CN102949435A - 柿叶总黄酮抑制胰岛β细胞凋亡的应用及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了柿叶总黄酮在制备抗糖尿病药物中的应用，柿叶总黄酮具有抑制胰岛β细胞凋亡，降低氧化应激胰岛β细胞自由基的产生，抑制氧化应激诱导的胰岛细胞凋亡，提高胰岛素分泌量，增强抗氧化酶活性的功能，用于治疗或预防糖尿病。本发明还涉及柿叶总黄酮的提取方法，包括步骤：1）用乙醇作为溶剂进行提取；2）得到的醇提液调节pH值，用石油醚和乙酸乙酯萃取后，用大孔吸附树脂处理；3）收集的洗脱液用冷冻干燥法处理得到柿叶总黄酮。

Description

柿叶总黄酮抑制胰岛β细胞凋亡的应用及其提取方法

技术领域

本发明涉及来源于植物材料的药用有效成分的提取方法及用途，具体涉及一种柿叶总黄酮的提取方法及其抑制胰岛β细胞凋亡的应用。

背景技术

糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷和（或）胰岛素抵抗而引起的，以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病。随着生活水平的提高，糖尿病发生率急剧上升，目前发病率为2%。糖尿病患者的胰岛β细胞凋亡增加会导致胰岛素分泌不足和β细胞数量减少。采取有效措施抑制胰岛β细胞的凋亡，将可能最大限度的减少β细胞功能和数量的降低。糖尿病氧化应激与胰岛β细胞的凋亡和功能有着密切的关系。高糖环境下，由于线粒体呼吸链中过多生成的氧自由基，可激活多元醇途径、蛋白激酶C途径和晚期糖基化终末产物途径，后者反过来还能够促进自由基的生成，从而形成恶性循环，这是导致糖尿病各种并发症发生和发展的中心环节。胰岛β细胞内表达的抗氧化物酶如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT），相对于其他组织都要低，这也使胰岛β细胞更容易受到氧化应激的攻击。抗氧化治疗可以减轻氧化应激，阻止或延缓糖尿病的发生发展。

柿叶是柿树科（Ebenaceae）柿属（Diospyros L.）植物柿树的新鲜或干燥叶。柿树是我国南北各地普遍栽培的一种果树，分布十分广泛，以山东、广西、山西分布较多，其他省份如安徽、河南、江苏、浙江、福建、广东、江西、湖南、湖北、陕西、甘肃等地也有一定规模的栽培。柿叶入药最早见于明《滇南本草第一卷》“柿花”项下，曰：“经霜叶敷臃疮。”《本草再新》中记载柿叶“味苦，性寒，无毒，专入肺经，治咳嗽吐血，止渴生津。”《分类草药性》亦记载柿叶可“治咳嗽气喘消肺气胀。”《广西中药材标准1990版》收载中药柿叶，其性味“苦、酸、涩、凉”，功能与主治为“清肺止咳，凉血止血，活血化癖，降血压。用于咳喘，肺气胀，各种内出血，高血压，脑动脉硬化症，冠心病。”现代药理分析表明，柿叶中含有丰富的类胡萝卜素、黄酮甙、芦丁、维生素C、胆碱等对有效药理成分。然而，我国目前柿叶基本上都被当作废物扔掉。

现代研究表明，柿叶中的主要有效成分是黄酮，黄酮类在柿叶中的总含量为121.3mg/100g。目前已发现的黄酮化合物有槲皮素(quercetin)、异槲皮素(isoquercitrin)、山萘酚(kaempferol)、山萘酚3-Ο-β-D-葡萄糖苷(kaempferol3-O-β-D-glucopyranoside)、山萘酚3-O-α-L-鼠李糖苷(kaempferol3-O-α-L-rhamnopyranoside)、山萘酚3-O-β-D-木糖苷（kaempferol3-O-β-D-xylopyramoside）、山萘酚3-O-α-L-阿拉伯糖苷（kaempferol3-O-α-L-arabinoside）、槲皮素3-O-[2″-O-（3,4,5-三羟基苯甲酰）]-葡萄糖苷（quercetin3-O-(2″-O-(galloyl)-β-D-glucopyranoside）、芦丁、金丝桃苷（槲皮素-3-半乳糖苷）、紫云英苷（astragalin）、杨梅树皮苷等。以上统称为柿叶总黄酮（persimmon leaftotal flavonoids,PLTF）。柿叶总黄酮具有显著的抗氧化活性，有望成为非常有潜力的新型天然抗氧化剂。

