TWI766565B

TWI766565B - 用於治療眼疾的組合物及其用途

Info

Publication number: TWI766565B
Application number: TW110103336A
Authority: TW
Inventors: 廖繼洲
Original assignee: 彥臣生技藥品股份有限公司
Priority date: 2015-02-26
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2022-06-01
Also published as: KR20170132176A; WO2016134660A1; US9370503B1; TWI719962B; TW202133841A; CA2977697C; JP2018506587A; TW201705953A; AU2016223994A1; EP3261635B1; KR102082351B1; CN107530319A; CN107530319B; EP3261635A1; EP3261635A4; AU2016223994B2; JP6700315B2; CA2977697A1

Abstract

本發明提供一種包含式(A)化合物之組合物及其用於製備治療眼疾藥物的用途，其中該組合物包含式(A)化合物，以及一醫藥上可接受之載體。

Description

用於治療眼疾的組合物及其用途

本發明係關於一種用於治療眼疾的方法。

隨著人口逐漸老化，視力的惡化越趨明顯及嚴重。有許多與老化密切相關眼疾，例如青光眼、老年性黃斑部病變(AMD)，視神經病變、缺血性視網膜病變、糖尿病視網膜病變、白內障、飛蚊症、近視、或散光與老花等。這些眼疾是引起視力障礙，甚至失明的主要疾病。

視網膜色素上皮細胞(RPE)係由單層細胞構成，並位於視網膜感光受器以及脈絡膜血管間，其對於機械性及代謝性支持感光受器上扮演著重要角色。此外，RPE的功能障礙是造成某些眼疾的主因，例如增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、葡萄膜炎以及AMD。AMD及其他疾病，例如糖尿病性視網膜病變(DR)，很可能與由光或代謝反應衍生的氧自由基的效應息息相關。

另一方面，眼部血流量亦與許多眼疾密切相關，包括青光眼、缺血性視網膜病變、以及老年性黃斑部病變(AMD)。因此，維持正常的眼部血流量對於預防/治療前述眼疾而言是必須的。

在美國及西歐，超過65歲的人中，老年性黃斑部病變(AMD)是導致眼盲的主要原因。在兩大洲中常見的危險因子包括年齡增加、吸煙、高血壓、心絞痛以及陽性家族史。AMD以非滲出及滲出兩種形式存在。非滲出型涉及中央視網膜萎縮以及中央視力緩慢及漸進的損失。滲出型的特徵在於，新血管生長穿過布魯赫膜(Bruch’s membrane)而進入視網膜下腔，以及經由血管生成的過程而發展的脈絡膜血管新生(CNV)。血管生成時常由缺血及缺氧所誘發。因為黃斑部僅具有單一的血液供應，而在體內視網膜具有最高的氧氣攝取量，因此，觀察到缺血與AMD的發展有強烈的關聯性並不令人意外(Strauss O.,Physiol.Res.2005；85(3)：845-881)。

由於上皮在氧氣張力以及與氧氣自由基有關的壓力下極為脆弱，在與缺血有關的疾病過程中，RPE內所產生的活性氧族群(ROS)可能對於RPE細胞造成損傷。AMD的一個重要的“早期”事件為，因為氧化損傷而造成RPE細胞的損失。氧化壓力被確認可涉及數種與老化相關的慢性疾病的病因，例如癌症、糖尿病、神經退化疾病及心血管疾病。

本發明係不可預期地發現一種具有式(A)的異戊烯基二氫黃酮化合物，其可有效治療眼疾：

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇獨立地代表-H、-OH、直鏈或支鏈烷基、或取代或未取代以-OH的異戊二烯基。

因此，在一方面，本發明提供一種在有需要的個體中治療眼疾的方法，其包含對該個體投予有效量的式(A)化合物。

另一方面，本發明提供一種用於治療眼疾的組合物，其包括式(A)化合物，以及一醫藥上可接受之載體。

所述式(A)化合物係經由本領域中習知的方法以化學合成得到。

應理解前述一般說明及以下詳細說明，對本發明而言都僅為示例性及解釋性的，而非限制性的。

前述的發明內容，以及以下的詳細說明，結合附圖一起閱讀將得到更佳的理解。為了說明本發明的目的，在圖例中顯示目前較佳的具體實施例。

在圖式中：圖1A顯示式(II)化合物對於ARPE-19細胞增生的影響。將ARPE-19細胞與式(II)化合物(“(II)”)一起培養72小時。圖1B顯示(II)對於HUVECs 增生的影響。將HUVECs與(II)一起培養72小時。數據係以平均值±SEM表示。每組n=6；(II)組相對於載體對照組而言，^* P<0.05，^** P<0.01。

