TW201634477A - 於植物體內表現之表皮生長因子的純化物之製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明之課題在於提供一種可提高於植物體內表現之EGF蛋白質之純化物之產率的手段。 本發明提供一種於植物體內表現之表皮生長因子的純化物之製造方法，其特徵在於包括：破碎步驟，其將含有表皮生長因子之植物體破碎；離心分離步驟，其將破碎液離心分離，並回收上清液；二相分配步驟，其將所回收之上清液供於使用由聚乙二醇相及鹽相所構成之水性二相系之水性二相分配法，回收聚乙二醇相；及層析步驟，其將聚乙二醇相供於離子交換層析法或吸附層析法；並且不包括超過濾步驟。

Description

於植物體內表現之表皮生長因子的純化物之製造方法

本發明係關於一種於植物體內表現之表皮生長因子之純化。

細胞生長因子係與對應之受容體結合，經過細胞內訊號傳遞系統而誘發細胞之生長所需之代謝系統活動，促進細胞之生長。表皮生長因子(EGF)為細胞生長因子之一。作為EGF之生理活性，除細胞生長作用以外，已知胃酸分泌抑制作用、抗潰瘍作用、消化器官黏膜保護作用、DNA合成促進作用、角膜修復作用、創傷治癒促進作用、抗炎症作用、鎮痛作用等。

EGF等細胞生長因子係利用作為醫藥品及化妝品等之成分之一。業界對EGF之有效率之生產方法亦有進行研究，報告有各種藉由基因重組之EGF之生產方法。作為該等報告之一例，有利用大腸菌之生產(非專利文獻1)、利用酵母之生產(非專利文獻2~4)、利用植物之生產(專利文獻1、非專利文獻5)等。

迄今為止，本申請案發明者等人發現可於植物細胞內以較高效率表現EGF之經改變之EGF編碼序列及訊息肽編碼序列，利用該序列，而確立藉由不使用基因重組植物之短暫性表現系而可實用化植物體內之EGF的生產方法(專利文獻2)。

由利用該短暫性表現技術所表現之EGF之植物體之 純化，係將超過濾與疏水性相互作用層析法組合而進行。

更具體而言，作為第一階段，自如下方式開始：於包含蛋白分解酵素抑制劑之緩衝液中，使用攪拌機等，將所收穫之植物地上部分破碎，並自植物組織萃取EGF。所收穫之地上部分即植物組織，基本上係由植物細胞構成。植物之細胞由將纖維素作為主成分之細胞壁保護，又，細胞內部包含葉綠體所代表之各種器官。自植物組織之EGF之萃取，係藉由物理手段破壞細胞壁、葉綠體等細胞內器官，而製備包含植物細胞內之成分之萃取物的步驟。該萃取物中一併包含植物組織之破壞物與微小之細胞之碎片、器官之破壞物等。

作為純化之第二階段，藉由過濾、離心等手段將因物理破壞所產生之植物組織之破壞物、細胞壁之斷片、及細胞內器官之破壞物去除，而製備包含EGF之組成物。該製備液於肉眼觀察下為澄清之液體，但仍包含微小之細胞壁之斷片、細胞內器官之斷片等。為了去除該等成分，而使用去除一定分子量以上之成分之超過濾。於超過濾步驟中，利用例如Miracloth(CALBIOCHEM公司)或玻璃纖維濾紙等過濾器進行過濾後，利用區分分子量10~30kDa左右之薄膜將濾液交叉流過濾，而獲得粗純化物。其後，藉由疏水性相互作用層析法進一步進行純化，而獲得純化物。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開公報WO 2011/083500

[專利文獻2]國際公開公報WO 2014/097733

[非專利文獻]

[非專利文獻1]F. kishimoto et al., Gene, 45, 311 (1986)

[非專利文獻2]M. S. Urdea, et al. Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 80 7461 (1983)

[非專利文獻3]J. M. Clements, et al., Gene 106, 267 (1991)

[非專利文獻4]Z. Hambali, Journal of International Studies, 10, 36 (2009)

