TW201600097A - 蓮蓬萃取物及其用於美白之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關於一種蓮蓬萃取物及其用於美白之用途，其係施予蓮蓬萃取物一有效劑量於皮膚，以抑制參與黑色素生成路徑相關之第二傳訊者(second messenger)、基因或蛋白質之表現並進而抑制酪胺酸酶活性，達到抑制黑色素生成之用途；其中蓮蓬萃取物係以下列步驟製得：提供一蓮蓬材料，利用熱水萃取蓮蓬材料以獲得一溶液，再經由過濾以獲得一濾液，最後乾燥濾液以製得一富含類黃酮(flavonoid)之蓮蓬萃取物。
Description
本發明係有關於一種蓮蓬萃取物及其用於美白之用途，尤其係指蓮蓬萃取物具有抑制參與黑色素生成路徑相關之第二傳訊者(second messenger)、基因或蛋白質表現並進而抑制酪胺酸酶活性之能力，進而達到抑制黑色素生成之用途；因此，蓮蓬萃取物可進一步運用於製備美白相關之化妝品組合物。
按，皮膚為了保護皮膚不受到陽光中紫外線的傷害，皮膚中的黑色素細胞(melanocytes)會合成黑色素(melanin)以防禦抵抗陽光中的紫外線。過去研究指出酪胺酸酶(tyrosinase)為調控黑色素生成之關鍵酵素，不僅參與黑色素生成過程中的許多反應，並且為催化反應中速率限制步驟的關鍵酵素，因此酪胺酸酶的含量可作為黑色素生成反應之指標。再者，黑色素生成之作用亦受到其他多種因子如酪胺酸酶相關蛋白-1 (tyrosinase related protein-1, TRP-1)及酪胺酸酶相關蛋白-2 (TRP-2) 等酵素或轉錄因子所調控，造成黑色素生成含量改變。由於黑色素生成量增加會導致膚色黯沉，而使人看起來較缺乏精神甚至影響美觀，因此如何保養皮膚以減緩黑色素生成，便成為眾多消費者追求之方向。
近年來，隨著健康取向相關的意識抬頭，以及化學合成的美容保養品多少存在有過敏或其他副作用之問題，使得以天然萃取物作為主要原料的方式愈來愈受消費者愛戴。經研究證實具有美白效果的天然物質例如麴酸(kojic acid)、鞣花酸(ellagic acid)和熊果素(arbutin)等等，上述三者皆屬酪胺酸酶抑制劑；其中麴酸與鞣花酸可螯合活化區域中的銅離子，使酪胺酸酶失去活性，而熊果素則可透過競爭型抑制機制防止酪胺酸酶與受質反應而抑制黑色素合成。雖然這些物質對於美白的確有顯著的功效，卻各有其使用上之限制，例如麴酸非常的不穩定容易被氧化而變色及引起皮膚過敏，且長期過量使用麴酸產品會導致細胞毒性且發生病變；此外，有些美白劑之作用係為直接破壞黑色素細胞，易造成細胞的毒殺性。因此，如何找出可用以抑制黑色素並且具有安全性之有效成分，便成為一重要課題。
植物蓮學名Nelumbo nucifera
Gaertnero，俗稱Lotus，中文亦稱「荷」、「蓮」，是宿根性多年生水生植物。近年有關於植物蓮的研究多著重於蓮心及荷葉等功能性成份之分析、生物活性之探討，然而對於蓮蓬(Lotus seedpod)則極少有科學文獻報導。蓮蓬為蓮的花心，別稱蓮房。蓮蓬為傳統中藥材，味苦性澀溫，本草綱目記載蓮蓬可用來行氣除脹、益補脾胃、止血化瘀、清熱、降肝火及止血，但目前蓮蓬被視為廢棄物大量丟棄。近年來已有文獻證實蓮蓬中富含原花青素(proanthocyanidins)，此成份屬於類黃酮(flavonoid)。進一步研究顯示蓮蓬原花青素具有抗氧化（J Agric Food Chem. 53, 2441-5, 2005； Behav Brain Res. 194, 100-7, 2008）、抗老化、增強記憶力(J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 65, 236-41, 2010；J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 65, 933-40, 2010；Rejuvenation Res. 14, 33-43, 2011）、免疫調節(Food Chem Toxicol. 48, 3374-84, 2010)以及抗癌(Food Chem. 122, 84-91, 2010)之功效。然而，目前未曾有研究探討蓮蓬對於皮膚黑色素的影響為何，亦未有研究探討其機制。中華民國專利案公開第200503761號「含蓮花之化妝品組合物」雖提及植物蓮各部位作為化妝品之添加物具有保濕、美白及增強皮膚彈性的功能，然而此案完全未提到任何製備萃取方法及產生功效的成分為何，僅揭露抑制黑色素，但亦完全無任何具體數據證實其功效，因此無從確切得知蓮蓬是否具有抑制黑色素之功效。
今，發明人即是鑑於上述現有美白產品於實際實施使用時仍具有多處缺失，藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種蓮蓬萃取物及其用於美白之用途，其係指蓮蓬萃取物具有抑制參與黑色素生成路徑相關之第二傳訊者、基因或蛋白質表現並進而抑制酪胺酸酶活性之能力，進而達到抑制黑色素生成之用途；因此，蓮蓬萃取物可進一步運用於製備美白相關之化妝品組合物。
為了達到上述實施目的，本發明一種蓮蓬萃取物用於美白之用途，其係施予蓮蓬萃取物一有效劑量(最佳可例如為0.13%-0.25%)於皮膚，以抑制參與黑色素生成路徑相關之第二傳訊者、基因或蛋白質之表現並進而抑制酪胺酸酶活性，達到抑制黑色素生成之用途；其中蓮蓬萃取物係以下列步驟製得：步驟一：提供一蓮蓬材料；步驟二：利用熱水萃取蓮蓬材料以獲得一溶液；步驟三：過濾溶液以獲得一濾液；以及步驟四：乾燥濾液以製得一蓮蓬萃取物。