圖2A顯示(II)對於ARPE-19細胞中缺氧誘導損傷的影響。將ARPE-19細胞與(II)一起培養72小時。圖2B顯示(II)對於HUVECs中缺氧誘導損傷的影響。將HUVECs與(II)一起培養72小時。對照組係在正常條件(5% CO₂和95%空氣)下以載體(30% HP-β-CD溶液)處理72小時；模型對照組係在缺氧條件(1% O₂，5% CO₂和94% N₂)下以載體處理72小時。數據以平均值±SEM表示。每組n=6；相對於模型對照組，^* P<0.05及^** P<0.01。

圖3A顯示(II)對於ARPE-19細胞中NaIO₃誘導損傷的影響。將ARPE-19細胞與(II)及NaIO₃一起培養72小時。圖3B顯示(II)對於HUVECs中NaIO₃誘導損傷的影響。將HUVECs與(II)及NaIO₃一起培養72小時。數據以平均值±SEM表示。每組n=6；相對於模型對照組，^* P<0.05及^** P<0.01。

圖4A顯示(II)對於ARPE-19細胞中H₂O₂誘導損傷的影響。將ARPE-19細胞與(II)及H₂O₂一起培養24小時。圖4B顯示(II)對於HUVECs中H₂O₂誘導損傷的影響。將HUVECs與(II)及H₂O₂一起培養24小時。數據以平均值±SEM表示。每組n=6；相對於模型對照組，^* P<0.05及^** P<0.01。

圖5A顯示(II)對於ARPE-19細胞中NaN₃誘導損傷的影響。將ARPE-19細胞與(II)及NaN₃一起培養72小時。圖5B顯示(II)對於HUVECs中NaN₃誘導損傷的影響。將HUVECs與(II)及NaN₃一起培養72小時。數據以平均值±SEM表示。每組n=6；相對於模型對照組，^* P<0.05及^** P<0.01。

圖6A顯示(II)對於ARPE-19細胞中t-BHP誘導損傷的影響。將ARPE-19細胞與(II)及t-BHP一起培養12小時。圖6B顯示(II)對於HUVECs中 t-BHP誘導損傷的影響。將HUVECs與(II)及t-BHP一起培養12小時。數據以平均值±SEM表示。每組n=6；相對於模型對照組，^* P<0.05及^** P<0.01。

圖7A-7C顯示1%的式(I)化合物(“(I)”)對於高眼壓兔(Ocular Hypertensive Rabbit)中眼部血流量的影響，其中圖7A顯示在Qm中虹膜的血液流量；圖7B顯示Qm中睫狀體的血液流量；以及圖7C顯示Qm中脈絡膜的血液流量。

圖8A-8C顯示1%的(II)化合物對於高眼壓兔中眼部血流量的影響，其中圖8A顯示在Qm中虹膜的血液流量；圖8B顯示Qm中睫狀體的血液流量；以及圖8C顯示Qm中脈絡膜的血液流量。

圖9顯示(I)對於缺血損傷後大鼠視網膜功能的b波恢復情況。星號代表對照組與試驗組間的顯著差異，其P<0.05(*)及P<0.01(**)。

圖10顯示(II)對於缺血損傷後大鼠視網膜功能的b波恢復情況。星號代表對照組與試驗組間的顯著差異，其P<0.05(*)。

圖11顯示1%的(II)對於雷射誘導AMD大鼠模型的影響。星號代表兩個數值間的顯著差異，其P<0.05。

圖12顯示1%的(II)對於NaIO₃誘導的乾性AMD大鼠模型的影響。星號代表兩個數值間的顯著差異，其P<0.05。

圖13顯示合成式(I)化合物的示意圖。

圖14顯示合成式(II)化合物的示意圖

在一方面，本發明提供一種在有需要的個體中治療眼疾的方法，其包含對該個體投予有效量的式(A)化合物：

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇獨立地代表-H、-OH、直鏈或支鏈烷基、或取代或未取代以-OH的異戊二烯基。式(A)化合物的一些實例可見於美國專利第7,585,892號，以引用方式將其全文併入本文中。

式(A)化合物係經由本領域中習知的方法以化學合成得到。

舉例而言，式(I)化合物可經由如圖13所示的流程I合成得到：

在另一實例中，式(II)化合物可經由如圖14所示的流程II合成得到：

本發明所使用的式(A)化合物包括但不限於一種具有式(I)至(X)中任一結構的化合物：

；以及

本文所使用術語「眼疾」係指與眼部相關的疾病，包括但不限於青光眼、老年性黃斑部病變(AMD)、缺血性視網膜病變、視神經病變、糖尿病性視網膜病變(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、葡萄膜炎以及老年性白內障。所述眼疾可以是一種與眼部血流量減少相關的疾病或病症，包括但不限於青光眼、缺血性視網膜病變、DR以及AMD。所述眼疾可以是一種與氧化壓力及/或缺氧誘導損傷相關的眼部疾病或病症，更具體地為視網膜色素上皮細胞(RPE)，包括但不限於青光眼、AMD、缺血性視網膜病變、視神經病變、DR以及DME。

