TW201534617A - 源自粒線體之肽ｍｏｔｓ３調節代謝及細胞存活 - Google Patents

Abstract

MOTS3係一種新穎多肽。本文中揭示使用MOTS3及其醫藥組合物治療諸如糖尿病、肥胖症、脂肪肝及癌症之疾病之方法。

Description

源自粒線體之肽MOTS3調節代謝及細胞存活 [相關申請案之交叉參考]

本申請案主張2013年3月15日申請之美國臨時申請案第61/801,474號之優先權，其為所有目的以其全文引用之方式併入本文中。

[政府權利]

本發明係根據由美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)授予之授權號1R01AG034430與授權號1R01GM090311在政府支持下完成。政府對本發明具有某些權利。

本發明係關於一種新穎之源自粒線體之肽(MOTS3)。該新穎肽可用於治療諸如糖尿病、肥胖症、脂肪肝及癌症之疾病之方法中。

在能量產生、程式化細胞死亡及活性氧物種(ROS)產生中包涵對代謝過程重要之粒線體，且在包括癌症、糖尿病、神經退化性疾病及老化之主要疾病的各個階段中均極大地涉及粒線體；但其在發病原理中之作用大部分仍不清楚。傳統上認為粒線體係「最終功能」胞器，接收且加工大量細胞信號以調節能量產生及細胞死亡。然而，粒線體傳回細胞之逆行信號轉導係一種瞭解不足之生物過程。

鈣、細胞色素C及ROS已認為係一種逆行性粒線體分子。顯然，Durieux等人提出源自粒線體之信號可以細胞非自主方式調節秀麗隱桿線蟲(C.elegans)之壽命，但尚未在蠕蟲中識別該等信號之性質(Durieux等人，Cell 144,79(2011年1月7日))。已在2001年，在從由阿茲海默氏病患者大腦之存活部分構建之cDNA庫選殖24胺基酸肽(現稱為人體肽(HN))且針對粒線體16S rRNA基因座繪圖時，發現該等源自粒線體之信號的特徵(Hashimoto等人，Proc Natl Acad Sci USA 98,6336(2001年5月22日))。此後，已證實HN係一種細胞保護及抗細胞凋亡因數，部分係由於其作為防止各種癌細胞中細胞凋亡之Bax拮抗劑(Guo等人，Nature 423,456(2003年5月22日))及作為拮抗IGFBP-3對癌細胞之細胞凋亡作用之IGFBP-3搭配物的作用(Ikonen等人，Proc Natl Acad Sci USA 100,13042(2003年10月28日)。最近之工作表明HN係一種寬譜存活因數(Nishimoto等人，Trends Mol Med 10,102(2004年3月))，然而其確切作用機制仍不清楚。

源自粒線體之人體肽與若干核編碼之cDNA共有92%至95%之一致性，此代表較大假定基因中之結構域，其表現尚未證實(Tajima等人，Neurosci Lett 324,227(2002年5月24日))。在腎臟、睪丸、大腦及胃腸道中存在源自粒線體之HN轉錄體。應注意，人體肽在物種(包括低級生物體)之間高度保守(90%至100%之間之同源性)。已在大腦及睪丸中表明存在此肽，且吾人已證實其在血漿、CSF及精液中以1至10ng/ml之濃度存在。已描述具有更有效作用之HN的新穎突變體及類似物，包括HNG(S14G)、HNG-F6A(非IGFBP-3結合，吾人最近在已提交之共同AECOM/UCLA專利下保護其作為2型糖尿病之可能治療)及colivelin(含有HN及ADNF9之部分序列之雜合肽)。人體肽及其類似物與衍生物展示對包括阿茲海默氏病、糖尿病及腎衰竭之疾病陣列之治療潛能。

此報導係對12S rRNA中之新穎開放閱讀框(ORF)之首次描述。12S rRNA中之此新穎ORF之名稱在12S rRNA 3(MOTS3)中係粒線體ORF。與HN類似(Y.Hashimoto等人，Proc Natl Acad Sci USA 98,6336(2001年5月22日))，MOTS3轉錄體經聚腺苷酸化且提議一種在整個物種中充分保守之基因內基因結構。

在肝臟、心臟、睪丸中偵測到相同分子量之MOTS3，但發現在小鼠及大鼠大腦中之分子量略微較高。其主要生物功能係對細胞培養物及小鼠中之粒線體呼吸與 葡萄糖利用具有強烈影響之代謝調節作用。亦已經活體外及活體內之各種方式測試MOTS3影響粒線體呼吸、葡萄糖利用、胰島素調節及細胞增殖/存活。

此外，MOTS3係一種源自粒線體之具有一般代謝調節作用之非毒性天然肽。其性質首先在於提供強烈體重與血糖調節以及活化AMPK，AMPK係經由mTOR途徑靶向糖尿病及癌症之主要藥物。MOTS3來自完全新一類之藥物，亦即僅在最近描述之源自mtDNA之信號轉導肽。因此，MOTS3及其醫藥調配物可用於治療具有多種代謝關聯之各種年齡相關疾病，諸如癌症、糖尿病、肥胖症及神經退化性疾病，但不足以治癒此疾病。

因此，本發明揭示新穎MOTS3 ORF及其用於治療疾病之方法。

在某些實施例中，本發明包含與SEQ ID NO：1具有70%序列一致性之經分離之多肽。在某些實施例中，經分離之多肽包含80%與SEQ ID NO：1之序列一致性。在某些實施例中，經分離之多肽包含90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。在某些實施例中，經分離之多肽包含SEQ ID NO：1之序列。

在某些實施例中，本發明包含與上文所述之多肽特異性結合之經分離之抗體。在某些實施例中，抗體係單株抗體。

在某些實施例中，本發明包含與SEQ ID NO：1具有70%序列一致性之經分離之多肽。在某些實施例中，多肽包含80%或90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。在某些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1之序列。

在某些實施例中，本發明包含一種治療糖尿病之方法，該方法包括對有此需要之受試者投與治療有效量之醫藥組合物之步驟，該醫藥組合物包含與SEQ ID NO：1具有70%序列一致性之經分離之多肽。在某些實施例中，多肽包含80%或90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。在某些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1之序列。在某些實施例中，糖尿病係I型糖尿病。在某些實施例中，糖尿病係II型糖尿病。在某些實施例中，受試者係人類。

在某些實施例中，本發明包含一種治療肥胖症及/或脂肪肝之方法，該方法包括對有此需要之受試者投與治療有效量之醫藥組合物之步驟，該醫藥組合物包含與SEQ ID NO：1具有70%序列一致性之經分離之多肽。在某些實施例中，多肽包含80%或90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。在某些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1之序列。在某些實施例中，受試者係哺乳動物。在某些實施例中，受試者係人類。

在某些實施例中，本發明包含一種治療癌症之方法，該方法包括對有此需要之受試者投與治療有效量之醫藥組合物之步驟，該醫藥組合物包含與SEQ ID NO：1 具有70%序列一致性之經分離之多肽。在某些實施例中，多肽包含80%或90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。在某些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1之序列。在某些實施例中，受試者係人類。在某些實施例中，癌症係選自乳癌、腦癌、結腸癌、黑素瘤、白血病(例如，AML)、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌組成之群之癌症。

在一些實施例中，本發明包含編碼SEQ ID NO：1之cDNA分子。在一些實施例中，本發明包含與SEQ ID NO：2至少80%、90%或100%一致之cDNA。

在一些實施例中，本發明包含包括編碼SEQ ID NO：1之核酸序列的表現載體。在一些實施例中，本發明包含包括與SEQ ID NO：2至少80%、90%或100%一致之cDNA的表現載體。

在一些實施例中，本發明提供一種在本發明中經如本文所述之表現載體轉型或轉染之宿主細胞。

圖1展示MOTS3係一種來自粒線體12S rRNA之聚腺苷酸化轉錄體(A)。MOTS 3序列在各種生物體中完全保守(B)。兔多株抗MOTS3抗體識別過度表現之MOTS3以及選殖至細胞中之表現載體中的GFP標記MOTS3(C)。在大鼠心臟、肝臟及睪丸中發現類似分子量之MOTS3，但在大腦中之分子量略微較高(D)。在不具有 粒線體DNA之Rho-0細胞中未偵測到MOTS3(E)。使用CO I/II(細胞色素氧化酶I/II)來證實缺少粒線體DNA。

圖2描繪在10%及1% FBS培養條件下MOTS3對粒線體活性之影響(A)。粒線體還原酶使MTT降低及耗氧速率(OCR)與細胞外酸化率(ECAR；量測由乳酸分泌導致培養基中之pH變化引起之醣解)(B)。

圖3描繪外源性MOTS3治療對粒線體呼吸之影響。處理每種藥物以測試在圖表頂部所述之特異性代謝參數；亦即寡黴素-ATP轉換、FCCP-最大呼吸量、魚藤酮-非ATP呼吸。

圖4描繪MOTS3過度表現藉由轉染對粒線體活性之影響。在細胞中選殖且表現各種形式之MOTS3。

圖5描繪外源性MOTS3之影響。

圖6描繪外源性MOTS3治療對葡萄糖吸收及醣解之影響。

圖7展示在治療96小時後，MOTS3(M3)與對照組(C)相比顯著誘發AMPK活化。此與圖6中在治療96小時後培養基中葡萄糖可用性之急劇減少相關。

圖8展示MOTS3使葡萄糖培養基中之細胞增殖及存活延遲，但在半乳糖培養基中未延遲，半乳糖培養基促使細胞主要依賴於粒線體功能存活。

圖9描繪MOTS3之細胞內表現對細胞增殖之影響。MOTS3經選殖至表現載體中且轉染至細胞中。

圖10描繪外源性MOTS 3對細胞衰老之影 響。藉由衰老相關之β-半乳糖苷酶水準來確定衰老(藍色)。

圖11展示MOTS3使體重及肝臟粒線體呼吸量降低。小鼠體內注射4天MOTS 3(腹膜內；每天0.5及5.0mg/kg)使體重顯著降低，但不改變食物攝取。肝臟粒線體呼吸量在兩種劑量之MOTS3下亦減少

