TW201606078A - 抑制ｌｅｃｔ２基因表現之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於靶向LECT2基因之雙股核糖核酸(dsRNA)組合物，及使用該等dsRNA組合物改變(例如抑制)LECT2表現之方法。

Description

抑制LECT2基因表現之組合物及方法 相關申請案之交叉引用
本申請案主張2013年10月2日申請之美國臨時申請案第61/885,693號及2014年8月11日申請之美國臨時申請案第62/035,819號之權益，該等臨時申請案之內容各以全文引用的方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且其全部內容以引用的方式併入本文中。該ASCII複本於2014年9月29日創建，命名為A2038-7200WO_SL.txt且為294,414位元組大小。
本發明係關於LECT2基因表現之特異性抑制。
澱粉樣變性為特徵為不溶性纖維蛋白質聚集物(稱為澱粉樣蛋白)在器官或組織中沈積之疾病群。澱粉樣蛋白可由突變或野生型蛋白質形成。一種用於澱粉樣蛋白疾病之命名系統使用形成澱粉樣蛋白沈積之蛋白質的縮寫，冠以字母「A」。因此，舉例而言，ALECT2為涉及由源自趨化性因子-2之白細胞形成之澱粉樣蛋白沈積物的澱粉樣變性之縮寫(ALECT2)。
LECT2澱粉樣變性(ALECT2)為最近發現之澱粉樣變性類型中之一者。已在患有腎或肝澱粉樣變性之個體中觀測到LECT2澱粉樣變 性。此澱粉樣變性形式可與腎病症候群或肝臟受累(例如肝炎，例如慢性肝炎)一起存在。其可尤其在墨西哥裔美國人及/或為編碼成熟LECT2蛋白質中位置40處(或未經處理蛋白質之位置58處)之纈胺酸的G對偶基因同型的個體中盛行。LECT2澱粉樣變性之治療有限，且需要新治療方法。
本發明描述用於調節LECT2基因表現之方法及iRNA組合物。在某些實施例中，使用LECT2特異性iRNA降低或抑制LECT2基因之表現。此類抑制可適用於治療與LECT2表現有關之病症，諸如澱粉樣變性，例如LECT2澱粉樣變性(ALECT2)。
因此，本文描述諸如在細胞或個體(例如哺乳動物，諸如人類個體)中實現RNA誘導沉默複合物(RISC)介導之LECT2基因之RNA轉錄物裂解之組合物及方法。亦描述用於治療與LECT2基因表現有關之病症，諸如LECT2澱粉樣變性之組合物及方法。
在一些實施例中，LECT2澱粉樣變性為腎澱粉樣變性。
在一些實施例中，LECT2澱粉樣變性涉及腎臟中之澱粉樣蛋白沈積。
在一些實施例中，LECT2澱粉樣變性與腎病(例如腎病症候群)有關。在一些實施例中，澱粉樣變性與蛋白尿有關。在一些實施例中，蛋白尿不存在。
在一些實施例中，LECT2澱粉樣變性為肝澱粉樣變性。在一些實施例中，LECT2澱粉樣變性涉及肝臟中之澱粉樣蛋白沈積。
在一些實施例中，LECT2澱粉樣變性與肝臟中之發炎(例如肝炎，例如慢性肝炎)有關。
在一些實施例中，個體為墨西哥後裔(例如墨西哥裔美國人)。
在實施例中，個體攜帶LECT2基因之G對偶基因，其編碼成熟蛋 白質中位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之纈胺酸。在實施例中，個體為G對偶基因之同型(G/G基因型)。在實施例中，個體中表現之LECT2蛋白質在成熟蛋白質中位置40處(或未經處理蛋白質中之胺基酸58處)具有纈胺酸。
在一些實施例中，本文所述之方法有效抑制澱粉樣蛋白沈積(例如藉由防止澱粉樣蛋白沈積或例如藉由減少澱粉樣蛋白沈積之尺寸、數目或程度減少澱粉樣蛋白沈積)或與澱粉樣蛋白沈積有關之症狀。
如本文所用，術語「iRNA」、「RNAi」、「iRNA劑」、「RNAi劑」或「iRNA分子」係指如本文所定義之彼術語的含有RNA之試劑，且其例如經RNA誘導沉默複合物(RISC)路徑介導RNA轉錄物之靶向裂解。在一個實施例中，如本文所述之iRNA抑制細胞或哺乳動物中之LECT2表現。
本文特性化之組合物中所包括之iRNA(例如dsRNA)包括RNA股(反義股)，該RNA股具有長度為30個核苷酸或小於30個核苷酸，一般19-24個核苷酸且實質上與LECT2基因(例如小鼠或人類LECT2基因)之mRNA轉錄物之至少部分互補的區(本文中亦稱為「LECT2特異性iRNA」。在實施例中，LECT2 mRNA轉錄物為人類LECT2 mRNA轉錄物，例如SEQ ID NO：1。在實施例中，LECT2 mRNA轉錄物在SEQ ID NO：1之核苷酸位置373處具有A至G取代。在實施例中，mRNA轉錄物編碼成熟LECT2蛋白質中位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之纈胺酸。在實施例中，mRNA轉錄物編碼成熟LECT2蛋白質中位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之異白胺酸。
在實施例中，本文所述之iRNA(例如dsRNA)包含具有與人類LECT2 mRNA之區實質上互補之區的反義股。在實施例中，人類LECT2 mRNA具有序列NM_002302.2(SEQ ID NO：1)。在實施例中，人類LECT2 mRNA轉錄物在SEQ ID NO：1之核苷酸位置373處具有A至 G取代。
在其他實施例中，iRNA涵蓋具有RNA股(反義股)之dsRNA，該RNA股具有與LECT2 mRNA之一部分實質上互補的區。在一個實施例中，iRNA涵蓋具有RNA股(反義股)之dsRNA，該RNA股具有與LECT2 mRNA(例如人類LECT2 mRNA，例如NM_002302.2(SEQ ID NO：1)中提供或在SEQ ID NO：1之核苷酸位置373處具有A至G取代之人類LECT2 mRNA)之一部分實質上互補的區。
在一個實施例中，用於抑制LECT2基因表現之iRNA包括至少兩個彼此互補之序列。iRNA包括具有第一序列之有義股及具有第二序列之反義股。反義股包括與編碼LECT2轉錄物之mRNA之至少部分實質上互補之核苷酸序列，且互補區長度為30個核苷酸或小於30個核苷酸，及至少15個核苷酸。一般而言，iRNA長度為19至24個核苷酸。
在一些實施例中，iRNA長度為19-21個核苷酸。在一些實施例中，iRNA長度為19-21個核苷酸且在脂質調配物中，例如脂質奈米粒子(LNP)調配物(例如LNP11調配物)中。在一個實施例中，靶向LECT2之iRNA在穩定核酸脂質粒子(SNALP)中調配。
在一些實施例中，iRNA長度為21-23個核苷酸。在一些實施例中，iRNA長度為21-23個核苷酸且為結合物形式，例如與一或多個如本文所述之GalNAc衍生物結合。
在一些實施例中，iRNA長度為約15至約25個核苷酸，且在其他實施例中，iRNA長度為約25至約30個核苷酸。當藉由此項技術中已知或如本文所述之方法分析時，靶向LECT2之iRNA當與表現LECT2之細胞接觸時抑制LECT2基因表現(例如至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%或至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%)。
在一個實施例中，本文特性化之iRNA(例如dsRNA)包含選自由表 2-3、5-6及9-10之有義序列組成之群的dsRNA之第一序列及選自由表2-3、5-6及9-10之相應反義序列組成之群的第二序列或由其組成。
在實施例中，本文特性化之iRNA(例如dsRNA)包含選自表2-3、5-6及9-10中提供之序列的有義序列及/或反義序列或由其組成。
本文特性化之iRNA分子可包括天然存在之核苷酸或可包括至少一個經修飾核苷酸，包括(但不限於)2'-O-甲基修飾之核苷酸、具有5'-硫代磷酸酯基之核苷酸及連接至膽固醇基衍生物之末端核苷酸。或者，經修飾核苷酸可選自以下之群：2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核苷酸、非環核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基-修飾之核苷酸、2'-烷基-修飾之核苷酸、(N-嗎啉基)核苷酸、胺基磷酸酯及包含非天然鹼基之核苷酸。此類經修飾序列可基於例如選自由表2-3、5-6及9-10之有義序列組成之群的該iRNA之第一序列，及選自由表2-3個、5-6及9-10之相應反義序列組成之群的第二序列。
在一個實施例中，如本文所述之iRNA靶向野生型LECT2 RNA轉錄物變異體，且在另一實施例中，iRNA靶向突變體轉錄物(例如攜帶對偶基因變異體之LECT2 RNA)。舉例而言，本發明特性化之iRNA可靶向LECT2之多態性變異體，諸如單核苷酸多形現象(SNP)。
在一些實施例中，iRNA(例如dsRNA)靶向(例如減少)編碼成熟LECT2蛋白質中位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之纈胺酸的mRNA。在一些實施例中，iRNA(例如dsRNA)靶向(例如減少)編碼成熟LECT2蛋白質中位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之異白胺酸的mRNA。在另一實施例中，iRNA(例如dsRNA)靶向(例如減少)編碼成熟LECT2蛋白質中位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之纈胺酸的mRNA及編碼成熟LECT2蛋白質中位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之異白胺酸的mRNA兩者。
在另一實施例中，iRNA靶向野生型及突變LECT2轉錄物兩者。 在另一實施例中，iRNA靶向LECT2之特定轉錄物變異體。在另一實施例中，iRNA劑靶向多種轉錄物變異體。
在一個實施例中，本發明特性化之iRNA靶向LECT2 RNA轉錄物之非編碼區，諸如轉錄物之5'或3'未轉譯區。
在一些實施例中，如本文所述之iRNA呈結合物(例如碳水化合物結合物)形式，其可用作如本文所述之靶向部分及/或配位體。在一個實施例中，結合物連接至dsRNA之有義股的3'端。在一些實施例中，結合物經連接子，例如經二價或三價分支鏈連接子連接。
在一些實施例中，結合物包含一或多個N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物。此類結合物在本文中亦稱為GalNAc結合物。在一些實施例中，結合物使RNAi劑(例如dsRNA)靶向特定細胞，例如肝臟細胞，例如肝細胞。GalNAc衍生物可經連接子，例如二價或三價分支鏈連接子連接。在特定實施例中，結合物為
在一些實施例中，RNAi劑經連接子，例如以下示意圖中所示之連接子連接至碳水化合物結合物，其中X為O或S
在一些實施例中，X為O。在一些實施例中，X為S。
在一些實施例中，RNAi劑結合至如表1所定義及下文所示之L96
在一些實施例中，RNAi劑結合至使RNAi(例如dsRNA)靶向所要器官(例如肝臟)或特定細胞類型(例如肝細胞)之配位體。在實施例中，RNAi劑結合至使RNAi劑(例如dsRNA)靶向肝臟之配位體(例如GalNAc配位體，例如L96)。
在一態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其用於抑制LECT2基因於生物體，一般人類個體中之表現。組合物通常包括一或多種本文所述之iRNA及醫藥學上可接受之載劑或傳遞媒劑。在一個實施例中，組合物用於治療與LECT2表現有關之病症，例如澱粉樣變性，例如LECT2澱粉樣變性。
在一個態樣中，本文提供之iRNA為用於抑制LECT2表現之雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含長度為15-30對鹼基之有義股及與SEQ ID NO：1之至少15個連續核苷酸互補的反義股。
在另一態樣中，本文提供之iRNA為包含與反義股互補之有義股 的雙股RNAi(dsRNA)，其中該反義股包含與LECT2 RNA轉錄物互補之區，其中各股均具有約14至約30個核苷酸，其中該雙股RNAi劑由式(III)表示：有義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5'(III)其中：i、j、k及l各自獨立地為0或1；p、p'、q及q'各自獨立地為0-6；Na及Na'各自獨立地表示包含0-25個經修飾或未經修飾之核苷酸或其組合的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；Nb及Nb'各自獨立地表示包含0-10個經修飾或未經修飾之核苷酸或其組合之寡核苷酸序列；np、np'、nq及nq'各自獨立地表示突出端核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾的基元；Nb之修飾不同於Y之修飾且Nb'之修飾不同於Y'之修飾。
在實施例中，有義股結合至至少一個配位體。
在實施例中，i為1；j為1；或i及j皆為1。
在實施例中，k為1；l為1；或k及l皆為1。
在實施例中，XXX與X'X'X'互補，YYY與Y'Y'Y'互補，且ZZZ與Z'Z'Z'互補。
在實施例中，Y'Y'Y'基元出現在反義股距5'端的11、12及13位置處。
在實施例中，Y'為2'-O-甲基。
在實施例中，雙螺旋區長度為15-30對核苷酸。
在實施例中，雙螺旋區長度為17-23對核苷酸。
在實施例中，雙螺旋區長度為19-21對核苷酸。
在實施例中，雙螺旋區長度為21-23對核苷酸。
在實施例中，核苷酸上之修飾係選自由以下組成之群：鎖核酸(LNA)、非環核苷酸、己糖醇或己醣核酸(HNA)、環己烯核酸(CeNA)、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2'-羥基及其任何組合。
在實施例中，核苷酸上之修飾為2'-O-甲基、2'-氟或兩者。
在實施例中，配位體包含碳水化合物。
在實施例中，配位體經連接子連接。
在實施例中，連接子為二價或三價分支鏈連接子。
在實施例中，配位體為
在實施例中，配位體及連接子如式XXIV中所示：
在實施例中，配位體連接至有義股之3'端。
在實施例中，dsRNA具有(例如包含)選自表2-3、5-6及9-10中提 供之序列之群的核苷酸序列(例如有義序列及/或反義序列)。
在另一態樣中，本文提供之iRNA為用於抑制LECT2表現之雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含有義股及反義股，該反義股包含與LECT2 RNA轉錄物互補之區，該反義股包含與表2-3、5-6及9-10中之任一者中所列之反義序列中之一者區別不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
在一些實施例中，dsRNA包含至少一個經修飾核苷酸。
在一些實施例中，經修飾核苷酸中之至少一者係選自由以下組成之群：2'-O-甲基修飾之核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基之核苷酸及連接至膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基之末端核苷酸。
在一些實施例中，經修飾核苷酸係選自由以下組成之群：2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核苷酸、非環核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基-修飾之核苷酸、2'-烷基-修飾之核苷酸、(N-嗎啉基)核苷酸、胺基磷酸酯及包含非天然鹼基之核苷酸。
在一些實施例中，互補區長度為至少17個核苷酸。
在一些實施例中，互補區長度為19至21個核苷酸。
在一些實施例中，互補區長度為19個核苷酸。
在一些實施例中，各股長度不超過30個核苷酸。
在一些實施例中，至少一個股包含至少1個核苷酸的3'突出端。
在一些實施例中，至少一個股包含具有至少2個核苷酸的3'突出端。
在一些實施例中，本文所述之iRNA(例如dsRNA)進一步包含配位體。
在一些實施例中，配位體為GalNAc配位體。
在一些實施例中，配位體使iRNA(例如dsRNA)靶向肝臟(例如肝細胞)。
在一些實施例中，配位體結合至dsRNA之有義股的3'端。
在一些實施例中，互補區由選自表2-3、5-6及9-10中提供之反義序列的反義序列組成。
在實施例中，互補區由選自本文揭示之雙螺旋體的反義序列組成，其中雙螺旋體將LECT2 mRNA或蛋白質表現抑制至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%或90%。
在一些實施例中，dsRNA包含有義股及反義股，該有義股包含選自表2、3、5、6、9或10之有義股序列或由其組成，且該反義股包含選自表2、3、5、6、9或10之反義序列或由其組成。在實施例中，dsRNA包含選自表2-3及5-11中所揭示之彼等雙螺旋體的相應有義序列及反義序列之對或由其組成。在某些實施例中，dsRNA包含選自表8中所揭示之彼等雙螺旋體之相應有義序列及反義序列之對或由其組成。
在一個態樣中，本發明提供含有至少一個本文揭示之iRNA(例如dsRNA)的細胞。細胞通常為哺乳細胞，諸如人類細胞。在實施例中，細胞為肝臟細胞(例如肝細胞)。
在一態樣中，本文提供一種用於抑制LECT2基因表現之醫藥組合物，該組合物包含本文所述之iRNA(例如dsRNA)。
在本文所述之醫藥組合物的實施例中，iRNA(例如dsRNA)在未緩衝溶液中投與。在實施例中，未緩衝的溶液為生理食鹽水或水。
在本文所述之醫藥組合物的實施例中，iRNA(例如dsRNA)與緩衝溶液一起投與。在實施例中，緩衝溶液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽或其任何組合。在實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。
在本文所述之醫藥組合物的實施例中，iRNA(例如dsRNA)靶向肝臟(例如肝細胞)。
在本文所述之醫藥組合物的實施例中，組合物經靜脈內投與。
在本文所述之醫藥組合物的實施例中，組合物經皮下投與。
在實施例中，醫藥組合物包含本文所述之iRNA(例如dsRNA)，其包含使iRNA(例如dsRNA)靶向肝臟細胞(例如肝細胞)之配位體(例如GalNAc配位體)。
在實施例中，醫藥組合物包含本文所述之iRNA(例如dsRNA)，其包含配位體(例如GalNAc配位體)，且醫藥組合物經皮下投與。在實施例中，配位體使iRNA(例如dsRNA)靶向肝臟細胞，例如肝細胞。
在某些實施例中，醫藥組合物(例如本文所述之組合物)包括脂質調配物。在一些實施例中，RNAi劑在LNP調配物中，例如MC3調配物。在一些實施例中，LNP調配物使RNAi劑靶向特定細胞，例如肝臟細胞(例如肝細胞)。在實施例中，脂質調配物為LNP11調配物。在實施例中，組合物經靜脈內投與。
在另一實施例中，醫藥組合物經調配以用於根據本文所述之給藥方案投與，例如不超過每四週一次、不超過每三週一次、不超過每兩週一次或不超過每週一次。在另一實施例中，醫藥組合物之投與可維持一個月或更長，例如1、2、3或6個月，或一年或更長。
在另一實施例中，含有本發明特性化之iRNA(例如靶向LECT2之dsRNA)的組合物與針對與LECT2表現有關之病症(例如LECT2澱粉樣變性)之第二療法結合投與。本文提供之iRNA或包含iRNA之組合物可在第二療法之前、之後或同時投與。在實施例中，iRNA在第二療法之前投與。在實施例中，iRNA在第二療法之後投與。在實施例中，iRNA與第二療法同時投與。
在一些實施例中，第二療法為有效治療病症或病症之症狀的非iRNA治療劑。
在一些實施例中，待藉由本文揭示之組合物或方法治療之病症 為例如藉由腎臟中之澱粉樣蛋白沈積影響腎功能之LECT2澱粉樣變性。在一些此類實施例中，iRNA與支持腎功能之療法(例如透析)結合投與。在實施例中，iRNA與利尿劑、ACE(血管收縮素轉化酶)抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑及/或透析結合投與以例如支持或控制腎功能。
在一些實施例中，待藉由本文揭示之組合物或方法治療之病症為LECT2澱粉樣變性，其涉及肝臟中之澱粉樣蛋白沈積。在一些此類實施例中，iRNA與支持肝功能之療法結合投與。
在一些實施例中，待藉由本文揭示之組合物或方法治療的病症為LECT2澱粉樣變性，且iRNA與移除受澱粉樣變性影響之所有或部分器官(例如割除受澱粉樣變性影響之腎臟或肝臟組織的全部或部分)結合投與。移除視情況與置換全部或部分移除器官結合進行(例如與腎臟或肝臟器官移植結合)。
在一態樣中，本文提供一種抑制細胞中LECT2表現之方法，該方法包含：(a)向細胞中引入本文所述之iRNA(例如dsRNA)及(b)維持步驟(a)之細胞持續足以獲得LECT2基因之mRNA轉錄物分解的時間，藉此抑制該細胞中之LECT2基因表現。
在一態樣中，本文提供一種減少或抑制細胞(例如肝臟細胞，例如肝細胞)中LECT2基因表現之方法。該方法包括使細胞與如本文所述之dsRNA接觸，藉此抑制LECT2基因之表現。如本文所用，「接觸」包括直接接觸細胞，以及間接接觸細胞。舉例而言，當向個體(例如靜脈內或皮下)投與包含RNAi之組合物時，可接觸個體內之細胞(例如肝臟細胞)。
在實施例中，該方法包括(a)向細胞中引入雙股核糖核酸(dsRNA)，其中dsRNA包括至少兩個彼此互補之序列。dsRNA包含具有第一序列之有義股及具有第二 序列之反義股；該反義股具有與編碼LECT2之mRNA之至少一部分實質上互補的互補區，且其中互補區長度為30個或小於30個核苷酸，例如15-30個核苷酸，且一般19-24個核苷酸，且其中dsRNA與表現LECT2之細胞接觸時將LECT2基因表現抑制至少10%，例如至少20%、至少30%、至少40%或40%以上；及(b)維持步驟(a)之細胞持續足以獲得LECT2基因之mRNA轉錄物分解的時間，藉此減少或抑制該細胞中之LECT2基因表現。
在上述抑制細胞中LECT2表現之方法的實施例中，細胞經離體、活體外或活體內處理。在實施例中，細胞為肝細胞。
在實施例中，細胞存在於需要治療、預防及/或處理與LECT2表現相關之病症的個體中。
在實施例中，病症為如本文所述之LECT2澱粉樣變性。
在實施例中，將LECT2表現抑制至少30%。
在實施例中，iRNA(例如dsRNA)具有0.0005-1nM，例如0.001至0.2nM、0.002至0.1nM、0.005至0.075nM或0.01至0.05nM範圍內之IC50。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)具有等於或小於0.02nM，例如0.0005至0.02nM，0.001至0.02nM、0.005至0.02nM或0.01至0.02nM範圍內之IC50。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)之IC50在0.01-1nM範圍內。
在實施例中，細胞(例如肝細胞)為哺乳細胞(例如人類、非人類靈長類或嚙齒動物細胞)。
在一個實施例中，個體為患有LECT2澱粉樣變性之哺乳動物(例如人類)。
在一個實施例中，引入之dsRNA減少或抑制LECT2基因於細胞中之表現。
在一個實施例中，dsRNA抑制LECT2基因之表現，或抑制澱粉樣 蛋白沈積(例如藉由防止澱粉樣蛋白沈積或減少澱粉樣蛋白沈積，例如減少澱粉樣蛋白沈積之尺寸、數目或程度)。抑制視情況涉及相較於參考(例如未經處理或經非靶向dsRNA(例如不靶向LECT2之dsRNA)的對照組)抑制至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或50%以上。
在其他態樣中，本發明提供用於治療與LECT2表現有關之病理學過程(例如澱粉樣蛋白沈積)的方法。在一個實施例中，該方法包括向個體(例如需要該治療之患者)投與有效(例如治療或預防有效)量的本文提供之dsRNA。
在一態樣中，本文提供一種治療及/或預防與LECT2表現相關病症(例如LECT2澱粉樣變性)之方法，其包含向需要該治療之個體投與治療有效量的本文所述之iRNA(例如dsRNA)或包含本文所述之iRNA(例如dsRNA)的組合物。
在一態樣中，本文提供一種治療與LECT2表現有關之病症(例如LECT2澱粉樣變性)的方法，其包含向需要該治療之個體投與雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含長度為15-30對鹼基的有義股及反義股且反義股與LECT2 mRNA轉錄物(例如人類LECT2 mRNA轉錄物，例如SEQ ID NO：1或在SEQ ID NO：1之核苷酸位置373處具有一種至g取代的核苷酸序列)之至少15個連續核苷酸互補。在一個實施例中，iRNA(例如dsRNA)靶向編碼成熟LECT2蛋白質之位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之纈胺酸的mRNA。
在一個實施例中，本文提供一種治療患有LECT2澱粉樣變性之個體的方法，該方法包含向該個體投與雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含長度為15-30對鹼基的有義股及反義股且反義股與LECT2 mRNA轉錄物(例如人類LECT2 mRNA轉錄物，例如SEQ ID NO：1或在SEQ ID NO：1之核苷酸位置373處具有一種至g取代的核苷酸序列)之至 少15個連續核苷酸互補。在一個實施例中，iRNA(例如dsRNA)靶向編碼成熟LECT2蛋白質之位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之纈胺酸的mRNA。
在一些實施例中，投與靶向LECT2之iRNA緩解或減輕患者中與LECT2表現有關之病症的至少一種症狀之嚴重程度。
在一個實施例中，個體患有LECT2澱粉樣變性。在另一實施例中，個體處於產生LECT2澱粉樣變性之風險中。
在實施例中，iRNA(例如dsRNA)調配成LNP調配物。
在實施例中，iRNA(例如dsRNA)呈GalNAc結合物形式。
在實施例中，iRNA(例如dsRNA)以0.05-50mg/kg劑量投與。
在實施例中，iRNA(例如dsRNA)以0.01mg/kg-5mg/kg個體體重之濃度投與。
在實施例中，iRNA(例如dsRNA)調配成LNP調配物且以0.05-5mg/kg之劑量投與。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)調配成LNP調配物且以0.1-0.5mg/kg之劑量投與。
在實施例中，iRNA(例如dsRNA)呈GalNAc結合物形式且以0.5-50mg/kg劑量投與。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)呈GalNAc結合物形式且以1-10mg/kg劑量投與。
在實施例中，該方法抑制LECT2基因之表現，或抑制澱粉樣蛋白沈積(例如藉由防止澱粉樣蛋白沈積或減少澱粉樣蛋白沈積，例如減少澱粉樣蛋白沈積之尺寸、數目或程度)。抑制視情況涉及相較於參考(例如未經處理或經非靶向dsRNA(例如不靶向LECT2之dsRNA))抑制至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。
在實施例中，iRNA(例如dsRNA)具有0.0005-1nM，例如0.001至0.2nM、0.002至0.1nM、0.005至0.075nM或0.01至0.05nM範圍內之 IC50。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)具有小於0.02nM，例如0.0005-0.02nM，0.001至0.02nM、0.005至0.02nM或0.01至0.02nM範圍內之IC50。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)之IC50在0.01-1nM範圍內。
在實施例中，本文所述之方法改善與LECT2相關病症(例如LECT2澱粉樣變性)有關之症狀。
在實施例中，本文所述之方法抑制個體中之LECT2基因表現。
在實施例中，本文所述之方法抑制澱粉樣蛋白沈積(例如藉由防止澱粉樣蛋白沈積或減少澱粉樣蛋白沈積，例如藉由減少澱粉樣蛋白沈積之尺寸、數目或程度)。
在實施例中，根據給藥方案投與iRNA(例如dsRNA)或包含iRNA之組合物。
在實施例中，個體為墨西哥後裔(例如墨西哥裔美國人)。
在實施例中，個體攜帶LECT2基因之G對偶基因，其編碼成熟蛋白質中位置40(未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之纈胺酸。在實施例中，個體為G對偶基因之同型(G/G基因型)。
在實施例中，個體中表現之LECT2蛋白質在成熟蛋白質中位置40處(或未經處理蛋白質中之胺基酸58處)具有纈胺酸。
在實施例中，iRNA(例如dsRNA)或包含iRNA之組合物例如根據給藥方案重複投與。
在實施例中，皮下投與iRNA(例如dsRNA)或包含iRNA之組合物。在實施例中，iRNA呈GalNAc結合物形式。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)以0.5-50mg/kg劑量投與。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)呈GalNAc結合物形式且以1-10mg/kg劑量投與。
在一態樣中，本文提供一種載體，其編碼如本文所述之iRNA(例如dsRNA)的至少一個股。
在一態樣中，本文提供一種編碼dsRNA之至少一個股的載體，其中該dsRNA包含與編碼LECT2之mRNA之至少一部分互補之區，其中該dsRNA長度為30對鹼基或小於30對鹼基，且其中該dsRNA靶向該mRNA使之裂解。
在實施例中，互補區長度為至少15個核苷酸。
在實施例中，互補區長度為19至21個核苷酸。
在一個態樣中，提供載體用於抑制細胞中之LECT2基因表現。在一個實施例中，該載體包含如本文所述之iRNA。在一個實施例中，該載體包括至少一個可操作地連接於核苷酸序列之調節序列，該核苷酸序列編碼如本文所述之iRNA的至少一個股。在一個實施例中，載體包含LECT2 iRNA之至少一個股。
在一態樣中，本文提供包含如本文所述之載體的細胞。
在一態樣中，本文提供含有用於抑制細胞中之LECT2基因表現之載體的細胞。該載體包括可操作地連接於核苷酸序列之調節序列，該核苷酸序列編碼如本文所述之iRNA中之一者的至少一個股。
所有公開案、專利申請案、專利及所提及之其他參考案均以全文引用的方式併入本文中。
本發明之各實施例之細節闡述於下文描述中。本發明之其他特徵、目標及優勢將自【實施方式】及【圖式簡單說明】，及自【申請專利範圍】顯而易知。
圖1描繪人類LECT2 mRNA轉錄物序列(參考序列NM_002302.2 GI：59806344，記錄日期為2013年4月17日；SEQ ID NO：1)。
iRNA藉由稱為RNA干擾(RNAi)之過程引導mRNA之序列特異性分解。本文描述調節(例如抑制)LECT2基因表現的iRNA及其使用方 法。亦提供治療與LECT2表現有關之病症，諸如澱粉樣變性(例如LECT2澱粉樣變性)之組合物及方法。
本文特性化之組合物之iRNA包括RNA股(反義股)，該RNA股具有長度為30個核苷酸或小於30個核苷酸，亦即長度為15-30個核苷酸，一般長度為19-24個核苷酸之區，該區與LECT2基因之mRNA轉錄物的至少部分(在本文中亦稱為「LECT2特異性iRNA」)實質上互補。使用此類iRNA使能夠靶向與如本文所述之LECT2表現有關之病症中所涉及的基因之mRNA分解。極低劑量之LECT2特異性iRNA可特異性且有效地介導RNAi，導致LECT2基因表現之顯著抑制。靶向LECT2之iRNA可特異性且有效地介導RNAi，導致顯著抑制LECT2基因之表現，其可例如在基於細胞之分析法中評定。
以下描述揭示如何製備含有iRNA之組合物及使用該組合物調節(例如抑制)LECT2基因表現，以及用於治療與LECT2基因表現有關之病症的組合物及方法。
本文特性化之醫藥組合物的實施例包括具有反義股之iRNA，該反義股包含長度為30個核苷酸或小於30個核苷酸，一般長度為19-24個核苷酸且與LECT2基因之RNA轉錄物之至少部分實質上互補的區。
在一些態樣中，本發明特性化含有LECT2 iRNA及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物、使用該等組合物抑制LECT2基因表現之方法及使用該等醫藥組合物治療與LECT2表現有關之病症(例如LECT2澱粉樣變性)的方法。
I. 定義
為方便起見，下文提供本說明書、實例及隨附申請專利範圍中所用之某些術語及短語之含義。若本說明書其他部分中使用之術語與本章節中提供之其定義之間存在明顯不一致，則將以本章節中之定義為準。
如本文所用，「LECT2」係指白細胞趨化因子2(亦稱為白細胞衍生趨化因子2、軟骨調節素-II、chm-II或chm2)。參見例如Yamagoe S等人，Genomics,1998 Mar 15；48(3)：324-9。LECT2首先鑑別為新穎嗜中性白血球趨化蛋白且與軟骨調節素II(一種用於軟骨細胞及骨胚細胞之生長刺激劑)相同。人類LECT2基因映射至染色體5q31.1-q32。同上。
人類LECT2 mRNA轉錄物之序列可發現於NM_002302.2(SEQ ID NO：1)處。小鼠LECT2 mRNA之序列可發現於NM_010702.1及NM_010702.2處，且大鼠LECT2 mRNA之序列可發現於NM_001108405.1處。