如本文所使用的術語「有效量」係指一足夠量的式(A)化合物，其可提供所需的治療效果，或誘導特定的反應。所需的有效量因個體而有所不同，取決於個體的疾病狀態、身理條件、年齡、性別、物種及重量等而定。然而，本領域技術人員僅使用常規的試驗方法即可確認適當的有效量。在本發明的一具體實施例中，所述有效量為可有效提高遭受氧化壓力及/或缺氧誘導損傷的RPE細胞的存活率的量。在一較佳的具體實施例中，所述有效量為可有效提高遭受氧化壓力及/或缺氧誘導損傷的RPE細胞的存活率，且同時對人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的存活率影響微小或無影響，或可有效降低HUVECs的存活率的量。在本發明的另一具體實施例中，所述有效量為可有效增加眼部血流量的量。在又一具體實施例中，所述有效量為可有效降低脈絡膜血管新生(CNV)的量。在另一具體實施例中，所述有效量為可有效增強RPE功能的量，藉由至少增強或恢復其c-波振幅(以ERG測量)。舉例而言，可將式(A)化合物口服地投予至個體，每天1-3次。針對每次口服給藥，式(A)化合物的劑量可為0.5至50mg，較佳地為2-25mg。亦可經由眼科給藥方式將式(A)化合物投予至個體，一次1-10施用量，一天1-10次，較佳地為一次1-5施用量，一天1-4次。舉例而言，每次可使用包含式(A)化合物的製劑3滴，一天3次。針對局部眼科給藥，可使用0.01-10%的式(A)化合物，較佳可使用0.1-1.0%的式(A)化合物。

在本發明的實例中，證實式(A)化合物能有效地治療各種眼疾，例如缺血性損傷後的視網膜功能障礙，以及雷射誘導的AMD。

因此，可將式(A)化合物投予至患有眼疾的個體，其中該眼疾係選自於由青光眼、老年性黃斑部病變(AMD)、缺血性視網膜病變、視神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、葡萄膜炎及老年性白內障所組成的群組。在本發明的一實例中，該眼疾為AMD。在一特定具體實施例中，該眼疾為乾性AMD。該眼疾可為或非為一眼癌。

再一方面，本發明提供一種組合物用於製備透過增加眼部血流量及增強視網膜色素上皮細胞(RPE)功能治療相關眼疾藥物之用途，其中該組合物包含選自由化合物(I)-(X)組成的群組中至少二化合物之組合。

根據本發明之一實施例，其中該組合物包含化合物(I)或化合物(II)。

根據本發明之一實施例，其中該組合物包含化合物(I)或化合物(II)及選自由化合物(I)-(X)組成之群之至少二化合物之組合。

根據本發明之一實施例，該組合物為蜂膠製備物或萃取物。

根據本發明之一實施例，該組合物為血桐製備物或萃取物。

另一方面，本發明提供一種用於治療眼疾的醫藥組合物，其包含式(A)化合物或其組合物，以及一醫藥上可接受之載體。

本發明之醫藥組合物可藉由習知之方法以一或多種醫藥上可接受之載體來製備。本文所使用的術語「醫藥上可接受之載體」包含任何標準的藥物載體。該類載體包括但不限於：鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、丙二醇，聚氧乙烯蓖麻油、奈米粒子、脂質體、聚合物及其組合。

本發明之醫藥組合物可調製為適用於所選擇的任何給藥模式的形式。舉例而言，適合於口服給藥的組合物包括固體形式，如丸劑、膠囊劑、顆粒劑、片劑及粉劑，以及液體形式，如溶液、糖漿、酏劑及懸浮劑。用於局部給藥的形式包括乳膏、軟膏、凝膠、懸浮液、滴劑、乳劑、經皮貼片。

除了標準載體外，本發明的口服用醫藥組合物可輔以一或多種賦形劑，其係通常用於口服製劑中，如界面活性劑、吸入劑、增溶劑、穩定劑、乳化劑、增稠劑、著色劑、甜味劑、調味劑及防腐劑。此類賦形劑係本領域中的技藝人士所習知。

根據本發明，該醫藥組合物可經由例如口服給藥、胃腸外注射、眼注射(例如，玻璃體內注射)、經皮貼片、或對眼睛局部給藥的任何途徑進行給藥。用於局部給藥的醫藥組合物可配製為眼膏劑、眼膠劑、眼霜劑或眼藥水的形式。

在一較佳具體實施例中，該醫藥組合物包含式(I)化合物：

在另一較佳具體實施例中，該醫藥組合物包含式(II)化合物：

通過以下實例進一步說明本發明，該等實例係以示例之目提供，而非限制之目的。

實例

實例1：式(A)化合物的合成

經由圖13所述的流程I合成式(I)化合物。經由圖14所述的流程II合成式(II)化合物。使用流程II，可合成如圖14所示的式(B)化合物，其中R1、R2、R3及R4係獨立地選自由氫基(H)及香葉基所組成的群組中。