圖12說明經MOTS3治療4天之小鼠展示降低之血糖水準(A)及升高之胰島素水準(B)。

圖13描述MOTS-c係一種在粒線體基因組中編碼之新穎肽。a，MOTS-c在粒線體基因組之12S rRNA中編碼為51bp開放閱讀框(ORF)。使用粒線體遺傳密碼產生串聯啟始/終止密碼子，而細胞質遺傳密碼產生活肽。b，cDNA末端之3’快速擴增(3’RACE)展示MOTS-c與人體肽轉錄體經聚腺苷酸化。c，比較在粒線體DNA(mtDNA)中編碼之MOTS-c與在經由進化自mtDNA(NUMT)轉移之核DNA中編碼之肽。d-e，經由長期暴露於低劑量之溴化乙錠(EtBr)而不含粒線體DNA之HeLa ρ0細胞具有不可偵測水準之以下各物：d，由qRT-PCR偵測之12S rRNA及MOTS-c轉錄體及e，粒線體編碼之蛋白細胞色素C氧化酶I及II(COI/II)以及MOTS-c，但通常表現藉由免疫墨點法偵測之核編碼之GAPDH。f，在HEK293細胞中免疫染色之MOTS-c(綠色)及hsp60(紅色)。比例尺，20μm。g-h，在g，小鼠體內之各種組織中及h，在人類及嚙齒動物之循環(血漿)中偵測MOTS-c。i- j，禁食(一種代謝應激)改變內源性MOTS-c在小鼠體內之i，組織及j，血漿中之表現。資料以平均值±SEM表示。斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖14描述MOTS-c調節基因表現且經由AICAR與AMPK信號轉導調節代謝。a，在MOTS-c治療(10μM；N=6)4小時及72小時後對HEK293細胞之主要組分分析(PCA)。b，對基因集富集之參數分析(PAGE)進一步展示時間依賴性之總體基因表現變化(N=6)。c，根據時間點(N=6)展示描繪上調基因(紅色)與下調基因(藍色)之文氏圖(Venn diagram)。d，對HEK293細胞(10μM；N=6)以MOTS-c治療72小時對各種基因集關於代謝及發炎之影響。e，MOTS-c對從頭嘌呤生物合成之影響。戊醣磷酸途徑(PPP)及NAD⁺注入從頭嘌呤生物合成途徑中(N=5)。藉由微陣列分析確定4小時與72小時之MOTS-c改變之酶(圖18b)。GAR：甘胺醯胺核糖核苷酸，FGAM：N-甲醯基甘胺脒核糖核苷酸，AIR：胺基咪唑核糖核苷酸，NCAIR：N5-羧基胺基咪唑核糖核苷酸，SAICAR：N-琥珀酸甲醯胺-5-胺基咪唑核糖核苷酸。顏色指示MOTS-c引起之變化；紅色：上調，藍色：下調，且灰色：未量測。f，穩定地過度表現MOTS-c之HEK293顯著增加AICAR水準(N=5)。g，展示在穩定過度表現MOTS-c之HEK293細胞中之從頭嘌呤生物合成途徑之代謝中間物(N=5)。h，AICAR係AMPK之有效活化劑。MOTS-c使AMPK活化且其下游途徑控制脂肪酸氧化(ACC與CPT-1)及葡萄糖吸 收(GLUT-4)。i，MOTS-c以時間及劑量依賴性方式促進AMPK與Akt磷酸化作用。資料以平均值±SEM表示。斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖15描述MOTS-c協調細胞葡萄糖、粒線體及脂肪酸代謝。在MOTS-c治療(10μM；N=6)後量測細胞培養基中之：a，葡萄糖及b，乳酸鹽。c，由代謝組學偵測MOTS-c依賴性之醣解中間物變化。d，藉由細胞外酸化率(ECAR)(N=6)測定即時醣解通量。藉由分別以葡萄糖、寡黴素及2-去氧葡萄糖攻擊細胞來評估醣解、醣解能力及醣解保留。e-f，在MOTS-c治療(N=6)後量測即時耗氧速率(OCR)。e，藉由以寡黴素及FCCP攻擊細胞評估ATP轉換及最大呼吸量，且f，計算多餘呼吸量、質子洩露及耦合效率。g，展示由代謝組學確定之MOTS-c治療後之TCA中間物(N=5)。h，在葡萄糖或半乳糖培養基下MOTS-c治療後對細胞數計數。半乳糖驅使哺乳動物細胞依賴於粒線體代謝(N=6)。如由代謝組學(N=5)所確定，MOTS-c誘使細胞內i，醯基-肉毒鹼穿梭，j，必需脂肪酸及k，β-氧化中間物肉豆蔻醯CoA發生變化。資料以平均值±SEM表示。斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖16描述MOTS-c調節小鼠之重量、代謝穩態及胰島素敏感度。a，以MOTS-c(每天5mg/kg；IP；BID)急性治療4天對遠親雜交CD-1雄性小鼠(N=6)中之主要脂肪因數IL-6與TNFα之循環水準的影響。b-f，對8 周大之雄性CD-1小鼠餵飼高脂肪飲食(以卡路里計60%)或匹配之對照飲食(N=10)。每天經腹膜內注射MOTS-c(每天0.5mg/kg)。b，體重，c，血糖，d，胰島素，e，肝臟H&E染色，f，骨骼肌AMPK磷酸化作用及GLUT4水準。g，以MOTS-c急性治療(每天5mg/kg；IP)7天對在雄性C57BL/6小鼠(N=7)上進行之腹膜內葡萄糖耐受性測試(IPGTT)的影響。h-j，對以高脂肪飲食(以卡路里計60%)餵飼且經MOTS-c(每天5mg/kg；IP)治療7天之C57BL/6小鼠(N=6至8)進行血糖正常性-高血糖鉗定。h，反映全身胰島素敏感性之葡萄糖輸注速率(GIR)，i，主要反映肌肉胰島素敏感性之胰島素刺激之葡萄糖清除速率(IS-GDR)，及j，肝臟之葡萄糖產量(HGP)。k-l，年幼(4個月)及老年(32個月)小鼠(N=3-4)體內之MOTS-c含量在k，骨骼肌及l，循環(血清)中下降。m，急性MOTS-c治療7天(每天5mg/kg；IP)對胰島素刺激之(60μU/ml)2-去氧葡萄糖吸收至年幼(3個月)與較大(12個月)雄性C57BL/6小鼠(N=6)之比目魚肌中的影響。n，對於MOTS-c作用之提議模型。資料以平均值±SEM表示。斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖17描述a，MOTS-c肽序列高度保守。b，MOTS-c之假定轉譯後修飾。c，產生MOTS-c抗體且藉由免疫墨點法測試針對MOTS-c之特異性。西方墨點法展示來自經pEV、pMOTS-c、pMOTS-c-EGFP、pEGFP轉染之HEK293細胞的MOTS-c偵測。d，以抗MOTS-c抗體單獨 (綠色)或在MOTS-c肽存在下(阻斷)對HEK293細胞進行染色。e，HEK293細胞中之MOTS-c(綠色)與hsp60(紅色)免疫染色。以Hoechst 33258對核進行染色(藍色)。比例尺，20μm。f，內部MOTS-c ELISA之標準曲線，其用於量測血漿中之MOTS-c。

圖18描述MOTS-c對從頭嘌呤生物合成途徑(N=5)之影響。a，MOTS-c治療(10μM；治療後24小時及72小時)調節HEK293細胞中之從頭嘌呤生物合成途徑。b，如由微陣列及獨創性途徑分析(IPA)(N=6)所測定，MOTS-c治療(10μM)改變在從頭嘌呤生物合成中所涉及之途徑之基因表現。參見圖14e關於代謝組學分析之覆蓋圖。紅色：上調，綠色：下調。各組之間在同一時間點內之斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖19描述MOTS-c對腺苷酸系統組分與菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)循環組分之影響。HEK293細胞中穩定地過度表現MOTS-c之a，ATP、ADP、AMP及環狀AMP(cAMP)水準與b，NAD⁺及NADH水準。EV：經空載體穩定轉染之HEK293。斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖20描述如由代謝組學(N=5)所測定，MOTS-c對穩定地過度表現MOTS-c之HEK293細胞中之a，嘌呤代謝及b，輔助因數及維生素代謝之組分的影響。EV：經空載體穩定轉染之HEK293。

圖21描述在經MOTS-c(10μM；72小時)治療 之HEK293細胞(N=3)中，如由螢光葡萄糖類似物2-NBDG所測定，MOTS-c對a，穩定地過度表現MOTS-c之HEK293細胞(N=6)中之葡萄糖與乳酸鹽之細胞外(培養基)水準及b，細胞內葡萄糖吸收率的影響。斯氏t檢定。***P<0.001。

圖22描述如由代謝組學(N=5)所測定，MOTS-c對穩定地過度表現MOTS-c之HEK293細胞中之各種糖受質代謝的影響。EV：經空載體穩定轉染之HEK293。

圖23描述如由代謝組學(N=5)所測定，在HEK293細胞中以外源性MOTS-c(10μM)治療24小時或72小時後的a，醣解及b，戊醣磷酸途徑(PPP)之中間代謝物，以及c，在穩定地過度表現MOTS-c之HEK293細胞中之PPP之中間代謝物。EV：經空載體穩定轉染之HEK293。各組之間在同一時間點內之斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖24描述如由代謝組學(N=5)所測定，外源性MOTS-c治療(10μM；24小時或72小時)對HEK293細胞中之三羧酸(TCA)循環中間物含量之影響。各組之間在同一時間點內之斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖25描述各種MOTS-c表現純系對HEK293細胞(N=12)中之耗氧速率(OCR)的影響。MOTS-c-HA：在N末端以HA標記之MOTS-c；MOTS-c-IRES-GFP：選殖 於經由內部核糖體進入位點(IRES)獨立地表現GFP之表現載體中之MOTS-c；MOTS-c-HA-IRES-GFP：選殖於具有IRES-GFP之表現載體中之MOTS-c-HA。斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖26描述藉由麩胱甘肽系統之狀態確定細胞之氧化還原平衡。在a，穩定地過度表現MOTS-c之HEK293細胞及b，經外源性MOTS-c(10μM)治療24小時或72小時(N=5)之HEK293細胞中測定還原形式之麩胱甘肽(GSH)與氧化形式之麩胱甘肽(GSSG)、其比率(GSH/GSSG)及總麩胱甘肽含量(GSH+GSSG)，EV：經空載體穩定轉染之HEK293。斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01。

圖27描述MOTS-c對脂質代謝之影響。a，MOTS-c調節穩定地過度表現MOTS-c之HEK293細胞中之脂質代謝。外源性MOTS-c治療(10μM；24小時或72小時)調節b，肉毒鹼穿梭系統成員、c，必需脂肪酸及d，β-氧化中間物肉豆蔻醯-CoA之含量。斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖28描述如由代謝組學(N=5)所測定，在a，穩定地過度表現MOTS-c之HEK293細胞及b，經外源性MOTS-c(10μM)治療24小時或72-小時之HEK293細胞中之長鏈脂肪酸含量。EV：經空載體穩定轉染之HEK293。斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖29描述急性MOTS-c(每天5mg/kg；IP； BID)治療4天對CD-1雄性小鼠(N=6)之a，體重改變(%)、b，食物攝取、c，血糖及d，脂肪因數的影響。e-f，MOTS-c(每天0.5mg/kg)對餵飼高脂肪飲食(以卡路里計60%)歷時8周之小鼠之e，每天食物攝取及f，總食物/熱量攝取的影響。各組之間在同一時間點內之斯氏t檢定。*P<0.05，**P<0.01。

圖30描述關於經MOTS-c(10μM)治療72小時之HEK293細胞(N=6)之微陣列資料。參見圖14d。

圖31描述在外源性MOTS-c治療(10μM)後24小時及72小時具有顯著(P 0.05)及邊緣顯著(0.05<P<0.1)變化或穩定地過度表現MOTS-c或空載體(EV)(N=5)之HEK293細胞中之生物化學物質(代謝物)的總數。紅色：增加，藍色：減少。韋爾奇雙樣本t測試(Welch’s Two Sample t-test)。

圖32描述來自圖16 h-j中之血糖正常性-高胰島素血性鉗定研究之代謝參數及循環因數。斯氏t檢定。

圖33描述6天禁食血糖。追蹤ZDF糖尿病大鼠直至其血糖>300ng/ml，此時以兩種劑量之一之MOTS-c或胰島素起始治療，在8 AM經IV給藥歷時6天。每組使用6只大鼠。6天後量測禁食血糖。ANOVA及斯氏t檢定用於分析及p值。

圖34描述第6天時血糖之絕對變化。在圖33所述之同一實驗中，展示血糖之絕對變化。經鹽水治療之 ZDF大鼠展示其血糖進一步升高100ng/ml。每天經胰島素治療之大鼠其血糖穩定在與基線類似之水準，而經MOTS-c治療之大鼠(每400克大鼠1mg)展示其血糖實質上降低。

圖35描述由葡萄糖吸收及乳酸鹽產量增加證實，MOTS-c刺激醣解通量。在穩定地過度表現MOTS-c之HEK293細胞(N=6)之培養基中之細胞外(A)葡萄糖及(B)乳酸鹽。

圖36描述MOTS-c增強活體外細胞葡萄糖通量且急性治療減少正常飲食餵飼之小鼠體內之葡萄糖含量。為測試胰島素敏感性，吾人歷時7天經腹膜內注射MOTS-c(每天5mg/kg)來治療小鼠且隨後使雄性C57BL/6小鼠(N=7)經受葡萄糖耐受性測試(GTT；1g/kg葡萄糖)。吾人發現葡萄糖清除率顯著增強，表明胰島素敏感性改良。

圖37描述測試MOTS-c(每天0.5mg/kg；IP)在高脂肪飲食(HFD以卡路里計60%)(N=10)之情形下對代謝之影響。儘管在餵飼正常飲食時，MOTS-c治療對體重無影響，但在餵飼HFD之小鼠中明顯防止肥胖(A)。(B-C)此體重差異並非歸因於食物攝取，因為各組之間之熱量攝取相同。(D-E)另外，MOTS-c治療防止HFD誘發之高胰島素血症，表明葡萄糖穩態得以改良。(F)由肝臟H&E染色所確定，MOTS-c亦減少HFD誘發之脂肪肝。

圖38描述測試MOTS-c(每天5.0mg/kg；IP) 對來自不同遺傳背景之小鼠C57BL/6(N=12)之高脂肪飲食(HFD，以卡路里計60%)的影響。(A)類似於CD-1小鼠，MOTS-c治療預防餵飼HFD之C57BL/6小鼠之肥胖症。(B)增重減少可能部分歸因於內臟脂肪之含量減少。(C)此體重差異並非由於食物攝取較少。此外，MOTS-c治療預防HFD誘發之高胰島素血症，表明葡萄糖穩態得以改良(D-E)。ND：正常飲食，HFD：高脂肪飲食。

圖39展示MOTS-c對全身代謝之影響，以MOTS-c(每天5mg/kg；BID，4天)或媒劑對照物(N=6)治療以正常飲食餵飼之遠親雜交CD-1雄性小鼠。以MOTS-c治療(4天)使體重、食物及血糖含量降低。在肥胖症及胰島素抗性之發病原理中涉及之循環IL-6與TNFα(A)之基礎含量亦因MOTS-c治療而顯著減少。

圖40展示已知癌細胞具有錯亂代謝以支撐其猛烈生長。MOTS-c係代謝穩態之調節劑，且影響惡性細胞之增殖能力。穩定地過度表現MOTS-c之乳癌細胞(4T1)展示(A)增殖速率減小及(B)呼吸減少。又，(C)MOTS-c治療在皮下同種異體移植小鼠模型中延緩乳癌(4T1)增殖；(D)如維持穩定體重所反映，MOTS-c治療無毒性。

圖41展示類似於乳癌，MOTS-c亦延緩前列腺癌細胞之生長。(A)MOTS-c治療延緩活體外前列腺癌細胞(22Rv1)增殖。(B-C)MOTS-c治療在皮下同種異體移植小鼠模型中亦延緩前列腺癌(22Rv1)增殖；(D)如維持穩 定體重所反映，MOTS-c治療無毒性。

圖42描述MOTS-c治療以劑量依賴性方式活體外延緩4種不同前列腺癌細胞株之增殖。MTT降低用以評估細胞增殖且呈現相對於對照物之相對量(RQ)。將細胞在最佳生長條件下處理48至72小時。

定義

便利起見，下文提供說明書、實例及隨附申請專利範圍中所用之某些術語及短語之含義。

如本文所用，術語「糖尿病」係指特徵在於胰島素產量及葡萄糖耐受性受損之廣泛病症種類。糖尿病包括1型及2型糖尿病(亦分別稱為青少年及成人發作型)、妊娠糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性、代謝症候群及葡萄糖耐受不良。常見症狀包括尿頻、煩渴、極餓、異常體重減少、疲勞感增加、易怒及視力模糊。下文中更詳細描述對該等個別病症之診斷。

