TW201542221A - 血糖代謝改善用組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明以提供一種改善及/或提升骨骼肌之糖代謝機能之血糖代謝改善用組成物為目的。藉由本發明,可提供一種含有柿葉萃取物之血糖代謝改善用組成物,其是經由將柿葉以40~60%乙醇-水混合液萃取之步驟而獲得者。
Description
本發明有關於血糖代謝改善用組成物。更詳細的說,本發明有關於一種血糖代謝改善用組成物,其含有柿葉萃取物,且該柿葉萃取物是透過將柿葉藉由以特定比例混合乙醇與水之溶液來萃取之步驟而獲得。
由於高熱量食物或飲料之攝取、日常運動量降低或肌力降低所伴隨之基礎代謝量下降等要因,過著攝取生命活動所必須以上過剩能量之生活的人是增加的,隨之而來,不僅在中高年層,在青年層中亦會病發糖尿病,或者顯示出胰島素抗性的人正在增加。又,亦已知脂肪細胞的老化會引起胰島素抗性,則在基礎代謝量或運動量下降的高齡者中,糖尿病發病的風險亦高。
如此,隨著日常生活的變化或者朝向高齡化社會的變遷,糖尿病患者有年年爆發性增加的傾向,可以認為是糖尿病高危險群之具有血糖代謝異常的人之存在甚至是糖尿病患者的數倍以上。實際上,在國民健康、營養調查或糖尿病實況調查中,亦明確的有同樣的傾向,可以說我
國(日本)糖尿病患者的增加是嚴重的。在這個狀況下,致力使糖尿病從根本上無法治癒之疾病,到「使糖尿病患者之病理狀態不惡化」或「使對顯示有胰島素抗性的人不病發糖尿病」是重要的。
如此致力解決的方法有「使血糖值推移至正常範圍,並進行糖尿病之發病預防或治療之方法」。具體而言,存在有飲食療法、運動療及藥物療法,配合對象者的情勢或狀態,單獨之該等療法或組合有該等療法之方法實際上正在進行。然而,限制攝取熱量的飲食療法,及固定時間以上之實行為必要的運動療法,無法持續實行的情況居多,特別是在老年者上,不僅基礎代謝量是大幅降低,隨著運動能力大幅降低,運動量會大幅減少,因此,難以僅以上述療法來應對之情況正在增加。另一方面,從防止醫療費増加的觀點來看,藥物療法亦不可稱得上是滿意的應對方法,又,就預防糖尿病的病發而言,是難以採用的方法。
於此,著眼在對血糖代謝有大大影響之骨骼肌的糖代謝,藉由併用或單獨使用以往處置之治療法或預防法,嘗試著開發可使糖尿病病發預防效果或糖尿病病理狀態改善效果顯著增強的手段。
作為使血糖值降低的生理機能之一,存在有「將血中的糖從血管(血液)吸收至骨骼肌並代謝之機能」。且已知該機能有一機制為「骨骼肌的收縮會促進細胞內AMP激酶的磷酸化(活性化),結果便是,細胞質內的葡萄糖運送蛋白4會藉由移動至細胞膜中,將血中的糖吸收至骨骼肌之細
胞內」之作用。進一步已知,如此往骨骼肌細胞內之糖的吸收,骨骼肌收縮之並非必需要素,而是藉由將AMP激酶活性化而產生。因此,即便在無法藉由運動使骨骼肌收縮的狀況中,仍有實現表現出與已運動之場合相同的將血中之糖吸收至骨骼肌之機能的可能性。近年來,已提出好幾個方案著眼在「利用經口攝取使AMP激酶活性化之物質,嘗試使血中之糖濃度降低」這點(專利文獻1及2)。
進一步,在將糖從血管(血液)吸收至骨骼肌細胞內之別的機制方面,亦已知「血中之胰島素會藉由骨骼肌間質結合至在細胞膜表面之胰島素受體,且藉由Akt磷酸化所致之活性化等的訊息傳遞分子之活性化,其所產生之結果便是細胞質內之葡萄糖運送蛋白4會移動到細胞膜中,血中的糖會被吸收至骨骼肌細胞內」之作用。在此機制中,將胰島素從分布於骨骼肌之毛細血管到轉移至骨骼肌間質之途徑,亦擔付了重要的角色。已知,藉由透過骨骼肌毛細血管之e-NOS活性化等的擴張機能亢進或血管新生而致生之毛細血管密度增加,會引起毛細血管之表面積與血流量之增加,因此使得朝向細胞之胰島素轉移會亢進,而可改善糖代謝(非專利文獻1)。
透過AMP激酶之前者機制及透過胰島素之後者機制是互相獨立之作用,且兩者都可期待表現出高糖之吸收效果。在健康的人,此2機制會一起正常表現,但在糖尿病患者或有胰島素抗性的人中,後者機制會降低或失去,因此藉由使此2機制一起表現,或使該等機能亢進,會有可
實現更接近健康人狀態之可能性。然而,使此2機制一起表現之方法尚屬未知,具體解決方法之提案是受到期望的。
專利文獻1:日本特開2010-37323號公報
專利文獻2:日本特開2011-37732號公報
非專利文獻1:Cell Metabolism, 13, 294-307,2011
本發明之目的在於提供一種可使骨骼肌之糖代謝機能改善及/或提升之血糖代謝改善用組成物。
本發明者有鑒於該情形而一再精心探討,結果發現,經由將柿葉利用以特定比例混合乙醇與水之溶液來萃取之步驟而獲得之柿葉萃取物,可使從透過AMP激酶之機制及透過胰島素之機制此2機制之骨骼肌的糖代謝機能大大改善及/或提升,進一步再重複研究進而完成本發明。
亦即,本發明,就代表性而言,包含以下項次所記載之主題。
項1.
