CN107530319A - 用于治疗眼疾的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于在有需要的个体中治疗眼疾的方法，其包含对该个体施用有效量的式(A)化合物。本发明还提供一种用于治疗眼疾的医药组合物，其包括式(A)化合物，以及一种医药上可接受的载体。

Description

用于治疗眼疾的化合物
技术领域
本发明涉及一种用于治疗眼疾的方法。
背景技术
随着人口逐渐老化，视力的恶化越来越明显及严重。有许多与老化密切相关眼疾，例如青光眼、老年性黄斑部病变(AMD)，视神经病变、缺血性视网膜病变、缺血性视网膜病变、老年性白内障等。这些眼疾是引起视力障碍，甚至老年人失明的主要疾病。
视网膜色素上皮细胞(RPE)是由单层细胞构成，并位于视网膜感光受器以及脉络膜血管间，其对于机械性及代谢性支持感光受器上扮演着重要角色。此外，RPE的功能障碍是造成某些眼疾的主因，例如增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、葡萄膜炎以及AMD。AMD及其他疾病，例如糖尿病性视网膜病变(DR)，很可能与由光或代谢反应衍生的氧自由基的效应息息相关。
另一方面，眼部血流量也与许多眼疾密切相关，包括青光眼、缺血性视网膜病变、以及老年性黄斑部病变(AMD)。因此，维持正常的眼部血流量对于预防/治疗前述眼疾而言是必须的。
在美国及西欧，超过65岁的人中，老年性黄斑部病变(AMD)是导致眼盲的主要原因。在两大洲中常见的危险因子包括年龄增加、吸烟、高血压、心绞痛以及阳性家族史。AMD以非渗出及渗出两种形式存在。非渗出型涉及中央视网膜萎缩以及中央视力缓慢及渐进的损失。渗出型的特征在于，新血管生长穿过布鲁赫膜(Bruch’s membrane)而进入视网膜下腔，以及经由血管生成的过程而发展的脉络膜血管新生(CNV)。血管生成时常由缺血及缺氧所诱发。因为黄斑部仅具有单一的血液供应，而在体内视网膜具有最高的氧气摄取量，因此，观察到缺血与AMD的发展有强烈的关联性并不令人意外(Strauss O.,Physiol.Res.2005；85(3):845-881)。
由于上皮在氧气张力以及与氧气自由基有关的压力下极为脆弱，在与缺血有关的疾病过程中，RPE内所产生的活性氧族群(ROS)可能对于RPE细胞造成损伤。AMD的一个重要的“早期”事件为，因为氧化损伤而造成RPE细胞的损失。氧化压力被确认可涉及数种与老化相关的慢性疾病的病因，例如癌症、糖尿病、神经退化疾病及心血管疾病。
发明内容
本发明涉及不可预期地发现一种具有式(A)的异戊烯基二氢黄酮化合物，其可有效治疗眼疾：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7独立地代表–H、–OH、直链或支链烷基、或取代或未取代以–OH的异戊二烯基。
因此，在一方面，本发明提供一种在有需要的个体中治疗眼疾的方法，其包含对该个体施用有效量的式(A)化合物。
另一方面，本发明提供一种用于治疗眼疾的医药组合物，其包括式(A)化合物，以及一种医药上可接受的载体。
所述式(A)化合物经由本领域技术人员熟知的方法以化学合成得到。
应理解前述一般说明及以下详细说明，对本发明而言都仅为示例性及解释性的，而非限制性的。
附图说明
前述的发明内容，以及以下的详细说明，结合附图一起阅读将得到更好的理解。为了说明本发明的目的，在图例中显示目前优选的具体实施例。
在附图中：
图1A显示式(II)化合物对于ARPE-19细胞增生的影响。将ARPE-19细胞与式(II)化合物(“(II)”)一起培养72小时。图1B显示(II)对于HUVECs增生的影响。将HUVECs与(II)一起培养72小时。数据以平均值±SEM表示。每组n＝6；(II)组相对于载体对照组而言，*P<0.05，**P<0.01。
图2A显示(II)对于ARPE-19细胞中缺氧诱导损伤的影响。将ARPE-19细胞与(II)一起培养72小时。图2B显示(II)对于HUVECs中缺氧诱导损伤的影响。将HUVECs与(II)一起培养72小时。对照组在正常条件(5％CO2和95％空气)下以载体(30％HP-β-CD溶液)处理72小时；模型对照组在缺氧条件(1％O2，5％CO2和94％N2)下以载体处理72小时。数据以平均值±SEM表示。每组n＝6；相对于模型对照组，*P<0.05及**P<0.01。