本發明另一目的為提供一種用於美白之化妝品組合物，其係包括一蓮蓬萃取物，且蓮蓬萃取物具有抑制黑色素生成之活性；其中蓮蓬萃取物係以下列步驟製得：步驟一：提供一蓮蓬材料；步驟二：利用熱水萃取蓮蓬材料以獲得一溶液；步驟三：過濾溶液以獲得一濾液；以及步驟四：乾燥濾液以製得一蓮蓬萃取物；其中上述組合物為口服組合物。
於本發明之一實施例中，蓮蓬萃取物可例如包括至少80%總黃酮含量。
於本發明之一實施例中，蓮蓬萃取物可例如包括2.8%-6.4%兒茶素、2.7%-4.1%原花青素、2.3%-3.3%香豆酸、及11.3%-13.7%表沒食子兒茶素 。
於本發明之一實施例中，黑色素生成路徑相關之第二傳訊者係環腺苷酸；再者，黑色素生成路徑相關之基因可例如為酪胺酸酶基因或酪胺酸酶相關蛋白-1 (TRP-1)基因。
於本發明之一實施例中，黑色素生成路徑相關之蛋白質係選自酪胺酸酶相關蛋白-1 (TRP-1)、黑素皮質素受體1 (MC1R)、磷酸化蛋白激酶A (p-PKA)、磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(p-CREB)、小眼相關轉錄因子(MITF)，以及磷酸化p38有絲分裂活化蛋白質激酶 (p-p38 MAPK)所構成之群組。
藉此，蓮蓬萃取物可進一步運用於化妝品中，如水劑、乳劑、膏劑、粉劑、或美白淡斑劑，以達到皮膚美白之功效。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明一種蓮蓬萃取物用於美白之用途，其係施予蓮蓬萃取物一有效劑量於皮膚，以抑制參與黑色素生成路徑相關之第二傳訊者(second messenger)、基因或蛋白質之表現並進而抑制酪胺酸酶活性，達到抑制黑色素生成之用途；其中請參考第一圖，蓮蓬萃取物係藉由下列步驟製得：
步驟一(S1)：提供一蓮蓬材料；
步驟二(S2)：利用熱水萃取蓮蓬材料以獲得一溶液；
步驟三(S3)：過濾溶液以獲得一濾液；以及
步驟四(S4)：乾燥濾液以製得一蓮蓬萃取物；其中黑色素生成路徑相關之基因係為酪胺酸酶基因或酪胺酸酶相關蛋白-1 (tyrosinase related protein-1, TRP-1)基因；黑色素生成路徑相關之蛋白質係選自酪胺酸酶相關蛋白-1 (TRP-1)、黑素皮質素受體1 (melanocortin 1 receptor, MC1R)、磷酸化蛋白激酶A(phosphorylated protein kinase A, p-PKA)、磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(phosphorylated cAMP response element-binding protein, p-CREB)、小眼相關轉錄因子(microphthalmia associated transcription factor, MITF)，以及磷酸化p38有絲分裂活化蛋白質激酶 (phosphorylated-p38 mitogen-activated protein kinases, p-p38 MAPK)所構成之群組；根據上述用途，蓮蓬萃取物可進一步作為美白之化妝品組成物。上述蓮蓬萃取物施予一動物個體之較佳有效劑量可例如為0.13%-0.25%，大於0.25%雖可有效抑制黑色素生成，然而需耗費較高的成本且可能造成較高的細胞死亡率；而小於0.13%之蓮蓬萃取物，抑制黑色素生成之效果可能較不佳。另，蓮蓬萃取物用於進行體外試驗之較佳有效劑量可例如為5-25 μg/ml，更佳為10-20 μg/ml；使用大於25 μg/ml之蓮蓬萃取物雖可有效抑制黑色素生成，然而需耗費較高的成本且可能造成較高的細胞死亡率；而使用小於5 μg/ml之蓮蓬萃取物，抑制黑色素生成之效果可能較不佳。
再者，本發明一種用於美白之化妝品組合物，其係包括一蓮蓬萃取物，且蓮蓬萃取物具有抑制黑色素生成之活性；其中蓮蓬萃取物係藉由如上所述步驟一(S1)-步驟四(S4)所製得；此蓮蓬萃取物可例如含有至少80%總黃酮；亦或含有下數多酚成份：2.8%-6.4%兒茶素(catechin)、2.7%-4.1%原花青素(procyanidin)、2.3%-3.3%香豆酸(ρ-coumaric acid)、以及11.3%-13.7% B16F0。
上述「乾燥」步驟可例如但不限定於冷凍乾燥處理、噴霧乾燥處理、蒸發處理或加熱乾燥處理；再者，說明中所述"載劑"係指適用於此處的任何安全及有效材料，其有助於蓮蓬萃取物之被攝入至細胞或組織中。
在此值得注意的是，本案發明人於同日申請有另一申請案『蓮蓬萃取物及其改善動脈粥狀硬化之用途』，在此不詳細說明，特將其所有內容包含於此作為參考。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
實驗一：蓮蓬萃取物（LSE）之製備及成份分析
首先，係由蓮花(Nelumbo nucifera
)植物(台灣鄉間常見大憨蓮)中取出蓮蓬(seedpod)部分(不含蓮子)以製備蓮蓬萃取物(lotus seedpod extract，LSE)，萃取步驟如下：秤取乾燥蓮蓬100 g，加入4 L蒸餾水，用95 ℃熱水加熱至沸騰後燜煮2小時以獲得一溶液，待冷卻後過濾以獲得一濾液，再將濾液進行冷凍乾燥，得其粉末即為蓮蓬粗萃取物，最後進行冷凍乾燥為蓮蓬萃取物(LSE)粉末。後續之實驗進行，均以滅菌水溶解LSE 乾燥粉末作為實驗材料。
(1)總多酚含量測定（Total phenolic content assay）