发明内容

本发明解决的问题在于提供柿叶总黄酮抑制胰岛β细胞凋亡的应用及其提取方法，从而有助于在糖尿病的防治过程中发挥作用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

柿叶总黄酮在制备抗糖尿病药物和/或保健品中的应用。

所述的抗糖尿病药物和/或保健品为促进胰岛细胞增殖和提高胰岛素分泌量的药物和/或保健品。

所述的抗糖尿病药物和/或保健品为增加Bcl-2mRNA表达和/或抑制p65蛋白表达的药物和/或保健品。

所述的抗糖尿病药物和/或保健品为抑制胰岛β细胞凋亡的药物和/或保健品。

所述的抗糖尿病药物和/或保健品为减少iNOS、Caspase3、Bax mRNA表达的药物和/或保健品。

所述的抗糖尿病药物和/或保健品为增强胰岛细胞抗氧化活性的药物和/或保健品。

所述的抗糖尿病药物和/或保健品为降低胰岛细胞自由基的产生的药物和/或保健品。

所述的抗糖尿病药物和/或保健品为增强抗氧化酶活性的药物和/或保健品。

一种柿叶总黄酮的制备方法，包括以下步骤：

1）将粉碎后干燥的柿叶，按1g：10～25ml的比例加入体积浓度为50～80%的乙醇，在微波超声下，加热回流提取10～30min，滤渣重复提取至少两次，合并提取液得到醇提液；

2）将醇提液用调节pH值至5.5后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，然后有机相用大孔树脂吸附，水洗至流出液无色，再用质量浓度为体积浓度为50～80%的乙醇洗脱，收集洗脱液；

3）将洗脱液减压浓缩后冷冻干燥，得到柿叶总黄酮。

所述的微波超声的频率为2000～3000MHz，功率为400～600W。

具体的所述的柿叶总黄酮提取物，经以下步骤提取得到：

1）称取粉碎的干燥柿叶，按1g：20ml的用量比加入体积浓度为75%的乙醇，在2000~3000MHz，400~600W微波条件下，加热回流提取20min，滤渣重复提取至少2次，合并各次提取液得到醇提液；

2）将醇提液用1%HCl调节PH值至5.5，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取后，有机相用AB-8大孔树脂吸附，水洗至流出液无色，再用体积浓度为75%乙醇洗脱，收集洗脱液；

3）将洗脱液60℃减压浓缩，-60℃冷冻干燥，得到柿叶总黄酮。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

糖尿病氧化应激与胰岛β细胞的凋亡和功能有着密切的关系，糖尿病患者的胰岛β细胞凋亡增加会导致胰岛素分泌不足和β细胞数量减少。而本发明公开了柿叶总黄酮（PLTF）能够促进胰岛细胞增殖和提高胰岛素分泌量，所以可以应用于制备抗糖尿病药物和/或保健品。

而且柿叶总黄酮能够降低氧化应激胰岛β细胞自由基的产生，抑制氧化应激诱导的β胰岛细胞凋亡，提高胰岛素分泌量，增强抗氧化酶活性，减少iNOS、Caspase3、Bax mRNA表达，增加Bcl-2mRNA的表达和抑制p65蛋白的表达，减轻凋亡，从而降低糖尿病的发生率。

进一步的本发明将粉碎后的柿叶，用乙醇作为溶剂进行提取，得到的醇提液调节PH值5.5，用石油醚和乙酸乙酯萃取后，用大孔吸附树脂处理，收集的洗脱液用冷冻干燥法处理得到柿叶总黄酮，提取方法步骤简单，易操作。

