TW201600101A - 發酵大豆萃取物作為吲哚胺２，３雙加氧酶抑制劑的應用 - Google Patents

Abstract

本發明關於發酵大豆萃取物作為吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)抑制劑的應用。

Description

發酵大豆萃取物作為吲哚胺2，3雙加氧酶抑制劑的應用 【相關申請案交互參照】

本申請案主張於2014年6月13日申請的第62/011,856號美國臨時專利申請案的優先權，這些全部在此完整併入當成參考。

本發明關於發酵大豆萃取物作為吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)抑制劑的用途。

吲哚胺2，3雙加氧酶(IDO1或IDO)是一種含有含鐵血紅素單體蛋白，其催化必需氨基酸色胺酸(Tryp)的降解。IDO已經被視為是一種賦予有力的免疫調節效應的酵素，以調節體內的免疫反應，歸因於其造成了必需氨基酸色胺酸的分解代謝的酵素活性。IDO調節的色胺酸分解代謝已經被證實藉由通過多種機轉而對T細胞產生效應，包括降低的T細胞增生、增加的T細胞自戕以及調控T細胞(T regulatory cells,Tregs)的誘發，其共同導致細胞免疫反應的損害[1-4]。

本發明非可預期的發現，發酵大豆萃取物有效於抑制吲哚胺2，3雙加氧酶的活性，因而可作為IDO抑制劑。

因此，本發明提供發酵大豆萃取物作為IDO抑制劑的應用。

具體而言，所述的發酵大豆萃取物是通過以至少一種乳酸菌(例如，乳桿菌屬(LactobaciIIus species)和可視需要的至少一種酵母菌(例如，酵母菌屬(Saccharomyces species))使水溶性大豆萃取物發酵來製得。

在部分具體實施例中，發酵後進行一或多個選自由以下組成的群組的步驟：滅菌、過濾、濃縮、凍乾及其任何組合。

在特定具體實施例中，該發酵大豆萃取物是通過包含以下步驟的過程來製得：(a)以至少一種乳酸菌伴隨至少一種酵母菌使水溶性大豆萃取物發酵，以形成發酵液；(b)對該發酵液進行滅菌；(c)過濾經滅菌發酵液；和(d)從經過濾發酵液移除水，以形成濃縮的發酵大豆萃取物。

本發明的各個具體實例的細節說明如後。本發明的其它特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。

出於闡釋本發明的目的，在圖式中顯示當前較佳的實施例。然而，應理解，本發明並不限於所顯示的較佳實施例。在圖式中：圖1顯示MS-20(本發明的發酵大豆萃取物)在人類周邊血單核細胞(PBMCs)抑制干擾素伽瑪(IFNγ)誘發的IDO活性。結果來自於n=6單獨實驗，資料以平均±標準差的方式呈現，其中(a)顯示色氨酸濃度降低(μM,Tryp)，(b)犬尿氨酸(kynurenine)濃度增加(μM,kyn)，以及(c)Kyn/Tryp比例(μmol/mmol)。

圖2顯示MS-20以劑量依賴方式在人類周邊血單核細胞(PBMCs)抑制IFNγ誘發的IDO活性，其中(a)為色氨酸濃度(Tryp)，(b)犬尿氨酸濃度(Kyn)，以及(c)為Kyn/Tryp比例(*10³)。這些結果顯示MS-20以劑量依賴方式抑制IDO活性，EC₅₀經計算分別為0.71、0.46或0.48%(1% MS-20=4mg/mL)。

圖3顯示MS-20以劑量依賴方式抑制IFNγ誘發的海拉(HeLa)人類子宮頸癌細胞IDO活性，其中(a)為犬尿氨酸濃度(μM,Kyn)及(b)抑制百分比(%)。這些結果以平均±標準差表示(n=3獨立實驗)。

圖4顯示人類周邊血單核細胞(PBMCs)的存活率。以0.125%-1%(0.5-4mg/mL)的MS-20處理人類PBMCs達2天。以MTT分析測定細胞存活率。結果顯示細胞存活率以MS-20劑量依賴的方式增加。這些結果來自於2次獨立實驗的平均值。