以沒食子酸(gallic acid, GA)(mg/kg)為標準品，甲醇溶解後分別取不同的量，以甲醇稀釋補足1 ml後，各加0.5 ml之2N Folin-Ciocalteu phenol reagent後搖勻，再加3 ml Na2
CO3
(200 g/L)搖勻，並於室溫靜置15分鐘後，加5或10 ml去離子水後搖勻，以1250×g 離心5 分鐘，在波長725 nm下測吸光值(甲醇歸零)，吸光值為縱座標，濃度為橫座標，得一標準曲線，並計算回歸方程式。樣品泡好濃度，取0.1 ml 樣品加0.9 ml 甲醇，以下步驟同標準品，按標準曲線項下測吸光值，依回歸方程式計算酚的含量。
(2) 總黃酮含量測定（Total flavonoid content assay）
以芸香素(rutin)(mg/ml)為標準品。甲醇溶解後分別取不同的體積，以30%乙醇稀釋並補足體積至10 ml 搖勻。接著各加0.3 ml 之1M NaNO3
後搖勻，室溫靜置6分鐘。再加0.3 ml之10% AlNO3
後搖勻，室溫靜置6分鐘。最後加入4 ml之4% NaOH溶液混合均勻，補0.4 ml去離子水至刻度，放置15分鐘。在波長510 nm測吸光值(乙醇歸零)，吸光值為縱座標，濃度為橫座標，得一標準曲線。並計算回歸方程式。樣品泡好濃度，取0.1 ml 樣品加0.9 ml 甲醇，以下步驟同標準品，按標準曲線項下測吸光值，依回歸方程式計算黃酮的含量。
(3) 總花青素含量測定（Total anthocyanin content assay）
花青素通常微弱酸性，在酸性環境下可以形成穩定的flavylium 陽離子構造。本次實驗採用Fuleki和Francis的酸鹼度差額法，精確定量待測樣品，得體積V，並從中吸取2 ml 試樣，經適當稀釋以濃鹽酸或氫氧化納溶液調pH，使一份pH 為1.0，另一份pH4.5。兩份稀釋液分別以分光光度計測其在520 nm 的吸光值，得A1
(pH 1.0者)與A2
(pH 4.5者)，再以下列公式計算每100克水果中所含總花青素毫克數。總花青素含量(mg 花青素/100 mg 萃取物)：[(A1-A2) x F x MW x V x 100/ε x ω]，其中MW：花青素分子量以delphinidin-3-diglycoside之分子量518.5 計算；V：總抽出液體積(mL)；F：稀釋倍數；ε：花青素之莫耳吸光係數，以delphinidin-3-diglycoside 在含0.1% 鹽酸的甲醇溶液之吸光係數ε 值 301.6 計算；ω：水果總重(g)。
(4) 高效能液相層析儀（HPLC）分析
為使LSE 製備固定標準化，實驗利用HPLC 鑑定其多酚成份。使用17 個多酚標準品：1. Gallic acid (GA)、2. protocatechuic acid (PCA)、3. catechin、4. procyanidin B2、5. epicatechin、6. caffeic acid、7. epigallocatechin gallate (EGCG)、8. ellagic acid (EA)、9. rutin、10. ρ-Coumaric acid、11. Epigallocatechin (EGC)、12. ferulic acid (FA)、13. epicatechin gallate (ECG)、14. gossypin、15. gossypetin、16. quercetin、17. naringenin。分析條件為用C-18 reverse-phase column (5 μm，Hypersil ODS，200 mm X 2.1 mm)，將LSE 過濾(0.45 μm)後，取20 μl 注入HPLC，移動相為A：0.1% Formic acid；B：acetonitrile wit 0.1% formic acid；0-5 min 為90% A、10% B；5-14 min 為70% A、30% B；14-19 min 為60% A、40% B；19-23 min 為40% A、60% B；23-24 min 為10% A、90% B；24-33 min 為100% B，在285 nm和345 nm處監測。
實驗二：蓮蓬萃取物(LSE) 之細胞毒性測試
B16F0 細胞株為老鼠黑色素瘤細胞，源自於台灣食品工業發展研究所(Food industry research and development institute, R.O.C)。將老鼠黑色素瘤細胞(B16F0)培養於含有10%胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS)、1% Penicillin-Streptomycin solution (Hyclone)以及1 % glutamine (Hyclone) 之DMEM培養基(Hyclone)中，根據其生長速度定期更換培養液；此外，將細胞放置於維持5% CO2
、37℃恆溫之細胞培養箱中進行培養。
進行細胞毒性測試實驗時，係將細胞接種於6 well培養皿中，每個培養皿種入2×105
個細胞，輕搖培養皿使細胞分散均勻後，培養於37℃、5% CO2
之恆溫培養箱中，24小時後以倒立式顯微鏡(Nikon Diaphot 300)觀察並記錄細胞型態與變化，待細胞生長至6分滿時，依序投予不同濃度之LSE (5-25 μg/ml)，48小時後將細胞收集於15 ml離心管中，並以 trypsan blue 染色法進行活細胞計數，以求得細胞存活率。計算公式為：細胞存活率（%）=(實驗組細胞數/對照組細胞數) ×100 %。