附图说明

图1为柿叶总黄酮对细胞生存率的影响；

图2为柿叶总黄酮抑制H₂O₂导致的胰岛细胞凋亡；

图3为柿叶总黄酮对H₂O₂损伤Min6细胞分泌胰岛素功能的影响；

图4为柿叶总黄酮对H₂O₂诱导胰岛细胞产生活性氧的清除作用；

图5-1为柿叶总黄酮对H₂O₂所致胰岛Min6细胞损伤抗氧化指标SOD的影响；

图5-2为柿叶总黄酮对H₂O₂所致胰岛Min6细胞损伤抗氧化指标CAT的影响；

图5-3为柿叶总黄酮对H₂O₂所致胰岛Min6细胞损伤抗氧化指标GSH的影响；

图5-4为柿叶总黄酮对H₂O₂所致胰岛Min6细胞损伤抗氧化指标MDA的影响；

图5-5为柿叶总黄酮对H₂O₂所致胰岛Min6细胞损伤抗氧化指标NO的影响。

图6-1为柿叶总黄酮对H2O2所致胰岛Min6细胞损伤Bcl-2mRNA表达水平的影响；

图6-2为柿叶总黄酮对H2O2所致胰岛Min6细胞损伤Bax mRNA表达水平的影响；

图6-3为柿叶总黄酮对H2O2所致胰岛Min6细胞损伤Bcl-2/Bax的影响；

图6-4为柿叶总黄酮对H2O2所致胰岛Min6细胞损伤iNOS mRNA表达水平的影响；

图6-5为柿叶总黄酮对H2O2所致胰岛Min6细胞损伤Caspase-3mRNA表达水平的影响；

图7柿叶总黄酮引起Min6细胞NF-κB p65蛋白表达的变化（图从左到右依次为control；150μM H₂O₂；7.5μM PLTF+150μM H₂O₂；7.5μM PLTF+150μM H₂O₂；5μM PLTF+150μM H₂O₂；2.5μM PLTF+150μM H₂O₂；1.25μMPLTF+150μM H₂O₂；0.625PLTF+150μM H₂O₂）

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、柿叶总黄酮的提取

实施例1

提取柿叶总黄酮，包括以下步骤：

（1）称取粉碎的干燥柿叶，按1g：20ml的用量比加入体积浓度为75%的乙醇，在2000~2500MHz，400~500W微波条件下，加热回流提取20min，滤渣重复提取至少2次，合并各次提取液得到醇提液；

（2）将醇提液用1%HCl调节PH值至5.5，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取后，有机相用AB-8大孔树脂吸附，水洗至流出液无色，再用体积浓度为75%乙醇洗脱，收集洗脱液；

（3）将洗脱液60℃减压浓缩，-60℃冷冻干燥，得到柿叶总黄酮。

实施例2

提取柿叶总黄酮，包括以下步骤：

（1）称取粉碎的干燥柿叶，按1g：20ml的用量比加入体积浓度为75%的乙醇，在2500~3000MHz，500~600W微波条件下，加热回流提取20min，滤渣重复提取至少2次，合并各次提取液得到醇提液；

（2）将醇提液用1%HCl调节PH值至5.0，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取后，有机相用AB-8大孔树脂吸附，水洗至流出液无色，再用体积浓度为75%乙醇洗脱，收集洗脱液；

（3）将洗脱液60℃减压浓缩，-60℃冷冻干燥，得到柿叶总黄酮。

2、胰岛细胞的培养及氧化应激模型的建立

选用的实验细胞为Min6小鼠胰岛β细胞株，是肉瘤病毒40通过T细胞转染非肥胖糖尿病小鼠（NOD鼠）得到的胰岛细胞瘤株。

选用第26-30代Min6细胞为研究对象，培养于含10%FBS和10μl/Lβ-巯基乙醇的高糖DMEM培养液中，在37℃含5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养，在细胞密度80%汇合时以96孔板每孔密度5×10⁴cells/ml细胞接种，培养24h后，用150μM H₂O₂损伤6h，检测各项指标。

3、MTT试验测定细胞存活率

Min6细胞以每孔接种5×10⁴/ml均匀种在96孔板上，于5%CO₂，37℃培养箱中培养。第2天进行分组加PLTF（柿叶总黄酮）后每孔加入200μl含有10%5mg/ml MTT的无血清DMEM溶液（0.5%浓度的MTT），孵箱避光培养4h。4h后终止培养，吸去孔内培养液，之后每孔加入100μl二甲基亚砜（DMSO），振荡5min使结晶物充分溶解。酶标仪设置测定波长设定为570nm，测各定各组细胞的OD值。

如图1所示，在加入150μM的H₂O₂6h后，与空白对照组相比，损伤组胰岛细胞的活力有极其显著的下降(P<0.01)，而预先用PLTF孵育24h的Min6细胞在H₂O₂损伤下的存活率降低程度变小(P<0.01)，且成浓度依赖性。表明PLTF对H₂O₂引起的胰岛细胞损伤有保护作用。

4、胰岛细胞凋亡率检测

Min6细胞以5×10⁴/ml的密度种于96孔板，贴壁24h后，换含不同浓度H₂O₂的培养液0.1ml，使H₂O₂终浓度为0、50、100、150μM干预1、2、4、6h，测MTT。Min6细胞经不同浓度H₂O₂作用6小时后，胰酶消化后用PBS洗细胞3次后进行Annexin-V-FITC-PI染色，参照试剂盒说明书进行染色，细胞经处理后于流式细胞仪检测，CellQuestTM软件分析结果如图2所示。

