TW201601718A - 苯酞化合物之應用 - Google Patents

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Abstract

一種使用苯酞化合物(phthalide)於製備藥劑的用途，該藥劑特別係用以治療及/或延緩浦肯野细胞(Purkinje cells)退化，且該苯酞化合物係選自以下群組：亞丁基苯酞、亞丁基苯酞之代謝前驅物、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受鹽、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受酯、以及前述之組合。

Description

苯酞化合物之應用
本發明係關於苯酞化合物(phthalide)之應用，尤其關於使用苯酞化合物於治療及/或延緩浦肯野细胞(Purkinje cells)退化之應用，特別是關於治療脊髓性小腦萎縮症、阿茲海默症、帕金森氏症之至少一者及/或延緩其發病的應用。
神經元(neuron)亦可稱為神經細胞，是生物體神經系統的結構與功能單位之一，可藉由化學訊號及電訊號與其它細胞進行訊息傳遞，具有各種不同的形狀和尺寸，直徑為約4微米至約100微米，結構上大致可分為細胞本體、樹突(dendrite)、及軸突(axon)三部分，其中樹突可將訊息帶入細胞本體，而軸突則可將訊息自細胞本體傳出。
浦肯野细胞為存在小腦中負責傳送神經衝動之功能的神經元，屬於γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)神經元的一種，其形態比普通神經細胞大且具有較多的樹突，主要功能為神經訊息傳遞及調控納-鉀離子通道。浦肯野细胞與生物體之運動協調功能有關，已知浦肯野细胞的退化(例如，浦肯野細胞死亡、細胞數量減少或損傷、或因細胞樹突數量減少而使其訊息傳遞功能下降)會影響其訊息傳遞的功能，故與阿茲海默症、帕 金森氏症、及脊髓性小腦萎縮症等神經疾病有關，且為該等神經疾病的進程指標(參見Schilling,K.等人，1991，Electrical activity in cerebellar cultures determines Purkinje cell dendritic growth patterns.Neuron 7，891-902，該文獻全文併於此處以供參考)。因此，若能抑制浦肯野细胞退化，則可提供治療如阿茲海默症、帕金森氏症、及脊髓性小腦萎縮症等神經性疾病之功效。
脊髓性小腦萎縮症(spinocerebellar atrophy)是最常 見的共濟失調疾病之一，其主要症狀為小腦共濟失調(cerebellar ataxia)，從而導致協調運動障礙、肌肉張力減低、眼球運動障礙、及言語障礙等。脊髓性小腦萎縮症的致病原因主要為遺傳或基因突變，使患者體內的特定染色體位置上的Atxin-3(ATXN3)基因之外顯子出現異常的CAG序列重複，使所表現的蛋白質中產生長鏈的麩胺酸(glutamine)，導致細胞凋亡。ATXN3為一種去泛素蛋白酶(deubiquitinating enzyme，DUB)，在泛素-蛋白酶路徑中，ATXN3具有防止異常蛋白聚集的功能。根據CAG序列重複在患者染色體中所出現的位置，脊髓性小腦萎縮症主要可分為第一型(SCA1)、第二型(SCA2)、第三型(SCA3)、第六型(SCA6)、第七型(SCA7)和DRPLA型等亞型。其中，SCA3又稱為馬卡多-約瑟夫氏病(Machado-Joseph disease，MJD)，為脊髓性小腦萎縮症中最常見的亞型，其特徵為染色體14q32.1位置上的外顯子10(exon 10)發生了異常的CAG序列重複。
目前臨床上對於浦肯野细胞退化所引起的相關疾病 仍無有效的治療方法，至多僅能透過物理治療及呼吸系統照護以減少併發症的發生機率，減緩病情惡化的速度。因此，仍極需可 有效治療及/或延緩浦肯野细胞退化相關之神經性疾病的藥物。
本案發明人研究後發現，苯酞化合物(phthalide)可治療及/或延緩浦肯野细胞退化，故可用於治療脊髓性小腦萎縮症、阿茲海默症、帕金森氏症之至少一者及/或延緩其發病。