图3A显示(II)对于ARPE-19细胞中NaIO3诱导损伤的影响。将ARPE-19细胞与(II)及NaIO3一起培养72小时。图3B显示(II)对于HUVECs中NaIO3诱导损伤的影响。将HUVECs与(II)及NaIO3一起培养72小时。数据以平均值±SEM表示。每组n＝6；相对于模型对照组，*P<0.05及**P<0.01。
图4A显示(II)对于ARPE-19细胞中H2O2诱导损伤的影响。将ARPE-19细胞与(II)及H2O2一起培养24小时。图4B显示(II)对于HUVECs中H2O2诱导损伤的影响。将HUVECs与(II)及H2O2一起培养24小时。数据以平均值±SEM表示。每组n＝6；相对于模型对照组，*P<0.05及**P<0.01。
图5A显示(II)对于ARPE-19细胞中NaN3诱导损伤的影响。将ARPE-19细胞与(II)及NaN3一起培养72小时。图5B显示(II)对于HUVECs中NaN3诱导损伤的影响。将HUVECs与(II)及NaN3一起培养72小时。数据以平均值±SEM表示。每组n＝6；相对于模型对照组，*P<0.05及**P<0.01。
图6A显示(II)对于ARPE-19细胞中t-BHP诱导损伤的影响。将ARPE-19细胞与(II)及t-BHP一起培养12小时。图6B显示(II)对于HUVECs中t-BHP诱导损伤的影响。将HUVECs与(II)及t-BHP一起培养12小时。数据以平均值±SEM表示。每组n＝6；相对于模型对照组，*P<0.05及**P<0.01。
图7A-7C显示1％的式(I)化合物(“(I)”)对于高眼压兔(Ocular HypertensiveRabbit)中眼部血流量的影响，其中图7A显示在Qm中虹膜的血液流量；图7B显示Qm中睫状体的血液流量；以及图7C显示Qm中脉络膜的血液流量。
图8A-8C显示1％的(II)化合物对于高眼压兔中眼部血流量的影响，其中图8A显示在Qm中虹膜的血液流量；图8B显示Qm中睫状体的血液流量；以及图8C显示Qm中脉络膜的血液流量。
图9显示(I)对于缺血损伤后大鼠视网膜功能的b波恢复情况。星号代表对照组与试验组间的显著差异，其P<0.05(*)及P<0.01(**)。
图10显示(II)对于缺血损伤后大鼠视网膜功能的b波恢复情况。星号代表对照组与试验组间的显著差异，其P<0.05(*)。
图11显示1％的(II)对于激光诱导AMD大鼠模型的影响。星号代表两个数值间的显著差异，其P<0.05。
图12显示1％的(II)对于NaIO3诱导的干性AMD大鼠模型的影响。星号代表两个数值间的显著差异，其P<0.05。
图13显示合成式(I)化合物的示意图。
图14显示合成式(II)化合物的示意图。
具体实施方式
在一方面，本发明提供一种在有需要的个体中治疗眼疾的方法，其包含对该个体施用有效量的式(A)化合物：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7独立地代表–H、–OH、直链或支链烷基、或取代或未取代以–OH的异戊二烯基。式(A)化合物的一些实例可见于美国专利第7,585,892号，以引用方式将其全文并入本文中。
式(A)化合物经由本领域技术人员熟知的方法以化学合成得到。
举例而言，式(I)化合物可经由如图13所示的流程I合成得到：
在另一实例中，式(II)化合物可经由如图14所示的流程II合成得到：
本发明所使用的式(A)化合物包括但不限于一种具有式(I)至(X)中任一结构的化合物：
以及
本文所使用术语“眼疾”是指与眼部相关的疾病，包括但不限于青光眼、老年性黄斑部病变(AMD)、缺血性视网膜病变、视神经病变、糖尿病性视网膜病变(DR)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、葡萄膜炎以及老年性白内障。所述眼疾可以是一种与氧化压力和/或缺氧诱导损伤相关的眼部疾病或病症，更具体地为视网膜色素上皮细胞(RPE)，包括但不限于青光眼、AMD、缺血性视网膜病变、视神经病变、DR以及DME。所述眼疾可以是一种与眼部血流量减少相关的疾病或病症，包括但不限于光眼、缺血性视网膜病变、DR以及AMD。