實例2：式(II)化合物對於ARPE-19細胞或HUVECs中氧化誘導損傷的影響

材料與方法

1.材料

溴化噻唑藍四氮唑(Thiazolyl blue tetrazolium bromide)(MTT，純度

97.5%)、杜氏磷酸鹽緩衝液(Dulbecco’s phosphate buffered saline；DPBS)、過氧化氫(H₂O₂，50wt.%水溶液)、叔丁基過氧化氫(t-BHP，70wt.%水溶液)、碘酸鈉(NaIO₃，純度

99.5%)、疊氮化鈉(NaN₃，純度

99.5%)以及Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s F12(DMEM/F12，1：1)係購自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)。人類視網膜色素上皮(ARPE-19)細胞、人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)、胎牛血清(FBS)、血管細胞基礎培養基和內皮細胞生長套組係購自ATCC(Manassas,VA,USA)。

人類視網膜色素上皮(RPE)細胞是為位於光細胞與脈絡膜層之間的關鍵/獨特細胞，以提供養分予光細胞，並將代謝廢棄物從光細胞處移除以維持正常/良好的視覺功能/活性。另一方面，HUVECs係位於全身的脈管中，包括脈絡膜及視網膜血管。藉由脈絡膜血管新生而使其特別有礙於視覺功能。以VEGF抑制劑抑制血管新生為降低血管生成/血管新生而用於治療濕性AMD的主要機制。因此，可促進RPE細胞增生/生長，但對於HUVECs細胞生長無效果或呈抑制作用的藥劑可能有用於預防/治療AMD。

2.細胞培養

使ARPE-19細胞生長於補充了10% FBS、100 units/ml青黴素G、以及100μg/ml硫酸鏈黴素的DMEM/F12培養基中。使HUVECs生長於補充了內皮細胞生長套組的血管細胞基礎培養基中。將細胞培養於37℃下含5% CO₂及95%空氣的增濕培養箱中。

3.式(II)化合物對於ARPE-19細胞或HUVECs的存活率影響

使用MTT檢測法量測ARPE-19細胞或HUVECs的存活率。將2×10⁵個ARPE-19細胞或5×10⁴個HUVECs播種於96-孔培養盤中(100μl/孔)，並使其生長過夜。藉由添加不含細胞的培養基，作為陰性對照組。接著，以含有式(II)(“(II)”)化合物(0.03、0.1、0.3、1、3及10μg/ml)及/或氧化劑(NaIO₃、 H₂O₂、t-BHP及NaN₃)的新鮮培養基處理細胞12、24、或72 hours(200μl/孔)。載體控制組係以載體處理。在培養孔中添加20μl MTT(5mg/ml)，並另外培養4小時。經培養後，移除培養基並加入100μl DMSO使來自存活細胞中MTT的三本基甲臢(formazan)溶解。使用微量盤分析儀(Bio-Rad Laboratories,Inc.,CA測量在570nm的吸光值。根據以下公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)=(測試樣本的吸光值-陰性對照組的吸光值)/(載體對照組的吸光值-陰性對照組的吸光值)×100%。

4.缺氧處理

使細胞貼附過夜，然後在缺氧環境下使其暴露於(II)或載體中72小時。使用搭配O₂及CO₂控制器且具有N₂及CO₂氣體來源的可控制溫度及濕度環境的C-腔室(Proox Model 110 and Pro CO₂ Model 120,Bio Spherix Ltd.,Redfield,NY,USA)維持缺氧環境(1% O₂、5% CO₂及94% N₂)。

5.統計分析

所有數據以平均值±S.E.M表示. 使用學生t檢定進行統計分析。P<0.05被認為具有統計顯著性。

結果

1.(II)對ARPE-19細胞及HUVECs中細胞毒性的影響

結果顯示由0.03μg/ml至3μg/ml的(II)並不會影響ARPE-19細胞或HUVECs的增生效果。然而，在10μg/ml的濃度下，(II)分別顯著地抑制ARPE-19細胞及HUVECs的增生效果達34%及92%(圖1A和1B)。然而，前者較後者低很多。

2.(II)對於ARPE-19細胞及HUVECs中缺氧誘導損傷的影響

在缺氧環境下，由0.03μg/ml至3μg/ml的(II)對於ARPE-19細胞的存活率無影響(圖2A)。在10μg/ml的濃度下，(II)可反轉ARPE-19細胞中因缺氧所誘導的損傷達24%。在缺氧環境下，當濃度為0.03、0.1及0.3μg/ml時，雖然(II)可分別顯著地增加HUVECs的存活率達22%、19%及26%(圖2B)，而在10μg/ml的濃度下，(II)可顯著地降低HUVECs的存活率達97%(P<0.01)。