實驗三：蓮蓬萃取物（LSE）對於黑色素生成及酪胺酸酶活性之影響
首先，分析LSE對於黑色素生成作用之影響，將B16F0細胞投予不同濃度的LSE及EGC後，再加入1 μM α-MSH共同培養48 小時，觀察細胞之黑色素產量及酪胺酸酶活性是否受到影響。
〈黑色素含量試驗〉
將4×105
個細胞於6公分培養皿中培養24小時後，投以不同劑量的LSE (5、10、15和20 μg/ml)或EGC (5、10、15和20 μM)，同時加入1 μM α-MSH，繼續培養48小時後，以trypsin-EDTA (Hyclone)作用將細胞收集於15 mL離心管中，離心去除上清液後，以PBS洗滌細胞pellet兩次，觀察細胞pellet 顏色並拍照，之後再以500 μl之1M NaOH (Sigma)溶解細胞pellet，並於80 ℃水浴中加熱1小時後，以12,000 rpm 高速離心20分鐘，取出上清液以ELISA reader 偵測波長在405 nm 之吸光值。以合成之melanin 作為黑色素標準溶液，濃度分別為0、50、100、150、200、400 μg/ml，作出檢量線再利用線性回歸方式換算黑色素含量；此外再取出10 μl上清液，以BSA為蛋白質標準溶液，進行蛋白質含量分析，以求得每毫克蛋白質中之細胞內黑色素含量。計算公式為：細胞內黑色素含量（%）= (實驗組OD405
/對照組OD405
) ×100 %。
〈酪胺酸酶活性試驗〉
將2×105
個細胞於6 well中培養24 小時後，投以不同劑量(10、15和20 μg/ml)的LSE或15 μM EGC，同時加入1 μM α-MSH，繼續培養48小時後，以trypsin-EDTA作用將細胞收集於15 cm 離心管中，離心去除上清液後，以PBS洗滌細胞pellet 兩次，將細胞pellet 溶解於0.2 ml 含有1 % Triton X-100之PBS溶液中，取出100 μl置於96 孔盤中，再加入100 μl 之2 mM L-DOPA，於37 ℃反應60分鐘後，以ELISA reader偵測波長在490 nm之吸光值。計算公式為：細胞內酪胺酸酶活性（%）=(實驗組OD490
/對照組OD490
) ×100 %。
實驗四：蓮蓬萃取物（LSE）對於酪胺酸酶及酪胺酸酶相關蛋白(TRP)之基因與蛋白質表現
已知酪胺酸酶的含量可作為黑色素生成反應之指標，並且過去研究發現酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2 等酵素調控黑色素生成作用，因此接下來利用西方墨點法(Western blotting)分析酪胺酸酶(Tyrosinase antibody, sc-7833, Santa Cruz)、TRP-1 (TRP-1 antibody, sc-10443, Santa Cruz)、TRP-2 (TRP-2 antibody, sc-25544, Santa Cruz)之蛋白質表現，以及利用Real-time PCR分析酪胺酸酶、TRP-1及TRP-2基因之mRNA表現。
〈B16F0 細胞蛋白質萃取製備〉
利用商業套組(Mitochondria isolation kit for mammalian cells, Thermo) 將B16F0細胞中的細胞核、細胞質及粒線體之蛋白質分離。
〈B16F0 細胞RNA萃取〉
首先以PBS潤洗細胞3次，加入1~2 ml TRIzolR Reagent (Invitrogen)，置於培養箱反應5~10分鐘後，將細胞分裝於微量離心管中，貯存於-80 ℃備用。隔日將離心管取出於冰上回溫，加入200 μl氯仿 (Sigma)，劇烈震盪15 秒，於室溫靜置10 分鐘後離心 (4℃，12,000 g，15 分鐘)後取得RNA液體。接著，置於新的微量離心管中，再加入500 μl的異丙醇(Sigma)上下搖晃15秒，靜置10 分鐘後離心 (4 ℃，12,000 g，15 分鐘)，離心完成後去除上清液，加入1 ml 75%無水酒精，上下搖晃15 秒後再離心 (4 ℃，7,500 g，10分鐘)，離心後去除上清液，置於無菌操作台內風乾至白色pellet 變透明，再加入20~25 μl DEPC水，置於乾式加熱槽60 ℃，加熱5分鐘。最後再取出3 μl mRNA於OD260
下測定濃度。mRNA濃度計算方式為：mRNA 濃度 = OD260
× 40 × 稀釋倍數。
〈Real-time PCR〉
在本實驗中，使用的引子序列(primer sequence)如表一所示。
實驗五：蓮蓬萃取物（LSE）對於MC1R、cAMP、與黑色素生成路徑相關蛋白質表現之影響
調控黑色素生成的路徑相當複雜，相關的文獻也不少，目前為止較被確定的路徑主要有兩條：(1) cAMP / PKA pathway；(2) MAPK (mitogen-activated protein kinase) pathway。
根據文獻指出α-MSH與其接受器MC1R結合後，會活化cAMP/ PKA路徑，促進黑色素的生成，為了釐清LSE抑制黑色素生成作用之分子機轉，本實驗首先利用西方墨點法分析MC1R (MC1-R antibody, sc-19485, Santa Cruz)蛋白之表現，再利用cAMP商業套組分析細胞內 cAMP濃度之變化；接著，利用西方墨點法分析p-PKA (p-PKAα/β/γ cat antibody, sc-32968, Cell Signaling)和PKA (PKAα cat antibody, sc-903, Cell Signaling)蛋白質表現之變化。