一種血糖代謝改善用組成物,含有柿葉萃取物,且該柿葉萃取物是經由將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取
之步驟而獲得。
項2.
如項1之血糖代謝改善用組成物,含有柿葉萃取物,且該柿葉萃取物是經由下述步驟而獲得:將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟,及使由前述步驟所獲得之萃取物吸附在填充了鍵結十八矽烷基之矽凝膠之管柱,並藉由5~10%乙腈-水混合液來溶析之步驟。
項3.
如項1之血糖代謝改善用組成物,含有柿葉萃取物,且該柿葉萃取物是經由下述步驟而獲得:將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟,及使由前述步驟所獲得之萃取物吸附在填充了修飾葡聚糖之管柱,並藉由70~100%甲醇-水混合液或60~80%丙酮-水混合液來溶析之步驟。
項4.
如上述項1~3之血糖代謝改善用組成物,其為經口組成物。
項A-1
一種使血糖代謝改善及/或提升之方法,包含對對象投予柿葉萃取物之步驟,該柿葉萃取物是經由將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟而獲得。
項A-2.
如上述項A-1之方法,包含對對象投予柿葉萃取物之步
驟,且該柿葉萃取物是經由下述步驟而獲得:將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟,及使由前述步驟所獲得之萃取物吸附在填充了鍵結十八矽烷基之矽凝膠之管柱,並藉由5~10%乙腈-水混合液來溶析之步驟。
項A-3.
如上述項A-1之方法,包含對對象投予柿葉萃取物之步驟,且該柿葉萃取物是經由下述步驟而獲得:將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟,及使由前述步驟所獲得之萃取物吸附在填充了修飾葡聚糖之管柱,並藉由70~100%甲醇-水混合液或60~80%丙酮-水混合液來溶析之步驟。
項B-1.
一種選自於由糖尿病、高血糖、耐糖能異常、胰島素抗性、動脈硬化、肥胖、體脂肪累積、脂質代謝異常、生活習慣病及脂肪肝所組成群組之至少1種之預防、改善及/或治療方法,包含對對象投予柿葉萃取物之步驟,且該柿葉萃取物是經由將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟而獲得。
項B-2.
如上述項B-1之方法,包含對對象投予柿葉萃取物之步驟,且該柿葉萃取物是經由下述步驟而獲得:將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟,及使由前述步驟所獲得之萃取物吸附在填充了鍵結十八
矽烷基之矽凝膠之管柱,並藉由5~10%乙腈-水混合液來溶析之步驟。
項B-3.
