TW201609116A - 用以治療血管損傷或病變相關疾病之組合物 - Google Patents

Abstract

本發明係揭露克弗爾乳發酵產物之用途，由於本發明所揭克弗爾乳發酵產物係能夠降低肌氨酸激酶數值、降低纖維化及膠原蛋白纖維累積量、抑制發炎反應，而能達到有效地維持個體步態行為、保護腎臟免於慢性腎臟病變或腎臟衰竭、降低中風或腦部病變之發生率及提昇個體存活率等功效。據此，藉由投予一含有有效量之本發明所揭克弗爾乳發酵產物之組合物至一個體，係能達到治療或減緩個體發生與血管損傷或病變相關疾病之功效。

Description

用以治療血管損傷或病變相關疾病之組合物

本發明係有關於一種發酵產物之用途，特別係指一種用以治療血管損傷或病變相關疾病之組合物。

按，所謂腦中風(stroke or cerebrovvascular accident；CVA)係指腦部血管發生破裂或堵塞，造成腦部血流受阻而使腦組織損傷之急性症狀。研究指出腦中風非為單一因子所引起之疾病，而為多個病灶所結合引起者，例如年齡、血壓、糖尿病、腦部疾病、外傷、抽煙等。根據世界衛生組織2012年全球十大致死率之統計資料，腦中風之排名為第二名，為全世界約620萬人之致死原因。而根據台灣衛生福利部統計，腦中風為十大死因中之第三名，平均每天約有30人死於中風。美國心臟與中風協會(American Heart/Stroke Association；AHA/ASA)公佈美國每年約有79.5萬人發生腦中風，平均每4分鐘有1人死於腦中風，並且，女性發生中風之機率係高於男性。

而腦中風可分為缺血性中風及出血性中風兩類，其中，缺血性中風之發生率較高，主要係由於血管因栓塞或梗塞導致腦部供血量不足，產生功能性障礙或壞死；出血性中風則係因腦血管病變而使血管破裂或蜘蛛網膜下腔出血。腦中風之患者會視其腦組織受損部位，具有不同程度及部份之神經系統缺損病徵，例如癱瘓、感覺異常、嘴臉歪斜、步態不 穩、失去說話能力、吞嚥困難、視力障礙等，嚴重者甚會引發併發疾病甚至死亡。目前目前臨床上對於腦中風之最佳治療藥物係為血栓溶解劑，惟，於該藥物具有嚴重副作用，使用上須受到嚴格限制，例如需於發病3小時內投予，因此，並非所有腦中風患者皆可使用該藥物進行治療。

慢性腎臟病變為一種世界流行性之腎臟疾病，據統計，約80~90%之慢性腎臟病變之患者不具有明顯症狀，無法被診斷，使患者隨著腎功能降低而面臨較高之死亡風險，又以65歲以上老人具有較高之死亡率。依據美國腎臟資料系統2008年之統計資料，台灣末期腎臟疾病之盛行率與發生率排名為世界第一。造成慢性腎臟病變之原因眾多，包含疾病、年齡、抽煙、胰島素抗性、高尿酸等因素，其中，糖尿病、高血壓、痛風、65歲以上老年人、具有家族遺傳腎臟病患者及飲食攝入高鹽等族群，皆為罹患腎臟病變之高危險群。

由過去之文獻資料可知，於血壓持續升高下，會造成腎臟內之血管發炎或動脈硬化症，使腎臟處於缺氧及發炎狀態，進而使腎臟損傷之發生，例如腎小球過濾降低、腎小管肥大及萎縮、間質纖維化、進行性腎小球硬化、動脈硬化等，最後可能導致末期腎臟病。有研究指出高血壓與慢性腎臟病係互為因果關係，進而嘗試透過嚴格控制血壓之方式來減緩腎功能之惡化，惟，研究結果顯示血壓控制較為嚴格之患者，其腎功能惡化程度係未較和緩。

近年來，天然物中生物活性肽(bioactive peptide)之研究發展快速，許多研究人員係以活性胜肽乳作為研究對象，而活性胜肽乳之功效會隨著其產製過程、使用菌元之不同而有差異性存在。舉例來說，日 本可爾必思公司(Calpis)以Lactobacillus helveticus與Saccharomyces cerevisiae共同醱酵所產製出之醱酵乳，其有效成分為VPP(valine-proline-proline)與IPP(isoleucine-proline-proline)之三胜肽，具有抑制ACE及抗高血壓之作用。

克弗爾(Kefir)係為一種酒精產物之產物，源自於北高加索山區，被視為滋養身體、維持健康、增強體魄，甚至可用以提供於病人食用。克弗爾由克弗爾菌元(Kefir grain)加入乳品發酵而成，其外觀呈現米白顆粒狀。更進一步來說，過去研究發現，克弗爾菌元係由酵母菌及乳酸菌共同組成，並且，克弗爾菌元之組成會因氣候、培養條件、溫度及乳源不同而有所差異。據研究指出，克弗爾具有改善腸胃道菌相環境、乳糖不耐症、提升免疫力、抗菌、抗氧化作用、降低膽固醇、降血壓等功效。雖然以克弗爾菌元所生產之發酵產物具有許多保健功效，惟，由於克弗爾菌元之菌相過於複雜，無法維持其內菌種穩定之比例，更無法於商業上量產利用。

本發明之主要目的係在於提供克弗爾乳發酵產物之用途，其係具有改善或治療血管損傷或病變相關疾病之功效，而能作為用以治療血管損傷、血管病變或與其相關疾病之組合物之有效成份。

本發明之另一目的係在於提供克弗爾乳發酵產物之用途，其係藉由投予有效量之本發明所揭克弗爾乳發酵產物至一已具有由血管損傷或病變所引起之疾病之個體，達到有效地改善及治療該疾病之功效。