圖5顯示海拉人類子宮頸癌細胞的存活率。以不同濃度的(a)MS-20或(b)L-1MT處理海拉人類子宮頸癌細胞達2天。結果顯示細胞存活率隨著MS-20的濃度增加而降低。這些結果以平均±標準差表示(n=3獨立實驗)。

圖6顯示MS-20以劑量依賴方式抑制IDO酵素活性。資料以抑制百分比(%)表示。這些結果以平均±標準差表示(n=2獨立實驗)。

除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域技術人員一般所瞭解相同的含義。如此處所使用者，以下用語具有歸因於該等用語的意義，除非另有限定。

在本文中，冠詞「一」是指一個或一個以上(亦即，至少一個)該冠詞語法上之受詞。舉例而言，一元件是指一個元件或多於一個的元件。

在本發明中，非可預期的發現，發酵大豆萃取物有效於抑制吲哚胺2，3雙加氧酶的活性，因而可作為IDO抑制劑。

因此，本發明提供一種抑制吲哚胺2，3雙加氧酶(IDO)的方法，包括將發酵大豆萃取物以有效於抑制IDO活性的含量投用於有需要的個體。

本發明也提供發酵大豆萃取物用於製備抑制吲哚胺2，3雙加氧酶活性的組合物的應用。本發明還提供一種抑制吲哚胺2，3雙加氧酶活性的方 法，包括使吲哚胺2，3雙加氧酶與有效於抑制IDO活性的含量的發酵大豆萃取物接觸。

根據本發明，此處所使用的發酵大豆萃取物是指通過利用至少一種乳酸菌和可視需要的至少一種酵母菌使水溶性大豆萃取物發酵製得的萃取物。在一個實施例中，該至少一種乳酸菌是乳桿菌屬且該至少一種酵母菌是酵母菌屬。在特定實施例中，發酵是使用不同種類的乳桿菌屬培養物(例如5、10、15、20、25或30種乳桿菌屬菌株的培養物)來實施，且較佳地，將至少一種酵母菌添加到不同種類的乳桿菌屬培養物中。可用於發酵的乳桿菌屬菌株包括，但不限於，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)CCRC(食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，臺灣)10695、14026、14064、14065及/或14079；德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii bulgaricus)CCRC10696、14007、14009、14010、14069、14071、14098及/或16054；德氏乳桿菌乳亞種(Lactobacillus Iactis lactis)CCRC10791、12267、12306、12312、12315、12323、14016、14015及/或14117；高加索優酪乳乳桿菌(LactobaciIIus kefir)CCRC14011及/或馬乳酒樣乳桿菌(Lactobacillus kefiranofaciens)CCRC16059。可用於發酵的酵母菌菌株包括，但不限於，釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CCRC20577、20578、20581、21494、21550、21797、21805、22138、22234、22337、22731及/或22728及/或乳酒假絲酵母菌(Candida kefyr)CCRC21269、21742及/或22057。具體而言，在發酵後進行一個或一個以上步驟，例如滅菌、過濾、濃縮、凍乾或其任何組合。較佳地，在發酵後通過例如加熱進行滅菌，且可視需要地進行過濾和濃縮。更佳地，可經由例如凍乾來乾燥發酵大豆萃取物，以獲得呈粉末形式的發酵大豆萃取物。在某一實施例中，本發明的發酵大豆萃取物是通過包含以下步驟的製程來製得：(a)利用至少一種乳酸菌伴隨至少一種酵母菌使水溶性大豆萃取物發酵，以形成發酵液；(b)對該發酵液進行滅菌；(c)過濾經滅菌 發酵液；和(d)自經過濾發酵液移除水，以形成濃縮的發酵大豆萃取物。本文所用的發酵大豆萃取物可如美國專利第6,855,350號和第6,733,801號來製備，所述專利的每一者都以全文引用方式併入本文中。

