CN110592030B

CN110592030B - 特异性抑制肝内lect2表达的腺相关病毒、构建及应用

Info

Publication number: CN110592030B
Application number: CN201910488390.4A
Authority: CN
Inventors: 虞朝辉; 厉有名; 王景骅; 洪东升
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2019-06-05
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2039-06-05
Also published as: CN110592030A

Abstract

本发明涉及一种特异性抑制肝内LECT2表达的腺相关病毒及其构建方法，以及其在制备防治非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。本发明构建了一种特异性抑制肝内LECT2表达的腺相关病毒，该腺相关病毒对LECT2的表达和分泌具有很高的抑制效果，从而达到防治非酒精性脂肪性肝病的作用，为新药筛选提供了基础。

Description

特异性抑制肝内LECT2表达的腺相关病毒、构建及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种特异性抑制肝内LECT2表达的腺相关病毒及其构建方法，以及其在制备防治非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。

(二)背景技术

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，其病理学改变以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征，它也是肝硬化和肝癌的重要病因。目前，诊断NAFLD的“金标准”依旧为肝脏活检，但是肝脏活检在临床上的应用有许多制约因素，如费用十分昂贵，可能出现肝内出血、胆汁渗漏、皮下血肿及全身感染等多种严重并发症。因此它不适合作为NAFLD常规筛查和疗效评估的首选方法。临床最多的NAFLD诊断方法是肝脏超声，但肝脏超声仍有缺陷，肝脏超声对肝脏脂变小于30％的患者诊断能力较差，对于腹部脂肪较多以及肥胖患者，肝脏超声诊断能力也有一定的降低。同时肝脏超声无法对NAFLD的严重程度进行评估，仅能作为初步筛查的手段。近来，更多的研究都聚焦在用血清学标志物来诊断NAFLD，如细胞角蛋白18，成纤维生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF-21)，视黄醇结合蛋白4等。但均仅局限于基础研究，尚未推广至临床。

白细胞衍生趋化因子2(leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2)是一种中性粒细胞趋化蛋白，近年来的研究发现，LECT2在调控机体代谢方面有着非常重要的作用，并可能调控NAFLD的发生和发展。本发明拟构建带有LECT2抑制序列的腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)来抑制小鼠肝脏LECT2的表达，从而观察LECT2在NAFLD中起到的具体作用。

(三)发明内容

本发明采用的技术方案是：

一种特异性抑制肝内LECT2表达的腺相关病毒，由如下方法构建获得：

(1)AAV293细胞经复苏，传代培养，待已贴壁的AAV293细胞密度长至30％～40％时，进行下一步质粒转染；

(2)构建含LECT2抑制序列(优选为CGTGCATTCTAACAGAAACAT)的目的质粒，将其与AAV2/8质粒和δF6质粒共同孵育，得到复合物；

(3)将步骤(2)复合物以PEI转染法转染至步骤(1)AAV293细胞中，经裂解，纯化，获得所述特异性抑制肝内LECT2表达的腺相关病毒。

步骤(2)中，所述目的质粒、AAV2/8质粒和δF6质粒用量之比为5～10:5～10:20，优选为7:7:20。

本发明还涉及构建所述的腺相关病毒的方法，所述方法包括：

(2)构建含LECT2抑制序列(优选为CGTGCATTCTAACAGAAACAT)的目的质粒，将其与AAV2/8质粒和δF6质粒共同孵育，得到复合物；所述目的质粒、AAV2/8质粒和δF6质粒用量之比为5～10:5～10:20，优选为7:7:20；

本发明还涉及所述腺相关病毒在制备防治非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明构建了一种特异性抑制肝内LECT2表达的腺相关病毒，该腺相关病毒对LECT2的表达和分泌具有很高的抑制效果，从而达到防治非酒精性脂肪性肝病的作用，为新药筛选提供了基础。

(四)附图说明

图1为采用LECT2 shRNA腺相关病毒尾静脉注射小鼠后LECT2的变化A：AAV尾静脉注射小鼠后小鼠肝脏LECT2 mRNA表达变化；B：AAV尾静脉注射小鼠后小鼠血清LECT2分泌变化(**P<0.01，***P<0.001)。

图2为抑制小鼠肝脏LECT2表达后对NAFLD的影响A：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠体重变化；B：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠肝脏体重比变化；C：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠白色脂肪变化；D：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠血清TG，TC变化；E：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠血清ALT，AST变化；F：抑制小鼠肝脏LECT2表达后行胰岛素耐量试验(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

图3为抑制小鼠肝脏LECT2表达后对NAFLD肝脏脂肪变的影响A：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠肝脏大体观；B：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠肝脏TG变化；C：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠肝脏病理HE染色；D：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠肝脏病理油红染色(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

图4为抑制小鼠肝脏LECT2表达后对肝脏脂质合成、氧化、自噬及炎症通路的影响A：抑制小鼠肝脏LECT2表达后肝脏脂质合成及氧化通路的蛋白变化；B：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠肝脏细胞核内SREBP1变化；C：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠肝脏自噬变化；D：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠肝脏巨噬细胞浸润情况；E：抑制小鼠肝脏LECT2表达后小鼠肝脏合成、炎症因子mRNA变化(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs shNC SCD组；##P<0.01，###P<0.001vs shNC HFD组)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞株