[非專利文獻5]Sonin Wirth, et al., Molecular Breeding 13: 23-35, 2004

根據專利文獻2所記載之上述純化方法，可以較高純度獲得具有生物活性之EGF蛋白質組成物。然而，根據其後之研究可知：至今為止之純化方法，在層析法後之最終產率為十數%左右，非常低的情況。即便提高植物組織內之EGF生產效率，於純化物之產率較低之情況下，仍無法充分地實現EGF之生產成本之削減。因此，本發明之目的在於提供一種可提高於植物體內表現之EGF蛋白質之純化物之產率之手段。

本申請案發明者等人對於植物組織內表現之EGF之純化步驟進行反覆研究，認為藉由超過濾膜之粗純化之步驟係成為降低產率之主要原因，努力進行研究的結果發現：採用使用由聚乙二醇相及鹽相所構成之水性二相系之二相分配法代替超過濾，利用 層析法純化藉由二相分配之純化液，藉此可提高具有活性之EGF蛋白質組成物純化物之產率，尤其是藉由在層析步驟中進行離子交換層析法，可將產率提高至習知之藉由超過濾之純化法之2倍以上，從而完成本申請案發明。

即，本發明提供一種於植物體內表現之表皮生長因子的純化物之製造方法，其特徵在於包括：破碎步驟，其將含有表皮生長因子之植物體破碎；離心分離步驟，其將破碎液離心分離，並回收上清液；二相分配步驟，其將所回收之上清液供於使用由聚乙二醇相及鹽相所構成之水性二相系之水性二相分配法，回收聚乙二醇相；及層析步驟，其將聚乙二醇相供於離子交換層析法或吸附層析法；並且不包括超過濾步驟。又，本發明提供一種調配有表皮生長因子之化妝品之製造方法，其包括藉由上述本發明之方法而製造於植物體內表現之表皮生長因子之純化物，並將該純化物調配至化妝品中。進而，本發明提供一種調配有表皮生長因子之醫藥品或準醫藥品之製造方法，其包括藉由上述本發明之方法而製造於植物體內表現之表皮生長因子之純化物，並將該純化物調配至醫藥品或準醫藥品中。

根據本發明，提供可以較高產率純化於植物體內表現之EGF之手段。與至今為止之純化方法相比，根據本發明可以非常高之產率萃取．純化於植物體內表現之EGF。藉此，可進一步抑制EGF組成物之製造成本，變得可實現調配有EGF之化妝品或醫藥品、準醫藥品之進一步廉價化。

圖1係為了將藉由二相分配法粗純化之EGF進一步純化而實施之離子交換層析法之層析圖。

圖2係對藉由離子交換層析法分取之分餾物(No.7、13、20、28~35、39)利用SDS-PAGE進行分析之結果。

本發明之EGF純化物之製造方法係為了萃取純化於植物體內表現之EGF而使用。EGF較佳為人類EGF。於植物體內之EGF之表現可為藉由在植物基因組中組入EGF編碼序列而成之重組植物之發現，亦可為藉由使組入有EGF編碼序列之重組植物病毒感染植物之短暫性表現系之表現。作為藉由短暫性表現系之EGF生產技術，可列舉本申請案發明者等人所確立之專利文獻2記載之方法。該方法係為了使編碼訊息肽及EGF之鹼基序列於值物細胞內表現而利用最適化之改變序列，本申請案序列表之序列編號1所示之鹼基序列為該改變序列之較佳一例。

本發明中，首先，將包含所表現之EGF之植物體於包含蛋白酶抑制劑之適當緩衝液中進行破碎(破碎步驟)。只要使用攪拌機或均質機等，於冷卻下進行破碎即可。作為破碎之植物體，亦可使用地上部分之任一部位，通常較佳為使用葉。

其次，將破碎液離心分離，並回收上清液(離心分離步驟)。此時，較佳為添加凝集劑進行離心分離。作為凝集劑，可較佳地使用陽離子性聚合物。陽離子性聚合物之使用濃度，係例如只要以1~5v/v%左右之最終濃度使用即可。藉由添加凝集劑並進行離心分離，可將引起二相分配步驟中之粗純化液之顯色、或層析 步驟中之對層析法載體之沈積等不良影響之目標蛋白質以外之雜質有效率地自破碎液去除。本申請案發明者等人發現：藉由將陽離子性聚合物中尤其是聚乙烯亞胺使用作為凝集劑，可極有效率地去除破碎液中之雜質。因此，作為凝集劑，尤佳為使用聚乙烯亞胺。