I型糖尿病亦稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、1型糖尿病及青少年糖尿病。該等術語在本文中可互換使用。下文中更詳細描述對該疾病之治療及診斷。

「胰臟β細胞」、「β胰島細胞」及類似術語係指在胰島(Islets of Langerhans)中發現之胰臟內分泌細胞群。β胰島細胞產生且向血流中分泌胰島素及胰澱素。

如本文所用，「改良細胞存活率」係指與對 照物相比，在給定條件下存活之細胞數目增加，例如在不存在治療之情形下在相同條件下存活之細胞數目。條件可為活體外、活體內、離體或原位。改良之細胞存活率可表述為比較值，例如若細胞存活率改良兩倍，則兩倍之多之細胞存活。細胞存活率改良可起因於細胞凋亡減少、細胞壽命增加或細胞功能及條件改良。在一些實施例中，細胞存活率與對照水準相比改良5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，細胞存活率係對照水準之兩倍、三倍、四倍、五倍或十倍。或者，細胞存活率改良可表述為細胞凋亡之減少百分比。在一些實施例中，舉例而言，細胞凋亡與對照樣本相比減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或高達100%。

如本文所用之術語「預防病症」並非欲為絕對術語。相反，例如預防1型糖尿病係指延遲病症發作、降低病症症狀之頻率或降低與此病症相關之症狀的嚴重性。因此，預防係指將為熟習此項技術者所瞭解之廣泛範圍的預防措施。在一些情形下，使症狀之頻率及嚴重性降低至非病理學水準，例如以便個體無需傳統之胰島素替代療法。在一些情形下，接受本發明組合物之個體症狀與未經治療之該病症個體所經歷之症狀相比僅為90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%頻繁或嚴重。

類似地，術語「治療病症」並非為絕對術 語。在一些態樣中，本發明之組合物試圖減少導致糖尿病症狀之胰島素產生細胞的損失。在一些情形下，治療導致預後改良或症狀之頻率或嚴重性降低。

如本文所用，術語「需要治療或預防之個體」係指經診斷患有1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性//代謝症候群或葡萄糖耐受不良之個體或存在發展任何該等病症風險之個體。需要治療之個體亦包括經歷影響胰臟之損傷、疾病或外科手術之彼等個體或另外其製造胰島素之能力受損之個體。該等個體可為任何哺乳動物，例如人類、狗、貓、馬、豬、綿羊、牛、小鼠、大鼠、兔或靈長類動物。

如本文所用，術語「序列一致性百分比」係藉由在一比較窗上比較兩個最佳對準之序列來測定，其中比較窗中之聚核苷酸序列部分與參考序列(例如，本發明之多肽)相比可包含添加或缺失(亦即，間隙)以用於兩個序列之最佳對準，該參考序列不包含添加或缺失。藉由測定相同核酸鹼基或胺基酸殘基在兩個序列中出現之位置數目以產生匹配位置數目，以匹配位置之數目除以比較窗中之位置總數且結果乘以100以產生序列一致性百分比來計算此百分比。

如本文所用，在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之情形下之術語「相同」或「一致性百分比」係指為相同序列之兩個或兩個以上序列或子序列。當在如使用以下序列比較演算法之一或藉由手動對準並視覺觀察所量測 之比較窗指定區域或在未指定之整個序列上進行比較及對準以實現最大對應時，若兩個序列具有規定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即，在規定區域上或在未規定時在整個序列上60%之一致性，視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之一致性)，則序列係「實質上一致的」。本發明提供與本文例示之多肽(例如，人體肽)實質上一致、或包含與本文例示之多肽實質上一致之序列的多肽或編碼多肽之聚核苷酸。此定義亦係指核苷酸測試序列之補體。

「糖尿病前期個體」係指禁食血糖含量大於110mg/dl但小於126mg/dl或2小時PG讀數大於140mg/dl但小於200mg/dl之成人。「糖尿病個體」係指禁食血糖含量大於126mg/dl或2小時PG讀數大於200mg/dl之成人。

引言

十年前，由阿茲海默氏病患者大腦之未受感染部分構建之cDNA庫選殖了第一種源自粒線體之肽(MDP)，即人體肽(HN)，且映射為粒線體16s rRNA基因座。HN已證實係一種細胞保護及抗細胞凋亡因數(Bachar,A.R.等人，(2010).Humanin is expressed in human vascular walls and has a cytoprotective effect against oxidized LDL-induced oxidative stress.Cardiovascular research 88,360-366；Guo,B.等人，(2003).Humanin peptide suppresses apoptosis by interfering with Bax activation.Nature 423,456-461；Hashimoto,Y.等人，(2001).A rescue factor abolishing neuronal cell death by a wide spectrum of familial Alzheimer's disease genes and Abeta.Proc Natl Acad Sci USA 98,6336-6341；Hoang,P.T.等人，(2010).The neurosurvival factor Humanin inhibits beta-cell apoptosis via signal transducer and activator of transcription 3 activation and delays and ameliorates diabetes in nonobese diabetic mice.Metabolism：clinical and experimental 59,343-349；及Ikonen,M.等人(2003).Interaction between the Alzheimer’s survival peptide humanin and insulin-like growth factor-binding protein 3 regulates cell survival and apoptosis.Proc Natl Acad Sci USA 100,13042-13047)。現有超過130個公開案描述HN生物學之各種態樣。

構建前述觀察，經由電腦模擬發現另一種在12S rRNA中編碼且已命名為MOTS3(12 S rRNA中之粒線體開放閱讀框)之MDP且在本文中揭示(表1)。

如本文所報導，MOTS3藉由調節粒線體功能/代謝及葡萄糖利用來改變細胞代謝狀態。此具有極大潛力應用於各種疾病中，粒線體在該疾病之發病原理或維護/ 進程中具有重要作用，諸如癌症、糖尿病、脂肪肝、神經退化性疾病、高血壓及老化。

此外，粒線體功能障礙在神經退化性病症，包括阿茲海默氏病(AD)以及高血壓之病理學中具有重要作用。

在癌症中，粒線體係用於生物合成前驅體生產以供應其特性猛烈增殖之重要胞器，其可因MOTS3依賴性粒線體功能抑制作用及減少之細胞增殖而抵消(Ward及Thompson,(2012)Metabolic reprogramming：a cancer hallmark even warburg did not anticipate.Cancer cell 21,297-308)。

諸如肥胖症及脂肪肝之代謝疾病亦可由MOTS3來治療，此係因為其在相同量之食物消耗下可有效調節體重及肝臟粒線體呼吸(圖11)。在糖尿病中，使5′-單磷酸腺苷(AMP)活化之蛋白激酶(AMPK)活化之藥物(諸如二甲雙脈及AICAR)已充分記載調節葡萄糖穩態且目前用於臨床中(Zhang等人，(2009)AMPK：an emerging drug target for diabetes and the metabolic syndrome.Cell metabolism 9,407-416)。因此，MOTS3亦係AMPK之強活化劑(圖6)以及葡萄糖含量之重要調節劑(圖12A)，且因此可用於治療糖尿病。

糖尿病

II型糖尿病(非胰島素依賴性糖尿病)係一種尤 其在發達國家快速增加之常見代謝病症。其特徵可在於胰島素抗性、胰島素不足及高血糖症。與II型糖尿病相關之因素包括膽固醇升高、肥胖症及高血壓。

II型糖尿病可能多年無法診斷，因為症狀可係偶發性的且必定比與I型糖尿病相關之症狀輕微。然而，未經治療之II型糖尿病患者體內之血糖含量升高可導致腎臟、眼睛及心血管系統功能受損。

此外，II型糖尿病可由補償胰島素抗性之β細胞衰竭導致。高熱量飲食及肌肉工作不足似乎係在肥胖症及II型糖尿病之發病原理中所涉及之重要環境因素。環境因素似乎經由兩種主要標靶作用。一種係如在大多數組織中由胰島素及其他激素所調節對葡萄糖、脂肪酸及其他代謝物進行加工，且另一種係β細胞功能。

肥胖症已成為一種主要之公共健康問題。由肥胖症引起或加劇之健康病況包括高血壓、糖尿病、睡眠呼吸中止、肥胖症相關之換氣不足、背部及關節問題、心血管疾病、非酒精性脂肪肝疾病及胃食道回流疾病。

身體質量指數(BMI)(以千克計之重量除以以公尺計之高度之平方來計算)係最常用接受之對於超重及/或肥胖症之量測。BMI超過25即認為超重，而肥胖症則定義為BMI為30或30以上，BMI為35或35以上則認為係嚴重共病且BMI為40或40以上則認為係病態肥胖症。

I型糖尿病係一種自體免疫疾病，其特徵在於 在淋巴細胞浸潤胰島後，胰腺β細胞漸進性破壞。此導致胰島素不足。

細胞凋亡係在1型糖尿病發展期間β細胞死亡之主要模式(O’Brien等人(1997)Diabetes 46：750-57)。IL-1、TNF-α及IFN-γ係在此自體免疫反應期間由T細胞及巨噬細胞釋放且係β細胞破壞之重要媒介物(Eizirik及Mandrup-Poulsen(2001)Diabetologia 44：2115-2133)。

胰島素樣生長因數結合蛋白-3(IGFBP-3)以與其IGF結合無關之方式誘發細胞凋亡(Rajah等人(1997)J Biol Chem.272：12181-88)。促炎性Th1細胞激素增加內源性IGFBP-3之核內聚集且向β細胞中加入外源性IGFBP-3誘發細胞凋亡(Shim等人(2004)Growth Norm IGF Res.14：216-25)。IGFBP-3係包括胰島素、瘦素、脂聯素及抵抗素之多種肽之一，其已證實在中樞神經系統中用於調節葡萄糖代謝(Muse等人(2007)J Clin Invest.117：1670-78；Obici等人(2002)Nat Med 8：1376-82)。在胰島移植後亦發生細胞凋亡引起之β細胞損失(Paraskevas等人(1999)FEBS Lett.455：203-8)；Tobiasch等人(2001)J Investig Med.49：566-71)。近期研究表明，分離之人類胰島以高於抗細胞凋亡蛋白Bcl-2之水準來表現促細胞凋亡蛋白Bax(Thomas等人(2002)Transplantation 74：1489)。

在美國，超過一百萬人患有I型糖尿病。根據美國糖尿病協會，該疾病每年導致數以千計之死亡且每年花費超過200億美元。需要可用於I型糖尿病之有效治 療劑或預防劑。

需要研發用以治療及預防I型及II型糖尿病之方法。因此，在本發明之某些實施例中，MOTS3及其醫藥組合物可用於治療及預防I型及II型糖尿病。

癌症

癌症係對現代社會之嚴重威脅。世界範圍內，每年有超過1000萬人經診斷患有癌症且估計到2020年此數值將增長至每年1500萬新病例。世界範圍內，癌症每年導致600萬例死亡或12%的死亡。

惡性癌症生長由於其獨特特徵而對現代醫學提出嚴重挑戰。其特徵包括不可控之細胞增殖導致未經調節之惡性組織生長、能夠侵襲局部以及甚至遠端組織、缺乏分化、缺乏可偵測之症狀且最顯著地缺乏有效治療及預防。

癌症可在任何年齡、任何器官之任何組織中發展。癌症之病因學尚未明確定義，但諸如遺傳易感受性、染色體斷裂病症、病毒、環境因素及免疫病症之機制均與惡性細胞生長及轉型有關。癌症涵蓋一大類醫學病況，在全世界範圍內影響數以百萬計之個體。癌症細胞可在身體之幾乎任何器官及/或組織中出現。當一部分身體內之細胞開始不受控制地生長或分化時，即發生癌症。所有癌症類型均由異常細胞不受控制生長開始。

存在多種類型之癌症，包括(但不限於)腦癌、 結腸癌、黑素瘤、白血病(例如，AML)、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌。

目前，一些可用之主要治療係外科手術、輻射治療及化學治療。外科手術常係一種劇烈措施且可具有嚴重後果。舉例而言，對於卵巢癌之所有治療均可導致不孕。對於子宮頸癌及膀胱癌之一些治療可導致不孕及/或性功能障礙。用於治療胰腺癌之外科手術程式可導致部分或完全移除胰腺且可對患者存在顯著風險。乳癌外科手術總是涉及移除部分或整個乳房。用於前列腺癌之一些外科手術程式存在尿失禁及陽萎風險。用於肺癌患者之程式常具有顯著之術後疼痛，因為必須切斷肋骨以到達及移除癌肺組織。另外，患有肺癌與另一種肺部疾病(諸如肺氣腫或慢性支氣管炎)之患者在外科手術後通常經歷呼吸短促增加。輻射治療具有殺死癌細胞之優勢，但其同時亦損害非癌組織。化學治療涉及向患者投與各種抗癌藥物，但常伴隨有害副作用。

因此，仍需要可治療及預防癌症之方法。該等方法可為適用於預防及治療人類及其他哺乳動物之癌症的醫藥組合物提供基礎。因此，在本發明之某些實施例中，MOTS3及其醫藥組合物可用於治療及預防癌症。特定而言，作為非限制性實例，MOTS3及其醫藥組合物可用於治療及預防腦癌、結腸癌、黑素瘤、白血病(例如，AML)、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌。

脂肪肝及肥胖症

脂肪肝，亦稱為脂肪肝疾病(FLD)，係一種在肝臟中聚集三酸甘油酯脂肪液泡之可逆病況。脂肪在肝細胞中聚集之過程稱為脂肪變性。

肥胖症係描述具有過多體脂之通用術語。當受試者吸收之卡路里多於其可燃燒之卡路里，導致脂肪存儲時，即發生肥胖症。肥胖症係由吸收比受試者所需更多之卡路里而未進行充足運動所導致。用於評估肥胖症之兩種最常用方法係身體質量指數(BMI)及腰圍。BMI係使用高度及重量來計算。高BMI(亦即，肥胖症)使II型糖尿病、心臟病及中風之風險增加。

