TW201703782A - 黑柄炭角菌菌絲體萃取物抗發炎之用途及抗發炎組合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途及基於此用途的組合物。所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物具有抗發炎活性，能用於製備抗發炎之醫藥組合物。

Description

黑柄炭角菌菌絲體萃取物抗發炎之 用途及抗發炎組合物

本發明是有關於一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途及基於此用途的組合物，特別是一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物抗發炎之用途，以及抗發炎組合物。

發炎是身體的一種防禦反應，慢性發炎反應和許多疾病相關，像是動脈粥狀硬化、敗血症、糖尿病、關節炎、自我免疫疾病、神經性疾病、肺部疾病甚至癌症的病程發展有密切關係，長時間發炎反應對人體有害且會導致疾病的發生，現代人與發炎相關疾病的死亡率亦有連年增高的趨勢。

已經有許多研究指出抗氧化物質具有良好的抗發炎功效。體內存在抗氧化防禦系統，若是增加體內抗氧化物質，像是血紅素氧化酶(heme oxygenase-1；HO-1)、醌氧化酶(NAD(P)H：quinone acceptor oxidoreductase 1；NQO-1)、穀胱甘肽(Glutathione；GSH)等，可以有效的 清除自由基、降低發炎反應所造成的影響、防心血管疾病或抑制癌症血管新生和轉移侵襲的作用。

因此，如何增強體內抗氧化防禦能力，降低發炎反應成了預防醫學的重要課題。雖然市面上有許多抗發炎藥物，但抗發炎藥物常具有強烈的副作用，例如類固醇之抗發炎藥物。類固醇藥物會抑制發炎反應中磷脂質(phospholipids)被磷脂酶A2(phospholipase A2)轉變為花生四烯酸(Arachidonic acid)的步驟，雖然可以有效的減少發炎反應，但因為類固醇也參與多種生理反應，會同時引發其它不必要的反應，也就是副作用。目前的研究多著重於尋找天然抗發炎物質，特別是具有非類固醇藥物抗發炎作用機轉的抗發炎物質，也就是能抑制環氧合酶(cyclooxygenase,COX)機轉的物質，或同時也能抑制促發炎細胞因子生成的物質。

黑柄炭角菌(Xylaria nigripe)隸屬於炭角菌目(Xylariales)、炭角菌科(Xylariaceae)及炭角菌屬(Xylaria)，是一種中國傳統的藥用真菌，通常生長於廢棄白蟻巢穴，其菌絲體形成的菌核即是中國傳統的中藥材料「烏靈參」，又稱作烏靈菌、雷震子等。根據四川《中藥志》記載，烏靈參有「補心腎、治失眠」療效之描述，其具有補氣固腎、健脾除濕及鎮定安神等多種生理活性。

因野生資源逐漸匱乏，黑柄炭角菌有採集不易與品質不穩定的問題。目前開始以人工液態培養黑柄炭角菌菌絲體，是解決天然黑柄炭角菌產量不足和品質不穩定等問題的一種方法。而液態培養的過程中，黑柄炭角菌除了合成 自身生長所需的有機物質外，還會分泌代謝產物，其中也可能包含具抗發炎功能的成分，因此以液態培養黑柄炭角菌具有發展天然抗發炎物質的潛力。但不同的培養方式會令菌體生長型態不同，其基因表達也不盡相同，所產出之代謝產物也必然有所差異，在功效上也不同，或可能產生新的功效與用途。

