TW201620926A - 免疫刺激性重構型流感病毒顆粒與免疫增強劑之組合及含有彼之疫苗 - Google Patents
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Abstract
本發明關於佐劑系統之製備,該佐劑系統能達到針對所欲抗原的體液及細胞免疫反應之所需水準。本發明提供包含免疫刺激性重構型流感病毒顆粒(IRIV)及免疫增強劑(immunopotentiator)之佐劑系統。本發明說明抗原被吸收或納入IRIV中且進一步與親脂性佐劑(諸如MPL)或吡喃葡萄糖基脂質佐劑(MPL之合成類似物)經調製。
Description
本發明關於佐劑系統之製備,該佐劑系統能達到針對所欲抗原的體液及細胞免疫反應之所需水準。本發明提供包含免疫刺激性重構型流感病毒顆粒(IRIV)及免疫增強劑(immunopotentiator)之佐劑系統。本發明說明抗原可被吸收或納入IRIV中且進一步與免疫增強劑(較佳為親脂性佐劑,諸如單磷醯脂質(MPL)或吡喃葡萄糖基脂質佐劑(MPL之合成類似物,GLA))經調製。
疫苗係針對任何細菌或病毒進行預防。其可像藥劑般作用以保護你的身體免於生病。基本上,疫苗和藥物治療之間的差異為疫苗為預防性質。第二者(藥物治療)為必須定期服用之治療。接種疫苗對建立兒童之免疫系統具關鍵性。嬰兒出生時具有一些他們從其母親獲得之免疫力,但該免疫力在短短幾個月後就開始消退。由於他們未曾接觸
過疾病,他們沒有機會充分建立其自身之免疫系統來對抗疫苗可預防性疾病。因此,疫苗對藉由預防每一個體罹患疫苗可預防性疾病來發展建造健康世界而言是必要的。科學家在研發對抗感染劑之治療或預防性疫苗的困難之一為達到免疫反應所需之保護水準。用於現代疫苗之純重組及合成抗原大致上較老式活/減毒疫苗及經滅殺之全有機體疫苗的免疫原性差。該重組及合成之抗原為較佳者,因為其製造及品質控制較簡單,無其他病毒或外部蛋白,因此毒性較低,在病毒為致癌性或建立持續性感染的情況下更加安全,甚至若無法培養病毒時仍可行。一種提高疫苗製造品質的方式為納入免疫調節劑或佐劑與經改質之投遞載劑,即,脂質體、免疫刺激複合物(ISCOM)、除明礬(其用來作為金標準)外之微米/奈米球。佐劑係藉由刺激免疫系統對疫苗作出更劇烈的反應來增強疫苗之效果,從而增加對抗特定疾病之免疫力。佐劑可用於多種目的:增強免疫原性、提供抗原-劑量節約、加速免疫反應、減少對加強免疫接種的需求、增加保護期間或提高在反應不良族群(包括新生兒、免疫受損個體及老人)中之療效。佐劑功能上被定義為添加在疫苗調製劑中以增強抗原在活體內之免疫原性的組分。佐劑根據其主要作用機制可被分成二種類別(投遞系統及免疫增強劑)。免疫增強劑直接(例如細胞因子)或透過模式識別受體(PRR)(諸如細菌組分)來活化先天免疫力,而投遞系統(例如微粒及奈米粒)濃縮該抗原並以重複模式顯示抗原,將疫苗抗原對準APC(抗原呈遞細胞)
並協助將抗原和免疫增強劑共同定位。因此,免疫增強劑和投遞系統均可用於增強活體內抗原特異性免疫反應。
目前使用之佐劑係使用實證方法研發,因此這些佐劑對當今許多疫苗接種挑戰而言並非最佳的。尤其是,歷史上對體液免疫反應的重視導致發展出能夠增強抗體反應之佐劑。因此,最常用之佐劑能有效提高血清抗體效價,但不會引發顯著之Th1(第1型T輔助細胞)反應或CTL(細胞毒性T-淋巴細胞)。因為需要針對慢性感染[例如利甚曼原蟲、HIV、C型肝炎病毒(HCV)、結核病、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、瘧疾和單純皰疹病毒(HSV),等]之疫苗,佐劑定性影響免疫反應之結果的能力為重要考量且癌症已將焦點轉移至產生細胞免疫反應,而佐劑特別適合引發此效果。
主要之佐劑群包括以明礬為底質之佐劑、礦物鹽佐劑,諸如鈣、鐵和鋯之鹽、完全弗氏(Freund's)佐劑(CFA)、佐劑乳劑,諸如不完全弗氏佐劑(IFA)、莫他尼德(montanide)、MF 59及佐劑65、細菌來源之佐劑、彼等之合適組合,等。