如美國專利第6,733,801號所述，製備方法是將大豆屬有機物(去脂後)與蒸餾水按照1：10的比例混合。將混合物加熱到100℃，並保持30分鐘，然後過濾得到大豆屬萃取物。將牛肉和海藻在蒸餾水中保持沸騰狀態30分鐘，以得到肉湯培養基。加入鹽、糖和瓊脂以得到特殊的瓊脂培養基。向特製的瓊脂培養基中加入乳酸菌和酵母菌株。培養基中的乳酸菌和可選的酵母菌轉移到大豆屬萃取物中，在36-43℃培養45-50小時。由於不同種類的微生物根據其相似的生長特性而成群生長，因此最好在培養前將這些微生物群分開加入到大豆屬萃取物中。這些生長特性為(例如)獨特營養培養基的任何要求、微生物菌株發酵後是否能產生較好的氣味、以及該類微生物是否能在此獨特的條件下存活。這樣做的目的是減少不同種菌株間的負面作用。不同的微生物菌株群最好在培養前以等比例加入到大豆屬發酵萃取物中，得到的萃取物在40℃下培養45-47小時。該培養過程結束後，再將異種培養物引入大豆屬萃取物中，在36-43℃下培養100-150小時。將最終的發酵萃取物加熱滅菌過濾。在濃縮器中去除95%的水份，得到濃縮或凝聚狀態的發酵的大豆屬萃取物。最上層經過瓷器過濾，分放在容器中密封保存。

此處所使用的名詞「個體」或「對象」包括人類及非人類動物，例如，伴侶動物(如，狗、貓及類似者)、農場動物(如，牛、羊、豬、馬及類似者)或實驗動物(如，大鼠、小鼠、天竺鼠及類似者)。

此處所使用的名詞「治療」是指為了治癒、癒合、減輕、舒緩、改變、矯正、改善、改進或影響該疾病、該疾病之症狀、該疾病引起的殘疾或 該疾病的進展，而將包含一或多種活性劑之組合物施用或投與至患有該疾病、該疾病之症狀或病況或該疾病的進展的個體。

此處所使用的名詞「有效量」是指各活性成分對個體可產生治療效應之所需含量，可以是單獨或結合一或多種活性成分。如熟習本項技術者可理解的，有效量將視情形而定，取決於，例如，給藥途徑，賦形劑的使用，及與其他活性成份的並用。例如，有效於抑制IDO活性的量是降低或抑制IDO活性的量，其可使用此領域已知的方法來決定或評估，例如，以細胞為基礎的分析或酵素分析(參見以下實例)。

在部分具體實施例中，本發明的發酵大豆萃取物有效於降低周邊血單核細胞(PBMCs)的IDO活性。

在部分具體實施例中，本發明的發酵大豆萃取物有效於增加周邊血單核細胞(PBMCs)的存活率。

在部分具體實施例中，本發明的發酵大豆萃取物有效於增加免疫反應，特別是T細胞調節的免疫反應，經由，例如，增加T細胞增生、降低T細胞自戕及降低調節T細胞而達成。

具體而言，本發明的發酵大豆萃取物有效於在有需要的個體治療IDO調節的免疫低下。此處所使用的名詞「免疫低下」可指免疫系統任一成員的損壞，導致降低的免疫功能。免疫低下可能由各種因素造成，例如，壓力、營養不良、感染疾病、癌症、器官移植的抗排斥藥物、抗發炎藥物或癌症的化療或輻射治療。

在部分具體實施例中，感染疾病是病毒感染，選自人類免疫不全病毒(HIV)、C型肝炎病毒、麻疹病毒、登革熱病毒及淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)所組成的群組。

在部分具體實施例中，化療是經由投用抗癌化療藥物而進行，選自順鉑(cisplatin)、多西它賽(docelaxel)、泛艾黴素(epirubicin)、艾日布林(eribulin)、弗瑞斯錠(fareston)、吉西它賓(gemcitabine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、泰莫西芬(tamoxifen)及長春新堿(vincristine)所組成的群組。