研究亦指出，活化cAMP所誘導之黑色素生成路徑的同時，也可能活化MAPK以啟動MITF降解途徑，達到黑色素生成平衡之目的。因此本實驗亦分析LSE 對於MAPK 路徑相關蛋白：p-ERK (p-ERK antibody,sc-7383, Novus)、p-p38 (Phospho-p38 MAPK antibody, #9211, Cell Signaling)、p-JNK2以及p-JNK1表現之影響。
〈細胞內Cyclic AMP 濃度分析〉
本實驗是用Cyclic AMP EIA kit 商業套組(昶安)以偵測cAMP；將具有偵測cAMP 的抗體coating在96 孔盤上，加入的樣品中若含有cAMP 就會與之結合，再加入的cAMP-acetylcholinesterase (AChE) conjugate anti-cAMP 抗體也會與cAMP專一性的結合並固定在微孔上，利用緩衝溶液洗掉多於的樣品後，再加入含有AChE 受質的Ellman’s Reagent 作為呈色劑，並於波長412 nm下測定吸光值，將吸光值帶入標準曲線即可換算出cAMP 濃度。
實驗六：蓮蓬萃取物（LSE）對於p-CREB 和MITF 蛋白質表現以及MITF與DNA結合能力之影響
過去研究指出α-MSH 可以藉由增加CREB 及MITF 等轉錄因子的活化，促進酪胺酸酶的表現，進而增加黑色素的生成，因此本實驗利用西方墨點法分析LSE對於細胞核內p-CREB (p-CREB-1 antibody, sc-101663, Santa Cruz)和MITF (MITF antibody, sc-10999, Santa Cruz)蛋白表現之影響。
再者，本發明人推測LSE抑制黑色素生成是透過干擾MITF 的活性，因此本實驗進一步利用電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 的方法分析轉錄因子MITF與 DNA的結合能力。其中，MITF probe為正股：ACTAC AACAC GTGTA GGCCA 5'-Biotin；反股：TGGCC TACAC GTGTT GTAGT 5'-Biotin 。
實驗七：蓮蓬萃取物（LSE）對於小鼠黑色素生成作用之影響
在動物實驗中，主要係利用UVB誘導黑色素生成。首先，用二次水配製不同濃度之蓮蓬萃取物，包含0.13 %及0.25 % LSE，和0.16% EGC，其中亦可選擇性地加入10%的酒精幫助水份揮發。
雄性C57B/6小鼠係由國家實驗研究院實驗動物中心購得，將購進之C57B/6 小鼠隨機分為5 組，分別為控制組(第一組)、UVB 組(第二組)、UVB+0.13% LSE組(第三組)、UVB+0.25% LSE組(第四組)以及UVB+0.16% EGC組(第五組)，每組5 隻。實驗先將配製好的試劑取出300 μl均勻塗抹於C57B/6 mice的耳朵上，塗抹完等待約30-60分鐘使水分揮發後，將C57B/6 mice放入UVB光照機器中，設定照射劑量為100 mJ/cm2
，照射完即完成一次實驗，每星期照射三次，實驗為期八週後，取其血液以及耳朵皮膚做分析。
〈黑色素切片染色(Fantana-Masson Stain) 〉
實驗係利用商業套組NovaUltraTM
Fontana Masson Stain Kit 來分析皮膚組織中黑色素的生成量，其原理是利用硝酸氨銀可經黑色素作用還原為黑色的金屬銀之特性，藉以計算黑色素的生成量，此套組可以使黑色素呈現棕黑色，細胞核呈現粉紅色，細胞質為淡粉紅色。
實驗八：蓮蓬萃取物（LSE）對於小鼠酪胺酸酶酪胺酸酶相關蛋白(TRP)表現之影響
取動物皮膚組織，利用西方墨點法分析酪胺酸酶及TRP相關蛋白等調控黑色素生成酵素之表現。實驗流程係將老鼠犧牲後取組織1.5 g置於50 ml離心管中並加入RIPA buffer及蛋白酶抑制劑混合液 (100：1)，將離心管置於冰上用均質機研磨。研磨完畢後將組織液分裝於1.5 ml離心管中，再離心 4℃，12,000g，10 分鐘，取出上清液，存放於-80 ℃冰箱。組織蛋白濃度定量方式利用商業套組Pierce BCA Protein Assay kit進行檢測。
結果
結果一：蓮蓬萃取物（LSE）成份分析及鑑定
(1)定性分析
請參閱第二A圖，X軸代表滯留時間（retention time, RT），Y軸代表吸光度(absorption)；以HPLC 分析17 個多酚標準品其滯留時間分別依序出現；另外，將蓮蓬萃取物與標準品兩兩混合，其RT分別在幾個時間點相吻合，從第二B圖 結果可得。總結如表二顯示，LSE 包含兒茶素(catechin)、原花青素(procyanidin B2)、香豆酸(ρ-Coumaric acid)、和表沒食子兒茶素(EGC)四個成份，各別含量約為4.6%、3.4%、2.8%和12.5%。
(2) 定量分析
請參閱表二，利用Folin-Ciocalteu方法測定LSE約莫得到29.6%總多酚含量；另一方面，根據HPLC之結果顯示：類黃酮(catechin + procyanidin B2 + quercetin = 20.5%)這類多酚占LSE成分比例最高。續利用Jia方法分析總黃酮含量之結果顯示LSE 約莫得到85.7%總黃酮(總類黃酮)。而所萃取出LSE 的花青素純度約有6.3%。上述成分鑑定試驗証實LSE 確為富含類黃酮之萃取物，其中以EGC 的比例最高。
根據初步的成份定量實驗結果顯示，蓮蓬萃取物之類黃酮含量85.7%高於荷葉萃取物（56%）(J Agric Food Chem. 57, 5925-32, 2009)，因此更具有成為化學預防物質之潛力。