采用AAV 293细胞进行腺相关病毒的构建，细胞株来源于浙江大学医学院孟卓贤课题组。用含10％胎牛血清(fatal bovine serun，FBS)的DMEM培养基进行培养。

1.1.2实验动物及饲料

实验用小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司。清洁级C57BL/6小鼠，雄性，6-7周龄，体重20-22g。正常饮食饲料(standard chow diet，SCD)由浙江省医学科学院动物中心提供。高脂饲料购自于美国Research Diets公司(货号D12492)，其中脂肪提供60％的能量，碳水化合物提供20％的能量，蛋白质提供20％的能量，总能量供应为5.21kcal/g。

1.1.3试剂

(1)DMEM培养基，胎牛血清：美国Gibco公司。在DMEM中加入0.5％胎牛血清或10％胎牛血清后使用。

(2)胰蛋白酶：杭州吉诺生物试剂有限公司。

(3)聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)转染试剂：美国sigma-aldrich公司。

(4)AAV 293细胞裂解液：用PBS配制，内含150mM NaCl，20mM Tris pH 8.0。

(5)MgCl₂，KCl，NaCl₂，酚红：上海国药集团化学试剂有限公司。

(6)苯甲酰酶：美国sigma-aldrich公司。

(7)碘克沙醇：美国sigma-aldrich公司。

不同浓度的碘克沙醇工作液配制：

17％碘克沙醇＝5ml 10×PBS，0.05ml 1M MgCl2，0.125ml 1M KCl，10ml 5MNaCl2，12.5ml碘克沙醇，22.325ml H₂O

25％碘克沙醇＝5ml 10×PBS，0.05ml 1M MgCl2，0.125ml 1M KCl，20ml碘克沙醇，0.1ml酚红，24.725ml H₂O

40％碘克沙醇＝5ml 10×PBS，0.05ml 1M MgCl2，0.125ml 1M KCl，33.3ml碘克沙醇，11.525ml H₂O

60％碘克沙醇＝5ml 10×PBS，0.05ml 1M MgCl2，0.125ml 1M KCl，50ml碘克沙醇，0.025ml酚红

(8)泊洛沙姆：美国sigma-aldrich公司。

(9)50％甘油：上海碧云天生物技术有限公司。

(10)AAV2/8质粒及δF6质粒：受赠于浙江大学孟卓贤课题组。

(11)LECT2 shRNA质粒由上海吉凯基因有限公司合成。

shRNA核心序列如下：C G T G C A T T C T A A C AG A A A C A T

(12)生理盐水：江西创欣药业。

(13)组织细胞蛋白提取液RIPA，BCA蛋白定量试剂盒：北京普利莱基因技术有限公司。

(14)蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂：美国Sigma-Aldrich公司。

(15)蛋白凝胶电泳配胶试剂盒：北京普利莱基因技术有限公司。

(16)Tris碱，SDS，甘氨酸：美国Amresco公司。

(17)10×TBST溶液，脱脂奶粉，牛血清白蛋白：上海生工生物工程有限公司。

(18)蛋白预染Marker：美国Thermo Scientific公司。

(19)蛋白上样缓冲液(5×)：杭州达文生物有限公司。

(20)PVDF膜(0.45μM，0.2μM)：美国Millipore公司。

(21)ECL化学发光液：上海碧云天生物有限公司。

(22)Western bolt用一抗：GAPDH，SREBP1，FAS，ACC，PPARα，CPT1α，Lamin B，LC3，P62，磷酸化STAT1，STAT1，NF-Kb-P65，PPARγ：美国abcam以及CST公司。

(23)一抗稀释液：上海碧云天生物技术有限公司。

(24)Western bolt用二抗：HRP结合的山羊抗鼠二抗，HRP结合的山羊抗兔二抗：杭州达文生物有限公司。

(25)核蛋白提取试剂盒：北京普利莱基因技术有限公司。

(26)F4/80免疫组化抗体：武汉谷歌生物技术有限公司。

(27)过氧化氢：上海国药集团化学试剂有限公司。

(28)枸橼酸钠粉末：北京中杉金桥生物技术有限公司。

(29)山羊血清工作液，DAB显色试剂，免疫组化用二抗：北京中杉金桥生物技术有限公司。

其它试剂：

(1)右旋葡萄糖：美国sigma-aldrich公司。

(2)4％多聚甲醛：武汉谷歌生物科技有限公司。

(3)磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)：杭州吉诺生物试剂有限公司。

(4)甘油三酯检测试剂盒：北京普利莱生物有限公司。

(5)无水乙醇，异丙醇，氯仿：上海国药集团化学试剂有限公司。

(6)DEPC水：上海生工生物工程有限公司。

(7)RNA抽提Trizol：大连Takara生物工程有限公司。

(8)逆转录试剂盒One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit，荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix.ExTag kit：大连Takara生物工程有限公司。