繼而，藉由水性二相分配法進行離心分離後之上清液所含之EGF之粗純化(二相分配步驟)。所謂水性二相分配法，係亦稱為水性二相分離之技術，自習知以來用於蛋白質等源自生物體物質之純化其本身為公知之技術(例如參照Folke Tjerneld、(譯)三宅淳、蛋白質 核酸 酵素，Vol.37,No.1,p.37-45,1992；Marco Rito-Palomares,Journal of Chromatography B,807(2004)p.3-11；Per-Ake Albertsson Ed.Partition of Cell particles and Macromolecules 3rd.Edition,Wiley(Inter-science)New York 1986 p.8-39；Methods in Enzymology,Vol.228,Academic Press 1994 p.28-42等)。為利用水溶液，藉由兩種水溶性聚合物或水溶性聚合物與鹽之組合使分離為2相之現象，藉由對各相中之分配係數之差而分離水溶液中之各物質之方法。作為習知之液液萃取法，通常為使用水性溶劑或水性溶劑及有機溶劑之分離，但由於較多生物體高分子會因與有機溶劑之接觸而發生改質，故而無法使用，相對於此，利用水溶性聚合物之2相分配技術，由於不利用有機溶劑，故而適於生物體高分子之分離。又，若將2相分配技術使用於生物體物質之分離，則有如以下之優點，本發明中亦可享受該等優點。

(1)由於不使用固相，故而不僅可避免生物體物質之吸附及伴隨其之構造破壞．改質等，且由於較多生物體物質會因親水性聚合物之共存而穩定化，故而變得可在常溫下進行操作。

(2)由於2相間之界面張力之差極小，故而可藉由混合而獲得相對穩定之微細液滴之懸浮狀態，因此分配平衡之達成迅速且容易。

(3)由於分配係數對於系之總體積、2相之體積比以及分離對象之濃度不敏感，故而基於試管規模之實驗結果容易進行規模放大(scale up)。

(4)可導入與目標物質之親和性較高之配位子，而提高分離之特異性。

本發明中，二相分配步驟中使用由水性聚合物相及鹽相所構成之水性二相系。使用聚乙二醇(PEG)作為水性聚合物。該水性二相系中，PEG相成為上層，鹽相成為下層，自植物體萃取之EGF蛋白質係分配於上層之PEG相。可使用之PEG之分子量為1000~20000之範圍，其中，可較佳地使用分子量1000~10000之PEG，尤佳地使用分子量3000~8000之PEG。再者，亦可將分子量不同之2種以上PEG混合而構建PEG相。

PEG相之PEG濃度可適當設定，通常為50w/w%以下，例如可為45w/w%以下、40w/w%以下、35w/w%以下、30w/W%以下、28w/w%以下、或25w/w%以下。PEG濃度之下限亦無特別限定，例如可為10W/w%以上、12w/w%以上、15w/w%以上、或20w/w%以上。於將2種以上PEG組合使用之情形時，上述濃度意指合計之濃度。

鹽相之構建可較佳地使用選自包含硫酸鹽及磷酸鹽之群組中之至少1種。作為硫酸鹽之具體例，可列舉：硫酸銨、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸鈉等，例如可較佳地使用硫酸銨。作為磷酸鹽之具體例，可列舉：磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸三鈉、磷酸氫 二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸三鉀、磷酸一鎂、磷酸二鎂、磷酸三鎂等，例如可較佳地使用磷酸氫二鈉。尤其是使用硫酸銨及磷酸氫二鈉之至少一者，尤佳為使用兩者。

鹽相之鹽濃度可根據PEG相之PEG濃度適當設定。通常，鹽濃度為30w/w%以下，例如可為25w/w%以下、20w/w%以下、15w/w%以下、10w/w%以下、8w/w%以下、或6w/w%以下。關於鹽濃度之下限，亦並無特別限定，例如可為2w/w%以上、3w/w%以上、或4w/w%以上。再者，此處所謂鹽相之鹽濃度，不包括純化對象物中所含之鹽類，係指用於構建鹽相而添加至系內所使用之鹽之濃度。於將2種以上鹽組合使用之情形時，上述濃度意指合計之濃度。