結果二： 濃度小於25 μg/ml之蓮蓬萃取物(LSE) 對細胞不具毒性
請參閱第三圖，X軸代表不同的處理條件，Y軸代表細胞存活率；由細胞計數的結果顯示，當LSE劑量大於25 μg/ml時，其細胞存活率約73%，才會對細胞造成顯著性的死亡，因此挑選5、10、15及20 μg/ml等對於細胞較無毒殺性的濃度作為後續實驗之劑量。
結果三：蓮蓬萃取物（LSE）可抑制黑色素生成及酪胺酸酶活性
請參閱第四A圖，X軸代表不同的處理條件，Y軸代表黑色素含量；實驗結果顯示，經α-MSH處理後B16F0細胞內之黑色素含量與控制組相較，提升了約159%；而給予LSE會抑制黑色素的產生，並且具有劑量依存效應(dose-dependent)，隨著劑量越高(5、10、15和20 μg/ml)，與誘導組(α-MSH)相較分別降至98.9%、87.3%、69.5%及62.8%。
EGC為LSE主要的多酚成分。由過去的文獻指出，純物質EGC具有抑制黑色素生成之功能。Kazuomi Sato等人以不同劑量 (0-20 μM)的EGC對於黑色素瘤細胞進行細胞活性測試，其結果顯示在加入純物質五天後，最高劑量20 μM 明顯的對細胞有毒殺作用。因此，本實驗各別挑選了5、10、15以及20 μM 進行試驗，檢驗在48小時候，EGC降低B16F0細胞株黑色素合成之效果。結果請參閱第四B圖，EGC在20 μM 時除了可抑制細胞生長外，且可能造成細胞內黑色素生成量增加；在15 μM 時與誘導組(α-MSH)相較降低了約90%，然其抑制效果不如LSE。
再者請參閱第四C圖，X軸代表不同的處理條件，Y軸代表酪胺酸酶活性；LSE於酪胺酸酶活性測試結果顯示，經α-MSH處理後B16F0細胞內之酪胺酸酶活性增加至控制組的200%；而給予LSE會抑制酪胺酸酶活性，並且呈現劑量依存效應，LSE (10、15 和20 μg/ml)之酪胺酸酶活性與誘導組(α-MSH)相較分別降低至71.3%、62.6% 和43.8%；而15 μM EGC之酪胺酸酶活性降低至誘導組的79.2%，與同劑量的LSE相較之下，EGC抑制酪胺酸酶活性之能力不如LSE。 【00100】結果四：蓮蓬萃取物（LSE）可調節酪胺酸酶及酪胺酸酶相關蛋白(TRP)之基因與蛋白質表現
【00101】 請參閱第五A圖，上圖為蛋白質表現量之電泳示意圖；下圖為量化分析圖： X軸代表不同的處理條件，Y軸代表酪胺酸酶(tyrosinase)、酪胺酸酶相關蛋白-1 (TRP-1)、酪胺酸酶相關蛋白-2 (TRP-2)蛋白質之表現。結果顯示，經α-MSH 處理後，酪胺酸酶及TRP-1 蛋白的表現分別增加至控制組的2倍及1.4 倍；給予LSE會抑制酪胺酸酶及TRP-1蛋白之表現，LSE (10、15 和20 μg/ml)之酪胺酸酶蛋白表現降低至誘導組(α-MSH)的0.75倍、0.58倍與0.44倍；而TRP-1之表現降低至誘導組的0.9倍、0.82倍與0.81倍；而15 μM EGC的酪胺酸酶降低至誘導組的0.73倍，對於TRP-1蛋白之表現沒有顯著抑制作用。另，α-MSH、LSE與EGC對於TRP-2蛋白之表現並無顯著的影響。 【00102】 請再參閱第五B圖，X軸代表不同的處理條件，Y軸代表酪胺酸酶(tyrosinase)、酪胺酸酶相關蛋白-1 (TRP-1)、酪胺酸酶相關蛋白-2 (TRP-2)基因之mRNA表現；結果顯示，α-MSH顯著誘發酪胺酸酶及TRP-1基因之mRNA表現，分別增加至控制組的1.75 倍及1.2倍；而給予LSE會抑制酪胺酸酶及TRP-1之 mRNA 表現，LSE (10、15 和20 μg/ml)之酪胺酸酶mRNA表現與誘導組(α-MSH)相較降低了0.85倍、0.76倍、0.63倍； TRP-1 mRNA之表現與誘導組相較分別降低了0.57倍、0.54倍與0.41倍；而15 μM EGC組的酪胺酸酶及TRP-1之 mRNA表現分別降低至誘導組的0.91倍和0.68倍。然而α-MSH、LSE與EGC對於TRP-2 mRNA之表現，沒有顯著的影響。 【00103】結果五：蓮蓬萃取物（LSE）可調節MC1R、cAMP、與黑色素生成路徑相關蛋白質之表現
【00104】 首先，觀察LSE對於MC1R表現之影響，請參閱第六A圖，上圖為蛋白質表現量之電泳示意圖；下圖為量化分析圖：X軸代表不同的處理條件，Y軸代表MC1R蛋白質表現。結果顯示，α-MSH會誘發MC1R蛋白表現，增加至控制組的1.36倍；而給予LSE會抑制MC1R蛋白表現，LSE (10、15和20 μg/ml)分別降低至誘導組(α-MSH)的0.79倍、0.7倍及0.63倍；而15 μM 的EGC並無顯著降低MC1R蛋白的表現。 【00105】 請參閱第六B圖，X軸代表不同的處理條件，Y軸代表cAMP表現；利用cAMP商業套組分析細胞內cAMP濃度之結果顯示，α-MSH顯著提高細胞內cAMP濃度，與控制組相較增加至172%；而給予LSE會降低細胞內cAMP濃度，LSE (10、15和20 μg/ml)之cAMP 濃度分別降低至誘導組(α-MSH)的0.77倍、0.63倍與0.58倍；而15 μM EGC組並無顯著降低細胞內cAMP濃度。 【00106】 請參閱第六C圖，上圖為蛋白質表現量之電泳示意圖；下圖為量化分析圖：X軸代表不同的處理條件，Y軸代表p-PKA之蛋白質表現。分析p-PKA及PKA蛋白表現變化之結果顯示，α-MSH 誘發p-PKA 蛋白之表現，增加至控制組的1.34倍，而給予LSE會抑制p-PKA 蛋白之表現，LSE (20 μg/ml) 之p-PKA 蛋白表現可降低至誘導組(α-MSH)的0.84倍，而 15 μM EGC之p-PKA蛋白表現降低至誘導組的0.84倍。