如上述項B-1之方法,包含對對象投予柿葉萃取物之步驟,且該柿葉萃取物是經由下述步驟而獲得:將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟,及使由前述步驟所獲得之萃取物吸附在填充了修飾葡聚糖之管柱,並藉由70~100%甲醇-水混合液或60~80%丙酮-水混合液來溶析之步驟。
若以本發明,因可將AMP激酶活性化,不僅可使因運動之血糖值降低作增強,即便不運動,亦可獲得與已運動時同等之血糖值降低效果。進一步,若以本發明,因可提高骨骼肌毛細血管密度,因此亦可獲得改善胰島素抗性之效果。
如上所述,本發明血糖代謝改善用組成物可使源自透過AMP激酶之機制及透過胰島素之機制此二機制之骨骼肌糖代謝機能改善及/或提升。因此,不僅在糖尿病患者或準糖尿病患者,在高齡者或臥床不起之人等無法確保充分運動量的人之中,可預防血糖值下降、糖尿病的病發,且可改善糖尿病的病理狀態。
進一步,本發明血糖代謝改善用組成物藉由在運動前、中、後攝取,做為提高運動效果之運動效果促進劑是有用的。又,本發明血糖代謝改善用組成物因可將AMP
激酶活性化,因此可期待抗老化效果。
圖1是顯示試驗例1-1結果之圖表。具體而言,圖1是顯示,使用了於製造例1中獲得之各柿葉萃取物之小鼠骨骼肌管細胞株的磷酸化AMPK(pAMPK)對總AMPK(tAMPK)表現比的測定結果。
圖2是顯示試驗例1-2結果之圖表。具體而言,圖2是顯示,使用了於製造例1中獲得之柿葉萃取物A及C的小鼠骨骼肌管細胞株之糖吸收促進活性的測定結果。
圖3是顯示試驗例2結果之圖表。具體而言,圖3是顯示,使用了於製造例2中獲得之各分餾物的小鼠骨骼肌管細胞株之糖吸收促進活性的測定結果。
圖4是顯示試驗例3結果之圖表。具體而言,圖4是顯示,使用了萃取物C及柿葉所包含之各種化合物的小鼠骨骼肌管細胞株之糖吸收促進活性的測定結果。
圖5是顯示試驗例4結果之圖表。具體而言,圖5是顯示,使用了於製造例3中獲得之或各分餾物的小鼠骨骼肌管細胞株之糖吸收促進活性的測定結果。
圖6是顯示參考試驗例1結果之圖表。具體而言,圖6是顯示,使用了參考製造例1中獲得之各萃取物的小鼠骨骼肌管細胞株之糖吸收促進活性的測定結果。
以下,針對本發明做詳細說明。
本發明血糖代謝改善用組成物含有柿葉萃取物,該柿葉萃取物是經由將柿葉藉由以特定比例混合乙醇與水之溶液來萃取之步驟而獲得。
供於萃取之柿葉並無特別限定,例如可使用柿樹科柿樹屬之落葉樹的葉子。柿葉可使用落葉前或落葉後之任一種葉子,然宜使用落葉前的葉子。又,供於萃取之柿葉亦可為依循常法施以乾燥等的前處理者。在柿葉之前處理方法方面,可舉例如,將採取自樹木之柿葉水洗,並依需要切斷成適當之大小(例如3mm寬左右),再以蒸籠蒸之後進行乾燥之方法;或將採取自樹木之柿葉水洗,並依需要切斷成適當之大小後進行乾燥之方法等。
萃取柿葉所使用之溶液,是以特定比例混合了乙醇與水之溶液(以下記載為「乙醇-水混合液」。),該乙醇-水混合液中乙醇的含量為40~60%(wt/wt)左右,且以45~55%(wt/wt)左右為宜、50%(wt/wt)左右為佳。另外,以下將乙醇含量為x%(wt/wt)之乙醇-水混合液記載為「x%乙醇-水混合液」。
柿葉之萃取方法,若為使用上述乙醇-水混合液之方法,則可利用習知的方法來進行。例如,宜為於已乾燥之柿葉,使用柿葉之約20倍量的50%乙醇-水混合液,在使用有加熱包之沸騰回流條件下萃取1小時之方法。
進一步,柿葉萃取物亦可為在經由以上述乙醇-水混合液來萃取之步驟後,再將以該步驟所獲得之萃取物經由濃縮之步驟而獲得者。濃縮方法並無特別限定,可適
宜選擇習知的方法來進行。可舉例如,經由以上述乙醇-水混合液來萃取之步驟後,利用常法從獲得之萃取液去除固態成分,並將以過濾處理將獲得之濾液使用蒸發器去除乙醇分,之後,進行凍結乾燥處理之方法。