因此，仍需要可治療及預防脂肪肝疾病及肥胖症之方法。因此，在本發明之某些實施例中，MOTS3及其醫藥組合物可用於治療及預防脂肪肝疾病及肥胖症。

多肽之表現及純化

本發明之天然產生之合成或重組多肽可經純化以用於組合物及功能分析中。本發明之天然產生之多肽可由任何來源純化。重組多肽可由任何適合之表現系統(例如，哺乳動物、昆蟲、酵母或細菌細胞培養物)純化。

本發明之肽(亦即，MOTS3及MOTS3類似物)可包括修飾肽及合成肽類似物。在一些實施例中，肽係與SEQ ID NO：1具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或100%一致性之肽。在一些實施例中，肽係包含 SEQ ID NO：1之肽。在一些實施例中，肽係SEQ ID NO：1。如本文所述之肽可經修飾以改良調配及儲存特性，或藉由合併有非肽結構以保護不穩定之肽鍵。本發明之肽可使用此項技術中已知之方法來製備。舉例而言，肽可藉由化學合成產生，例如使用固相技術及/或自動肽合成器。在某些情形下，可使用固相策略，在自動多重肽合成器(Abimed AMS 422)上使用9-茀基甲氧羰基(Fmoc)化學物來合成肽。隨後可藉由逆相HPLC來純化肽且凍乾。

對於重組方法而言，本發明包括編碼本文揭示之多肽之分離核酸、包含核酸之表現載體及包含表現載體之宿主細胞。更特定而言，本發明提供編碼MOTS3肽及具有MOTS3活性之MOTS3肽類似物之分離核酸，該等肽包括(但不限於)SEQ ID NO：1。在一些實施例中，本發明包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或100%一致性之肽的cDNA分子。在一些實施例中，本發明包含編碼SEQ ID NO：1之cDNA分子。在一些實施例中，本發明包含與SEQ ID NO：2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或100%一致性之cDNA。

當重組蛋白通常在啟動子誘發後由大量轉型細菌表現時，儘管表現可為構成性的，但蛋白仍可形成不溶性聚集體。存在若干種方案適用於純化蛋白包涵體。舉例而言，聚集體蛋白(下文中稱為包涵體)之純化通常包括藉由通常(但不限於)在約100-150μg/ml溶菌酶與0.1% Nonidet P40(一種非離子性清潔劑)之緩衝液中培育來破壞細菌細胞，從而來萃取、分離及/或純化包涵體。細胞懸浮液可使用Polytron研磨器(Brinkman Instruments,Westbury,N.Y.)來研磨。或者，細胞可在冰上經音波處理。溶解細菌之替代方法在前文之Ausubel等人及Sambrook等人中描述且將為熟習此項技術者顯而易見。

通常使細胞懸浮液離心且使含有包涵體之顆粒物再懸浮於不溶解但洗滌包涵體之緩衝液中，例如20mM Tris-HCl(pH 7.2)、1mM EDTA、150mM NaCl及2% Triton-X 100(一種非離子性清潔劑)。可能有必要重複洗滌步驟以移除盡可能多之細胞碎屑。其餘包涵體顆粒物可再懸浮於適當緩衝液(例如，20mM磷酸鈉，pH 6.8，150mM NaCl)中。其他適當緩衝液將為熟習此項技術者顯而易見。

在洗滌步驟之後，藉由添加作為強氫受體與強氫供體之溶劑(或各自具有該等特性之一之溶劑組合)來溶解包涵體。形成包涵體之蛋白隨後可藉由以相容性緩衝液稀釋或滲析來復性。合適溶劑包括(但不限於)尿素(約4M至約8M)、甲醯胺(至少約80%，基於體積/體積計)及脈鹽酸鹽(約4M至約8M)。能夠溶解聚集體形成蛋白之一些溶劑，諸如SDS(十二烷基硫酸鈉)及70%甲酸，不適用於此程式，因為蛋白可能發生不可逆變性，伴隨缺少免疫原性及/或活性。儘管脈鹽酸鹽及類似試劑係變性劑，但該變性並非不可逆且經移除(例如，藉由滲析)或稀釋變 性劑可發生復性，使得可再形成所關注之免疫活性及/或生物活性蛋白。溶解後，可藉由標準分離技術自其他細菌蛋白分離蛋白。

或者，可能自細菌周質純化蛋白。當蛋白輸出至細菌周質中時，除熟習此項技術者已知之其他方法以外，可藉由冷滲壓衝擊來分離細菌之周質部分(參見Ausubel等人，上文)。為自周質分離重組蛋白，使細菌細胞離心以形成顆粒物。使顆粒物再懸浮於含有20%蔗糖之緩衝液中。為溶解細胞，使細菌離心且使顆粒物再懸浮於冰冷之5mM MgSO₄中並在冰浴中保持約10分鐘。使細胞懸浮液離心且將上清液傾析並保存。可藉由熟習此項技術者熟知之標準分離技術自宿主蛋白分離上清液中存在之重組蛋白。

本發明之多肽可藉由標準技術純化至實質性純度，包括以諸如硫酸銨之物質選擇性沈澱；管柱層析、免疫純化方法及其他(參見例如，Scopes,Protein Purification：Principles and Practice(1982)；美國專利第4,673,641號；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊)；及Sambrook等人MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，(1989))。

在純化多肽時可採用多種程式。舉例而言，可使用離子交換或免疫親和性管柱來純化多肽。

常作為初始步驟，且若蛋白混合物複雜，則 初始鹽析法可自所關注之重組蛋白分離多種不需要之宿主細胞蛋白(或源自細胞培養基之蛋白)。較佳之鹽係硫酸銨。硫酸銨藉由有效減少蛋白混合物中之水量使蛋白沈澱。蛋白隨後基於其溶解度沈澱。蛋白之疏水性愈大，則愈可能在較低之硫酸銨濃度下沈澱。一種典型方案係向蛋白溶液中添加飽和硫酸銨以使得所得硫酸銨濃度在20%至30%之間。此將使大部分疏水性蛋白沈澱。丟棄沈澱物(除非所關注蛋白係疏水性的)且向上清液中添加硫酸銨至已知使所關注蛋白沈澱之濃度。隨後使沈澱物溶解於緩衝液中且若必要，則經由滲析或透析移除多餘鹽。依賴於蛋白溶解度之其他方法(諸如冷乙醇沈澱)係為熟習此項技術者所熟知且可用於分餾複雜之蛋白混合物。

基於計算之分子量，可使用經由具有不同孔徑之膜(例如，Amicon或Millipore膜)進行超濾來分離具有更大及更小尺寸之蛋白。作為第一步驟，經由孔徑具有比所關注蛋白之分子量較低之分子量截止值的膜對蛋白混合物進行超濾。隨後針對具有大於所關注蛋白之分子量之分子截止值的膜對超濾作用之滯留物進行超濾。重組蛋白將穿過此膜進入濾液。隨後可如下所述對濾液進行層析。

所關注蛋白亦可基於其尺寸、表面淨電荷、疏水性及與配位體之親合性自其他蛋白分離。另外，抵抗蛋白之抗體可與管柱基質結合且使蛋白免疫純化。所有該等方法在此項技術中均熟知。

使用針對各種親和標籤(諸如血球凝集素 (HA)、FLAG、Xpress、Myc、六聚組胺酸、麩胱甘肽S轉移酶(GST)及其類似物)產生之抗體的免疫親和層析法可用於純化多肽。His標籤亦可充當某些金屬(例如，Ni)之螯合劑且因此該等金屬亦可用於純化含有His之多肽。純化後，視情況藉由特異性蛋白水解裂解移除標籤。

熟習此項技術者將顯而易見，可以任何規模且使用來自多個不同製造商(例如，Pharmacia Biotech)之設備來進行層析技術。

醫藥組合物

本發明之肽可視必要與合適之醫藥賦形劑一起投與。熟習此項技術者將瞭解，組合物將視投藥模式及劑量單位元而變化。

組合物通常包括習知之醫藥載劑或賦形劑且可另外包括其他藥劑、載劑、佐劑、稀釋劑、組織滲透增強劑、增溶劑及其類似物。組合物較佳將含有約0.01重量%至約90重量%、約0.1重量%至約75重量%、約0.1重量%至50重量%或約0.1重量%至10重量%之本發明之結合物或其組合，其餘由合適之醫藥載劑及/或賦形劑組成。可藉由此項技術中熟知之方法針對特定組合物及投藥途徑來定製適當之賦形劑。參見例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)。

合適賦形劑之實例包括(但不限於)乳糖、右旋 糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、水、鹽水、糖漿、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素及聚丙烯酸，諸如Carbopol，例如Carbopol 941、Carbopol 980、Carbopol 981等。組合物可另外包括潤滑劑，諸如滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油；濕潤劑；乳化劑；懸浮劑；防腐劑，諸如羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸乙酯及羥基苯甲酸丙酯(亦即，對羥苯甲酸酯)；pH調節劑，諸如無機及有機酸及鹼；甜味劑；著色劑；及調味劑。組合物亦可包含可生物降解之聚合物珠粒、葡聚糖及環糊精包涵複合物。

對於經口投藥而言，組合物可呈錠劑、糖錠、膠囊、乳液、懸浮液、溶液、糖漿、噴霧、散劑及持續釋放調配物之形式。用於經口投藥之合適賦形劑包括醫藥級別之甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂及其類似物。

在一些實施例中，醫藥組合物採用藥丸、錠劑或膠囊之形式，且因此組合物可連同結合物或結合物組合一起含有任何以下各物：稀釋劑，諸如乳糖、蔗糖、磷酸二鈣及其類似物；崩解劑，諸如澱粉或其衍生物；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂及其類似物；及結合劑，諸如澱粉、阿拉伯膠、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、纖維素及其衍生物。結合物亦可調配於例如配置於聚乙二醇(PEG)載劑中之栓劑 中。

液體組合物可藉由將結合物或結合物組合及視情況一或多種醫藥學上可接受之佐劑溶解或分散於諸如鹽水溶液(例如，0.9% w/v氯化鈉)、右旋糖水溶液、甘油、乙醇及其類似物之載劑中以形成例如用於經口、局部或靜脈內投藥之溶液或懸浮液來製備。本發明之結合物亦可調配於保留灌腸中。

對於局部投藥而言，本發明之組合物可呈乳液、洗液、凝膠、乳霜、凍膠、溶液、懸浮液、油膏及經皮貼劑之形式。對於藉由吸入傳遞而言，組合物可以乾粉或液體形式經由噴霧器傳遞。對於非經腸投藥而言，組合物可呈無菌可注射溶液及無菌封裝散劑之形式。可注射溶液較佳調配成約4.5至約7.5之pH。

本發明之組合物亦可以凍乾形式提供。該等組合物可包括緩衝劑(例如碳酸氫鹽)以供在投藥前復水，或在凍乾組合物中可包括緩衝劑以供例如以水復水。凍乾組合物可另外包含合適之血管收縮劑，例如腎上腺素。凍乾組合物可視情況與復水緩衝劑組合封裝以在注射器中提供，以便復水組合物可即刻投與患者。

一般熟習此項技術者瞭解，投與之劑量將視多種因素而變化，包括(但不限於)待投與之特定肽組合物、投藥模式、應用類型(例如，預防、治療等)、患者之年齡及患者之身體狀況。較佳應使用產生所需結果所需之最小劑量及濃度。對於兒童、老年人、體弱患者及患心臟 病及/或肝病之患者，可適當調節劑量。可由此項技術中已知之研究，使用用於評估劑量之實驗動物模型獲得進一步指引。對於特定應用而言若適當，則MOTS3或MOTS3類似物可在無過度實驗下經調配以供對哺乳動物(包括人類)投藥。另外，可使用標準劑量-反應方案，在無不當實驗之情形下確定組合物之適當劑量。

在一些實施例中，本發明之含肽組合物係以特定劑量之肽投與受試者或經調配以供以單位劑量向受試者投與肽。在一些實施例中，投與受試者之劑量係每天約0.001至約1000mg。在一些實施例中，投與受試者之劑量係每天約0.1至約500mg。在一些實施例中，投與受試者之劑量係每天約0.5至約100mg。在一些實施例中，本發明之組合物係經調配以用於單位劑量投藥，其中單位劑量係每天約0.001至約1000mg。在一些實施例中，本發明之組合物係經調配以用於單位劑量投藥，其中單位劑量係每天約0.1至約500mg。在一些實施例中，本發明之組合物係經調配以用於單位劑量投藥，其中單位劑量係每天約0.5至約100mg。

投藥方法

若必要可經由任何接受之投藥模式進行本發明之肽與合適之醫藥學賦形劑之投藥。因此，投藥例如可為靜脈內、局部、皮下、透皮、經皮、肌肉內、經口、關節內、非經腸、小動脈內、皮內、心室內、顱內、腹膜 內、病灶內、鼻內、經直腸、陰道或藉由吸入。投藥可例如經由注射直接靶向胰腺組織。

本發明之組合物可重複投與例如至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次或8次以上，或組合物可藉由連續輸注投與。合適之投藥位點包括(但不限於)真皮、黏膜、支氣管、胃腸道、肛門、陰道、眼睛及耳朵。調配物可採用固體、半固體、凍乾散劑或液體劑型之形式，諸如錠劑、藥丸、糖錠、膠囊、散劑、溶液、懸浮液、乳液、栓劑、保留灌腸、乳霜、油膏、洗液、凝膠、氣霧劑或其類似物，較佳為適合簡單投與精確劑量之單位劑型。