3.(II)對於ARPE-19細胞及HUVECs中NaIO₃誘導損傷的影響

在0.03、1、3及10μg/ml的濃度下，(II)可顯著地反轉因30μg/ml的NaIO₃所誘導損傷的ARPE-19細胞存活率(P<0.05，圖3A)。在10及3μg/ml的濃度下，(II)亦可分別反轉因100及300μg/ml的NaIO₃所誘導損傷的ARPE-19細胞存活率達24%及7%(P<0.05，圖3A)。然而，在3及10μg/ml的濃度下，(II)增強NaIO₃所誘導的HUVECs損傷(圖3B)。

4.(II)對於ARPE-19細胞及HUVECs中H₂O₂誘導損傷的影響

在10μg/ml的濃度下，(II)可分別反轉因200μM及400μM的H₂O₂所誘導損傷的ARPE-19細胞存活率達55%及72%(P<0.01，圖4A)。另一方面，0.3及1μg/ml的(II)亦可反轉因H₂O₂誘導的HUVECs損傷。然而，10μg/ml的(II)可分別增強因200及400μM的H₂O₂所誘導的HUVECs損傷達63%及42%(P<0.01，圖4B)。

5.(II)對於ARPE-19細胞及HUVECs中NaN₃誘導損傷的影響

由0.03μg/ml至10μg/ml的(II)可顯著地反轉因NaN₃所誘導的ARPE-19細胞損傷(圖5A)。在10μg/ml的濃度下，(II)可分別增強因0.3、1及3mM的NaN₃所造成的HUVECs損傷達95%、75%及71%(P<0.01，圖5B)。3μg/ml(II)亦增強因0.3及3mM的NaN3所誘導的HUVECs損傷達75%及44%(圖5B)。

6.(II)對於ARPE-19細胞及HUVECs中t-BHP誘導損傷的影響

(II)可顯著地反轉因t-BHP所誘導的ARPE-19細胞損傷(圖6A)。然而，10μg/ml的(II)可分別增強因50、100及200μM的t-BHP所誘導的HUVECs損傷達71%、80%及76%(P<0.01，圖6B)。3μg/ml的(II)亦可增強50及100μM的t-BHP所誘導的HUVECs損傷達27%及21%(圖6B)。

實例3：眼睛血流量(OBF)的增強

眼部血流量係緊密地關聯於多種眼部疾病，包括青光眼、缺血性視網膜病變、糖尿病性視網膜病變及老年性黃斑部病變(AMD)。因此，維持正常的眼睛血流量對於預防/治療前述眼部疾病而言是必要的。

材料及方法

1.材料

採購0.5%的愛爾卡因(Alcaine)市售品。於實驗室製備20%滅菌的高張鹽水溶液。由E-ZTrac(Los Angeles,CA)採購有色微球體。以含有0.01%(v/v)Tween 80的鹽水稀釋有色微球體以防止其互相黏聚。在每個時間點下以注射每0.4ml含2百萬個微球體的溶液。

重量為2-3.0公斤的紐西蘭雌兔由市售購得。動物照護及處理係依照相關制度的指導準則進行。

2.方法

以35mg/kg氯胺酮和為5mg/kg甲苯噻嗪藉由肌內注射麻醉兔子。在之後，每一小時給藥初始劑量的一半。經由右頸動脈插管至左心室，以進行有色微球體的注射，而在股動脈上插管以收集血液樣本。在左眼處以一滴鹽酸丙美卡因眼藥水(Bausch & Lomb,Inc.,Tampa,FL,USA)處理。針直接插入左眼的前室中，並使其連接於40mmHg的食鹽水壓力計上。高眼壓模型使眼睛血流量降低至約正常值的三分之一。在建立高眼壓模型後30分鐘，取10g/l的黃酮或載體(30% HP-β-CD溶液)50μl局部灌輸於左眼。以該化合物或載體處理後經0、30、60及120分鐘後以有色微球體測量眼睛血流量。在每個時間點，注射2百萬個微球體作為對照，在微球體注射剛好一分鐘後，從股動脈收集血液樣本。將血液樣本收集在肝素化的試管中，並記錄體積。於最終血液取樣後，注射100mg/kg戊巴比妥鈉使兔子安樂死。摘除左眼，並解剖成虹膜、睫狀體、視網膜及脈絡膜。秤重所有組織。