佐劑被納入任何疫苗調製劑中的好處必須與不良反應之風險平衡。對佐劑之不良反應可分類為局部或全身性。重要之局部反應包括疼痛、局部發炎、腫脹、注射部位壞死、淋巴腺病、肉芽腫形成、潰瘍及產生無菌膿腫。全身性反應包括噁心、發燒、佐劑性關節炎、葡萄膜炎(uveitis)、嗜酸性粒細胞增多(eosinophilia)、過敏
(allergy)、過敏性反應(anaphylaxis)、器官特異性毒性、免疫抑制或自身免疫性疾病及釋放不同細胞因子。不幸的是,強力之佐劑作用時常與毒性增加關聯,如CFA(完全弗氏佐劑)之情況所例示,該CFA雖然有效,但用於人體是有毒的。因此,佐劑研究的主要挑戰之一為獲得效力,同時將毒性減至最低。實現此目標之困難反映在儘管明礬早在80年前即首次被發現,但仍是當今所使用之主要人類佐劑的事實。
IRIV之佐劑性質為本技藝所周知,例如從WO 92/19267中得知,該WO 92/19267中揭示IRIV對與其偶聯之抗原的佐劑效果。
然而,雖然使用病毒顆粒作為佐劑有許多優點,例如低毒性和高免疫原性,目前之疫苗學中的問題之一為低免疫原性抗原缺乏必須之免疫原性。在亞單位疫苗方面,令人高度期望的是合適之投遞系統、免疫增強劑及經分離之抗原的組合對引發理想之免疫反應將是必要的。在許多情況中,對病毒顆粒調製劑添加額外之佐劑會破壞病毒顆粒調製劑之免疫學性質,因為該等佐劑具高極性,例如明礬佐劑使病毒顆粒變形,而以角鯊烯為底質之佐劑(像MF-59)會溶解病毒顆粒膜。因此,研發包含投遞系統及免疫增強劑之合適的佐劑系統是有困難的。
因此,需要研發可有效之免疫增強佐劑系統,此免疫增強佐劑系統可用於研發免疫原性組成物並提供針對所欲抗原之所需的體液及細胞免疫反應。
本文中,根據本申請案,本發明者已研發出新穎之免疫刺激性重構型流感病毒顆粒與親脂性佐劑(其中該親脂性佐劑較佳為吡喃葡萄糖基脂質佐劑,下文中稱為GLA)之組合,而不破壞各系統之免疫刺激效果;相反地,此佐劑系統提供令人驚訝之超級刺激效果。
目的之一,本發明提供包含合適之投遞系統及合適之免疫增強劑的佐劑系統。
目的之一,本發明提供包含作為投遞系統之病毒顆粒及作為免疫增強劑之合適佐劑的佐劑系統。根據本發明之病毒顆粒為免疫刺激性重構型流感病毒顆粒(IRIV)。根據本發明之IRIV為如WO 92/19267中所揭示者。其係由下列各項所構成:(a)磷脂質之混合物;(b)基本上經重構之功能性病毒外套;及(c)流感血球凝集素(hemagglutinin)蛋白(HA)或其衍生物(其為生物活性且能夠誘導該IRIV與細胞膜融合並能夠在該IRIV被抗原呈遞細胞(較佳為連同所欲抗原之巨噬細胞或B細胞)內吞後誘導該IRIV之細胞溶解作用)。
於進一步之態樣中,本發明提供包含所欲抗原連同如本文所描述之佐劑系統的免疫原性組成物。
於進一步之態樣中,根據本發明之免疫原性組成物包含:(a)磷脂質之混合物;(b)基本上經重構之功能性病毒
外套;(c)流感血球凝集素蛋白(HA)或其衍生物(其為生物活性且能夠誘導該IRIV與細胞膜融合並能夠在該IRIV被抗原呈遞細胞(較佳為巨噬細胞或B細胞)內吞後誘導該IRIV之細胞溶解作用);和(d)佐劑及(e)所欲抗原。
於一該態樣中,所欲抗原包括選自細菌、病毒、寄生蟲之和真菌之感染劑。
於另一態樣中,本發明提供製備包含投遞系統及免疫增強劑之佐劑系統的方法。
於一較佳之態樣中,本發明提供包含病毒顆粒及親脂性佐劑(較佳為GLA)之佐劑系統。
於另一態樣中,本發明提供包含病毒顆粒及佐劑之佐劑系統於研發針對感染劑或致癌劑或致病劑之疫苗的用途。
於一該態樣中,本發明提供用於誘導針對免疫原性分子(所欲抗原)之免疫反應的醫藥組成物,該醫藥組成物包含免疫原性組成物與醫藥上可接受之載體或賦形劑。
於較佳之態樣中,本發明提供含有用於各種抗原之本發明的免疫原性組成物之疫苗。這些疫苗可以習知途徑和劑量投予。
本發明關於佐劑系統之製備,該佐劑系統能達到針對所欲抗原的體液及細胞免疫反應之適當水準。
於一該實施態樣中,該佐劑系統包含投遞系統及免疫
增強劑。
根據本發明之投遞系統為病毒顆粒,較佳為免疫刺激性重構型流感病毒顆粒(IRIV)。根據本發明之IRIV為如PCT國際申請案WO 92/19267中所揭示者。根據本發明之免疫增強劑為傳統用於製備疫苗之佐劑,該疫苗能誘導針對所欲抗原之保護水準的免疫反應。