如本文所使用的术语“有效量”是指足够量的式(A)化合物，其可提供所需的治疗效果，或诱导特定的反应。所需的有效量因个体而有所不同，取决于个体的疾病状态、身理条件、年龄、性别、物种及重量等而定。然而，本领域技术人员仅使用常规的试验方法即可确认适当的有效量。在本发明的一个具体实施例中，所述有效量为可有效提高遭受氧化压力和/或缺氧诱导损伤的RPE细胞的存活率的量。在一个优选的具体实施例中，所述有效量为可有效提高遭受氧化压力和/或缺氧诱导损伤的RPE细胞的存活率，且同时对人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)的存活率影响微小或无影响，或可有效降低HUVECs的存活率的量。在本发明的另一个具体实施例中，所述有效量为可有效增加眼部血流量的量。在又一个具体实施例中，所述有效量为可有效降低脉络膜血管新生(CNV)的量。在另一个具体实施例中，所述有效量为可有效增强RPE功能的量，通过至少增强或恢复其c-波振幅(以ERG测量)。举例而言，可将式(A)化合物口服地施用至个体，每天1-3次。针对每次口服给药，式(A)化合物的剂量可为0.5至50mg，优选地为2-25mg。也可经由眼科给药方式将式(A)化合物施用至个体，一次1-10施用量，一天1-10次，优选地为一次1-5施用量，一天1-4次。举例而言，每次可使用包含式(A)化合物的制剂3滴，一天3次。针对局部眼科给药，可使用0.01-10％的式(A)化合物，优选可使用0.1-1.0％的式(A)化合物。
在本发明的实例中，证实式(A)化合物能有效地治疗各种眼疾，例如缺血性损伤后的视网膜功能障碍，以及激光诱导的AMD。
因此，可将式(A)化合物施用至患有眼疾的个体，其中该眼疾选自于由青光眼、老年性黄斑部病变(AMD)、缺血性视网膜病变、视神经病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、葡萄膜炎及老年性白内障所组成的群组。在本发明的一个实例中，该眼疾为AMD。在一个特定具体实施例中，该眼疾为干性AMD。该眼疾可为或不为眼癌。
另一方面，本发明提供一种用于治疗眼疾的医药组合物，其包含式(A)化合物，以及一种医药上可接受的载体。
本发明的医药组合物可通过本领域技术人员已知的方法以一种或多种医药上可接受的载体来制备。本文所使用的术语“医药上可接受的载体”包含任何标准的药物载体。该类载体包括但不限于：盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、丙二醇，聚氧乙烯蓖麻油、纳米粒子、脂质体、聚合物及其组合。
本发明的医药组合物可调制为适用于所选择的任何给药模式的形式。举例而言，适合于口服给药的组合物包括固体形式，如丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂及粉剂，以及液体形式，如溶液、糖浆、酏剂及悬浮剂。用于局部给药的形式包括乳膏、软膏、凝胶、悬浮液、滴剂、乳剂、经皮贴片。
除了标准载体外，本发明的口服用医药组合物可辅以一种或多种赋形剂，其通常用于口服制剂中，如表面活性剂、吸入剂、增溶剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、着色剂、甜味剂、调味剂及防腐剂。此类赋形剂是本领域技术人员熟知的。
根据本发明，该医药组合物可经由例如口服给药、胃肠外注射、眼注射(例如，玻璃体内注射)、经皮贴片、或对眼睛局部给药的任何途径进行给药。用于局部给药的医药组合物可配制为眼膏剂、眼胶剂、眼霜剂或眼药水的形式。
在一个优选的具体实施例中，该医药组合物包含式(I)化合物：
在另一个优选的具体实施例中，该医药组合物包含式(II)化合物：
通过以下实例进一步说明本发明，这些实例以示例之目提供，而非限制之目的。
实施例
实施例1：式(A)化合物的合成
经由图13所述的流程I合成式(I)化合物。经由图14所述的流程II合成式(II)化合物。使用流程II，可合成如图14所示的式(B)化合物，其中R1、R2、R3及R4独立地选自由氢基(H)及香叶基所组成的群组中。
实施例2：式(II)化合物对于ARPE-19细胞或HUVECs中氧化诱导损伤的影响
材料与方法
1.材料