由E-Z Trac(Los Angeles,CA,USA)提供所有樣本處理及微球體計數的操作細節。簡言之，加入血液溶血試劑至含有血液樣本的微量離心管中，然後震盪混合並在6000rpm下離心30分鐘。移除上清液，然後添加組織/血液消化試劑I及II。在試管上加蓋，然後震盪混合並離心30分鐘。移除上清液，添加計數試劑，震盪混合後離心15分鐘。移除上清液，以精確體積的計數試劑重新懸浮微球體。在顯微鏡下以血球計數器計算微球體的數目。將組織/血液消化試劑I加入含有組織樣本的微量離心管中，密封並在95℃下加熱15分鐘。然後，震盪混合試管30秒，再加熱並再震盪混合，直到組織樣本完全溶解。在組織樣本仍處於高溫下，加入組織/血液消化試劑II，然後在試管上加蓋、震盪混合並離心30分鐘。其後的操作程序與處理血液樣本一樣，並進行微球體計數。

根據以下公式計算在某個時間點下每個組織的血流量：Qm=(Cm x Qr)/Cr。Qm是組織的血流量，單位為μl/min/mg，Cm是組織中微球體的數量，Qr是血液樣本的流速，單位為μl/min，而Cr則為在對照血液樣本中的微球體數量。

結果

在灌輸藥物30分鐘後，1%的式(I)(“(I)”)化合物及1%的(II)可使虹膜及脈絡膜的血液流量顯著提高(分別為圖7A-7C及圖8A-8C)。

實例4：缺血性損傷後視網膜功能的促進

單獨量測眼內壓(IOP)不應該是診斷青光眼的唯一決定因素，單獨降低IOP不應該是新藥開發的唯一評估法(Chiou et al.,Ophthalmic Res.18：265-269,1986)。理想的抗青光眼藥劑應該能降低IOP，並可改善眼部血流量(Hong et al.,J.Ocular Pharmacol.9：117-124,1993)。在眼睛不同部位的血流量研究不僅會提供對於藥物作用機制的理解，亦可有利於更安全的抗青光眼藥物的開發(Chiou et al.,Ophthalmic Res.18：265-269,1986)。此外，僅次於青光眼，視網膜退化是導致失明的主要原因(Lierman,Mary Ann Liebert,Inc.,New York,NY,1987)。大多數視網膜病變是由缺血性退化所造成，即便已經試驗了多種藥劑，包括血管舒張劑、抗凝血劑及血液減粘劑，仍是難以治療此病症(O’Connor,Medcom,Inc.,New York,NY,1974)。迄今為止，這些試劑中並沒有似乎可用於缺血性視網膜病變(LaVail et al.,Alan R.Liss,Inc.,New York,NY,1985)。因此，開發一種可用於治療缺血性視網膜退化的新藥劑是重要的。缺血後視網膜功能的恢復可以藉由視網膜電流圖中的b波振幅的回復來確定。除了青光眼外，這些可促進視網膜功能恢復的藥劑亦可有利於治療AMD、DR及DME。

材料及方法

1.方法

先前文獻已說明視網膜缺血試驗(Chiou et al.,J.Ocular Pharmacol.9：179-185,1993,and Chiou et al.,J.Ocular Pharmacol.10：493-498,1994)。進行視網膜電流圖(ERG)評估在缺血損傷前後的視網膜功能。使用與角膜接觸的Ag/AgCl電極紀錄ERG。將一根不銹鋼針頭插入兩眼間的皮下處當作參考電極，另一根針則插入頸部皮下處作為接地電極。使用光刺激器(Grass PS22 Flash)在離眼睛5英吋處產生閃光，以波動掃描器紀錄ERG電位。ERG系統係購自LKC Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD)。使用白光刺激的單道閃光(10毫秒)引起ERG的a-及b-波。由a-波的波谷至b-波的波峰處測量b-波的波峰振幅。

使Long-Evans大鼠(200-250g)於暗處適應至少2小時，接著以肌肉內注射氯胺酮(35mg/kg)加上甲苯噻嗪(5mg/kg)進行麻醉。每間隔一小時給藥初始劑量的一半以維持適當的麻醉狀態。以1%的托吡卡胺(50μl)使瞳孔擴張，以利進行ERG試驗。使用置於視神經及睫狀後動脈附近的縛線使中央視網膜與睫狀後動脈閉塞而產生視網膜缺血。使用微量移液器尖管將放置於眼睛窩底部的縛線綁緊，以閉塞視網膜血管30分鐘。在30分鐘的視網膜缺血後，放開縛線，使視網膜動脈再次流通。其後30、60、90、120、180及240分鐘，測量ERG。在閉塞中央視網膜動脈前，進行化合物及載體的局部給藥。

2.統計分析

所有數據以平均值±SEM表示。使用學生t檢定分析試驗結果的顯著性。在所有試驗中，概率值(P)<0.05被認為是具有顯著性。

結果

當將中央視網膜及睫狀後動脈綁住時，流至這些血管的血液被迫停止，使得ERG的b-波迅速降至零。當鬆綁時，血流恢復往常，而b-波振幅僅回復至起始值的20%。然而，當灌輸1%的(I)時，b-波振幅回復至起始值的約50%(圖9)，且藥物的作用可在施用藥物後持續至少240分鐘。