(9)96孔qPCR板，qPCR封板膜：美国Bio-rad公司。

(10)qPCR引物：由杭州擎科生物技术有限公司合成。

(11)二甲苯，中性树胶，1％盐酸乙醇：上海国药集团化学试剂有限公司。

(12)油红O染液，苏木素，伊红染色染液：南京建成生物试剂有限公司。

(13)鼠LECT2酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂盒：台湾abnova公司。

(14)人LECT2 ELISA检测试剂盒：美国USBiological公司。

1.1.4材料设备

(1)生物安全柜，CO₂恒温培养箱：美国Thermo Scientific公司。

(2)电热恒温水浴锅：上海森信实验设备有限公司。

(3)台式超速冷冻离心机MAX-XP：美国贝克曼库尔特有限公司

(4)培养瓶、培养皿：美国Corning公司。

(5)超速离心管：美国贝克曼库尔特有限公司。

(6)病毒浓缩管：美国Millpore公司。

(7)蛋白垂直电泳转膜系统：美国Bio-rad公司。

(8)蛋白显影仪：上海勤翔有限公司。

(9)免疫组化笔：北京中杉金桥生物技术有限公司。

其它材料设备：

(1)常温离心机及低温离心机：德国Eppendorf公司。

(2)纯水仪：美国Millipore公司。

(3)制冰机：美国Scotsman公司。

(4)4℃冰箱，-20℃冰箱：日本松下公司。

(5)电子天平：瑞士Mettler Toledo公司。

(6)组织研磨仪：武汉谷歌生物科技有限公司。

(7)液氮罐：美国Thermo Scientific公司。

(8)移液器(2.5μl、10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl)：德国Eppendorf公司。

(9)2ml、1.5ml、0.6ml、0.2ml规格的EP管及各种型号清洁级枪头：美国Axygen公司。

(10)15ml，50ml离心管，冻存管，96孔细胞培养板：美国Corning公司。

(11)血糖仪：美国强生公司。

(12)血糖试纸：美国强生公司。

(13)眼科镊，剪刀：山东新华医疗器械有限公司。

(14)酶标仪：美国Bio-rad公司。

(15)Nanodrop2000c RNA浓度测定仪：美国Thermo Scientific公司。

(16)普通PCR仪：美国Bio-rad公司。

(17)实时荧光定量PCR仪：美国Bio-rad公司。

(18)96孔PCR板，PCR板覆膜：美国Bio-rad公司。

(19)载玻片，盖玻片，包埋盒：江苏世泰实验器材有限公司。

(20)冰冻切片机，石蜡切片机：德国Leica公司。

(21)光学显微镜：日本Olympus公司。

(22)1ml注射器、2ml注射器、5ml注射器、生化采血管：美国BD公司。

(23)酶标板混匀装置：太仓市华利达实验设备有限公司。

1.1.5溶液及试剂配制

表1：10×电泳液配方(以1L体积为例)

表2：1×电泳液配方(以1L体积为例)

表3：10×转膜液配方(以1L体积为例)

表4：1×转膜液配方(以1L体积为例)

表5：1×TBST配方(以1L体积为例)

表6：封闭液配方(以100ml体积为例)

1.2实验方法

1.2.1腺相关病毒的构建

(1)细胞复苏：

开启37℃水浴，超净台紫外照射30分钟。取出冻存在液氮中的AAV293细胞，于37℃水浴内放置至完全溶解后，在超净台内将液体吸出至15ml离心管内，加入9ml的DMEM培养基，800转离心3分钟，弃上清，将15ml含10％FBS的DMEM培养基加入15ml离心管中，轻轻吹打，重悬细胞，将细胞悬液加入15cm培养皿中，放入37℃细胞培养箱(5％CO₂)中培养。

(2)细胞传代：

当AAV293细胞状态较好，15cm培养皿中细胞密度达至70％以上时，可考虑1：3传代，具体过程如下：用1×PBS洗2遍，加入3ml胰酶(含0.02％EDTA)，约1分钟后将吹下的胰酶液(含细胞)加入预先加了3ml完全培养基的15ml离心管中，800转离心3分钟，吸去上清，用适量完全培养基重悬细胞，将细胞悬液加入预先加了9ml培养基15cm培养瓶中，放入37℃细胞培养箱(5％CO₂)中培养。

(3)细胞冻存：

当AAV293细胞状态较好时可进行细胞冻存。二甲基亚砜(dimethylenesulfoxide，DMSO)及完全培养基以1：9的比例配置冻存液。将细胞消化，离心，弃去上清后，用1ml冻存液小心吹打、重悬，移入冻存管中。在管壁上标记好具体的细胞名称、冻存日期及冻存者姓名，放入冻存盒，24小时后置入液氮内长期保存。

(4)质粒转染：

当已贴壁的AAV293细胞密度长至30％～40％可以进行质粒转染。

转染步骤如下：

(1)超净台内每皿细胞加入15ml无血清DMEM培养基以及250μlPEI。

(2)每皿细胞分别加入7μl AAV2/8质粒(1000ng/μl)，20μlδF6质粒(1000ng/μl)以及7μl目的质粒(1000ng/μl)(即LECT2 shRNA质粒)。在室温下孵育15分钟，使复合物形成。