又,柿葉萃取物亦可為在經由以上述乙醇-水混合液來萃取之步驟後,依需要,對以該步驟獲得之萃取物進一步經由施以萃取處理之步驟而獲得者。在進一步之萃取處理的具體方法方面,可舉例如,在經由以上述乙醇-水混合液來萃取之步驟後,使獲得之萃取物溶解在約9倍量之純水,並進行超音波處理後,進行約10000G的離心處理,回收上澄液之方法。更進一步,在經由以乙醇-水混合液來萃取之步驟後,亦可將上述獲得之萃取物經由濃縮之步驟而獲得之萃取物,進一步供於萃取處理。
進一步,柿葉萃取物亦可為在經過以上述乙醇-水混合液來萃取之步驟後,再經由使用管柱來分餾之步驟而獲得者。
在分餾所使用之管柱方面,可使用習知之管柱,然宜為填充了鍵結十八矽烷基之矽凝膠之管柱(例如,Purif-Pack Size200 ODS管柱)填充了修飾葡聚糖之管柱(例如,Sephadex LH-20管柱)等。
分餾所使用之溶析液,可依照使用之管柱來適宜選擇使用,然在使用填充了鍵結十八矽烷基之矽凝膠之管柱時,宜使用混和了乙腈與水之溶液(以下記載為「乙腈-水混合液」。);在使用填充有修飾葡聚糖之管柱時,宜使
用混和了甲醇與水之溶液(以下記載為「甲醇-水混合液」。),或混和了丙酮與水之溶液(以下記載為「丙酮-水混合液」。)。此外,以下分別記載乙腈含量為x%之乙腈-水混合液為「x%乙腈-水混合液」、甲醇含量為x%之甲醇-水混合液為「x%甲醇-水混合液」,及丙酮含量為x%之丙酮-水混合液為「x%丙酮-水混合液」。
又,分餾之條件(例如,流量等)並無特別限制,依所使用之管柱或溶析液來適宜設定即可。
在適宜之分餾方法上,在使用填充了鍵結十八矽烷基之矽凝膠的管柱來進行分餾時,可舉,使經由以上述乙醇-水混合液來萃取之步驟所獲得之萃取物,吸附在填充了鍵結十八矽烷基之矽凝膠的管柱,邊使乙腈-水混合液中的乙腈含量從0%分別上昇至1~10%左右,邊利用溶析之步進梯度(Step-wise gradient)來分餾之方法。該方法之中,利用1~10%乙腈-水混合液析出之分餾物,因為改善及/或提昇糖代謝機能之效果高而為宜;利用5~10%乙腈-水混合液析出之分餾物,因為改善及/或提昇糖代謝機能之效果特別高而為佳。特別是,經由利用依次以0%乙腈-水混合液(即水)、5%乙腈-水混合液及10%乙腈-水混合液來溶析之步驟而獲得之利用5%乙腈-水混合液來析出之分餾物及利用10%乙腈-水混合液來析出之分餾物,因為改善及/或提昇糖代謝機能之效果非常高而為佳,其中,利用5%乙腈-水混合液來析出之分餾物,因為改善及/或提昇糖代謝機能之效果極高而特別為佳。
又,使用填充了修飾葡聚糖之管柱來進行分餾時,可舉,使經由利用上述乙醇-水混合液來萃取之步驟而獲得之萃取物,吸附在填充了修飾葡聚糖之管柱,並以步進梯度,邊使甲醇-水混合液中之甲醇含量從0%每次上昇10~20%左右邊溶析來分餾之方法。進一步,亦宜在結束以100%甲醇-水混合液(亦即,甲醇)之溶析後,利用60~80%左右之丙酮-水混合液來溶析之方法。在該方法中,利用40~100%左右之甲醇-水混合液及60~80%左右之丙酮-水混合液來析出之分餾物,因改善及/或提昇糖代謝機能之效果高而為宜;利用80~100%左右之甲醇-水混合液及70%左右之丙酮-水混合液來析出之分餾物,因改善及/或提昇糖代謝機能之效果特別高而為佳。特別是,經由利用依次以0%甲醇-水混合液(自亦即,水)、20%甲醇-水混合液、40%甲醇-水混合液、60%甲醇-水混合液、80%甲醇-水混合液、100%甲醇-水混合液(亦即,甲醇)及70%丙酮-水混合液來溶析之步驟而獲得之利用100%甲醇-水混合液來析出之分餾物及利用70%丙酮-水混合液來析出之分餾物,因改善及/或提昇糖代謝機能之效果極高而特別為佳。
本發明血糖代謝改善用組成物,可為上述之柿葉萃取物本身,亦可為除了該柿葉萃取物之外,含有其他成分。就其他成分而言,可舉諸如藥學上或食品衛生學上可容許之載體等。
又,本發明血糖代謝改善用組成物,可利用做為經口組成物。就經口組成物而言,可做成醫藥品、準醫藥
品,另外亦可做成諸如以預防、改善糖尿病、高血糖、耐糖能異常、胰島素抗性、動脈硬化、肥胖、體脂肪累積、脂質代謝異常、生活習慣病、脂肪肝等,或以糖代謝亢進、抗老化的生理機能為概念之機能性飲食品、疾病者用食品、特定保健用食品、營養機能食品、營養補助食品、運動療法用食品、痩身用食品等。