以1%的(II)處理可獲得類似的結果，唯一不同的是，藥物作用的時程較短，約可持續120分鐘(圖10)。然而，其效用約與1%的(I)相同。

實例5：雷射誘導AMD的抑制

老年性黃斑部病變(AMD)是在西方國家中超過50歲視力障礙患者的主要疾病。AMD的發病率隨著年齡而增加，因此75歲及以上人士中有三分之一患有某種形式的AMD。由於AMD對人口老化的巨大衝擊，在過去十年中，很多公眾關注及研究一直專注這種病症。

AMD最初係發生於視網膜色素上皮細胞(RPE)產生病理性變化以及玻璃膜疣形成的“乾燥”型態，其可能發展成具有脈絡膜血管新生(CNV)的地圖樣萎縮及/或“濕潤”型態的AMD(Klein,Ophthalmology 1997；104：7-21)。在脫離的RPE之下的布魯赫膜(Bruch’s membrane)的破壞，可做為新生及未成熟的脈絡膜血管長入視網膜下腔的入口，而導致CNV的形成。CNV可使視網膜下腔處滲漏出體液以及出血，進而導致視力模糊、視覺扭曲及視力突然喪失。如果不及時治療，這些病變將會發展成一個規則的纖維瘢痕，稱為盤狀疤痕，其通常會導致不可逆的中心視力喪失。

材料及方法

將大鼠隨機分成2組。對照組以載體(30% HP-β-CD溶液)進行灌輸。試驗組以5mg/ml的本發明化合物滴眼液進行灌輸。在雷射誘導損傷前1週以及損傷後4週，每天3次，在所有大鼠的兩眼上灌輸1滴滴眼液。整體過程中，以肌肉內注射氯胺酮(35mg/kg)及甲苯噻嗪(5mg/kg)進行大鼠的麻醉。使用10mg/ml的阿托品及25mg/ml的苯腎上腺素各一滴使瞳孔擴張。以VOLK super Pupil XL Biomicroscopy Lens(Keeler Instruments Inc.,Broomall,PA,USA)觀看眼底。使用532波長的雙頻Nd：YAG雷射(Laserex LP3532；Lumenis Inc.,Salt Lake City,UT,USA)。雷射參數為光斑尺寸100μm，曝光0.15秒，功率150-200mw。將五個雷射光斑投射在圍繞視神經大致等距的眼底處。急性的汽泡說明布魯赫膜的破裂。只有泡沫形成的雷射光斑被包含於本研究中。視網膜下出血的病變被排除。在雷射處理2及4週後，以數位眼底照相機(TRC-50EX；TOPCON,Tokyo,Japan)進行螢光素血管造影術(FA)。經由舌下靜脈注射100mg/ml的螢光素鈉鹽(0.5ml/kg)。擷取早期(低於2分鐘)及晚期(超過7分鐘)螢光素期影像。在注射3滴螢光素鈉鹽後，經由舌下靜脈注射100mg/ml的異硫氰酸螢光素-葡聚醣(1.4mg/kg)。在20分鐘內擷取螢光素影像。藉由Imagenet2000 digital imaging system(Topcon Medical Systems,Inc.,Paramus,NJ.USA)選擇最清晰的圖片測量CNV形成的面積。

結果

當以雷射光使大鼠眼睛的布魯赫膜破裂時，以螢光素血管造影術測量螢光素的滲漏。以電腦定量地測量CNV形成的面積，並以mm²表示。如圖11所示，對照組眼睛會產生約2.5mm²的CNV面積，其係顯著地被1%的(II)灌輸所抑制。

實例6：NaIO₃誘導乾性AMD的降低

2004年的分析報告指出，在年紀超過40歲的美國人中的1.47%人口，至少有一個存在AMD及/或黃斑部出現地圖樣萎縮，亦即1.75百萬個人患有AMD。AMD的發病率隨著年齡急劇增加，有15%年長超過80歲的白人婦女具有新生血管型AMD及/或地圖樣萎縮。超過700萬的個體具有發展成AMD的實質風險。由於快速老化的人口，2020年時，患有AMD的人口數目將增加 50%至2.95百萬人。在另一個研究中，在美國高加索人口裡所有眼盲案例中有54%是因AMD所造成。該研究預測，至2020年，在美國盲人的人數可能高達70%。

材料及方法

將總數30隻8週大的雄性布朗挪威(Brown-Norway；BN)大鼠隨機分成3組，10隻大鼠在正常組別，10隻大鼠在NaIO₃組別，而10隻大鼠在(II)+NaIO₃組別。對照組係單獨灌輸溶劑(2-羥丙基-β-環糊精，Sigma-Aldrich)，而不進行NaIO₃注射。NaIO₃組係經由舌下靜脈以溶劑灌輸，再加上35mg/kg的NaIO₃注射；而(II)+NaIO₃組則以1%的(II)低眼液灌輸，再加上35mg/kg的NaIO₃注射。經NaIO₃注射前1週以及注射後4週，每天3次，在所有大鼠的眼睛中灌輸1滴。在2及4週末，以ERG的c-波測量RPE的功能。