本發明之一目的，在於提供一種使用一苯酞化合物於製備藥劑的用途，其中該藥劑係用於治療及/或延緩浦肯野细胞退化，且其中該苯酞化合物係選自以下群組：亞丁基苯酞(n-butylidenephthalide)、亞丁基苯酞之代謝前驅物、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受鹽、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受酯、以及前述之組合。
本發明之又一目的，在於提供一種於一個體中治療及/或延緩浦肯野细胞退化的方法，包含投予該個體有效量的一苯酞化合物，其中該苯酞化合物係選自以下群組：亞丁基苯酞、亞丁基苯酞之代謝前驅物、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受鹽、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受酯、以及前述之組合。
本發明之詳細技術內容及部分實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
第1圖所示為經pEGFP-C1、pEGFP-C1-Ataxin3Q28、 pEGFP-C1-Ataxin3Q84轉染之細胞經不同條件處理後的螢光顯微鏡照片；第2圖所示為經不同條件處理後斑馬魚之存活率的長條圖；第3圖所示為經不同條件處理後斑馬魚之行為測試結果的長條圖；第4圖所示為經不同條件處理後斑馬魚之神經元的共軛焦顯微鏡照片；第5圖為經不同條件處理後之SCA3小鼠進行Local motor測試之結果的曲線圖；第6圖為經不同條件處理後之SCA3小鼠進行轉棒測試之結果的曲線圖；第7圖為經不同條件處理後之SCA3小鼠之小腦切片的免疫化學組織染色圖；第8圖為經不同條件處理後之SCA3小鼠之小腦組織之鈣結合蛋白的西方墨點圖；第9圖為經不同條件處理後之SCA3小鼠之小腦組織之經泛素化蛋白的西方墨點圖。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」或「治療有效量」，係指投予至個體時， 可有效至少部分改善懷疑個體之病情的化合物數量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物；所謂「治療」係包括預防特定疾病或症狀、減輕特定之疾病或症狀、及/或防止或消除該病症；所謂「延緩浦肯野细胞退化」乙語係指延緩浦肯野细胞之細胞死亡、損傷、及/或訊息傳遞功能下降；單位「毫克/公斤體重」係指每公斤體重個體所須之投藥量。
本案發明人發現，特定苯酞化合物(phthalide)可治 療及/或延緩浦肯野细胞退化。因此，本發明提供一種使用一苯酞化合物於製備用以治療及/或延緩浦肯野细胞退化之藥劑的用途，其中該苯酞化合物係選自以下群組：亞丁基苯酞、亞丁基苯酞之代謝前驅物、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受鹽、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受酯、以及前述之組合。
於根據本發明一具體實施態樣中，係使用亞丁基苯 酞(butylidenephthalide；BP)以製備用以治療及/或延緩浦肯野细胞退化之藥劑。亞丁基苯酞即下式(I)化合物，在自然狀態下同時包含(Z)-亞丁基苯酞((Z)-butylidenephthalide，順式亞丁基苯酞)及(E)-亞丁基苯酞((E)-butylidenephthalide，反式亞丁基苯酞)二種異構物形式。較佳地，係於本發明使用Z-亞丁基苯酞含量為90%或更高之亞丁基苯酞。
於本文中，所謂「亞丁基苯酞之代謝前驅物」係指 一經生物體代謝後會產生亞丁基苯酞的化合物。舉例言之，但不以此為限，已知具如下式(II)結構之3-亞丁基-4,5-二氫苯酞(3-butylidene-4,5-dihydrophthalide)，又稱「藁本內酯」(ligustilide)，其於生物體代謝後會產生亞丁基苯酞，屬亞丁基苯酞之代謝前驅物。
