하여 ERG를 기록하였다. 하나의 스테인리스강 바늘을 기준 전극으로서 두 눈 사이에 피하 삽입시키고, 또 다른 바늘을 접지 전극으로서 목 내로 피하 삽입시켰다. 광자극기(photostimulator)(Grass PS22 Flash)를 사용하여 눈으로부터 5인치에서 빛의 섬광을 생성시켰고, ERG 전위를 기록계(polygraph) 상에 기록하였다. ERG 시스템을 LKC Technologies, Inc.(Gaithersburg, MD)로부터 구매하였다. 백색광 자극의 단일 섬광(10 msec)을 사용하여 ERG a- 및 b-파를 불러 일으켰다. 피크 b-파 진폭은 a-파의 골(trough)로부터 b-파의 피크까지 측정되었다.

적어도 2시간 암-적응된 롱스-에반스 래트(Long-Evans rats)(200-250 g)를 케타민(35mg/kg) 플러스 자일라진(5mg/kg)으로 근육내 마취시켰다. 초기 도즈의 절반을 1시간 간격으로 투여하여 충분한 마취를 유지시켰다. ERG 실험을 위해서 1% 트로피카미드(tropicamide)(50 μl)로 동공을 확장시켰다. 시신경과 뒤섬모체동맥(posterior ciliary artery) 주위에 넣은 결찰실을 사용한 중심 망막 및 뒤섬모체동맥의 폐쇄에 의해서 망막 허혈을 생성시켰다. 결찰실을 안와(eyeball socket)의 기저부에 넣은 마이크로피펫 팁(micropipette tip)을 통해서 단단하게 당겨서 망막 혈관을 30분 동안 폐쇄시켰다. 30분 동안의 망막 허혈 후에, 결찰실을 풀고, 망막 동맥을 재관류시켰다. 그 후 30, 60, 90, 120, 180 및 240분에서 ERG를 측정하였다. TPE와 비히클 둘 모두가 중심 망막 동맥의 폐쇄 전에 국소 투여되었다.

3. 통계학적 분석

모든 데이터는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 스튜던트 t-시험을 이용하여 결과의 유의성을 분석하였다. <0.05의 확률값(P)이 모든 실험에서 유의한 것으로 여겨졌다.

결과

*중심 망막 및 뒤섬모체동맥이 결찰된 때에, 이들 동맥으로의 혈류가 중단되고 ERG의 b-파가 급속히 0(제로)으로 떨어졌다. 결찰이 제거되는 때에, 혈류가 전과 같이 재개되었지만, b-파 진폭은 본래의 수준의 단지 20%로 회복되었다. 그러나, 1% TPE가 투여된 때에는, b-파 진폭이 본래의 수준의 대략 40%로 회복되었고, 약물 작용은 약물 적용 후 적어도 240분 지속되었다(도 8).

실시예 4: 레이저 유도된 AMD의 억제

연령-관련된 시력 감퇴(AMD)는 서양의 50세 초과의 환자에서의 시각 손상의 주된 질환이다. AMD의 유병률은 연령이 증가함에 따라서 증가하여 75세 또는 그 초과의 개인들 중 1/3까지가 AMD의 일부 형태를 앓고 있다. 노령화 인구에 대한 AMD의 큰 영향을 고려하면, 많은 공공 이익 및 연구는 지난 십 년 동안 이러한 조건에 집중되었다.

*AMD는 초기에 망막 색소 상피(RPE)에서의 병적 변화 및 드루젠 형성(drusen formation)과 함께 "건성" 형태로 발생하고, 지도모양 위축(geographic atrophy) 및/또는 맥락막 혈관신생(CNV)과 함께 AMD의 "습성" 형태로 진행할 수 있다(Klein, Ophthalmology 1997; 104:7-21). 탈착된 RPE 하에 부르크 막(Bruch's membrane)의 파괴가 새롭고 미숙한 맥락막 혈관을 위한 입구로서 작용하여 망막밑공간으로 성장하고, 이는 CNV의 형성을 유도한다. CNV는 채액을 누출시킬 뿐만 아니라 망막밑공간에서의 출혈을 유도하여 흐려보임, 시각 왜곡 및 갑작스런 시력 상실을 초래할 수 있다. 치료되지 않고 방치되면, 이들 병변은 원반모양 반흔으로 일컬어지는 조직화된 섬유질 반흔을 형성하도록 진행하고, 이는 전형적으로는 비가역적 중심 시력 상실을 초래한다.