由此可知LSE係藉由抑制MC1R蛋白表現，減少c-AMP濃度，進而降低細胞質內PKA活化以達到減低黑色素生成之效果。 【00107】 接著，請再參閱第七圖，左圖為蛋白質表現量之電泳示意圖；右圖為量化分析圖：X軸代表不同的處理條件，Y軸代表p-ERK、p-p38、p-JNK1、p-JNK2之蛋白質表現；分析LSE對於MAPK 路徑相關蛋白表現影響之結果顯示，LSE對於p38 MAPK 影響最明顯，α-MSH 處理時會增加p-p38 MAPK之表現，增加至控制組的1.25 倍，而給予LSE會抑制p-p38 MAPK之表現，尤其是LSE 濃度在15 μg/ml時抑制效果最為顯著，降低至誘導組(α-MSH)的0.84倍。 【00108】結果六：蓮蓬萃取物（LSE）可抑制p-CREB 和MITF 蛋白質表現以及抑制MITF與DNA結合能力
【00109】 請參閱第八圖，上圖為蛋白質表現量之電泳示意圖；下圖為量化分析圖：X軸代表不同的處理條件，Y軸代表MITF、p-CREB之蛋白質表現；分析LSE對於細胞核內MITF和p-CREB蛋白表現影響之結果顯示，α-MSH顯著增加MITF和p-CREB蛋白之表現，與控制組相比分別增加至1.77倍及1.95倍；而給予LSE會抑制MITF和p-CREB之蛋白表現，LSE (15和20 μg/ml)之MITF表現分別降低至誘導組(α-MSH)的0.7倍和0.9倍；而15 μM EGC對於MITF表現則無顯著的影響； LSE (10、15和20 μg/ml)之p-CREB表現則分別降低至誘導組的0.64倍、0.63倍及0.52倍，而15 μM EGC則降低至誘導組的0.64倍。 【00110】 請再參閱第九圖，上圖為分析蛋白質(MITF)與核酸(DNA)結合能力之電泳示意圖，MITF與DNA結合會形成MITF complex，而未與MITF結合的DNA為free probe；下圖為量化分析圖：X軸代表不同的處理條件，Y軸代表(MITF complex)相對密度。由實驗結果顯示，經過α-MSH 處理後MITF 與DNA 結合能力增加至控制組的2.3 倍；而給予LSE 會抑制MITF 與DNA 的結合能力，LSE 10、15和20 μg/ml之MITF與DNA的結合能力降低至誘導組(α-MSH)的 0.73倍、0.39倍及0.31倍，而15 μM EGC 之MITF 與DNA 的結合能力僅降低至誘導組的0.62倍。 【00111】結果七：蓮蓬萃取物（LSE）可抑制小鼠黑色素生成作用
【00112】 蓮蓬萃取物對於影響小鼠黑色素生成作用之組織染色示意圖如第十A圖所示，UVB照射後會增加黑色素生成(圖中黑色點增加)，處理LSE或EGC會抑制黑色素生成量。進一步將染色結果量化，如第十B圖所示，X軸代表不同的處理條件，Y軸代表黑色素含量；實驗結果顯示，UVB 照射誘發小鼠皮膚黑色素生成，與控制組相比顯著增加至1.94倍，而LSE會降低黑色素的產量，LSE 0.13% 和0.25% 之黑色素分別降低至UVB組的0.69倍及0.58倍，而EGC 0.16% 組黑色素的生成量降低至UVB組的0.69倍。 【00113】結果八：蓮蓬萃取物（LSE）可抑制小鼠酪胺酸酶及酪胺酸酶相關蛋白(TRP)表現之影響
【00114】 請參閱第十一圖，X軸代表不同的處理條件，Y軸代表酪胺酸酶(tyrosinase)、酪胺酸酶相關蛋白-1 (TRP-1)、酪胺酸酶相關蛋白-2 (TRP-2)蛋白質之表現。結果顯示，UVB 照射誘發小鼠酪胺酸酶及TRP-1蛋白表現，分別增加至控制組的2.55倍和1.49倍，而給予LSE 會抑制酪胺酸酶及TRP-1蛋白之表現，LSE 0.13% 和0.25%之酪胺酸酶表現分別降低至UVB組的0.6倍和0.59倍，EGC 0.16%對於酪胺酸酶活性無顯著的影響；而LSE 0.13%、0.25%及EGC 0.16%之TRP-1之表現分別降低至UVB組的0.9倍、0.67倍及0.54倍；另，LSE與EGC對於TRP-2蛋白之表現與細胞實驗結果相同，並無顯著的影響。由上述結果可知，預先給予LSE有助於減少之後照射UVB所導致的黑色素之生成，且其是透過抑制酪胺酸酶與TRP-1蛋白的表現。 【00115】 綜上所述，本發明證實具有高安全性(低細胞毒性)之蓮蓬萃取物(LSE)具有抑制酪胺酸酶、調控黑色素生成相關基因及蛋白表現，以及抑制黑色素之功效。根據本發明之用途，蓮蓬萃取物可應用於作為美白淡斑之化妝材料組成物或保養品，可例如為水劑、乳劑、膏劑、粉劑、美白淡斑劑、防曬油或濃縮精華液之成分或添加於面膜中使用，提供使用者以一適當量施予皮膚，進而達到保護皮膚免於紫外線傷害、美白之功效。 【00116】 由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點: 【00117】 1. 本發明首次利用細胞及動物實驗，證實蓮蓬萃取物（LSE）可以減少曝照UVB之皮膚黑色素的形成，並且抑制酪胺酸酶、TRP-1等調控黑色素合成之酵素的表現，因此LSE具有應用於美容醫學、化妝品等行業之潛力。 【00118】 2. 本發明蓮蓬萃取物(LSE)係蓮蓬直接經由水煮萃取而得，保留天然植物本身最原始之生物活性，無有機溶劑殘存之虞，亦不具人工合成化學物質對人體衍生氧化性傷害之作用。 【00119】 3.本發明所使用蓮蓬萃取物(LSE)，證實常被人丟棄不用的「蓮蓬」部分亦具有其減緩黑色素生成之功效；據此，不僅增加蓮花植物的使用效能，亦提供消費者在美白淡斑相關化妝品上更多的選擇。 【00120】 另，與前案200503761相較下，本發明不僅具有HPLC分析蓮蓬萃取物之組成份及比例數據，亦利用細胞實驗及動物實驗等數據，確切證實本發明蓮蓬萃取物具有美白之功效及其機制為何；故本發明已進一步證明前案未揭露之技術特徵而具進步性。 【00121】 綜上所述，本發明之蓮蓬萃取物及其用於美白之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。 【00122】 惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