(3)弃去培养皿中原培养基，再加入15ml无血清DMEM培养基，再加入上述混合液，放入37℃细胞培养箱(5％CO₂)培养。

(4)第二天再加入含0.5％FBS的DMEM培养基5ml，继续培养。

(5)72小时后，用细胞刮刮下细胞，连带培养基上清加入离心瓶，1000转离心10分钟。

(6)弃上清，加入20ml 1×PBS后轻吹散将细胞转移到50ml离心管中，在同样条件离心，弃上清，加入5ml细胞裂解液，混匀，-80℃保存备用。

(7)将裂解后的细胞在37℃水浴反复冻融三次。

(8)在裂解液中加入5μl 1M MgCl2。

(9)在裂解液中加入5μl 25KU/ml的苯甲酰酶，37℃水浴15分钟，每隔5分钟涡旋混匀一次。

(10)4℃4000转离心30分钟，取上清待纯化。

(11)分别准备17％，25％，40％，60％的碘克沙醇溶液。

(12)在33ml的超速离心管中用导管在管底加入6ml 17％的碘克沙醇溶液，再在管底加入6ml 25％的碘克沙醇溶液，再在管底加入5ml40％的碘克沙醇溶液，再在管底加入4ml 60％的碘克沙醇溶液。并在40％和60％分界面做好标记。

(13)在超速离心管的最上层加入准备好的裂解液。

(14)在超速离心机中用14℃53000转离心160分钟，转头型号70Ti升速MAX，降速5。

(15)在超滤管中加入5ml含有10^-4泊洛沙姆的1×PBS，3500转离心5分钟来激活超滤管。

(16)在40％的碘克沙醇溶液层中吸出液体3.5-4ml，加入到激活的超滤管中。

(17)用含有10^-4泊洛沙姆的1×PBS加满到超滤管管口，颠倒混匀后3500转离心20分钟，弃去底部废液。重复该步骤3次，最后一次离心浓缩病毒液2-3ml，然后加入50％甘油(甘油终浓度5％)，混匀后分装保存于-80℃待用。

1.2.2小鼠尾静脉注射携带LECT2 shRNA的腺相关病毒

购买6-7周龄的雄性C57BL/6小鼠，在清洁级动物房内适应一周，自由进食以及饮水，室内温度控制在22℃左右，明暗各12小时。为了抑制LECT2在小鼠肝脏中的表达，采用尾静脉注射腺相关病毒。步骤如下：

(1)用生理盐水1:1稀释含LECT2抑制序列的病毒液或对照病毒液。

(2)暴露小鼠尾静脉，用酒精棉球消毒。

(3)用1ml注射器吸取稀释好的病毒液，并进行尾静脉穿刺，每只小鼠尾静脉注射120μl稀释好的病毒液。

(4)拔出注射器针头，用无菌纱布按压注射位置。

(5)将小鼠放回鼠笼。

1.2.3腺相关病毒转染效率测定

基础饮食继续喂养2周后对小鼠进行感染效率的测定。具体步骤如下：

(1)取空白对照小鼠3只，注射对照病毒液小鼠3只以及注射LECT2抑制序列的病毒液小鼠3只。

(2)麻醉小鼠，行眼球摘除取血，取完血后处死小鼠。取小鼠肝脏用PBS冲洗，取肝脏最大叶中的一块肝组织，分装在冻存管中，液氮速冻。

(3)提取肝组织的RNA，步骤详见1.2.2.7。

(4)用qPCR方法测定肝内LECT2以及增强绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)的表达量，步骤详见1.2.2.8。

(5)小鼠眼球取血后将全血于常温静置30分钟，再常温用3000转离心10分钟，取上清进行LECT2测定，步骤详见1.2.2.9。

(6)空白对照组EGFP不表达，注射对照病毒液小鼠及注射LECT2抑制序列的病毒液小鼠EGFP高表达代表转染成功。注射LECT2抑制序列的病毒液小鼠肝脏LECT2表达水平以及血清LECT2水平明显低于注射对照病毒液小鼠说明抑制成功。

1.2.4腺相关病毒注射老鼠的NAFLD动物模型构建

购买6-7周龄的雄性C57BL/6小鼠，在清洁级动物房内适应一周，自由进食以及饮水，室内温度控制在22℃左右，明暗各12小时。然后开始实验，小鼠注射腺相关病毒后先予SCD继续喂养2周，接着NAFLD造模小鼠喂养HFD，对照组小鼠喂养SCD，每两周记录体重变化，喂养8周后处死小鼠，处死前6小时禁食。

处死小鼠前先麻醉，行眼球摘除取血，取完血后处死小鼠，取肝脏称重并记录。用PBS冲洗，取肝脏最大叶中的一块肝组织，放入包埋盒内，放入4％多聚甲醛中固定用于HE染色。同一叶肝脏内切取一块组织用于冰冻切片油红染色。将其余肝组织切成多块，分别放在4个冻存管中。液氮速冻，然后转运存放在-80℃冰箱内长期保存。