本發明之次一目的係在於提供克弗爾乳發酵產物之用途，其 係用以提供患有與血管損傷或病變相關疾病之患者一種全新、安全且有效之醫藥組合物，其中，該與血管損傷或病變相關疾病係好發於腦部或腎臟，如腦中風、腦血管病變、腦水腫、腦部萎縮、腦部病變、腎動脈硬化症、腎小球受損、腎小球硬化、腎間質纖維化、腎衰竭或其他腎臟病變等。

為能達成上述目的，本發明之實施例係揭露一種將克弗爾乳發酵產物用於製造治療血管損傷或病變相關疾病之組合物之用途，其中，該克弗爾乳發酵產物係由一動物乳以克弗爾菌元所發酵而得者。

較佳地，該與血管損傷或病變相關疾病係發生於腦部或腎臟。

較佳地，該與血管損傷或栓塞相關疾病係為腦中風、腦血管病變、腦水腫、腦部萎縮、腦部病變、腎動脈硬化症、腎小球受損、腎小球硬化、腎間質纖維化、腎衰竭或其他腎臟病變。

較佳地，該克弗爾乳發酵產物係包含有自一經克弗爾菌元發酵之動物乳所得之至少一胜肽，而經高效率液相層析儀以一預定分析條件分析出該胜肽之分子量小於3kD，並且於高效率液相層析圖中滯留時間為20~40分鐘間具有波峰。

較佳地，該克弗爾乳發酵產物係包含有於該高效率液相層析圖中標號1至7所示之胜肽群，而該高效率液相層析圖係選自於由第一圖至第八圖所組成之群。

更進一步來說，上述高效率液相層析圖之分析條件如下：檢測波長為215nm，分離管柱為SEC管柱，沖提液為100mM磷酸鹽緩衝液、1M氯化鈉以及1mM乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid； EDTA)，酸鹼值6.5，流速為0.5ml/min。

較佳地，該克弗爾乳發酵產物係包含胺基酸序列編碼為SEQ ID No.1之多胜肽。

第一圖係為第一批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第二圖係為第二批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第三圖係為第三批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第四圖係為第四批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第五圖係為第五批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第六圖係為第六批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第七圖係為第七批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第八圖係為第八批次之發酵乳之HPLC層析圖。