人類LECT2蛋白質為分泌之16kDa蛋白質。LECT2蛋白質由肝臟分泌。其與雞myb誘導之骨髓1蛋白質之軟骨調節素重複區域具有高度序列相似性(http：//www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene=LECT2；2013年8月29日存取)。LECT2基因中之多形現象與類風濕性關節炎有關。同上。
LECT2表現於多種組織中，包括腦及胃以及肝臟。Koshimizu,Y & Ohtomi,M.(2010)Brain Res.1311：1-11。在使用間接免疫過氧化酶染色以研究正常及患病人類器官及組織(除肝臟外)中LECT2表現之研究中，發現LECT2一般表現於血管、內皮及平滑肌細胞、脂肪細胞、大腦神經細胞、頂部鱗狀上皮、副甲狀腺細胞、汗腺及皮脂腺上皮、胸腺小體(Hassall body)及免疫造血系統中之一些單核細胞。儘管偶爾在骨胚細胞、軟骨細胞、心肌及骨胳肌肉細胞、胃腸道平滑肌細胞及一些組織之上皮細胞中積極染色，但此蛋白質一般為消極的。Nagai等人.(1998)Pathol Int.48(11)：882-6。
人類LECT2基因編碼151種胺基酸，包括18種胺基酸信號肽。分泌之蛋白質具有133個殘基。已鑑別出基因之外顯子3中之核苷酸172 處的G/A多形現象(密碼子由GTC變為ATC)且解釋未經處理蛋白質之位置58(或成熟蛋白質之位置40)處的纈胺酸或異白胺酸的存在。G對偶基因在歐洲後裔個體中總頻率為0.477且頻率範圍為0.6-0.7。參見Benson,M.D.等人.(2008)Kidney International,74：218-222；Murphy,C.L.等人，(2010)Am J Kidney Dis,56(6)：1100-1107。患有LECT2澱粉樣變性之患者通常為G對偶基因之同型。不希望受理論約束，已提出將嵌入之異白胺酸(A對偶基因)側鏈置換為纈胺酸(對偶基因)可對蛋白質去穩定化且可能造成此LECT2變異體之類澱粉樣傾向。Murphy,C.L.等人，(2010)Am J Kidney Dis,56(6)：1100-1107。
如本文所用，「LECT2澱粉樣變性」或「ALECT2」包括涉及含有LECT2蛋白質(例如LECT2蛋白質之任何多態性變異體)或LECT2蛋白質之一部分的澱粉樣蛋白或澱粉樣蛋白原纖維沈積之澱粉樣變性。LECT2蛋白質可為變異(例如突變)LECT2蛋白質。澱粉樣變性可為全身或局部的。在實施例中，LECT2澱粉樣變性涉及腎臟及/或肝臟中之澱粉樣蛋白沈積。
「G」、「C」、「A」、「T」及「U」各自一般分別代表含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷及尿嘧啶作為鹼基之核苷酸。然而，應理解術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦可指如下文進一步詳述之經修飾核苷酸或替代部分。技術人員熟知鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可置換為其他部分而不實質上更改包含攜帶此類置換部分之核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對特性。例如(但不限於)包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之核苷酸鹼基配對。因此，本發明特性化之dsRNA的核苷酸序列中之含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可置換為含有例如肌苷之核苷酸。在另一實例中，寡核苷酸任何位置之腺嘌呤及胞嘧啶可分別置換為鳥嘌呤及尿嘧啶以形成與目標mRNA之G-U擺動鹼基配對。含有此類置換部分之序列適於本發 明特性化之組合物及方法。
如本文所用，術語「iRNA」、「RNAi」、「iRNA劑」或「RNAi劑」係指如本文所定義之彼術語的含有RNA之試劑，且其例如經RNA誘導沉默複合物(RISC)路徑介導RNA轉錄物之靶向裂解。在一個實施例中，如本文所述之iRNA實現LECT2表現抑制。可基於ALECT2 mRNA含量降低或ALECT2蛋白質含量降低評定ALECT2表現抑制。如本文所用，「目標序列」係指ALECT2基因轉錄期間形成的mRNA分子之核苷酸序列的連續部分，包括為主要轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。序列之目標部分將至少足夠長以用作iRNA引導之彼部分處或附近之裂解的受質。舉例而言，目標序列長度一般將為9-36個核苷酸，例如長度為15-30個核苷酸，包括其間之所有子範圍。作為非限制性實例，目標序列可為15-30個核苷酸、15-26個核苷酸、15-23個核苷酸、15-22個核苷酸、15-21個核苷酸、15-20個核苷酸、15-19個核苷酸、15-18個核苷酸、15-17個核苷酸、18-30個核苷酸、18-26個核苷酸、18-23個核苷酸、18-22個核苷酸、18-21個核苷酸、18-20個核苷酸、19-30個核苷酸、19-26個核苷酸、19-23個核苷酸、19-22個核苷酸、19-21個核苷酸、19-20個核苷酸、20-30個核苷酸、20-26個核苷酸、20-25個核苷酸、20-24個核苷酸、20-23個核苷酸、20-22個核苷酸、20-21個核苷酸、21-30個核苷酸、21-26個核苷酸、21-25個核苷酸、21-24個核苷酸、21-23個核苷酸或21-22個核苷酸。
如本文所使用，術語「包含序列之股」係指包含使用標準核苷酸命名法提及之序列所描述的核苷酸鏈之寡核苷酸。
如本文所用，且除非另外指示，否則如技術人員將理解，術語「互補」當用於相對於第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列時，係指包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸在某些條件下與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸雜交且形成雙螺旋結構之能力。此 類條件可例如為嚴格條件，其中嚴格條件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃，持續12-16小時，隨後洗滌。可應用其他條件，諸如生物體內部可能遇到的生理學上相關條件。技術人員將能夠判斷最適於根據雜交核苷酸之最用應用測試兩個序列之互補性的條件集合。
iRNA內(例如如本文所述之dsRNA內)的互補序列包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸在一個或兩個核苷酸序列的整個長度上的鹼基配對。此類序列在本文中可稱為彼此「完全互補」。然而，若本文中將第一序列稱為關於第二序列「實質上互補」，則兩個序列可完全互補，或其在雜交成高達30對鹼基之雙螺旋體時可形成一或多個，但一般不超過5、4、3或2個不匹配鹼基對，同時保留在與其最終應用最相關之條件下雜交的能力，例如經RISC路徑抑制基因表現。然而，若兩個寡核苷酸經設計以在雜交時形成一或多個單股突出端，則此類突出端不應視為關於互補判定之錯配。舉例而言，針對本文所述之目的，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸及另一長度為23個核苷酸之寡核苷酸的dsRNA，其中較長寡核苷酸包含與較短寡核苷酸完全互補的21個核苷酸之序列，仍可稱為「完全互補」。
如本文所用，「互補」序列亦可包括非沃森-克里克鹼基對(non-Watson-Crick base pair)及/或由非天然及經修飾核苷酸形成的鹼基對，只要滿足上文關於其雜交能力之要求。此類非沃森-克里克鹼基配對包括(但不限於)G：U擺動或胡森鹼基配對(Hoogstein base pairing)。
本文之術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可關於dsRNA之有義股與反義股之間的鹼基匹配，或iRNA劑之反義股與目標序列之間的鹼基匹配使用，如將自其使用情形理解。
如本文所用，「與信使RNA(mRNA)之至少部分實質上互補」的聚核苷酸係指聚核苷酸與所關注mRNA(例如編碼ALECT2蛋白質之mRNA)之連續部分實質上互補。舉例而言，若序列與mRNA編碼LECT2之不間斷部分實質上互補，則聚核苷酸與LECT2 mRNA之至少一部分互補。作為另一實例，若序列與mRNA編碼LECT2之不間斷部分實質上互補，則聚核苷酸與LECT2 mRNA之至少一部分互補。
如本文所用，術語「雙股RNA」或「dsRNA」係指包括具有雜交雙螺旋區之RNA分子或分子複合物的iRNA，該雙螺旋區包含兩個反平行且實質上互補之核酸股，其將稱為關於目標RNA「有義」及「反義」定向。雙螺旋區可為允許例如藉由RISC路徑特異性分解所要目標RNA之任何長度，但通常將在9至36對鹼基長度，例如15-30對鹼基長度的範圍中。考慮到9至36對鹼基的雙螺旋體，雙螺旋體可為此範圍中之任何長度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36及其間之任何子範圍，包括(但不限於)15-30對鹼基、15-26對鹼基、15-23對鹼基、15-22對鹼基、15-21對鹼基、15-20對鹼基、15-19對鹼基、15-18對鹼基、15-17對鹼基、18-30對鹼基、18-26對鹼基、18-23對鹼基、18-22對鹼基、18-21對鹼基、18-20對鹼基、19-30對鹼基、19-26對鹼基、19-23對鹼基、19-22對鹼基、19-21對鹼基、19-20對鹼基、20-30對鹼基、20-26對鹼基、20-25對鹼基、20-24對鹼基、20-23對鹼基、20-22對鹼基、20-21對鹼基、21-30對鹼基、21-26對鹼基、21-25對鹼基、21-24對鹼基、21-23對鹼基或21-22對鹼基。藉由用Dicer及類似酶類加工在細胞中產生之dsRNA一般在19-22對鹼基長度的範圍內。dsDNA之雙螺旋區之一個股包含與目標RNA之區實質上互補的序列。形成雙螺旋結構之兩個股可來自具有至少一個自身互補區的單個RNA分子，或可由兩個或兩個以上各別RNA分子形 成。若雙螺旋區由單個分子的兩個股形成，則該分子可具有在形成雙螺旋結構之一個股的3'端與另一股的5'端之間由單股核苷酸鏈分隔的雙螺旋區(本文稱為「髮夾環」)。髮夾環可包含至少一個不成對核苷酸；在一些實施例中，髮夾環可包含至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少20個、至少23個或23個以上不成對核苷酸。若dsRNA之兩個實質上互補股由各別RNA分子構成，則彼等分子無需共價連接，但可共價連接。若兩個股藉由除髮夾環之外的方式共價連接，則連接結構稱為「連接子」。術語「siRNA」在本文中亦用於指如上文所述之dsRNA。
在另一實施例中，iRNA劑可為引入細胞或生物體中以抑制目標mRNA的「單股siRNA」。單股RNAi劑結合於RISC核酸內切酶Argonaute 2，其又裂解目標mRNA。單股siRNAs一般為15-30個核苷酸且經化學改質。單股siRNA之設計及測試描述於美國專利第8,101,348號及Lima等人，(2012)Cell 150：883-894中，其各自之全部內容以引用的方式併人本文中。本文所述之任何反義核苷酸序列(例如表2-3、5-6及9-10)中所提供之序列)可用作如本文所述之單股siRNA或藉由Lima等人，(2012)Cell 150：883-894中所述之方法經化學改質。
在另一態樣中，RNA劑為「單股反義RNA分子」。單股反義RNA分子與目標mRNA內之序列互補。單股反義RNA分子可藉由與mRNA鹼基配對及物理上阻斷轉譯機制以化學計量方式抑制轉譯，參見Dias,N.等人，(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。或者，單股反義分子藉由與目標雜交且經RNaseH裂解事件裂解目標來抑制目標mRNA。單股反義RNA分子長度可為約10至約30個核苷酸且具有與目標序列互補之序列。在一個實施例中，單股反義RNA分子可包含至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20個以上與本文所述之目標位置(例如表2-3、5-6及9-10中之任一者中提供的序列)中之任一 者互補的連續核苷酸之序列。在另一實施例中，單股反義RNA分子可包含至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20個以上來自本文所述之反義核苷酸序列(例如表2-3、5-6及9-10中之任一者中提供的序列)中之任一者的連續核苷酸之序列。
熟習此項技術者將認識到術語「RNA分子」或「核糖核酸分子」不僅涵蓋自然界中表現或發現之RNA分子，而且亦涵蓋如本文所述或如此項技術中已知的包含一或多個核糖核苷酸/核苷類似物或衍生物之RNA之類似物及衍生物。嚴格而言，「核苷」包括核苷鹼基及核糖，且「核糖核苷酸」為具有一個、兩個或三個磷酸基部分之核苷。然而，如本文所用，術語「核苷」及「核糖核苷酸」可視為等效。RNA之核鹼基結構，核糖結構或核糖-磷酸基骨架結構可經修飾，例如如下文所述。然而，包含核苷類似物或衍生物之分子必須保留形成雙螺旋體之能力。作為非限制性實例，RNA分子亦可包括至少一個經修飾核苷，包括(但不限於)2'-O-甲基修飾之核苷酸、包含5'硫代磷酸酯基之核苷、連接至膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基之末端核苷、鎖核苷、無鹼基核苷、非環核苷、2'-去氧-2'-氟修飾之核苷、2'-胺基-修飾之核苷、2'-烷基-修飾之核苷、(N-嗎啉基)核苷、包含胺基磷酸酯基或非天然鹼基之核苷或其任何組合。或者，RNA分子可包含至少2個，至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個或20個以上，至多dsRNA分子之整個長度的經修飾核糖核苷。RNA分子中此類複數個經修飾核糖核苷中之每一者的修飾無需相同。在一個實施例中，預期用於本文所述之方法及組合物中的經修飾RNA為肽核酸(PNA)，其能夠形成必需雙螺旋體結構且允許或介導目標RNA例如經RISC路徑特異性分解。
在一個態樣中，經修飾核苷包括脫氧核苷。在此類實例中， iRNA劑可包含一或多個去氧核苷，包括例如去氧核苷突出端，或dsRNA之雙股部分內的一或多個去氧核苷。在某些實施例中，RNA分子例如在一股或兩股中包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%或95%以上(但不超過100%)去氧核糖核苷的去氧核糖核苷百分比。在其他實施例中，術語「iRNA」不涵蓋雙股DNA分子(例如天然存在之雙股DNA分子或含有100%去氧核苷之DNA分子)。
在一個態樣中，RNA干擾劑包括與目標RNA序列相互作用以引導目標RNA之裂解的單股RNA。不希望受理論束縛，引入細胞中之長雙股RNA藉由稱為Dicer之III型核酸內切酶分解成siRNA(Sharp等人，Genes Dev.2001,15：485)。Dicer為核糖核酸酶-III樣酶，其將dsRNA加工成特徵為兩個鹼基3'突出端之19-23對鹼基的短干擾RNA(Bernstein等人，(2001)Nature 409：363)。siRNA接著併入RNA誘導沉默複合物(RISC)中，其中一或多種解螺旋酶展開siRNA雙螺旋體，使互補反義股能夠引導目標識別(Nykanen等人，(2001)Cell 107：309)。當結合於適當目標mRNA時，RISC內之一或多種核酸內切酶裂解目標以誘導沉默(Elbashir等人，(2001)Genes Dev.15：188)。因此，在一個態樣中，本發明係關於一種單股RNA，其促進形成RISC複合物以實現目標基因之沉默。
如本文所用，術語「核苷酸突出端」係指自iRNA雙螺旋體結構(例如dsRNA)突出的至少一個不成對核苷酸。舉例而言，當dsRNA之一個股的3'端衍生超過另一股之5'端時，或當dsRNA之一個股的5'端衍生超過另一股之3'端時，存在核苷酸突出端。dsRNA可包含具有至少一個核苷酸的突出端；或者突出端可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或超過五個核苷酸。核苷酸突出端可包含核苷酸/核苷類似物(包括去氧核苷酸/核苷)或由其組 成。突出端可在有義股上，反義股上或其任何組合。此外，突出端之核苷酸可在dsRNA之反義股或有義股中任一者之5'端、3'端或兩端上。
在一個實施例中，dsRNA之反義股在3'端及/或5'端具有1至10個核苷酸突出端。在一個實施例中，dsRNA之有義股在3'端及/或5'端具有1至10個核苷酸突出端。在另一實施例中，突出端中之一或多個核苷酸置換為核苷硫代磷酸酯。
如本文關於dsRNA所用之術語「鈍」或「鈍端」意謂在dsRNA之既定末端處不存在不成對核苷酸或核苷酸類似物，亦即無核苷酸突出端。dsRNA之一端或兩端可為鈍端。若dsRNA之兩端皆為鈍的，則dsRNA稱為鈍端的。應明確，「鈍端」dsRNA為兩端皆鈍之dsRNA，亦即分子之任一端皆無核苷酸突出端。通常，此類分子的全部長度上均為雙股的。
術語「反義股」或「引導股」係指包括與目標序列實質上互補之區的iRNA(例如dsRNA)之股。如本文所用，術語「互補區」係指反義股上與如本文所定義之序列(例如目標序列)實質上互補之區。若互補區與目標序列不完全互補，則分子之內部區或末端區中可存在錯配。一般而言，大多數耐受錯配在末端區中，例如在5'及/或3'端之5、4、3或2個核苷酸內。
如本文所用之術語「有義股」或「過客股」係指包括與如本文所定義之彼術語的反義股區實質上互補之區的iRNA之股。
如本文所用，術語「SNALP」係指穩定核酸-脂質粒子。SNALP表示塗佈包含核酸(諸如iRNA)或轉錄iRNA之質體的降低水性內體之脂質小泡。SNALP描述於例如美國專利申請公開案第2006/0240093號、第2007/0135372號及國際申請案第WO 2009/082817號中。此等申請案以全文引用的方式併入本文中。
如熟習此項技術者所理解，當涉及iRNA時，「引入細胞中」意謂促進或實現攝取或吸收至細胞中。iRNA之吸收或攝取可藉由未受輔助之擴散或主動細胞過程，或藉由輔助試劑或裝置進行。此術語之含義不限於活體外細胞；當細胞為活有機體之部分時，iRNA亦可「引入細胞中」。在此情形中，引入細胞中將包括傳遞該生物體。舉例而言，對於活體內傳遞，iRNA可注入組織部位中或全身性投與。活體內傳遞亦可藉由β-葡聚糖傳遞系統進行，諸如美國專利第5,032,401號及第5,607,677號，及美國公開案第2005/0281781號中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。活體外引入細胞中包括此項技術中已知之方法，諸如電穿孔及脂質體轉染。其他方法亦在下文中描述或為此項技術中已知。
如本文所用，術語「調節表現」係指在用如本文所述之iRNA組合物處理的細胞中LECT2基因表現相較於對照細胞中之LECT2表現至少部分「抑制」或部分「活化」。對照細胞包括未處理細胞或用非靶向對照iRNA處理之細胞。
術語「活化」、「增進」、「上調表現」、「提高表現」及其類似術語在提及LECT2基因之範圍內，此處係指如LECT2 mRNA之量相較於與第一細胞或細胞群實質上相同但未經處理之第二細胞或細胞群(對照細胞)提高所顯現至少部分活化LECT2基因之表現，LECT2 mRNA可自轉錄LECT2基因且已經處理使得LECT2基因之表現提高的第一細胞或細胞群分離或在其中偵測。
在一個實施例中，LECT2基因之表現藉由投與如本文所述之iRNA活化至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在一些實施例中，LECT2基因藉由投與本發明特性化之iRNA活化至少約60%、70%或80%。在一些實施例中，LECT2基因之表現藉由投與如本文所述之iRNA活化至少約85%、90%或95%或95%以上。 在一些實施例中，使用如本文所述之iRNA處理的細胞中LECT2基因表現相較於未經處理之細胞中的表現提高至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或1000倍以上。藉由小dsRNA活化表現描述於例如Li等人，2006 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103：17337-42以及US2007/0111963及US2005/226848中，其各自以引用的方式併入本文中。
術語「沉默」、「抑制表現」、「下調表現」、「抑制表現」及其類似術語在提及LECT2基因之範圍內，此處係指如例如基於LECT2 mRNA表現、LECT2蛋白質表現或與LECT2基因表現功能上關聯之另一參數所評定至少部分抑制LECT2基因之表現。舉例而言，抑制LECT2表現可藉由相較於對照組減少可自轉錄LECT2基因且已經處理使得LECT2基因表現得以抑制之第一細胞或細胞群分離或在其中偵測之LECT2 mRNA之量顯現。對照組可為與第一細胞或細胞群實質上相同之第二細胞或細胞群，但第二細胞或細胞群未經處理(對照細胞)。 抑制程度通常表示為對照水準百分比，例如，
或者，抑制程度可根據與LECT2基因表現功能上關聯之參數(例如LECT2基因編碼之蛋白質的量)的降低給出。與LECT2基因表現功能上關聯之參數的降低可類似地表示為對照水準百分比。大體上，可組成性的或藉由染色體組工程改造在任何表現LECT2之細胞中且藉由任何適當分析法測定LECT2基因沉默。
舉例而言，在某些情況下，LECT2基因之表現藉由投與本文揭示之iRNA抑制至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在一些實施例中，LECT2基因藉由投與本文揭示之iRNA抑制至少約60%、65%、70%、75%或80%。在一些實施例中，LECT2基因 藉由投與如本文所述之iRNA抑制至少約85%、90%、95%、98%、99%或99%以上。
在本發明之情形中，術語「治療」及其類似術語意謂預防、減輕或緩解與LECT2表現有關之病症相關的至少一種症狀或減緩或逆轉此類病症之進展或預期進展。舉例而言，本文特性化之方法當用於治療LECT2澱粉樣變性時可用於抑制澱粉樣蛋白沈積，減輕或預防澱粉樣變性之一或多種症狀或降低相關病狀(例如腎病症候群或肝炎)之風險或嚴重程度。因此，除非上下文另外明確指出，否則術語「治療」及其類似術語意欲涵蓋防治，例如預防與LECT2表現有關之病症及/或病症症狀。
疾病標記或症狀情形中之「較低」意謂此類含量中之任何降低，例如統計學上或臨床上顯著降低。降低可為例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少40%，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。降低可低至對無此類病症之個體而言正常範圍內可接受之含量。
如本文所用，短語「治療有效量」及「預防有效量」及其類似術語係指在治療、預防或處理與LECT2表現有關之任何病症或病理學過程中提供治療益處之量。治療有效之特定量可視此項技術中已知之因素而變化，諸如病症或病理學過程之類型、患者病史及年齡、病症或病理學過程之階段及其他療法之投與。
如本文所用，「醫藥組合物」包含藥理學有效量之iRNA及醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，「藥理學有效量」、「治療有效量」或簡言之「有效量」係指有效產生預期藥理學、治療或預防性結果之iRNA的量。舉例而言，在治療與LECT2表現有關之病症(例如LECT2澱粉樣變性)的方法中，有效量包括有效減輕一或多種與LECT2澱粉樣變性有關之症狀的量、有效抑制澱粉樣蛋白沈積(例如LECT2澱粉 樣蛋白沈積)之量或有效降低產生與LECT2澱粉樣變性有關之病狀之風險的量。舉例而言，若既定臨床治療在與疾病或病症有關之可量測參數中存在至少10%降低時視為有效，則用於治療彼疾病或病症之藥物的治療有效量為獲得彼參數至少10%降低所必需之量。舉例而言，治療有效量之靶向LECT2之iRNA可使LECT2 mRNA含量或LECT2蛋白質含量降低任何可量測量，例如降低至少10%、20%、30%、40%或50%。
術語「醫藥學上可接受之載劑」係指用於投與治療劑之載劑。此類載劑包括(但不限於)生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術語具體而言不包括細胞培養基。對於經口投與之藥物，醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)醫藥學上可接受之賦形劑，諸如惰性稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑。適合惰性稀釋劑包括碳酸鈉及碳酸鈣、磷酸鈉及磷酸鈣及乳糖，而玉米澱粉及褐藻酸為適合崩解劑。黏合劑可包括澱粉及明膠，儘管潤滑劑(若存在)一般將為硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。若需要，則錠劑可經諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之材料包覆以延遲胃腸道中之吸收。藥物調配物中包括之藥劑在下文中進一步描述。
術語「約」當涉及數字或數字範圍時意謂所提及之數字或數字範圍為實驗變化性內(或統計實驗誤差內)之近似值，且因此數字或數字範圍可例如與所述數字或數字範圍有1%至15%的差異。
II. iRNA劑
本文描述調節(例如抑制)LECT2基因表現之iRNA劑。
在一些實施例中，iRNA劑活化細胞或哺乳動物中之LECT2基因之表現。
在一些實施例中，iRNA劑包括用於抑制細胞或個體(例如哺乳動 物，例如人類)中之LECT2基因表現的雙股核糖核酸(dsRNA)分子，其中dsRNA包括具有互補區之反義股，該互補區與LECT2基因表現中形成之mRNA之至少一部分互補，且其中該互補區長度為30個核苷酸或小於30個核苷酸，長度一般為19-24個核苷酸，且其中如例如PCR或基於分支鏈DNA(bDNA)之方法或基於蛋白質之方法(諸如西方墨點法)所評定，dsRNA當與表現LECT2基因之細胞接觸時將LECT2基因之表現抑制例如至少10%、20%、30%、40%或50%。
LECT2基因表現之調節(例如抑制)可藉由例如PCR或基於分支鏈DNA(bDNA)之方法或藉由基於蛋白質之方法，諸如藉由西方墨點法分析。細胞培養物(諸如COS細胞、HeLa細胞、原生肝細胞、HepG2細胞、原生培養細胞或來自個體之生物樣品)中LECT2基因之表現可藉由量測LECT2 mRNA含量(諸如藉由bDNA或TaqMan分析法)或使用例如西方墨點法或流式細胞技術藉由量測蛋白質含量(諸如藉由免疫螢光分析)分析。
dsRNA包括兩個RNA股，其充分互補以在將使用dsRNA之條件下雜交形成雙螺旋結構。dsRNA之一個股(反義股)包括與目標序列實質上互補且一般完全互補之互補區，該目標序列源自LECT2基因表現期間形成之mRNA之序列。另一股(有義股)包括與反義股互補之區，使得兩個股在適合條件下組合時雜交且形成雙螺旋結構。一般而言，雙螺旋結構之長度為15至30(包括15及30)，更一般而言18至25(包括18及25)，更一般而言19至24(包括19及24)且最一般而言19至21(包括19及21)對鹼基。類似地，與目標序列互補之區的長度為15至30(包括15及30)，更一般而言18至25(包括18及25)，更一般而言19至24(包括19及24)且最一般而言19至21(包括19及21)個核苷酸。
在一些實施例中，dsRNA之長度為15至20(包括15及20)個核苷酸，且在其他實施例中，dsRNA之長度為25至30(包括25及30)個核苷 酸。如一般技術者將瞭解，靶向裂解之RNA的靶向區最通常將為較大RNA分子(通常分子)之部分。若相關，則mRNA目標之「部分」為具有足夠長度之mRNA目標之連續序列，其為RNAi引導之裂解的受質(亦即經RISC路徑裂解)。在一些情況下，具有雙螺旋結構且短至9對鹼基之dsRNA介導RNAi引導之RNA裂解。目標最通常將為至少15個核苷酸之長度，例如15-30個核苷酸之長度。
熟習此項技術者亦將認識到雙螺旋區為dsRNA之主要功能部分，例如9至36，例如15-30對鹼基之雙螺旋區。因此，在一個實施例中，在加工成具有例如15-30對鹼基且使所要RNA靶向裂解之功能性雙螺旋體的方面而言，雙螺旋區大於30對鹼基之RNA分子或RNA分子複合物為dsRNA。因此，一般技術者將認識到在一個實施例中，miRNA為dsRNA。在另一實施例中，dsRNA不為天然存在之miRNA。在另一實施例中，適用於目標LECT2表現之iRNA劑並非藉由裂解較大dsRNA在目標細胞中產生。
如本文所述之dsRNA可進一步包括一或多個單股核苷酸突出端。dsRNA可藉由如下文進一步論述的此項技術中已知之標準方法合成，例如藉由使用自動DNA合成器，諸如購自例如Biosearch,Applied Biosystems,Inc。
在一個實施例中，LECT2基因為人類LECT2基因。在另一實施例中，LECT2基因為小鼠或大鼠LECT2基因。
在特定實施例中，dsRNA含有包含選自表2-3、5-6及9-10中提供之有義序列的有義序列或由其組成之有義股，及包含選自表2-3、5-6及9-10中提供之反義序列的反義序列或由其組成之反義股。
在一個態樣中，dsRNA將包括至少有義核苷酸序列及反義核苷酸序列，藉此有義股係選自表2-3、5-6及9-10中提供之序列，且相應反義股係選自表2-3、5-6及9-10中提供之序列。
在此等態樣中，兩個序列中之一者與兩個序列中之另一者互補，該等序列中之一者與藉由表現LECT2基因產生之mRNA序列實質上互補。因而，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸描述為有義股，且第二寡核苷酸描述為相應反義股。如本文別處所描述且如此項技術中已知，與各別寡核苷酸上相對，dsRNA之互補序列亦可作為單個核酸分子之自身互補區含於其中。
技術人員熟知具有20至23，但具體而言21對鹼基之雙螺旋結構的dsRNA譽為尤其有效誘導RNA干擾(Elbashir等人，EMBO 2001,20：6877-6888)。然而，其他已發現較短或較長RNA雙螺旋結構同樣有效。
在上文所述之實施例中，藉助於表2-3、5-6及9-10中提供之寡核苷酸序列的性質，本文所述之dsRNA可包括至少一個長度最少為19個核苷酸的股。合理預期具有表2、3、5、6、9或10之序列中之一者但一端或兩端僅減去幾個核苷酸的較短雙螺旋體相較於上文所述之dsRNA將類似地有效。
在一些實施例中，dsRNA具有至少15、16、17、18、19、20或20個以上來自表2、3、5、6、9或10之序列中之一者的連續核苷酸之部分序列。
在一些實施例中，dsRNA具有包含至少15、16、17、18或19個表2中提供之反義序列的連續核苷酸之反義序列，及包含至少15、16、17、18或19個表2中提供之相應有義序列的連續核苷酸之有義序列。
在一些實施例中，dsRNA具有包含至少15、16、17、18、19、20、21、22或23個表3中提供之反義序列的連續核苷酸的反義序列，及包含至少15、16、17、18、19、20或21個表3中提供之相應有義序列的連續核苷酸的有義序列。
在一些實施例中，dsRNA具有包含至少15、16、17、18、19、 20、21、22或23個表5中提供之反義序列的連續核苷酸的反義序列，及包含至少15、16、17、18、19、20或21個表5中提供之相應有義序列的連續核苷酸的有義序列。
在一些實施例中，dsRNA具有包含至少15、16、17、18、19、20、21、22或23個表6中提供之反義序列的連續核苷酸的反義序列，及包含至少15、16、17、18、19、20或21個表6中提供之相應有義序列的連續核苷酸的有義序列。
在一些實施例中，dsRNA具有包含至少15、16、17、18、19、20、21、22或23個表5中提供之反義序列的連續核苷酸的反義序列，及包含至少15、16、17、18、19、20或21個表9中提供之相應有義序列的連續核苷酸的有義序列。
在一些實施例中，dsRNA具有包含至少15、16、17、18、19、20、21、22或23個表6中提供之反義序列的連續核苷酸的反義序列，及包含至少15、16、17、18、19、20或21個表10中提供之相應有義序列的連續核苷酸的有義序列。
在一些此類實施例中，dsRNA儘管僅包含表2、3、5、6、9或10中提供之序列的一部分，但如包含表2、3、5、6、9或10中提供之全長序列的dsRNA一樣有效抑制LECT2表現程度。在一些實施例中，該dsRNA抑制LECT2基因表現程度與相較於包含本文揭示之完全序列的dsRNA區別不超過5、10、15、20、25、30、35、40、45或50%抑制。
表2-3、5-6及9-10中提供之iRNA鑑別LECT2轉錄物中對RISC介導之裂解敏感之位點。因而，本發明進一步特性化靶向此類序列中之一者的iRNA。如本文所用，若iRNA促進轉錄物在特定位點內任何地方之裂解，則iRNA稱為靶向RNA轉錄物之特定位點。此類iRNA一般將包括至少15個來自表2-3、5-6及9-10中提供之序列中之一者的連續 核苷酸，其偶接至與LECT2基因中所選序列連續之區的額外核苷酸序列。
儘管目標序列之長度一般為15-30個核苷酸，但此範圍中引導任何既定目標RNA裂解之特定序列之適用性存在廣泛變化。本文所述之多種軟體套裝及準則提供鑑別用於任何既定基因目標之最佳目標序列的指導，但亦可採用經驗方法，其中既定尺寸(作為非限制性實例，21個核苷酸)之「窗」或「遮罩」字面上或象徵性的(包括例如電子雜交)置於目標RNA序列上以鑑別可用作目標序列之尺寸範圍中的序列。藉由將序列「窗」向最初目標序列位置之上游或下游逐漸移動一個核苷酸，可鑑別下一潛在目標序列，直至鑑別出針對任何所選既定目標尺寸的可能序列之完整集合。與系統性合成偶合且測試經鑑別序列(使用本文所述或此項技術中已知之分析法)以鑑別表現最佳之彼等序列的此製程可鑑別當用iRNA劑靶向時介導目標基因表現之最佳抑制的RNA序列。因此，儘管例如表2-3、5-6及9-10中所鑑別之序列代表有效目標序列，但預期可藉由使「窗」向既定序列之上游或下游逐漸「行走」一個核苷酸以識別具有相同或較佳抑制特徵之序列，實現抑制效率之進一步最佳化。