1.2.5动物肝组织RNA提取及浓度测定

样本的处理：

(1)取30-50mg肝组织，加入1ml的trizol裂解液。

(2)在EP管中加入磁珠，使用组织研磨仪将肝组织碾碎，4℃12000转离心15分钟。

(3)取匀浆裂解液上清800μl至新的1.5ml EP管中，加入氯仿160μl，上下颠倒EP管充分混匀后，于4℃静置5分钟。

(4)4℃12000转离心15分钟，吸取320μl上层液体(小心不要吸入白色的中间层)，转移至另一新的1.5ml EP管中。

(5)在上层液体中加入320μl的异丙醇，上下颠倒EP管充分混匀后，于4℃静置5分钟。

(6)4℃12000转离心10分钟。

(7)小心地弃去上清，保留沉淀，每管加入1ml用DEPC水稀释的75％乙醇，洗涤沉淀。

(8)4℃7200转离心5分钟。

(9)小心地弃去上清，保留沉淀，4℃干燥沉淀5-10分钟，再加入适量的DEPC水溶解沉淀，涡旋混匀，静置10-20分钟。

(10)采用Nanodrop微量分光光度仪测量RNA的浓度，测定结果中A260/A280在1.9-2.0之间表示RNA纯度高，根据浓度用DEPC水稀释至100ng/μl备用。

1.2.6动物肝组织RNA逆转录及荧光定量PCR

(1)逆转录：按照下表的比例混匀各个样品

混匀步骤在冰上操作，混匀后。用PCR仪进行逆转录，程序如下：37℃15分钟，85℃5秒，4℃维持，即可得到cDNA原液。

(2)荧光定量PCR：按照下表配制样本反应液

加样操作在冰上进行，将所有样本反应液小心加入96孔PCR板，贴上PCR封板膜，3000转离心3分钟。准备PCR上机操作。

(3)荧光PCR反应程序如下

步骤1：95℃，30秒

步骤2：95℃，5秒

步骤3：60℃，34秒

步骤4：95℃，15秒

步骤5：重复步骤2至步骤4，40个循环

步骤6：95℃，15秒

步骤7：60℃，60秒

步骤8：从60℃阶梯升温，0.15℃每秒，连续记录

步骤9：95℃，15秒

(4)采用2^-△△CT的方法比较各组基因的表达差异。

引物如下表

GAPDH(小鼠来源)，LECT2(小鼠来源)引物序列见第一部分。

1.2.7动物血清LECT2测定(ELISA法)

采用鼠源LECT2 ELISA试剂盒进行测定，具体步骤如下：

(1)用包被缓冲液稀释捕获抗体，96孔板中每孔加入100μl的捕获抗体，在4℃冰箱孵育过夜。

(2)弃去捕获抗体，往每孔加入洗涤液200μl，在酶标板混匀装置上以500转的速度洗2分钟，洗2遍。

(3)往每孔加入200μl封闭液，在室温孵育1小时。

(4)标准品配置：将鼠源LECT2标准品用样本稀释液1:10稀释，作为最高浓度，再采用倍比稀释法来稀释第2-7孔，第8孔作为空白孔。

(5)将小鼠血清样本用样本稀释液稀释10倍。

(6)弃去96孔板内液体，每孔加入标准品或样品100μl，在室温孵育1小时。

(7)弃去96孔板内液体，往每孔加入洗涤液200μl，在酶标板混匀装置上以500转的速度洗2分钟，洗4遍。

(8)用样本稀释液1:100稀释检测抗体，每孔加入稀释后的检测抗体100μl，在室温孵育1小时。

(9)弃去96孔板内液体，往每孔加入洗涤液200μl，在酶标板混匀装置上以500转的速度洗2分钟，洗4遍。

(10)用HRP稀释液1:100稀释HRP抗体，每孔加入稀释后的HRP抗体100μl，在室温孵育30分钟。

(11)弃去96孔板内液体，往每孔加入洗涤液200μl，在酶标板混匀装置上以500转的速度洗2分钟，洗4遍。

(12)每孔加入TMB液100μl，在室温孵育15-30分钟。

(13)每孔加入终止液100μl，开启酶标仪，用酶标仪测定450nm处的吸光度。

(14)制作标曲，计算血清中LECT2的含量。

1.2.8葡萄糖耐量实验

在小鼠喂养基础饮食或高脂饮食7周后进行葡萄糖耐量实验，实验前16小时小鼠禁食。实验当天先测量小鼠体重，再用剪刀剪小鼠尾巴尖端，用血糖试纸擦取少量小鼠血液，用血糖仪测定小鼠空腹血糖。根据体重每10g腹腔注射100μl 10％的葡萄糖溶液。于注射10％葡萄糖后第15，30，60，90，120分钟用血糖仪分别测定小鼠血糖。

1.2.9小鼠血生化指标检测

小鼠眼球取血后将全血于常温静置30分钟，再用3000转常温离心10分钟，取上清进行血液生化指标的检测，小鼠血液生化测量指标包括：TG，TC，谷丙转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)。所有的小鼠血液生化指标的测量均使用深圳雷杜生命科技公司生产的Chemray 240型全自动生化分析仪以及标准方法测量。