第九圖係為未經發酵之原料乳之HPLC層析圖。

第十圖係為蛋白質標準品之HPLC層析圖。

第十一圖A係為正常SHRSP品系大鼠之步態參數圖形。

第十一圖B係為具中風現象之SHRSP品系雄性大鼠之步態參數圖形。

第十一圖C係為具中風現象之SHRSP品系雌性大鼠之步態參數圖形。

第十二圖A係為具中風現象之SHRSP品系雌性大鼠之腎上腺，經H & E染色切片後分別於不同倍率下觀察之結果。

第十二圖B係為具中風現象之SHRSP品系雄性大鼠之腎上腺，經H & E染色切片後分別於不同倍率下觀察之結果。

第十三圖A係為具中風現象之SHRSP品系雌性大鼠之腸繫膜。

第十三圖B係為具中風現象之SHRSP品系雄性大鼠之腸繫膜。

第十四圖A~D分別為27週齡之SHRSP品系大鼠之腦部磁振照影T2影像。

第十四圖E~H分別為58週齡之SHRSP品系大鼠之腦部磁振照影T2影像。

第十五圖A及B分別為具中風現象之SHRSP品系大鼠之腦部組織與腦部磁振照影T1影像之對照。

第十五圖C及D係分別於不同倍率下觀察具中風現象之SHRSP品系大鼠之腦部切片之結果。

第十六圖A係為具中風現象之SHRSP品系大鼠之腦部磁振照影T1影像。

第十六圖B係以磁振照影儀掃描具中風現象之SHRSP品系大鼠之腦部中SWI值之結果。

第十六圖C係以磁振照影儀掃描具中風現象之SHRSP品系大鼠之腦部中DKI值之結果。

第十七圖A係為具中風現象之SHRSP品系大鼠腦部T2影像之連續圖。

第十七圖B係為具中風現象之SHRSP品系大鼠腦部切片之連續圖。

第十八圖係顯示老年之WKY品系大鼠及不同年齡之SHRSP品系大鼠腎臟之T1磁振照影影像。

第十九圖A係為老年之WKY品系大鼠腎臟之T1磁振照影影像。

第十九圖B係為老年且中風之SHRSP品系大鼠腎臟之T1磁振照影影像。

第十九圖C係於不同倍率下觀察老年之WKY品系大鼠腎臟切片之結果。

第十九圖D係於不同倍率下觀察老年之SHRSP品系大鼠腎臟切片之結果。

第二十圖係為各該組大鼠於飼養過程中每週體重變化之結果。

第二十一圖係為各該組大鼠血液中肌氨酸激酶累積量。

第二十二圖A及B分別為各該組大鼠血液中鈣離子與鎂離子之含量。

第二十三圖係為第二組至第四組大鼠之步態影像分析結果。

第二十四圖係為CatWalk步態參數示意圖。

第二十五圖A係為第二組至第四組大鼠之最大接觸面積經統計分析之結果。

第二十五圖B係為第二組至第四組大鼠之最大接觸時間比數值經統計分析之結果。

第二十五圖C係為第二組至第四組大鼠之腳掌面積經統計分析之結果。

第二十五圖D係為第二組至第四組大鼠前爪之間平均寬度經統計 分析之結果。

第二十五圖E係為第二組至第四組大鼠後爪之間平均寬度經統計分析之結果。

第二十六圖係為各該組大鼠之腎臟外觀。

第二十七圖係為於不同倍率下觀察各該組大鼠腎臟切片經H&E染色後之結果。

第二十八圖係為於不同倍率下觀察各該組大鼠腎臟切片經梅生三色(Masson's trichrome)染色法處理後之結果。

第二十九圖係觀察各該組大鼠腎臟切片經Sirius red染色後之結果。

第三十圖係觀察各該組大鼠腎臟切片經免疫化學染色法處理後之結果。

第三十一圖係觀察各該組大鼠腎動脈切片經Sirius red染色後之結果。

第三十二圖係觀察各該組大鼠腦部組織之外觀及其切片經H&E染色後之結果。

第三十三圖係為各該組大鼠死亡率之統計分析結果。

於本發明下列實例中所提及之名詞加以說明如下，但不用以侷限本發明說明書及申請專利範圍，而未加以說明之名詞乃依據本發明所屬技術領域且具通常知識者已瞭解之意義加以定義。

所謂「克弗爾乳發酵產物」係指包含有本發明所揭第一圖至 第八圖中任一圖中波峰1至7所組成之胜肽群，而該胜肽群係得藉由發酵法，將一動物乳以克弗爾菌元進行發酵反應所獲得，舉例來說，克弗爾菌元之濃度為2%，發酵溫度為20~40℃，發酵時間至少20小時。另由發明人所申請之中華民國專利第096135346號所揭內容可知，克弗爾乳發酵產物中係包含有一多胜肽，其序列為SEQ ID No.1。

所謂「克弗爾菌元」，係指克弗爾粒(Kefir grain)，顏色為香檳色或米白色，外型呈不對稱之兩面，其中一面係為粗糙而成螺旋狀，另一面係較為光滑平整。更進一步來說，克弗爾菌元係由乳酸菌及酵母菌所組共生之菌相(symbioticyeast-bacteria community)，主要菌群包含有乳酸桿菌(Lactobacillus)，如嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus)、發酵乳酸桿菌(Lb.fermentum)、乾酪乳酸桿菌(Lb.casei)、瑞士乳酸桿菌(Lb.helveticus)、胚芽乳酸桿菌(Lb.plantarum)、短乳酸桿菌(Lb.brevis)、克弗爾乳酸桿菌(Lb.kefir)、鼠李糖桿菌(Lb.casei subsp.rhamnosus)等；白念球菌(Leuconostoc)，如腸膜明串珠菌(Leu.mesenteroides)；雷特氏乳酸球菌亞種(Lacotococcus lactis subsp.cremoris)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)；酵母菌，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Sac.pastorianus)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis var.lactis)、耐熱型酵母(Klu.Marxianus)、畢赤酵母(Pichia fermentans)、海洋念珠菌(Candida maris)、克弗爾酵母(Can.kefir)等。

所謂「自發性易中風型高血壓大鼠」，其係利用高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat；SHR)以及血壓較高的(Wistar-Kyoto rat；WKY)大鼠近親交配80世代所培育出來的品種，並於出生第8週開始餵食1%之氯化鈉則具有較高發生中風率。過去研究指出，該品系大鼠之疾病模式為易引發中風，在出生滿100天有80%公鼠和出生滿150天有60%母鼠會發展成腦中風，且易出現嚴重大腦病變，如梗塞、出血與中風，或心肌病變，如梗塞或纖維化，或腎臟疾病，如慢性腎臟病變CKD、惡性腎硬化等。一般來說，該品系大鼠之壽命為18個月，相較於如WKY品系大鼠(Wistar Kyoto rat)係少約6個月。

所謂「有效量」乙詞係指欲產生所求特定效果所需化合物或活性成份之量，得以其在組合物中所佔重量百分比表示。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，該有效量會因為欲引起特定效果之投予方式而有所不同。一般來說，活性成分或化合物於組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳者係為約30%至約100%。

所謂「醫藥組合物」或「組合物」乙詞係包含一有效量之欲產生特定效果之所需化合物或活性成份，以及至少一藥學上能接受之載體。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，醫藥組合物之型態得隨著欲引起特定效果之投予方式有所不同，如錠劑、粉劑、針劑等，並且，該載體亦隨著醫藥組合物之型態而得為固態、半固態或液態。舉例來說，載體包含，但不限於，明膠、乳化劑、烴類混合物、水、甘油、生理食鹽水、緩衝生理鹽水、羊毛脂、石蠟、蜂蠟、二甲基硅油、乙醇。

為能進一步說明本發明，以下將茲舉本發明之實例並配合圖表做詳細說明如后，而以下實例中之動物試驗本項動物試驗係皆通過中興大學試驗動物管理委員會之審查。

實例一：製備克弗爾乳發酵產物

取一定量之動物乳作為一原料乳，經低溫滅菌後，並以一定量之克弗爾菌元(kefir grain)於20℃~40℃下進行發酵反應至少20小時，而後濾去克弗爾菌元，產製出一克弗爾發酵乳。舉例來說，所使用克弗爾菌元之濃度為2%，發酵溫度為20℃，發酵時間為20小時。

將不同批次之該克弗爾發酵乳以及該原料乳分別以高效能液相層析儀(HPLC)進行分離，其中，檢測波長為215nm，分離管柱為SEC管柱(TSK-GEL G2000SWxl,300mm X 7.8mm ID,Tosoh Bioscience股份有限公司)，沖提液為100mM磷酸鹽緩衝液、1M氯化鈉以及1mM乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)，酸鹼值6.5，流速為0.5ml/min，結果如第一圖至第九圖所示，其中，各批次之該克弗爾發酵乳之高效能液相層析圖係分別如第一圖至第八圖所示，該原料乳之高效能液相層析圖係如第九圖所示。