此外，預期對於例如表2-3、5-6及9-10中鑑別之任何序列，可藉由系統地添加或移除核苷酸產生較長或較短序列且藉由使具有較長或較短尺寸之窗自彼點沿目標RNA向上或向下行走來對彼等序列及所產生序列進行測試。此外，偶合此方法產生新候選目標，在如此項技術中已知或如本文所述之抑制分析法中基於彼等目標序列測試iRNA之效用，可導致進一步提高抑制效率。此外，此類經最佳化序列可藉由例如引入如本文所述或如此項技術中已知之經修飾核苷酸，添加或改變突出端或如此項技術中已知及/或本文中所述之其他修飾調整，使分子作為表現抑制劑進一步使最佳化(例如提高血清穩定性或循環半 衰期、提高熱穩定性、增強跨膜傳遞、靶向特定位置或細胞類型、增加與沉默路徑酶類之相互作用、增加自內體之釋放等)。
如本文所述之iRNA可含有與目標序列之一或多個錯配。在一個實施例中，如本文所述之iRNA含有不超過3個錯配。若iRNA之反義股含有與目標序列之錯配，則錯配區較佳不位於互補區中心。若iRNA之反義股含有與目標序列之錯配，則錯配較佳限於互補區之5'或3'端的最後5個核苷酸內。舉例而言，對於與LECT2基因之區互補的23個核苷酸之iRNA劑RNA股，RNA股的中心13個核苷酸內一般不含任何錯配。本文所述之方法或此項技術中已知之方法可用於判斷含有一個與目標序列之錯配的iRNA是否有效抑制LECT2基因之表現。考慮具有錯配之iRNA抑制ALAS1基因表現之功效是重要的，若LECT2基因中之特定互補區已知在群體內具有多態序列變化，則尤其重要。
在一個實施例中，dsRNA之至少一個端具有1至4個，一般1或2個核苷酸的單股核苷酸突出端。具有至少一個核苷酸突出端之dsRNA相對於其鈍端對應物具有出乎意料地優良抑制特性。在另一實施例中，iRNA(例如dsRNA)之RNA經化學改質以提高穩定性或其他有益特徵。本發明特性化之核酸可藉由此項技術中良好確立之方法合成及/或修飾，諸如「Current protocols in nucleic acid chemistry,」Beaucage,S.L.等人(編)，John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA中所述之彼等方法，其以引用的方式併入本文中。修飾包括例如(a)末端修飾，例如5'端修飾(磷酸化、結合、反向鍵聯等)、3'端修飾(結合、DNA核苷酸、反向鍵聯等)，(b)鹼基修飾，例如用穩定鹼基、去穩定化鹼基或與搭配物之擴展抗體庫鹼基配對之鹼基置換，移除鹼基(無鹼基核苷酸)或經結合鹼基，(c)糖修飾(例如在2'位置或4'位置處或具有非環糖)或糖置換，以及(d)主鏈修飾，包括磷酸二酯鍵之修飾或置換。適用於本發明之RNA化合物的特定實例包括(但不限於)含有經 修飾主鏈或非天然核苷間鍵之RNA。具有經修飾主鏈之RNA尤其包括主鏈中不具有磷原子者。對於本說明書而言，且如此項技術中有時提及，核苷間主鏈中不具有磷原子之經修飾RNA亦可視為寡核苷。在特定實施例中，經修飾RNA之核苷間主鏈中將具有磷原子。
經修飾RNA主鏈包括例如硫代磷酸酯基；對掌性硫代磷酸酯基；二硫代磷酸酯基；磷酸三酯基；胺基烷基磷酸三酯基；甲基及其他烷基膦酸酯基，包括3'-伸烷基膦酸酯基及對掌性膦酸酯基；亞膦酸酯基；胺基磷酸酯基，包括3'-胺基胺基磷酸酯基及胺基烷基胺基磷酸酯基；硫代胺基磷酸酯基；硫代烷基膦酸酯基；具有標準3'-5'鍵之硫代烷基磷酸三酯基及硼烷磷酸酯基，此等之2'-5'鍵聯之類似物，及具有反轉極性者，其中相鄰核苷單元對3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'鍵聯。亦包括多種鹽、混合鹽及游離酸形式。
教示上述含磷鍵製備之代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第3,687,808號；第4,469,863號；第4,476,301號；第5,023,243號；第5,177,195號；第5,188,897號；第5,264,423號；第5,276,019號；第5,278,302號；第5,286,717號；第5,321,131號；第5,399,676號；第5,405,939號；第5,453,496號；第5,455,233號；第5,466,677號；第5,476,925號；第5,519,126號；第5,536,821號；第5,541,316號；第5,550,111號；第5,563,253號；第5,571,799號；第5,587,361號；第5,625,050號；第6,028,188號；第6,124,445號；第6,160,109號；第6,169,170號；第6,172,209號；第6,239,265號；第6,277,603號；第6,326,199號；第6,346,614號；第6,444,423號；第6,531,590號；第6,534,639號；第6,608,035號；第6,683,167號；第6,858,715號；第6,867,294號；第6,878,805號；第7,015,315號；第7,041,816號；第7,273,933號；第7,321,029號及美國專利RE39464，其各自以引用的方式併入本文中。
不包含磷原子之經修飾RNA主鏈具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵，或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成之主鏈。此等包括具有(N-嗎啉基)鍵(部分由核苷之糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫基、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫代甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基主鏈；含有烯烴之主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；及具有混合N、O、S及CH2組成部分之其他主鏈者。
教示上述寡核苷製備之代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第5,034,506號；第5,166,315號；第5,185,444號；第5,214,134號；第5,216,141號；第5,235,033號；第5,64,562號；第5,264,564號；第5,405,938號；第5,434,257號；第5,466,677號；第5,470,967號；第5,489,677號；第5,541,307號；第5,561,225號；第5,596,086號；第5,602,240號；第5,608,046號；第5,610,289號；第5,618,704號；第5,623,070號；第5,663,312號；第5,633,360號；第5,677,437號及第5,677,439號，其各自以引用的方式併入本文中。
在適於或預期用於iRNA中之其他RNA模擬物中，核苷酸單元之糖及核苷間鍵(亦即主鏈)置換為新基團。鹼基單元保持與適當核酸目標化合物雜交。一種此類寡聚化合物(已顯示具有極佳雜交特性之RNA模擬物)稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA之糖主鏈置換為含有醯胺之主鏈，詳言之胺基乙基甘胺酸主鏈。核鹼基保留且直接或間接結合至主鏈之醯胺部分的氮雜氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第5,539,082號；第5,714,331號及第5,719,262號，其各自以引用的方式併入本文中。PNA化合物之進一步教示可見於例如Nielsen等人，Science,1991,254,1497-1500中。
本發明特性化之一些實施例包括具有硫代磷酸酯主鏈之RNA及 具有雜原子主鏈之寡核苷，且特定言之上文提及之美國專利第5,489,677號之--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中原生磷酸二酯主鏈表示為--O--P--O--CH2--]，及上文提及之美國專利第5,602,240號之醯胺主鏈。在一些實施例中，本文特性化之RNA具有上文提及之美國專利第5,034,506號之(N-嗎啉基)主鏈結構。
經修飾RNA亦可含有一或多個經取代糖部分。本文特性化之iRNA(例如dsRNA)可在2'位置處包括以下中之一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。例示性適合修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m為1至約10。在其他實施例中，dsRNA在2'位置處包括以下中之一者：C1至C10低碳烷基、經取代低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、報導基團、嵌入劑、改良iRNA之藥物動力學特性之基團或改良iRNA之藥力學特性之基團及具有類似特性之其他取代基。在一些實施例中，修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即烷氧基-烷氧基。另一例示性修飾為2'-二甲基胺基氧基乙氧基，亦即O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱為2'-DMAOE，及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(在此項技術中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即2'-O--CH2--O--CH2- -N(CH2)2。
在其他實施例中，iRNA劑包含一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上)非環核苷酸(或核苷)。在某些實施例中，有義股或反義股或有義股及反義股兩者每股包括少於五個非環核苷酸(例如每股四個、三個、兩個或一個非環核苷酸)。一或多個非環核苷酸可存在於例如有義股或反義股或兩股之雙股區中；iRNA劑之有義股或反義股或兩股之5'端、3'端、5'及3'端兩者處。在一個實施例中，有義股或反義股或兩者之位置1至8處存在一或多個非環核苷酸。在一個實施例中，一或多個非環核苷酸存在於自反義股之5'端的反義股之位置4至10(例如位置6-8)處。在另一實施例中，一或多個非環核苷酸存在於iRNA劑之一個或兩個3'末端突出端處。
如本文所用之術語「非環核苷酸」或「非環核苷」係指具有非環糖，例如非環核糖的任何核苷酸或核苷。例示性非環核苷酸或核苷可包括核鹼基，例如天然存在或經修飾核鹼基(例如如本文所述之核鹼基)。在某些實施例中，核糖碳(C1、C2、C3、C4或C5)中任一者之間的鍵獨立地或組合地不存在於核苷酸中。在一個實施例中，核糖環之C2-C3碳之間的鍵不存在，例如非環2'-3'-斷-核苷酸單體。在其他實施例中，C1-C2、C3-C4或C4-C5之間的鍵不存在(例如1'-2'、3'-4'或4'-5'-斷核苷酸單體)。例示性非環核苷酸揭示於US 8,314,227中，其以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，非環核苷酸可包括US 8,314,227之圖1-圖2中之單體D-J中之任一者。在一個實施例中，非環核苷酸包括以下單體：
其中Base為核鹼基，例如天然存在或經修飾之核鹼基(例如如本文所述之核鹼基)。
在某些實施例中，非環核苷酸可例如藉由使非環核苷酸偶合至另一部分(尤其例如配位體(例如GalNAc、膽固醇配位體)、烷基、多元胺、糖、多肽)經修飾或衍生。
在其他實施例中，iRNA劑包括一或多個非環核苷酸及一或多個LNA(例如如本文所述之LNA)。舉例而言，一或多個非環核苷酸及/或一或多個LNA可存在於有義股、反義股或兩者中。一個股中非環核苷酸之數目可與相對股中LNA之數目相同或不同。在某些實施例中，有義股及/或反義股包含少於五個位於雙股區或3'-突出端中之LNA(例如四個、三個、兩個或一個LNA)。在其他實施例中，一個或兩個LNA位於有義股之雙股區或3'-突出端中。或者，或組合的，有義股及/或反義股包含少於五個在雙股區或3'-突出端中之非環核苷酸(例如四個、三個、兩個或一個非環核苷酸)。在一個實施例中，iRNA劑之有義股在有義股之3'-突出端中包含一個或兩個LNA，及在iRNA劑之反義股的雙股區中包含一個或兩個非環核苷酸(例如在反義股之5'端的位置4至10(例如位置6-8))。
在其他實施例中，iRNA劑中包括一或多個非環核苷酸(單獨或除了一或多個LNA之外)導致以下中之一或多者(或全部)：(i)脫靶作用降低；(ii)RNAi中之過客股參與減少；(iii)引導股對其目標mRNA之特異性提高；(iv)微RNA脫靶作用降低；(v)穩定性提高；或(vi)iRNA分子之抗分解性提高。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)及2'-氟(2'-F)。亦可在iRNA之RNA上的其他位置處，尤其3'末端核苷酸上或2'-5'鍵聯dsRNA中之糖之3'位置及5'末端核苷酸之5'位置處作出類似修飾。iRNA亦可具有糖模擬物，諸如環丁基 部分置換戊呋喃糖。教示此類經修飾糖結構之製備的代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第4,981,957號；第5,118,800號；第5,319,080號；第5,359,044號；第5,393,878號；第5,446,137號；第5,466,786號；第5,514,785號；第5,519,134號；第5,567,811號；第5,576,427號；第5,591,722號；第5,597,909號；第5,610,300號；第5,627,053號；第5,639,873號；第5,646,265號；第5,658,873號；第5,670,633號及第5,700,920號，其中某些為本申請案共同擁有，且其各自以引用的方式併入本文中。
iRNA亦可包括核鹼基(此項技術中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文所用，「未經修飾」或「天然」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾核鹼基包括其他合成及天然核鹼基，諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵基尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基anal、其他8-取代腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基(尤其5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤及7-去氮雜腺嘌呤及3-去氮雜鳥嘌呤及3-去氮雜腺嘌呤。其他核鹼基包括美國專利第3,687,808號中揭示者，Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.編，Wiley-VCH,2008中揭示者；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858頁-第859頁，Kroschwitz,J.L編，John Wiley & Sons,1990中揭示者；Englisch等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613揭示者及Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications，第289頁-第302頁，Crooke,S.T.及Lebleu,B.編，CRC Press,1993揭示者此等核鹼基中之某些尤其適用於提高本發明特性化之寡聚化合物的結合親和力。此等包括5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及0-6取代嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示使核酸雙螺旋體穩定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.及Lebleu,B.編，dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993，第276頁-第278頁)且為例示性鹼基取代，甚至更特定當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合時。
教示某些上述經修飾核鹼基以及其他經修飾核鹼基之製備的代表性美國專利包括(但不限於)上述美國專利第3,687,808號，以及美國專利第4,845,205號；第5,130,30號；第5,134,066號；第5,175,273號；第5,367,066號；第5,432,272號；第5,457,187號；第5,459,255號；第5,484,908號；第5,502,177號；第5,525,711號；第5,552,540號；第5,587,469號；第5,594,121號；第5,596,091號；第5,614,617號；第5,681,941號；第6,015,886號；第6,147,200號；第6,166,197號；第6,222,025號；第6,235,887號；第6,380,368號；第6,528,640號；第6,639,062號；第6,617,438號；第7,045,610號；第7,427,672號及第7,495,088號，其各自以引用之方式併入本文中，及美國專利第5,750,692號，其亦以引用之方式併入本文中。
iRNA之RNA亦可經經修飾以包括一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上)鎖核酸(LNA)(在本文中亦稱為「鎖核苷酸」)。在一個實施例中，鎖核酸為具有經修飾核糖部分之核苷酸，其中核糖部分包含額外橋連接，例如2'及4'碳。此結構將核糖有效「鎖定」為3'-內結構構形。向siRNA添加鎖核酸已顯示提高血清中 之siRNA穩定性，提高熱穩定性及降低脫靶作用(Elmen,J.等人，(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.等人，(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.等人，(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
教示鎖核酸之製備的代表性美國專利包括(但不限於)以下：美國專利第6,268,490號；第6,670,461號；第6,794,499號；第6,998,484號；第7,053,207號；第7,084,125號；第7,399,845號及第8,314,227號，其各自以全文引用的方式併入本文中。例示性LNA包括(但不限於)2',4'-C亞甲基雙環核苷酸(參見例如Wengel等人，國際PCT公開案第WO 00/66604號及第WO 99/14226號)。
在其他實施例中，iRNA劑包括一或多個(例如約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或10個以上)G-鉗核苷酸。G鉗核苷酸為經修飾胞嘧啶類似物，其中修飾賦予雙螺旋體內之互補鳥嘌呤的沃森-克里克及胡森面兩者以氫結合能力，參見例如Lin及Matteucci,1998,J.Am.Chem.Soc.,120,8531-8532。寡核苷酸內之單個G鉗類似物取代可導致實質上提高之螺旋熱穩定性及與互補寡核苷酸雜交時的錯配辨別。iRNA分子中之此類核苷酸的納入可導致對核酸目標、互補序列或模板股之親和力及特異性提高。
RNA分子端的潛在穩定修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二烷醯基-尿苷-3"-磷酸酯、反向鹼基dT(idT)及其他。此修飾之揭示內容可見於PCT公開案第WO 2011/005861號中。
iRNA基元
在一個實施例中，有義股序列可由式(I)表示： 5' nb-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' (I)其中：i及j各自獨立地為0或1；p及q各自獨立地為0-6；各Na獨立地表示包含0-25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同經修飾核苷酸；各Nb獨立地表示包含0-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；各np及nq獨立地表示突出端核苷酸；其中Nb及Y不具有相同修飾；及XXX、YYY及ZZZ各自獨立地表示一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之基元。YYY較佳為全部2'-F修飾核苷酸。
在一個實施例中，Na及/或Nb包含交替模式之修飾。
在一個實施例中，YYY基元存在於有義股之裂解位點處或裂解位點附近。舉例而言，當RNAi劑具有長度為17-23個核苷酸的雙螺旋區時，YYY基元可存在於有義股之裂解位點處或裂解位點附近(例如可存在於位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11,12或11、12、13處)，計數自5'端的第1個核苷酸開始；或計數視情況自5'端在雙螺旋區內之第1對核苷酸處開始。
在一個實施例中，i為1且j為0，或i為0且j為1，或i及j皆為1。有義股因此可由下式表示：5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib)；5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic)；或5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id)。
當有義股由式(Ib)表示時，Nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股表示為(Ic)時，Nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股表示為式(Id)時，各Nb獨立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。較佳地，Nb為0、1、2、3、4、5或6。各Na可獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y及Z中之每一者可彼此相同或不同。
在其他實施例中，i為0且j為0，且有義股可由下式表示：5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
當有義股由式(Ia)表示時，各Na獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
在一個實施例中，RNAi之反義股序列可由式(II)表示：5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)其中：k及l各自獨立地為0或1；p'及q'各自獨立地為0-6；各Na'獨立地表示包含0-25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同經修飾核苷酸；各Nb'獨立地表示包含0-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；各np'及nq'獨立地表示突出端核苷酸；其中Nb'及Y'不具有相同修飾；及X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之基元。
在一個實施例中，Na'及/或Nb'包含交替模式之修飾。
Y'Y'Y'基元存在於反義股之裂解位點處或裂解位點附近。舉例而言，當RNAi劑具有長度為17-23個核苷酸之雙螺旋區時，Y'Y'Y'基元可存在於反義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15處，計數自5'端的第1個核苷酸開始；或計數視情況自5'端在雙螺旋區內之第1對核苷酸處開始。Y'Y'Y'基元較佳存在於位置11、12、13處。
在一個實施例中，Y'Y'Y'基元為全部2'-OMe修飾核苷酸。
在一個實施例中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或k及l皆為1。
反義股因此可有下式表示：5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb)；5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc)；或5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np' 3' (IId)。
當反義股由式(IIb)表示時，Nb'表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na'獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為(IIc)時，Nb'表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na'獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(IId)時，各Nb'獨立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na'獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。Nb較佳為0、1、2、3、4、5或6。
在其他實施例中，k為0且l為0，且反義股可由下式表示：5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 3' (Ia)。
當反義股表示為式(IIa)時，各Na'獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
X'、Y'及Z'中之每一者可彼此相同或不同。
有義股及反義股之各核苷酸可經LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羥基或2'-氟獨立地修飾。舉例而言，有義股及反義股之各核苷酸經2'-O-甲基或2'-氟獨立地修飾。各X、Y、Z、X'、Y'及Z'尤其可表示2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾。
在一個實施例中，當雙螺旋區為21nt時，RNAi劑之有義股可含有在該股之9、10及11位置處存在的YYY基元，計數自5'端的第1個核苷酸開始；或計數視情況自5'端在雙螺旋區內之第1對核苷酸處開始；且Y表示2'-F修飾。有義股可在雙螺旋區之相對端另外含有XXX基元或ZZZ基元作為翼形修飾；且XXX及ZZZ各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
在一個實施例中，反義股可含有在該股之11、12、13位置處存在的Y'Y'Y'基元，計數自5'端的第1個核苷酸開始，或計數視情況自5'端在雙螺旋區內之第1對核苷酸處開始；且Y'表示2'-O-甲基修飾。反義股可在雙螺旋區之相對端額外含有X'X'X'基元或Z'Z'Z'基元作為翼形修飾；且X'X'X'及Z'Z'Z'各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中之任一者表示的有義股分別與由式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(IId)中之任一者表示的反義股形成雙螺旋體。
因此，用於本發明方法之RNAi劑可包含有義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，RNAi雙螺旋體由式(III)表示：有義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5'(III)其中：i、j、k及l各自獨立地為0或1； p、p'、q及q'各自獨立地為0-6；各Na及Na '獨立地表示包含0-25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個不同經修飾核苷酸；各Nb及Nb '獨立地表示包含0-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；其中各np'、np、nq'及nq，其各自可存在或可不存在，獨立地表示突出端核苷酸；及XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾的基元。
在一個實施例中，i為0且j為0；或i為1且j為0；或i為0且j為1；或i及j皆為0；或i及j皆為1。在另一實施例中，k為0且l為0；或k為1且l為0；k為0且l為1；或k及l皆為0；或k及l皆為1。
形成RNAi雙螺旋體之有義股及反義股之例示性組合包括下式：5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3' 3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Na 'nq ' 5'(IIIa)
5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3' 3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na 'nq ' 5'(IIIb)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3' 3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Na '-nq ' 5'(IIIc)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3' 3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na-nq ' 5'(IIId)
當RNAi劑由式(IIIa)表示時，各Na獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi劑由式(IIIb)表示時，各Nb獨立地表示包含1-10、1-7、1-5或1-4個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi劑表示為式(IIIc)時，各Nb、Nb'獨立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi劑表示為式(IIId)時，各Nb、Nb'獨立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na、Na'獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na、Na'、Nb及Nb'獨立地包含交替模式之修飾。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)中X、Y及Z中之每一者可彼此相同或不同。
當RNAi劑由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示時，Y核苷酸中之至少一者可與Y'核苷酸中之一者形成鹼基對。或者，Y核苷酸中之至少兩者與相應Y'核苷酸形成鹼基對；或全部三個Y核苷酸均與相應Y'核苷酸形成鹼基對。
當RNAi劑由式(IIIb)或(IIId)表示時，Z核苷酸中之至少一者可與Z'核苷酸中之一者形成鹼基對。或者，Z核苷酸中之至少兩者與相應Z'核苷酸形成鹼基對；或全部三個Z核苷酸均與相應Z'核苷酸形成鹼基對。
當RNAi劑表示為式(IIIc)或(IIId)時，X核苷酸中之至少一者可與X'核苷酸中之一者形成鹼基對。或者，X核苷酸中之至少兩者與相應X'核苷酸形成鹼基對；或全部三個X核苷酸均與相應X'核苷酸形成鹼基對。
在一個實施例中，Y核苷酸上之修飾與Y'核苷酸上之修飾不同，Z核苷酸上之修飾與Z'核苷酸上之修飾不同及/或X核苷酸上之修飾與X'核苷酸上之修飾不同。
在一個實施例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾。在另一實施例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾且np'>0且至少一個np'經硫代磷酸酯鍵連接至鄰近核苷酸。在另一實施例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0且至少一個np'經硫代磷酸酯鍵連接至鄰近核苷酸，且有義股結合至一或多個經二價或三價分支鏈連接子連接的GalNAc衍生物。在另一實施例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0且至少一個np'經硫代磷酸酯鍵連接至鄰近核苷酸，有義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵，且有義股結合至一或多個經二價或三價分支鏈連接子連接的GalNAc衍生物。