所謂「醫藥可接受之鹽」，係包括所述含有酸官能基 之苯酞化合物與有機或無機鹼所形成之醫藥可接受之鹽。其中，與無機鹼所形成之鹽之例子包括，但不限於，鹼金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽)、鹼土金屬鹽(如鈣鹽、鎂鹽)、過渡金屬鹽(如鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽及鋁鹽)、以及銨鹽；與有機鹼所產生之鹽之例子包括與甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、異丙基胺、三丙基胺、三丁基胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基胺乙醇、2-二乙基胺乙醇、二環己基胺、離胺酸鹽、精胺酸鹽、組胺酸鹽、咖啡鹼、海巴胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、乙烯二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基銨化合物、四乙基銨化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、二環己基胺、二苯甲基胺、N,N-二苯甲基苯乙基胺、1-伊芬胺(1-ephenamine)、N,N-二苯甲基乙烯二胺、聚胺樹脂及其類似物等所形成之鹽。
所謂「醫藥可接受之酯」，係包括所述含有如-OH官 能基之苯酞化合物與酸反應所得之酯。該酸可為無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磺胺酸、硝酸、及磷酸之無機酸，和有機酸例如醋酸、三氟醋酸、己二酸、抗壞血酸、天門冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟腦酸(camphoric acid)、樟腦磺酸(camphorsulfonic acid)、肉桂酸、檸檬酸、二葡萄糖酸、乙烷磺酸、麩胺酸、甘醇酸、甘油磷酸、半硫酸(hemisulfic acid)、己酸(hexanoic acid)、甲酸、2-羥基乙磺酸(isethionic acid)、乳酸、羥基馬來酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、三甲基苯磺酸(mesitylenesulfonic acid)、甲磺酸、萘磺酸(naphthalenesulfonic acid)、菸鹼酸、2-萘磺酸、草酸、撲酸(pamoic acid)、果膠酯酸、苯基醋酸、3-苯丙酸、特戊酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、對-甲苯磺酸、十一烷酸等。
可經由任何合合宜方式提供用於本發明之苯酞化合 物。舉例言之，但不以此為限，可自當歸、川芎、藁本萃取純化而提供3-亞丁基-4,5-二氫苯酞。此外，可自例如當歸經萃取純化而提供或自商業上購買而獲得亞丁基苯酞。另外，可先將自市面上購得(例如購自Alfa Aesar公司)之亞丁基苯酞(為(Z)-及(E)-亞丁基苯酞之混合物)以適量的矽膠包埋(重量比為亞丁基苯酞：矽膠=1：3)，隨後進行矽膠管柱層析，以正己烷作為移動相沖提，依不同時間點收集沖提出的(Z)-亞丁基苯酞及(E)-亞丁基苯酞，分別提供(Z)-亞丁基苯酞及(E)-亞丁基苯酞。
如上所述，於本發明中，所提供之藥劑係具有治療 及/或延緩浦肯野细胞退化之功效，尤其可延緩或避免浦肯野细胞死亡，且可增加浦肯野细胞中蛋白質之泛素化作用，故可用於 治療脊髓性小腦萎縮症、阿茲海默症、及帕金森氏症之至少一者及/或延緩其發病。於本發明之部分實施態樣中，該藥劑係用於治療第三型脊髓性小腦萎縮症(SCA3)及/或延緩其發病。如本說明書實施例所示，本發明所提供之藥劑可有效延緩或避免患有第三型脊髓性小腦萎縮症之患者小腦中的浦肯野细胞死亡，且可有效改善患者的運動行為。
可以任何合宜的用量施用本發明所提供之藥劑，端 視投予個體之需求而異。舉例言之，當使用於人體以治療及/或延緩浦肯野细胞退化時，藥劑之用量，以亞丁基苯酞計，為每天約30毫克/公斤體重至約2,000毫克/公斤體重，較佳為每天約100毫克/公斤體重至約1,000毫克/公斤體重。惟，對於急性患者而言，其用量可視實際需要而酌增，例如增加至數倍或數十倍。此外，所投予之藥劑之總量可視需要於單次投藥程序中全部給予，或於多次投藥程序中分別給藥。