二相分配步驟中，只要於離心分離後之上清液中添加適當量之PEG及鹽，充分進行攪拌直至完全溶解後，進行離心分離並回收上層之PEG相即可。通常，於4℃~室溫左右之溫度下進行二相分配。

所回收之PEG相繼而供於藉由層析法之純化(層析步驟)。作為水性二相分配技術之問題，由於EGF中間純化物溶解於PEG相中，故而為了進一步促進純化必須去除PEG。關於藉由水性二相分配之源自生物體物質之純化，至今為止已研究超過濾法或凝膠過濾層析法等數種方法(Marco Rito-Palomares,Journal of Chromatography B,807(2004)p.3-11)，但由於PEG相之黏度之高程度等而於實用化方面殘存較多問題。本申請案發明者等人為了解決該問題而反覆研究的結果發現，作為去除PEG之手段，離子交換層析法為最有效之手段。

離子交換層析法係利用生物體分子之帶電狀態，並與具有相反電荷之載體可逆地結合．溶出而回收之方法。可利用每種蛋白質之溶出條件之差異進行純化。填充至管柱中之載體於分子結構之一部分具有作為離子基而電離之結構，因此與具有相反電荷之物質結合。例如，蛋白質包含多種之離子性胺基酸，於分子表面具有正電荷及負電荷兩者。將該電荷之總和稱為有效表面電荷，但胺基酸之帶電狀態根據溶液之pH值變化為正或負，因此蛋白質分子之有效表面電荷亦依存於pH值而變化，每種蛋白質存在表面電荷之正負均衡之等電點。於較多之情形時，結合於載體之蛋白質，提高緩衝劑之離子強度(鹽濃度)、或者改變pH值使其溶出。若提高離子強度，則鹽離子(通常Na⁺或Cl^-)及結合於載體之成分與載體表面之電荷拮抗，結合成分開始溶離。隨著離子強度升高，於該pH值下自有效表面電荷最少之蛋白質逐漸溶出。若改變pH值，則達到等電點之蛋白質失去與載體之結合力而逐漸溶出。

但是，層析步驟並不限定於離子交換層析法，亦可藉由吸附層析法而純化PEG相。蛋白質分子之吸附主要係使用羥磷灰石載體。

層析步驟中，為了消除PEG相之黏度或鹽相之較高鹽濃度所致之不良影響，較理想係將所回收之PEG相稀釋至2倍~20倍左右。稀釋倍率係根據所使用之PEG之分子量、鹽之種類、濃度而適當選擇。只要使EGF吸附於層析法載體，洗淨後，於具有適當濃度梯度之溶出液中進行溶出，一邊適當監控280nm之吸光度，一邊回收包含EGF之分餾物即可。

藉由以上步驟，變得可不進行超過濾而以較高產率回 收純化於植物體內表現之EGF。所獲得之EGF純化物可調配至化妝品或醫藥品、準醫藥品等各種製品中而使用。所謂「調配至製品中」，意指將EGF純化物使用作為該製品之成分之一，於該製品之製造步驟之任一步驟中與其他成分之至少一部分進行混合。

[實施例]

以下，基於實施例更具體地說明本發明。但是，本發明並不限定於下述實施例。

依照專利文獻2(WO 2014/097733)所記載之方法製成組入有成熟型人類EGF之胺基酸序列之菸草鑲嵌病毒(TMV)表現載體，將接種有重組TMV RNA之植物之葉作為材料而實施EGF之純化。