該等佐劑包括以明礬為底質之佐劑、礦物鹽佐劑,諸如鈣、鐵及鋯之鹽、完全弗氏佐劑(CFA)、佐劑乳劑,諸如弗氏不完全佐劑(IFA)、莫他尼德、MF 59及佐劑65、細菌來源之佐劑、親脂性佐劑、彼等之合適組合。
病毒顆粒或是吸收或是納入所欲抗原以分別誘導針對所欲抗原之體液反應或細胞反應。
於一較佳之實施態樣中,本發明提供包含佐劑系統連同免疫原性分子之免疫原性組成物。該等免疫原性組成物誘導保護水準之針對抗原的免疫反應。
於一更佳之實施態樣中,本發明提供包含下列各項之免疫原性組成物:(a)磷脂質之混合物;(b)基本上經重構之功能性病毒外套;(c)流感血球凝集素蛋白(HA)或其衍生物,其為生物活性並能夠誘導該IRIV與細胞膜融合且能夠誘導該IRIV被抗原呈遞細胞(較佳為巨噬細胞或B細胞)內吞後之細胞溶解作用;和(d)佐劑,較佳為親脂性佐劑及(e)所欲抗原。
本文所描述之“磷脂質混合物”含有天然或合成之磷脂質或彼等之混合物。其至少包含二種選自甘油磷脂質之群
組的不同化合物,諸如磷脂醯膽鹼或磷脂醯乙醇胺及膽固醇。
術語“基本上經重構之功能性病毒外套”係指經重構之流感病毒外套,此經重構之流感病毒外套基本上缺乏天然存在於該流感病毒外套膜部分之內(下方)的組分。於一較佳之實施態樣中,該基本上經重構之功能性病毒外套顯現出單層雙層之形式。該等缺乏組分之實例為天然流感病毒外套之基質蛋白。
作為本發明之IRIV組分的術語“生物活性HA或其衍生物”係指HA或基本上顯示出該天然HA之全部生物活性,因而能夠介導本發明之IRIV經由含有唾液酸之受體吸附至其靶的細胞之衍生物。此外,該等HA組分可被循環之抗流感抗體識別。此生物活性為本發明之IRIV的基本特性。
術語“親脂性佐劑”係指TLR7(Toll樣受體)共軛結合之磷脂質,即,Telormedix(以下稱為TMX)、單磷醯脂質A(Mono Phosphoryl Lipid A)(以下稱為MPL)、GLA或彼等之組合。
於一該實施態樣中,所欲抗原包括利甚曼原蟲(Leishmania)、HIV、C型肝炎病毒(HCV)、肺結核(tuberculosis)及單純皰疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)、引起瘧疾(malaria)之寄生蟲、人類乳頭狀瘤(papilloma)病毒及其他類似物。所欲抗原可為親水性或親脂性。於本發明中,該親脂性抗原係與經調製之病毒顆粒
混合;而親水性抗原必須透過交聯劑共價連接至病毒顆粒之表面。連接子為本技藝所周知。熟習本技藝之人士能夠根據所需抗原選擇本技藝中可用之連接子。該連接子可為可裂解之連接子、非可裂解之連接子、酸不穩定性連接子、光不穩定性連接子、肽酶不穩定性連接子,等。
於進一步之實施態樣中,本發明提供用於製備及純化所欲抗原之方法。所欲抗原可藉由習知方法或技術製備,這些方法或技術包括依序選殖所欲基因,表現所欲基因,純化及表徵從所欲基因取得之蛋白質。上文中提及之步驟涉及本技藝中已知之工具和技術。熟習本技藝之人士可根據要求來選擇該等已知之技術,以達到與所欲抗原之所需表現和純度。
此處,本發明中,較佳地,利甚曼原蟲抗原Leish F3(NH-SMT)、VID 94、VID 99、VID 105、VID 111、KMP 11、LJL 143、Leish F1、Leish F2可使用已知之工具和技術藉由上述步驟製備。
所欲基因可使用本技藝中可用之技術(諸如DNA分離、PCR技術,等)從寄生蟲之基因組DNA中分離出,或可藉由化學方式合成。所欲基因之選殖包括藉由在不同的選殖位點使用限制性內切酶將所欲基因插入載體中。重組技術中所使用之載體為本技藝所已知。此處,本發明中,載體可選自pET-29a(+)(Novagen公司)、以畢赤酵母為基礎之載體,諸如pPicz α、pPIC6、pGAPZ、pAO815或其他類似載體、以哺乳動物細胞為基礎之載體,諸如
pOptiVEC-TOPO、pc DNATM3.1,等。此處,根據本發明中,較佳地,載體可根據利甚曼原蟲的不同抗原選自pET-29a(+)(Novagen)、pET-28a(+)、pPicz α。