術語「單位劑型」係指適合作為用於人類受試者之單位元劑量之物理離散單元，每一單元含有經計算結合合適之醫藥賦形劑(例如，安瓿)產生所需啟始、耐受性及/或治療作用之預定量的活性材料。另外，可製備更濃之組合物，隨後可由其產生更稀之單位劑量組合物。更濃之組合物因此將含有實質上大於例如至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或10倍以上之量的結合物或結合物組合。

用於製備該等劑型之方法為熟習此項技術者所知(參見例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990))。欲投與之組合物含有醫藥學有效量之本發明之肽以改良β胰島細胞之存活率。另外，可使用熟習合成有機 化學技術者已知且例如March,Advanced Organic Chemistry：Reactions,Mechanisms and Structure，第4版，New York,Wiley-Interscience(1992)所述之標準程式來製備本發明之肽之醫藥學上可接受之鹽(例如，酸加成鹽)且包括於組合物中。

在另一種方法中，編碼本發明之多肽之核酸係用於活體外及活體內轉染細胞。該等核酸可插入任何多種熟知載體中以如下文所述轉染標靶細胞及生物體。將核酸經由載體與標靶細胞之相互作用離體或活體內轉染至細胞中。在啟動子之控制下，核酸隨後表現本發明之多肽，由此減輕與胰島素產量減少相關之疾病的作用。

該等基因療法程式已在許多情形下用於校正後天性及遺傳性遺傳缺陷、癌症及其他疾病。在人類體內表現人工基因之能力促使預防及/或治癒多種重要之人類疾病，包括不順從其他療法治療之多種疾病(關於基因療法程式之綜述，參見Anderson,Science,256：808-813(1992)；Nabel等人，TIBTECH,11：211-217(1993)；Mitani等人，TIBTECH,11：162-166(1993)；Mulligan,Science,926-932(1993)；Dillon,TIBTECH,11：167-175(1993)；Miller,Nature,357：455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology,6(10)：1149-1154(1998)；Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience,8：35-36(1995)；Kremer等人，British Medical Bulletin,51(1)：31-44(1995)；Haddada等人，在Current Topics in Microbiology and Immunology(Doerfler & Bohm編，1995)中；及Yu等人，Gene Therapy,1：13-26(1994))。

對於傳遞核酸而言，可使用病毒載體。合適之載體例如包括如Lilley等人，Curr.Gene Ther.,1(4)：339-58(2001)中所述之皰疹單純型病毒載體、如例如Polo等人，Dev.Biol.(Basel),104：181-5(2000)中所述之α病毒DNA及粒子複製子、如例如Mazda,Curr.Gene Ther.,2(3)：379-92(2002)中所述之基於艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus，EBV)之質體載體、如例如Otomo等人，J.Gene Med.,3(4)：345-52(2001)中所述之EBV複製子載體系統、如例如Gao等人，PNAS USA,99(18)：11854(2002)中所述之來自恆河猴之腺病毒相關病毒、如例如Nicklin等人，Curr.Gene Ther.,2(3)：273-93(2002)中所述之腺病毒及腺相關病毒載體。其他合適之腺相關病毒(AAV)載體系統可易於使用此項技術中熟知之技術來建構(參見例如，美國專利第5,173,414號及第5,139,941號；PCT公開案第WO 92/01070號及第WO 93/03769號；Lebkowski等人，Mol.Cell.Biol.,8：3988-3996(1988)；Vincent等人(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter,Current Opinion in Biotechnology 3：533-539(1992)；Muzyczka,Current Topics in Microbiol.and Immunol.,158：97-129(1992)；Kotin,Human Gene Therapy,5：793-801(1994)；Shelling等人，Gene Therapy,1：165-169(1994)；及Zhou等人，J. Exp.Med.,179：1867-1875(1994))。其他合適之載體包括例如Kim等人，Cancer Gene Ther.,9(9)：725-36(2002)中所述之E1B基因減毒複製腺病毒及例如，Pascual等人，J.Immunol.,160(9)：4465-72(1998)中所述之非複製腺病毒載體。例示性載體可如Okayama等人，Mol.Cell.Biol.,3：280(1983)所揭示來建構。

在一些實施例中，本發明包括包含編碼SEQ ID NO：1之核酸序列的表現載體。在一些實施例中，本發明包括包含編碼與SEQ ID NO：1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或100%一致性之肽之核酸序列的表現載體。在一些實施例中，本發明包括包含與SEQ ID NO：2具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或100%一致性之cDNA的表現載體。

分子結合物載體，諸如Michael等人，J.Biol.Chem.,268：6866-6869(1993)及Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：6099-6103(1992)中所述之腺病毒嵌合載體亦可根據本發明之方法用於基因傳遞。

在一說明性實施例中，逆轉錄病毒為基因傳遞系統提供便利且有效之平臺。使用此項技術中已知之技術將選定之編碼本發明之多肽之核苷酸序列插入載體中且封裝於逆轉錄病毒粒子中。隨後可分離重組病毒且傳遞至受試者。合適之載體包括如例如Scherr等人，Curr.Gene Ther.,2(1)：45-55(2002)中所述之慢病毒載體。已描述其他說明性逆轉錄病毒系統(例如，美國專利第5,219,740 號；Miller等人，BioTechniques,7：980-990(1989)；Miller,Human Gene Therapy,1：5-14(1990)；Scarpa等人，Virology,180：849-852(1991)；Bums等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：8033-8037(1993)；及Boris-Lawrie等人，Curr.Opin.Genet.Develop.,3：102-109(1993)。

其他已知之基於病毒之傳遞系統描述於例如，Fisher-Hoch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：317-321(1989)；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,569：86-103(1989)；Flexner等人，Vaccine,8：17-21(1990)；美國專利第4,603,112號、第4,769,330號及第5,017,487號；WO 89/01973；美國專利第4,777,127號；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner,Biotechniques,6：616-627(1988)；Rosenfeld等人，Science,252：431-434(1991)；Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91：215-219(1994)；Kass-Eisler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：11498-11502(1993)；Guzman等人，Circulation,88：2838-2848(1993)；Guzman等人，Cir.Res.,73：1202-1207(1993)；及Lotze等人，Cancer Gene Ther.,9(8)：692-9(2002)中。

治療及預防應用

在某些態樣中，本發明之組合物係用於治療或預防有需要之受試者之疾病或病症。適合以本文所述之MOTS3或MOTS3類似物組合物治療之疾病或病症之實例 包括(但不限於)治療及預防包括(但不限於)以下之病症：1型及2型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性、代謝症候群、葡萄糖耐受不良、癌症(例如，乳癌、腦癌、結腸癌、黑素瘤、白血病(例如，AML)、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌)、肥胖症及脂肪肝疾病。本發明之組合物可預防性地用於例如遺傳上具有糖尿病傾向之個體。

熟習此項技術者將瞭解，本發明之MOTS3肽及類似物可與用於治療或預防本文所述之任何疾病之其他治療劑共同投與。共同投藥可同時，例如在單一醫藥組合物或獨立組合物中。本發明之組合物亦可與另一治療劑分開投與，例如以獨立之給藥時程。

實例

實例1。

3’RACE分析表明MOTS3係經聚腺苷酸化，與HN類似(圖1A)。在如下文所述之初始篩檢後，確定MOTS 3具有有效生物活性，且其肽序列在各種物種中均完全保守(圖1B)。吾人已產生可藉由在細胞培養物中將ORF選殖至表現載體中來偵測內源性及過度表現之MOTS3(經GFP標記之MOTS3亦如此)的抗MOTS3多株兔抗體(圖1C)。使用該等證實抗體，吾人可在大鼠心臟、肝臟及睪丸中偵測到類似分子量之MOTS3且在大腦中偵測到分子量略高之MOTS3(圖1D)。心臟中之表現水準似 乎最高，心臟係具有最高粒線體密度之一之器官。此外，已使用溴化乙錠清除粒線體DNA之rho-O HeLa細胞不表現MOTS3以及其他正好描述之粒線體編碼蛋白，諸如細胞色素氧化酶I及II(COI及COII)，證實其粒線體來源(圖1E)。

實例2。

由海馬技術(Seahorse technology)量測之耗氧速率(OCR)以及MTT減少(在10%與1% FBS條件下)所量測，合成MOTS3之外源性治療導致粒線體依賴性代謝遷移(圖2)。以合成肽進行外源性MOTS3治療(圖3)以及藉由選殖進行內源性表現(圖4)均抑制粒線體活性。顯然，外源性MOTS3治療降低細胞ATP含量及粒線體活性(MTT)，同時發生自體吞噬增加(圖5)。

如由培養基中之殘餘葡萄糖含量及藉由螢光標記之葡萄糖類似物吸收所量測(圖6A及圖6B)，MOTS3治療誘使葡萄糖吸收增加。如所預期，乳酸鹽分泌與葡萄糖消耗升高一致地增加(圖6A)。顯然，藉由96小時之MOTS3治療，當消耗掉介質中之大部分葡萄糖時，在經MOTS3處理之細胞中之AMPK活化顯著較高(圖7)，此與如圖5中所示之細胞ATP含量劇烈減少及自體吞噬增加一致。由外源性MOTS3誘發之細胞代謝受損導致在葡萄糖介質下而非在半乳糖介質下之細胞增殖及存活率降低(圖8)；半乳糖迫使細胞依賴於粒線體代謝存活。

藉由轉染表現純系進行細胞內MOTS3過度表現亦延遲細胞增殖(圖9)。有趣的是，如由衰老相關之β-半乳糖苷酶染色所量測(圖10)，8天之外源性MOTS 3治療誘發細胞衰老。

實例3。

在小鼠體內，在不顯著改變食物攝取的情形下，4天注射MOTS3(i.p.；每天0.5或5.0mg/kg)導致顯著體重減輕(圖11)。此外，與吾人之活體外研究相一致，在兩種測試劑量下之MOTS3治療後，肝臟之粒線體呼吸量均減少(圖11)。顯然，MOTS3治療顯著減少血糖含量(圖12A)且亦具有較高之胰島素含量(圖12B)，表明與在細胞培養物中所觀察一致之葡萄糖吸收增加(圖6)。

實例4。

MOTS-c：一種預防肥胖症且調節代謝穩態之在粒線體基因組中編碼之新穎肽

摘要

傳統上已知粒線體基因組僅編碼13蛋白，其係使用粒線體特異性遺傳密碼進行轉譯。此近期受到人體肽發現之挑戰，人體肽係一種在粒線體16S rRNA中編碼之肽。人體肽提議可能存在產生生物活性肽之未曾探索之粒線體基因(C.Lee,K.Yen,P.Cohen,Humanin：a harbinger of mitochondrial-derived peptides？Trends in endocrinology and metabolism：TEM,(2013年2月7日))。此處吾人報導一種在粒線體12S rRNA中編碼之新穎肽，稱為MOTS-c(12 SrRNA c之粒線體開放閱讀框)，其在各種組織及循環中均偵測到。MOTS-c藉由調節核苷酸、葡萄糖、粒線體及脂肪酸代謝二充當代謝穩態之重要調節劑。顯然，MOTS-c經由從頭嘌呤生物合成途徑使內源性AICAR含量增加>20倍，且亦使小鼠之HEK293細胞及骨骼肌中之AMPK信號轉導活化。小鼠體內之MOTS-c治療預防高脂肪飲食誘發之增重及胰島素抗性。此外，與年齡依賴性之肌肉胰島素抗性相一致，發現血漿及肌肉中之MOTS-c含量隨年齡而下降，且MOTS-c治療足夠恢復大齡小鼠體內之胰島素敏感性。發現MOTS-c以及人體肽表明粒線體在協調重要細胞過程(包括代謝)中先前未知之調節作用。吾人之發現表明，源自粒線體之肽(MDP)(包括MOTS-c)不僅闡明新穎粒線體生物學，而且亦可提供可用於改善與老化及年齡相關慢性疾病相關之代謝功能障礙的新穎診斷性生物標記及治療標靶。

進行電腦模擬搜尋在粒線體DNA(mtDNA)之12S rRNA區域中編碼生物活性肽之潛在開放閱讀框(ORF)。MOTS-c經識別為轉譯成16胺基酸肽(圖13a)之51bp開放閱讀框(ORF)，其高度保守(圖17a)。該肽亦經受若干假定轉譯後修飾(圖17b)。MOTS-c之轉譯理論上可為粒線體或細胞質，但由於粒線體遺傳密碼產生串聯之啟始/終止密碼子(圖13a)，因此MOTS-c必須經歷細胞質 轉譯，表明其聚腺苷酸化轉錄體(圖13b)係藉由目前未知之機制自粒線體輸出(Y.Ninomiya,S.Ichinose,Subcellular distribution of mitochondrial ribosomal RNA in the mouse oocyte and zygote.PloS one 2,e1241(2007)及R.Amikura,M.Kashikawa,A.Nakamura,S.Kobayashi,Presence of mitochondria-type ribosomes outside mitochondria in germ plasm of Drosophila embryos.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98,9133(2001年7月31日))。