1.2.10肝组织内甘油三酯测定

采用GPO酶法测定甘油三酯含量，具体步骤如下：

(1)取30-50mg肝组织，称重，每mg肝组织加入20μl的甘油三酯提取裂解液。

(2)在EP管中加入磁珠，使用组织研磨仪将肝组织碾碎，将裂解液分成两部分，一部分采用BCA法测定蛋白浓度，另一部分用于测定TG含量。

(3)将用于测定蛋白浓度的部分4℃12000转离心15分钟，取上清，用1×PBS稀释25倍用于测定蛋白浓度。

(4)制作蛋白测定标准曲线：将4mg/ml的蛋白标准品用1×PBS倍比稀释，在第1管至第7管中加入100μl 1×PBS，在第1管内加入100μl标准品，混匀，从第1管吸取100μl溶液至第2管，如此类推，依次稀释至第7管，各管的浓度为2mg/ml，1mg/ml，500μg/ml，250μg/ml，125μg/ml，62.5μg/ml，31.25μg/ml以及空白孔(仅有1×PBS)。

(5)配制蛋白测定工作液，将R1和R2以50：1混合，在96孔细胞培养板中加入25μl的标准品或稀释后的样品，再加入200μl蛋白测定工作液，混匀后37℃静置反应30分钟。

(6)将96孔板放于酶标仪中，用570nm波长测定吸光度，绘制标准曲线，计算蛋白浓度。

(7)将裂解液的另一部分室温静置5分钟，然后70℃水浴10分钟。

(8)室温2000转离心10分钟，去上清至新的EP管中。

(9)制作TG标准曲线：将4mM TG的标准品用1×PBS倍比稀释，在第1管至第7管中加入100μl 1×PBS，在第1管内加入100μl标准品，混匀，从第1管吸取100μl溶液至第2管，如此类推，依次稀释至第7管，各管的浓度为2mM，1mM，500μM，250μM，125μM，62.5μM，31.25μM以及空白孔(仅有1×PBS)。

(10)配制TG测定工作液，将R1和R2以4：1混合，在96孔细胞培养板中加入10μl的标准品或稀释后的样品，再加入190μl TG测定工作液，混匀后37℃静置反应10分钟。

(11)将96孔板放于酶标仪中，用570nm波长测定吸光度，绘制标准曲线，计算TG浓度，并用之前计算好的蛋白浓度调整TG含量，计算单位以μg/mg蛋白表示。

1.2.11苏木素、伊红染色

(1)将新鲜肝脏取下后，放于包埋盒中，迅速固定于4％多聚甲醛中固定，采用自动脱水机脱水，采用石蜡包埋保存。

(2)将石蜡块在-20℃冰箱保存过夜，然后用切片机切片。

(3)将载玻片放在53℃的加热平板上烤片。

(4)在60℃烤箱中烘干约90分钟后放于室温保存。

(5)进行脱蜡，将玻片放于二甲苯Ⅰ中10分钟，二甲苯Ⅱ中10分钟，二甲苯Ⅲ中10分钟，100％乙醇Ⅰ中5分钟，100％乙醇Ⅱ中5分钟，90％乙醇中5分钟，80％乙醇中5分钟，70％乙醇中5分钟，双蒸水中5分钟。

(6)放入苏木素中5分钟，流水冲洗10秒，再用1×PBS反蓝30秒，流水冲洗1分钟，1％盐酸乙醇分色3秒，双蒸水中浸泡冲洗5分钟，伊红染色3分钟，最后在双蒸水中浸泡冲洗5分钟。

(7)脱水处理，将玻片放入70％乙醇中1分钟，80％乙醇中1分钟，90％乙醇中1分钟，100％乙醇Ⅰ中1分钟，100％乙醇Ⅱ中1分钟，二甲苯Ⅰ中5分钟，二甲苯Ⅱ中5分钟，二甲苯Ⅲ中5分钟。

(8)用中性树胶封片。

(9)显微镜下观察，拍照。

1.2.12油红O染色

(1)取冰冻肝脏组织用冰冻切片机切片后放到载玻片上。

(2)将油红O染色液AB液以5：2的比例混合，将载玻片放入混合液染色15分钟。

(3)用蒸馏水洗10分钟。

(4)将载玻片放入复染液染色5分钟。

(5)用蒸馏水洗10-15分钟。

(6)将水性封固剂滴在样本表面，用盖玻片封片，注意排除气泡。

(7)显微镜下观察，拍照。

1.2.13动物肝组织蛋白提取及浓度测定

(1)配制RIPA裂解液(含1％蛋白酶抑制剂、以及1％磷酸酶抑制剂)。

(2)取30-50mg肝组织，称重，每mg肝组织加入20μl的RIPA裂解液。

(3)在EP管中加入磁珠，使用组织研磨仪将肝组织碾碎，4℃12000转离心15分钟。

(5)将离心好的样品蛋白裂解液取上清，用1×PBS稀释25倍。

(6)配制蛋白测定工作液，将R1和R2以50：1混合，在96孔细胞培养板中加入25μl的标准品或稀释后的样品，再加入200μl蛋白测定工作液，混匀后37℃静置反应30分钟。