溴化噻唑蓝四氮唑(Thiazolyl blue tetrazolium bromide)(MTT，纯度≥97.5％)、杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline；DPBS)、过氧化氢(H2O2，50wt.％水溶液)、叔丁基过氧化氢(t-BHP，70wt.％水溶液)、碘酸钠(NaIO3，纯度≥99.5％)、叠氮化钠(NaN3，纯度≥99.5％)以及Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham’s F12(DMEM/F12，1：1)购自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)。人类视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞、人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)、胎牛血清(FBS)、血管细胞基础培养基和内皮细胞生长套组购自ATCC(Manassas,VA,USA)。
人类视网膜色素上皮(RPE)细胞是位于光细胞与脉络膜层之间的关键/独特细胞，以提供养分给光细胞，并将代谢废弃物从光细胞处移除以维持正常/良好的视觉功能/活性。另一方面，HUVECs位于全身的脉管中，包括脉络膜及视网膜血管。通过脉络膜血管新生而使其特别有碍于视觉功能。以VEGF抑制剂抑制血管新生为降低血管生成/血管新生而用于治疗湿性AMD的主要机制。因此，可促进RPE细胞增生/生长，但对于HUVECs细胞生长无效果或呈抑制作用的药剂可能有用于预防/治疗AMD。
2.细胞培养
使ARPE-19细胞生长于补充了10％FBS、100units/ml青霉素G、以及100μg/ml硫酸链霉素的DMEM/F12培养基中。使HUVECs生长于补充了内皮细胞生长套组的血管细胞基础培养基中。将细胞培养于37℃下含5％CO2及95％空气的增湿培养箱中。
3.式(II)化合物对于ARPE-19细胞或HUVECs的存活率影响
使用MTT检测法测量ARPE-19细胞或HUVECs的存活率。将2×105个ARPE-19细胞或5×104个HUVECs播种于96-孔培养盘中(100μl/孔)，并使其生长过夜。通过添加不含细胞的培养基，作为阴性对照组。接着，以含有式(II)(“(II)”)化合物(0.03、0.1、0.3、1、3及10μg/ml)和/或氧化剂(NaIO3、H2O2、t-BHP及NaN3)的新鲜培养基处理细胞12、24、或72小时(200μl/孔)。载体控制组以载体处理。在培养孔中添加20μl MTT(5mg/ml)，并另外培养4小时。经培养后，移除培养基并加入100μl DMSO使来自存活细胞中MTT的三苯基甲臜(formazan)溶解。使用微量盘分析仪(Bio-Rad Laboratories,Inc.,CA测量在570nm的吸光值。根据以下公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(测试样本的吸光值–阴性对照组的吸光值)/(载体对照组的吸光值–阴性对照组的吸光值)×100％。
4.缺氧处理
使细胞贴附过夜，然后在缺氧环境下使其暴露于(II)或载体中72小时。使用搭配O2及CO2控制器且具有N2及CO2气体来源的可控制温度及湿度环境的C-腔室(Proox Model110and Pro CO2Model 120,Bio Spherix Ltd.,Redfield,NY,USA)维持缺氧环境(1％O2、5％CO2及94％N2)。
5.统计分析
所有数据以平均值±S.E.M表示.使用学生t检验进行统计分析。P<0.05被认为具有统计显著性。
结果
1.(II)对ARPE-19细胞及HUVECs中细胞毒性的影响
结果显示由0.03μg/ml至3μg/ml的(II)并不会影响ARPE-19细胞或HUVECs的增生效果。然而，在10μg/ml的浓度下，(II)分别显著地抑制ARPE-19细胞及HUVECs的增生效果达34％及92％(图1A和1B)。然而，前者较后者低很多。
2.(II)对于ARPE-19细胞及HUVECs中缺氧诱导损伤的影响
在缺氧环境下，由0.03μg/ml至3μg/ml的(II)对于ARPE-19细胞的存活率无影响(图2A)。在10μg/ml的浓度下，(II)可反转ARPE-19细胞中因缺氧所诱导的损伤达24％。在缺氧环境下，当浓度为0.03、0.1及0.3μg/ml时，虽然(II)可分别显著地增加HUVECs的存活率达22％、19％及26％(图2B)，而在10μg/ml的浓度下，(II)可显著地降低HUVECs的存活率达97％(P<0.01)。
3.(II)对于ARPE-19细胞及HUVECs中NaIO3诱导损伤的影响