讓BN大鼠在暗處適應2小時，之後以肌肉內注射35mg/kg氯胺酮加上5mg/kg甲苯噻嗪進行麻醉。在之後，每一小時給藥初始劑量的一半。使用1%的阿托品及2.5%的苯腎上腺素各一滴使所有大鼠的瞳孔擴張。在記錄前，給予一滴0.5%丁卡因進行表面麻醉。進行ERG測量時，保持所有大鼠溫暖。接著進行由Peachey發展的DC-ERG紀錄方法。簡言之，使用內徑1mm帶有纖維的玻璃毛細管(Sutter Instruments,Novato,CA)，在其中充填Hanks平衡鹽水溶液(Invitrogen,Carlsbad,CA)，並與附有連接器的Ag/AgCl導線電極進行連接。將電極放置於角膜表面。使應答放大(dc-100Hz；增益=1000X；DP-31,Warner Instruments,Hamden,CT)，並在10Hz或1000Hz下使其數位化。以iWORX LabScribe Data Recording Software(iWorxOCB Sciences,Dover,NH)分析數據。使用Fiber-lite高強度照明器(Dolan-Jenner Industries,Inc.MA)，由光通道獲得光刺激，並將中性密度濾光片(Oriel,Stratford,CT)放置於光徑中以調整刺激的亮度。本試驗所使用的刺激亮度為3.22 log cd/m²，進行刺激4分鐘。使用Minolta (Ramsey,NJ)LS-110光度計，聚焦於光纖束位於大鼠眼睛上的輸出端，以進行亮度校正。

結果

當以NaIO₃處理大鼠時，會專一地引起RPE細胞的退化。因此，NaIO₃係被使用於發展出乾性AMD的動物模型，而已ERG的c-波震幅測量受損的細胞功能。如圖12所示，NaIO₃顯著地抑制對照組ERG的c-波。然而，以1%(II)處理經NaIO₃處理的大鼠可顯著地反轉其ERG的c-波。NaIO₃是一種可使RPE細胞專一性地退化的強力毒素。因此，在經NaIO₃處理的眼睛中，ERG的c-波被完全地抑制(圖12)。必須注意的是，由NaIO₃誘導而產生的乾性AMD模型可藉由1%的(II)反轉4次(圖12)。如果藉由給予較小劑量而使NaIO₃抑制現象最小化，因1%的(II)造成的反轉可更加明顯且顯著。由於乾性AMD是一種會導致眼盲的可怕疾病，任何可預防/處理乾性AMD的藥物是很有價值的。

本領域中之技藝人士理解在不脫離本發明的廣義發明性概念下，可針對上述具體實施例進行修改。因此，可理解的是，本發明並不局限於其所揭示的特定具體實施例，其旨在涵蓋由所附申請專利範圍所定義的本發明精神及範圍內的修飾。

Claims

一種組合物用於製備透過增加眼部血流量及增強視網膜色素上皮細胞(RPE)功能治療相關眼疾藥物之用途，其中該組合物主要包含式(I)及式(II)化合物之組合：

其中該藥物可有效提高遭受氧化壓力及/或缺氧誘導損傷的RPE的存活率；可有效提高遭受氧化壓力及缺氧誘導損傷的RPE的存活率，且同時對人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的存活率影響微小或無影響，或可有效降低HUVECs的存活率；及可有效降低脈絡膜血管新生(CNV)。
如請求項1的用途，其中該藥物另包括一醫藥上可接受之載體。
如請求項2的用途，其中該醫藥上可接受之載體係選自鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、丙二醇，聚氧乙烯蓖麻油、奈米粒子、脂質體、聚合物、及其組合。
如請求項1的用途，其中該眼疾係選自於由青光眼、老年性黃斑部病變(AMD)、缺血性視網膜病變、視神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、葡萄膜炎及白內障組成的群組。
如請求項1的用途，其中該藥物係局部地投予眼睛，或以口服。
如請求項1的用途，其中該組合物來自蜂膠製備物或萃取物。
如請求項1的用途，其中該組合物來自血桐製備物或萃取物。
一種蜂膠萃取物用於製備透過可有效增加眼部血流量的量及增強RPE功能治療相關眼疾之藥物之用途，其中該蜂膠萃取物包含式(I)及式II)化合物之組合：

其中該眼疾係選自於由青光眼、老年性黃斑部病變(AMD)、缺血性視網膜病變、視神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、葡萄膜炎及白內障所組成的群組。