<TMV表現載體之製成及病毒接種之概要(詳細情況係如專利文獻2記載)>

包含編碼將菸草延展訊息肽序列、53個殘基之成熟型人類EGF序列、及小胞體保留訊息KDEL連結而成之胺基酸序列的鹼基序列之嵌入DNA(序列編號1)係藉由化學合成而製作。另一方面，利用PacI及XhoI將可表現重組菸草鑲嵌病毒之質體UB001消化，於瓊脂糖凝膠中泳動後自凝膠萃取．純化。利用T4 DNA連接酶將嵌入DNA及UB001連接(37℃、20分鐘)。藉由熱休克將所獲得之質體DNA導入至大腸菌NEB5-α(New England BioLabs公司)，以含安比西林之培養基加以篩選，使單菌落增殖，使用mini prep套組(Qiagen公司)自該大腸菌細胞萃取．純化質體DNA，藉此獲得於UB001之菸草鑲嵌病毒MP區域與CP區域之間插入有嵌入DNA之重組TMV 表現質體。將該重組TMV表現質體DNA作為模板，使用Ambion mMessage mMachine kit(Life Technologies)進行轉錄反應。

使用轉錄反應後之反應液，與緩衝劑(GENEWARE(註冊商標)接種緩衝液(GIB))混合而製成接種原。使用該接種原，對菸草(Nicotiana benthamiana)每1個體之2片真葉，滴下每片葉30μL之接種原，以戴著手套之手指輕擦，使葉損傷，藉此使重組TMV RNA感染菸草。

<自菸草之葉之EGF之粗純化>

於接種後栽培14天後，收穫出現病徵之菸草葉243g。萃取用緩衝液(50mM三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值8.5)、10mM之EDTA、1mM之PMSF(苯甲基磺醯氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride)、作為蛋白酶抑制劑)、0.1%Triton X-100)於萃取作業前冷藏保存於4℃。

對243g之葉添加244mL之萃取用緩衝液，利用榨汁器進行破碎萃取，置於玻璃瓶中而保存為冰液。對該液以4%(V/V)之比率添加聚乙烯亞胺50%溶液，放置20分鐘後，以4℃進行10,000g、10分鐘離心，將該上清液分離，實施2相分配法之純化。

<藉由二相分配法之純化>

於藉由上述方法進行處理之上清液549mL中添加(NH₄)₂SO₄ 18.14g、Na₂HPO₄ 15.59g、聚乙二醇6000(PEG6000)167.7g，利用攪拌器進行攪拌直至完全溶解後，以4℃進行10,000g、10分鐘離心，回收上層部。將其製成藉由2相分配法之純化液。

<藉由離子交換層析法之純化>

將藉由2相分配法純化之溶液100mL置於具有攪拌裝置之容器中，一邊攪拌一邊利用RO(reverse osmosis，逆滲透)水稀釋至950mL，利用氫氧化鈉溶液製備為pH值10.2後，利用RO水製成1L。

將該稀釋液1L以4.3mL/分之速度流入經20mM甘胺酸緩衝液(pH值10.2)平衡化之HiPrep Q XL管柱(GE healthcare公司)，其後利用20mM甘胺酸緩衝液(pH值10.2)洗淨。對該管柱，於20mM甘胺酸緩衝液(pH值10.2)中以0~0.5M(0.5莫耳/L)氯化鈉之濃度梯度溶液進行溶出，一邊監控280nm之吸光度，一邊分取15mL之分餾物(圖1)。

<藉由SDS-PAGE之分析>

對藉由離子交換層析法分取之分餾物(No.7、13、20、28~35、39)利用SDS-PAGE進行分析。分析係將分子量標記(Molecular Weight Marker)、EGF1μg、各分餾物10μL於電泳條件300V、20mA、80分鐘下實施，進行染色(圖2)。對電泳後之染色圖像進行掃描分析，算出各分餾物之純度(表1)。

<產率>

使用R&D公司之套組，藉由EIA法測定各分餾物之EGF濃度，算出產率，將專利文獻1所記載之純化法與上述本申請案純化方法進行比較。將其結果示於表2。確認根據藉由不進行超過濾之二相分配法之本申請案純化方法，層析法後之最終產率提高至2倍 以上，可產率佳地獲得EGF純化物。

<110> 優你生物股份有限公司

<120> 於值物體內表現之表皮生長因子的純化物之製造方法

<130> 1564

<160> 2

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 插入序列，SP-EGF-KDEL

<220>

<221> CDS

<222> (10)..(261)

<400> 1

<210> 2

<211> 83

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構造

<400> 2

Claims (37)