選殖後,藉由使用宿主細胞系統,經由轉化或轉染以進一步從插入之所欲基因製造蛋白質。具有所欲基因之載體將其轉化或轉染入宿主細胞中,其中蛋白質將從插入之所欲基因產生。宿主細胞可選自原核細胞(諸如大腸桿菌)或真核細胞(諸如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))或哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)。此處,根據本發明,較佳地,宿主細胞可選自大腸桿菌及巴斯德畢赤酵母。
隨後,經由使用本技藝中已知之方法,可以所需之規模進行高細胞密度發酵。該等方法包括分批、分批餵料及灌注法。此處,本發明中,分批餵料法為用於大規模製造利甚曼原蟲抗原之較佳方法。從所欲基因(較佳為利甚曼原蟲抗原)獲致之蛋白質的純化係經由使用管柱色層分析技術或過濾技術或彼等之合適組合進行。管柱色層分析技術包括離子交換管柱色層分析法、疏水性交互作用管柱色層分析法、親和性管柱色層分析法、尺寸排阻管柱色層分析法、混合模式之管柱色層分析法及彼等之組合。過濾技術主要包括使用各種緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝液、tris緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液及其他類似物)之超濾和滲濾。熟習本技藝之人士可選擇本技藝中可用之合適的純化技術來取得所需之純度。此處,根據本發明,使用離子交換柱色層分析技術來純化所欲蛋白質,較佳為靶的利甚曼原蟲抗原
之蛋白質。
此處,本發明中,所欲抗原之蛋白質的表徵已藉由使用完整質量及肽質量指紋技術完成。
於另一實施態樣中,本發明提供製備包含投遞系統及免疫增強劑之佐劑系統的方法。
於一較佳之實施態樣中,本發明提供用於製備免疫原性組成物之方法,其包含:(a)調製病毒顆粒;(b)吸收抗原以製備含有抗原之經修飾的病毒顆粒;(c)對該含有吸收之抗原的經修飾之病毒顆粒添加佐劑。
病毒顆粒之調製劑充分描述於PCT國際申請案WO 92/19267中。
為了獲得針對所欲抗原之體液免疫反應,調製第一病毒顆粒,隨後吸收所需抗原,以獲得含有抗原之經修飾的病毒顆粒。在親脂性抗原的情況中,將抗原與經調製之病毒顆粒混合;而在親水性抗原的情況中,抗原必須透過交聯劑共價連接該病毒顆粒之表面。
為了獲得細胞免疫反應,對該病毒顆粒成分之懸浮液添加該抗原,隨後經共同調製。該等添加抗原可導致含有或者是吸附在病毒顆粒或者是納入病毒顆粒之所需抗原的經修飾之病毒顆粒。因此,根據本發明之經修飾之病毒顆粒為含有或者是吸附在病毒顆粒或者是納入病毒顆粒之所需抗原的病毒顆粒。
根據本發明,佐劑(較佳為親脂性佐劑)係加至上述之病毒顆粒調製劑。
於一較佳之實施態樣中,本發明提供包含病毒顆粒及親脂性佐劑之佐劑系統。
於更佳之實施態樣中,本發明提供包含IRIV及GLA或其衍生物之佐劑系統。
於另一實施態樣中,本發明提供製備佐劑系統之方法,其包含:(a)調製含有親脂性抗原或親水性抗原之經修飾的病毒顆粒,(b)對該含有抗原之經修飾的病毒顆粒添加佐劑。
此處,根據本發明,該佐劑系統中之佐劑係選自以明礬為底質之佐劑、礦物鹽佐劑,諸如鈣、鐵及鋯之鹽、完全弗氏佐劑(CFA)、佐劑乳劑,諸如不完全弗氏佐劑(IFA)、莫他尼德(montanide)、MF 59及佐劑65、細菌來源之佐劑、親脂性佐劑。
於一較佳之實施態樣中,製備該佐劑系統之方法中的佐劑為選自下列群組之親脂性佐劑:Telormedix(下文中稱為TMX)、單磷醯脂質A(下文中稱為MPL)、GLA或彼等之組合。於更佳之實施態樣中,製備該佐劑系統之方法中的佐劑為GLA或其衍生物。
於另一實施態樣中,本發明提供包含病毒顆粒及免疫增強劑之佐劑系統於研發針對感染劑或致癌劑或致病劑之疫苗的用途。
於一較佳之實施態樣中,本發明提供佐劑系統與利甚曼原蟲抗原之組合以誘導保護水準之免疫反應。
於一該實施態樣中,本發明提供用於誘導針對免疫原性分子(所欲抗原)之免疫反應的醫藥組成物,該醫藥組成物包含免疫原性組成物及醫藥上可接受之載體或賦形劑。