另取一定量之蛋白質標準品以高效能液相層析儀(HPLC)進行分離，其中，分離條件係相同於用以分離該克弗爾發酵乳者。該蛋白質標準品之高效能液相層析圖係如第十圖所示，其中，由第十圖結果可知分子大小為2kD及14kD之滯留時間(retention time)，進而藉由內標法算出分子大小為3kD之滯留時間。

依據第一圖至第八圖分別與第九圖比對之結果，可知第一圖至第八圖中之標號1至7所示之波鋒係為該原料乳中所未含有之胜肽群，此即為本發明所揭克弗爾乳發酵產物之組成份。由上可知，本發明所揭克弗爾乳發酵產物係包含有如第一圖至第八圖中任一圖內標號1至7所示自克弗 爾發酵乳所分離之胜肽群，並且依據上述分離條件，各該胜肽之波峰係出現於滯留時間20~40分鐘之間。此外，由於本發明所揭克弗爾乳發酵產物係分別存在於不同批次之發酵乳中，顯示本發明係能穩定地生產本發明所揭克弗爾乳發酵產物。

更進一步來說，各圖中標號1至7之波峰滯留時間如下表一所示。

再者，將第一圖至第八圖中之任一圖與第十圖相比對，可知第一圖至第八圖中任一圖內標號1至7所示胜肽群中之各該胜肽分子量係分別小於3kD，因此可知，本發明所揭克弗爾乳發酵產物係包含有自克弗爾發酵乳中所得之至少一分子量小於3kD之胜肽。

將含有該克弗爾乳發酵產物之克弗爾發酵乳以冷凍乾燥機(美國VirTis公司)乾製成粉末狀，以供後續實例使用。

實例二：動物試驗之分組

(一)材料

WKY品系大鼠：品系為Wistar kyoto(WKY/NcrlNarl，下稱 WKY品系大鼠)，經由國家衛生研究院試驗動物中心所預留之50週齡以上之大鼠，飼養於中興大學生命科學系二館動物房大鼠室，室內為自動化控制12小時光照與12小時黑暗之規律性交錯晝夜，溫度控制於22-26℃，濕度控制於50-60%。隨時給予飲水和飼料(德國Altromin試驗用大鼠飼料# 1324)。

自發性易中風型高血壓大鼠(stroke prone spontaneously hypertensive rat；下稱SHRSP品系大鼠)：品系為SHRSP/Ngsk，由日本京都大學醫學院所進口，經由自行繁殖由F1至目前F5世代。飼養於中興大學生命科學系二館動物房大鼠室，為單一品系飼養之獨立空間，室內為自動化控制12小時光照與12小時黑暗之規律性交錯晝夜。此外，除依循國立衛生研究院(National Institutes of Health)之要求(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)，由於此品系之特殊體質與對環境要求較嚴格，其溫度控制維持不得低於22℃，濕度晴天不得高於60%、雨天不得高於40%。隨時給予飲水和飼料(德國Altromin試驗用大鼠飼料# 1324)。懷孕哺乳期之母鼠飼養需更換飼料為國家動物中心特殊配方飼料(Rodent lab auto diet # 5L65)。

(二)分組

將不同品系大鼠進行分組，並且分別以不同條件加以飼養30天，其中：

第一組：50~60週齡之WKY品系大鼠，作為正常對照組。

第二組：55~55週齡之SHRSP品系大鼠，作為未處理對照組。

第三組：55~55週齡之SHRSP品系大鼠，投予與後續組 別中之克弗爾乳發酵產物及三胜肽產品(Trade^®)相當鈉含量之1%鹽水，其中，氯化鈉之劑量為每天每公斤0.178毫克，作為中風模式大鼠。

第四組：55~55週齡之SHRSP品系大鼠，投予1%鹽水以及本發明所揭克弗爾乳發酵產物，而克弗爾乳發酵產物之劑量為每天每公斤140毫克，氯化鈉之劑量如第三組。

第五組：55~55週齡之SHRSP品系大鼠，投予1%鹽水以及日本可爾必思公司所生產之三胜肽產品，而三胜肽產品之劑量為每天每公斤140毫克，氯化鈉之劑量如第三組。

實例三：分析具中風現象之SHRSP品系大鼠

(一)材料

老年(50~60週齡)之WKY品系大鼠，年經(14週齡)之正常SHRSP品系大鼠、中年(36週齡)之正常SHRSP品系大鼠及老年(51、58、65週齡)之老年具中風現象之SHRSP品系大鼠。

(二)步態分析

利用CatWalk步態系統(Noldus,CatWalkTM XT)分析具有中風現象之SHRSP品系大鼠及正常SHRSP品系大鼠，結果如第十一圖所示，其中，分析係使用(Noldus,CatWalkTM XT 9.1及10.0)兩種版本交叉分析，並輸出至Excel檔進行後續所需數值之計算及作圖。

由第十一圖A之結果顯示，正常SHRSP品系大鼠之腳掌著地於玻璃上之影像非常清楚且完整，並且，將其時間軸(timing view)配合站立期(stance)與擺檔期(swing)參數之數值進行分析，由數值得知正常SHRSP品系大鼠之四隻腳掌長度及間隔具相當一致性。請參第十一圖 B，具中風現象之SHRSP品系雄性大鼠之腳掌呈像雖然略為完整，但走路卻無法直線行走，會有停頓及偏斜之狀況。另觀第十一圖C，具中風現象之SHRSP品系雌性大鼠之腳掌幾乎無法完整打印在玻璃板上，並且，於時間軸數值明顯顯示，其僅靠著單一左半邊前腳在支撐整個身體行動。