150μM H₂O₂用于Min6细胞6h后，早期凋亡细胞比例（43.6%）与正常细胞凋亡比例（23.6%）相比显著增加（P<0.05）。分别用7.5、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μM PLTF预孵育24h，然后加入150μM H₂O₂继续孵育6h，早期凋亡细胞比例分别为16.5%、21%、22.4%、25%、27.5%和28.6%，与H₂O₂处理的凋亡细胞比例（43.6%）相比显著减少（P<0.05）。结果表明PLTF能抵抗H₂O₂引起的Min6细胞凋亡。

5、测定胰岛素含量

细胞诱导结束后除去培养基，用PBS冲洗后加入含0.5%BSA无糖KRB缓冲液，37℃孵育2h，每孔取出100μl上清后，按照Linco胰岛素放免试剂盒说明操作。细胞数量差异用考马斯亮蓝蛋白定量进行校正。收集细胞，4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，加入预冷细胞裂解液裂解细胞，冰上孵育60min，4℃离心收集上清液即为蛋白样本，各取25μl待测样本，加入1.5ml考马斯亮蓝染液，再次混匀后室温静置15min，酶标仪测定吸光度和蛋白浓度。

检测结果如图3所示，150μM H₂O₂作用6h能显著降低胰岛素分泌水平，当分别以不同浓度PLTF（0.3125、0.625、1.25、2.5、5、7.5μM）处理Min6细胞24h后，胰岛素分泌增加，与对照组（control）相比较，差异具有统计学意义（P<0.01），且呈剂量依赖性增加趋势。

6、胞内ROS水平测试

采用荧光（二氯荧光素）探针法，离心收集细胞后用PBS清洗3次，每孔加入终浓度为20μM的DCFH-DA，37℃水浴避光温育15min，激发波长设定为499nm，测定521nm处的荧光强度，用荧光强度表征胞内总的ROS水平。

从图4所示的检测结果可以发现，150μM H₂O₂作用6h使胰岛细胞活性氧水平显著升高（P<0.05），而PLTF（7.5、5、2.5μM）显著降低H₂O₂诱导胰岛细胞产生的活性氧，而且呈浓度依赖性。

7、细胞抗氧化指标测定

实验过程按照南京建成生物工程公司生产的测试试剂盒说明书进行。图5-1~5-5所示分别为SOD、CAT、GSH、MDA、NO损伤抗氧化指标。150μMH₂O₂作用胰岛细胞6h导致SOD、GSH、CAT活力显著下降（P<0.01），NO、MDA含量显著上升（P<0.01），差异具有统计学意义。而PLTF增加了H₂O₂损伤下胰岛细胞内的SOD、GSH和CAT活性，呈一定的浓度依赖性。PLTF使SOD、GSH、CAT都明显升高（P<0.01），NO、MDA都明显下降（P<0.01），而且随着PLTF浓度的增大，这种趋势越来越明显，差异具有统计学意义（P<0.01）。这就表明PLTF不仅能够提高胰岛Min6细胞抗氧化酶的活力，而且能抵抗H₂O₂所致胰岛Min6细胞损伤。

8、RT-PCR分析检测Bcl-2、Bax、iNOS、Caspaes-3mRNA表达

提取RNA过程按照TAKARA RNA提取试剂盒进行。逆转录步骤按PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time反转录酶试剂盒说明书操作。

所用引物见表1。

表1RT-CR分析用引物

Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax、iNOS、Caspase-3的mRNA指标见图6-1~6-5。从图中可见，用H₂O₂处理的胰岛细胞Bcl-2mRNA与对照组相比在损伤组内表达水平上升(P<0.01)，可认为H₂O₂激活了通路，Bax mRNA表达水平极显著增高(P<0.01)；加入PLTF后，7.5、5、2.5、1.25μM能降低Bax mRNA表达水平，促进Bcl-2mRNA表达水平的增加，与H₂O₂组相比有显著性差异。Bax/bcl-2结果显示，150uM H₂O₂能明显增加了细胞凋亡（P<0.01），7.5μMPLTF却显著减少了细胞凋亡（P<0.01），这就说明PLTF能抑制H₂O₂引起的凋亡。用H₂O₂处理胰岛细胞后iNOS mRNA和Caspase-3mRNA表达水平极显著增高（P<0.01），而PLTF预孵育后，随着PLTF浓度的增大，iNOS和Caspase-3mRNA量减小，说明PLTF能抑制H₂O₂引起的凋亡。