在0.03、1、3及10μg/ml的浓度下，(II)可显著地反转因30μg/ml的NaIO3所诱导损伤的ARPE-19细胞存活率(P<0.05，图3A)。在10及3μg/ml的浓度下，(II)也可分别反转因100及300μg/ml的NaIO3所诱导损伤的ARPE-19细胞存活率达24％及7％(P<0.05，图3A)。然而，在3及10μg/ml的浓度下，(II)增强NaIO3所诱导的HUVECs损伤(图3B)。
4.(II)对于ARPE-19细胞及HUVECs中H2O2诱导损伤的影响
在10μg/ml的浓度下，(II)可分别反转因200μM及400μM的H2O2所诱导损伤的ARPE-19细胞存活率达55％及72％(P<0.01，图4A)。另一方面，0.3及1μg/ml的(II)也可反转因H2O2诱导的HUVECs损伤。然而，10μg/ml的(II)可分别增强因200及400μM的H2O2所诱导的HUVECs损伤达63％及42％(P<0.01，图4B)。
5.(II)对于ARPE-19细胞及HUVECs中NaN3诱导损伤的影响
由0.03μg/ml至10μg/ml的(II)可显著地反转因NaN3所诱导的ARPE-19细胞损伤(图5A)。在10μg/ml的浓度下，(II)可分别增强因0.3、1及3mM的NaN3所造成的HUVECs损伤达95％、75％及71％(P<0.01，图5B)。3μg/ml(II)也增强因0.3及3mM的NaN3所诱导的HUVECs损伤达75％及44％(图5B)。
6.(II)对于ARPE-19细胞及HUVECs中t-BHP诱导损伤的影响
(II)可显著地反转因t-BHP所诱导的ARPE-19细胞损伤(图6A)。然而，10μg/ml的(II)可分别增强因50、100及200μM的t-BHP所诱导的HUVECs损伤达71％、80％及76％(P<0.01，图6B)。3μg/ml的(II)也可增强50及100μM的t-BHP所诱导的HUVECs损伤达27％及21％(图6B)。
实例3：眼睛血流量(OBF)的增强
眼部血流量与多种眼部疾病紧密相关，包括青光眼、缺血性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变及老年性黄斑部病变(AMD)。因此，维持正常的眼睛血流量对于预防/治疗前述眼部疾病而言是必要的。
材料及方法
1.材料
采购0.5％的爱尔卡因(Alcaine)市售品。在实验室制备20％灭菌的高张盐水溶液。由E-Z Trac(Los Angeles,CA)采购有色微球体。以含有0.01％(v/v)Tween 80的盐水稀释有色微球体以防止其互相黏聚。在每个时间点注射每0.4ml含2百万个微球体的溶液。
重量为2-3.0公斤的纽西兰雌兔由市售购得。动物照护及处理依照相关制度的指导准则进行。
2.方法
以35mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪通过肌内注射麻醉兔子。在之后，每一小时给药初始剂量的一半。经由右颈动脉插管至左心室，以进行有色微球体的注射，而在股动脉上插管以收集血液样本。在左眼处以一滴盐酸丙美卡因眼药水(Bausch&Lomb,Inc.,Tampa,FL,USA)处理。针直接插入左眼的前室中，并使其连接于40mmHg的食盐水压力计上。高眼压模型使眼睛血流量降低至约正常值的三分之一。在建立高眼压模型后30分钟，取10g/l的黄酮或载体(30％HP-β-CD溶液)50μl局部灌输于左眼。以该化合物或载体处理后经0、30、60及120分钟后以有色微球体测量眼睛血流量。在每个时间点，注射2百万个微球体作为对照，在微球体注射刚好一分钟后，从股动脉收集血液样本。将血液样本收集在肝素化的试管中，并记录体积。在最终血液取样后，注射100mg/kg戊巴比妥钠使兔子安乐死。摘除左眼，并解剖成虹膜、睫状体、视网膜及脉络膜。称重所有组织。
由E-Z Trac(Los Angeles,CA,USA)提供所有样本处理及微球体计数的操作细节。简言之，加入血液溶血试剂至含有血液样本的微量离心管中，然后震荡混合并在6000rpm下离心30分钟。移除上清液，然后添加组织/血液消化试剂I及II。在试管上加盖，然后震荡混合并离心30分钟。移除上清液，添加计数试剂，震荡混合后离心15分钟。移除上清液，以精确体积的计数试剂重新悬浮微球体。在显微镜下以血球计数器计算微球体的数目。将组织/血液消化试剂I加入含有组织样本的微量离心管中，密封并在95℃下加热15分钟。然后，震荡混合试管30秒，再加热并再震荡混合，直到组织样本完全溶解。在组织样本仍处于高温下，加入组织/血液消化试剂II，然后在试管上加盖、震荡混合并离心30分钟。其后的操作程序与处理血液样本一样，并进行微球体计数。