在一個實施例中，當RNAi劑由式(IIIa)表示時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0且至少一個np'經硫代磷酸酯鍵連接至鄰近核苷酸，有義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵，且有義股結合至一或多個經二價或三價分支鏈連接子連接的GalNAc衍生物。
在一個實施例中，RNAi劑為含有至少兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙螺旋體的多聚體，其中該雙螺旋體藉由連接子連接。連接子可為可裂解或不可裂解的。視情況而言，多聚體進一步包含配位體。雙螺旋體各自可靶向相同基因或兩個不同基因；或雙螺旋體各自可靶向同一基因的兩個不同目標位置。
在一個實施例中，RNAi劑為含有三個、四個、五個、六個或六個以上由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙螺旋體之多聚體，其中雙螺旋體藉由連接子連接。連接子可為可裂解或不可裂解 的。視情況而言，多聚體進一步包含配位體。雙螺旋體各自可靶向相同基因或兩個不同基因；或雙螺旋體各自可靶向同一基因的兩個不同目標位置。
在一個實施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之兩個RNAi劑在5'端彼此連接，且3'端中之一或兩者視情況結合至一個配位體。各試劑可靶向相同基因或兩個不同基因；或各試劑可靶向同一基因的兩個不同目標位置。
iRNA結合物
本文揭示之iRNA劑可呈結合物形式。結合物可在iRNA分子中之任何適合位置處連接，例如有義股或反義股之3'端或5'端。結合物視情況經連接子連接。
在一些實施例中，本文所述之iRNA劑化學上連接至一或多個配位體、部分或結合物，其可例如藉由影響(例如提高)iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝入而賦予官能性。此類部分包括(但不限於)脂質部分，諸如膽固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556)、膽酸(Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538)、脂族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75：49-54)、磷脂，例如1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-磷酸二-十六烷基-rac-甘油酯或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-磷酸三乙銨(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)、多元胺或聚乙二醇鏈 (Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969-973)或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)或十八烷基胺或己基胺基-羰氧基膽固醇基部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
在一個實施例中，配位體改變其併入之iRNA劑的分佈、靶向或壽命。在一些實施例中，配位體提供針對所選目標(例如分子、細胞或細胞類型；區室，例如細胞或器官區室；身體之組織、器官或區)相較於例如不存在此類配位體之物種提高之親和力。典型配位體將不參與雙螺旋核酸中之雙螺旋配對。
配位體可包括天然存在之物質，諸如蛋白質(例如人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如聚葡萄糖、普魯蘭(pullulan)、幾丁質、聚葡萄胺糖、菊糖、環糊精或玻尿酸)；或脂質。配位體亦可為重組或合成分子，諸如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之實例包括聚胺基酸為聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-順丁烯二酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-順丁烯二酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪。多元胺之實例包括：聚乙烯亞胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精脒、多元胺、偽肽-多元胺、肽模擬物多元胺、樹狀體多元胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、多元胺之四級鹽或α螺旋肽。
配位體亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質(例如抗體)，其結合至特定細胞類型，諸如腎臟細胞。靶向基團可為促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、 界面活性劑蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺多價甘露糖、多價海藻糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸鹽、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸、脂質、膽固醇、類固醇、膽酸、葉酸、維生素B12、生物素或RGD肽或RGD肽模擬物。
在一些實施例中，配位體為包含一或多種N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物之GalNAc配位體。在一些實施例中，GalNAc配位體用於使iRNA靶向肝臟(例如肝細胞)。GalNAc配位體之額外描述提供於題為碳水化合物結合物之章節中。
配位體之其他實例包括染料、嵌入劑(例如吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素、絲裂黴素C(mitomycin C))、卟啉(TPPC4、德賽卟啉(texaphyrin)、賽卟啉(Sapphyrin))、多環芳族烴(例如吩嗪、二氫吩嗪)、人工核酸內切酶(例如EDTA)、親脂性分子，例如膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、四異戊二烯基氧基己基、十六烷基甘油、冰片(borneol)、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡噁嗪)及肽結合物(例如觸足肽、Tat肽)、烷基化劑、磷酸酯、胺基、巰基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代烷基、放射性標記之標記物、酶、半抗原(例如生物素)、輸送/吸收促進劑(例如阿司匹林(aspirin)、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇、吖啶-咪唑結合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配位體可為蛋白質，例如醣蛋白；或肽，例如對共配位體具有特異性親和力之分子；或抗體，例如結合至特定細胞類型(諸如癌細胞、內皮細胞或骨骼細胞)之抗體。配位體亦可包括激素及激素受 體。其亦可包括非肽物質，諸如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺多價甘露糖或多價海藻糖。配位體可為例如脂多醣、p38 MAP激酶之活化劑或NF-κB之活化劑。
配位體可為例如藥物之物質，其可例如藉由破壞細胞之細胞骨架，例如藉由破壞細胞之微管、微絲及/或中等長絲提高iRNA劑向細胞中之攝入。藥物可為例如塔克酮(taxon)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、細胞遲緩素、諾考達唑(nocodazole)、傑普肯立德(japlakinolide)、拉春庫林A(latrunculin A)、毒傘素(phalloidin)、斯文霍立德A(swinholide A)、引達喏新(indanocine)或美瑟文(myoservin)。
在一些實施例中，連接至如本文所述之iRNA的配位體用作藥物動力學調節劑(PK調節劑)。PK調節劑包括親脂體、膽酸、類固醇、磷脂類似物、肽、蛋白質黏合劑、PEG、維生素等。例示性PK調節劑包括(但不限於)膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、維生素E、生物素等。包含許多硫代磷酸酯鍵之寡核苷酸亦已知結合於血清蛋白質，因此主鏈中包含多個硫代磷酸酯鍵之短寡核苷酸(例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸)亦為本發明之配位體(例如作為PK調節配位體)。此外，結合血清組分(例如血清蛋白質)之適體亦適用作本文所述之實施例中的PK調節配位體。
本發明之配位體結合之寡核苷酸可藉由使用攜帶側位反應性官能基之寡核苷酸合成，該官能基諸如衍生自鍵聯分子連接至寡核苷酸(下文所述)。此反應性寡核苷酸可與市售配位體、經合成攜帶多種保護基中之任一者的配位體或連接有鍵聯部分之配位體直接反應。
本發明之結合物中所用之寡核苷酸可藉由熟知固相合成技術方便地且常規地製備。用於此類合成之設備由若干供應商出售，包括例 如Applied Biosystems(Foster City,Calif.)。可另外或替代地採用此項技術中已知用於此類合成之任何其他方式。亦已知使用類似技術製備其他寡核苷酸，諸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物。
在本發明之配位體結合之寡核苷酸及攜帶配位體分子之序列特異性鍵聯之核苷中，寡核苷酸及寡核苷可利用標準核苷酸或核苷前驅物，或已攜帶鍵聯部分之核苷酸或核苷結合物前驅物、已攜帶配位體分子之配位體-核苷酸或核苷-結合物前驅物，或攜帶非核苷配位體之構築嵌段裝配至適合DNA合成器上。
當使用已攜帶鍵聯部分之核苷酸-結合物前驅物時，通常完成序列特異性鍵聯之核苷的合成，且配位體分子接著與鍵聯部分反應形成配位體結合寡核苷酸。在一些實施例中，藉由自動合成器使用配位體-核苷結合物衍生之胺基磷酸酯(除了市售且常規用於寡核苷酸合成之標準胺基磷酸酯及非標準胺基磷酸酯之外)合成本發明之寡核苷酸或鍵聯核苷。
脂質結合物
在一個實施例中，配位體為脂質或基於脂質之分子。此類脂質或基於脂質之分子通常可結合血清蛋白質，諸如人類血清白蛋白(HSA)。HSA結合配位體允許將結合物分佈於目標組織。舉例而言，目標組織可為肝臟，包括肝臟之實質細胞。可結合HSA之其他分子亦可用作配位體。舉例而言，可使用萘普生(neproxin)或阿司匹林。脂質或基於脂質之配位體可(a)提高結合物之耐分解性，(b)提高目標細胞或細胞膜中之靶向或輸送，及/或(c)可用於調整與血清蛋白質(例如HSA)之結合。
基於脂質之配位體可用於調節(例如控制(例如抑制))結合物與目標組織之結合。舉例而言，更牢固結合至HSA之脂質或基於脂質之配位體將較不可能靶向腎臟且因此較不可能自身體清除。較不牢固結合 至HSA之脂質或基於脂質之配位體可用於使結合物靶向腎臟。
在一個實施例中，基於脂質之配位體結合HSA。舉例而言，配位體可以充分親和力結合HSA使得結合物至非腎臟組織之分佈得以提高。然而，親和力通常並非如此強，使得HSA-配位體結合不能顛倒。
在另一實施例中，基於脂質之配位體與HSA之結合較弱或根本不結合，使得結合物至腎臟之分佈提高。靶向腎臟細胞之其他部分亦可用於代替基於脂質之配位體或除了基於脂質之配位體之外使用。
在另一態樣中，配位體為例如維生素之部分，其經例如增生細胞之目標細胞吸收。其尤其適用於治療特徵在於例如惡性或非惡性類型，例如癌細胞之非所需細胞增殖之病症。例示性維生素包括維生素A、E及K。其他例示性維生素包括B族維生素，例如葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛或癌細胞吸收之其他維生素或營養物。亦包括HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
細胞穿透劑
在另一態樣中，配位體為細胞穿透劑，諸如螺旋細胞穿透劑。在一個實施例中，試劑為兩性的。例示性試劑為肽，諸如tat或觸足肽。若試劑為肽，則其可經修飾，包括肽模擬物、反演體、非肽或偽肽鍵，及使用D-胺基酸。螺旋劑通常為α-螺旋劑，且可具有親脂性及疏脂性狀態。
配位體可為肽或肽模擬物。肽模擬物(在本文中亦稱為寡肽模擬物)為能夠摺疊成與天然肽類似之經界定三維結構的分子。肽及肽模擬物與iRNA劑之連接可諸如藉由提高細胞識別及吸收影響iRNA之藥物動力學分佈。肽或肽模擬物部分長度可為約5-50個胺基酸，例如長度為約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。
肽或肽模擬物可為例如細胞穿透肽、陽離子肽、兩性肽或疏水 性肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe組成)。肽部分可為樹枝狀肽、限定肽或交聯肽。在另一替代中，肽部分可包括疏水性膜易位序列(MTS)。例示性含有疏水性MTS之肽為具有胺基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：685)之RFGF。含有疏水性MTS之RFGF類似物(例如胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：686))亦可為靶向部分。肽部分可為「傳遞」肽，其可攜帶跨越細胞膜之極性大分子(包括肽、寡核苷酸及蛋白質)。舉例而言，已發現來自HIV Tat蛋白質(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：687))及果蠅觸足蛋白質(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：688))之序列能夠用作傳遞肽。肽或肽模擬物可藉由隨機DNA序列編碼，例如自噬菌體呈現庫或一珠粒-一化合物(OBOC)組合庫鑑別之肽(Lam等人，Nature,354：82-84,1991)。通常，經併入之單體單元繫栓至dsRNA劑之肽或肽模擬物為細胞靶向肽，諸如精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)-肽或RGD模擬物。肽部分之長度可在約5個胺基酸至約40個胺基酸的範圍內。肽部分可具有結構修飾，從而提高穩定性或引導構形特性。可採用下文所述之結構修飾中之任一者。
用於本發明之組合物及方法中的RGD肽可為直鏈或環狀，且可經修飾(例如糖基化或甲基化)以促進靶向特定組織。含有RGD之肽及肽模擬物可包括D-胺基酸，以及合成RGD模擬物。除了RGD之外，可使用靶向整合素配位體之其他部分。此配位體之較佳結合物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD肽部分可用於靶向特定細胞類型，例如腫瘤細胞，諸如內皮腫瘤細胞或乳癌腫瘤細胞(Zitzmann等人，Cancer Res.,62：5139-43,2002)。RGD肽可促進dsRNA劑靶向多種其他組織之腫瘤，包括肺、腎臟、脾臟或肝臟(Aoki等人，Cancer Gene Therapy 8：783-787,2001)。通常，RGD肽將促進iRNA劑靶向腎臟。RGD肽可為直鏈或環 狀，且可經修飾(例如糖基化或甲基化)以促進靶向至特定組織。舉例而言，糖基化RGD肽可將iRNA劑傳遞至表現αVβ3之腫瘤細胞(Haubner等人，Jour.Nucl.Med.,42：326-336,2001)。
「細胞穿透肽」能夠穿透細胞，例如微生物細胞，諸如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞，諸如人類細胞。微生物細胞穿透肽可為例如α-螺旋直鏈肽(例如LL-37或Ceropin P1)、含有二硫鍵之肽(例如α-防禦素、β-防禦素或牛抗菌肽(bactenecin))，或僅含有一個或兩個主要胺基酸之肽(例如PR-39或肽抗生素(indolicidin))。細胞穿透肽亦可包括核定位信號(NLS)。舉例而言，細胞穿透肽可為二分兩性肽(諸如MPG)，其源自HIV-1 gp41之融合肽結構域及SV40大T抗原之NLS(Simeoni等人，Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
碳水化合物結合物
在本發明之組合物及方法的一些實施例中，iRNA寡核苷酸進一步包含碳水化合物。如本文所述，碳水化合物結合之iRNA有利於活體內傳遞核酸以及適於活體內治療用途之組合物。如本文所用，「碳水化合物」係指為由一或多個具有至少6個碳原子之單醣單元(其可為直鏈、分支鏈或環狀)與鍵結於各碳原子之氧、氮或硫原子組成碳水化合物本身之化合物；或具有由一或多個各自具有至少6個碳原子之單醣單元(其可為直鏈、分支鏈或環狀)與鍵結於各碳原子之氧、氮或硫原子組成碳水化合物部分作為其一部分之化合物。代表性碳水化合物包括糖(含有約4、5、6、7、8或9個單醣單元之單糖、二糖、三糖及寡糖)及多糖，諸如澱粉、肝糖、纖維素及多醣膠。特定單醣包括C5及C5以上(例如C5、C6、C7或C8)糖；二醣及三醣，包括具有兩個或三個單醣單元之糖(例如C5、C6、C7或C8)。
在一個實施例中，碳水化合物結合物包含單醣。在一個實施例中，單醣為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。包含一或多種N-乙醯基半乳 糖胺(GalNAc)衍生物之GalNAc結合物描述於，例如美國專利第8,106,022號，其全部內容以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，GalNAc結合物用作使iRNA該特定細胞之配位體。在一些實施例中，GalNAc結合物例如藉由用做肝臟細胞(例如肝細胞)之去唾液酸醣蛋白受體之配位體使iRNA靶向肝臟細胞。
在一些實施例中，碳水化合物結合物包含一或多種GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可經連接子，例如二價或三價分支鏈連接子連接。在一些實施例中，GalNAc結合物結合至有義股之3'端。在一些實施例中，GalNAc結合物經連接子(例如如本文所述之連接子)結合至iRNA劑(例如有義股之3'端)。
在一些實施例中，GalNAc結合物為
在一些實施例中，RNAi劑經如以下示意圖所示之連接子連接至碳水化合物結合物，其中X為O或S
在一些實施例中，RNAi劑結合至如表1所定義及下文所示之L96
在一些實施例中，用於本發明之組合物及方法中之碳水化合物結合物係選自由以下組成之群：
用於本文所述之實施例中之另一代表性碳水化合物結合物包括(但不限於)
(式XXIII)，當X或Y中之一者為寡核苷酸時，另一者為氫。
在一些實施例中，碳水化合物結合物進一步包含如上文所述之一或多種額外配位體，諸如(但不限於)PK調節劑及/或細胞穿透肽。
在一個實施例中，本發明之iRNA經連接子結合至碳水化合物。具有本發明之組合物及方法之連接子的iRNA碳水化合物結合物之非限制性實例包括(但不限於) (式XXX)，當X或Y中之一者為寡核苷酸時，另一者為氫。
連接子
在一些實施例中，本文所述之結合物或配位體可使用可裂解或不可裂解之多種連接子連接至iRNA寡核苷酸。
術語「連接子」或「連接基團」意謂連接化合物之兩個部分，例如共價連接化合物之兩個部分的有機部分。連接子通常包含直接鍵或諸如氧或硫之原子、諸如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH之單元或諸如(但不限於)以下之原子鏈：經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，該一或多個亞甲基可間雜有O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取 代或未經取代之雜環或經其封端；其中R8為氫、醯基、脂族或經取代脂族。在一個實施例中，連接子為約1-24個原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18個原子、7-17、8-17、6-16、7-16或8-16個原子。
在一個實施例中，本發明之dsRNA結合至選自式(XXXI)-(XXXIV)中之任一者中所示之結構之群的二價或三價分支鏈連接子： 其中：q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C每次出現時獨立地表示0-20且其中重複單元可相同或不同；P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C每次出現時各自獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C每次出現時獨立地為不存在、伸烷基、經取代之伸烷基，其中一或多個亞甲基可間雜有O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')=C(R")、C≡C或C(O)中之一或多者或經其封端； R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出現時各自獨立地為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、 NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、 或雜環 基；L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示配位體；亦即每次出現時各自獨立地表示單醣(諸如GalNAc)、雙醣、三醣、四醣、寡醣或多醣；且Ra為H或胺基酸側鏈。三價結合GalNAc衍生物尤其適於與RNAi劑一起用於抑制目標基因之表現，諸如具有式(XXXV)者： 其中L5A、L5B及L5C表示單醣，諸如GalNAc衍生物。
適合結合GalNAc衍生物之二價及三價分支鏈連接子之實例包括(但不限於)上述式II、VII、XI、X及XIII之結構。
可裂解連接基團為在細胞外部足夠穩定，但進入目標細胞時裂解以釋放該連接子固持在一起之兩個部分的連接基團。在一較佳實施例中，可裂解連接基團在目標細胞中或在第一參考條件(其可例如經選擇用於模擬或表示細胞內條件)下比在個體血液中或在第二參考條件(其可例如經選擇用於模擬或表示血液或血清中存在之條件)下裂解快至少約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或90倍以上，或快至少約100倍。
可裂解連接基團對裂解劑敏感，例如pH、氧化還原電位或分解分子之存在。一般而言，裂解劑在細胞內部比在血清或血液中更普遍或以更高含量或活性存在。此類分解劑之實例包括：選擇用於特定受質或不具有受質特異性之氧化還原劑，包括例如細胞中存在之氧化或還原酶類或還原劑，諸如硫醇，其可藉由還原分解氧化還原可裂解連接基團；酯酶；可建立酸性環境之內體或試劑，例如產生5或小於5之pH值者；可藉由充當通用酸、肽酶(其可為受質特異性的)及磷酸酶來水解或分解酸可裂解連接基團之酶類。
可裂解鍵聯基團(諸如二硫鍵)可對pH敏感。人類血清之pH為7.4，而平均細胞內pH略低，在約7.1-7.3範圍內。內體具有更為酸性之pH，在5.5-6.0範圍內，且溶酶體具有甚至更酸性之pH，為約5.0。一些連接子將具有在較佳pH下裂解之可裂解連接基團，藉此自細胞內部之配位體釋放陽離子脂質或釋放至細胞之所要區室中。
連接子可包括可由特定酶裂解之可裂解連接基團。併入連接子中之可裂解連接基團之類型可視待靶向細胞而定。舉例而言，靶向肝臟之配位體可經包括酯基之連接子連接至陽離子脂質。肝臟細胞富含酯酶，且因此連接子在肝臟細胞中將比在非富含酯酶之細胞類型中更有效地裂解。富含酯酶之其他細胞類型包括肺、腎皮質及睾丸之細胞。
當靶向富含肽酶之細胞類型(諸如肝臟細胞及滑膜細胞)時，可使用含有肽鍵之連接子。
一般而言，可藉由測試分解劑(或條件)裂解候選連接基團之能力來評估候選可裂解連接基團之適用性。將亦需要亦測試候選可裂解連接基團在血液中或與其他非目標組織接觸時的抗裂解能力。因此，可判斷第一及第二條件之間的相對裂解敏感性，其中選擇第一條件以指示目標細胞中之裂解且選擇第二條件以指示其他組織或生物流體(例 如血液或血清)中之裂解。評估可在無細胞系統、細胞、細胞培養物、器官或組織培養物或整個動物中進行。其可適用於在無細胞或培養條件中進行最初評估及藉由在整個動物中進一步評估來確認。在較佳實施例中，適用候選化合物在細胞中(或在選擇用於模擬細胞內條件之活體外條件下)比在血液或血清中(或在選擇用於模擬胞外條件之活體外條件下)裂解快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。
氧化還原可裂解連接基團
在一個實施例中，可裂解連接基團為在還原或氧化時裂解之氧化還原可裂解連接基團。還原可裂解連接基團之實例為二硫化物連接基團(-S-S-)。為了判斷候選可裂解連接基團是否為適合「還原可裂解連接基團」或例如是否適於與特定iRNA部分及特定靶向劑一起使用，可參看本文所述之方法。舉例而言，使用此項技術中已知模擬細胞(例如目標細胞)中將觀測到的裂解速率之試劑，藉由與二硫蘇糖醇(DTT)或其他還原劑一起培育評估候選物。候選物亦可在選擇用於模擬血液或血清條件之條件下評估。在一個中，候選化合物在血液中斷裂至多約10%。在其他實施例中，適用候選化合物在細胞中(或在選擇用於模擬細胞內條件之活體外條件下)比在血液或血清中(或在選擇用於模擬胞外條件之活體外條件下)分解快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。候選化合物之裂解速率可使用標準酶動力學分析法在選擇用於模擬細胞內介質之條件下測定且與選擇用於模擬胞外介質之條件比較。
基於磷酸酯基之可裂解連接基團
在另一實施例中，可裂解連接子包含基於磷酸酯基之可裂解連接基團。基於磷酸酯基之可裂解連接基團藉由分解或水解磷酸酯基之試劑裂解。細胞中裂解磷酸酯基之試劑的實例為細胞中之酶類，諸如 磷酸酶。基於磷酸酯基之連接基團之實例為-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。較佳實施例為-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。較佳實施例為-O-P(O)(OH)-O-。此等候選物可使用與上文所述類似之方法評估。
酸可裂解連接基團
在另一實施例中，可裂解連接子包含酸可裂解連接基團。酸可裂解連接基團為在酸性條件下裂解之連接基團。在較佳實施例中，酸可裂解連接基團在pH為約6.5或6.5以下(例如約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或5.0以下)之酸性環境中裂解或藉由可用作通用酸之酶類的試劑裂解。在一種細胞中，特定低pH細胞器(諸如內體及溶酶體)可提供用於酸可裂解連接基團之裂解環境。酸可裂解連接基團之實例包括(但不限於)腙、酯及胺基酸之酯。酸可裂解基團可具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。當碳連接至酯(烷氧基)之氧時，較佳實施例為芳基、經取代之烷基或三級烷基，諸如二甲基戊基或第三丁基。此等候選物可使用與上文所述類似之方法評估。
基於酯之可裂解連接基團
在另一實施例中，可裂解連接子包含基於酯之可裂解連接基團。基於酯之可裂解連接基團藉由細胞中之諸如酯酶及醯胺酶的酶類裂解。基於酯之可裂解連接基團的實例包括(但不限於)伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯。酯可裂解連接基團具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此 等候選物可使用與上文所述類似之方法評估。
基於肽之可裂解連接基團
在另一實施例中，可裂解連接子包含基於肽之可裂解連接基團。基於肽之可裂解連接基團藉由細胞中之諸如肽酶及蛋白酶的酶類裂解。基於肽之可裂解連接基團為胺基酸之間形成以獲得寡肽(例如二肽、三肽等)及多肽的肽鍵。基於肽之可裂解基團不包含醯胺基(-C(O)NH-)。醯胺基可在任何伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵為胺基酸之間形成以獲得肽及蛋白質的特定類型之醯胺鍵。基於肽之裂解基團一般限於胺基酸之間形成以產生肽及蛋白質的肽鍵(亦即醯胺鍵)且不包括整個醯胺官能基。基於肽之可裂解連接基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA及RB為兩個相鄰胺基酸之R基團。此等候選物可使用與上文所述類似之方法評估。教示RNA結合物之製備的代表性美國專利包括(但不限於)美國專利第4,828,979號；第4,948,882號；第5,218,105號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730號；第5,552,538號；第5,578,717,5,580,731號；第5,591,584號；第5,109,124號；第5,118,802號；第5,138,045號；第5,414,077號；第5,486,603號；第5,512,439號；第5,578,718號；第5,608,046號；第4,587,044號；第4,605,735號；第4,667,025號；第4,762,779號；第4,789,737號；第4,824,941號；第4,835,263號；第4,876,335號；第4,904,582號；第4,958,013號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,245,022號；第5,254,469號；第5,258,506號；第5,262,536號；第5,272,250號；第5,292,873號；第5,317,098號；第5,371,241號；第5,391,723號；第5,416,203號；第5,451,463號；第5,510,475號；第5,512,667號；第5,514,785號；第5,565,552號；第5,567,810號；第5,574,142號；第5,585,481號；第5,587,371號；第 5,595,726號；第5,597,696號；第5,599,923號；第5,599,928號及第5,688,941號；第6,294,664號；第6,320,017號；第6,576,752號；第6,783,931號；第6,900,297號；第7,037,646號；第8,106,022號，其各自之全部內容以引用的方式併入本文中。
並非必需既定化合物中之所有位置都均勻修飾，且實際上一種以上前述修飾可併入單個化合物中或甚至iRNA內之單個核苷處。本發明亦包括為嵌合化合物之iRNA化合物。
在本發明之情形中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合體」為含有兩個或兩個以上化學上獨特區之iRNA化合物(例如dsRNA)，其各自由至少一個單體單元(亦即在dsRNA化合物之情形中的核苷酸)製成。此等iRNA通常含有RNA經修飾之至少一個區以賦予iRNA提高之抗核酸酶分解性、提高之細胞攝入及/或提高之對目標核酸的結合親和力。iRNA之額外區可用作能夠裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜交之酶類的受質。舉例而言，RNase H為細胞核酸內切酶，其裂解RNA：DNA雙螺旋體之RNA股。因此，RNase H之活化導致RNA目標裂解，藉此大大提高iRNA抑制基因表現之效率。因此，當使用嵌合dsRNA時，通常可使用較短iRNA獲得與雜交至相通目標區之硫代磷酸酯去氧dsRNA相當之結果。RNA目標之裂解可藉由凝膠電泳，且必要時此項技術中已知之相關核酸雜化技術常規偵測。
在某些情況下，iRNA之RNA可經非配位體基團修飾。許多非配位體分子已結合至iRNA以提高iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝入，且進行此類結合之程序在科學文獻中可獲得。此類非配位體部分具有所包括之脂質部分，諸如膽固醇(Kubo,T.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4：1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人， Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.,1991,10：111；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75：49)、磷脂，例如1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-磷酸二-十六烷基-rac-甘油酯或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-磷酸三乙銨(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、多元胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969)或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、棕櫚基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)或十八烷基胺或己基胺基-羰氧基膽固醇基部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。上文已列出教示此類RNA結合物之製備的代表性美國專利。典型結合方案涉及在序列之一或多個位置處攜帶胺基連接子之RNA的合成。胺基接著使用適當偶合或活化試劑與所結合之分子反應。結合反應可在溶液狀態中使用仍結合於固體支撐物之RNA進行或在RNA裂解後進行。藉由HPLC進行之RNA結合物之純化通常獲得純結合物。