本發明之一態樣是在提供一種黑柄炭角菌(Xylaria nigripes)菌絲體萃取物之用途，其係用於製備抗發炎之醫藥組合物。黑柄炭角菌菌絲體萃取物係由下述步驟所製得：提供一基質，基質實質由0.5~5%重量比之糙米粉、0.1~1%重量比之麥芽萃取物以及99.4~94%重量比之水所組成。接著進行發酵製程，其係於基質中接種黑柄炭角菌，並於一發酵溫度下培養一發酵時間，以獲得一發酵物質。再分離發酵物質，以獲得黑柄炭角菌菌絲體。接著進行萃取製程，其係利用溶劑與黑柄炭角菌菌絲體混合成混合物後，將混合物攪拌一萃取時間。最後去除混合物之一固體部份，以獲得一上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物，且黑柄炭角菌菌絲體萃取物具有抗發炎活性。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，前述之基質係由2%重量比之糙米粉、0.5%重量比之麥芽萃出物以及97.5%重量比之水所組成。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中發酵製程之發酵溫度為25℃，發酵時間為10天。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中萃取製程之溶劑可為80℃至100℃的熱水，萃取時間可為0.5小時至2小時。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中萃取製程之溶劑可為70%重量比之乙醇，萃取時間可為22小時至26小時。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中混合物之固體部份可利用一離心方式、一過濾方式或上述方式之組合而去除。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中抗發炎活性可抑制一氧化氮(NO)之生成。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中抗發炎活性可抑制促發炎細胞因子之生成，而促發炎細胞因子可為腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、介白素6(interleukin-6,IL-6)或介白素12(interleukin-12,IL-12)。

依據前述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中抗發炎活性可抑制環氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)之活性。

本發明之另一態樣是在提供一種抗發炎之組合物，組合物包含一有效劑量之黑柄炭角菌菌絲體萃取物。

依據前述之抗發炎之組合物，組合物係呈選自以下群組之一形式：醫藥組合物、化妝品組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物。

藉此，本發明之黑柄炭角菌菌絲體萃取物因具有抗發炎活性，可抑制NO和促發炎細胞因子之生成，以及可抑制COX-2之活性，故本發明之黑柄炭角菌菌絲體萃取物可用於製備抗發炎之醫藥組合物。而包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物之組合物可作為抗發炎訴求之醫藥組合物、化妝品組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物上，具有運用於生醫保健市場之潛能。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

100‧‧‧黑柄炭角菌菌絲體萃取物之製備方法

110、120、130、140、150‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之製備步驟流程圖。

本說明書揭露內容提出黑柄炭角菌菌絲體萃取物的新穎用途，以體外試驗評估黑柄炭角菌菌絲體萃取物抗發炎活性，並進一步驗證黑柄炭角菌菌絲體萃取物的抗發炎活性係為抑制一氧化氮(NO)之生成、抑制促發炎細胞因子之生成以及抑制環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)之活性。本說明書揭露內容提出的黑柄炭角菌菌絲體萃取物為潛在的抗發炎物質，可用以製備抗發炎的醫藥組合物。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。

<試驗例> 一、製備黑柄炭角菌菌絲體萃取物

請參照第1圖，其係黑柄炭角菌菌絲體萃取物之製備步驟流程圖。第1圖中，黑柄炭角菌菌絲體之製備方法100包含步驟110、步驟120、步驟130、步驟140和步驟150。

步驟110是提供一基質，基質實質係由0.5~5%重量比之糙米粉、0.1~1%重量比之麥芽萃出物以及99.4~94%重量比之水所組成。較佳地，基質係由2%重量比之糙米粉、0.5%重量比之麥芽萃出物以及97.5%重量比之水所組成。更進一步說，使用之基質的組成份為20g/L糙米粉與5g/L麥芽萃出物。使用之發酵槽為5公升的攪 拌式發酵槽(stirred-tank fermentor)，工作體積為3公升。以提供碳源、氮源及水份讓後續黑柄炭角菌能進行液態培養。

步驟120是進行一發酵製程，係於基質中接種黑柄炭角菌，並於一發酵溫度下培養一發酵時間，以獲得一發酵物質。所使用之菌株為黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219為佳，購自食品工業發展研究所食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心(臺灣，新竹)，黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219為一分離自台灣本土的菌株。然需說明的是，上述黑柄炭角菌菌株(BCRC34219)僅為本發明之一實施方式。發酵製程係以調節溫度、通氣量等條件，使黑柄炭角菌菌絲體生長。更進一步的說，發酵製程的條件為，將300mL黑柄炭角菌種菌接種至基質中，再以攪拌轉速為100rpm、通氣量為1vvm及發酵溫度為25℃等發酵條件培養10天後，可獲得發酵物質。