意識到MOTS-c亦可由於稱為核粒線體DNA轉移(NUMT)之現象而具有核來源之可能性(M.Ricchetti,F.Tekaia,B.Dujon,Continued colonization of the human genome by mitochondrial DNA.PLoS biology 2,E273(2004年9月))。使用NCBI核苷酸基礎局部對準搜尋工具(basic local alignment search tool，BLAST)，發現NUMT或其肽產物均不與粒線體MOTS-c序列具有完全同源性(圖13c)。為進一步證實其粒線體來源，量測已選擇性地耗盡粒線體DNA(ρ0)之HeLa細胞中的MOTS-c表現。在HeLa-ρ0細胞中，12S rRNA與MOTS-c轉錄體兩者由qRT-PCR均無法偵測(圖13d)，且使用MOTS-c特異性抗體之免疫墨點法(圖17c)展示編碼粒線體之細胞色素氧化酶I及II(COI/II)與MOTS-c之不可偵測含量，但編碼核之GAPDH之表現無變化(圖13e)。為研究其次細胞分佈圖案，將HEK293細胞免疫染色用於MOTS-c且觀測粒線體 共區域化(圖13f；圖17d、17e)。在小鼠及大鼠之各種組織中(圖13g)以及在人類與嚙齒動物之血漿循環中(圖13h；圖17f)偵測MOTS-c。顯然，禁食改變了MOTS-c在某些代謝活性組織(圖13i)與在血漿(圖13j)中之內源性表現。

為闡明MOTS-c之生物學作用，在MOTS-c(10μM)治療4小時及72小時後對HEK293細胞進行微陣列分析。主要組分分析(PCA)表明，MOTS-c在72小時之前促使明顯之整體性基因表現譜遷移(圖14a)。為進一步突出由MOTS-c改質之功能途徑之間之差異，採用基因集合富集之參數分析(PAGE)來證實基因表現在MOTS-c治療後4小時發生顯著改變，在72小時之前變得明顯不同(圖14b)。4小時與72小時之基因印記之間存在適度重疊，表明對應於MOTS-c治療之時間依賴性進程(圖14c)。發現MOTS-c對在細胞代謝及炎症中涉及之途徑中之基因表現具有深刻影響(圖14d；圖30)。

其次，在經MOTS-c或空表現純系(分別為MOTS-c-ST及MOTS-c-EV細胞)穩定轉染或經合成MOTS-c(10uM)外源性治療24小時及72小時之HEK293細胞中使用代謝組學輪廓分析來研究MOTS-c對總體代謝之影響。在356種指定代謝物中，發現194種在MOTS-c-ST細胞中顯著改變，且49種及177種分別在24小時及72小時後顯著改變(圖31)。有趣的是，發現從頭嘌呤生物合成途徑發生顯著變化(圖14e，圖20a)，包括在外源 性MOTS-c治療72小時時，內源性AICAR(5-胺基咪唑-4-甲醯胺核糖核苷酸)濃度增加>20倍(圖18a)。與代謝組學發現相一致，微陣列分析亦表明，MOTS-c早在治療後4小時即改變嘌呤從頭生物合成(圖18b)。嘌呤係由戊醣磷酸途徑(PPP)產生之核糖-5-磷酸酯(R5P)來合成，且亦由源自NAD⁺之ADP-核糖來合成(圖14e)。發現醣解/PPP加速且NAD⁺之含量增加(圖18a、19b)，但經MOTS-c治療之細胞中之ADP-核糖與R5P之含量減少。該等資料由麩醯胺酸含量減少及焦磷酸酯(PPi)含量增加得到進一步支持(圖14g)，表明MOTC-s刺激該等途徑在HEK293細胞中之通量增加。在AICAR處之堆積最終阻塞且減少下游中間物，諸如肌苷、腺苷醯琥珀酸、AMP以及嘌呤最終產物，包括腺嘌呤、鳥嘌呤及黃嘌呤(圖14g、18及20a)。MOTS-c可藉由改變葉酸鹽代謝促使AICAR處之堆積。觀測到5-甲基-四氫葉酸鹽(5Me-THF)顯著減少(圖20b)，此係催化將AICAR甲醯基化為其下游中間物F-AICAR所需。實際上，先前報導表明，藉由胺甲喋呤抑制葉酸鹽代謝使細胞內AICAR含量增加(E.5.Chan,B.N.Cronstein,Methotrexate--how does it really work？Nature reviews.Rheumatology 6,175(Mar,2010))。葉酸鹽代謝(尤其5Me-THF)受損亦已指示為藉由抗糖尿病藥物二甲雙胍活化AMPK所潛在之一種機制(B.Corominas-Faja等人，Metabolomic fingerprint reveals that metformin impairs one-carbon metabolism in a manner similar to the antifolate class of chemotherapy drugs.Aging 4,480(2012年7月))。

AICAR係主要能量調節劑AMPK之有效活化劑，證實經由磷酸化作用誘發之乙醯基-CoA羧基酶(ACC)的失活來刺激脂肪酸氧化，緩解肉毒鹼棕櫚醯基轉移酶1(CPT-1)之異位抑制作用，此係脂肪酸輸送至粒線體中用於β-氧化作用之重要機制。(G.Hasko,B.Cronstein,Regulation of inflammation by adenosine.Frontiers in immunology 4,85(2013))。AICAR誘發之AMPK活化部分地藉由增加與運動所達成相當之GLUT4轉錄來增強葡萄糖在肌肉中之吸收(G.R.Steinberg,B.E.Kemp,AMPK in Health and Disease.Physiological reviews 89,1025(2009年7月))。72小時之MOTS-c治療(10μM)導致AMPKα(Thr172)與ACC(Ser79)之磷酸化作用，且亦以時間及劑量依賴性方式(圖14i)增加CPT-1與GLUT4蛋白之含量(圖14h)。此外，發現MOTS-c促使Ser-473處之Akt的磷酸化作用(圖14i)。顯然，在第AMP含量及高ADP與ATP含量下觀測到AMPK活化(圖19a、20a)。ATP增加可歸因於醣解增強，此係產生ATP之一種快速但低效之方法(P.S.Ward,C.B.Thompson,Metabolic reprogramming：a cancer hallmark even warburg did not anticipate.Cancer cell 21,297(2012年3月20日))。該等發現表明，MOTS-c促使AMPK之AMP非依賴性活化，與水楊酸鹽(K.Hashiguchi,Q.M.Zhang-Akiyama, Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA.Methods in molecular biology 554,383(2009))、瘦素(T.Ohta等人，Untargeted metabolomic profiling as an evaluative tool of fenofibrate-induced toxicology in Fischer 344 male rats.Toxicologic pathology 37,521(2009年6月))及二甲雙胍(N.Fujii,N.Jessen,L.J.Goodyear,AMP-activated protein kinase and the regulation of glucose transport.American journal of physiology.Endocrinology and metabolism 291,E867(2006年11月))所達成之活化類似。

其次，研究MOTS-c對集中於葡萄糖與脂肪酸代謝及細胞呼吸之細胞代謝的影響。發現MOTS-c刺激由葡萄糖吸收(圖15a；圖21a、b)及乳酸鹽產量(圖15b；圖21a)增加所反映之醣解。另外，細胞內葡萄糖含量連同其他醣解中間物一起減少(圖15c；圖22)，進一步證實醣解通量增加。MOTS-c亦改變其他糖受質之利用(圖22)。為直接即時測試醣解速率，量測細胞外酸化率(ECAR)。MOTS-c-ST細胞具有較高之基礎醣解速率，且在經葡萄糖刺激時展示改良之醣解反應(圖15d)。又，由寡黴素治療所評估，總醣解能力在該等細胞中較高(圖15d)。MOTS-c-ST與MOTS-c-EV細胞之間之細胞內乳酸鹽含量相同(圖15c)，因為MOTS-c-ST細胞之多餘產量經釋放至培養基中(圖15b；圖21a)。與在MOTS-c-ST細胞中之觀測相一致，質譜分析提供關於在MOTS-c治療24小時內HEK293 細胞醣解增加之進一步證據(圖23a)。戊醣磷酸途徑(PPP)(醣解之一種替代分支)為從頭嘌呤生物合成提供R5P。在外源性MOTS-c(10μM)治療72小時後，在MOTS-c-ST細胞中且亦在MOTS-c-EV細胞中觀測到PPP中間物(包括R5P)之含量減少(圖23b、c)。

其次，量測粒線體呼吸，因為醣解最終產物穿梭至粒線體中以經由氧化性磷酸化作用進一步能量提取。與醣解增加相一致，MOTS-c治療降低HEK293細胞中之基礎耗氧速率(OCR)以及最大呼吸量(圖15e)。此與「Crabtree效應」相一致，其係包括癌細胞、淋巴細胞、幹細胞及精子之快速分裂細胞對應於高葡萄糖濃度展示抑制呼吸之現象(K.H.Ibsen,The Crabtree effect：a review.Cancer research 21,829(1961年8月)；T.Wang,C.Marquardt,J.Foker,Aerobic glycolysis during lymphocyte proliferation.Nature 261,702(1976年6月24日)；及V.Gogvadze,S.Orrenius,B.Zhivotovsky,Mitochondria in cancer cells：what is so special about them？Trends in cell biology 18,165(2008年4月))。電子輸送鏈活性減小亦由質子滲漏減少表明(M.Jastroch,A.S.Divakaruni,S.Mookerjee,J.R.Treberg,M.D.Brand,Mitochondrial proton and electron leaks.Essays in biochemistry 47,53(2010))(圖15f)。氧化能力減小與MOTS-c-ST細胞中及經外源性MOTS-c治療之HEK293細胞中消耗TCA循環中間物相關(圖15g；圖24)。在HEK293細胞中瞬時轉染 MOTS-c表現純系亦減小OCR(圖25)。儘管粒線體代謝減少，但如由還原與氧化麩胱甘肽之比率(GSH/GSSG)所確定，MOTS-c並不擾亂細胞氧化還原平衡，然而在MOTS-c治療72小時後，MOTS-c-ST細胞與HEK293細胞中之總麩胱甘肽含量減少(圖26)。為測試MOTS-c是否藉由增加醣解通量或藉由靶向粒線體代謝本身來抑制粒線體呼吸，在以葡萄糖或半乳糖作為主要碳來源之培養基中培養HEK293細胞。在哺乳動物細胞中，半乳糖主要由粒線體代謝，轉移了能量產量對氧化性磷酸化作用之依賴性(L.D.Marroquin,J.Hynes,J.A.Dykens,J.D.Jamieson,Y.Will,Circumventing the Crabtree effect：replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.Toxicological sciences：an official journal of the Society of Toxicology 97,539(2007年6月))。MOTS-c在大量葡萄糖條件下減少細胞增殖，但無法影響在半乳糖培養基中培養之細胞。該等資料表明，MOTS-c誘發之呼吸抑制作用可能在葡萄糖吸收增加後繼發(圖15h)。

脂質代謝亦受到MOTS-c之顯著影響(圖27a)。MOTS-c-ST細胞與MOTS-c-EV細胞相比展現較高水準之肉毒鹼穿梭以及增加濃度之肉毒鹼與去氧肉毒鹼(圖15i)。在經外源性MOTS-c治療之細胞中亦觀測到該等發現，但程度較小(圖27b)。與肉毒鹼穿梭增加相一致，吾人發現在MOTS-c-ST細胞中(圖15j)以及在經 MOTS-c治療之HEK293細胞中(圖27c)，必需脂肪酸之含量減少。在進入粒線體之後，脂肪酸經歷β-氧化以引申出還原電位及乙醯基-CoA。肉豆蔻醯-CoA(一種早期之β-氧化中間物)在MOTS-c-ST細胞中(圖15k)以及在經MOTS-c(10uM)外源性治療之HEK293細胞中(圖27d)顯著增加。此外，其他長鏈脂肪酸亦顯著減少，表明脂肪酸利用增加(圖28)。顯然，β-氧化本身並非有氧反應，且在經AICAR(L.D.Marroquin,J.Hynes,J.A.Dykens,J.D.Jamieson,Y.Will,Circumventing the Crabtree effect：replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.Toxicological sciences：an official journal of the Society of Toxicology 97,539(2007年6月))及二甲雙胍(A.Martin-Montalvo等人，Metformin improves healthspan and lifespan in mice.Nature communications 4,2192(2013年7月31日))治療期間，在呼吸減少下觀測到脂肪酸氧化增加。

在遠親雜交CD-1雄性小鼠中以MOTS-c急性治療4天(每天5mg/kg；BID)導致體重、食物攝取及血糖含量適度減少(圖29a-c)，但使血漿IL-6及TNFα之基礎含量顯著減少(圖16a；圖29d)，該等係在肥胖症及胰島素抗性中涉及到(M.F.Gregor,G.S.Hotamisligil,Inflammatory mechanisms in obesity.Annual review of immunology 29,415(2011))。考慮到吾人在培養細胞中之發現，測試MOTS-c對餵飼高脂肪飲食(HFD；以卡路里計 60%)之遠親雜交CD-1小鼠體內之代謝的影響(L.A.Scrocchi,D.J.Drucker,Effects of aging and a high fat diet on body weight and glucose tolerance in glucagon-like peptide-1 receptor -/- mice.Endocrinology 139,3127(1998年7月)及W.L.Breslin,K.Strohacker,K.C.Carpenter,L.Esposito,B.K.McFarlin,Weight gain in response to high-fat feeding in CD-1 male mice.Laboratory animals 44,231(2010年7月))。MOTS-c治療8周對餵飼正常飲食之小鼠之體重無影響，但明顯預防HFD誘發之肥胖症(圖16b)。此體重差異並非由於食物攝取，因為各組之間之卡路里消耗相同(圖29e-f)。高脂肪餵飼促使高胰島素血症試圖克服周邊胰島素抗性以維持葡萄糖穩態(M.Hou等人，Protective effect of metformin in CD1 mice placed on a high carbohydrate-high fat diet.Biochemical and biophysical research communications 397,537(2010年7月2日))。重要的是，MOTS-c治療預防高胰島素血症(圖16c、d)且改善HFD餵飼小鼠體內之肝臟脂質聚積(圖16e)。顯然，與吾人之活體外研究一致，MOTS-c促使該等HFD餵飼小鼠之肌肉中之AMPK活化與GLUT4表現(圖16f)。