根据以下公式计算在某个时间点下每个组织的血流量：Qm＝(Cm x Qr)/Cr。Qm是组织的血流量，单位为μl/min/mg，Cm是组织中微球体的数量，Qr是血液样本的流速，单位为μl/min，而Cr则为在对照血液样本中的微球体数量。
结果
在灌输药物30分钟后，1％的式(I)(“(I)”)化合物及1％的(II)可使虹膜及脉络膜的血液流量显著提高(分别为图7A-7C及图8A-8C)。
实施例4：缺血性损伤后视网膜功能的促进
单独测量眼内压(IOP)不应该是诊断青光眼的唯一决定因素，单独降低IOP不应该是新药开发的唯一评估法(Chiou et al.,Ophthalmic Res.18:265-269,1986)。理想的抗青光眼药剂应该能降低IOP，并可改善眼部血流量(Hong et al.,J.Ocular Pharmacol.9:117-124,1993)。在眼睛不同部位的血流量研究不仅会提供对于药物作用机制的理解，也可有利于更安全的抗青光眼药物的开发(Chiou et al.,Ophthalmic Res.18:265-269,1986)。此外，仅次于青光眼，视网膜退化是导致失明的主要原因(Lierman,Mary AnnLiebert,Inc.,New York,NY,1987)。大多数视网膜病变是由缺血性退化所造成，即便已经试验了多种药剂，包括血管舒张剂、抗凝血剂及血液减粘剂，仍难以治疗此病症(O’Connor,Medcom,Inc.,New York,NY,1974)。迄今为止，这些试剂中并没有似乎可用于缺血性视网膜病变(LaVail et al.,Alan R.Liss,Inc.,New York,NY,1985)。因此，开发一种可用于治疗缺血性视网膜退化的新药剂是重要的。缺血后视网膜功能的恢复可以通过视网膜电流图中的b波振幅的回复来确定。除了青光眼外，这些可促进视网膜功能恢复的药剂也可有利于治疗AMD、DR及DME。
材料及方法
1.方法
先前文献已说明视网膜缺血试验(Chiou et al.,J.Ocular Pharmacol.9:179-185,1993,and Chiou et al.,J.Ocular Pharmacol.10:493-498,1994)。进行视网膜电流图(ERG)评估在缺血损伤前后的视网膜功能。使用与角膜接触的Ag/AgCl电极纪录ERG。将一根不锈钢针头插入两眼间的皮下处当作参考电极，另一根针则插入颈部皮下处作为接地电极。使用光刺激器(Grass PS22Flash)在离眼睛5英寸处产生闪光，以波动扫描仪纪录ERG电位。ERG系统购自LKC Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD)。使用白光刺激的单道闪光(10毫秒)引起ERG的a-及b-波。由a-波的波谷至b-波的波峰处测量b-波的波峰振幅。
使Long-Evans大鼠(200-250g)在暗处适应至少2小时，接着以肌肉内注射氯胺酮(35mg/kg)加上甲苯噻嗪(5mg/kg)进行麻醉。每间隔一小时给药初始剂量的一半以维持适当的麻醉状态。以1％的托吡卡胺(50μl)使瞳孔扩张，以利于进行ERG试验。使用置于视神经及睫状后动脉附近的缚线使中央视网膜与睫状后动脉闭塞而产生视网膜缺血。使用微量移液器尖管将放置于眼睛窝底部的缚线绑紧，以闭塞视网膜血管30分钟。在30分钟的视网膜缺血后，放开缚线，使视网膜动脉再次流通。其后30、60、90、120、180及240分钟，测量ERG。在闭塞中央视网膜动脉前，进行化合物及载体的局部给药。
2.统计分析
所有数据以平均值±SEM表示。使用学生t检验分析试验结果的显著性。在所有试验中，概率值(P)<0.05被认为是具有显著性。
结果
当将中央视网膜及睫状后动脉绑住时，流至这些血管的血液被迫停止，使得ERG的b-波迅速降至零。当松绑时，血流恢复往常，而b-波振幅仅回复至起始值的20％。然而，当灌输1％的(I)时，b-波振幅回复至起始值的约50％(图9)，且药物的作用可在施用药物后持续至少240分钟。
以1％的(II)处理可获得类似的结果，唯一不同的是，药物作用的时程较短，约可持续120分钟(图10)。然而，其效用约与1％的(I)相同。
实施例5：激光诱导AMD的抑制