【00123】
(S1)‧‧‧步驟一
(S2)‧‧‧步驟二
【00124】
(S3)‧‧‧步驟三
(S4)‧‧‧步驟四
(S1)‧‧‧步驟一
(S2)‧‧‧步驟二
【00124】
(S3)‧‧‧步驟三
(S4)‧‧‧步驟四
第一圖：本發明較佳實施例之步驟流程圖
第二A圖：十七種多酚標準品之HPLC圖譜
第二B圖：蓮蓬萃取物之HPLC圖譜
第三圖：蓮蓬萃取物之細胞毒性測試結果
第四A圖：蓮蓬萃取物對於黑色素生成之影響
第四B圖：表沒食子兒茶素(EGC)對於黑色素生成之影響
第四C圖：蓮蓬萃取物對於酪胺酸酶活性之影響
第五A圖：蓮蓬萃取物對於酪胺酸酶及酪胺酸酶相關蛋白(TRP)表現之影響
第五B圖：蓮蓬萃取物對於酪胺酸酶及酪胺酸酶相關蛋白(TRP)基因表現之影響
第六A圖：蓮蓬萃取物對於黑素皮質素受體1 (MC1R)表現之影響
第六B圖：蓮蓬萃取物對於環腺苷酸(cAMP)表現之影響
第六C圖：蓮蓬萃取物對於其一黑色素生成路徑相關蛋白質表現之影響
第七圖：蓮蓬萃取物對於另一黑色素生成路徑相關蛋白質p-ERK、p-p38、p-JNK1、p-JNK2表現之影響
第八圖：蓮蓬萃取物對於細胞核內p-CREB 和MITF 蛋白質表現之影響
第九圖：蓮蓬萃取物對於MITF與DNA結合能力之影響
第十A圖：蓮蓬萃取物對於影響小鼠皮膚黑色素生成作用之組織染色示意圖
第十B圖：蓮蓬萃取物對於影響小鼠皮膚黑色素生成作用之分析圖
第十一圖：蓮蓬萃取物對於小鼠酪胺酸酶及酪胺酸酶相關蛋白(TRP)表現之影響
Claims (10)
- 一種蓮蓬萃取物用於美白之用途，其係施予蓮蓬萃取物一有效劑量於皮膚，以抑制參與黑色素生成路徑相關之第二傳訊者(second messenger)、基因或蛋白質之表現並進而抑制酪胺酸酶活性，達到抑制黑色素生成之用途；其中該蓮蓬萃取物係以下列步驟製得： 步驟一：提供一蓮蓬材料； 步驟二：利用熱水萃取該蓮蓬材料以獲得一溶液； 步驟三：過濾該溶液以獲得一濾液；以及 步驟四：乾燥該濾液以製得一蓮蓬萃取物。
- 如申請專利範圍第１項所述之蓮蓬萃取物用於美白之用途，其中該有效劑量係0.13%-0.25%。
- 如申請專利範圍第１項所述之蓮蓬萃取物用於美白之用途，其中該黑色素生成路徑相關之第二傳訊者係環腺苷酸(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)。
- 如申請專利範圍第１項所述之蓮蓬萃取物用於美白之用途，其中該黑色素生成路徑相關之基因係為酪胺酸酶基因或酪胺酸酶相關蛋白-1 (tyrosinase related protein-1, TRP-1)基因。
- 如申請專利範圍第１項所述之蓮蓬萃取物用於美白之用途，其中該黑色素生成路徑相關之蛋白質係選自酪胺酸酶相關蛋白-1 (TRP-1)、黑素皮質素受體1 (melanocortin 1 receptor, MC1R)、磷酸化蛋白激酶A(phosphorylated protein kinase A, p-PKA)、磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(phosphorylated cAMP response element-binding protein, p-CREB)、小眼相關轉錄因子 (microphthalmia associated transcription factor, MITF)，以及磷酸化p38有絲分裂活化蛋白質激酶 (phosphorylated-p38 mitogen-activated protein kinases, p-p38 MAPK)所構成之群組。
- 如申請專利範圍第１項所述之蓮蓬萃取物用於美白之用途，其中該蓮蓬萃取物係進一步作為美白之化妝品組成物。
- 一種用於美白之化妝品組合物，其係包括一蓮蓬萃取物，且該蓮蓬萃取物具有抑制黑色素生成之活性；其中蓮蓬萃取物係以下列步驟製得： 步驟一：提供一蓮蓬材料； 步驟二：利用熱水萃取該蓮蓬材料以獲得一溶液； 步驟三：過濾該溶液以獲得一濾液；以及 步驟四：乾燥該濾液以製得一蓮蓬萃取物。
- 如申請專利範圍第7項所述之用於美白之化妝品組合物，其中該蓮蓬萃取物係包括至少80%總黃酮。
- 如申請專利範圍第7項所述之用於美白之化妝品組合物，其中該蓮蓬萃取物係包括2.8%-6.4%兒茶素(catechin)、2.7%-4.1%原花青素(procyanidin)、2.3%-3.3%香豆酸(ρ-coumaric acid)、及11.3%-13.7%表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC) 。
- 如申請專利範圍第7項所述之用於美白之化妝品組合物，其中化妝品組合物為水劑、乳劑、膏劑、粉劑、美白劑或淡斑劑之化妝品。
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