(三)腎上腺病理切片及腸繫膜外觀

將具有中風現象之SHRSP品系之雄性大鼠及雌性大鼠分別犧牲後，分別觀察其腎上腺組織經H & E染色之組織切片以及其腸繫膜，結果如第十二圖及第十三圖所示。由上述結果可知，不論性別為何，具有中風現象之SHRSP品系大鼠腎上腺幾乎出現血栓及大量出血之狀況，導致腎上腺血管堵塞，甚而腎臟衰竭，並且，具有中風現象之SHRSP品系大鼠之腸繫膜皆有血管堵塞情形發生。

(四)腦部磁振造影及組織病理分析

以小動物磁振造影儀ClinScan 7T-MRI(Bruker BioSpin GmbH,Ettlingen,Germany)對於不同週齡之SHRSP品系大鼠進行照射，結果如第十四圖所示，其中，進行T1影像及T2影像之參數如下表二所示。

由第十四圖A~D之結果可知，27週齡之年輕SHRSP品系大鼠於腦部T2照射之結果並無明顯症狀出現，但於圖中*所指之紋狀體部分已經開始出現些許變化，並且，於其大腦皮層之處亦得觀察出些許但不明顯 之變化；而由第十四圖之E~H之結果顯示，58週齡之老年SHRSP品系大鼠腦部側皮層部已出現小小白點，並且，其海馬迴尾端之海馬傘(fi)、側腦室(LV)接近胼胝體(cc)之部分開始出現病變，以及越接近齒狀回(DG)處出現些許表示血液流過之白色部分，及大腦輕微萎縮之情況。

將具中風現象之SHRSP品系大鼠予以犧牲，取出腦部並且進行切片，而於切片過程中發現有大量液體流出，出現明顯空腔，由於整顆腦部都充斥著液體，因此具中風現象之SHRSP品系大鼠腦部較為腫大，具有明顯水腫之情形。

該大鼠腦部之磁振造影及H&E組織染色切片結果如第十五圖至第十七圖所示。由第十五圖之結果顯示，具有中風現象之SHRSP品系大鼠左腦皮質部出現出血情況，並且具有紅血球滯留血管之情形。於T2影像中，由於具有中風現象之SHRSP品系大鼠側腦室室區域(LV)具有明顯大片亮起來之情況，因此，透過第十六圖A之T1造影之結果可知，造成其側腦室室區域量起來之原因非血流經過。並且，如第十六圖B及C所示，藉由掃描與水分子擴散速率相關之DKI值與物質磁化率相關之SWI值，顯示水分大量累積於該大鼠側腦室室區域，俾使於T2影像下觀察到大腦與腦殼間空腔部擴大，具有嚴重腦組織萎縮之情況，整個顆腦皮質部於照攝當下皆處於較白之情況。另由第十七圖可知，該大鼠除具有腦水腫症狀外，上有腦部小血管梗塞，皮質部細胞大量死亡且出現大片海綿狀區域等病徵。

(五)腎臟磁振造影及組織病理分析

將老年之WKY品系大鼠、年輕之正常SHRSP品系大鼠、中年之正常SHRSP品系大鼠，以及老年且具中風現象之SHRSP品系大鼠分別 於T1打入顯影劑進行腎臟磁振造影，結果如第十八圖所示，其中，進行T1影像之參數如下表三所示。

由第十八圖之結果顯示，由於WKY品系大鼠之腎臟為正常，於T1打入顯影劑後，血液能夠流通過其腎臟，因此於T1影像下可觀察到其腎臟皮質部呈現明亮。而由於年輕及中年SHRSP品系大鼠之腎臟分別處於較為健康之狀態，因此顯影劑打入後仍能隨著血液流通至腎臟皮質部，故於T1影像下，年輕及中年SHRSP品系大鼠之腎臟仍能呈現較為明亮之影像。惟，由於老年且具中風現象之SHRSP品系大鼠患有慢性腎臟病變，造成嚴重腎臟損傷，因此，顯影劑進入血流後無法完整大量地通過腎臟，導致其腎臟之T1影像呈現全黑。

更進一步地，將上開各該大鼠犧牲後，分別取其腎臟進行H&E染色並且進行病理分析，結果如第十九圖所示。由第十九圖A及C之結果可知，WKY品系大鼠之腎臟完整且病理切片結果可看到在50倍放大下其腎臟要比中風SHRSP大鼠來得好，其400倍放大下腎小球完整飽滿，反觀年老且具中風現象之SHRSP品系大鼠，於50倍放大倍率下觀察，其腎臟具有大量發炎細胞之浸潤，腎動脈梗塞及硬化、大量透明圓柱體(hyaline cast)出現，腎小球玻璃狀樣空泡化及近、遠曲小管萎縮，腎盂部有大量尿液滯留等病徵。

實例四：大鼠之生理分析

(一)材料

實例二中之第一至第四組大鼠。

(二)體重變化

每週紀錄各該組大鼠之體重，連續四週，結果如第二十圖所示。相較於第二組大鼠，第三組大鼠之體重於第二週開始已有下降之趨勢，並且於第三週及第四週時，第三組大鼠之體重以較其他四組皆顯著下降(p<0.001)，由此可知，投予本發明所揭克弗爾乳發酵產物係不會使大鼠因為攝取鹽水而干擾鈉離子、鉀離子引起生理功能喪失，造成體重下降之情形。

(三)代謝變化

收集各該組大鼠飼養第0天及第30天之24小時尿液，並以生化試紙紙測試初期腎臟之變化，並利用生化儀測試其尿蛋白、尿肌肝及尿中離子的排泄情況，以及檢測各該組大鼠體內之離子排泄率，結果分別如表四及表五所示。