재료 및 방법

TP의 추출물(TPE)을 실시예 1에 따라서 제조하였다. 래트를 2 그룹으로 무작위로 나누었다. 대조군에게는 비히클(30% HP-β-CD 용액)을 투여하였다. 시험군에게는 5 mg/ml의 TPE 점안제를 투여하였다. 모든 래트의 양 눈에 레이저 유도된 손상 1주 전 및 4주 후에 일일 3회 1 방울의 안과 용액을 투여하였다. 케타민(35mg/kg) 및 자일라진(5mg/kg)의 근육내 주사에 의해서 모든 절차를 위해서 래트를 마취시켰다. 동공을 각각 한 방울씩의 10mg/ml의 아트로핀 및 25mg/ml의 페닐에프린으로 확장시켰다. 안저부를 VOLK super Pupil XL Biomicroscopy Lens (Keeler Instruments Inc., Broomall, PA, USA)에 의해서 가시화시켰다. 이중 주파수 Nd:YAG 레이저(Laserex LP3532; Lumenis Inc., Salt Lake City, UT, USA)를 532nm 파장에서 사용하였다. 레이저 파라미터는 100μm 스폿 사이즈(spot size), 0.15-초 노출 및 150-200 mw 파워에 의해서 사용되었다. 시신경 둘레에서 대체로 동일한 거리로 안구의 안저부에 5개의 레이저 스폿을 형성시켰다. 극심한 증기포(Acute vapor bubble)는 부르크 막의 파괴를 암시하였다. 기포 형성이 있는 레이저 스폿만이 연구에 포함되었다. 망막하 출혈이 있는 병변은 배제되었다. 플루오레세인 혈관 조영술(fluorescein angiography: FA)을 디지털 안저부 카메라(TRC-50EX; TOPCON, Tokyo, Japan)로 레이저 치료 2 및 4주 후에 수행하였다. 100 mg/ml의 플루오레세인 소듐 염을 설하 정맥을 통해서 주입(0.5ml/kg)하였다. 초기(2분 이내) 및 후기(7분 초과) 둘 모두의 플루오레세인 상을 포착하였다. 100 mg/ml 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란을 3 방울의 플루오레세인 소듐 염 주입 후에 설하 정맥을 통해서 주입(1.4mg/kg)하였다. 플루오레세인 사진을 20분 내에 찍었다. 가장 명백한 사진을 Imagenet2000 디지털 영상화 시스템(Topcon Medical Systems, Inc., Paramus, NJ. USA)에 의한 CNV 형성 측정의 영역을 위해서 선택하였다.

결과

래트 눈의 부르크 막이 레이저 빔에 의해서 파괴된 때에, 플루오레세인 누출이 플루오레세인 혈관 조영술에 의해서 측정되었다. CNV 형성의 영역을 컴퓨터로 정량적으로 측정하고 mm²로 나타냈다. 도 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 대조군 눈은 1% TPE 투여에 의해서 유의하게 억제된 대략 2.5 mm² CNV 영역을 생성시켰다.

실시예 5: NaIO ₃ -유도된 건성 AMD의 감소

2004년 분석은 40세 초과의 미국인 중에 1.47%의 인구에서 적어도 한 눈에 AMD 및/또는 지도모양 위축(geographic atrophy)이 나타났으며, 1.75 백만의 개인들이 AMD를 앓고 있다고 보고하였다. AMD의 유병률은 연령이 증가함에 따라서 극적으로 증가했으며, 80세 초과의 백인 노인 여성의 15% 초과가 혈관 신생 AMD 및/또는 지도모양 위축을 앓고 있다. 7 백만 명 초과의 개인들이 AMD를 발병할 실질적인 위험에 있다. 급속한 노령화 인구로 인해서, AMD를 앓고 있는 사람의 수는 2020년에는 2.95 백만 명까지 50% 증가할 것이다. 또 다른 연구에서, AMD는 미국의 백인 인구 중에서 모든 현재의 시각상실의 54%에 대한 원인인 것으로 보고되었다. 그러한 연구는 미국에서의 맹인의 수가 2020년까지 70% 만큼 많이 증가할 수 있음이 예측되었다. 이러한 연구는 요오드산 나트륨 (NaIO₃) 유도된 망막 색소 상피(RPE) 퇴행에 대한 TPE의 효과를 관찰하는 것이다.

재료 및 방법

TP의 추출물(TPE)을 실시예 1에 따라서 제조하였다. 전체 30 마리의 주령 8주 웅성 Brown-Norway(BN) 래트를 3개의 그룹, 10 마리 래트의 정상군, 10 마리 래트의 NaIO₃ 군 및 10 마리 래트의 TPE + NaIO₃ 군으로 무작위로 나누었다. 대조군에게는 NaIO₃ 주입 없이 용매 (2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, Sigma-Aldrich) 단독을 투여하였다. NaIO₃ 군에게는 설하 정맥을 통해서 용매 + 35mg/kg NaIO₃를 투여하는 반면에; TPE + NaIO₃군에게는 1% TPE 점안제 + 35 mg/kg NaIO₃ 주입으로 투여하였다. 모든 래트의 양 눈에는 NaIO3 주입 1주 전 및 4주 후에 일일 3회 1 방울로 투여하였다. 2주 및 4주의 마지막에, RPE 기능을 ERG의 c-파로 측정하였다.