在部分具體實例中，輻射治療包括銫，銥，碘或鈷。輻射治療可以是全身性或針對位置的局部性，例如，針對腫瘤位置及固體癌組織。幅射治療可以是傳統的外照射和電子放射療法，質子放射療法，近距離放射療法和分子放射療法。

具體而言，如此領域已知者，IDO的免疫抑制活性已經在不同的生理及病理情況中予以證實，包括癌症。基於測定色氨酸及犬尿氨酸的血清濃度的研究，IDO顯示在患有癌症的病患中慢性活化，且IDO活化與廣泛的疾病狀態有關。IDO在許多的人類腫瘤種類及定位於腫瘤引流淋巴結(TDLNs)的星狀細胞(DCs)過度表現。增加的IDO表現已經顯示是對於患有急性髓性白血病(AML)、小細胞肺癌、黑素瘤、卵巢癌、結腸直腸癌、胰腺癌及子宮內膜癌之病患的降低存活之獨立預後可變因素。因此，IDO抑制可被確認為癌症免疫療法的有希望的方式。

在部分具體實施例中，癌症包括胃癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、子宮頸癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌及血癌。

本發明的發酵大豆萃取物可通過任何生理上可接受的途徑來遞送，例如，經口、經腸外(例如，肌內、靜脈內、皮下、腹膜內)、經皮、經直腸、通過吸入等。在一具體實施例中，本發明的發酵大豆萃取物是經口投與。

在部分具體實施例中，根據本發明的發酵大豆萃取物可以有效量投用達一段足夠時間，以在有需要的病患活化或恢復T細胞活性。

為幫助遞送，可用生理上可接受的載劑將本發明發酵大豆萃取物調配為組合物。可將本發明組合物調配成藥物、食品添加劑或保健產品。

本文所使用的「生理上可接受的」乙詞指載劑與組合物中所含的活性成份相容，較佳地能穩定該活性成份，並且對治療個體無害。載劑可用作活性成份的稀釋劑、媒劑、賦形劑或介質。適宜賦形劑的一些實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠(gum acacia)、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿和甲基纖維素。醫藥組合物可另外包括潤滑劑，例如，滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油；潤濕劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，例如，羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯；增甜劑；和矯味劑。

可根據說明書中所提供教示內容使用常規技術視需要以任何形式來製備本發明的組合物。在某些實例中，可將本發明組合物製成以下形式：錠劑、丸劑、粉劑、錠劑、香囊、扁囊劑、酏劑、懸浮劑、乳劑、溶液、糖漿劑、軟和硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射液及包裝的粉末。

本發明組合物可通過任何生理上可接受的途徑來遞送，例如經口、經腸外(例如肌內、靜脈內、皮下、腹膜內)、經皮、經直腸、通過吸入和諸如此類。在一具體實施例中，本發明的組合物是經口投與。

現將參照以下實施例更具體地闡述本發明，提供所述實施例用於說明性而非限制性目的。

實施例

在本研究中，我們使用IFNγ刺激的人類周邊血單核細胞(PBMCs)，以研究本發明的發酵大豆萃取物(下稱MS-20)對於色氨酸降解的效應。以IFNγ刺激PBMC誘發顯著的色氨酸分解代謝，其可反應於色氨酸濃度降低及犬尿氨酸濃度的平行增加，相較於未經刺激的細胞而言。並行地，也觀察到細胞存活 的增加。以增加劑量0.5-4mg/mL(0.125%-1%)MS-20處理經IFNγ刺激的PBMC顯著地抑制IFNγ誘發的色氨酸降解。MS-20的該等效應是劑量依賴的。此一基於細胞的IDO分析也在具有較高內生IDO表現的海拉人類子宮頸癌細胞中進行，結果也在海拉細胞中觀察到相同的經由MS-20的抑制現象，IC₅₀為1.8mg/mL。由MS-20抑制IDO也經由酵素分析確認，獲得與基於細胞分析類似的結果(IC₅₀為1.86mg/mL)。這些結果證實MS-20對於IFNγ誘發的IDO有抑制作用。