於一較佳之實施態樣中,本發明提供含有用於各種抗原之本發明的免疫原性組成物之疫苗。該疫苗包含所欲抗原及如本發明中所揭示之免疫原性組成物,其可引發針對靶的抗原之免疫反應。這些疫苗可以習知途徑和劑量投予。
於一該實施態樣中,本發明提供刺激有需要刺激免疫反應之患者的免疫反應之方法,其包含投予合適劑量之如本發明所揭示之免疫原性組成物。
SDS PAGE:此為用於根據蛋白質之分子量分離蛋白質的技術。此處,將含有蛋白質之混合物的樣本在電場中,在具有特定篩分粒度之聚丙烯醯胺凝膠上泳行且該蛋白質根據彼等之尺寸以不同速度移動,因此可被分開。將所得之條帶圖案與分子量階梯相比較以決定該抗原之分子量。
BCA分析:此為用於定量蛋白質之生化試驗。總蛋白濃度係藉由樣本溶液從綠色變成紫色之顏色變化與蛋白質濃度之比例呈現,然後可使用比色技術測量該總蛋白濃
度。
ELISA:此為酶聯免疫吸附分析,其中該動物中之血清轉化係藉由特定抗體與相應抗原之間的交互作用測量。所得之結果係藉由該反應混合物與反應中所使用之受質反應後顯影之顏色強度測量。結果係在ELISA裝置中測量。
第1圖描繪藉由IPTG誘導後之一小時期間,Leish F3蛋白在宿主細胞中的表現。
第2圖描繪在滲濾及無菌過濾後之純化的Leish F3蛋白。
第3圖描繪該Leish F3蛋白之完整質量係在預期範圍內,即,約73 KDa。
第4圖描繪Leish F3蛋白之特性已藉由肽質量指紋圖譜(fingerprinting)確認。
第5圖描繪針對KMP 11利甚曼原蟲抗原之體液反應。
第6圖描繪針對LJL 143利甚曼原蟲抗原之體液反應。
第7圖描繪針對NH-SMT(Leish F3)利甚曼原蟲抗原之體液反應。
(提供本專利說明書中所使用之所有術語的縮寫列表)
下列非限制性實施例描述佐劑系統及其含有所欲抗原之一的調製劑,該調製劑可根據本發明製備。將可理解的是,可製備含有不同抗原之其他免疫原性組成物且該等免疫原性組成物係在熟習本技藝之人士的技術範圍內並包含在本發明之範圍內。
Leish F3(NH-SMT)抗原之製備及其純化
Leish F3抗原製劑
經由將二個編碼該蛋白質(即,非特異性核苷水解酶(NH)及固醇24-c-甲基轉移酶(SMT))之利甚曼原蟲開放閱讀框構串聯鏈接來形成Leish F3。此步驟適用於融合蛋白。
選殖細節
將來自嬰兒利甚曼原蟲基因組DNA之基因N(非特異性核苷水解酶alias NH基因;GenBank XP_001464969.1)的開放閱讀框構進行PCR擴增(Kumar et al.(2010)Am.J.Trop.Med.Hyg.82:808-813)。類似地,將來自嬰兒利甚曼原蟲基因組DNA之基因S(固醇24-c甲基轉移酶alias SMT基因;GenBank XP_001469832.1)的開放閱讀框構進行PCR擴增。使用該PCR產物作為模板,以使用剪接重疊PCR法融合。將最終之融合產物選殖入pET-29a(+)載
體(Novagen)中。在非融合蛋白的情況中,來自基因組DNA之單一PCR產物從或經化學合成之基因將被進一步選殖入載體中。此處,pET-28a(+)或pPicz α亦可作為載體。例如,熟習本技藝之人士可使用用於LJL 143抗原之pOptiVEC-TOPO或pPicz α及用於KMP11利甚曼原蟲抗原之pET-28a(+)。
將重組質粒轉化入用於表現之大腸桿菌菌株NS/HMS174(DE3)中。熟習本技藝之人士可使用巴斯德畢赤酵母或CHO細胞株或其他已知之哺乳動物細胞株來表現所欲之重組抗原。
所欲蛋白之表現
將選殖株接種到LB肉湯培養基中以產生用於進一步發酵過程的種子。使用此種子來接種該含有用於生長宿主細胞之界定的培養基(諸如M9)之發酵器,隨後表現該所欲蛋白。藉由IPTG誘導後,將來自發酵器的每小時樣本溶解,裝填在SDS PAGE凝膠中並確認所欲蛋白之表現,如第1圖所示。結果顯示出該所欲蛋白係以所需水準表現在該宿主系統中。
利甚曼原蟲蛋白之純化
使用細胞破碎機(French press)將從發酵器收穫之細胞溶解,分離出以包涵體形式表現之蛋白質並使用不同的緩衝劑清洗液純化。將純化之包涵體溶解在離液劑(如尿素