本發明血糖代謝改善用組成物之形態並無特別限定,利用做為經口組成物時,可做成諸如硬膠囊、軟膠囊、補充劑、咀嚼錠、飲料、粉末飲料、顆粒、薄膜等形態。又,使用做為飲食品時,亦可做成諸如茶系飲料,運動飲料,美容飲料,果汁飲料,碳酸飲料,酒精飲料,清涼飲料,果凍飲料,以水或熱水、碳酸水等稀釋之濃縮型飲料等的飲料;使之溶解或懸浮在水或熱水等來飲用之粉末或顆粒、錠等的乾燥固態物;錠狀點心,果凍類,零食類,烘培點心,炸點心,蛋糕類、巧克力,口香糖,糖果,橡膠糖等點心類;湯類,麵類,米飯類,穀類等的食品形態。其中,在通常生活中利用時,宜為補充劑型、咀嚼錠、單次飲料型(one shot drink)等形態;在以提高運動效果為目的而攝取時,以運動飲料等的飲料形態最佳。進一步,該等經口組成物可做成已填充在容器之包裝食品來提供給消費者。容器若為可密封者則無特別限定。
為錠劑、顆粒劑、膠囊劑等的經口用固態製劑,內服液劑、糖漿劑等的經口用液體製劑等之情形,以乾燥物換算,相對於經口組成物總量,可摻和0.01~95質量%左
右之血糖代謝改善用組成物,且以摻和5~90質量%左右為宜、以摻和10~80質量%左右為最佳。為上述以外之經口組成物之情形,可摻和0.001~50質量%左右之血糖代謝改善用組成物,且以摻和0.005~30質量%左右為宜、以摻和0.01~10質量%左右為最佳。
又,本發明亦提供一種使血糖代謝改善及/或提升之方法,其包含對對象投予本發明血糖代謝改善用組成物之步驟。
進一步,本發明亦提供一種糖尿病、高血糖、耐糖能異常、胰島素抗性、動脈硬化、肥胖、體脂肪累積、脂質代謝異常、生活習慣病、脂肪肝等之預防、改善及/或治療方法,其包含對對象投予本發明血糖代謝改善用組成物之步驟。
以下將舉實施例來進一步詳細說明本發明,然本發明並非為下述例所限定者。此外,以下除非另有註明,「%」表示「質量%」。
將乾燥並切斷之國產柿葉約10g,使用20倍質量的各種溶劑來萃取。萃取所使用之溶劑為純水、25%(wt/wt)乙醇-水混合液、50%(wt/wt)乙醇-水混合液、75%(wt/wt)乙醇-水混合液及乙醇等5種。柿葉之萃取是使用回流萃取裝置,並以1小時、沸騰回流的條件來實施。萃取處理後,使用110網格的尼龍去除大的不溶物,之後,使用定性濾紙
No.1(ADVANTEC公司製)來進行過濾處理。獲得之濾液,是以含有乙醇之溶劑來萃取時,是在使用蒸發器除去乙醇分之後凍結乾燥;是以純水來萃取時,是將過濾處理而獲得之萃取物直接凍結乾燥。
此外,以下之利用各溶劑來獲得之萃取物,分別記載為萃取物A(以純水獲得之萃取物)、萃取物B(以25%(wt/wt)乙醇-水混合液獲得之萃取物)、萃取物C(以50%(wt/wt)乙醇-水混合液獲得之萃取物)、萃取物D(以75%(wt/wt)乙醇-水混合液獲得之萃取物)及萃取物E(以乙醇獲得之萃取物)。
評價以上述製造例1獲得之柿葉萃取物的糖代謝改善作用。糖代謝改善作用之評價,是在小鼠骨骼肌管細胞株(C2C12細胞)進行AMP激酶磷酸化活性之測定,進一步,針對萃取物A與C,亦進行糖吸收促進活性之測定。
將分別添加並溶解柿葉萃取物A~E(粉末)使對培養基之最終濃度成為0.02%者做為試料(實施例1-1~1-5)。又,負控制是使用什麼都沒添加的培養基(比較例1-1)、正控制是使用AICAR(最終濃度2mM)(比較例1-2)。接著,將小鼠骨骼肌管細胞株(C2C12細胞)種到6孔細胞培養皿,並在添加了10%胎牛血清及1%抗菌劑之DMEM培養基中,且在37℃、5%二氧化碳存在下,培養3天。
細胞在成為融合(confluent)狀態下,交換含有1%胎牛血清之DMEM培養基,再進一步培養使之完全分化。進一步,在交換新培養基後,分別添加實施例1-1~1-5及比較例1-1~1-2之試料,並在37℃、5%二氧化碳存在下培養。以PBS(-)洗淨細胞兩次後,加入150μL之添加有磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑及PMSF之細胞溶解緩衝液,以細胞刮除器回收細胞溶解液。