於本發明中，所提供之藥劑可呈任何形式，並以任何合宜之方式施用。舉例言之，但不以此為限，可經由口服、鼻腔給藥、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、及/或皮下或組織間緩釋劑型等方式施用至一需要的個體。其中，由於口服投藥劑型便於病人按時自行服用，故於本發明之一較佳實施態樣中，係以口服劑型提供該藥劑，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等。視使用形式及用途而定，該藥劑可更包含一醫藥可接受的載劑。於本發明之部分實施態樣中，係以橄欖油作為載劑。
以製備適於口服投藥之劑型為例，該藥劑中可含有 任何不會不利影響所含活性成分(即，亞丁基苯酞、其代謝前驅物、及/或前述之醫藥可接受鹽及/或酯)之活性的醫藥可接受載劑，例如：油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。可利用任何合宜之方法，將該組合物製成適於口服投藥的劑型。
至於製備適於靜脈注射或皮下注射之劑型，該藥劑 可例如包含一或多種等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、助溶劑(solubilizer)、乳化劑、以及其他載劑等成分，以製成一靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等。
除了上述佐劑外，該藥劑可視需要另含有調味劑、 調色劑、著色劑等添加劑，以提高所得藥劑服用時的口適感及視覺感受；另可添加合宜用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善藥劑的儲存性。此外，視需要地，可於本發明所提供之藥劑中併含一或多種其他活性成分，例如抗氧化劑(如維他命E)、神經滋養因子(neurotrophic factor)等，以進一步加強本發明藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對藥劑內所含之苯酞化合物之所欲功效沒有不利的影響即可。
此外，可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用本發明所提供之藥劑，端視投予個體之需求而異。
本發明亦提供一種於一個體中治療及/或延緩小腦浦肯野细胞退化的方法，其係包含對該個體施用一有效量之一苯酞化合物，其中該苯酞化合物係選自以下群組：亞丁基苯酞、亞 丁基苯酞之代謝前驅物、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受鹽、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受酯、以及前述之組合。其中，有關該活性成分之選用以及其性質、施用型態與劑量，均如上述之說明。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
[實施例]
[實施例1]體外細胞試驗
細胞轉染
本實驗測試亞丁基苯酞以及3-亞丁基-4,5-二氫苯酞對SCA3蛋白質表現程度的影響。首先，將含有綠色螢光蛋白之pEGFP-C1-Ataxin3Q84(即，具異常CAG重複數目(84Q)之Ataxin基因的質體)或pEGFP-C1-Ataxin3Q28質體(即，具正常CAG重複數目(28Q)之Ataxin基因的質體)(購自Addgene公司，美國)，經由轉染試劑(Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent，InvitrogenTM)轉染至人類胚胎腎臟細胞(Human embryonic kidney，HEK)293T((Bioresource Collection and Research Center，台灣)或神經幹細胞(Neural stem cell，NSC)中。將細胞培養於含有10%胎牛血清(Gibco)之DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，Thermo)，於5% CO2之37℃培養箱中。之後，以濃度5微克/毫升之亞丁基苯酞(A10353，購自Alfa Aesar，美國；純度95%)或3-亞丁基-4,5-二氫苯酞(5393-015M1，購自pharmaron，中國)處理細胞24小時後，使用螢光顯微鏡觀察各 組細胞中GFP-ATXN3蛋白質聚集的情形。實驗以野生型(wild type)細胞及經綠色螢光蛋白(GFP)轉染之細胞作為對照組。實驗結果顯示於第1圖。