1. 一種於植物體內表現之表皮生長因子的純化物之製造方法，其特徵在於包括：破碎步驟，其將含有表皮生長因子之植物體破碎；離心分離步驟，其將破碎液離心分離，並回收上清液；二相分配步驟，其將所回收之上清液供於使用由聚乙二醇相及鹽相所構成之水性二相系之水性二相分配法，回收聚乙二醇相；及層析步驟，其將聚乙二醇相供於離子交換層析法或吸附層析法；並且不包括超過濾步驟。
2. 如請求項1之方法，其中，聚乙二醇之分子量為1000~20000。
3. 如請求項1之方法，其中，層析步驟係藉由離子交換層析法而進行。
4. 如請求項2之方法，其中，層析步驟係藉由離子交換層析法而進行。
5. 如請求項1之方法，其中，用於構建鹽相之鹽為選自包含硫酸鹽及磷酸鹽之群組中之至少1種。
6. 如請求項2之方法，其中，用於構建鹽相之鹽為選自包含硫酸鹽及磷酸鹽之群組中之至少1種。
7. 如請求項3之方法，其中，用於構建鹽相之鹽為選自包含硫酸鹽及磷酸鹽之群組中之至少1種。
8. 如請求項4之方法，其中，用於構建鹽相之鹽為選自包含硫酸鹽及磷酸鹽之群組中之至少1種。
9. 如請求項5之方法，其中，硫酸鹽為硫酸銨。
10. 如請求項6之方法，其中，硫酸鹽為硫酸銨。
11. 如請求項7之方法，其中，硫酸鹽為硫酸銨。
12. 如請求項8之方法，其中，硫酸鹽為硫酸銨。
13. 如請求項5之方法，其中，磷酸鹽為磷酸氫二鈉。
14. 如請求項6之方法，其中，磷酸鹽為磷酸氫二鈉。
15. 如請求項7之方法，其中，磷酸鹽為磷酸氫二鈉。
16. 如請求項8之方法，其中，磷酸鹽為磷酸氫二鈉。
17. 如請求項9之方法，其中，磷酸鹽為磷酸氫二鈉。
18. 如請求項10之方法，其中，磷酸鹽為磷酸氫二鈉。
19. 如請求項11之方法，其中，磷酸鹽為磷酸氫二鈉。
20. 如請求項12之方法，其中，磷酸鹽為磷酸氫二鈉。
21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中，聚乙二醇相之聚乙二醇濃度為10w/w%~50w/w%。
22. 如請求項1至20中任一項之方法，其中，鹽相之鹽濃度為2w/w%~30w/w%。
23. 如請求項21之方法，其中，鹽相之鹽濃度為2w/w%~30w/w%。
24. 如請求項1至20中任一項之方法，其中，對上述破碎液添加凝集劑並進行離心分離。
25. 如請求項21之方法，其中，對上述破碎液添加凝集劑並進行離心分離。
26. 如請求項22之方法，其中，對上述破碎液添加凝集劑並進行離心分離。
27. 如請求項23之方法，其中，對上述破碎液添加凝集劑並進行離心分離。
28. 如請求項24之方法，其中，凝集劑為陽離子性聚合物。
29. 如請求項25之方法，其中，凝集劑為陽離子性聚合物。
30. 如請求項26之方法，其中，凝集劑為陽離子性聚合物。
31. 如請求項27之方法，其中，凝集劑為陽離子性聚合物。
32. 如請求項28之方法，其中，陽離子性聚合物為聚乙烯亞胺。
33. 如請求項29之方法，其中，陽離子性聚合物為聚乙烯亞胺。
34. 如請求項30之方法，其中，陽離子性聚合物為聚乙烯亞胺。
35. 如請求項31之方法，其中，陽離子性聚合物為聚乙烯亞胺。
36. 一種調配有表皮生長因子之化妝品之製造方法，其包括藉由請求項1至35中任一項之方法而製造於植物體內表現之表皮生長因子之純化物，並將該純化物調配至化妝品中。
37. 一種調配有表皮生長因子之醫藥品或準醫藥品之製造方法，其包括藉由請求項1至35中任一項之方法而製造於植物體內表現之表皮生長因子之純化物，並將該純化物調配至醫藥品或準醫藥品中。