步驟130是分離發酵物質，係將發酵物質分離為固體部份和液體部份，其中固體部份包含黑柄炭角菌菌絲體。在發酵製程完成後，因發酵物質中已充滿黑柄炭角菌菌絲體，因此將發酵物質中的液體部份和固體部分分離後，即可於固體部份中獲得黑柄炭角菌菌絲體。而分離方式可為過濾方式、離心方式或上述方式之組合。

步驟140是進行一萃取製程，利用一溶劑與黑柄炭角菌菌絲體混合成一混合物後，將混合物攪拌一萃取時間。於萃取製程中，溶劑可為可為80℃至100℃的熱水，萃 取時間可為0.5小時至2小時。或溶劑可為70%重量比之乙醇，萃取時間可為22小時至26小時。更進一步的說，進行黑柄炭角菌菌絲體萃取物製備時，先使用水清洗黑柄炭角菌菌絲體數次，再利用冷凍乾燥機乾燥黑柄炭角菌菌絲體，製成菌絲體粉末，菌絲體粉末樣品保存於密閉容器內。再將菌絲體粉末與90℃熱水以重量比1：10至1：30之比例混合成一混合物後，將混合物攪拌1小時以萃取其中具有功能性的成分。或是將菌絲體粉末與70%重量比之乙醇以重量比1：10至1：30之比例混合成一混合物後，將混合物攪拌24小時以萃取其中具有功能性的成分。

步驟150是去除混合物之固體部份，以獲得上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物。經過萃取製程後，黑柄炭角菌菌絲體萃取物已溶解至溶劑中，其中包含具有功能性的成分，因此去除混合物中固體部份後，所獲得的上清液中包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物。而混合物之固體部份可利用離心方式、過濾方式或上述方式之組合而去除。更進一步的說，將萃取後之樣品經過濾與離心步驟，取上清液進行濃縮，再使用冷凍乾燥機進行乾燥，即得黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物。

二、黑柄炭角菌菌絲體萃取物抗發炎能力 1.抑制一氧化氮(NO)生成能力測定

生物體於發炎反應時會產生大量的NO自由基，實驗上可利用脂多醣類(Lipopolysaccharide,LPS)來誘發巨噬細胞的發炎反應並產生NO自由基，當生物體產 生不穩定的NO時，在組織中會很快的氧化成穩定的產物，如亞硝酸鹽(nitrite)。因此可使用Griess試劑[1%磺胺(sulfanilamide)溶液與0.1% N-1-萘基乙烯二胺二鹽酸鹽(N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride)溶液]之呈色反應測定亞硝酸鹽量來定量NO，以評估黑柄炭角菌菌絲體萃取物抑制巨噬細胞經LPS誘發後之NO生成能力，為一簡單且可信的抗發炎活性試驗方法。

本試驗例先以LPS誘導大鼠巨噬細胞RAW264.7以產生NO，再以Griess試劑定量NO。其中以只添加LPS之試驗為控制組，而同時添加LPS與樣品之試驗為實驗組，可以觀察添加樣品所引起之抑制NO產生之情形，並計算NO抑制率，其中樣品分別為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物。大鼠巨噬細胞RAW264.7係購自食品工業發展研究所食品工業發展研究所生物資源保存與研究中心(臺灣，新竹)。RAW264.7細胞培養液為含10%胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養液。進行NO抑制率分析時，先將RAW264.7細胞以3×10⁵cells/well之濃度接種於96孔微量盤中，於37℃、5% CO₂培養箱中培養。培養24小時後，分別添加1μg/mL的LPS與樣品，再於37℃、5% CO₂培養箱中培養24小時。培養後將培養液吸出，加入100μl Griess試劑，室內避光反應10分鐘後，以酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader)測定在波長540nm的吸光值。並以亞硝酸鈉為標準品作出標準曲線， 換算樣品組之亞硝酸鹽生成量，再依下列公式計算樣品NO抑制率： 其中為僅添加LPS時NO₂ ^-的濃度；為同時添加LPS和樣品時NO₂ ^-的濃度。本試驗另以NO抑制劑L-Name(L-NG-Nitroarginine methyl ester)作為正控制組進行試驗。