iRNA傳遞
iRNA向有需要之個體的傳遞可以多種不同方法實現。活體內傳遞可藉由向個體投與包含iRNA(例如dsRNA)之組合物直接進行。或者，傳遞可藉由投與一或多種編碼及引導iRNA表現之載體間接進行。此等替代方式在下文中進一步論述。
直接傳遞
一般而言，傳遞核酸分子之任何方法可改適以與iRNA一起使用(參見例如Akhtar S.及Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144 及WO94/02595，其以全文引用的方式併入本文中)。然而，為了活體內成功傳遞iRNA分子存在三個需要考慮的重要因素：(a)傳遞分子之生物穩定性，(2)預防非特異性作用，及(3)傳遞分子於目標組織中之積累。iRNA之非特異性作用可藉由局部投與，例如藉由直接注射或植入至組織(作為非限制性實例，腫瘤)或表面投與製劑而降至最低。向治療部位局部投與使試劑之局部濃度最大，限制試劑暴露於可能受試劑損傷或可能分解試劑之全身組織，及使待投與之iRNA分子的總劑量較低。若干研究已顯示當局部投與iRNA時成功阻斷基因產物之基因表現。舉例而言，藉由在食蟹獼猴中之玻璃體內注射(Tolentino,MJ等人(2004)Retina 24：132-138)及小鼠中之視網膜下注射(Reich,SJ.等人，(2003)Mol.Vis.9：210-216)眼內傳遞VEGF dsRNA皆顯示預防年齡相關之黃斑變性實驗模型中新血管生成。此外，在小鼠中直接瘤內注射dsRNA減少腫瘤體積(Pille,J.等人，(2005)Mol.Ther.11：267-274)且可延長荷瘤小鼠存活時間(Kim,WJ.等人，(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li,S.等人，(2007)Mol.Ther.15：515-523)。RNA干擾亦已顯示藉由直接注射成功局部傳遞至CNS(Dorn,G.等人，(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.等人，(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.等人，(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.等人，(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.等人，(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)及藉由鼻內投與傳遞至肺部(Howard,KA.等人，(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang,X.等人，(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko,V.等人，(2005)Nat.Med.11：50-55)。對於全身性投與iRNA治療疾病，RNA可經修飾或使用藥物傳遞系統傳遞；兩種方法皆用於防止活體內內切及外切核酸酶快速分解dsRNA。
RNA之修飾或醫藥載劑亦可允許使iRNA組合物靶向目標組織及 避免非所要脫靶作用。iRNA分子可藉由化學結合至其他基團(例如如本文所述之脂質或碳水化合物基團)經修飾。此類結合物可用於使iRNA靶向特定細胞，例如肝臟細胞，例如肝細胞。舉例而言，GalNAc結合物或脂質(例如LNP)調配物可用於使iRNA靶向特定細胞，例如肝臟細胞，例如肝細胞。
諸如膽固醇之親脂性基團提高細胞攝入及防止分解。舉例而言，針對結合至親脂性膽固醇部分之ApoB的iRNA全身性注射至小鼠且在肝臟及空腸中皆導致阻斷apoB mRNA基因表現(Soutschek,J.等人，(2004)Nature 432：173-178)。iRNA結合至適體已顯示在前列腺癌小鼠模型中抑制腫瘤生長及介導腫瘤消退(McNamara,JO.等人，(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。在一替代實施例中，iRNA可使用諸如奈米粒子、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體或陽離子傳遞系統之藥物傳遞系統傳遞。帶正電陽離子傳遞系統促進iRNA分子(帶負電)之結合且亦提高帶負電細胞膜處之相互作用以允許細胞有效攝入iRNA。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可結合於iRNA或誘導形成包住iRNA之小泡或微胞(參見例如Kim SH.等人，(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。形成小泡或微胞進一步防止全身性投與時iRNA分解。製備及投與陽離子-iRNA錯合物之方法完全在熟習此項技術者之能力範圍內(參見例如Sorensen,DR.等人，(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.等人，(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS等人(2007)J.Hypertens.25：197-205，其以全文引用的方式併入本文中)。適用於全身傳遞iRNA之藥物傳遞系統之一些非限制性實例包括DOTAP(Sorensen,DR.等人，(2003)，上文；Verma,UN.等人，(2003)，上文)、寡非他命(Oligofectamine)，「固體核酸脂質粒子」(Zimmermann,TS.等人，(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY.等人，(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A. 等人，(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙二亞胺(Bonnet ME.等人，(2008)Pharm.Res.Aug 16 Epub ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)及聚醯胺胺(Tomalia,DA.等人，(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.等人，(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。在一些實施例中，iRNA與環糊精形成用於全身投與之複合物。iRNA及環糊精之投與方法及醫藥組合物可見於美國專利第7,427,605號中，其以全文引用的方式併入本文中。
載體編碼之iRNA
在另一態樣中，靶向LECT2基因之iRNA可自插入DNA或RNA載體中之轉錄單元表現(參見例如Couture,A等人，TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A.等人，國際公開案第WO 00/22113號；Conrad，國際PCT公開案第WO 00/22114號；及Conrad，美國專利第6,054,299號)。視所用特定構築體及目標組織或細胞類型而定，表現可為短暫(約幾小時至幾週)或持久的(幾週至幾個月或更長)。此等轉殖基因可作為直鏈構築體、圓形質體或病毒載體形式引入，其可為整合或非整合載體。轉殖基因亦可經構築以允許其作為染色體外質體遺傳(Gassmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
個別股或iRNA之股可自表現載體上之啟動子轉錄。若兩個各別股待表現以生成例如dsRNA，則兩個各別表現載體可共同引入(例如藉由轉染或感染)至目標細胞中。或者，dsRNA之各個體股可藉由啟動子轉錄，其皆位於同一表現質體上。在一個實施例中，dsRNA表現為由連接子聚核苷酸序列接合之倒置重複單元使得dsRNA具有主幹及迴路結構。
iRNA表現載體通常為DNA質體或病毒載體。與真核細胞(例如脊椎動物細胞)相容之表現載體可用於產生重組構築體以表現如本文所 述之iRNA。真核細胞表現載體為此項技術中所熟知且獲自許多市售來源。通常，此類載體含有用於插入所要核酸片段之適宜限制位點。iRNA表現載體之傳遞可為全身傳遞，諸如藉由靜脈內或肌肉內投與，藉由向自患者離體種植隨後再引入患者中之目標細胞投與，或藉由允許引入所要目標細胞中的任何其他方式。
iRNA表現質體可作為與陽離子脂質載劑(例如寡非他命)之複合物或基於非陽離子脂質之載劑(例如Transit-TKOTM)轉染至目標細胞。本發明亦涵蓋經一週或一週以上之時段靶向目標RNA之不同區域的iRNA介導之阻斷基因表現的多種脂質轉染。將寄主細胞成功引入載體可使用多種已知方法監測。舉例而言，短暫轉染可使用報導體，諸如螢光標記物，諸如綠色螢光蛋白質(GFP)發信號。可使用向經轉染細胞提供對特定環境因素(例如抗生素及藥物)之抗性(諸如濕黴素B耐藥性)的標記物確保離體穩定轉染細胞。
本文所述之方法及組合物可利用之病毒載體系統包括(但不限於)(a)腺病毒載體；(b)反轉錄病毒載體，包括(但不限於)慢病毒載體、莫洛尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia virus)等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純性疱疹病毒載體；(e)SV40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小RNA病毒載體；(i)痘病毒載體，諸如天花(orthopox)，例如牛痘病毒載體或鳥類痘病毒，例如金絲雀痘或家禽痘；及(j)輔助病毒依賴型或裸腺病毒。複製缺陷病毒亦可能有利。不同載體將併入或不併入細胞基因組中。需要時，構築體可包括用於轉染之病毒序列。或者，構築體可併入能夠游離型複製之載體(例如EPV及EBV載體)中。用於重組表現iRNA之構築體一般將需要管理要素(例如啟動子、強化子等)以確保iRNA於目標細胞中表現。下文中進一步描述載體及構築體需考慮之其他態樣。
適用於傳遞iRNA之載體將包括足以在所要目標細胞或組織中表 現iRNA之管理要素(啟動子、強化子等)。可選擇管理要素以提供構成或調節/誘導性表現。
iRNA之表現可例如藉由使用對某些生理學調節因素(例如循環葡萄糖含量或激素)敏感之誘導性調節序列精密調節(Docherty等人，1994,FASEB J.8：20-24)。此類適於控制細胞或哺乳動物中dsRNA表現之誘導性表現系統包括例如藉由蛻皮激素、雌激素、孕酮、四環素、二聚化學誘導劑及異丙基-β-D1-硫代半乳糖苷(IPTG)調節。熟習此項技術者將能夠基於iRNA轉殖基因之預期用途選擇適當管理/啟動子序列。
在一特定實施例中，可使用含有編碼iRNA之核酸序列的病毒載體。舉例而言，可使用反轉錄病毒載體(參見Miller等人，Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。此等反轉錄病毒載體含有病毒基因組之正確封裝及整合至宿主細胞DNA中必須的組分。編碼iRNA之核酸序列選殖至一或多個載體中，此促進核酸傳遞至患者中。關於反轉錄病毒載體之更多細節可見於例如Boesen等人，Biotherapy 6：291-302(1994)中，其描述使用反轉錄病毒載體將mdr1基因傳遞至造血幹細胞以使幹細胞更耐化學療法。其他說明反轉錄病毒載體於基因療法中之用途的參考文獻為：Clowes等人，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem等人，Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons及Gunzberg,Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；以及Grossman及Wilson,Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114(1993)。預期使用之慢病毒載體包括，例如美國專利第6,143,520號；第5,665,557號及第5,981,276號中所述之基於HIV之載體，該等案以引用的方式併入本文中，腺病毒亦預期用於傳遞iRNA。腺病毒為尤其具有吸引力之媒劑，例如用於將基因傳遞至呼吸道上皮。腺病毒天然感染呼吸道上皮，在呼吸道上皮引起輕度疾病。基於腺病毒之傳遞系統的其他目標 為肝臟、中樞神經系統、內皮細胞及肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞之優勢。Kozarsky及Wilson,Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)呈現基於腺病毒之基因療法的評論。Bout等人，Human Gene Therapy 5：3-10(1994)表明使用腺病毒載體將基因轉移至食蟹獼猴的呼吸道上皮。在基因療法中使用腺病毒之其他情形可見於Rosenfeld等人，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld等人，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli等人，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT公開案WO94/12649；及Wang等人，Gene Therapy 2：775-783(1995)中。用於表現本發明特性化之iRNA的適合AV載體、用於構築重組AV載體之方法及用於將載體傳遞至目標細胞之方法描述於Xia H等人.(2002),Nat.Biotech. 20：1006-1010中。
亦涵蓋腺相關病毒(AAV)載體之用途(Walsh等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；美國專利第5,436,146號)。在一個實施例中，iRNA可自具有例如U6或H1 RNA啟動子或巨細胞病毒(CMV)啟動子之重組AAV載體表現為兩個各別互補單股RNA分子。用於表現本發明特性化之dsRNA的適合AAV載體、構築重組AV載體之方法及將載體傳遞至目標細胞中之方法描述於Samulski R等人，(1987),J.Virol.61：3096-3101；Fisher K J等人，(1996),J.Virol,70：520-532；Samulski R等人，(1989),J.Virol.63：3822-3826；美國專利第5,252,479號；美國專利第5,139,941號；國際專利申請案第WO 94/13788號；及國際專利申請案第WO 93/24641號中，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。
另一典型病毒載體為痘病毒，諸如牛痘病毒，例如減毒牛痘，諸如經修飾病毒Ankara(MVA)或NYVAC；鳥類痘病毒，諸如家禽痘或金絲雀痘。
病毒載體之向性可藉由使用來自其他病毒之包膜蛋白或其他表 面抗原對載體進行假模式化或藉由按需要取代不同病毒衣殼蛋白來修飾。舉例而言，慢病毒載體可使用來自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)及其類似物的表面蛋白質假模式化。可藉由工程改造載體以表現不同衣殼蛋白血清型來製備AAV載體以靶向不同細胞；參見例如Rabinowitz J E等人，(2002),J Virol 76：791-801，其全部揭示內容以引用的方式併入本文中。
載體之醫藥製劑可包括在可接受稀釋劑中之載體，或可包括嵌入有基因傳遞工具之緩釋基質。或者，若可自重組細胞(例如反轉錄病毒載體)完整製造全部基因傳遞載體，則醫藥製劑可包括一或多種產生基因傳遞系統之細胞。
III. 含有iRNA之醫藥組合物
在一個實施例中，本發明提供醫藥組合物，其含有如本文所述之iRNA及醫藥學上可接受之載劑。含有iRNA之醫藥組合物適用於治療於LECT2基因之表現活性活性有關的疾病或病症(例如LECT2澱粉樣變性)。此類醫藥組合物基於傳遞模式調配。舉例而言，組合物可調配用於經非經腸傳遞(例如藉由靜脈內(IV)傳遞)全身投與。在一些實施例中，本文提供之組合物(例如LNP調配物)調配用於靜脈內傳遞。在一些實施例中，本文提供之組合物(例如包含GalNAc結合物之組合物)調配用於皮下傳遞。
本文特性化之醫藥組合物以足以抑制LECT2基因表現之劑量投與。一般而言，iRNA之適合劑量將在0.01至200.0mg/kg接受者體重/天範圍內，一般1至50mg/kg接受者體重/天範圍內。舉例而言，dsRNA可以每單次劑量0.05mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg投與。醫藥組合物可每天一次投與，或iRNA可全天以適當間隔分兩次、三次或三次以上子劑量投與或甚至經控制釋放調配物使用連 續輸注或傳遞。在彼情況下，各子劑量中所含之iRNA必須相應較少以達到每日總劑量。劑量單元亦可複合以經若干天傳遞，例如使用經若干天提供iRNA持續釋放之習知持續釋放調配物。持續釋放調配物在此項技術中熟知且尤其適用於在特定部位傳遞試劑，諸如可與本發明之試劑一起使用。在此實施例中，劑量單元含有相應多個每日劑量。
單次劑量對LECT2含量之作用可為長效的，使得隨後劑量以不超過3、4或5天間隔，或不超過1、2、3或4週間隔投與。
熟練技術人員將瞭解某些因素可能影響有效治療個體之劑量及時間安排，包括(但不限於)疾病或病症之嚴重程度、先前治療、個體之一般健康狀況及/或年齡及存在之其他疾病。此外，使用治療有效量之組合物治療個體可包括單次治療或一系列治療。本發明涵蓋之個別iRNA之有效劑量及活體內半衰期之估算可使用習知方法進行或基於活體內測試使用適合動物模型進行。
適合動物模型(例如含有表現人類LECT2之轉殖基因的小鼠)可用於測定投與LECT2 siRNA之治療有效劑量及/或有效劑量方案。
本發明亦包括包含本文特性化之iRNA化合物的醫藥組合物及調配物。本發明之醫藥組合物可視需要局部或全身治療以及待治療區域而定以多種方式投與。投與可為表面(例如藉由皮膚貼)、經肺(例如藉由吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括藉由噴霧器)、氣管內、鼻內、表皮及經皮、經口或非經腸。非經腸投與包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；皮下，例如經由植入裝置；或顱內，例如藉由實質內、鞘內或室內投與。
iRNA可以靶向特定組織(諸如產生紅血球之組織)之方式傳遞。舉例而言，iRNA可傳遞至骨髓、肝臟(例如肝臟之肝細胞)、淋巴腺體、脾臟、肺(例如肺之肋膜)或脊椎。在一個實施例中，iRNA傳遞至 骨髓。
用於表面投與之醫藥組合物及調配物可包括皮膚貼、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧、液體及粉末。習知醫藥載劑、水性、粉末或油性基劑、增稠劑及其類似物可能必要或合需要的。經塗佈避孕套、手套及其類似物亦可適用。適合表面調配物包括本發明特性化之iRNA與表面傳遞劑(諸如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑)混雜者。適合脂質及脂質體包括中性(例如二油醯基磷脂醯DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼DMPC、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼)、陰離子型(例如二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油DMPG)及陽離子型(例如二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯基磷脂醯乙醇胺DOTMA)。本發明特性化之iRNA可囊封於脂質體內或可在其上形成複合物(尤其對陽離子脂質體)。或者，iRNA可與脂質，尤其陽離子脂質複合。適合脂肪酸及酯包括(但不限於)二十碳四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼或C1-20烷基酯(例如異丙基肉豆蔻酸酯IPM)、單甘油酸酯、二甘油酸酯或其醫藥學上可接受之鹽。表面調配物詳細描述於美國專利第6,747,014號中，其以引用的方式併入本文中。
脂質調配物
除微乳液之外亦存在許多組織化界面活性劑結構已經研究及用於藥物之調配物。此等包括單層、微胞、雙層及小泡。自藥物傳遞之觀點，小泡(諸如脂質體)因為其特異性及其提供之作用持續時間而具有有吸引力的極大重要性。如本發明中所使用，術語「脂質體」意謂由以球面雙層排列之兩親媒性脂質構成之小泡。
脂質體為單層或多層小泡，其具有由親脂性材料形成之膜及水性內部。水性部分含有待傳遞之組合物。陽離子脂質體具有能夠融合至細胞壁之優勢。非陽離子脂質體儘管不能與細胞壁有效融合，但由巨噬細胞活體內吸收。
為了穿越完整哺乳動物皮膚，脂質小泡必須在適合經皮梯度影響下穿過各自直徑小於50nm的一連串細孔。因此，希望使用高度可變形且及穿過此類細孔之脂質體。
脂質體之其他優勢包括：獲自天然磷脂之脂質體為生物相容且可生物降解的；脂質體可併入多種水及脂質可溶性藥物中；脂質體可在其固有區室中保護囊封藥物免於代謝及分解(Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁)。製備脂質體調配物之重要考慮因素為脂質體之脂質表面電荷、小泡尺寸及水性體積。
脂質體適用於將活性成分轉移及傳遞至作用部位。因為脂質膜結構上類似於生物膜，所以當脂質體施用至組織時，脂質體開始與細胞膜合併且隨著脂質體與細胞之合併進展，脂質內容物排空至細胞中，活性劑可在細胞中起作用。
大量調查已致力於研究脂質調配物作為許多藥物之傳遞模式。愈來愈多的證據表明對於表面投與，脂質體存在若干優於其他調配物之優勢。此類優勢包括降低與所投與藥物之高全身吸收的副作用、增加所投與藥物在所要目標處之積累及向皮膚投與多種藥物(親水性及疏水性兩者)之能力。
若干報導已詳述脂質體向皮膚傳遞藥劑(包括高分子量DNA)之能力。已向皮膚投與包括鎮痛劑、抗體、激素及高分子量DNA之化合物。大部分施用導致靶向上部表皮。
脂質體分為兩大類。陽離子脂質體為帶正電脂質體，其與帶負 電DNA分子相互作用形成穩定複合物。帶正電DNA/脂質體複合物結合至帶負電細胞表面且在核內體中內化。由於核內體內之酸性pH，脂質體破裂，將其內容物釋放至細胞質(Wang等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985)。
對pH敏感或帶負電之脂質體捕獲DNA而非與其複合。因為DNA及脂質皆帶類似電荷，發生斥力而非複合物形成。儘管如此，一些DNA捕獲於此等脂質體之水性內部中。對pH敏感之脂質體已用於向培養物中之細胞單層傳遞編碼胸苷激酶基因之DNA。在目標細胞中偵測到外源基因之表現(Zhou等人，Journal of Controlled Release,1992,19,269-274)。
一種主要類型之脂質組合物包括磷脂而非天然衍生之膽鹼磷脂。中性脂質體組合物例如可由二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)或二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)形成。陰離子脂質體組合物一般由二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油形成，而陰離子融合脂質體主要由二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)形成。另一類型之脂質組合物由磷脂醯膽鹼(PC)(諸如大豆PC及蛋PC)形成。另一類型由磷脂及/或磷脂醯膽鹼及/或膽固醇之混合物形成。
若干研究已評定脂質藥物調配物至皮膚之表面傳遞。含有干擾素之脂質體向天竺鼠皮膚之施用導致皮膚疱疹潰瘍減少，而經其他方式(例如作為溶液或作為乳液)傳遞干擾素為低效的(Weiner等人，Journal of Drug Targeting,1992,2,405-410)。此外，額外研究測試作為脂質調配物之部分投與干擾素相較於使用水性系統投與干擾素之功效，且得出結論脂質調配物優於水性投與(du Plessis等人，Antiviral Research,1992,18,259-265)。
非離子脂質系統(詳言之包含非離子界面活性劑及膽固醇之系統)亦已經檢驗以判斷其向皮膚傳遞藥物之效用。包含NovasomeTM I(二 月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂基醚)及NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧化乙烯-10-硬脂基醚)之非離子脂質調配物用於向小鼠皮膚之真皮中傳遞環孢素A。結果指示此類非離子脂質系統有效促進環孢素A沈積至皮膚的不同層中(Hu等人，S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466)。
脂質體亦包括「空間穩定」脂質體，如本文所用之術語「空間穩定」脂質體係指脂質體包含一或多種特殊脂質，其在併入脂質體中時導致循環壽命相對於缺乏此類特殊脂質之脂質體延長。空間穩定脂質體之實例為脂質體形成小泡部分之部分(A)包含一或多種醣脂，諸如單唾液酸神經節苷脂GM1或(B)經一或多種親水性聚合物(諸如聚乙二醇(PEG)部分)衍生者。儘管不希望受任何特定理論約束，但此項技術中認為至少對於含有神經節苷脂、鞘磷脂或PEG衍生之脂質的空間穩定脂質體，此等空間穩定脂質體的延長之循環半衰期源於網狀內皮系統之細胞中的攝入減少(Allen等人，FEBS Letters,1987,223,42；Wu等人，Cancer Research,1993,53,3765)。
包含一或多種醣脂之多種脂質體為此項技術中已知。Papahadjopoulos等人.(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)報導單唾液酸神經節苷脂GM1、半乳糖腦苷脂硫酸酯及磷脂醯環己六醇提高脂質體之血液半衰期的能力。Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)闡述了此等發現。美國專利第4,837,028號及WO 88/04924皆屬於Allen等人，其揭示包含(1)鞘磷脂及(2)神經節苷脂GM1或半乳糖腦苷脂硫酸酯之脂質體。美國專利第5,543,152號(Webb等人)揭示包含鞘磷脂之脂質體。包含1,2-sn-二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼之脂質體揭示於WO 97/13499(Lim等人)中。
經一或多種親水性聚合物衍生之許多包含脂質之脂質體及其製備方法為此項技術中已知。Sunamoto等人(Bull.Chem.Soc.Jpn., 1980,53,2778)描述包含非離子清潔劑2C1215G之脂質體，該清潔劑含有PEG部分。Illum等人(FEBS Lett.,1984,167,79)注意到使用聚合二醇親水性塗佈聚苯乙烯粒子導致血液半衰期顯著延長。藉由連接聚烷二醇(例如PEG)之羧基修飾之合成磷脂由Sears(美國專利第4,426,330號及第4,534,899號)描述。Klibanov等人(FEBS Lett.,1990,268,235)描述表明包含經PEG或PEG硬脂酸酯衍生之磷脂醯乙醇胺(PE)的脂質體的血液循環半衰期顯著延長。Blume等人(Biochimica et Biophysica Acta,1990,1029,91)將此類觀測延續至其他PEG衍生之磷脂，例如由二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)及PEG之組合形成的DSPE-PEG。外表面上具有共價結合之PEG部分的脂質體描述於Fisher之歐洲專利第EP 0 445 131 B1號及WO 90/04384中。含有1-20莫耳% PEG衍生之PE的脂質體組合物及其使用方法由Woodle等人(美國專利第5,013,556號及第5,356,633號)及Martin等人(美國專利第5,213,804號及歐洲專利第EP 0 496 813 B1號)描述。包含許多其他脂質-聚合物結合物之脂質體揭示於WO 91/05545及美國專利第5,225,212號(皆屬於Martin等人)及WO 94/20073(Zalipsky等人)中。包含PEG修飾之神經醯胺脂質的脂質體描述於WO 96/10391(Choi等人)中。美國專利第5,540,935號(Miyazaki等人)及美國專利第5,556,948號(Tagawa等人)描述含有PEG之脂質體，其可經其表面上之官能部分進一步衍生。
許多包含核酸之脂質體為此項技術中已知。Thierry等人之WO 96/40062揭示用於將高分子量核酸囊封至脂質體中之方法。Tagawa等人之美國專利第5,264,221號揭示蛋白質鍵結之脂質體且確證此類脂質體之內容物可包括dsRNA。Rahman等人之美國專利第5,665,710號描述某些將寡去氧核苷酸囊封至脂質體中之方法。Love等人之WO 97/04787揭示包含靶向raf基因之dsRNA的脂質體。
轉移體為另一類型之脂質體，且為作為用於藥物傳遞媒劑之有 吸引力候選物的高度可變形脂質聚集物。轉移體可描述為脂質滴，其高度可變形使得能夠容易穿過小於液體之孔。轉移體適於其使用環境，例如其自身最佳化(適應皮膚中之孔形狀)、自身修復、通常到達其目標而不分段及通常自身裝載。為了製備轉移體，可向標準脂質組合物添加表面邊緣活化劑，通常界面活性劑。轉移體已用於向皮膚傳遞血清白蛋白。轉移體介導之血清白蛋白傳遞已顯示皮下注射含有血清白蛋白之溶液為有效的。
界面活性劑在諸如乳液(包括微乳液)及脂質體之調配物中發現廣泛應用。許多不同類型之界面活性劑(天然及合成)之特性的最常見分類及分級方式是藉由使用親水/親脂平衡(HLB)。親水性基團(亦稱為「頂」)之性質提供調配物中所用不同界面活性劑之最適用分類方式(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第285頁)。
若界面活性劑分子未經離子化，則其分類為非離子界面活性劑。非離子界面活性劑在醫藥及化妝產品中發現廣泛應用且可在廣泛pH值範圍上使用。一般而言，視其結構而定，其HLB值在2至約18範圍內。非離子界面活性劑包括非離子酯，諸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脫水山梨糖醇酯、蔗糖酯及乙氧基化酯。此類別中亦包括非離子烷醇醯胺及醚，諸如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物。聚氧化乙烯界面活性劑為非離子界面活性劑類別之最普遍成員。
若界面活性劑分子攜帶負電荷，則當其溶解或分散於水中時，界面活性劑分類為陰離子型。陰離子界面活性劑包括羧酸鹽，諸如皂類；醯基乳酸酯；胺基酸之醯胺；硫酸酯，諸如硫酸烷基酯及硫酸乙氧基化烷基酯；磺酸酯，諸如苯磺酸烷基酯、醯基羥乙基磺酸酯、醯基牛磺酸酯及磺基丁二酸酯；及磷酸酯。陰離子界面活性劑類別之最 重要成員為硫酸烷基酯及皂類。
若界面活性劑分子攜帶正電荷，則當其溶解或分散於水中時，界面活性劑分類為陽離子。陽離子界面活性劑包括四級銨鹽及乙氧基化胺。四級銨鹽為此類別之最常用成員。
若界面活性劑分子能夠攜帶正電荷或負電荷，則界面活性劑分類為兩性的。兩性界面活性劑包括丙烯酸衍生物、經取代烷基醯胺、N-烷基甜菜鹼及磷脂。
已評論界面活性劑於藥品、調配物及乳液中之使用(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第285頁)。
核酸脂質粒子
在一個實施例中，本發明特性化之LECT2 dsRNA完全囊封於脂質調配物中，例如形成SPLP、pSPLP、SNALP或其他核酸-脂質粒子。如本文所用，術語「SNALP」係指穩定核酸-脂質粒子，包括SPLP。如本文所用，術語「SPLP」係指包含囊封於脂質小泡內之質體DNA之核酸-脂質粒子。SNALP及SPLP通常含有陽離子脂質、非陽離子脂質及防止粒子聚集之脂質(例如PEG-脂質結合物)。SNALP及SPLP極其適用於全身施用，因為其在靜脈內(i.v.)注射後展現長循環壽命且在末端部位積聚(例如與投與部位物理上分開之部位)。SPLP包括「pSPLP」，其包括如PCT公開案第WO 00/03683號中所述之囊封冷凝劑-核酸複合物。本發明之粒子通常具有約50nm至約150nm，更通常約60nm至約130nm，更通常約70nm至約110nm，最通常約70nm至約90nm之平均直徑且實質上無毒。此外，核酸當存在於本發明之核酸-脂質粒子中時，耐水溶液中之核酸酶分解。核酸-脂質粒子及其製備方法揭示於例如美國專利第5,976,567號；第5,981,501號；第6,534,484號；第6,586,410號；第6,815,432號及PCT公開案第WO 96/40964號中。