及鹽酸胍)中。使該含有溶解之蛋白的溶液澄清並將上清液進行陰離子交換色層分析。將由此管柱取得之洗提液再次進行陰離子交換色層分析。
蛋白質再折疊及無菌過濾
在用於蛋白質之正確再折疊之調製緩衝液的存在下,將純化之蛋白質保持在冷的條件下過夜。將讓經正確再折疊之蛋白質進行無菌過濾並儲存。
藉由SDS-PAGE分析該純化之蛋白質的純度並藉由BCA(二喹啉甲酸(Bicinchronic acid)分析)測定蛋白質濃度。最終蛋白質之凝膠圖像顯示在第2圖中。第5和7泳道之單一條帶顯示出使用所採用之純化方法將Leish F3純化至高達所需水準。藉由SDS PAGE分析,該根據本發明之純化的Leish F3蛋白的純度超過95%。純化之蛋白質的產量為每升發酵肉湯約600mg。
蛋白質表徵
藉由完整質量、肽質量指紋圖譜及圓二色光譜(circular dichroism spectra)和螢光光譜來決定最終之純化蛋白質的特徵。
完整質量
進行MALDI TOF分析以測定Leish F3抗原之實際分子量(質量)。Leish F3蛋白之藥物物質顯示出完整分子質
量為73714道耳吞。該數據顯示於第3圖中。
肽質量指紋圖譜
肽質量指紋圖譜(PMF)為用於鑑定蛋白質之分析技術,其中該所欲蛋白先被裂解成較小之肽,其絕對質量可藉由質譜儀(諸如MALDI-TOF)準確測量。使用BLAST工具將肽質量與含有已知之蛋白質序列的資料庫進行比較。進行結果之統計分析以找到最佳匹配。
進行Mascot搜索後,Leish F3樣本之肽質量指紋圖譜明顯命中來自嬰兒利甚曼原蟲JPCM5之“推定的固醇24-c-甲基轉移酶蛋白”。其顯示於第4圖中。從MASCOT搜索獲致之BLAST結果顯示出本發明之Leish F3蛋白明顯根據Mascot積分直方圖。
含自發性結合至其表面之利甚曼原蟲病毒抗原的IRIV GLA之製備
使用緩衝液和溶劑系統溶解純化之流感病毒的沉澱小丸。將混合物離心並將含有該流感突起蛋白(HA)和病毒磷脂質之上清液加入磷脂質混合物中。將全部懸浮液在低溫(4℃)下攪拌特定時間。接著,將懸浮液施加在經平衡之管柱並以用於製備該磷脂質分散液之相同緩衝液洗提。樣本體積和管柱維度為能使在空隙容積VO洗提出之IRIV完全分離並取得膽酸鹽膠束。在第一次色層分析後,進行
第二次色層分析透析。藉由超速離心將源自利甚曼原蟲之純化抗原(NH-SMT或LJL-141或KMP-11)沉澱成小丸。將上述製備之IRIV加入該沉澱小丸中。該利甚曼原蟲抗原藉由Vander-Waals力自發地吸附在IRIV的表面上。
將該IRIV-利甚曼原蟲複合物在低溫下小心攪拌24小時。接著,對上述之複合物加入GLA之穩定乳劑。其導致免疫原性組成物-佐以利甚曼原蟲抗原之IRIV GLA。藉由習知技術分析此免疫原性組成物以測定產體液免疫反應。
含有交聯至膜之瘧疾抗原的IRIV之製備
根據實施例1製備IRIV,但包含下列改變:
以合適之交聯劑分子將瘧疾抗原分子附著在IRIV。
將磷酸乙醇胺(PE)與N-琥珀醯亞胺吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP)偶聯。將乾燥之PE重新溶解於氯仿中。然後加入三乙胺(TEA),接著加入在乾燥甲醇中之SPDP。然後將該混合物在室溫,氮氣下攪拌1至2小時,直到反應完成(即,無游離之PE)。將反應產物在旋轉蒸發器中乾燥。將乾燥之脂質重新懸浮在氯仿中並立即施加在矽酸色層分析柱之頂部。將溶液倒入10ml塑料注射器桶中,以玻璃纖維塞住。令剩餘物排出並為該注射器筒安裝一個塑料可拋棄式三路龍頭。施加脂質後,以氯仿清洗管柱。最後,以一系列氯仿-甲醇混合物洗提該管柱。然後藉由薄層色
層分析法(TLC),使用以氯仿-甲醇-水發展之矽膠板將純衍生物定位。該衍生物之泳行速度較游離PE快,藉由磷鉬酸鹽或碘將斑點可視化。
匯集含有所需產物之餾分並在減壓下,在旋轉蒸發器中藉由蒸發濃縮。