請參照下表一，為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物抑制巨噬細胞經LPS誘發後之NO生成的能力。

實驗結果顯示，不論是在何種樣品濃度，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物之NO抑制率均優於黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物，而黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物隨著樣品濃度增加，其抑制巨噬細胞經LPS誘發後之NO的效果越好，當黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物濃度為100μg/mL時，NO抑制率可達40%。而正控制組L-Name濃度為2mM時，其NO抑制率為76.9%。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物皆具有抑制NO 生成之能力，但黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物抑制NO生成之能力較佳。

2.抑制促發炎細胞因子生成能力測定

本發明所稱之「促發炎細胞因子(proinflammatory cytokine)」係指一系列可以促進炎症的細胞因子的總稱，促發炎細胞因子在急性發炎反應中扮演重要的角色，可增加血管通透性，因而導致紅、腫、熱、痛等發炎反應。比較常見的促炎細胞因子包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、介白素6(interleukin-6,IL-6)和介白素12(interleukin-12,IL-12)等，因此抑制這些細胞因子也可以有助於減少某些疾病的發炎症狀。

實驗上將RAW264.7細胞以3×10⁵cells/well之濃度接種於96孔微量盤中，於37℃、5% CO₂培養箱中培養。培養24小時後，分別添加1μg/mL的LPS與樣品，再於37℃、5% CO₂培養箱中培養24小時，其中樣品分別為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物。培養後將培養液吸出，使用ELISA MAX Deluxe Sets套組(BioLegnd,USA)分析TNF-α、IL-6和IL-12等促發炎細胞因子的表現量，再依下列公式計算樣品的促發炎細胞因子生成之抑制率： 其中[促發炎細胞因子]_control為僅添加誘導劑LPS時促發炎 細胞因子生成的濃度，[促發炎細胞因子]_sample為同時添加誘導劑LPS與樣品時促發炎細胞因子生成的濃度。

請參照下表二，為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物抑制巨噬細胞經LPS誘發後之促發炎細胞因子生成的能力。

實驗結果顯示，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物於濃度為10、50、100μg/mL時，TNF-α抑制率分別為9.8%、16.7%和18.4%，IL-6抑制率分別為14.3%、43.6%和56.2%，IL-12抑制率分別為4.9%、20.8%和32.6%。顯示黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對於促發炎細胞因子，如TNF-α、IL-6和IL-12的生成具有抑制作用，且具有劑量依賴性。而黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物於濃度為10、50、100μg/mL時，TNF-α抑制率分別為3.6%、5.8%和2.1%，IL-6抑制率分別為3.4%、5.6%和12.4%，對於IL-12則顯示無抑制作用，顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物皆具有抑制促發炎細胞因子生成之能力，且不論在何種樣品濃度，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物抑制促發炎細胞因子生成之能力均優於黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物。

3.抑制環氧合酶-2(COX-2)活性能力測定

環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)為巨噬細胞中的發炎因子，常在發炎部位發現有大量COX-2表現，當身體組織受到某種刺激如外傷、感染等會活化COX-2，使得前列腺素(prostaglandins,PGs)大量生成，具有促進發炎、血管新生、抑制細胞凋亡並促使癌細胞生長的作用。