將細胞溶解液超音波處理後,利用離心回收上清液。直到使用於測定前上清液是以-80℃保存。測定上清液之蛋白質濃度,將樣品間之蛋白濃度調整至固定。調整上清液之蛋白濃度後,加入樣品緩衝液(Thermo),將熱變性者使用到以下的西方墨點法。
西方墨點法是以下述之方法來進行。首先,在使用7.5%電泳膠之SDS-PAGE後,利用iblot轉印在硝酸纖維膜上,將做為1次抗體之磷酸化AMPK抗體(CST)及總AMPK(CST)以含有5%BSA或脫脂奶之TBST稀釋1000倍,邊保持在4℃邊在搖動器上使之反應過夜。接著,將硝酸纖維膜徹底洗淨後,以5%脫脂奶TBST使標記有HRP之二次抗體(CST、1:5000或Santa Cruz、1:10000)在室溫下反應1小時。進一步,將硝酸纖維膜徹底洗淨後,以SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Thermo)或ECL Plus Western Blotting Detection System(GE)使之發光,並使用CCD攝影圖像解析裝置(GE)來檢測化學發光。此外,活性程度是以負控制試料設為1之相對值來表示。測定結果顯示
在表1及圖1。
如自表1及圖1所顯而得知,實施例1-3(萃取物C)之AMP激酶磷酸化活性是最高的,接著,實施例1-2(萃取物B)亦高。從上暗示了,依據萃取柿葉所使用之乙醇-水混合液中乙醇之比例,獲得之萃取物的AMP激酶磷酸化活性會有差異。
針對在上述試驗例1顯示了最高AMP激酶磷酸活性之萃取物C及顯示了低AMP激酶磷酸活性之萃取物A,利用下述方法,使用小鼠骨骼肌管細胞(C2C12細胞),進行糖吸收促進活性之測定。
將小鼠骨骼肌芽細胞(C2C12細胞)培養在高葡萄糖DMEM(5790)中,將細胞以5000 cells/200μL/well之濃度,種在黑色微量滴定盤(Falcon)並培養後,將已分化成肌管細胞之細胞用於實驗上。試料方面,是使用將於上述製造例1中所獲得之萃取物A及C分別調整最終濃度至0.02%及0.05%者(實施例2-1~2-4),又,分別是在負控制使用什麼都沒添加之培養基(比較例2-1),在正控制使用胰島素(10nM)(比較例2-2)。
實驗當天,將培養基交換成低葡萄糖DMEM
(6047),在進行飢餓後,交換成分別已溶解實施例2-1~2-4及比較例2-1~2-2試料之培養基,培養(incubate)60分鐘。處理後,去除培養基,交換成溶解有100μM光標識非水解性糖類似物、6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-6-Deoxyglucose(6-NBDG;invitrogen公司製)之低葡萄糖DMEM培養基,使之反應30分鐘,之後,除去培養基。以PBS洗淨後,使用螢光盤式分析儀(plate reader),以444nm/538nm emission進行測定。測定結果顯示在表2及圖2。
如從表2及圖2所顯而得知,實施例2-4(萃取物C)具有極高的骨骼肌管細胞之糖吸收促進活性。又,從實施例2-2及2-4之結果,暗示了糖吸收促進活性是有濃度依賴性的。
如從以上之試驗例1之結果所顯而得知,將柿葉使用以特定比例來混和乙醇與水之溶液來萃取之柿葉萃取物,具有高的AMP激酶磷酸化活性及糖吸收促進活性。
使利用上述製造例1而獲得之萃取物C(凍結乾燥品)以9倍質量蒸餾水分散,在超音波處理後,進行10000G的離心,獲得上清液。使獲得之上清液吸附在Purif-Pack Size200 ODS管柱。溶析之移動相是使用純水及乙腈-水混合液,流量設為60ml/min。溶析是,首先,以純水溶析10分鐘,接
著,以5%乙腈-水混合液溶析10分鐘,之後,利用使乙腈含量各逐步上昇5%之乙腈-水混合液各溶析10分鐘,並在利用20%乙腈-水混合液溶析10分鐘之時間點結束。之後,將各析出液以蒸發器濃縮後,凍結乾燥獲得分餾物。
此外,以下之以各析出液來析出之分餾物,分別記載為分餾物A(以純水析出之分餾物)、分餾物B(以5%乙腈-水混合液析出之分餾物)、分餾物C(以10%乙腈-水混合液析出之分餾物)、分餾物D(以15%乙腈-水混合液析出之分餾物)及分餾物E(以20%乙腈-水混合液析出之分餾物)。