由表四之結果可知，第四組大鼠中之尿酮體(Ketone)以及尿素氮(Nitrate)初期數值分別有異常，但是經過連續四週餵食本發明所揭克弗爾乳發酵產物後，其尿酮體呈現正常之陰性反應，並且尿素氮降低至正常值內。而第三組大鼠尿液中之尿素氮卻有上升之現象。另由表五之結果可知，第三組大鼠之鈉、鉀、氯等離子之排泄率皆高於其他組別，並且，其尿蛋白肌肝比值(UPC)不僅明顯高於其他組別且超出正常範圍，顯示第三組大鼠腎臟之尿蛋白比例極高，具有嚴重腎損傷之症狀。

由於尿素氮會經腎臟絲球體過濾後排泄到尿中，倘若腎臟排泄機能變差，血液中尿素氮濃度則會增加，因此，由表四及表五之結果顯示本發明所揭克弗爾乳發酵產物係能有效改善腎臟排泄機能並且避免腎臟損傷之情形發生。

(四)血液生化值

取各該組大鼠之血液，分別檢測其內與肌肉心腦血管相關之肌氨酸激酶(CK)、與腎臟功能相關之血中尿素氮(BUN)和血中肌酸酐(CRE)以及因腎臟代謝或荷爾蒙異常而變化之金屬離子，如鈣、鎂，檢 測結果係如表六、第二十一圖及第二十二圖所示。

由表六及第二十一圖之結果顯示，第三組大鼠之肌氨酸激酶顯著高於第二組及第四組大鼠。再者，由表六及第二十二圖之結果顯示，第三組大鼠血液中鈣離子明顯流失(p<0.05)，而第四組大鼠之血液中鈣離子係顯著回升(p<0.05或p<0.001)而具有較佳之血鈣含量。各該組大鼠血液中鎂離子之含量變化係如同各該組大鼠之鈣離子含量變化。

實例五：大鼠之步態分析

(一)材料

實例二中之第二至四組大鼠。

(二)步態影像分析

藉由CatWalk步態分析系統(Noldus,CatWalkTM XT)分別測量第二至第四組大鼠於試驗第0天及第28天之步態，結果如第二十三圖 所示，其中，圖中分別以不同顏色表示大鼠之前後四腳之爪子循環步態，藍色為右側前腳(RF)，紅色為右側後腳(RH)，黃色為左側前腳(LF)及綠色為左側後腳(LH)。

由第二十三圖之結果可知，第二組小鼠走路之規律性、距離及協調性都非常完整。由第三組大鼠之腳印明顯看出其四隻腳步打印都非常模糊且不明顯，尤其是其右側前腳以及後面兩隻腳，而根據臨床中風判別之腦部與肢體協調為相對的標準研判，第三組大鼠之左大腦可能出現受損之情形，導致其右半邊腳步較輕。第四組大鼠之步態係分別近似於第二組之步態，即打印明顯且步輻正常。

(三)CatWalk步態分析系統之數據分析

由過去文獻可知與中風最直接相關之步態打印分析數值為最大接觸面積(Max Contact Area)，其示意圖如第二十四圖所示。進一步地將與中風相關之步態分析數據整理如表七所示，再統計分析出具有差異之結果，如第二十五圖所示，其中，上述分析結果係使用(Noldus,CatWalkTM XT 9.1及10.0)兩種版本交叉分析，並輸出至Excel檔進行後續所需數值之計算及作圖。

首先，由第二十五圖之結果可知，由於體重降低之原因，第三組之最大接觸面積係明顯低於其它組別，並且可知其右側前腳及兩隻後腳之數直接顯著降低，符合上開第二十二圖之結果。

再者，基於最大接觸時間比數值(Max Contact At)常被用於觀測脊髓損傷，其數值會和最大接觸面積相對照為幾乎為相反值，並且其數值幾乎都會增加，因此，由表五及第二十五圖A至B之結果顯示，第三組大鼠之最大接觸面積與最大接觸時間比均較第二組及第四組大鼠之中風傾向與脊髓損傷指數顯著提高(p<0.01)。

藉由如完整打印在玻璃上的完整表面面積之數值(腳掌面積)要大於最大接觸面積(PrintArea≧Max Contact Area)，以及，前爪之間的平均寬度(BOS-FrontPaws)與後爪之間的平均寬度(BOS-HindPaws)彼此間為相反等標準，係可用以判別是前腳或後腳因為疼痛所造成腳走路有易摔倒之情況出現。將之與表五及第二十五圖C至E之結果比對可知，第三組大鼠之前腳爪平均寬度要較其他組別來的低，顯示第三組大鼠之前腳可能因為其半邊神經傳導方面出現問題導致腳掌無法完整踩踏於玻璃上。

藉由上述結果可知，僅投予1%鹽水之SHRSP品系大鼠具有 步態不穩之情形，相似於實例二中具有中風現象之SHRSP品系大鼠，表示投予1%鹽水確實能夠誘導之SHRSP品系大鼠具有中風現象。而藉由投予有效量之本發明所揭克弗爾乳發酵產物至罹患中風或具其相關病徵之個體，係能改善或治療個體腦中風或其相關病症，並且能有效減緩其步態不穩之狀況。據此，本發明所揭克弗爾乳發酵產物係具有治療與腦血管病變或損傷相關病症之功效。

實例六：大鼠臟器外觀分析

(一)材料

實例二中之第一至四組大鼠。

(二)臟器外觀

將完成試驗之各該組大鼠予以犧牲後，分別取其腎臟、腎上腺及腦。先觀察各該組大鼠之腎臟外觀，如第二十六圖所示，再分別算出各該臟器佔其最終體重之比率，結果如下表八所示，其中，*表示該組與第二組間具有顯著差異(p<0.05)。