如第1圖所示(右下角之比例尺為100微米)，未經GFP轉染的細胞不會發出螢光，而經質體轉染的細胞則可明顯觀察到螢光表現，顯示實驗所使用的細胞可成功表現GFP及ATXN3。此外，經亞丁基苯酞或3-亞丁基-4,5-二氫苯酞處理之細胞的螢光表現Ataxin3Q84的程度明顯降低，相較於未經藥物處理的組別，顯示亞丁基苯酞及3-亞丁基-4,5-二氫苯酞可減少ATXN3蛋白質的數量。
[實施例2]斑馬魚活體內試驗
(1)測試安全劑量
本實驗使用斑馬魚做為動物模式，實驗組使用之斑馬魚品系為Tg(HuC：GFP)，此品系特徵為初級感覺神經元(Rohon-Beard cells)會產生螢光，故方便進行觀察，控制組則使用野生型品系，全部魚種皆由TZCAS(中研院台灣斑馬魚中心(Taiwan Zebrafish Core Facility at Academia Sinica)，台灣)及TZCF(台灣斑馬魚中心(Taiwan Zebrafish Core Facility)，台灣)提供。首先，測試亞丁基苯酞對於斑馬魚之毒性，注射不同劑量之亞丁基苯酞至斑馬魚，於28.5℃進行培養，並於48小時後觀察其存活率。
結果如第2圖所示，野生型斑馬魚之存活率為100%，而經500毫克/公斤亞丁基苯酞注射之斑馬魚的存活率約50%，經250毫克/公斤及50毫克/公斤亞丁基苯酞注射之斑馬魚 的存活率都大於75%，但在經ATXN3 MO或H2O注射後，斑馬魚的存活率有些微下降，推測可能是因注射時感染或魚卵品質不佳。由此實驗結果可知，濃度250毫克/公斤以下之亞丁基苯酞對斑馬魚為安全劑量。
(2)斑馬魚行為測試
本實驗使用ATXN3基因之嗎啉基DNA片段(morpholinos，Gene Tools，美國；以下稱為ATXN3 MO)以消除斑馬魚之內源性ATXN3的表現，以引起神經損傷效果。MO為DNA結構進行修飾而成，具有阻斷mRNA轉譯蛋白功能，可使生物不表現特定目標蛋白。實驗所用之ATXN3 MO的序列為5'-TCCTCCTCGTCCAGCTGCTGTGCTA-3'(SEQ ID NO.：1)，所使用之標準品控制組的序列為5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3'(SEQ ID NO.：2)(以下稱為Ct MO)。注射前，將MO溶解於ddH2O，儲存於-20℃備用。在斑馬魚之魚卵出生約1小時內，進行微注射，並於注射完24至48小時(hour post fertilization，hpf)後，以300奈莫耳濃度/微升之ATXN3 MO、或ATXN3 MO合併250毫克/公斤亞丁基苯酞、125毫克/公斤亞丁基苯酞、或62.5毫克/公斤亞丁基苯酞微注射處理魚卵，48小時後，以滴管尖(tip)刺激魚尾，並測量刺激致魚尾移動所需的次數。
實驗結果如第3圖所示，相較於野生型(簡稱Wt)、Ct MO、及控制組(Mock)，注射ATXN3 MO之組別的斑馬魚之刺激魚尾致移動的次數明顯較高，而在經亞丁基苯酞注射後則有回復的現象，由此可知亞丁基苯酞具有恢復疾病斑馬魚之行為能 力的效果，且其中又以濃度250毫克/公斤之效果最明顯。
(3)共軛焦顯微鏡試驗
以300奈莫耳濃度/微升ATXN3 MO、250毫克/公斤亞丁基苯酞、或ATXN3 MO合併250毫克/公斤亞丁基苯酞、125毫克/公斤亞丁基苯酞、或62.5毫克/公斤亞丁基苯酞微注射處理魚卵，48小時後，將魚體封入玻片中，以共軛焦顯微鏡進行活體螢光運動神經元拍攝。
實驗結果顯示，野生型之斑馬魚中沒有特殊的神經損傷，且只注射亞丁基苯酞及Ct MO也未出現明顯的神經損傷；但在注射Ataxin-3 MO後，會導致斑馬魚之神經訊號明顯減弱，由此證明Ataxin-3 MO具有神經損傷效果且具有專一性。此外，如第4圖所示，以250毫克/公斤亞丁基苯酞治療ATXN3 MO斑馬魚，具有維持運動神經元數量之效果。其中，第4圖所示數據為存活數/總隻數*100%所得。
[實施例3]小鼠活體內試驗