各分餾物之產量,設使用之萃取物C質量為100%時,分餾物A為約58%、分餾物B為約17%、分餾物C為約15%,而分餾物D與E幾乎無法回收。此外,離心後之沉澱成分(不溶分)為約19%。
針對以上述製造例1所獲得之萃取物C(實施例3-1),以及以上述製造例2所獲得之分餾物A~C(實施例3-2~3-4)和不溶分(實施例3-5),與試驗例1-2同樣的來測定骨骼肌管細胞之糖吸收促進活性。進一步,與試驗例1-2同樣的,分別在負控制使用什麼都沒添加之培養基(比較例3-1),在正控制使用胰島素(10nM)(比較例3-2)。此外,將實施例3-1~3-5之試料調整使其最終濃度成為0.02質量%。測定結果顯示在表3及圖3。
如從表3及圖3可清楚確認,實施例3-3(分餾物B)及實施例3-4(分餾物C)具有較實施例3-1(萃取物C)高之糖吸收促進活性。特別是可確認到,實施例3-3(分餾物B)具有非常高的糖吸收促進活性。
針對以上述製造例1所獲得之萃取物C(實施例4-1),以及已知被包含在柿葉之山柰酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、(+)-兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、芸香苷與沒食子酸等7化合物(實施例4-2~4-8),與試驗例1-2同樣的,測定骨骼肌管細胞之糖吸收促進。進一步,與試驗例1-2同樣的,分別在負控制使用什麼都添加之培養基(比較例4-1),在正控制使用胰島素(10nM)(比較例4-2)。此外,將實施例4-1~4-8之試料調整使其最終濃度成為0.01質量%。測定結果顯示在表4及圖4。
如從表4及圖4所明瞭,實施例4-3(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)、實施例4-6(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)及實施例4-8(沒食子酸)顯示出與實施例4-1(萃取物C)同樣高之糖
吸收促進活性,然該等之外的化合物,顯示出較實施例4-1低之活性。
表4及圖4中顯示出高活性之槲皮素-3-O-葡萄糖苷、表沒食子兒茶素沒食子酸酯及沒食子酸等3化合物,在萃取物C之中含量不高,因此雖被認為是對萃取物C之作用貢獻某種程度之存在,但卻暗示了萃取物C中主要之有効成分為該等化合物以外者。
使利用上述製造例1所獲得之萃取物C(凍結乾燥品)分散在9倍質量之蒸餾水,在超音波處理後,進行10000G的離心,獲得上清液。使獲得之上清液吸附在Sephadex LH-20管柱(GE Healthcare Japan(股)公司製)。溶析之移動相是使用純水、甲醇-水混合液及甲醇,並設流量為20ml/min。溶析是,首先,以純水溶析10分鐘,接著,以20%甲醇-水混合液溶析10分鐘,之後,利用使甲醇含量各逐步上昇20%之甲醇-水混合液各溶析10分鐘。在利用甲醇之10分鐘的溶析結束之時間點,進一步以70%丙酮-水混合液600mL溶析移動相。之後,將各析出液以蒸發器濃縮後,凍結乾燥獲得分餾物。
此外,以下之以各析出液溶析而獲得之分餾物,分別記載為分餾物F(以純水析出之分餾物)、分餾物G(以20%甲醇-水混合液析出之分餾物)、分餾物H(以40%甲醇-水混合液析出之分餾物)、分餾物I(以60%甲醇-水混合液析
出之分餾物)、分餾物J(以80%甲醇-水混合液析出之分餾物)、分餾物K(以甲醇析出之分餾物)及分餾物L(以70%丙酮-水混合液析出之分餾物)。
各分餾物之產量,設使用之萃取物C質量為100%時,分餾物F為約65%、分餾物G為約2%、分餾物H為約5%、分餾物I為約2%、分餾物J為約5%、分餾物K為約2%及分餾物L為約6%。此外,在上述溶析未析出之成分(不溶分)為約13%。