在一個實施例中，脂質比藥物比率(質量/質量比)(例如脂質比dsRNA比率)將在約1：1至約50：1、約1：1至約25：1、約3：1至約15：1、約4：1至約10：1、約5：1至約9：1或約6：1至約9：1範圍內。
陽離子脂質可為例如氯化N,N-二油基-N,N-二甲基銨(DODAC)、溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基銨(DDAB)、氯化N-(I-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTAP)、氯化N-(I-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二次亞油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亞油基胺甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-嗎啉基)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油基氧基-3-三甲基胺基丙烷氯化物鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯化物鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二次亞油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亞油基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)或其類似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊[d][1,3]間二氧雜環戊烯-5-胺(ALN100)、4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二 基)二-十二烷-2-醇(Tech G1)或其混合物。陽離子脂質可佔粒子中存在之總脂質的約20莫耳%至約50莫耳%或約40莫耳%總脂質。
在另一實施例中，化合物2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷可用於製備脂質-siRNA奈米粒子。2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷之合成描述於2008年10月23日申請之美國臨時專利申請案第61/107,998號中，其以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，脂質-siRNA粒子包括40% 2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷：10% DSPC：40%膽固醇：10% PEG-C-DOMG(莫耳百分比)，粒徑為63.0±20nm且0.027 siRNA/脂質比。
非陽離子脂質可為陰離子脂質或中性脂質，包括(但不限於)二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯基-乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反PE、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、膽固醇或其混合物。若包括膽固醇，則非陽離子脂質可為粒子中存在之總脂質的約5莫耳%至約90莫耳%，約10莫耳%，或約58莫耳%。
抑制粒子聚集之結合脂質可為例如聚乙二醇(PEG)-脂質，包括(但不限於)PEG-二醯基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA結合物可為例如PEG-二月桂基氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕櫚基氧基丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧基丙基(C]8)。防止粒子聚 集之結合脂質可為粒子中存在之總脂質的約0莫耳%至約20莫耳%或約2莫耳%。
在一些實施例中，核酸-脂質粒子進一步包含例如占粒子中存在之總脂質的約10莫耳%至約60莫耳%或約48莫耳%的膽固醇。
在一些實施例中，iRNA在脂質奈米粒子(LNP)中調配。
LNP01
在一個實施例中，利匹哆異德(lipidoid)ND98．4HCl(MW 1487)(參見美國專利申請案第12/056,230號，3/26/2008申請，其以引用的方式併入本文中)、膽固醇(Sigma-Aldrich)及PEG-神經醯胺C16(Avanti Polar Lipids)可用於製備脂質-dsRNA奈米粒子(例如LNP01粒子)。各自於乙醇中之儲備溶液可如下製備：ND98，133mg/ml；膽固醇，25mg/ml；PEG-神經醯胺C16，100mg/ml。ND98、膽固醇及PEG-神經醯胺C16儲備溶液接著可以例如42：48：10莫耳比組合。組合脂質溶液可與水性dsRNA混合(例如在乙酸鈉pH 5中)，使得最終乙醇濃度為約35-45%且最終乙酸鈉濃度為約100-300mM。脂質-dsRNA奈米粒子通常在混合時自發形成。視所要粒徑分佈而定，所得奈米粒子混合物可使用Thermobarrel擠壓機，諸如Lipex擠壓機(Northern Lipids,Inc)經聚碳酸酯膜(例如100nm截止)擠出。在一些情形中，擠壓步驟可為省略。可藉由例如透析或切向流過濾實現乙醇移除及同時緩衝液更換。緩衝液可更換為例如約pH 7，例如約pH 6.9、約pH 7.0、約pH 7.1、約pH 7.2、約pH 7.3或約pH 7.4之磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。
LNP01調配物描述於例如國際申請公開案第WO 2008/042973號中，其以引用的方式併入本文中。
額外例示性脂質-dsRNA調配物提供於下表中。
DSPC：二硬脂醯基磷脂醯膽鹼
DPPC：二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼
PEG-DMG：PEG-二肉豆蔻醯基甘油(C14-PEG或PEG-C14)(PEG之平均莫耳重量為2000)
PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(PEG之平均莫耳重量為2000)
PEG-cDMA：PEG-胺甲醯基-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基胺(PEG之平均莫耳重量為2000)
包含SNALP(1,2-二次亞油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA))之調配物描述於2009年4月15日申請之國際公開案第WO2009/127060號中，其以引用的方式併入本文中。
包含XTC之調配物描述於例如2009年1月29日申請之美國臨時第61/148,366號；2009年3月2日申請之美國臨時第61/156,851號；2009年6月10日申請之美國臨時第61/185,712號；2009年7月24日申請之美國臨時第61/228,373號；2009年9月3日申請之美國臨時第61/239,686號及2010年1月29日申請之國際申請案第PCT/US2010/022614號，其以引用的方式併入本文中。
包含MC3之調配物描述於例如2009年9月22日申請之美國臨時第61/244,834號；2009年6月10日申請之美國臨時第61/185,800號及2010年6月10日申請之國際申請案第PCT/US10/28224號，其以引用的方式併入本文中。
包含ALNY-100之調配物描述於例如2009年11月10日申請之國際專利申請案第PCT/US09/63933號中，其以引用的方式併入本文中。
包含C12-200之調配物描述於2009年5月5日申請之美國臨時第61/175,770號及2010年5月5日申請之國際申請案第PCT/US10/33777號中，其以引用的方式併入本文中。
合成陽離子脂質
本發明特性化之核酸-脂質粒子中所用之任何化合物(例如陽離子脂質及其類似物)可藉由已知有機合成技術製備。除非另外規定，否則所有取代基如下文所定義。
「烷基」意謂含有1至24個碳原子的直鏈或分支鏈非環狀或環狀飽和脂族烴。代表性飽和直鏈烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基及其類似基團；而飽和分支鏈烷基包括異丙基、第二丁基、異丁基、第三丁基、異戊基及其類似基團。代表性飽和環烷基包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基及其類似基團；而不飽和環烷基包括環戊烯基及環己烯基及其類似基團。
「烯基」意謂相鄰碳原子之間含有至少一個雙鍵的如上文所定 義之烷基。烯基包括順式及反式異構體兩者。代表性直鏈及分支鏈烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基及其類似烯基。
「炔基」意謂相鄰碳之間額外含有至少一個參鍵的如上文所定義之任何烷基或烯基。代表性直鏈及分支鏈炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基及其類似炔基。
「醯基」意謂連接點處之碳經側氧基取代的任何烷基、烯基或炔基，如下文所定義。舉例而言，-C(=O)烷基、-C(=O)烯基及-C(=O)炔基為醯基。
「雜環」意謂5至7員單環或7至10員雙環雜環，其為飽和、不飽和或芳族的且含有1或2個獨立地選自氮、氧及硫之雜原子，且其中氮及硫雜原子可視情況經氧化，且氮雜原子可視情況經四級銨化，包括上述雜環中之任一者稠合至苯環的雙環。雜環可經任何雜原子或碳原子連接。雜環包括如下所定義之雜芳基。雜環包括嗎啉基、吡咯啶酮基、吡咯啶基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、內醯脲基、戊內醯胺基、環氧乙基、氧雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫哌喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫硫代哌喃基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫硫代哌喃基及其類似雜環。
術語「視情況經取代之烷基」、「視情況經取代之烯基」、「視情況經取代之炔基」、「視情況經取代之醯基」及「視情況經取代之雜環」意謂當經取代時，至少一個氫原子置換為取代基。在側氧基取代基(=O)之情形中，兩個氫原子經置換。就此而言，取代基包括側氧基、鹵素、雜環、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx及-SOnNRxRy，其中n 為0、1或2，Rx及Ry相同或不同且獨立地為氫、烷基或雜環，且該烷基及雜環取代基各自可經以下中之一或多者進一步取代：側氧基、鹵素、-OH、-CN、烷基、-ORx、雜環、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx及-SOnNRxRy。
「鹵素」意謂氟、氯、溴及碘。
在一些實施例中，本發明特性化之方法可能需要使用保護基。保護基方法為熟習此項技術者所熟知(參見例如Protective Groups in Organic Synthesis,Green,T.W.等人，Wiley-Interscience,New York City,1999)。簡言之，本發明情形中之保護基為降低或消除官能基之非所需反應性的任何基團。在某些反應期間可向官能基添加保護基以遮蔽其反應性，接著移除以揭示原始官能基。在一些實施例中，使用「醇保護基」。「醇保護基」為降低或消除醇官能基之非所需反應性的任何基團。可使用此項技術中熟知之技術添加及移除保護基。
合成式A
在一個實施例中，本發明特性化之核酸-脂質粒子使用式A之陽離子脂質調配： 其中R1及R2獨立地為各自可視情況經取代之烷基、烯基或炔基，且R3及R4獨立地為低碳烷基或R3與R4可結合在一起形成視情況經取代之雜環。在一些實施例中，陽離子脂質為XTC(2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷)。一般而言，除非另外規定，否則上述式A之脂質可藉由以下反應流程1或2製備，其中全部取代基如 上文所定義。
脂質A製備根據流程1製備，其中R1及R2獨立地為各自可視情況經取代之烷基、烯基或炔基，且R3及R4獨立地為低碳烷基或R3與R4可結合在一起形成視情況經取代之雜環。酮1及溴化物2可購買或根據一般技術者已知之方法製備。1與2之反應產生縮酮3。用胺4處理縮酮3產生式A之脂質。式A之脂質可使用式5之有機鹽轉化成相應銨鹽，其中X為選自鹵素、氫氧根、磷酸根、硫酸根或其類似物之陰離子相對離子。
或者，酮1起始物質可根據流程2製備。格林納試劑(格林納試劑) 6及氰化物7可購買或根據一般技術者已知之方法製備。6與7之反應產生酮1。如流程1中所描述將酮1轉化成相應式A之脂質。
合成MC3
如下製備DLin-M-C3-DMA(亦即4-(二甲胺基))丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯)。在室溫下攪拌(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53g)、4-N,N-二甲基胺基丁酸鹽酸鹽(0.51g)、4-N,N-二甲胺基吡啶(0.61g)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.53g)於二氯甲烷(5mL)中之溶液隔夜。溶液用稀鹽酸，隨後稀碳酸氫鈉水溶液洗滌。有機部分經無水硫酸鎂乾燥，過濾且在旋轉蒸發儀上移除溶劑。殘餘物向下通過使用1-5%甲醇/二氯甲烷溶離梯度之矽膠管柱(20g)。將含有經純化產物之溶離份合併且移除溶劑，產生無色油狀物(0.54g)。
合成ALNY-100
使用以下流程3進行縮酮519[ALNY-100]之合成：
合成515：
在氮氣氛圍下，在0℃下，向二頸RBF(1L)中LiAlH4(3.74g，0.09852mol)於200ml無水THF中之經攪拌懸浮液中緩慢添加514(10g，0.04926mol)於70mL THF中之溶液。完成添加後，使反應混合物升溫至室溫，接著加熱至回流持續4小時。藉由TLC監測反應進展。反應完成後(藉由TLC)，使混合物冷卻至0℃且藉由小心添加飽和Na2SO4溶液淬滅。在室溫下攪拌反應混合物4小時且濾出。殘餘物用 THF良好洗滌。混合濾液及洗滌液且用400mL二噁烷及26mL濃HCl稀釋，且在室溫下攪拌20分鐘。在真空下去除揮發物得到呈白色固體狀之515的鹽酸鹽。產量：7.12g 1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ=9.34(寬峰，2H),5.68(s,2H),3.74(m,1H),2.66-2.60(m,2H),2.50-2.45(m,5H)。
合成516：
向250mL二頸RBF中的化合物515於100mL無水DCM中之攪拌溶液中添加NEt3(37.2mL，0.2669mol)且在氮氣氛圍下冷卻至0℃。緩慢添加含N-(苯甲氧基-羰氧基)-丁二醯亞胺(20g，0.08007mol)之50mL無水DCM後，使反應混合物升溫至室溫。反應完成後(藉由TLC 2-3小時)，混合物依序用1N HCl溶液(1×100mL)及NaHCO3飽和溶液(1×50mL)洗滌。有機層接著經無水Na2SO4乾燥且蒸發溶劑獲得粗物質，其藉由矽膠管柱層析純化獲得呈黏性塊狀物之516。產量：11g(89%)。1H-NMR(CDCl3,400MHz)：δ=7.36-7.27(m,5H),5.69(s,2H),5.12(s,2H),4.96(br.,1H)2.74(s,3H),2.60(m,2H),2,30-2.25(m,2H)。LC-MS[M+H]-232.3(96.94%)。
合成517A及517B：
在單頸500mL RBF中將環戊烯516(5g，0.02164mo1)溶解於220mL丙酮及水(10：1)溶液中，且在室溫下向其中添加N-甲基嗎啉-N-氧化物(7.6g，0.06492mol)，隨後添加4.2mL 7.6% OsO4(0.275g，0.00108mol)於第三丁醇中之溶液。反應完成後(約3小時)，藉由添加固體Na2SO3淬滅混合物且在室溫下攪拌所得混合物1.5小時。反應混合物用DCM(300mL)稀釋且用水(2×100mL)，隨後飽和NaHCO3(1×50mL)溶液、水(1×30mL)及最終用鹽水(1×50mL)洗滌。有機相經Na2SO4乾燥且在真空中移除溶劑。粗物質之矽膠管柱層析純化獲得非對映異構體之混合物，其藉由製備型HPLC分離。產量：-6g粗產 物
517A-峰-1(白色固體)，5.13g(96%)。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ=7.39-7.31(m,5H),5.04(s,2H),4.78-4.73(m,1H),4.48-4.47(d,2H),3.94-3.93(m,2H),2.71(s,3H),1.72-1.67(m,4H)。LC-MS-[M+H]-266.3,[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86%。藉由X射線確認立體化學性。
合成518：
利用與針對化合物505合成所述類似之程序，獲得呈無色油狀之化合物518(1.2g，41%)。1H-NMR(CDCl3,400MHz)：δ=7.35-7.33(m,4H),7.30-7.27(m,1H),5.37-5.27(m,8H),5.12(s,2H),4.75(m,1H),4.58-4.57(m,2H),2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H),1.96-1.91(m,2H),1.62(m,4H),1.48(m,2H),1.37-1.25(br m,36H),0.87(m,6H)。HPLC-98.65%。
合成化合物519之通用程序：
以逐滴方式將化合物518(1當量)於己烷(15mL)中之溶液添加至LAH於THF中之冰冷之溶液(1M，2當量)。完成添加後，混合物在40℃下加熱0.5小時，接著再於冰浴上此外。混合物用Na2SO4飽和水溶液小心地水解，接著經矽藻土過濾且縮減成油狀物。管柱層析法提供呈無色油狀之純519(1.3g，68%)。13C NMR=130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1；電噴霧MS(+ve)：C44H80NO2(M+H)+之分子量計算值654.6，實驗值654.6。
藉由標準方法或無擠壓方法製備之調配物可以類似方式表徵。舉例而言，調配物通常經目測表徵。其應為不含聚集物或沈降物之半透明發白溶液。脂質-奈米粒子之粒徑及粒徑分佈可使用例如Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern,USA)藉由光散射量測。粒子之尺寸應為 約20-300nm，諸如40-100nm。粒徑分佈應為單峰式的。使用染料排斥分析法估算調配物中之總dsRNA濃度以及捕獲分數。經調配dsRNA之樣品可與RNA-結合染料(諸如Ribogreen(Molecular Probes))一起在調配中斷界面活性劑(例如0.5% Triton-X100)存在或不存在下培育。調配物中之總dsRNA可藉由相對於標準曲線的來自含有界面活性劑之樣品的信號測定。藉由自總dsRNA含量減去「游離」dsRNA含量(如藉由在無界面活性劑存在下之信號所量測)測定捕獲分數。捕獲dsRNA百分比通常>85%。對於SNALP調配物，粒徑為至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm及至少120nm。適合範圍通常為約至少50nm至約至少110nm、約至少60nm至約至少100nm或約至少80nm至約至少90nm。
用於經口投與之組合物及調配物包括粉末或顆粒、微粒、奈米粒子、水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥囊、錠劑或微錠劑。可能需要增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。在一些實施例中，經口調配物為本發明特性化之dsRNA與一或多種穿透增強界面活性劑及螯合劑結合投與的調配物。適合界面活性劑包括脂肪酸及/或其酯或鹽、膽酸及/或其鹽。適合膽酸/鹽包括鵝膽酸(CDCA)及熊去氧鵝去氧膽酸(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、穀胺膽酸、甘胺膽酸、甘胺去氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺去氧膽酸、牛磺-24,25-二氫-夫西地酸鈉及甘胺二氫夫西地酸鈉。適合脂肪酸包括二十碳四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸、三癸酸、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼或單甘油酸酯、二甘油酸酯或其醫藥學上可接受之鹽(例如鈉)。在一些實施例中，使用穿透增強劑 之組合，例如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽之組合。一個例示性組合為月桂酸、癸酸及UDCA之鈉鹽。其他穿透增強劑包括聚氧化乙烯-9-月桂基醚、聚氧化乙烯-20-鯨蠟基醚。本發明特性化之DsRNA可以包括噴霧乾燥之粒子的顆粒形式或複合形成微米或奈米粒子之顆粒形式經口傳遞。DsRNA複合劑包括聚胺基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧雜環丁烷、聚烷基氰基丙烯酸酯；陽離子化明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)及澱粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE衍生之聚亞胺、短梗黴多糖、纖維素及澱粉。適合複合劑包括聚葡萄胺糖、N-三甲基聚葡萄胺糖、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚鳥胺酸、聚精胺、魚精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基乙烯P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(例如對胺基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸脂、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-白蛋白及DEAE-聚葡萄糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、海藻酸鹽及聚乙二醇(PEG)。dsRNA之經口調配物及其製備詳細描述於美國專利6,887,906、美國公開案第20030027780號及美國專利第6,747,014號，其各自以引用的方式併入本文中。
用於非經腸、實質內(至大腦中)、鞘內、室內或肝內投與之組合物及調配物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適合添加劑，諸如(但不限於)穿透增強劑、載劑化合物及其他醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
本發明之醫藥組合物包括(但不限於)溶液、乳液及含有脂質體之調配物。此等組合物可由多種組分產生，包括(但不限於)預成型液體、自身乳化固體及自身乳化半固體。
本發明特性化之醫藥調配物宜呈單位劑型，其可根據醫藥行業 中熟知之習知技術製備。此類技術包括使活性成分與醫藥載劑或賦形劑締合之步驟。一般而言，藉由使活性成分與液體載劑或細粉狀固體載劑或兩者均勻且緊密締合且隨後必要時使產物成形來製備調配物。
本發明特性化之組合物可調配成許多可能劑型中之任一者，諸如(但不限於)錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糊漿、軟凝膠、栓劑及灌腸劑。組合物亦可在水性、非水性或混合介質中調配成懸浮液。水性懸浮液可另外含有提高懸浮液黏度之物質，包括例如羧基甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
額外調配物 乳液
本發明之組合物可製備及調配為乳液。乳液通常為一種液體以液滴形式(一般直徑一般超過0.1μm)分散於另一種液體中的異質系統(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第2卷，第335頁；Higuchi等人，in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985，第301頁)。乳液通常為包含兩種彼此緊密混合及分散的不可混溶液相的兩相系統。一般而言，乳液可為油包水(w/o)或水包油(o/w)變體。當水相細分成微小液滴且作為微小液滴分散至主體油相中時，所得組合物稱為油包水(w/o)乳液。或者，當油相細分成微小液滴且作為微小 液滴分散至主體水相中時，所得組合物稱為水包油(o/w)乳液。乳液可另外含有除分散相之外的組分，及可以水相、油相或本身呈分離相之溶液的形式存在的活性藥物。乳液中亦可根據需要存在如乳化劑、穩定劑、染料及抗氧化劑之醫藥賦形劑。醫藥乳液亦可為由兩個以上相構成的多種乳液，諸如油包水包油(o/w/o)及水包油包水(w/o/w)乳液的情形。此類複雜調配物通常提供簡單二元乳液不能提供之某些優勢。o/w乳液之個別小油滴封閉小水滴的多種乳液構成w/o/w乳液。同樣，封閉於油性連續相中穩定之水液珠中的小油滴系統提供o/w/o乳液。
乳液之特徵為熱力學穩定性極低或無熱力學穩定性。通常，乳液之分散相或不連續相良好分散於外部或連續相中且藉助於乳化劑或調配物之黏度維持此形式。如乳液型軟膏基劑及乳霜之情形中，乳液之任一相可為半固體或固體。其他穩定乳液之方式需要使用可併入中乳液中之任一相中的乳化劑。乳化劑可廣泛分成四個類別：合成界面活性劑、天然存在之乳化劑、吸收基劑及精細分散之固體(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。
合成界面活性劑亦稱為表面活性劑，其已發現在乳液調配中之廣泛適用性且已在文獻中評論(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第 285頁；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第1卷，第199頁)。界面活性劑通常為兩親媒性的且包含親水性及疏水性部分。界面活性劑之親水性比疏水性之比率成為親水/親脂平衡(HLB)且為調配物製備中分類及選擇界面活性劑的重要工具。界面活性劑可基於親水性基團之性質分成不同類別：非離子、陰離子、陽離子及兩性(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第285頁)。
乳液調配物中所用之天然存在之乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂及阿拉伯膠。吸收基劑具有親水性特性使得其可吸取水形成w/o乳液，但仍保留其半固體稠度，諸如無水羊毛脂及親水性石蠟脂。細粉狀固體亦已用作良好乳化劑，尤其與界面活性劑組合及在黏稠製劑中。此等包括極性無機固體，諸如重金屬氫氧化物；不膨脹黏土，諸如膨潤土、綠坡縷石、鋰皂石、高嶺土、蒙脫石、膠態矽酸鋁及膠態矽酸鎂鋁；顏料及非極性固體，諸如碳或三硬脂酸甘油酯。
乳液調配物中亦包括多種非乳化材料且有助於乳液之特性。此等包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑、親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第335頁；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。
親水性膠體或親水膠體包括天然存在之膠及合成聚合物，諸如 多糖(例如阿拉伯膠、瓊脂、褐藻酸、角叉菜膠、瓜爾豆膠、加拉亞膠(karaya gum)及黃蓍膠)、纖維素衍生物(例如羧基甲基纖維素及羧甲基丙基纖維素)，及合成聚合物(例如卡波姆(carbomer)、纖維素醚及羧基乙烯基聚合物)。此等在水中分散或膨脹形成膠態溶液，其藉由在分散相液體周圍形成強界面膜且藉由提高外部狀態之黏度穩定乳液。
因為乳液通常含有許多容易支持微生物生長之成分，諸如碳水化合物、蛋白質、固醇及磷脂，所以此等調配物通常併入有防腐劑。乳液調配物中包括的常用防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、四級銨鹽、苯紮氯銨、對羥基苯甲酸酯及硼酸。亦通常向乳液調配物中添加抗氧化劑以防止調配物劣化。所用抗氧化劑可為自由基清除劑，諸如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基化羥基甲氧苯、丁基化羥基甲苯或還原劑(諸如抗壞血酸及偏亞硫酸氫鈉)，及抗氧化性增效劑(諸如檸檬酸、酒石酸及卵磷脂)。
乳液調配物經皮膚、經口及非經腸途徑之施用及其製造方法已在文獻中評論(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。用於經口傳遞之乳液調配物因為容易調配以及吸收功及生物可用性觀點已極廣泛使用(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams及Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。礦物油基劑輕瀉劑、油溶性維生素及高脂肪營養製劑為通常作為o/w乳液經口投與之物質。
在本發明之一個實施例中，iRNA及核酸之組合物調配為微乳液。微乳液可定義為水、油及兩親媒性之系統，其為單光學各向同性及熱力學穩定液體溶液(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams及Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁)。微乳液通常為首先在水性界面活性劑溶液中分散油，接著添加充分量之第四組分(一般中等鏈長度醇)形成透明系統製備的系統。因此，微乳液亦描述為兩種不可混溶液體之熱力學穩定各向同性澄清分散液，其藉由表面活性分子之界面膜穩定(Leung及Shah,Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.編，1989,VCH Publishers,New York，第185頁-第215頁)。微乳液通常經由組合包括油、水、界面活性劑、輔助界面活性劑及電解質三至五種組分製備。微乳液視所用油及界面活性劑之特性以及界面活性劑分子之極性頂部及烴尾部的結構及幾何封裝而定為油包水(w/o)或水包油(o/w)類型(Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985，第271頁)。
利用相圖之現象學方法已充分研究及產生供熟習此項技術者瞭解的如何調配微乳液之全面知識(參見例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams及Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及 Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第245頁；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger及Banker(編)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第335頁)。與習知乳液相比，微乳液提供將不溶於水之藥物溶解於自發形成之熱力學穩定液體之調配物中的優勢。
用於製備微乳液之界面活性劑包括(但不限於)單獨或與輔助界面活性劑組合之離子界面活性劑、非離子界面活性劑、Brij 96、聚氧化乙烯油醇醚、聚脂肪酸甘油酯、單月桂酸四甘油酯(ML310)、單油酸四甘油酯(MO310)、單油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、單癸酸十甘油酯(MCA750)、單油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)。輔助界面活性劑一般為短鏈醇，諸如乙醇、1-丙醇及1-丁醇，其用於藉由穿透至界面活性劑膜中且因此產生無序膜(因為界面活性劑分子之間產生空隙)而提高界面流動性。然而，微乳液可不使用輔助界面活性劑製備且無醇自身乳化微乳液系統為此項技術中已知。水相通常可為(但不限於)水、藥物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇及乙二醇衍生物。油相可包括(但不限於)諸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中鏈(C8-C12)單、二及三-甘油酯、聚氧乙基化甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚二醇化甘油酯、飽和聚二醇化C8-C10甘油酯、植物油及聚矽氧油。