藉由下列程序將瘧疾抗原(CSP抗原)硫醇化:將純化之瘧疾抗原溶解在磷酸鹽緩衝液中。然後,將在乙醇中之特定濃度的SPDP溶液混合並在攪拌下,以Hamilton注射器緩慢地加入該瘧疾蛋白溶液中以使SPDP對蛋白質之莫耳比為15:1。將乙醇濃度保持在5%以下,以防止蛋白質變性。令該混合物在室溫(20℃)下反應30分鐘。反應停止後,藉由凝膠色層分析法將蛋白質從反應物中分離,以含有檸檬酸鈉、磷酸鈉及0.05M氯化鈉之溶液平衡之。
以下述方式將經預處理之IRIV與瘧疾抗原偶聯:依實施例1中之描述製備IRIV。使用PE-SPDP代替PE。依下述將瘧疾-SPDP還原:經由加入1M HCl將在檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液中之瘧疾-SPDP溶液的pH值調整為pH 5.5。在每一毫升之蛋白質溶液中加入10μl之DTT溶液、在0.2M醋酸鹽緩衝液,pH 5.5(165mg之醋酸鈉,在10ml中)中之2.5M二硫代蘇糖醇(DTT,380mg/ml)。令溶液靜置30分鐘。隨後,在經PBS緩衝液,pH7.0平衡之管柱上,藉由色層分析法從DTT分離出蛋白質。為了防止硫醇氧化,以氮氣將所有緩衝液吹泡以除去氧氣。該蛋白質餾分亦是在氮氣下收集。
最後,藉由在室溫下攪拌過夜,將IRIV與該硫醇化之蛋白質混合。
接著,將GLA之穩定乳劑加入上述之複合物中。其導致免疫原性組成物-佐以瘧疾抗原之IRIV GLA。
利甚曼原蟲抗原納入IRIV GLA複合物
根據實施例1製備IRIV,但包含下列改變:
將利甚曼原蟲抗原加入含有該流感突起蛋白(HA)、病毒磷脂質及磷脂質混合物之懸浮液中,再進行管柱色層分析純化步驟。
在最終管柱色層分析步驟之後,收集該懸浮液並加入乳化之GLA懸浮液中。其導致免疫原性組成物-佐以利甚曼原蟲抗原之IRIV GLA。藉由習知技術分析此免疫原性組成物,以測定細胞免疫反應。
經IRIV GLA調製之利甚曼原蟲KMP 11抗原的免疫原性
經皮下途徑,以下列各自含有2μg之KMP 11利甚曼原蟲抗原的調製劑為每組10隻Balb/c小鼠之組別進行免疫化:
體液免疫反應已在不同的時間間隔-第0天、第14天、第28天和第56天,藉由ELISA測定IgG抗體進行監控。此實驗之結果顯示在第5圖中。其顯示出與其他含有各種習知佐劑之KMP 11抗原的組成物相比較時,根據本發明之包含經IRIV GLA調製的KMP 11之組成物顯示出協同作用之較強的針對KMP 11利甚曼原蟲抗原的免疫反應。
經IRIV GLA調製之利甚曼原蟲之LJL 143抗原的免疫原性
經皮下途徑,以下列各自含有2μg之LJL 143利甚曼原蟲抗原的調製劑為每組10隻Balb/c小鼠之組別進行免疫化:
體液免疫反應已在不同的時間間隔-第0天、第14天、第28天和第56天,藉由ELISA測定IgG抗體進行監控。此實驗之結果顯示在第6圖中。其顯示出與其他含有各種習知佐劑之LJL 143抗原的組成物相比較時,根據本發明之包含經IRIV GLA調製的LJL 143之組成物顯示出協同作用之較強的針對LJL 143利甚曼原蟲抗原的免疫反應。
經IRIV GLA調製之利甚曼原蟲之NH-SMT(Leish F3)抗原的免疫原性
經皮下途徑,以下列各自含有2μg之NH-SMT(Leish F3)利甚曼原蟲抗原的調製劑為每組10隻Balb/c小鼠之組別進行免疫化:
體液免疫反應已在不同的時間間隔-第0天、第14天、第28天和第56天,藉由ELISA測定IgG抗體進行監控。此實驗之結果顯示在第7圖中。其顯示出與其他含有各種習知佐劑之NH-SMT(Leish F3)抗原的組成物相比較時,根據本發明之包含經IRIV GLA調製的NH-SMT(Leish F3)之組成物顯示出協同作用之較強的針對NH-SMT(Leish F3)利甚曼原蟲抗原的免疫反應。
Claims (25)
- 一種免疫原性組成物,其包含:(a)抗原;及(b)佐劑系統其中該佐劑系統包含投遞系統及免疫增強劑(immunopotentiator)。
- 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物,其中該投遞系統為病毒顆粒。
- 如申請專利範圍第2項之免疫原性組成物,其中該病毒顆粒為免疫刺激性重構型流感病毒顆粒。