針對以上述製造例1獲得之萃取物C(實施例5-1)、以上述製造例2獲得之分餾物B(實施例5-2)、以上述製造例3獲得之分餾物F~L(實施例5-3~5-9),與試驗例2同樣的,測定骨骼肌管細胞之糖吸收促進效果。進一步,分別在負控制使用什麼都沒添加之培養基(比較例5-1),並且在正控制使用胰島素(10nM)(比較例5-2)、胰島素(100nM)(比較例5-3)及AICAR(最終濃度3mM)(比較例5-4)。此外,將實施例5-1~5-9之試料調整使最終濃度成為0.02質量%。獲得之結果顯示在表5及圖5。
如從表5及圖5可清楚確認,實施例5-8(分餾物K)及實施例5-9(分餾物L)具有較實施例5-2(分餾物B)更高之
糖吸收促進活性。
在利用乙醇-水混合液來萃取之以外的方法方面,是利用以下之溫度差二階段萃取法,調製柿葉萃取物。
將乾燥並切斷之國產柿葉約10g,與20倍質量之各設定溫度的純水混合,輕輕攪拌後,靜置1小時。接著,在使用110網格之尼龍回收殘渣後,將濾液凍結乾燥。純水之設定溫度分別設為5℃、30℃、60℃及80℃。
此外,以下之從各設定溫度之純水獲得之萃取物,分別記載為5C-1(以5℃之純水獲得之萃取物)、30C-1(以30℃純水獲得之萃取物)、60C-1(以60℃純水獲得之萃取物)及80C-1(以80℃純水獲得之萃取物)。
進一步,將上述回收之殘渣,使用回流萃取裝置,在1小時且沸騰回流之條件下進行萃取。萃取處理後,使用110網格之尼龍去除大的不溶物,之後,使用定性濾紙No.1(ADVANTEC社製)來過濾處理,並將濾液凍結乾燥。
此外,以下之從利用各設定溫度純水獲得之殘渣所萃取之萃取物,分別記載為5C-2(從以5℃純水獲得之殘渣所萃取之萃取物)、30C-2(從以30℃純水而獲得之殘渣殘渣所萃取之萃取物)、60C-2(從以60℃純水而獲得之殘渣所萃取之萃取物)及80C-2(從以80℃純水而獲得之殘渣所萃取之萃取物)。
又,將乾燥並切斷之國產柿葉約10g,與20倍質
量之100℃純水混合,使用回流萃取裝置,在2小時且沸騰回流之條件下進行萃取。萃取處理後,使用110網格之尼龍去除殘渣,之後,使用定性濾紙No.1(ADVANTEC公司製)過濾處理,並將濾液凍結乾燥。此外,以下將利用該操作所獲得之萃取物記載為100C。
針對以上述參考製造例1而獲得之30C-1~80C-1(參考例3~6)、100C(參考例7)及30C-2~80C-2(參考例8~11),以及以上述製造例2而獲得之分餾物B(參考例2),與試驗例1-2同樣的,測定骨骼肌管細胞之糖吸收促進活性。進一步,與試驗例5同樣的,在負控制是使用什麼都沒添加之培養基(參考例1)。此外,將參考例3~11之試料調整使最終濃度成為0.02質量%。測定結果顯示在表6及圖6。
如從表6及圖6所明瞭,以使用了純水之溫度差二階段萃取法而獲得之柿葉萃取物(參考例3~11),顯示出較參考例2(分餾物B)更低的糖吸收活性。從該等結果首次暗示了,藉由將柿葉使用乙醇-水混合液來進行萃取,可獲得顯示出良好之糖吸收促進活性之柿葉萃取物。
Claims (4)
- 一種血糖代謝改善用組成物,含有柿葉萃取物,且該柿葉萃取物是經由將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟而獲得。
- 如請求項1之血糖代謝改善用組成物,其中含有柿葉萃取物,且該柿葉萃取物是經由下述步驟而獲得:將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟,及使已由前述步驟獲得之萃取物吸附在填充了鍵結十八矽烷基之矽凝膠之管柱,並藉由5~10%乙腈-水混合液來溶析之步驟。
- 如請求項1之血糖代謝改善用組成物,其中含有柿葉萃取物,且該柿葉萃取物是經由下述步驟而獲得:將柿葉以40~60%乙醇-水混合液來萃取之步驟,及使已由前述步驟獲得之萃取物吸附在填充了修飾葡聚糖之管柱,並藉由70~100%甲醇-水混合液或60~80%丙酮-水混合液來溶析之步驟。
- 如上述請求項1至3之血糖代謝改善用組成物,其為經口組成物。
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