其次，藉由進行葡萄糖耐受性測試(GTT)來測試MOTS-c對通常研究之具有肥胖症傾向之C57BL/6小鼠菌株中之葡萄糖穩態的影響。經MOTS-c治療之小鼠展示快速之葡萄糖清除率，表明胰島素敏感性增強(圖16g)。

其次，進行高胰島素血性-血糖正常性鉗定研究以定量MOTS-c治療7天對全身胰島素敏感性之影響，而無隨治療持續時間延長發生之體重變化無關。如在胰島素刺激期間維持血糖常態所需之外源性葡萄糖輸注速率(GIR)增加約30%所反映，MOTS-c使全身胰島素敏感性得以改良(圖16h)。胰島素促使葡萄糖配置至周邊組織中且抑制肝臟葡萄糖產量(HGP)以在葡萄糖可用性增加期間維持穩態(C.R.Kahn,Banting Lecture.Insulin action,diabetogenes,and the cause of type II diabetes.Diabetes 43,1066(1994年8月))。在鉗定期間輸注氚化葡萄糖以確定MOTS-c作用對胰島素敏感性之組織特異性。儘管觀測到MOTS-c治療顯著增強胰島素刺激之葡萄糖清除速率(IS-GDR)(圖16i)，但未偵測到MOTS-c對肝臟胰島素敏感性之影響，因為各組之間之肝臟葡萄糖生產(HGP)速率相當(圖16j)。考慮到胰島素刺激之70%至85%之葡萄糖係經處理至骨骼肌中，因此可在該組織中調節MOTS-c增強胰島素敏感性及葡萄糖穩態之作用。實際上，此觀念藉由在MOTS-c治療後在HFD餵飼小鼠之骨骼肌中之強烈AMPK活化及GLUT4表現增加得到支持(圖16f)。此外，MOTS-c亦增強葡萄糖吸收至以生理學劑量之人類胰島素離體刺激之比目魚肌中。由於在老化期間伴隨胰島素抗性之發展，肌肉(圖16k)與循環(圖16l)中之MOTS-c含量下降(C.R.Kahn,Banting Lecture.Insulin action,diabetogenes,and the cause of type II diabetes.Diabetes 43,1066(1994年8月))，因此若藉 由量測胰島素刺激之吸收至中年(12個月)與年幼(3個月)雄性C57BL/6小鼠之比目魚肌中之葡萄糖(2-去氧葡萄糖)，MOTS-c可逆轉胰島素作用之年齡依賴性受損，則進行測定。胰島素抗性跡象在約12個月大之C57BL/6小鼠中開始展現(C.R.Kahn,Banting Lecture.Insulin action,diabetogenes,and the cause of type II diabetes.Diabetes 43,1066(1994年8月))。實際上，來自大齡小鼠之肌肉更具胰島素抗性，但7天MOTS-c治療使得恢復與年幼動物相當之敏感性(圖16m)。

論述

技術進步已揭示了先前未知之粒線體遺傳特性，表明在粒線體DNA中存在小的ORF(T.R.Mercer等人，The human mitochondrial transcriptome.Cell 146,645(2011年8月19日))。值得注意的是，已在果蠅(Drosophila)中報導核基因組中之各種生物活性小ORF(E.G.Magny等人，Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames.Science 341,1116(2013年9月6日)；J.Savard,H.Marques-Souza,M.Aranda,D.Tautz,A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides.Cell 126,559(2006年8月11日)；T.Kondo等人，Small peptides switch the transcriptional activity of Shavenbaby during Drosophila embryogenesis.Science 329,336(2010年7月16日)；及M.I.Galindo,J.I.Pueyo,S.Fouix,S.A.Bishop,J.P.Couso,Peptides encoded by short ORFs control development and define a new eukaryotic gene family.PLoS biology 5,e106(2007年5月))。文獻中有證據論述潛在存在在粒線體DNA(mtDNA)中編碼之因素。舉例而言，在20世紀80年代早期選殖聚腺苷酸化粒線體rRNA純系作為由幹擾素誘發之人類骨髓母細胞構建之cDNA庫之部分(J.Villegas,P.Araya,E.Bustos-Obregon,L.O.Burzio,Localization of the 16S mitochondrial rRNA in the nucleus of mammalian spermatogenic cells.Molecular human reproduction 8,977(2002年11月))，證實在mtDNA中編碼之一種強幹擾素誘發之因素。又，在人類中，發現16S rRNA位於人類生精細胞之細胞核中(J.Durieux,S.Wolff,A.Dillin,The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity.Cell 144,79(2011年1月7日))，而在果蠅中，已在細胞質中發現粒線體rRNA，其在細胞質中對建立生殖細胞具有重要作用(R.Amikura,M.Kashikawa,A.Nakamura,S.Kobayashi,Presence of mitochondria-type ribosomes outside mitochondria in germ plasm of Drosophila embryos.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98,9133(2001年7月31日))。

MOTS-c可為使粒線體與細胞或遠端器官(諸如 骨骼肌)之間有效雙向連通之適應產物，尤其考慮到其轉譯需要哺乳動物遺傳密碼。本文提供足夠證據表明MOTS-c及人體肽作為新一類之調節總體生理學之先天性粒線體信號(C.Lee,K.Yen,P.Cohen,Humanin：a harbinger of mitochondrial-derived peptides？Trends in endocrinology and metabolism：TEM,(2013年2月7日))。近期使用線蟲秀麗隱桿線蟲(C.elegans)之報導證實，神經元中之粒線體破壞導致小腸中之粒線體未折疊蛋白反應(UPR)且延長壽命，此係由使得應力可在器官間連通之未識別循環信號介導之一種效應(D.K.Woo,G.S.Shadel,Mitochondrial stress signals revise an old aging theory.Cell 144,11(2011年1月7日)及C.Cheadle,M.P.Vawter,W.J.Freed,K.G.Becker,Analysis of microarray data using Z score transformation.The Journal of molecular diagnostics：JMD 5,73(2003年5月))。

儘管尚未完全確認MOTS-c作用之具體機械詳情，但其對代謝之影響將可能對老化及年齡相關疾病具有重要暗示，該等疾病包括糖尿病、癌症、動脈粥樣硬化及神經退化。MDP之新興生物學及在MOTS-c作用中獨特涉及AICAR與AMPK(圖16n)為擴展吾人對於粒線體在生理學及病理學病況中之作用的理解以及識別新穎之診斷及治療標靶提供了有趣之機會。

方法

細胞培養物

常規在37℃與5% CO₂下補充有10%胎牛血清(FBS)之杜貝卡氏經改良依格培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM))中培養HEK293與HeLa細胞。缺乏粒線體DNA之ρ0細胞係藉由如前文所述在低劑量之溴化乙錠(EtBr；100ng/mL)中培養HeLa細胞而產生(K.Hashiguchi,Q.M.Zhang-Akiyama,Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA.Methods in molecular biology 554,383(2009))。MOTS-c-ST細胞係藉由在含有10% FBS之DMEM中選擇且維持G418(500μM；Sigma)而產生。

小鼠

根據南加州大學(University of Southern California)及加州大學洛杉磯分校(University of California Los Angeles)實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)進行所有動物工作。在所有活體內實驗中每天經由腹膜內注射來注射MOTS-c(Genscript,USA)。8周大之CD-1(ICR)小鼠購自Harlan。C57BL/6小鼠購自Jackson Laboratories。對小鼠餵飼高脂肪飲食(以卡路里計60%)及購自Research Diets之匹配對照飲食(目錄號分別為D12492及D12450J)歷時8周。每週兩次替換顆粒物且每天記錄體重及食物消耗(N=10)。

選殖

使用限制酶EcoRI(5’)及XhoI(3’)進行定向選殖以建構MOTS-c表現純系。合成由限制酶側接之MOTS-c及MOTS-c-HA核苷酸序列且經5’磷酸化(IDT，USA)、雜交且與消化之pcDNA3.1(+)(Invitrogen，USA)或pcDNA-IRES GFP(來自位於AECOM之Nir Barzilai之善意禮物)接合。除非另外規定，否則所有酶均購自NEB(USA)。

免疫細胞化學

在室溫下，將塗在蓋玻片上之HEK293細胞以4%多聚甲醛固定15min。固定之後，將細胞在室溫下在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中以0.2% Triton X-100滲透10分鐘且在室溫下在含有0.2% Triton X-100及1%牛血清白蛋白(BSA)之PBS中阻斷1小時。隨後在4℃下將細胞在含有0.2% Triton X-100及1% BSA之PBS中以兔抗MOTS-c抗體(1：50)及山羊抗hsp60抗體(1：100；Santa Cruz Biotechnology,USA)培育隔夜。在以PBS洗滌三次之後，將細胞在室溫下在含有0.2% Triton X-100及1% BSA之PBS中以Alexa Fluor 488-結合之驢抗兔IgG(1：200；Invitrogen,US)及Alexa Fluor 568-結合之驢抗山羊IgG(1：200；Invitrogen)進一步培育1小時。在室溫下在含有Hoechst 33258(2mg/ml；Invitrogen)之PBS中對核染色5分鐘。在室溫下以69μg/ml MOTS-c肽(Genscript, USA)培育1小時後，藉由使用MOTS-c抗體證實免疫染色之特異性。蓋玻片安裝有ProLong Gold螢光保護劑(Invitrogen)並在ELYRA PS.1(Carl Zeiss,Germany)下使用雷射器寬場進行觀測。對於結構照明顯微術(SIM)影像而言，以光柵旋轉五次收集Z形疊加剖面且使用ELYRA PS.1軟體重建影像。

免疫分析

使整個MOTS-c肽與鑰孔蟲戚血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)結合且注射至兔體內。使用IgG純化血清進行西方墨點法及ELISA。藉由USC研發之內部夾層ELISA量測來自血清、血漿及CSF之循環MOTS-c含量。定製之兔抗MOTS-c多株抗血清係在YenZym Antibodies,LLC(South San Francisco,CA)產生。使用經蛋白A/G管柱層析(Pierce,Rockford,IL)純化之IgG子類作為捕獲抗體。抗MOTS-c IgG經生物素標記且用作偵測抗體。為量測內源性MOTS-c含量，使用25pg/mL至6400pg/mL範圍內之合成MOTS-c(GenScript)作為標準物。在分析之前，在90%乙腈與10% 1N HCl中萃取MOTS-c。簡言之，向100μL血漿中添加200μL萃取試劑、輕柔混合且在室溫下培育30分鐘。將混合物離心且移除上清液並乾燥。將乾燥之萃取物以具有0.5% Tween 20之200μL磷酸鹽緩衝液復水且隨後用於分析。對96孔微量滴定盤以每孔0.5μg塗佈以捕獲抗體且在室 溫下在震蕩器上培育4hr。向適當孔中添加標準物、對照物或萃取樣本及預滴定之偵測抗體且在以洗滌緩衝液洗滌2次且以Superblock緩衝液(Pierce Chemicals,Rockford,IL)洗滌2次後培育隔夜。將孔洗滌3次且隨後添加以鏈黴親和素-HRP並在室溫下進一步培育30分鐘。洗滌後，每孔添加200μL OPD溶液(1mg/mL在過氧化氫基質中)且培育10至20分鐘。藉由添加2N H₂SO₄終止反應，且在490nm下在板式分光光度計(Molecular Designs,Sunnyvale,CA)上量測吸光度。分析內及分析間之係數變化(CV)小於10%。使用小鼠胰島素分析套組(MSD；目錄號K112BZC-1)及Sector Imager 2400A(MSD,USA)偵測血漿胰島素含量。

對於西方墨點法而言，在具有無EDTA蛋白酶及磷酸酶抑制劑之1% Triton X-100(Roche,USA)中製備蛋白樣本，在95℃下加熱5分鐘，在4%至20%梯度之tris-甘胺酸凝膠(TGX；Bio-Rad,USA)上運行且在9V下使用渦輪半乾轉移系統(Transblot Turbo；Biorad)轉移至PVDF膜(Bio-Rad)上歷時15至30分鐘。將膜以5% BSA阻斷30分鐘且在4℃下以初級抗體培育過夜，繼而在室溫下以次級HRP-結合抗體培育1小時。使用增強之ECL(Immun-Star WesternC；Bio-Rad)及Chemidoc XRS系統(Bio-Rad)偵測化學發光並成像。

微陣列

使用RNeasy套組(Qiagen,Valencia,CA)分離RNA且隨後與BD-103-0603 Illumina Beadchips雜交。如前文所述，使原始數據經歷Z標準化(C.Cheadle,M.P.Vawter,W.J.Freed,K.G.Becker,Analysis of microarray data using Z score transformation.The Journal of molecular diagnostics：JMD 5,73(2003年5月))。藉由使用DIANE 6.0軟體(http：//www.grc.nia.nih.gov/branches/rrb/dna/diane_software.pdf)進行在樣品中之所有可偵測探針之標準化Z分值上進行之主要組分分析。藉由在兩個方向上之z測試<0.05、錯誤發現率<0.30以及z-比率>1.5且ANOVA p值<0.05來選擇顯著基因。如前文所述來分析基因集富集之參數分析(PAGE)(S.Y.Kim、D.J.Volsky，PAGE：parametric analysis of gene set enrichment.BMC bioinformatics 6,144(2005))。使用Ingenuity Pathways Analysis^©(Ingenuity Systems；Redwood City,CA)(N=6)進行基因調節網路與正則途徑分析。