由第二十六圖之結果可知，第一組大鼠之腎臟表面平滑且飽滿，而第二組大鼠之腎臟外觀具有些許凹凸表面(圖中白色箭頭處)，但大致來說為完整。第三組大鼠之腎臟外觀相較於第二組明顯凹陷且不平整(圖 中白色箭頭處)，並且有萎縮之情形發生。第四組大鼠之腎臟外觀仍保持良好之狀態。另由表八之結果可知，第三組大鼠之腦部組織重量係顯著高於第四組大鼠，並且其腎臟重量係高於第四組。

實例七：大鼠腎臟分析

(一)材料

實例二中之第一至四組大鼠。

(二)腎臟組織病理分析之評分

依據本發明所屬技術領域且具通常知識者所熟知之技術將各該組大鼠之腎臟進行組織切片，並將該切片送交至中興大學獸醫系進行病理積分評估，藉由組織病理學檢查得知各該組大鼠腎臟是否產生病變，結果如表九所示。

由表九之結果可知，第三組大鼠之於腎皮質及髓質部入 球小動脈及其疾病之發生率係顯著高於其他組別(p<0.05)，而腎小管發生透明圓柱體之機會係差距不大。雖然各該組大鼠之腎臟皆屬於慢性腎臟病變，惟，第三組大鼠係具有較為嚴重之慢性腎臟病變，並且，其腎小動脈顯著具有中度肥大及間質樣變性(p<0.05)。

(三)腎臟病理切片分析

將各該組大鼠犧牲後，分別取其腎臟臟器並進行去皮浸泡於10%之福馬林中，每隔一天更換一次福馬林至少浸泡2~3天，送至中興大學獸醫病理所做成蠟塊與H&E染色切片，以觀察於各該組大鼠腎臟臟器中之組織病變與細胞分布情況，並且分別針對各該切片之腎小球(glomerulus)、腎小管(tubular atrophy)與腎動脈管(interlobular arteries)三部分進行拍攝，結果如第二十七圖所示。

另以特殊化學梅生三色(Masson's trichrome)染色去分析各該組大鼠腎臟之纖維化程度，以及利用Sirius red染色觀察各該組大鼠之腎小球膠原蛋白的醣類累積情況，結果分別如第二十八圖及第二十九圖所示。又以免疫化學染色單核細胞趨化蛋白(MCP-1)觀察各該組大鼠腎臟中單核細胞(monocytes)與巨噬細胞(macrophages)之累積情況，結果如第三十圖所示。

由第二十七圖之結果可知，第一組大鼠腎臟周邊近曲與遠曲小管排列方式完整且整齊，入球小動脈部完整且無肥大情況，並且於腎小球之部分，其絲球體與包氏囊間是緻密的，因此，第一組大鼠整體腎臟是完整健康。第二組大鼠因具有慢性腎臟疾病，導致其具有輕微結節性腎小球硬化、入球小動脈病徵、間質纖維化、腎小管萎縮、小動脈肥大與 透明圓柱體(hyaline casts)等病徵出現。第三組大鼠之腎臟腎小球周圍出現炎症細胞大量聚集及間質纖維化，以及絲球體萎縮而造成包氏囊空腔部擴大，入球小動脈纖維樣壞死，並且，因為其排尿功能變差，導致透明圓柱體大量出現於近遠曲小管周邊及腎盂部，皮質部受損情況要較髓質部高，大部份都集中於血管周邊。由於第四組大鼠慢性腎臟病變之情形較為和緩，因此，於第四組大鼠之腎小球呈現完整之狀態，並且血管之厚度增厚情況降低，幾乎沒有出現透明圓柱體。

由第二十八圖之結果可知，相較於第一組大鼠，第二組及第三組大鼠皆累積大量膠原蛋白纖維(圖中藍色部份)，並且由倍率100之視野下進行比較發現，第二組及第三組大鼠之血管結締組織因具有受損情形，故呈現藍色，而其中第三組大鼠腎臟組織纖維化之情形又較第二組大鼠嚴重。而由第二十九圖之結果可知，第三組大鼠腎小球部周邊膠原蛋白纖維之累積(圖中紅色部份)係明顯高於其他組別，並且，第三組大鼠腎小球之結構非常不完整，具有破損，絲球體部萎縮。相較於第二組或第三組大鼠，第四組大鼠之膠原蛋白纖維累積量係明顯減少，並且其腎小球飽滿周邊近遠曲小管結構完整排列整齊。

由於單核細胞趨化蛋白為引起炎症細胞聚集之主要破壞因子，能夠於發炎部位活化巨噬細胞與單核球，並促使平滑肌細胞、腎小管上皮細胞等發炎細胞之聚集，進一步促使發炎反應與腎間質纖維化，因此由第三十圖之結果可知，第三組大鼠內皮細胞中累積大量單核細胞趨化蛋白，且其小血管中亦有單核細胞趨化蛋白而呈現深咖啡色，顯示第三組大鼠腎臟發炎及受損情形嚴重。而相較於第三組大鼠，第四組大鼠內皮細 胞中單核細胞趨化蛋白之累積情形明顯降低，而整體顏色呈現近似於第一組大鼠，顯示第四組大鼠腎臟受損情形較為輕微。

(四)腎臟動脈病理分析

藉由Sirius red染色觀察各該組大鼠腎動脈，結果如第三十一圖所示，顯示第二組及第三組大鼠之腎動脈外管壁厚度與內管腔之增生情況明顯且較為肥大，外層部亦出現粥狀玻璃樣(media)結締組織疏鬆樣，並且，其膠原蛋白纖維因為血管內皮增生，導致累積情況明顯增加，管壁腔亦較厚。而第四組大鼠內管腔空腔部較大，近似於第一組大鼠之動脈樣態，並且，其結締組織彈力蛋白纖維血管壁扎實，無鬆散所造成不規則之情形。