出於藥物溶解及提高藥物吸收之觀點，微乳液尤其受關注。已提議基於脂質之微乳液(o/w及w/o兩者)提高藥物(包括肽)之口服生物可用性(參見例如美國專利第6,191,105號；第7,063,860號；第7,070,802號；第7,157,099號；Constantinides等人，Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供改良藥物溶解作用、保護藥 物免於酶促水解、可能由於界面活性劑誘發之膜流動性及滲透率改變而提高藥物吸收、容易製備、比固體劑型容易經口投與、提高臨床效能及降低毒性之優勢(參見例如美國專利第6,191,105號；第7,063,860號；第7,070,802號；第7,157,099號；Constantinides等人，Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Ho等人，J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。當在環境溫度下將微乳液組分置於一起時，通常可自發地形成微乳液。此在調配不耐熱藥物(肽或iRNA)時尤其有利。微乳液亦已在化妝及醫藥應用中有效經皮傳遞活性組分。預期本發明之微乳液組合物及調配物將促進iRNA及核酸自胃腸道的提高的全身吸收，以及提高iRNA及核酸的局部細胞攝入。
本發明之微乳液亦可含有額外組分及添加劑(諸如脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(Grill 3)、葵酸酯及穿透增強劑)來改良調配物特性及提高本發明之iRNA及核酸的吸收。本發明微乳液中所用之穿透增強劑可分類為屬於五種廣泛類別中之一種：界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合劑非界面活性劑(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁)。上文已對此等類別中之每一種進行論述。
穿透增強劑
在一個實施例中，本發明採用多種穿透增強劑以向動物皮膚有效傳遞核酸，尤其iRNA。大多數藥物以離子化及非離子化形式存在於溶液中。然而，一般僅脂質可溶性或親脂性藥物容易穿過細胞膜。已發現若待穿過之膜經穿透增強劑處理，則即使非親脂性藥物亦可穿過細胞膜。除了幫助非親脂性藥物通過細胞膜擴散之外，穿透增強劑亦提高親脂性藥物之滲透率。
穿透增強劑可分類為屬於五種廣泛類別中之一種，亦即界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合劑非界面活性劑(參見例如 Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁)。下文中更詳細描述上述類別之穿透增強劑中之每一者。
界面活性劑：關於本發明，界面活性劑(或「表面活性劑」)為當溶解於水溶液中時減少溶液表面張力或水溶液與及液體之間的界面張力，提高iRNA通過黏膜之吸收的化學實體。除了膽汁鹽及脂肪酸之外，此等穿透增強劑包括例如月桂基硫酸鈉、聚氧化乙烯-9-月桂基醚及聚氧化乙烯-20-鯨蠟基醚(參見例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁)；及全氟化學乳液，諸如FC-43。Takahashi等人，J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252。
脂肪酸：用作穿透增強劑之多種脂肪酸及其衍生物包括例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸鹽、單油酸甘油酯(1-單油醯基-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、二十碳四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、其C1-20烷基酯(例如甲基、異丙基及第三丁基)，及其單甘油酯及二甘油酯(亦即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞麻油酸酯等)(參見例如Touitou,E.等人，Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；El Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁鹽：膽汁之生理學作用包括促進脂質及脂溶性維生素的分 散及吸收(參見例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Brunton，第38章in：Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，Hardman等人編，McGraw-Hill,New York,1996，第934頁-第935頁)。多種天然膽汁鹽及其合成衍生物用作穿透增強劑。因此術語「膽汁鹽」包括膽汁之任何天然存在之組分以及其任何合成衍生物。適合膽汁鹽包括例如膽酸(或其醫藥學上可接受之鈉鹽，膽酸鈉)、去氫膽酸(去氫膽酸鈉)、去氧膽酸(去氧膽酸鈉)、穀胺膽酸(穀胺膽酸鈉)、甘胺膽酸(甘胺膽酸鈉)、甘胺去氧膽酸(甘胺去氧膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸鈉)、牛磺去氧膽酸(牛磺去氧膽酸鈉)、鵝去氧膽酸(鵝去氧膽酸鈉)、熊去氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-夫西地酸鈉(STDHF)、甘胺二氫夫西地酸鈉及聚氧化乙烯-9-月桂基醚(POE)(參見例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁；Swinyard，第39章In：Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro編，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990，第782頁-第783頁；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto等人，J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita等人，J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
螯合劑：與本發明結合使用之螯合劑可定義為藉由與溶液形成複合物自溶液移除金屬離子，提高iRNA通過黏膜之吸收的化合物。關於其在本發明中作為穿透增強劑之用途，螯合劑具有亦用作DNase抑制劑之附加優勢，因為大多數所表徵之DNA核酸酶需要二價金屬離子來催化且因此由螯合劑抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。適合螯合劑包括(但不限於)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬 酸、水楊酸鹽(例如水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽及均香蘭酸鹽)、膠原蛋白之N-醯基衍生物、月桂醇-9及β-二酮之N-胺基醯基衍生物(烯胺)(參見例如Katdare,A.等人，Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur等人，J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
非螯合劑非界面活性劑：如本文所用，非螯合劑非界面活性劑穿透增強化合物可定義為展現作為螯合劑或界面活性劑之不顯著活性，但仍然提高iRNA通過消化道黏膜之吸收的化合物(參見例如Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。此類穿透增強劑包括例如不飽和環脲、1-烷基-及1-烯基氮雜環-脂肪酮衍生物(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁)；及非類固醇消炎劑，諸如雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、吲哚美辛(indomethacin)及苯基丁氮酮(Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
提高iRNA在細胞水準之攝入的試劑亦可添加至本發明之醫藥組合物及其他組合物中。舉例而言，亦已知陽離子脂質，諸如脂質體(Junichi等人，美國專利第5,705,188號)、陽離子甘油衍生物及聚陽離子分子，諸如聚離胺酸(Lollo等人，PCT申請案WO 97/30731)會提高dsRNA之細胞攝入。市售轉染試劑之實例尤其包括例如LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、293fectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、CellfectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、DMRIE-CTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、FreeStyleTM MAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、 LipofectamineTM 2000 CD(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、RNAiMAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OligofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OptifectTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、X-tremeGENE Q2轉染試劑(Roche；Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOTAP脂質體轉染試劑(Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOSPER脂質體轉染試劑(Grenzacherstrasse,Switzerland)或Fugene(Grenzacherstrasse,Switzerland)、Transfectam®試劑(Promega；Madison,WI)、TransFastTM轉染試劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-20試劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-50試劑(Promega；Madison,WI)、DreamFectTM(OZ Biosciences；Marseille,France)、EcoTransfect(OZ Biosciences；Marseille,France)、TransPassa D1轉染試劑(New England Biolabs；Ipswich,MA,USA)、LyoVecTM/LipoGenTM(Invivogen；San Diego,CA,USA)、PerFectin轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、NeuroPORTER轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER 2轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、Cytofectin轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、BaculoPORTER轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、TroganPORTERTM轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、RiboFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、PlasFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、UniFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)、SureFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)或HiFectTM(B-Bridge International,Mountain View,CA,USA)。
可用於提高所投與核酸之穿透的其他試劑包括二醇，諸如乙二醇及丙二醇；吡咯，諸如2-吡咯；氮酮及萜類，諸如檸檬烯及薄荷 酮。
載劑
本發明之某些組合物亦在調配物中併入載劑化合物。如本文所用，「載劑化合物」或「載劑」可指為惰性的(亦即本身不具有生物活性)但藉由活體內過程識別為核酸的核酸或其類似物，該活體內過程藉由例如分解生物活性核酸或促進其自循環移除來降低具有生物活性之核酸的生物可用性。共投與核酸及載劑化合物(載劑化合物通常過量)可導致肝臟、腎臟或其他循環外儲集器官中回收之核酸量實質上減少，此可能由於載劑化合物與核酸之間對共用受體之競爭。舉例而言，當與聚纖維糖酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸(polycytidic acid)或4-乙醯胺基-4'異硫氰基-芪-2,2'-二磺酸共投與時，部分硫代磷酸酯dsRNA於肝組織中之回收可減少(Miyao等人，DsRNA Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura等人，DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183)。
賦形劑
與載劑化合物相比，「醫藥載劑」或「賦形劑」為用於向動物傳遞一或多種核酸醫藥學上可接受之溶劑、懸浮劑或任何其他藥理學惰性媒劑。賦形劑可為液體或固體且根據打算之計劃投與方式選擇從而當與核酸及既定醫藥組合物之其他組分組合時提供所要容積、稠度等。典型醫藥載劑包括(但不限於)黏合劑(例如預膠凝玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥基丙基甲基纖維素等)；填充劑(例如乳糖及其他糖、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、二氧化矽、膠態二氧化矽、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(例如澱粉、羥基乙酸澱粉鈉等)；及濕潤劑(例如月桂基硫酸鈉等)。
適於非-非經腸投與且不與核酸有害反應的醫藥學上可接受之有機或無機賦形劑亦可用於調配本發明之組合物。適合醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮及其類似物。
用於表面投與核酸之調配物可包括無菌及非無菌水溶液、常用溶劑(諸如醇)中之非水溶液或核酸於液體或固體油基劑中之溶液。溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適合添加劑。可使用適於非-非經腸投與且不與核酸有害反應的醫藥學上可接受之有機或無機賦形劑。
適合醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮及其類似物。
其他組分
本發明之組合物可額外含有技術上確定使用量之醫藥組合物中常規存在之其他佐劑組分。因此，舉例而言，組合物可另外含有相容的醫藥學上活性材料，諸如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑，或可含有適用於物理調配本發明組合物之多種劑型的額外材料，諸如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及穩定劑。然而，此類材料在添加時不應不恰當地干擾本發明組合物之組分的生物活性。調配物可經滅菌，且需要時與例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳族物質及其類似物的助劑混合，該等助劑不會與調配物之核酸有害地相互作用。
水性懸浮液可含有提高懸浮液黏度之物質，包括例如羧基甲基纖維素鈉、山梨糖醇及/或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
在一些實施例中，本發明特性化之醫藥組合物包括(a)一或多種 iRNA化合物及(b)一或多種藉由非RNAi機制起作用的生物劑。此類生物劑之實例包括干擾LECT2與至少一種LECT2結合搭配物之相互作用的試劑。
此類化合物之毒性及治療功效可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如測定LD50(50%群體中之致死劑量)及ED50(在50%群體中治療上有效的劑量)。毒性與治療作用之間的劑量比率為治療指數且其可表示為比率LD50/ED50。呈現高治療指數之化合物為典型的。
自細胞培養分析法及動物研究獲得之資料可用於調配一系列用於人類的劑量。本發明特性化之組合物的劑量一般在包括幾乎不具有毒性或不具有毒性之ED50的循環濃度範圍內。劑量可視所採用劑型及所用投與途徑而定在此範圍內變化。對於本發明特性化之方法中所用的任何化合物，可自細胞培養分析法初始估算治療有效劑量。可在動物模型中調配劑量以達到化合物或適當時目標序列之多肽產品的循環血漿濃度範圍(例如實現降低濃度之多肽)，該範圍包括如細胞培養物中測得之IC50(亦即實現症狀之一半最大抑制的測試化合物濃度)。此類資訊可用於更精確判定人類中之適用劑量。血漿中之含量可例如藉由高效液相層析法量測。
除了如上文所述之投與之外，本發明特性化之iRNA可與有效治療與LECT2表現相關之疾病或病症的其他已知試劑組合投與。在任何情況下，投藥醫師可基於使用此項技術中已知或本文所述之標準功效量測觀測到的結果調整iRNA投與之量及時間安排。
治療與LECT2基因表現有關之病症的方法
本發明係關於靶向LECT2之iRNA抑制LECT2表現及/或治療與LECT2表現有關之疾病、病症或病理學過程的用途。
在一個態樣中，提供治療與LECT2表現有關之病症的方法，該方 法包含向有需要之個體投與本文揭示之iRNA(例如dsRNA)。在一些實施例中，iRNA抑制(降低)LECT2表現。在一些實施例中，iRNA提高LECT2表現。
如本文所用，「與LECT2表現有關之病症」、「與LECT2表現有關之疾病」、「與LECT2表現有關之病理學過程」或其類似術語包括LECT2表現經改變(例如相對於正常含量降低或增加)之任何病狀、病症或疾病。在一些實施例中，LECT2表現降低。在一些實施例中，LECT2表現提高。在實施例中，可在個體之血液(例如血漿)中偵測LECT2表現之降低或提高。在實施例中，可在來自個體之組織樣品(例如腎臟樣品或肝臟樣品)偵測LECT2表現中之降低或提高。可相對於同一個體在產生病症之前觀測到的含量或相對於未患病症之其他個體評定降低或提高。降低或提高可限於身體之特定器官、組織或區(例如腎臟或肝臟)。
如本文所用，待根據本文所述之方法治療的「個體」包括人類或非人類動物，例如哺乳動物。哺乳動物可為例如嚙齒動物(例如大鼠或小鼠)或靈長類動物(例如猴)。在一些實施例中，個體為人類。
「有需要之個體」包括患有或懷疑患有與LECT2表現有關之病症或處於產生與LECT2表現有關之病症風險中的個體。在一些實施例中，個體患有或懷疑患有與LECT2表現有關之病症。在一些實施例中，個體處於產生與LECT2表現有關之病症的風險中。
在一些實施例中，個體為用作與LECT2表現有關之病症(例如LECT2澱粉樣變性)之模型的動物。
LECT2澱粉樣變性
在實施例中，與LECT2表現有關之病症為澱粉樣變性，例如LECT2澱粉樣變性。LECT2澱粉樣變性已描述於若干臨床研究中。參見例如Benson,M.D.等人(2008)Kidney International,74：218-222； Murphy,C.L.等人(2010)Am J Kidney Dis,56(6)：1100-1107；Larsen,C.P.等人.(2010)Kidney Int.,77(9)：816-819；Holanda,D.G.等人.(20011)Nephrol.Dial.Transplant.,26(1)：373-376；及Sethi,S.等人.(2012)Kidney International 82,226-234(下文Sethi等人)。
LECT2澱粉樣變性之臨床及病理學特徵模擬澱粉樣蛋白輕鏈(AL)澱粉樣變性之臨床及病理學特徵。此等症狀包括例如腎病及腎衰竭之症狀，例如流體滯留、腫脹及呼吸短促。澱粉樣變性可影響心臟、周邊神經系統、胃腸道、血液、肺及皮膚。心臟併發症包括例如心臟衰竭及不規則心臟搏動。其他症狀包括例如中風、胃腸病症、肝腫大、脾臟功能下降、腎上腺及其他內分泌腺體功能下降、皮膚顏色改變或生長、肺問題、出血及瘀傷問題、疲勞及體重減輕。在實施例中，本文描述之方法於本文所述之一或多種症狀中之改善有關。
用於診斷澱粉樣變性(例如LECT2澱粉樣變性)之方法描述於例如Leung,N.等人.(2010)Blood,2012年9月4日線上公開；DOI 10.1182/blood-2012-03-413682；Shiller,S.M.等人(2011).Laboratory Methods for the Diagnosis of Hereditary Amyloidoses,Amyloidosis-Mechanisms and Prospects for Therapy,Dr.Svetlana Sarantseva(編)，ISBN：978-953-307-253-1；Sethi等人.(見上文)及美國專利申請公開案第20100323381號。
基於Sethi等人提供之結果，LECT2澱粉樣變性造成腎澱粉樣變性病例之顯著百分比。參見Sethi等人之表1，其顯示藉由雷射顯微切除及腎生物檢體及/或腎切除樣本之質譜研究的127個腎澱粉樣變性研究病例中26個確定為LECT2澱粉樣蛋白型。Sethi等人另外報導載脂蛋白E蛋白質及血清澱粉樣蛋白P組分(SAP)亦存在於全部LECT2澱粉樣變性病例中。
在實施例中，澱粉樣變性(例如LECT2澱粉樣變性)涉及全身澱粉 樣蛋白沈積。在實施例中，澱粉樣變性(例如LECT2澱粉樣變性)主要為局部的或主要侷限於特定組織或器官(例如腎臟或肝臟)。
在實施例中，澱粉樣變性(例如LECT2澱粉樣變性)為遺傳性的。
在實施例中，LECT2澱粉樣變性使用來自個體之樣品(例如生物檢體樣品)的分析診斷。在實施例中，生物檢體樣品為腎生物檢體。在實施例中，樣品為腎切除樣品。在實施例中，樣品來自肝臟生物檢體或其他經切除之肝臟組織。在實施例中，樣品使用選自免疫組織化學、LECT2免疫分析、電子顯微法、雷射顯微切除及質譜中之一或多者的方法分析。在實施例中，使用雷射顯微切除及質譜診斷LECT2澱粉樣變性。
在實施例中，澱粉樣變性(例如LECT2澱粉樣變性)影響腎臟，例如涉及腎臟中之澱粉樣蛋白沈積。在實施例中，腎功能由於澱粉樣變性而受損。在實施例中，個體遭受流體滯留、腫脹及呼吸短促中之一或多者。在實施例中，個體患有腎病症候群。在實施例中，個體罹患蛋白尿。在實施例中，個體患有腎衰竭。
在實施例中，澱粉樣變性(例如LECT2澱粉樣變性)影響肝臟，例如涉及肝臟中之澱粉樣蛋白沈積。在實施例中，肝功能由於澱粉樣變性而受損。在實施例中，個體患有肝炎，例如慢性肝炎。在實施例中，肝炎為病毒肝炎。
已發現LECT2澱粉樣變性在墨西哥裔美國人中尤其盛行且亦與編碼成熟蛋白質中位置40(未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之纈胺酸的LECT2基因之G對偶基因的同型性有關。參見例如Benson,M.D.等人.(2008)Kidney International,74：218-222：Murphy,C.L.等人.(2010)Am J Kidney Dis,56(6)：1100-1107。
在一些實施例中，個體為墨西哥後裔。在一些實施例中，個體為墨西哥裔美國人。
在實施例中，個體攜帶LECT2基因之G對偶基因，其編碼成熟蛋白質中位置40(未經處理蛋白質中之胺基酸58)處之纈胺酸。在實施例中，個體為G對偶基因之同型(G/G基因型)。在實施例中，個體中表現之LECT2蛋白質在成熟蛋白質中位置40處(或未經處理蛋白質中之胺基酸58處)具有纈胺酸。
在一些實施例中，該方法降低LECT2表現。在實施例中，相對於同一個體在治療之前的含量評定LECT2表現中之降低。在一些實施例中，藉由比較經治療個體(或個體群)中之LECT2表現程度與對照個體(或個體群)(例如未經治療個體(或個體群)或經不靶向LECT2之對照治療(例如iRNA(例如dsRNA)治療之個體(或個體群)))中之程度，該方法顯示降低LECT2表現。
在實施例中，該方法減少澱粉樣蛋白沈積，例如包含LECT2蛋白質或其部分之澱粉樣蛋白之沈積。在實施例中，蛋白質為野生型蛋白質。在實施例中，蛋白質為在位置40處(如本文所述，成熟分泌蛋白質之位置40或未經處理蛋白質中之胺基酸58處)包括纈胺酸的人類LECT2蛋白質或其部分。在實施例中，該方法降低澱粉樣蛋白沈積之尺寸、數目及/或程度。
在實施例中，該方法減輕一或多種與澱粉樣蛋白沈積有關之症狀。
在一些實施例中，dsRNA以使dsRNA靶向特定器官或組織以抑制該器官或組織中之澱粉樣蛋白沈積的形式投與。
在一些實施例中，dsRNA靶向肝臟。在一些實施例中，dsRNA結合至使dsRNA靶向肝臟(例如肝細胞)之配位體，例如GalNAc配位體(例如如本文所述之GalNAc配位體)。
本文亦提供一種減少澱粉樣蛋白沈積之方法，該方法包含向有需要之個體(例如患有或懷疑患有LECT2澱粉樣變性或處於產生 LECT2澱粉樣變性之風險中)投與如本文所揭示之dsRNA。在實施例中，該方法減少(例如預防或減輕)澱粉樣蛋白沈積之尺寸、數目及/或程度。澱粉樣蛋白沈積之尺寸、數目及/或程度可使用此項技術中已知之任何方法(例如免疫分析、免疫組織化學、質譜)評定。澱粉樣蛋白沈積之減少可涉及澱粉樣蛋白沈積(例如澱粉樣蛋白沈積之尺寸、數目及/或程度)減少至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或50%以上。
在本文提供之方法中，iRNA(例如dsRNA)及其組合物以治療有效量投與。投與LECT2 siRNA之治療作用可例如藉由與適當對照組比較實現。舉例而言，抑制澱粉樣蛋白沈積可例如藉由將任何適當參數(例如評定澱粉樣蛋白沈積之尺寸、數目或程度之參數)與適當對照組中之相同參數比較在患有澱粉樣變性(例如LECT2澱粉樣變性)之患者群中實現。對照組(例如交叉設計中之類似個體群或相同個體群)可包括例如未經治療群體、已使用習知治療進行治療的群體、已使用安慰劑或非靶向iRNA治療之群體，及其類似群體。
類風濕性關節炎
類風濕性關節炎亦為與LECT2表現有關之病症。詳言之，在日本群體中，發現擁有編碼成熟蛋白質中之位置40(或未經處理蛋白質中之胺基酸58)處的異白胺酸的LECT2基因之A對偶基因者產生類風濕性關節炎之整體風險提高。具有兩個A對偶基因與疾病嚴重程度高度相關。參見Kameoka,Y.等人.(2000)Arth Rheum,43(6)：1419-20。
在本文提供之方法的一個實施例中，與LECT2表現有關之病症為類風濕性關節炎。在一個實施例中，dsRNA抑制患有類風濕性關節炎之個體中的LECT2表現。在一些此類實施例中，dsRNA抑制源自滑膜組織及/或滑液之細胞(例如單核細胞及纖維母細胞)中的LECT2表現。在一些實施例中，dsRNA靶向編碼成熟蛋白質中之位置40(未經處理 蛋白質中之胺基酸58)處的異白胺酸的mRNA。
肝臟損傷
LECT2表現在急性肝臟損傷期間可能提高。
在本文提供之方法的一個實施例中，與LECT2表現有關之病症為急性肝臟損傷。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)調節(例如提高或降低)LECT2表現。在實施例中，iRNA調節肝臟中之LECT2表現。在實施例中，iRNA降低肝臟中之LECT2表現。在實施例中，iRNA提高肝臟中之LECT2表現。
組合療法
在實施例中，本文揭示之iRNA(例如dsRNA)與已知有效治療與LECT2表現有關之病症(例如LECT2澱粉樣變性)或此類病症之症狀的第二療法(例如一或多種額外療法)組合投與。iRNA可在第二療法之前、之後或同時投與。在實施例中，iRNA在第二療法之前投與。在實施例中，iRNA在第二療法之後投與。在實施例中，iRNA與第二療法同時投與。
第二療法可為額外治療劑。iRNA及額外治療劑可在相同組合物中組合投與或額外治療劑可作為各別組合物之部分投與。
在一些實施例中，第二療法為有效治療病症或病症之症狀的非iRNA治療劑。
在一些實施例中，待藉由本文揭示之組合物或方法治療之病症為例如藉由腎臟中之澱粉樣蛋白沈積影響腎功能之LECT2澱粉樣變性。在一些此類實施例中，iRNA與支持腎功能之療法(例如透析、利尿劑、血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑、血管收縮素受體阻斷劑(ARB)或透析)結合投與。
在一些實施例中，待藉由本文揭示之組合物或方法治療之病症為LECT2澱粉樣變性，其涉及肝臟中之澱粉樣蛋白沈積。在一些此類 實施例中，iRNA與支持肝功能之療法結合投與。
在一些實施例中，待藉由本文揭示之組合物或方法治療的病症為LECT2澱粉樣變性，且iRNA與移除受澱粉樣變性影響之所有或部分器官(例如割除受澱粉樣變性影響之腎臟或肝臟組織的全部或部分)結合投與。移除視情況與置換全部或部分移除器官結合進行(例如與腎臟或肝臟器官移植結合)。
投與劑量、途徑及時間安排
可向個體(例如人類個體，例如患者)投與治療量之iRNA。治療量可為例如0.05-50mg/kg。舉例而言，治療量可為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、or 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/kg dsRNA。
在一些實施例中，調配iRNA用於傳遞至目標器官，例如肝臟。
在一些實施例中，iRNA調配為脂質調配物，例如如本文所述之LNP調配物。在一些此類實施例中，治療量為0.05-5mg/kg，例如0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0mg/kg dsRNA。在一些實施例中，靜脈內投與脂質調配物(例如LNP調配物)。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)調配為LNP調配物且以0.1至0.5mg/kg劑量投與(例如靜脈內投與)。
在一些實施例中，藉由經一段時間(諸如5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘或25分鐘時段)靜脈內輸注投與iRNA。
在一些實施例中，iRNA呈如本文所述之GalNAc結合物形式。在一些此類實施例中，治療量為0.5-50mg，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/kg dsRNA。在一些實施例
中，皮下投與GalNAc結合物。在實施例中，iRNA(例如dsRNA)呈GalNAc結合物形式且以1至10mg/kg劑量投與(例如皮下投與)。
在一些實施例中，例如定期(諸如每天、每兩週(亦即每兩週一次))重複投與持續一個月、兩個月、三個月、四個月或四個月以上。最初治療方案之後，可以較低頻率投與治療。舉例而言，在每兩週投與持續三個月之後，投與可每月重複一次持續六個月或一年或一年以上。
在一些實施例中，iRNA劑分兩次或兩次以上劑量投與。在一些實施例中，隨後劑量之數目及量取決於所要作用之實現，例如抑制澱粉樣蛋白沈積，或治療或預防作用之實現，例如減輕或預防一或多種與病症有關之症狀。
在一些實施例中，根據時程投與iRNA劑。舉例而言，iRNA劑可每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次或每週五次投與。在一些實施例中，時程涉及有規律間隔投與，例如每小時、每四小時、每六小時、每八小時、每十二小時、每天、每兩天、每三天、每四天、每五天、每週、每兩週或每月。在實施例中，iRNA劑以實現所要作用所需之頻率投與。