1.材料方法 1.1.試劑

細胞株購自美國典型組織培養物中心(ATCC)及依據建議的培養條件例行維護。L-1MT(IDO抑制劑)、L-色氨酸、L-犬尿氨酸購自Sigma-Aldrich。人類IFNγ購自R&D Systems，根據製造商的建議儲存和使用。

1.2 IDO酵素活性分析

IDO活性測定採用比色法。簡言之，將2×10⁶細胞通過冷凍和解凍破壞，溶解物(250μL)通過離心澄清化，加入等量2倍IDO緩衝液(100mM磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，pH為6.5，含40mM抗壞血酸、20μm的亞甲基藍、200mg/ml過氧化氫酶和800μm的L-色氨酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))。在37℃培育30分鐘後，加入100μL的30%三氯乙酸以終止反應，在52℃再另外培育30分鐘，並離心。將上清液用Ehrlich試劑(100mg對-二甲基苯甲醛，5mL冰醋酸)於微量滴定板孔(96孔格式)等量混合，使顏色發展10分鐘，然後以分光量度計在490nm讀取吸亮度。樣本相對於空白試劑以490nm濾鏡在微量盤分析儀(BioTek Systems)讀取。犬尿氨酸的濃度對應於犬尿氨酸標準曲線予以計算。

1.3以細胞為基礎的IDO分析 在人類PBMC測定抑制劑活性

人類周邊血單核細胞(PBMCs)是通過Ficoll-Hypaque密度梯度分離自健康志願者的白血球細胞濃縮物(從血庫得到)。該測定如下進行：人類PBMCs以每孔2×10⁵的密度接種於含有RPMI培養基的96孔培養板，RPMI含有10%胎牛血清，100單位/毫升青黴素和鏈黴素(GIBCO)。將100ng/mL的人類IFNγ(R&D Systems)及MS-20連續稀釋液添加至合適的孔，使得每孔最終體積為200μL培養基。在含5%CO₂的濕潤培養箱中，于37℃培育40-44小時後，收集來自三重複的孔的上清液並予以保存，以供藉由HPLC的色氨酸和犬尿氨酸分析。對於剩餘的細胞，進行MTT細胞存活分析，以測定經過各種處理後的細胞存活率。

1.4在以海拉細胞為基礎的IDO/犬尿氨酸分析測定抑制劑活性

海拉細胞(# CCL-2)是從美國典型組織培養物中心(ATCC，馬納薩斯，維吉尼亞州)獲得，並常規維持於Dulbecco氏改良Eagle培養基(DMEM)，其含有10%牛胎兒血清，含有100單位/毫升的青黴素和鏈黴素(GIBCO)。將細胞保持在37℃，供給5%CO₂的濕潤培養箱中。該分析如下進行：將海拉細胞以5×10³每孔的密度接種在96孔培養板，生長過夜。隔日，將50ng/mL的人類IFNγ(R&D Systems)及MS-20或L-1MT的連續稀釋液，以每孔200μL培養基總體積，加入到細胞中。經過額外40-44小時培養後，收集來自三重複的孔的上清液並予以保存，以供藉由HPLC的色氨酸和犬尿氨酸分析。對於剩餘的細胞，進行MTT細胞存活分析，以測定細胞存活率。

1.5藉由HPLC分析培養基中的色氨酸及犬尿氨酸。

為了測定IDO活性，使用高效能液相層析法(High performance liquid chromatography)在反相測量上清液的色氨酸和犬尿氨酸的濃度，以及計算Kyn/Tryp[5]。

2.結果

在以細胞為基礎的IDO分析中，以IFNγ刺激PBMC，觀察到色氨酸的降解有提升。相較於未經處理的細胞，IFNγ刺激的PBMC的上清液含有顯著較低的色氨酸的濃度(P<0.001，表1及圖1)。相較之下，在IFNγ刺激的細胞中，犬尿酸濃度顯著上升(P<0.001，未顯示)。因此，Kyn/Tryp比例在IFNγ刺激的PBMC比在未經IFNγ刺激的PBMC還要高(P<0.001，表1a及圖1)。