綜合上述結果可知，SHRSP品系大鼠經1%鹽水誘導後，其腎臟之表現係極度相似於同實例三中具中風現象之SHRSP品系大鼠，因此可知，投予高鹽至SHRSP品系大鼠確實能夠產製出具中風且腎臟損傷之動物模式。而藉由投予本發明所揭克弗爾乳發酵產物至一具有腎臟病變或損傷之個體，能夠有效降低其腎臟組織纖維化及膠原蛋白纖維累積之功能，並且能夠抑制腎臟發炎反應之發生。因此，本發明所揭克弗爾乳發酵產物係具有有效治療或改善與腎血管病變相關病症或腎臟損傷之功效，而能作為相關醫藥組合物之有效成份。

實例八：大鼠腦部分析

(一)材料

實例二中之第一至五組大鼠。

(二)腦部病理切片分析

取各該組大鼠於試驗完成後犧牲，分別取其腦部組織，用以觀察其外觀，並且進行H&E組織切片染色，結果如第三十二圖所示。

由第三十二圖之結果可知，第三組大鼠腦部組織外觀較為重，而由其病理切片發現側腦室(Lateral ventricle)、脈絡叢(Choroid plexus)部位有積水的情況發生，並且，海馬迴區域接近CA3區域的地方，細胞聚集較稀疏。而雖然第四組及第五組大鼠之腦部組織分別係未有嚴重積水之現象，但是，第五組大鼠之神經細胞聚集於CA3區域，其稀鬆程度係類似於第三組大鼠，並且有較少細胞存活現象出現，反觀第四組大鼠於CA3區之神經細胞之聚集密度係以回覆為正常值。

由此可知，投予1%鹽水至SHRSP品系大鼠後，其腦部切片與積水情形係類似於實例三中具中風現象之SHRSP品系大鼠，因此，藉由投予1%鹽水確實能將SHRSP品系大鼠誘導為中風模式大鼠。而投予市售抗高血壓之三胜肽產品(Trade^®)係無法改善具中風現象之大鼠腦部組織，而不具有治療或減緩腦部組織受損或其相關病症之功效。相較與此，投予有效量之本發明所揭克弗爾乳發酵產物至具中風現象之個體後，係能改善或治療其腦部組織病變或損傷之情形。據此，本發明所揭克弗爾乳發酵產物係具有治療或改善腦部損傷、病變或其相關病徵之功效，而能作為相關醫藥組合物之有效成份。

實例九：大鼠死亡率評估

觀察上述實例二中各組大鼠自試驗開始至結束間之死亡變化，統計出於犧牲前之死亡率評估，結果如第三十三圖所示，顯示第三組之死亡率係高達70%，而第四組大鼠之死亡率相較於第三組不僅明顯下 降，並且與第二組大鼠之死亡率相同。

由此可推知，由於第三組大鼠具有代謝性缺損、腎臟損傷及腦中風等病症，當以1%鹽水誘導伴隨高血壓之狀態下，可能會導致第三組大鼠多重器官衰竭，故其死亡率極高。不過，由於本發明所揭克弗爾乳發酵產物係具有改善或減緩個體腎臟損傷、腦中風及代謝性缺損等病症之能力，因此，藉由藉由投予本發明所揭克弗爾乳發酵產物至罹患上述病症之個體，係能夠有降降低個體之死亡率與正常個體一樣，並且，其下降幅度係優於投予市售三胜肽產品(Trade^®)。

綜合上述實例可證實，本發明所揭克弗爾乳發酵產物係能夠降低肌氨酸激酶數值、降低纖維化及膠原蛋白纖維累積量、抑制發炎反應，而能有效地維持個體步態行為、保護腎臟免於慢性腎臟病變或腎臟衰竭、降低中風或腦部病變之發生率及提昇個體存活率。據此，藉由投予有效量之本發明所揭克弗爾乳發酵產物至一個體，係能達到治療或減緩個體發生與血管損傷或病變相關疾病之功效。

以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。

<110> 大葉大學

<120> 用以治療與血管損傷或病變相關疾病之組合物

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 克弗爾乳發酵產物

<300>

<310> TW096135346

<311> 1997-09-21

<312> 2011-06-11

<400> 1

Claims (7)

1. 一種將克弗爾乳發酵產物用於製造治療血管損傷或病變相關疾病之組合物之用途，其中，該克弗爾乳發酵產物係由一動物乳以克弗爾菌元所發酵而得者。
2. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，該血管損傷或病變相關疾病係發生於由腦部及腎臟所組成之群。
3. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，該血管損傷或栓塞相關疾病選自由腦中風、腦血管病變、腦水腫、腦部萎縮、腦部病變、腎動脈硬化症、腎小球受損、腎小球硬化、腎間質纖維化、腎衰竭及其他腎臟病變所組成之群。
4. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，該克弗爾乳發酵產物係包含有自一經克弗爾菌元發酵之動物乳所得之至少一胜肽，而經高效率液相層析儀以一預定分析條件分析出該胜肽之分子量小於3kD，並且於高效率液相層析圖中滯留時間為20~40分鐘間具有波峰。
5. 依據申請專利範圍第1所述用途，其中，該克弗爾乳發酵產物係包含有於該高效率液相層析圖中標號1至7所示之胜肽群，而該高效率液相層析圖係選自於由第一圖至第八圖所組成之群。
6. 依據申請專利範圍第4或5所述用途，其中，該分析條件係如下：檢測波長為215nm，分離管柱為SEC管柱，沖提液為100mM磷酸鹽緩衝液、1M氯化鈉以及1mM乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)，酸鹼值6.5，流速 為0.5ml/min。
7. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，該克弗爾乳發酵產物係包含胺基酸序列編碼為SEQ ID No.1之多胜肽。