環氧合酶-2會催化花生四烯酸(arachidonic acid,AA)生成前列腺素H2(prostaglandin H2,PGH2)，而PGH2可藉由氯化亞錫而還原成PGF2α(prostaglandin F2α)，再利用酵素免疫分析法測定PGF2α的含量，可以用來計算樣品對COX-2酵素活性抑制率。本試驗係利用COX-(human recombinant)-inhibitor screening kit(Catalog No.560131,Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)測定黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物樣品對COX-2酵素活性之抑制能力。COX-2抑制率之計算公式如下： 其中PG _control 為初始酵素活性100%時PGF2α生成的濃度，PG _sample 為添加黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物或黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物樣品後PGF2α的濃度。本試驗另以COX-2酵素抑制劑DuP 697作為正控制組進行試驗。

請參照下表三，為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對COX-2酵素活性之抑制率。

實驗結果顯示，正控制組DuP 697濃度為60μM時，其COX-2抑制率為83.3%。黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物於濃度為1、5、10mg/mL時，COX-2抑制率分別為27.8%、34.8%和41.2%。而黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物於濃度為1、5、10mg/mL時，COX-2抑制率分別為54%、62.2%和63.4%。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物皆具有抑制COX-2活性之能力，且不論在何種樣品濃度，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物之COX-2抑制率均優於黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物。

由上所述，本發明所揭露之黑柄炭角菌菌絲體萃取物於抗發炎活性分析結果顯示，其具有抑制巨噬細胞經LPS誘發後之NO生成、抑制巨噬細胞經LPS誘發後之促發炎細胞因子生成以及抑制COX-2之活性等抗發炎活性。故本發明之黑柄炭角菌菌絲體萃取物可用於製備抗發炎之醫藥組合物。而包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物之組合物，可作為抗發炎訴求的醫藥組合物、化妝品組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物上，具有運用於生醫保健市場之潛能。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

100‧‧‧黑柄炭角菌菌絲體萃取物之製備方法

110、120、130、140、150‧‧‧步驟

Claims (13)

1. 一種黑柄炭角菌(Xylaria nigripes)菌絲體萃取物之用途，其係用於製備抗發炎之醫藥組合物，其中該黑柄炭角菌菌絲體萃取物係由下述步驟所製得：提供一基質，其中該基質實質由0.5~5%重量比之糙米粉、0.1~1%重量比之麥芽萃取物以及99.4~94%重量比之水所組成；進行一發酵製程，該發酵製程係於該基質中接種一黑柄炭角菌，並於一發酵溫度下培養一發酵時間，以獲得一發酵物質；分離該發酵物質，以獲得該黑柄炭角菌菌絲體；進行一萃取製程，該萃取製程係利用一溶劑與該黑柄炭角菌菌絲體混合成一混合物後，將該混合物攪拌一萃取時間；以及去除該混合物之一固體部份，以獲得一上清液，其中該上清液包含該黑柄炭角菌菌絲體萃取物，且該黑柄炭角菌菌絲體萃取物具有一抗發炎活性。
2. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該基質係由2%重量比之糙米粉、0.5%重量比之麥芽萃取物以及97.5%重量比之水所組成。
3. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該發酵溫度為25℃。
4. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該發酵時間為10天。
5. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該溶劑為80℃至100℃的熱水，該萃取時間為0.5小時至2小時。
6. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該溶劑為70%重量比之乙醇，該萃取時間為22小時至26小時。
7. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該固體部份係利用一離心方式、一過濾方式或上述方式之組合而去除。
8. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該抗發炎活性係抑制一氧化氮(NO)之生成。
9. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該抗發炎活性係抑制一促發炎細胞因子之生成。
10. 如申請專利範圍第9項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該促發炎細胞因子為腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、介白素6(interleukin-6,IL-6)或介白素12(interleukin-12,IL-12)。
11. 如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之用途，其中該抗發炎活性係抑制環氧合酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)之活性。
12. 一種抗發炎之組合物，其中該組合物包含如申請專利範圍第1項所述之黑柄炭角菌菌絲體萃取物之一有效劑量。
13. 如申請專利範圍第12項所述之抗發炎之組合物，其係呈選自以下群組之一形式：醫藥組合物、化妝品組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物。