本實驗使用MJD84.2基因轉殖小鼠(即，經人類84CAG重複ATXN3基因轉殖的小鼠，簡稱SCA3小鼠)進行實驗。MJD84.2基因轉殖小鼠為研究脊髓性小腦萎縮症之動物模型，這類小鼠會在出生後4週內出現步態異常的情況，之後會開始陸續出現輕度震顫、中度活動能力減退、前/後肢不正常收縮(約24周齡)、及有無力趴地的情況。
(1)MJD84.2基因轉殖小鼠之治療
將二週齡之MJD84.2基因轉殖小鼠隨機分為5個組別，每組6隻，分別以如下列條件進行處理2周：(1)未處理；(2)餵食橄欖油 (即，僅餵食佐劑)；(3)餵食亞丁基苯酞100毫克/公斤/每天分兩次餵食(bid)；(4)餵食亞丁基苯酞500毫克/公斤/每天分兩次餵食(bid)；(5)餵食3-亞丁基-4,5-二氫苯酞100毫克/公斤/每天分兩次餵食(bid)；另以野生型小鼠(WT)作為控制組。2週後，開始進行，Local motor及轉棒測試。
(2)Local motor測試
進行Local motor測試，以測試小鼠之運動能力。
使10週齡的小鼠於轉棒(rotarod)上進行了測試，每3週測試一次。接著，將小鼠放置在一個透明的壓克力盒2小時，使牠自由移動，利用機器VersaMax 420(AccuscanInstrumentsInc，USA)進行1小時之行為測試後，進行數據分析統計。
實驗結果如第5A、5B、及5C圖所示，相較於未處理及經橄欖油餵食組，經亞丁基苯酞或3-亞丁基-4,5-二氫苯酞餵食組的小鼠的總移動距離(第5A圖)、移動次數(第5B圖)、及移動時間(第5C圖)都較長，顯示其運動能力較佳。本實驗結果顯示亞丁基苯酞及3-亞丁基-4,5-二氫苯酞可改善MJD84.2基因轉殖小鼠的運動行為。
(3)轉棒(rotarod)測試
進行轉棒測試，以測試小鼠之平衡能力及抓握能力。測試之前，先使小鼠練習二星期後，再進行第一次行為測試，此實驗為利用IITC轉棒(IITC Life Science Inc，美國)進行測試。使10週齡的小鼠於轉棒(rotarod)上進行了測試，每3週測試一次，條件為在300秒內從4至40轉進行線性加速，記錄小鼠自轉棒掉落(latency to fall)的時間(秒)。每次試驗持續最多5分鐘， 在每次測驗之間使小鼠至少休息15分鐘，以避免疲勞。轉棒試驗後，記錄小鼠的體重。小鼠去每天進行3次試驗，連續四天，以每天平均自轉棒掉落下降的時間進行統計分析。
實驗結果如第6圖所示，相較於未處理及經橄欖油餵食組，在經亞丁基苯酞或3-亞丁基-4,5-二氫苯酞餵食的組別中，小鼠的平衡能力及抓握能力較佳，顯示亞丁基苯酞及3-亞丁基-4,5-二氫苯酞可改善MJD84.2基因轉殖小鼠的運動行為。
[實施例4]組織化學染色試驗
將八週齡之MJD84.2基因轉殖小鼠(即，具有經修飾之ATXN3 gene)隨機分為5個組別，，每組6隻，並以下列條件進行處理：(1)未處理；(2)餵食橄欖油；(3)餵食亞丁基苯酞100毫克/公斤/每天分兩次餵食(bid)；(4)餵食亞丁基苯酞500毫克/公斤/每天分兩次餵食(bid)；(5)餵食3-亞丁基-4,5-二氫苯酞100毫克/公斤/每天分兩次餵食(bid)。之後，分別在第20週及24週時犧牲小鼠並進行小腦切片染色及組織蛋白萃取(參見實施例5)，以3.7%福爾馬林隔夜固定小鼠全腦組織後，將樣品包埋入石蠟中。使用Quanto套組(Thermo，美國)將樣品進行切片(4微米)並安裝在顯微鏡幻燈片上。
第7圖所示為SCA3小鼠免疫化學組織染色小腦的切片染色結果，其中，未治療組及經橄欖油餵食組顯示明顯的浦肯野细胞缺失，但經亞丁基苯酞或3-亞丁基-4,5-二氫苯酞治療之組別的小鼠，其浦肯野细胞數量顯著多於未治療組別及橄欖油組，此實驗結果顯示亞丁基苯酞及3-亞丁基-4,5-二氫苯酞治療可可延緩或避免浦肯野细胞死亡。
[實施例5]西方墨點法
取於實施例4犧牲之SCA3小鼠的全腦組織，進一步分離出小腦組織，並進行蛋白質萃取。將所得純化蛋白質分別使用抗-泛素(ubiquitin)抗體以及抗-鈣結合蛋白(calbindin)抗體進行西方墨點法分析，以測定各組別之SCA3小鼠之小腦組織之泛素及鈣結合蛋白的蛋白質含量變化。實驗以β-肌動蛋白作為內控制組。