9、蛋白质免疫印迹测p65蛋白表达

将细胞接种6孔板中，处理细胞后用PBS洗涤细胞3次，每孔加入100μl裂解液，冰上裂解60min，不断混匀震荡6孔板。最后在高速低温离心机中4℃、14，000rpm离心20min，吸上清-20℃保存备用。考马斯亮蓝蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，中性滤纸和硝酸纤维素膜。电转转膜，恒压100V-150V电转1-1.5h。将膜放入封闭液室温平缓摇1h，用TBST液室温洗3次。加入鼠源p65多克隆抗体（1∶1000）、兔源p38多克隆抗体（1∶1000）、兔源p-p38多克隆抗体（1∶1000）及鼠源β-actin多克隆抗体（1∶5000）中孵育，4℃过夜后用TBST洗涤3次。加入相应的二抗，摇动1-2h，TBST洗涤3次。利用增强化学发光法（ECL）显影检测蛋白，过程参照Western BlottingLuMinol Reagent说明书。待膜稍干后，将SolutionA和Solution B等体积混合后加至膜上，反应1分钟。在暗室中进行膜与X光胶片的压片，根据荧光强弱选择曝光时间。显影，定影。用ECL法进行扫描。条带灰度用Quantityone图像分析软件半定量分析，各浓度组通过与相应β-actin条带密度比较，分析趋势。

p65蛋白是NF-κB激活后的活性片断，其核转位后可调节其下游iNOS基因转录。用PLTF预处理Min6细胞24h后，加入150μM H₂O₂，作用6h后，Western blot检测结果可见图7。与损伤组相比，在加入PLTF的细胞中胞核NF-κBp65蛋白水平降低，说明PLTF可保护Min6细胞，使NF-κB激活片断p65蛋白的核内转位水平降低。

综上，利用高糖DMEM培养基常规培养胰岛细胞，然后加入柿叶总黄酮24小时后H₂O₂损伤6h，建立损伤应激损伤基础，通过MTT实验测定细胞生长率，胰岛素分泌量，结果证实柿叶总黄酮促进了胰岛细胞增殖和胰岛素的分泌量；通过流式细胞术分析细胞凋亡率，可以知道柿叶总黄酮能够有效抑制细胞凋亡，再通过细胞内各项抗氧化指标测试，发现柿叶总黄酮能降低胰岛细胞自由基的产生、细胞MDA和NO含量；另外，经实验证实能够减少iNOS、Caspase3、Bax mRNA表达，增加Bcl-2mRNA的表达和抑制p65蛋白的表达，找到了柿叶总黄酮的作用靶点。所以，柿叶总黄酮能够应用于制备抗糖尿病药物和/或保健品。

Claims (10)

1.柿叶总黄酮在制备抗糖尿病药物和/或保健品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗糖尿病药物和/或保健品为促进胰岛细胞增殖和提高胰岛素分泌量的药物和/或保健品。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗糖尿病药物和/或保健品为增加Bcl-2mRNA表达和/或抑制p65蛋白表达的药物和/或保健品。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗糖尿病药物和/或保健品为抑制胰岛β细胞凋亡的药物和/或保健品。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗糖尿病药物和/或保健品为减少iNOS、Caspase3、Bax mRNA表达的药物和/或保健品。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗糖尿病药物和/或保健品为增强胰岛细胞抗氧化活性的药物和/或保健品。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗糖尿病药物和/或保健品为降低胰岛细胞自由基的产生的药物和/或保健品。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗糖尿病药物和/或保健品为增强抗氧化酶活性的药物和/或保健品。

9.一种柿叶总黄酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将粉碎后干燥的柿叶，按1g：10～25ml的比例加入体积浓度为50～80%的乙醇，在微波超声下，加热回流提取10～30min，滤渣重复提取至少两次，合并提取液得到醇提液；

2）将醇提液用调节pH值至4.5～5.5后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，然后有机相用大孔树脂吸附，水洗至流出液无色，再用质量浓度为体积浓度为50～80%的乙醇洗脱，收集洗脱液；

3）将洗脱液减压浓缩后冷冻干燥，得到柿叶总黄酮。

10.如权利要求9所述的柿叶总黄酮的制备方法，其特征在于，所述的微波超声的频率为2000～3000MHz，功率为400～600W。

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