(7)将96孔板放于酶标仪中，用570nm波长测定吸光度，绘制标准曲线，计算蛋白浓度。

(8)将样本蛋白用RIPA裂解液稀释至5μg/μl，再加入5×上样缓冲液(终浓度为1×)，混匀后于95℃水浴10分钟使蛋白变性。

1.2.14蛋白质免疫印迹

(1)根据说明书中的配方配制8％、10％或12％的SDS-PAGE凝胶。

(2)配制好1×电泳液。

(3)蛋白上样：在加样孔中加入蛋白标记和10μl样本蛋白(蛋白总上样量约为30μg-50μg)。

(4)在电泳槽中加入1×电泳液至刻度线，用恒定电压80V跑约30-40分钟至蛋白标记分开，转为恒定电压130V跑至上样缓冲液指示剂距玻璃板底缘1cm时停止。

(5)配制好1×转膜液，放冰上预冷。

(6)转膜：用剪刀裁剪合适大小的PVDF膜，将其放入甲醇溶液中浸泡30秒。取出电泳槽中的玻璃板，撬开玻璃板，切取胶的边缘，将胶置于预冷的1×转膜液。转膜夹的放置顺序为：黑色板、滤纸2层、SDS-PAGE凝胶、PVDF膜、滤纸1层、白色板，注意需要驱赶气泡。固定好转膜夹后，放入转膜槽。加入预冷的1×转膜液。放置于泡沫盒中的冰中。恒定电流250mA，转膜90-120分钟(根据SDS-PAGE凝胶浓度调整)。

(7)配制5％脱脂奶粉或5％牛血清白蛋白，37℃水浴保温。

(8)封闭：取出转膜夹，用镊子取出其中的PVDF膜，转移至5％脱脂奶粉或5％牛血清白蛋白中，置于室温摇床上，以60转每分钟的速度孵育1小时。

(9)配置10ml相应的一抗溶液，放入15ml离心管，根据目的蛋白的分子量将裁剪PVDF膜，并小心放入对于抗体溶液中。置于4℃摇床上50转每分钟的速度孵育过夜。

(10)配制1×TBST。

(11)用镊子取出放在一抗中的PVDF膜，放入1×TBST中，放置于摇床上，100转每分钟的速度洗涤，每次10分钟，洗涤3次。

(12)将对应二抗用1×TBST溶液配置，加入抗体孵育盒，每条条带用10ml二抗孵育。放置于摇床上，50转每分钟的速度孵育1小时。

(13)用镊子取出放在二抗中的PVDF膜，放入1×TBST中，放置于摇床上，100转每分钟的速度洗涤，每次10分钟，洗涤3次。

(14)将ECL发光液的A液和B液等体积混合，涡旋10秒，取出PVDF膜，用滤纸吸掉多余的TBST溶液，加入配制好的ECL发光液，每张膜250μl左右，放入显影仪，进行显影。

1.2.15动物肝组织核蛋白提取

(1)取30-50mg肝组织，称重，每mg肝组织加入10μl的A液。

(2)在EP管中加入磁珠，使用组织研磨仪将肝组织碾碎。

(3)将匀浆液在冰上静置2分钟，取250μl上清放入新的EP管。

(4)涡旋10秒，静置10分钟，期间涡旋一次。

(5)每管加入12.5μl B液，涡旋10秒。

(6)静置1分钟，4℃1000转离心5分钟。

(7)取上清，上清为胞浆蛋白，4℃14000转离心15分钟，取上清进行定量(定量步骤见动物肝组织蛋白提取及浓度测定)。

(8)取沉淀，加入105μl A+B混合液(A:B为20:1)，涡旋10s，使无沉淀，静置1分钟，4℃1000转离心5分钟，重复1次。

(9)弃上清，加入75μl C液，涡旋10秒，静置30分钟，其间每5分钟涡旋一次。

(10)4℃14000转离心15分钟，取上清，再加入5×上样缓冲液(终浓度为1×)，混匀后于95℃水浴10分钟使蛋白变性。

1.2.16免疫组化

(2)将石蜡块在-20℃冰箱保存过夜，然后用切片机切片。

(3)将载玻片放在53℃的加热平板上烤片。

(4)在60℃烤箱中烘干约90分钟后放于室温保存。

(6)在3％过氧化氢溶液中室温孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。

(7)将玻片放入1×PBS中，以60转每分钟的速度洗3次，每次5分钟。

(8)用粉末配制枸橼酸盐缓冲液，加入修复盒中，置微波炉内高火加热5分钟，放入切片，高火加热5分钟，中火加热5分钟。

(9)取出容器，在室温中自然冷却30分钟。

(10)将玻片放入1×PBS中，以60转每分钟的速度洗3次，每次5分钟。

(11)用免疫组化笔在载玻片上的组织周围画圈，适量滴加山羊血清工作液。置入湿盒中，37℃封闭1小时。

(12)用一抗稀释液稀释抗体至适当浓度(F4/80为1:500)，弃去血清工作液，加入一抗，放入湿盒内，4℃孵育过夜。

(13)弃去一抗，将玻片放入1×PBS中，以60转每分钟的速度洗3次，每次5分钟。

(14)滴加相应二抗，放入湿盒中，37℃孵育1小时。

(15)将玻片放入1×PBS中，以60转每分钟的速度洗3次，每次5分钟。

(16)配制DAB，在载玻片上滴加DAB，待颜色稳定后浸入双蒸水中中止反应，然后再用流水冲洗切片20分钟，以去除DAB。

(17)脱水处理，将玻片放入70％乙醇中1分钟，80％乙醇中1分钟，90％乙醇中1分钟，100％乙醇Ⅰ中1分钟，100％乙醇Ⅱ中1分钟，二甲苯Ⅰ中5分钟，二甲苯Ⅱ中5分钟，二甲苯Ⅲ中5分钟。