BN 래트를 2시간 동안 암실 적응시키고, 이어서, 케타민 35mg/kg + 자일라진 5 mg/kg를 근육 내로 투여하여 마취시켰다. 초기 도즈의 절반을 그 후 1 시간마다 투여하였다. 모든 래트의 동공을 각각 한 방울씩의 1%의 아트로핀 및 2.5%의 페닐에프린으로 확장시켰다. 기록 전에, 한 방울의 0.5% 테트라케인(tetracaine)을 표면 마취를 위해서 투여하였다. 모든 래트를 ERG 측정 동안 따뜻하게 유지시켰다. Peachey에 의해서 개발된 DC-ERG 기록 방법을 따랐다. 요약하면, 행크스 균형된 염 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 충전된 필라멘트의 1-mm 직경 유리 모세관 튜브(Sutter Instruments, Novato, CA)를 사용하여 부착된 커넥터를 구비한 Ag/AgCl 와이어 전극과 연결하였다. 전극을 각막 표면에 위치시켰다. 반응을 증폭시키고(dc-100 Hz; 증폭율 = 1000X; DP-31, Warner Instruments, Hamden, CT), 10Hz 또는 1000Hz에서 디지털화하였다. 데이터를 iWORX LabScribe Data Recording Software(iWorxOCB Sciences, Dover, NH)에 의해서 분석하였다. 자극 휘도를 조절하도록 광 경로에 위치된 중성 밀도 필터(neutral density filter)(Oriel, Stratford, CT)가 구비된 광섬유 고강도 발광체(fiber-lite high intensity illuminator)(Dolan-Jenner Industries, Inc. MA)를 사용하여 광 채널로부터 광 자극을 유도하였다. 본 실헌에서 사용된 자극 휘도는 3.22 log cd/m²이었고, 4분 동안 자극되었다. 휘도 보정은 래트 눈이 위치된 광섬유 다발의 출력측에 집중된 Minolta (Ramsey, NJ) LS-110 광도계에 의해서 이루어졌다.

결과

래트를 NaIO₃로 처리하였을 때에, 그것은 특히 RPE 세포의 퇴행을 유발시켰다. 그 결과, NaIO₃를 사용하여 건성 AMD 동물 모델을 발생시키고, 손상된 세포 기능을 ERG의 c-파 진폭으로 측정하였다. 도 10으로부터 알 수 있는 바와 같은, ERG의 대조 c-파는 NaIO₃에 의해서 현저하게 억제되었다. 그러나, 1% TPE에 의한 NaIO₃-처리된 래트의 처리는 이의 ERG의 c-파를 현저하게 역전시킬 수 있다. NaIO₃는 특히 눈에서의 RPE 세포를 퇴행시키기 위한 강력한 독소이다. 그 결과, ERG의 c-파는 NaIO₃-처리된 눈에서 거의 완전히 억제시켰다(도 10). 이러한 NaIO₃ 유도된 건성 AMD 모델이 1% TPE에 의해서 3배 역전될 수 있다는 것을 주지하는 것이 중요하다(도 10). 건성 AMD가 시력상실을 유발시키는 아주 안 좋은 질환이기 때문에, 건성 AMD를 예방/치료할 수 있는 어떠한 약물이 매우 가치있을 수 있다.

당업자에게는 상기 기재된 실시형태의 광범위한 발명 개념으로부터 벗어나지 않으면서 그러한 실시형태에 대해서 변화가 이루어질 수 있다는 것이 인정될 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정의 실시형태로 한정되지 않으며 첨부된 청구범위에 의해서 정의된 본 발명의 사상 및 범위 내의 변화를 포괄하는 것으로 의도된다는 것을 이해해야 한다.

Claims

대만 그린 프로폴리스의 추출물(extract of Taiwanese green propolis: TPE)을 포함하는, 안과 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 안혈류의 향상을 위한 약제학적 조성물로서,
TPE가 (i) 대만 프로폴리스를 95% 에탄올로 45℃에서 48 시간 동안 추출하여 제 1 추출물을 얻는 단계; (ii) 제 1 추출물의 가용성 분획을 수거하는 단계; 및 (iii) 가용성 분획을 2 내지 10배로 농축시켜 TPE를 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해서 대만 프로폴리스로부터 제조되어, TPE 1g이 100 mg 이상의 프로폴린(propolin) C, 80 mg 이상의 프로폴린 D, 30 mg 이상의 프로폴린 F, 및 50 mg 이상의 프로폴린 G을 함유하고, TPE 1g이 350 mg 이상의 전체 프로폴린을 함유하고,
약제학적 조성물이 산화성 스트레스 및/또는 저산소증-유도된 손상을 앓고 있는 망막 색소 상피(RPE) 세포의 생존율을 향상시키기에 효과적이고, 동시에, 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)의 생존율에 효과가 없거나 거의 없거나, HUVEC의 생존율을 감소시키기에 효과적인 양으로 대상체에 투여되는, 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
경구 투여, 비경구 주입, 유리체내 주입(intravitreal injection), 또는 피부 패치(skin patch)를 통해서 투여되는, 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
안연고, 아이 겔(eye gel), 아이 크림(eye cream) 또는 점안제(eye drop)로 제형화되는, 약제학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
약제학적 조성물이 녹내장(glaucoma), 연령-관련된 시력 감퇴(age-related macular degeneration: AMD), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 시신경병증(optic neuropathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema), 포도막염(uveitis), 및 노년 백내장(senile cataract)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 안과 질환의 치료에 사용되는, 약제학적 조성물.