代謝組學

將HEK293細胞以MOTS-c(10μM)或水(媒劑)處理24小時及72小時。亦使用經證實之MOTS-c表現載體或空載體(對照物)穩定轉染之HEK293細胞。將細胞培養於10-cm盤中之7-mL補充有10% FBS之無苯酚之DMEM中。為進行收集，將細胞以冰冷之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次且在吸出上清液後即刻擦除、離心及速 凍。使用冷凍顆粒物進行代謝組學分析(Metabolon)。非標靶之代謝輪廓分析儀器採用三種獨立平臺之組合：為基礎物種優化之超高效液相層析/串聯質譜法(UHPLC/MS/MS²)、為酸性物種優化之UHPLC/MS/MS²及氣相層析/質譜法(GC/MS)。基本上如前文所述加工樣品(T.Ohta等人，Untargeted metabolomic profiling as an evaluative tool of fenofibrate-induced toxicology in Fischer 344 male rats.Toxicologic pathology 37,521(2009年6月)及A.M.Evans,C.D.DeHaven,T.Barrett,M.Mitchell,E.Milgram,Integrated,nontargeted ultrahigh performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry platform for the identification and relative quantification of the small-molecule complement of biological systems.Analytical chemistry 81,6656(2009年8月15日))。在最小體積之水中，使用Covaris適應性聚焦聲學E系列組織破壞器/均質器溶解細胞。自均質物中提取100μL等分試樣用於後續質譜法且提取25μL用於量測總蛋白(Bradford分析)。使用自動液體處理器(Hamilton LabStar,Salt Lake City,UT)，以含有四種標準物之甲醇自均質物沈澱蛋白以報導萃取效率。將所得上清液分成相同等分試樣以供在三個平臺上進行分析。隨後使在氮氣下乾燥及經真空乾燥之等分試樣在50μL水中之0.1%甲酸中(酸性條件)或在50μL水中之6.5mM碳酸氫銨(pH 8，鹼性條件)中復水以用於兩次UHPLC/MS/MS² 分析，或在60℃下使用等份之雙三甲基-矽烷基-三氟乙醯胺及乙腈：二氯甲烷：環己烷(5：4：1)與5%三乙胺之溶劑混合物歷時一小時衍生至50μL之最終體積以用於GC/MS分析。另外，與實驗樣品一致地分析三種類型之對照物：源自匯集之實驗樣品等分試樣的在整個資料集中充當技術複製之樣品等分試樣、充當方法空白之萃取水樣品及插入每一分析樣品中以使得可監控儀器效能之標準物混合物。實驗樣品及對照物在整個平臺運行日隨機分配。

對於UHLC/MS/MS²分析而言，使用Waters Acquity UPLC(Waters,Millford,MA)分離等分試樣且使用由電噴灑電離(ESI)源與線性離子阱(LIT)質譜分析器組成之LTQ質譜計(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA)進行分析。MS儀器掃描99至1000m/z且使用每秒約6次掃描之動態排除在MS與MS²掃描之間交替。在以氦作為載送氣體且溫度自60℃升至340℃之5%苯基二甲基聚矽氧管柱上分離用於GC/MS之衍生樣品，且隨後在具有電子衝擊電離及50至750原子質量單位掃描範圍之單位質量解析力下操作之Thermo-Finnigan Trace DSQ MS(Thermo Fisher Scientific,Inc.)上進行分析。

藉由自動比較實驗樣品與化學標準物條目參考庫之離子特徵來識別代謝物，該等特徵包括滯留時間、分子量(m/z)、較佳加合物及內源片段以及相關MS光譜，且藉由使用Metabolon研發之軟體視覺觀測進行品質控制來進行策劃(C.D.Dehaven,A.M.Evans,H.Dai,K.A. Lawton,Organization of GC/MS and LC/MS metabolomics data into chemical libraries.Journal of cheminformatics 2,9(2010))。

為統計學分析及數據顯示目的，假定任何缺失值均低於偵測極限且將該等值與化合物最小值一起輸入(最小值輸入)。另外，基於每一樣品將每一值標準化為總蛋白值。使用「R」進行對數轉換數據之統計學分析(http：//cran.r-project.org/)，此係一種自由可用之開源軟體封裝。進行斯氏t檢定以比較實驗組之間之數據。

葡萄糖及乳酸鹽分析

根據製造商說明，使用葡萄糖及D-乳酸鹽分析套組量測來自細胞培養基之細胞外葡萄糖及乳酸鹽(Eton Bioscienes,USA)。根據製造商說明，藉由使用2-NBDG(Invitrogen,USA)之顯微術來測定細胞內葡萄糖。

耗氧量及細胞外酸化率

使用XF24/96細胞外通量分析儀(Seahorse Bioscience)量測即時耗氧速率(OCR)。藉由以寡黴素及FCCP攻擊細胞來評估ATP轉換及最大呼吸量。藉由「最大呼吸速率/基礎呼吸速率」確定備用呼吸量，藉由「ATP轉換OCR-非粒線體OCR(魚藤酮/抗黴素A)」確定質子滲漏，且藉由「1-(ATP轉換OCR/基礎呼吸速率)」確定耦合效率。使用細胞外酸化率(ECAR)來測定醣解率。以葡 萄糖刺激細胞來確定活性醣解率，且以寡黴素刺激細胞來確定最大醣解能力且以2-DG刺激細胞來確定醣解能力。

離體比目魚肌去除葡萄糖吸收

在12周大之小鼠體內使用2-去氧葡萄糖(Perkin Elmer)及60μl/ml人類胰島素(Novo Nordisk Pharmaceutical Industries)來評估全身肌肉離體葡萄糖吸收，與前文所述存在微小變化(V.Ribas等人，Myeloid-specific estrogen receptor α deficiency impairs metabolic homeostasis and accelerates atherosclerotic lesion development.Proc Natl Acad Sci U S A 108,16457(2011年9月27日)及C.E.McCurdy,G.D.Cartee,Akt2 is essential for the full effect of calorie restriction on insulin-stimulated glucose uptake in skeletal muscle.Diabetes 54,1349(2005年5月))。簡言之，自麻醉動物小心切除比目魚肌及EDL肌肉且即刻在35℃下在具有或不具有60μU/ml胰島素之完整Krebs-Henseleit緩衝液中培育30min。隨後將肌肉轉移至含有3mCi/ml ³H-2-去氧葡萄糖及0.053mCi/ml ¹⁴C-甘露糖醇之相同緩衝液中，且培育20min後進行速凍。使肌肉在溶解緩衝液中均質化且針對放射活性計數或經歷西方墨點法。葡萄糖吸收相對於甘露糖醇之非特異性吸收標準化且以每公克比目魚肌之葡萄糖吸收mmol數來評估。

高胰島素血性-血糖正常性鉗定研究

經外科手術在右側頸靜脈中放置雙導管且如前文所述在外科手術3天後進行葡萄糖鉗定研究(V.Ribas等人，Myeloid-specific estrogen receptor alpha deficiency impairs metabolic homeostasis and accelerates atherosclerotic lesion development.Proc Natl Acad Sci U S A 108,16457(2011年9月27日)；A.L.Hevener等人，Muscle-specific Pparg deletion causes insulin resistance.Nature medicine 9,1491(2003年12月)；及A.L.Hevener等人，Macrophage PPAR gamma is required for normal skeletal muscle and hepatic insulin sensitivity and full antidiabetic effects of thiazolidinediones.J Clin Invest 117,1658(2007年6月))。使所有動物禁食6h且在鉗定前4h投與最後之MOTS-c劑量。研究神志清醒狀態下之動物。在90分鐘恆量輸注(5.0μCi/h,0.12ml/h)之[3-³H]D-葡萄糖(Perkin Elmer)後測定基礎葡萄糖轉換。基礎期之後，同時開始葡萄糖(50%右旋糖，Abbott Laboratories)及胰島素(8mU/kg/min，Novo Nordisk Pharmaceutical Industries)外加示蹤劑(5.0μCi/h)之輸注，且使用可變之葡萄糖輸注速率(GIR)鉗定血糖常態下之葡萄糖含量。在穩定狀態下，由示蹤劑稀釋技術量測之總葡萄糖清除速率(GDR)等於內源性或肝臟葡萄糖產量速率(HGP)與外源性(冷)葡萄糖輸注速率(GIR)的總和(A.L.Hevener等人，Muscle-specific Pparg deletion causes insulin resistance. Nature medicine 9,1491(2003年12月)；A.L.Hevener等人，Macrophage PPAR gamma is required for normal skeletal muscle and hepatic insulin sensitivity and full antidiabetic effects of thiazolidinediones.J Clin Invest 117,1658(2007年6月)；及R.Steele,Influences of glucose loading and of injected insulin on hepatic glucose output.Ann N Y Acad Sci 82,420(1959年9月25日))。總GDR之胰島素刺激組分(IS-GDR)等於總GDR減去基礎葡萄糖轉換速率。

葡萄糖耐受性測試(GTT)

使用血糖儀(Freestyle,Abbott)量測血糖。每天以MOTS-c(每天0.5mg/kg；IP)或無菌純水(媒劑)處理12周大之雄性C57BL/6小鼠歷時7天。隨後對小鼠注射D-葡萄糖(1g/kg；IP)且在葡萄糖注射後0、15、30、60、90及120分鐘時自尾部對血液取樣。

提供上文所述實例以給予一般熟習此項技術者關於如何進行及使用本揭示案之組合物、系統及方法之實施例的完整揭示內容及描述，且不欲限制發明人所認為其揭示內容之範疇。對熟習此項技術者所顯而易見之關於進行本揭示案之上述模式的修改欲在以下申請專利範圍之範疇內。說明書中提及之所有專利及公開案指示熟習本申請案所屬技術者之水準。本揭示案中引用之所有參考案均以引用方式併入，該引用程度就如同已將每一參考案之全 部內容個別地以引用方式併入一般。

所有標題及部分名稱係僅用於澄清及參考目的且不認為以任何方式限制。舉例而言，熟習此項技術者將瞭解根據本文所述本發明之精神及範疇，適當時組合來自不同標題及部分之各種態樣的適用性。

本文引用之所有參考案均以其全文引用方式且為所有目的併入本文中，該引用程度就如同已特定地且個別地將每一個別公開案或專利或專利申請案之全部內容為所有目的以引用方式併入一般。

如熟習此項技術者顯而易見，在不偏離本申請案之精神及範疇下可對其進行多種修改及變化。本文所述之特定實施例及實例係僅藉由實例方式提供，且揭示內容僅由隨附申請專利範圍之術語以及申請專利範圍授權等效物之完整範疇來限制。

<110> 加州大學董事會(The Regents of the University of California)

<120> 源自粒線體之肽MOTS3調節代謝及細胞存活

<140> 104106066

<141> 2015-02-25

<150> 61/801,474

<151> 2013-03-15

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 灰狼(Canis lupus)

<400> 3

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 斑馬魚(Danio rerio)

<400> 4

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 褐鼠(Rattus norvegicus)

<400> 6

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 獅(Panthera leo)

<400> 7

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOTS-c Ch.17a

<400> 8

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOTS-c Ch.17b

<400> 9

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOTS-c Ch.11

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOTS-c Ch.1

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOTS-c Ch.4

<400> 12

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOTS-c Ch.17c

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOTS-c Ch.X

<400> 14

<210> 15

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOTS-c Ch.17d

<400> 15

Claims (24)

1. 一種經分離之多肽，其包含70%與SEQ ID NO：1之序列一致性。
2. 如申請專利範圍第1項之多肽，其包含80%與SEQ ID NO：1之序列一致性。
3. 如申請專利範圍第1項之多肽，其包含90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。
4. 如申請專利範圍第1項之多肽，其包含SEQ ID NO：1之序列。
5. 一種經分離之抗體，其與如申請專利範圍第1項、第2項、第3項或第4項之多肽特異性結合。
6. 如申請專利範圍第5項之抗體，其中該抗體係單株抗體。
7. 一種醫藥組合物，其包含與SEQ ID NO：1具有70%序列一致性之經分離之多肽。
8. 如申請專利範圍第7項之組合物，其中該多肽包含80%或90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。
9. 如申請專利範圍第7項之組合物，其中該多肽包含SEQ ID NO：1之序列。
10. 一種包含與SEQ ID NO：1具有70%序列一致性之經分離之多肽之醫藥組合物用於製造供治療受試者之糖尿病的藥物之用途。
11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該多肽包含80%或90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。
12. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該多肽包含SEQ ID NO：1之序列。
13. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該糖尿病係I型糖尿病。
14. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該糖尿病係II型糖尿病。
15. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該受試者係人類。
16. 一種包含與SEQ ID NO：1具有70%序列一致性之經分離之多肽之醫藥組合物用於製造供治療受試者之肥胖症及/或脂肪肝的藥物之用途。
17. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該多肽包含80%或90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。
18. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該多肽包含SEQ ID NO：1之序列。
19. 如申請專利範圍第16項之用途，其中該受試者係人類。
20. 一種包含與SEQ ID NO：1具有70%序列一致性之經分離之多肽之醫藥組合物用於製造供治療受試者之癌症的藥物之用途。
21. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該多肽包含80%或90%與SEQ ID NO：1之序列一致性。
22. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該多肽包含SEQ ID NO：1之序列。
23. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該受試者係人類。
24. 如申請專利範圍第20項之用途，其中該癌症係選自乳癌、腦癌、結腸癌、黑素瘤、白血病(例如，AML)、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌及胃癌組成之群之癌症。