在實施例中，時程涉及緊密間隔投與，隨後較長時段不投與藥劑。舉例而言，時程可涉及在相對短時間段(例如約每6小時、約每12小時、約每24小時、約每48小時或約每72小時)投與最初劑量組，隨後較長時段不投與iRNA劑(例如約1週、約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週或約8週)。在一個實施例中，iRNA劑最初每小時投與且隨後以較長間隔(例如每天、每週、每兩週或每月)投與。在另一實施例中，iRNA劑最初每天投與且隨後以較長間隔(例如每週、每兩週或每月)投與。在某些實施例中，較長間隔隨時間增加或基於所要作用之實現判斷。
在投與全部劑量之iRNA之前，可向患者投與較小劑量，諸如5%輸注劑量，且監測不良作用，諸如過敏性反應，或升高之脂質含量或血壓。在另一實例中，可監測患者之非所需作用。
調節LECT2基因表現之方法
在另一態樣中，本發明提供一種用於在細胞或個體中調節(例如抑制或活化)LECT2基因表現之方法。在一些實施例中，細胞為離體、活體外或活體內的。在一些實施例中，細胞為肝臟(例如肝細胞)。在一些實施例中，細胞在個體(例如哺乳動物，諸如人類)中。在一些實施例中，個體(例如人類)處於與如本文所述之LECT2表現的表現有關之病症的風險中或診斷為患有該病症。
在一個實施例中，該方法包括使細胞與有效降低細胞中LECT2基因表現之量的如本文所述之iRNA接觸。如本文所用，「接觸」包括直接接觸細胞，以及間接接觸細胞。舉例而言，當向個體(例如靜脈內或皮下)投與包含iRNA之組合物時，可接觸個體內之細胞。
LECT2基因之表現可基於LECT2 mRNA之表現程度、LECT2蛋白質或功能上與LECT2基因表現程度關聯之另一參數的程度評定。在一些實施例中LECT2表現抑制至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在一些實施例中，iRNA之IC50在0.001-0.01nM、0.001-0.10nM、0.001-1.0nM、0.001-10nM、0.01-0.05nM、0.01-0.50nM、0.02-0.60nM、0.01-1.0nM、0.01-1.5nM、0.01-10nM範圍內。IC50值可相對於適當對照值(例如非靶向iRNA之IC50)標準化。
在一些實施例中，該方法包括向細胞中引入如本文所述之iRNA且維持細胞足以達到LECT2基因之mRNA轉錄物分解的時間，藉此抑 制細胞中LECT2基因之表現。
在一個實施例中，該方法包括向哺乳動物投與本文所述之組合物(例如包含靶向LECT2之iRNA的組合物)，以便降低目標LECT2基因之表現，諸如長期維持，例如至少兩天、三天、四天或四天以上，例如一週、兩週、三週或四週或四週以上。在一些實施例中，可在第一次投與的1小時、2小時、4小時、8小時、12小時或24小時內偵測到LECT2表現降低。
在另一實施例中，該方法包括向哺乳動物投與如本文所述之組合物，使得目標LECT2基因之表現相較於未處理動物增加例如至少10%。在一些實施例中，LECT2之活化作用可長期維持，例如至少兩天、三天、四天或四天以上，例如一週、兩週、三週、四週或四週以上。不希望受理論約束，iRNA可藉由穩定LECT2 mRNA轉錄物、與基因組中之啟動子相互作用、及/或抑制LECT2表現之抑制劑來活化LECT2表現。
適用於本發明之方法及組合物特性的iRNA特異性靶向LECT2基因之RNA(原生或經處理)。用於使用iRNA抑制LECT2基因表現之組合物及方法可如本文別處所述製備及執行。
在一個實施例中，該方法包括投與含有iRNA之組合物，其中iRNA包括與待治療個體(例如哺乳動物，例如人類)之LECT2基因的RNA轉錄物之至少一部分互補的核苷酸序列。組合物可藉由此項技術中已知之任何適當方式投與，包括(但不限於)經口、腹膜內或非經腸途徑，包括顱內(例如腦室內、腦實質內及鞘內)、靜脈內、肌肉內、皮下、經皮、氣管(噴霧劑)、經鼻、直腸及表面(包括頰內及舌下)投與。
在某些實施例中，組合物藉由靜脈內輸注或注射投與。在一些此類實施例中，組合物包含脂質調配之siRNA(例如LNP調配物，諸如 LNP11調配物)用於靜脈內輸注。
在其他實施例中，組合物經皮下投與。在一些此類實施例中，組合物包含與GalNAc配位體結合之iRNA。在一些此類實施例中，配位體使iRNA靶向肝臟(例如肝細胞)。
除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。儘管可使用與本文所述之方法及材料類似或等效的方法及材料實施或測試本發明特性化之iRNA及方法，但下文描述適合方法及材料。所有公開案、專利申請案、專利及所提及之其他參考案均以全文引用的方式併入本文中。在有矛盾的情況下，將以本發明(包括定義)為準。另外，本文所述之材料、方法及實例僅為說明性的且並不欲作為限制。
實例 實例1. LECT2 siRNA
本文提供之核酸序列使用標準命名法表示。參見表1之縮寫。
1TL96之化學結構如下：
實驗方法 生物資訊 轉錄物
進行siRNA設計以鑑別靶向人類、食蟹獼猴、小鼠及大鼠LECT2轉錄物之siRNA。設計使用以下來自NCBI基因資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)標註之NCBI RefSeq集合之轉錄物：人類NM_002302.2；小鼠NM_010702.1；大鼠NM_001108405.1。對於食蟹獼猴，設計使用根據源自肝臟之cDNA文庫定序之轉錄物。由於高靈長類動物/嚙齒動物序列分異度，siRNA雙螺旋體分若干各別批次設計，包括(但不限於)僅含有匹配人類及食蟹獼猴轉錄物之雙螺旋體；僅人類、食蟹獼猴及小鼠轉錄物；及僅人類、食蟹獼猴、小鼠及大鼠轉錄物的批次。大多數siRNA雙螺旋體設計成所列人類轉錄物與各設計批次中考慮之其他物種轉錄物(上述)之間享有100%一致性。在一些情況下，當反義股：目標mRNA互補鹼基對為GC或CG對時(參見表3，具有標記G21U、G21A、C21A之寡聚物)，第一反義(最後有義)位置允許雙螺旋體與mRNA目標之間的錯配。在此等情況下，雙螺旋體設計成在第一反義：最後有義對處具有UA或AU對。因此，雙螺旋體保持互補但關於目標錯配(U：C、U：G、A：C或A：G)。
siRNA設計、特異性及功效預測
全部可能19mer之預測特異性是從各序列預測。接著選擇缺乏超過7個核苷酸之重複單元的候選19mer。此等353候選人類/食蟹獼猴、24人類/食蟹獼猴/小鼠及10人類/食蟹獼猴/小鼠/大鼠siRNA用於使用python指令碼『BruteForce.py』中建構之詳盡「暴力破解」算法的針對適當轉錄組(定義為人類、食蟹獼猴、小鼠或大鼠NCBI Refseq組內NM_及XM_記錄之集合)之全面研究。指令碼隨後解析轉錄物-寡比對，產生基於siRNA與任何潛在『脫靶』轉錄物之間錯配的位置及數目之評分。脫靶評分經加權以強調siRNA在從分子5'端之位置2-9中的『種子』區中之差異。藉由對個別錯配評分求和給出針對來自暴力破解研究之各寡-轉錄物對的錯配評分；位置2-9中之錯配視為2.8，裂解位點位置10-11中之錯配視為1.2，且區12-19中之錯配視為1.0。藉由比較七聚體及八聚體之頻率進行額外脫靶預測，七聚體及八聚體源自由各寡聚物之六聚體產生的3個獨特種子。相對於5'開始的位置2-7之六聚體用於形成2個七聚體及一個八聚體。藉由向六聚體添加3'A形成『七聚體1』，藉由向六聚體添加5'A形成七聚體2；藉由向六聚體之5'及3'端添加A形成八聚體。預先計算人類、食蟹獼猴、小鼠或大鼠3'UTRome中之八聚體及七聚體(定義為來自NCBI's Refseq資料庫之轉錄組的子序列，其中編碼區之末端『CDS』經明確定義)頻率。使用來自八聚體頻率範圍之中位值將八聚體頻率根據七聚物頻率標準化。接著藉由計算((3×標準化八聚體計數)+(2×七聚體2計數)+(1×七聚體1計數))之和計算『mirSeedScore』。
根據計算之評分將兩個siRNA股分成特異性類別：評分高於3取得高度特異性資格，等於3取得特異性資格且2.2至2.8取得中等特異性資格。雙螺旋體藉由反義股之特異性分類，接著選擇反義寡聚物具有高預測功效之雙螺旋體(包括種子區之最大UA含量及低全部GC含量) 特徵的中等(或較高)特異性雙螺旋體。選擇23種人類/食蟹獼猴/小鼠有義：反義寡核苷酸對，包括第一反義位置換為UA(上述)之6種。類似地，選擇24種人類/食蟹獼猴及5種人類/食蟹獼猴/小鼠/大鼠寡核苷酸對。所選反義寡聚物接著長度延長至23個核苷酸，且有義寡聚物長度延長至21個核苷酸。接著選擇仍完全匹配至少人類及食蟹獼猴轉錄物之48寡核苷酸對(不包括UA調換序列之第一位置)用於合成及黏接至雙螺旋體。(表3)
亦選擇匹配至少人類LECT2轉錄物的一組198對19mer寡聚物。選擇與全部其他註釋人類轉錄物具有至少一個錯配且具有如上文之良好預測功效的此等。(表2)
1H：人類；C：食蟹獼猴；M：小鼠；R：大鼠
實例2. LECT2 siRNA之活體外篩選 實驗方法 細胞培養及轉染：
藉由向96孔板中之每孔5μl siRNA雙螺旋體中每孔添加14.8μl Opti-MEM加0.2μl脂染胺RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.目錄號13778-150)轉染原生食蟹獼猴肝細胞(PCH)(Celsis # M003055，批次CBT)且在室溫下培育15分鐘。接著向siRNA混合物中添加含有約2×104個PCH細胞之80μl InVitroGRO CP大鼠培養基(InVitro Technologies)。在RNA純化之前培育細胞24小時。在10nM及0.1nM最終雙螺旋體濃度下進行單次劑量實驗且經8、6倍稀釋在10nM至36fM最終雙螺旋體濃度之劑量範圍上進行劑量反應實驗。
RNA分離：
使用DYNABEADS mRNA分離套組(Invitrogen，物料編號：610-12)進行總RNA分離。採集細胞且溶解於150μl溶解/結合緩衝液中，接著在850rpm下使用Eppendorf Thermomixer混合5分鐘(整個方法中混合速度相同)。向圓底板中添加10μl磁性珠粒及80μl溶解/結合緩衝液混合物且混合1分鐘。使用磁性表座捕捉磁性珠粒且移除清液層而不擾亂珠粒。移除清液層後，將溶解之細胞添加至剩餘珠粒中且混合5分鐘。移除清液層後，磁性珠粒用150μl洗滌緩衝液A洗滌2次且混合1分鐘。再次捕捉珠粒且移除清液層。珠粒接著用150μl洗滌緩衝液B洗滌，捕捉且移除清液層。珠粒隨後用150μl溶離緩衝液洗滌，捕捉且移除清液層。使珠粒乾燥2分鐘。乾燥後，添加50μl溶離緩衝液且在70℃下混合5分鐘。將珠粒捕捉於磁體上5分鐘。移除40μl清液層且添加至另一96孔板。
cDNA合成：
使用ABI高能力cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA，目錄號4368813)合成cDNA。每次反應向10μl總RNA中添加2μl 10×緩衝液、0.8μl 25×dNTP、2μl隨機引子、1μl反轉錄酶、1μl RNase抑制劑及3.2μl H2O之主混合物。使用Bio-Rad C-1000或S-1000熱循環機(Hercules,CA)藉由以下步驟產生cDNA：25℃ 10分鐘，37℃ 120分鐘，85℃ 5秒，4℃保持。
即時PCR：
向384孔板(Roche目錄號04887301001)中之每孔中含有0.5μl定製設計之食蟹獼猴GAPDH TaqMan探針(F-GCATCCTGGGCTACACTGA(SEQ ID NO：494)、R-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO：495)、探針-CCAGGTGGTCTCCTCC(SEQ ID NO：496))、0.5μl人類Lect2(Hs01040204_m1-其具有與食蟹獼猴Lect2之交叉反應性)及5μl Lightcycler 480探針主混合物(Roche目錄號04887301001)之主混合物中添加2μl cDNA。使用△△Ct(RQ)分析法在LightCycler480即時PCR系統(Roche)中進行即時PCR。除非概述表中另外說明，否則在兩次獨立轉染中測試各雙螺旋體且一式兩份地分析轉染。
為了計算相對倍數變化，即時資料使用△△Ct方法分析且根據使用10nM AD-1955轉染之細胞或模擬轉染細胞進行的分析法標準化。IC50用使用XLFit之4參數擬合模型計算且使用AD-1955轉染之細胞或原生細胞標準化。
經修飾及未經修飾之LECT2 siRNA序列分別顯示於表5及6中。本文提供之核酸序列使用標準命名法(參見表1之縮寫)表示。在一些情況下，當反義股：目標mRNA互補鹼基對為GC或CG對時(參見表5及6，具有標記G21U、G21A、C21A之寡聚物)，第一反義(最後有義)位置允許雙螺旋體與mRNA目標之間的錯配。在此等情況下，雙螺旋體設計成在第一反義：最後有義對處具有UA或AU對。因此，雙螺旋體保持互補但關於目標錯配(U：C、U：G、A：C或A：G)。
結果
原生猴肝細胞中之單次劑量篩選結果顯示於表7中。單次劑量實驗在10nM及0.1nM最終雙螺旋體濃度下進行且資料表示為剩餘訊息相對於AD-1955非靶向對照之百分比。
單次劑量篩選中測試之LECT2 siRNA雙螺旋體子組在原生猴肝細胞中之劑量反應篩選中進一步測試。結果顯示於表8中。在10nM至36fM最終雙螺旋體濃度之劑量範圍上進行劑量反應實驗。資料表示為IC50值。
實例3. LECT2 siRNA基因行走 實驗方法 生物資訊：
使用常規R及Python腳本設計一組靶向人類LECT2基因(NCBI refseqID NM_002302.2；NCBI基因ID 3950「源自白細胞之趨化因子2」)之93重疊siRNA。LECT2 REFSEQ mRNA長度為1077個鹼基。
活體外篩選： 細胞培養及轉染：
藉由向96孔板中之每孔5μl siRNA雙螺旋體中每孔添加14.8μl Opti-MEM加0.2μl脂染胺RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.目錄號 13778-150)轉染原生食蟹獼猴肝細胞(PCH,Celsis # M003055，批次CBT)且在室溫下培育15分鐘。接著將含有約2×104個PCH細胞之80μl無酚紅威廉姆斯介質E(phenol red-free Williams Medium E)(Life Technologies #A1217601)添加至siRNA混合物中。在RNA純化之前培育細胞24小時。在10nM下進行單次劑量實驗。
使用DYNABEADS mRNA分離套組(Invitrogen，物料編號：610-12)進行總RNA分離。採集細胞且溶解於150μl溶解/結合緩衝液中，接著在850rpm下使用Eppendorf Thermomixer混合5分鐘(整個方法中混合速度相同)。向圓底板中添加10μl磁性珠粒及80μl溶解/結合緩衝液混合物且混合1分鐘。使用磁性表座捕捉磁性珠粒且移除清液層而不擾亂珠粒。移除清液層後，將溶解之細胞添加至剩餘珠粒中且混合5分鐘。移除清液層後，磁性珠粒用150μl洗滌緩衝液A洗滌2次且混合1分鐘。再次捕捉珠粒且移除清液層。珠粒接著用150μl洗滌緩衝液B洗滌，捕捉且移除清液層。珠粒隨後用150μl溶離緩衝液洗滌，捕捉且移除清液層。使珠粒乾燥2分鐘。乾燥後，添加50μl溶離緩衝液且在70℃下混合5分鐘。將珠粒捕捉於磁體上5分鐘。移除40μl清液層且添加至另一96孔板。
cDNA合成：
使用ABI高能力cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA，目錄號4368813)合成cDNA。每次反應向10μl總RNA中添加2μl 10×緩衝液、0.8μl 25×dNTP、2μl隨機因子、1μl反轉錄酶、1μl RNase抑制劑及3.2μl H2O之主混合物。使用Bio-Rad C-1000或S-1000熱循環機(Hercules,CA)藉由以下步驟產生cDNA：25℃ 10分鐘，37℃ 120分鐘，85℃ 5秒，4℃保持。
即時PCR：
向384孔板(Roche目錄號04887301001)中之每孔中含有0.5μl定製 設計之食蟹獼猴GAPDH TaqMan探針(F-GCATCCTGGGCTACACTGA(SEQ ID NO：494)、R-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO：495)、探針-CCAGGTGGTCTCCTCC(SEQ ID NO：496))、0.5μl人類Lect2(Hs01040204_m1-其具有與食蟹獼猴Lect2之交叉反應性)及5μl Lightcycler 480探針主混合物(Roche目錄號04887301001)之主混合物中添加2μl cDNA。使用△△Ct(RQ)分析法在LightCycler480即時PCR系統(Roche)中進行即時PCR。除非概述表中另外說明，否則在兩次獨立轉染中測試各雙螺旋體且一式兩份地分析轉染。為了計算相對倍數變化，即時資料使用△△Ct方法分析且根據使用10nM AD-1955轉染之細胞或模擬轉染細胞進行的分析法標準化。
經修飾及未經修飾之LECT2 siRNA序列分別顯示於表9及10中。本文提供之核酸序列使用標準命名法(參見表1之縮寫)表示。
結果
使用經修飾LECT2 siRNA序列的原生猴肝細胞中之單次劑量篩選結果顯示於表11中。單次劑量實驗在10nM最終雙螺旋體濃度下進行且資料表示為剩餘訊息相對於AD-1955非靶向對照之百分比。
等效物
熟習此項技術者頂多使用常規實驗即可識別或能夠確定本文中所述之本發明的特定實施例的許多等效物。此類等效物欲由隨附申請專利範圍所涵蓋。
<110> 美商艾爾妮蘭製藥公司
<120> 抑制LECT2基因表現之組合物及方法
<130> A2038-7200TW
<140>
<141>
<150> 62/035,819
<151> 2014-08-11
<150> 61/885,693
<151> 2013-10-02
<160> 1053
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1077
<212> DNA
<213> 智人
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<211> 19
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<211> 19
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<212> RNA
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<211> 19
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<210> 1034
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<210> 1038
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<212> RNA
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<220>
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<220>
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<212> RNA
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<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<211> 19
<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
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<220>
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<210> 1044
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1044
<210> 1045
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<210> 1046
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1046
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1048
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1049
<210> 1050
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1050
<210> 1051
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1051
<210> 1052
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1052
<210> 1053
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /備註=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 1053

Claims (74)

  1. 一種用於抑制LECT2表現之雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含長度為15-30對鹼基之有義股及長度為15-30對鹼基之反義股，且該反義股與SEQ ID NO：1之至少15個連續核苷酸互補。
  2. 一種用於抑制LECT2表現之雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含有義股及反義股，該反義股包含與LECT2 RNA轉錄物互補之區，該反義股包含與表2-3、5-6及9-10中所列之反義序列中之一者區別不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
  3. 如請求項1或2之dsRNA，其中該dsRNA包含至少一個經修飾核苷酸。
  4. 一種包含互補之有義股與反義股的雙股RNAi(dsRNA)，其中該反義股包含與包含SEQ ID NO：1之LECT2 RNA轉錄物或在SEQ ID NO：1之核苷酸位置373處具有A至G取代之核苷酸序列互補之區，其中各股具有約14至約30個核苷酸，其中該dsRNA由式(III)表示：有義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'反義：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5'(III)其中：i、j、k及l各自獨立地為0或1；p、p'、q及q'各自獨立地為0-6；Na及Na'各自獨立地表示包含0-25個經修飾或未經修飾之核苷酸或其組合的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸； Nb及Nb'各自獨立地表示包含0-10個經修飾或未經修飾之核苷酸或其組合之寡核苷酸序列；np、np'、nq及nq'各自獨立地表示突出端核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾的基元；Nb之修飾不同於Y之修飾且Nb'之修飾不同於Y'之修飾。
  5. 如請求項4之dsRNA，其中i為1；j為1；或i及j皆為1。
  6. 如請求項4之dsRNA，其中k為1；l為1；或k及l皆為1。
  7. 如請求項4之dsRNA，其中XXX與X'X'X'互補，YYY與Y'Y'Y'互補，且ZZZ與Z'Z'Z'互補。
  8. 如請求項4之dsRNA，其中Y'Y'Y'基元存在於該反義股自5'端起之11、12及13位置處。
  9. 如請求項8之dsRNA，其中Y'為2'-O-甲基。
  10. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該雙螺旋區之長度為15-30對核苷酸。
  11. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該雙螺旋區之長度為17-23對核苷酸。
  12. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該雙螺旋區之長度為19-21對核苷酸。
  13. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該雙螺旋區之長度為21-23對核苷酸。
  14. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該互補區之長度為至少17個核苷酸。
  15. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該互補區之長度為19個核苷酸。
  16. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該互補區之長度為19至21 個核苷酸。
  17. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中至少一個股包含具有至少1個核苷酸之3'突出端。
  18. 如請求項10之dsRNA，其中至少一個股包含具有至少2個核苷酸之3'突出端。
  19. 如請求項3或4之dsRNA，其中該等經修飾核苷酸中之至少一者係選自由以下組成之群：2'-O-甲基修飾之核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基之核苷酸及連接至膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基之末端核苷酸。
  20. 如請求項3或4之dsRNA，其中該等經修飾核苷酸中之至少一者係選自由以下組成之群：2'-去氧-2'氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核酸(LNA)、非環核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基-修飾之核苷酸、2'-烷基-修飾之核苷酸、(N-嗎啉基)核苷酸、胺基磷酸酯及包含非天然鹼基之核苷酸。
  21. 如請求項3或4之dsRNA，其中該等核苷酸上之該等修飾係選自由以下組成之群：鎖核酸(LNA)、非環核苷酸、己糖醇或己醣核酸(HNA)、環己烯核酸(CeNA)、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-去氧、2'-羥基及其組合。
  22. 如請求項3或4之dsRNA，其中該等核苷酸上之該等修飾為2'-O-甲基、2'-氟或兩者。
  23. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該有義股與至少一個配位體結合。
  24. 如請求項23之dsRNA，其中該配位體連接至該有義股之3'端。
  25. 如請求項23之dsRNA，其中該配位體包含碳水化合物。
  26. 如請求項23之dsRNA，其中該配位體為GalNAc配位體。
  27. 如請求項23之dsRNA，其中該配位體為
  28. 如請求項23至27中任一項之dsRNA，其中該配位體經連接子連接。
  29. 如請求項28之dsRNA，其中該連接子為二價或三價分支鏈連接子。
  30. 如請求項28之dsRNA，其中該配位體及連接子如式XXIV中所示：
  31. 如請求項23至30中任一項之dsRNA，其中該配位體使該dsRNA靶向肝細胞。
  32. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該互補區由選自表2-3、5-6及9-10中所揭示反義序列的反義序列組成。
  33. 如前述請求項中任一項之dsRNA，其中該dsRNA包含由選自表2-3、5-6及9-10中所揭示有義序列的有義序列組成之有義股，及由選自表2-3、5-6及9-10中所揭示反義序列的反義序列組成之反義股。
  34. 一種細胞，其含有如前述請求項中任一項之dsRNA。
  35. 一種用於抑制LECT2基因表現之醫藥組合物，該組合物包含如請求項1至33中任一項之dsRNA。
  36. 如請求項35之醫藥組合物，其中dsRNA含於未緩衝溶液中投與。
  37. 如請求項36之醫藥組合物，其中該未緩衝溶液為生理食鹽水或水。
  38. 如請求項35之醫藥組合物，其中該dsRNA與緩衝溶液一起投與。
  39. 如請求項38之醫藥組合物，其中該緩衝溶液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白(prolamine)、碳酸鹽、磷酸鹽或其任何組合。
  40. 如請求項38之醫藥組合物，其中該緩衝溶液為磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。
  41. 如請求項35之醫藥組合物，其中該組合物包含脂質調配物。
  42. 如請求項41之醫藥組合物，其中該脂質調配物為LNP調配物。
  43. 如請求項42之醫藥組合物，其中該脂質調配物為LNP11調配物。
  44. 如請求項35至43中任一項之醫藥組合物，其中該dsRNA靶向肝臟細胞或肝細胞。
  45. 如請求項35至44中任一項之醫藥組合物，其中該組合物經靜脈內投與。
  46. 如請求項35至44中任一項之醫藥組合物，其中該組合物經皮下投與。
  47. 如請求項45之醫藥組合物，其中該組合物包含脂質調配物且經靜脈內投與。
  48. 如請求項46之醫藥組合物，其中該組合物包含與選自碳水化合物配位體或GalNAc配位體之配位體結合的dsRNA。
  49. 一種抑制細胞中LECT2表現之方法，該方法包含：(a)向該細胞中引入如請求項1至33中任一項之dsRNA，及(b)維持步驟(a)之細胞持續足以達到LECT2基因之mRNA轉 錄物分解的時間，藉此抑制該細胞中之該LECT2基因表現。
  50. 如請求項49之方法，其中該細胞係於離體、活體外或活體內處理。
  51. 如請求項49之方法，其中該細胞存在於需要治療、預防及/或處理與LECT2表現相關之病症的個體中。
  52. 如請求項51之方法，其中該病症為澱粉樣變性。
  53. 如請求項52之方法，其中該澱粉樣變性為LECT2澱粉樣變性。
  54. 如請求項49至53中任一項之方法，其中該細胞為肝臟細胞或肝細胞。
  55. 如請求項49至54中任一項之方法，其中抑制該LECT2表現至少20%。
  56. 如請求項49至54中任一項之方法，其中抑制該LECT2表現至少30%。
  57. 一種治療與LECT2表現有關之病症的方法，其包括向需要該治療之個體投與治療有效量之(i)如請求項1至33中任一項之dsRNA，或(ii)如請求項35至48中任一項之組合物。
  58. 一種治療LECT2澱粉樣變性之方法，其包括向需要該治療之個體投與雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包含長度為15-30對鹼基的有義股及長度為15-30對鹼基之反義股，且該反義股與SEQ ID NO：1之至少15個連續核苷酸或在SEQ ID NO：1之核苷酸位置373處具有A至G取代之核苷酸序列互補。
  59. 如請求項57或58之方法，其中該個體患有澱粉樣變性或處於產生澱粉樣變性之風險中。
  60. 如請求項57或58之方法，其中該澱粉樣變性為LECT2澱粉樣變性。
  61. 如請求項49至60中任一項之方法，其中該dsRNA或包含該dsRNA之組合物根據給藥方案投與。
  62. 如請求項61之方法，其中該給藥方案為每週、每兩週或每月。
  63. 如請求項49至62中任一項之方法，其中該方法減少LECT2澱粉樣蛋白沈積。
  64. 一種減少患有LECT2澱粉樣變性之個體中LECT2澱粉樣蛋白沈積之方法，該方法包括向該個體投與(i)如請求項1至33中任一項之dsRNA，或(ii)如請求項35至48中任一項之組合物。
  65. 如請求項57至64中任一項之方法，其中該dsRNA以0.05-50mg/kg之劑量投與。
  66. 如請求項57至64中任一項之方法，其中該dsRNA以0.01mg/kg至5mg/kg該個體體重之濃度投與。
  67. 如請求項65之方法，其中該dsRNA調配為LNP調配物且以0.1mg/kg至0.5mg/kg之劑量投與。
  68. 如請求項65之方法，其中該dsRNA結合至GalNAc配位體。
  69. 如請求項65之方法，其中該dsRNA結合至GalNAc配位體且以1mg/kg至10mg/kg之劑量投與。
  70. 一種編碼dsRNA之至少一個股的載體，其中該dsRNA包含與編碼LECT2之mRNA之至少一部分互補之區，其中該dsRNA長度為30對鹼基或小於30對鹼基，且其中該dsRNA靶向該mRNA使之裂解。
  71. 如請求項70之載體，其中該互補區之長度為至少15個核苷酸。
  72. 如請求項70之載體，其中該dsRNA包含選自表2、3、5、6、9或10中所揭示序列的反義序列及/或有義序列。
  73. 如請求項70至72中任一項之載體，其中該互補區之長度為19至 21個核苷酸。
  74. 一種細胞，其包含如請求項70至73中任一項之載體。
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