- 如申請專利範圍第3項之免疫原性組成物,其中該免疫刺激性重構型流感病毒顆粒包含磷脂質、基本上經重構之功能性病毒外套及生物活性HA或其衍生物之混合物。
- 如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物,其中該免疫增強劑為佐劑。
- 如申請專利範圍第5項之免疫原性組成物,其中該佐劑係選自下列群組:以明礬為底質之佐劑、礦物鹽佐劑、完全弗氏(Freund's)佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)、莫他尼德(montanide)、MF 59及佐劑65、細菌來源之佐劑、親脂性佐劑、親水性佐劑或彼等之合適組合。
- 如申請專利範圍第6項之免疫原性組成物,其中該礦物鹽佐劑係選自下列群組:鈣、鐵及鋯之鹽類或彼等之合適組合。
- 如申請專利範圍第6項之免疫原性組成物,其中該親脂性佐劑係選自:Telormedix、單磷醯脂質A(Mono Phosphoryl Lipid A)、吡喃葡萄糖基脂質佐劑及彼等之合適組合。
- 一種製備免疫原性組成物之方法,其包含:(a)調製病毒顆粒;(b)吸收或納入抗原以製備含有抗原之經修飾的病毒顆粒;(c)對該含有吸收之抗原的經修飾之病毒顆粒添加佐劑。
- 如申請專利範圍第9項之方法,其中該病毒顆粒為免疫刺激性重構型流感病毒顆粒。
- 如申請專利範圍第9項之方法,其中該佐劑可選自下列群組:親水性佐劑和親脂性佐劑。
- 如申請專利範圍第11項之方法,其中該親水性佐劑係透過交聯劑共價連接病毒顆粒之表面。
- 一種佐劑系統,其包含:(a)投遞系統或載劑;及(b)免疫增強劑。
- 如申請專利範圍第13項之佐劑系統,其中該投遞系統為病毒顆粒。
- 如申請專利範圍第13項之佐劑系統,其中該病毒顆粒為免疫刺激性重構型流感病毒顆粒。
- 如申請專利範圍第14項之佐劑系統,其中該免 疫增強劑為選自下列群組之佐劑:以明礬為底質之佐劑、礦物鹽佐劑、完全弗氏(Freund's)佐劑(CFA)、不完全弗氏佐劑(IFA)、莫他尼德(montanide)、MF 59及佐劑65、細菌來源之佐劑、親脂性佐劑、親水性佐劑。
- 如申請專利範圍第16項之佐劑系統,其中該親脂性佐劑係選自下列群組:Telormedix、單磷醯脂質A、吡喃葡萄糖基脂質佐劑及彼等之組合。
- 如申請專利範圍第13項之佐劑系統,其包含:(a)病毒顆粒;及(b)吡喃葡萄糖基脂質佐劑。
- 如申請專利範圍第18項之佐劑系統,其中該病毒顆粒為免疫刺激性重構型流感病毒顆粒。
- 一種製備如申請專利範圍第13項之佐劑系統的方法,其包含:(a)調製含有親脂性抗原或親水性抗原之經修飾的病毒顆粒,(b)對該含有抗原之經修飾的病毒顆粒添加佐劑。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物及可選擇地用於誘導針對抗原之免疫反應的醫藥上可接受之載體或賦形劑。
- 一種含有如申請專利範圍第1項之免疫原性組成物的疫苗,其係用於誘導針對抗原之免疫反應。
- 一種如申請專利範圍第1至8項中任一項之免疫原性組成物於製備用於刺激患者之免疫反應的藥物之用 途。
- 如申請專利範圍第1至8項中任一項之免疫原性組成物,其中該抗原係選自下列群組:利甚曼原蟲(Leishmania)、HIV、C型肝炎病毒(HCV)、肺結核(tuberculosis)及單純皰疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)、引起瘧疾(malaria)之寄生蟲、人類乳頭狀瘤(papilloma)病毒,較佳為利甚曼原蟲抗原。
- 如申請專利範圍第24項之免疫原性組成物,其中該利甚曼原蟲抗原係選自下列群組:Leish F3、VID 94、VID 99、VID 105、VID111、KMP 11、LJL 143、Leish F1和Leish F2,較佳為Leish F3或KMP 11或LJL 143。
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