以0.5-4mg/mL(0.125%-1%)的MS-20處理細胞，不影響靜息細胞的色氨酸代謝(資料未顯示)。相較之下，在PBMC，以IFNγ刺激提升了色氨酸的降解、犬尿酸的產生，以及Kyn/Tryp比例以劑量依賴方式受到MS-20的影響(圖2)。在IFNγ活化的海拉人類子宮頸癌細胞，也觀察到類似受MS-20抑制的現象(圖3)。的確，在海拉細胞受50ng/mL的IFNγ刺激40-42小時後，在培養基中的色氨酸濃度下降到甚至低於檢測限制(表1b)。L-1MT，一種IDO抑制劑，平行地予以測試，以比較IDO抑制活性。以MS-20抑制IDO也可藉由IDO酵素分析獲得確認，結果類似於以細胞為基礎的分析(圖6；IC 50=1.86mg/mL)。這些結果顯示，MS-20有效地抑制IDO活性。

MTT(細胞存活率)分析結果顯示PBMC的存活率在MS-20存在下增加(表1a)，而海拉細胞的存活率在MS-20最高濃度(4mg/mL)下，僅有輕度的降低(20%)。此等在PBMC及海拉細胞的細胞存活率的改變是劑量依賴性的(圖4-5)。綜合判斷之，由MS-20處理所觀察到的IDO活性降低並非因細胞數量或細胞存活率下降所致。

咸信本發明所屬技藝中具一般知識者基於本文的敘述，無須進一步之例示即可將本發明應用至其最廣泛之範圍。因此，應瞭解此處所提供之敘述及申請專利範圍系供例示目的而非以任何方式限制本發明之範疇。

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5. Widner B, Werner ER, Schennach H, Wachter H, Fuchs D. Simultaneous measurement of serum tryptophan and kynurenine by HPLC. Clin Chem 1997; 43:2424-6.

Claims (13)

1. 一種發酵大豆萃取物用於製備抑制吲哚胺2，3雙加氧酶活性的組合物的應用。
2. 如請求項1的應用，其中所述的組合物有效於降低周邊血單核細胞的吲哚胺2，3雙加氧酶活性。
3. 如請求項1的應用，其中所述的組合物有效於增加周邊血單核細胞的存活率。
4. 如請求項1的應用，其中所述的組合物有效於提升免疫反應。
5. 如請求項4的應用，其中所述的免疫反應是T細胞調節的免疫反應。
6. 如請求項1的應用，其中所述的組合物有效於治療吲哚胺2，3雙加氧酶調節的免疫低下。
7. 如請求項1的應用，其中所述的組合物包含另一吲哚胺2，3雙加氧酶抑制劑。
8. 如請求項1的應用，其中所述的另一吲哚胺2，3雙加氧酶抑制劑是1-甲基色氨酸。
9. 如請求項1至8中任一項的應用，其中所述的發酵大豆萃取物是通過以至少一種乳酸菌和可視需要的至少一種酵母菌使水溶性大豆萃取物發酵來製得。
10. 如請求項9的應用，其中該至少一種乳酸菌是乳桿菌屬(Lactobacillus species)且該酵母菌是酵母菌屬(Saccharomyces species)。
11. 如請求項9的應用，其中在發酵後進行一或多個選自由以下組成的群組的步驟：滅菌、過濾、濃縮、凍乾及其任何組合。
12. 如請求項9的應用，其中該發酵大豆萃取物是通過包含以下步驟的過程來製得：(a)以至少一種乳酸菌伴隨至少一種酵母菌使水溶性大豆萃取物發酵，以形成發酵液；(b)對該發酵液進行滅菌；(c)過濾經滅菌發酵液；和(d)從經過濾發酵液移除水，以形成濃縮的發酵大豆萃取物。
13. 一種抑制吲哚胺2，3雙加氧酶活性的方法，包括使吲哚胺2，3雙加氧酶與發酵大豆萃取物接觸，其中該發酵大豆萃取物的量有效於抑制吲哚胺2，3雙加氧酶的活性。