如第8圖所示，相較於未治療組及經橄欖油餵食組，經亞丁基苯酞或3-亞丁基-4,5-二氫苯酞治療之組別的小鼠其鈣結合蛋白的蛋白質表現量明顯較高。已知鈣結合蛋白為浦肯野细胞之標記物(marker)，此實驗結果與切片結果皆顯示浦肯野细胞的數量增加，證實亞丁基苯酞及3-亞丁基-4,5-二氫苯酞可減緩SCA3疾病進程。
此外，如第9圖所示，相較於未治療組及經橄欖油餵食組，經亞丁基苯酞治療之組別的小鼠其經泛素進行泛素化(ubiquitin ubiquitination)之蛋白質的含量明顯較高，顯示亞丁基苯酞具有增加泛素進行泛素化之能力，亦即，可增加小腦神經細胞中蛋白質之泛素化作用，故可增加錯誤蛋白經由蛋白酶體(proteasome)代謝的效率，減緩SCA3之疾病進程。
以上實施例之結果顯示，使用本發明所涉特定苯酞化合物可治療及/或延緩浦肯野细胞退化，故可治療脊髓性小腦萎縮症、阿茲海默症、帕金森氏症及/或延緩其發病。
上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違 背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後附申請專利範圍所界定者。
<110> 長弘生物科技股份有限公司
<120> 苯酞化合物之應用
<130> 無
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> ATXN3 MO
<400> 1
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 控制組MO
<400> 2

Claims (12)

  1. 一種使用一苯酞化合物(phthalide)於製備藥劑的用途，其中該藥劑係用於治療及/或延緩浦肯野细胞(Purkinje cells)退化，且其中該苯酞化合物係選自以下群組：亞丁基苯酞(n-butylidenephthalide)、亞丁基苯酞之代謝前驅物、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受鹽、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受酯、以及前述之組合。
  2. 如請求項1之用途，其中該苯酞化合物係亞丁基苯酞。
  3. 如請求項2之用途，其中該亞丁基苯酞係包含90%或更高之Z-亞丁基苯酞。
  4. 如請求項1之用途，其中該苯酞化合物係亞丁基苯酞之代謝前驅物、亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受鹽、及/或亞丁基苯酞之代謝前驅物之醫藥可接受酯。
  5. 如請求項3之用途，其中亞丁基苯酞之代謝前驅物係3-亞丁基-4,5-二氫苯酞(3-butylidene-4,5-dihydrophthalide)。
  6. 如請求項1之用途，其中該藥劑更包含橄欖油(olive oil)作為載劑。
  7. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該藥劑係用於延緩或避免小腦中浦肯野细胞(Purkinje cells)死亡。
  8. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該藥劑係呈以下劑型：口服、鼻腔給藥、靜脈注射、皮下或組織間緩釋。
  9. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該藥劑係用於增加浦肯野细胞中蛋白質之泛素化作用。
  10. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該藥劑係用於治療以下疾病及/或延緩其發病：脊髓性小腦萎縮症、阿茲海默症、帕金森氏症、及前述之組合。
  11. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該藥劑係用於治療脊髓性小腦萎縮症及/或延緩其發病。
  12. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該藥劑係用於治療第三型脊髓性小腦萎縮症及/或延緩其發病。
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