老年性黄斑部病变(AMD)是在西方国家中超过50岁视力障碍患者的主要疾病。AMD的发病率随着年龄而增加，因此75岁及以上人士中有三分之一患有某种形式的AMD。由于AMD对人口老化的巨大冲击，在过去十年中，很多公众关注及研究一直专注这种病症。
AMD最初发生于视网膜色素上皮细胞(RPE)产生病理性变化以及玻璃膜疣形成的“干燥”型态，其可能发展成具有脉络膜血管新生(CNV)的地图样萎缩和/或“湿润”型态的AMD(Klein,Ophthalmology 1997；104:7-21)。在脱离的RPE之下的布鲁赫膜(Bruch’smembrane)的破坏，可做为新生及未成熟的脉络膜血管长入视网膜下腔的入口，而导致CNV的形成。CNV可使视网膜下腔处渗漏出体液以及出血，进而导致视力模糊、视觉扭曲及视力突然丧失。如果不及时治疗，这些病变将会发展成一个规则的纤维瘢痕，称为盘状疤痕，其通常会导致不可逆的中心视力丧失。
材料及方法
将大鼠随机分成2组。对照组以载体(30％HP-β-CD溶液)进行灌输。试验组以5mg/ml的本发明化合物滴眼液进行灌输。在激光诱导损伤前1周以及损伤后4周，每天3次，在所有大鼠的两眼上灌输1滴滴眼液。整体过程中，以肌肉内注射氯胺酮(35mg/kg)及甲苯噻嗪(5mg/kg)进行大鼠的麻醉。使用10mg/ml的阿托品及25mg/ml的苯肾上腺素各一滴使瞳孔扩张。以VOLK super Pupil XL Biomicroscopy Lens(Keeler Instruments Inc.,Broomall,PA,USA)观看眼底。使用532波长的双频Nd:YAG激光(Laserex LP3532；Lumenis Inc.,SaltLake City,UT,USA)。激光参数为光斑尺寸100μm，曝光0.15秒，功率150-200mw。将五个激光光斑投射在围绕视神经大致等距的眼底处。急性的汽泡说明布鲁赫膜的破裂。只有泡沫形成的激光光斑被包含于本研究中。视网膜下出血的病变被排除。在激光处理2及4周后，以数字眼底照相机(TRC-50EX；TOPCON,Tokyo,Japan)进行荧光素血管造影术(FA)。经由舌下静脉注射100mg/ml的荧光素钠盐(0.5ml/kg)。采集早期(低于2分钟)及晚期(超过7分钟)荧光素期影像。在注射3滴荧光素钠盐后，经由舌下静脉注射100mg/ml的异硫氰酸荧光素-葡聚醣(1.4mg/kg)。在20分钟内采集荧光素影像。通过Imagenet2000digital imaging system(Topcon Medical Systems,Inc.,Paramus,NJ.USA)选择最清晰的图片测量CNV形成的面积。
结果
当以激光使大鼠眼睛的布鲁赫膜破裂时，以荧光素血管造影术测量荧光素的渗漏。以计算机定量地测量CNV形成的面积，并以mm2表示。如图11所示，对照组眼睛会产生约2.5mm2的CNV面积，其显著地被1％的(II)灌输所抑制。
实施例6：NaIO3诱导干性AMD的降低
2004年的分析报告指出，在年纪超过40岁的美国人中的1.47％人口，至少有一个存在AMD和/或黄斑部出现地图样萎缩，也即1.75百万个人患有AMD。AMD的发病率随着年龄急剧增加，有15％年长超过80岁的白人妇女具有新生血管型AMD和/或地图样萎缩。超过700万的个体具有发展成AMD的实质风险。由于快速老化的人口，2020年时，患有AMD的人口数目将增加50％至2.95百万人。在另一个研究中，在美国高加索人口里所有眼盲案例中有54％是因AMD所造成。该研究预测，至2020年，在美国盲人的人数可能高达70％。
材料及方法
将总数30只8周大的雄性布朗挪威(Brown-Norway；BN)大鼠随机分成3组，10只大鼠在正常组别，10只大鼠在NaIO3组别，而10只大鼠在(II)+NaIO3组别。对照组单独灌输溶剂(2-羟丙基-β-环糊精，Sigma-Aldrich)，而不进行NaIO3注射。NaIO3组经由舌下静脉以溶剂灌输，再加上35mg/kg的NaIO3注射；而(II)+NaIO3组则以1％的(II)低眼液灌输，再加上35mg/kg的NaIO3注射。经NaIO3注射前1周以及注射后4周，每天3次，在所有大鼠的眼睛中灌输1滴。在2及4周末，以ERG的c-波测量RPE的功能。