(18)用中性树胶封片。

(19)显微镜下观察，拍照。

1.2.17统计学分析

实验数据采用均数±标准差显示，使用SPSS 18.0版本统计软件对数据进行统计学检验。采用Student’s t-test方法比较组间差异。P<0.05提示差异有统计学意义。

1.3结果

1.3.1应用LECT2 shRNA腺相关病毒尾静脉注射抑制小鼠肝脏LECT2表达对小鼠肝脏的影响

为了进一步研究LECT2在NAFLD当中发挥的作用，我们构建了带有LECT2 shRNA的腺相关病毒，并通过尾静脉对小鼠分别注射带有LECT2 shRNA的腺相关病毒及对照空载腺相关病毒。结果显示，和对照组相比，不论是喂养基础饮食还是高脂饮食，注射带有LECT2shRNA的腺相关病毒的小鼠的肝脏LECT2 mRNA表达量下降超过80％(图1A)。进一步测定小鼠血清LECT2的水平，我们发现注射带有LECT2 shRNA的腺相关病毒的小鼠血清LECT2含量下降也超过80％(图1B)。说明该腺相关病毒对LECT2的表达和分泌具有很高的抑制效果。

喂养HFD后，和对照组相比，LECT2抑制组的小鼠体重和对照组没有明显差异(图2A)，但肝体比有轻度下降(图2B)，白色脂肪含量轻度下降(图2C)，血清TC以及ALT有明显下降(图2D,E)，血清TG和AST无明显差异(图2D,E)，GTT显示，小鼠胰岛素抵抗水平没有明显的变化(图2F)。值得关注的是，喂养HFD后，和对照组相比，LECT2抑制组的小鼠的肝脏从大体观可发现较对照组更为红润(图3A)。同时我们发现LECT2抑制组的肝内TG含量较对照组明显降低(图3B)，HE染色及油红O染色均显示在肝脏中抑制LECT2的表达后，肝脏的脂肪变程度得到了明显的改善(图3C,D)。

1.3.2抑制小鼠肝脏LECT2表达对小鼠肝脏脂肪变和炎症影响的分子机制。

我们已经发现抑制小鼠肝脏LECT2的表达可以减轻HFD所致的脂肪变以及炎症。接下来我们对其分子机制进行进一步挖掘。我们采用western blot以及qPCR的方法对脂质合成、脂质氧化等多个环节进行评估发现，在HFD饮食条件下，抑制小鼠肝脏LECT2的表达可以显著降低脂质的从头合成。肝细胞核内的SREBP-1的蛋白表达明显下降(图4B)，其下游的FAS，ACC也有明显的下降(图4A)。同时，抑制小鼠肝脏LECT2的表达增加脂质氧化，脂质氧化相关蛋白肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1α，CPT1α)，以及过氧化物酶体增殖剂激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα，PPARα)均较对照组明显上升(图4A)。我们还发现，抑制小鼠肝脏LECT2的表达后自噬相关蛋白的表达有明显变化，LC3明显增加，P62明显降低，提示抑制小鼠肝脏LECT2的表达后自噬增强(图4C)。

由于和对照组相比，喂养HFD后，LECT2抑制组小鼠的血清ALT水平明显下降，因此我们进一步对肝脏炎症进行了研究。我们发现，HFD饲养的小鼠其肝内巨噬细胞浸润增强，单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)以及肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factorα，TNF-α)的表达明显增强，而LECT2抑制组小鼠的肝内巨噬细胞浸润较对照组明显降低，MCP-1以及TNF-α的表达也明显降低(图4D，E)。

Claims

1.一种特异性抑制肝内LECT2表达的腺相关病毒，由如下方法构建获得：

（1）AAV293细胞经复苏，传代培养，待已贴壁的AAV293细胞密度长至30%~40%时，进行下一步质粒转染；

（2）构建含LECT2抑制序列的目的质粒，将其与AAV2/8质粒和δF6质粒共同孵育，得到复合物；所述抑制序列为：CGTGCATTCTAACAGAAACAT；所述目的质粒、AAV2/8质粒和δF6质粒用量之比为5~10:5~10:20；

（3）将步骤（2）复合物以PEI转染法转染至步骤（1）AAV293细胞中，经裂解，纯化，获得所述特异性抑制肝内LECT2表达的腺相关病毒。

2.构建权利要求1所述的腺相关病毒的方法，所述方法包括：

（2）构建含LECT2抑制序列的目的质粒，将其与AAV2/8质粒和δF6质粒共同孵育，得到复合物；所述目的质粒、AAV2/8质粒和δF6质粒用量之比为5~10:5~10:20；所述抑制序列为：CGTGCATTCTAACAGAAACAT；

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述目的质粒、AAV2/8质粒和δF6质粒用量之比为7:7:20。

4.权利要求1所述腺相关病毒在制备防治非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。