让BN大鼠在暗处适应2小时，之后以肌肉内注射35mg/kg氯胺酮加上5mg/kg甲苯噻嗪进行麻醉。在之后，每一小时给药初始剂量的一半。使用1％的阿托品及2.5％的苯肾上腺素各一滴使所有大鼠的瞳孔扩张。在记录前，给予一滴0.5％丁卡因进行表面麻醉。进行ERG测量时，保持所有大鼠温暖。接着进行由Peachey发展的DC-ERG纪录方法。简言之，使用内径1mm带有纤维的玻璃毛细管(Sutter Instruments,Novato,CA)，在其中充填Hanks平衡盐水溶液(Invitrogen,Carlsbad,CA)，并与附有连接器的Ag/AgCl导线电极进行连接。将电极放置于角膜表面。使应答放大(dc-100Hz；增益＝1000X；DP-31,Warner Instruments,Hamden,CT)，并在10Hz或1000Hz下使其数字化。以iWORX LabScribe Data Recording Software(iWorxOCB Sciences,Dover,NH)分析数据。使用Fiber-lite高强度照明器(Dolan-JennerIndustries,Inc.MA)，由光通道获得光刺激，并将中性密度滤光片(Oriel,Stratford,CT)放置于光径中以调整刺激的亮度。本试验所使用的刺激亮度为3.22log cd/m2，进行刺激4分钟。使用Minolta(Ramsey,NJ)LS-110亮度计，聚焦于光纤束位于大鼠眼睛上的输出端，以进行亮度校正。
结果
当以NaIO3处理大鼠时，会专一地引起RPE细胞的退化。因此，NaIO3被使用于发展出干性AMD的动物模型，而已ERG的c-波震幅测量受损的细胞功能。如图12所示，NaIO3显著地抑制对照组ERG的c-波。然而，以1％(II)处理经NaIO3处理的大鼠可显著地反转其ERG的c-波。NaIO3是一种可使RPE细胞专一性地退化的强力毒素。因此，在经NaIO3处理的眼睛中，ERG的c-波被完全地抑制(图12)。必须注意的是，由NaIO3诱导而产生的干性AMD模型可通过1％的(II)反转4次(图12)。如果通过给予较小剂量而使NaIO3抑制现象最小化，因1％的(II)造成的反转可更加明显且显著。由于干性AMD是一种会导致眼盲的可怕疾病，任何可预防/处理干性AMD的药物是很有价值的。
本领域技术人员理解在不脱离本发明的广义发明性概念下，可针对上述具体实施例进行修改。因此，可理解的是，本发明并不局限于其所公开的特定具体实施例，其旨在涵盖由所附权利要求书所定义的本发明精神及范围内的修饰。

Claims (9)

1.一种在有需要的个体中治疗眼疾的方法，其包含对该个体施用有效量的式(A)化合物：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7独立地代表–H、–OH、直链或支链烷基、或取代或未取代以–OH的异戊二烯基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该有效量选自于由下列所组成的群组的量：可有效提高遭受氧化压力和/或缺氧诱导损伤的RPE细胞的存活率的量；可有效提高遭受氧化压力和/或缺氧诱导损伤的RPE细胞的存活率，且同时对人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)的存活率影响微小或无影响，或可有效降低HUVECs的存活率的量；可有效增加眼部血流量的量；可有效降低脉络膜血管新生(CNV)的量；可有效增强RPE功能的量；以及可有效达成以上功效的组合的量。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该式(A)化合物为具有式(I)至(X)中任一结构的化合物：
4.根据权利要求1所述的方法，其中该眼疾选自于由青光眼、老年性黄斑部病变(AMD)、缺血性视网膜病变、视神经病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、葡萄膜炎及老年性白内障所组成的群组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该眼疾为AMD。
6.根据权利要求5所述的方法，其中该AMD为干性AMD。
7.根据权利要求1所述的方法，其中该式(A)化合物局部地施用至该个体的眼睛，或以口服地施用至该个体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中该式(A)化合物调制为眼膏剂、眼胶剂、眼霜剂或眼药水。
9.根据权利要求1所述的方法，其中该眼疾不是眼癌。
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