KR20150131176A - 미토콘드리아 유래의 펩티드 ｍｏｔｓ3에 의해 조절되는 물질대사 및 세포 생존 - Google Patents

Abstract

MOTS3은 신규한 폴리펩티드이다. MOTS3 및 이의 제약학적 조성물을 이용하여 질환, 예를 들면, 당뇨병, 비만, 지방간, 그리고 암을 치료하는 방법이 본원에서 개시된다.

Description

미토콘드리아 유래의 펩티드 ＭＯＴＳ3에 의해 조절되는 물질대사 및 세포 생존{MITOCHONDRIAL-DERIVED PEPTIDE MOTS3 REGULATED METABOLISM AND CELL SURVIVAL}

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2013년 3월 15일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/801,474에 우선권을 주장하고, 상기 출원은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.

정부 권리

본 발명은 국립보건원 (NIH)에 의해 수여된 보조금 번호 1R01AG034430과 보조금 번호1R01GM090311 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.

발명의 분야

본 발명은 신규한 미토콘드리아-유래된 펩티드 (MOTS3)에 관계한다. 이러한 신규한 펩티드는 질환, 예를 들면, 당뇨병, 비만, 지방간, 그리고 암을 치료하는 방법에서 이용될 수 있다.

배경

물질대사 과정의 중심에 있는 미토콘드리아는 에너지 생산, 예정된 세포 사멸, 그리고 반응성 산소 종 (ROS) 산출에 관련되고, 그리고 암, 당뇨병, 신경변성 질환, 그리고 노화를 비롯한 주요 질환의 다양한 시기에 심하게 연루된다; 하지만 병인에서 이의 역할은 여전히 거의 불분명하다. 전통적으로, 미토콘드리아는 에너지 생산과 세포 사멸을 조절하는 방대한 양의 세포 신호를 수용하고 처리하는 "종료 기능" 소기관으로서 고려되었다. 하지만, 미토콘드리아가 세포로 역으로 소통하는 역행성 신호전달은 불량하게 이해되는 생물학적 과정이다.

칼슘, 시토크롬 C, 그리고 ROS는 역행성 미토콘드리아 분자인 것으로 고려되었다. 특히, Durieux 등은 미토콘드리아로부터 유래하는 신호가 세포에서 예쁜꼬마선충 (C. elegans)의 수명을 비-자율 방식으로 조절할 수 있다는 것을 제안하였지만, 이런 신호의 성격은 기생충에서 확인되지 않았다 (Durieux et al., Cell 144, 79 (Jan 7, 2011). 이런 미토콘드리아-유래된 신호의 실체는 2001년에 발견되었을 수 있는데, 이때 현재 휴마닌 (HN)으로서 알려져 있는 24개 아미노산 펩티드가 알츠하이머 환자의 뇌의 생존 분획물로부터 작제된 cDNA 라이브러리로부터 클로닝되었고 미토콘드리아 16S rRNA 좌위에 지도화되었다 (Hashimoto et al., Proc Natl Acad Sci USA 98, 6336 (May 22, 2001). 그 이후로, HN은 부분적으로, 암 세포에 대한 IGFBP-3의 아폽토시스 작용을 길항작용하는 IGFBP-3 상대 (Ikonen et al., Proc Natl Acad Sci USA 100, 13042 (Oct 28, 2003)로서 다양한 암 세포에서 아폽토시스를 예방하는 Bax 길항제 (Guo et al., Nature 423, 456 (May 22, 2003)로서 역할로 인해, 세포보호성과 항아폽토시스성 인자인 것으로 나타났다. 더욱 최근의 작업은 HN이 넓은 스펙트럼 생존 인자라는 것을 지시한다 (Nishimoto et al., Trends Mol Med 10, 102 (Mar, 2004)), 하지만, 이의 정확한 작용 기전은 여전히 불분명하다.

미토콘드리아-유래된 휴마닌은 여러 핵-인코딩된 cDNA와 92-95% 동일성을 공유하는데, 이들은 발현이 검증되지 않은 더욱 큰 가상적인 유전자 내에서 도메인을 나타낸다 (Tajima et al., Neurosci Lett 324, 227 (May 24, 2002)). 미토콘드리아 기원의 HN 전사체는 신장, 고환, 뇌, 그리고 위장관에서 존재한다. 중요한 점은 휴마닌이 하등 생물체를 비롯하여, 종 사이에서 고도로 보존된다는 것이다 (90-100% 사이에 상동성). 상기 펩티드는 뇌와 고환에서 증명되었고, 그리고 우리는 이것이 혈장, CSF와 정액에서 1-10 ng/ml 농도에서 존재한다는 것을 확인하였다. HNG (S14G), HNG-F6A (비-IGFBP-3 결합, 이것은 제출된 공동 AECOM/UCLA 특허 하에 가능한 2형 당뇨병 치료제로서 최근에 보호되었다) 및 콜리벨린 (HN과 ADNF9의 부분적인 서열을 내포하는 하이브리드 펩티드)을 비롯하여, 더욱 유력한 작용을 갖는 HN의 신규한 돌연변이체와 유사체가 설명되었다. 휴마닌 및 이의 유사체와 유도체는 알츠하이머병, 당뇨병과 신부전을 비롯한 질환의 어레이에 대한 치료 잠재력을 보여주고 있다.

이러한 보고는 12S rRNA에서 신규한 개방 해독틀 (ORF)의 첫 번째 설명이다. 12S rRNA에서 이러한 신규한 ORF의 명칭은 투웰브 S rRNA 3에서 미토콘드리아 ORF (MOTS3)이다. HN (Y. Hashimoto et al., Proc Natl Acad Sci USA 98, 6336 (May 22, 2001))과 유사하게, MOTS3 전사체는 폴리아데닐화되고, 그리고 종 전역에서 충분히 보존되는 유전자 내에 유전자 구조를 암시한다.

MOTS3은 간, 심장, 고환에서 동일한 분자량에서 검출되지만, 생쥐와 쥐의 뇌에서는 약간 더 높은 분자량으로 발견된다. 이의 주요 생물학적 기능은 세포 배양액과 생쥐 둘 모두에서 미토콘드리아 호흡과 글루코오스 활용에 대한 강한 영향에 의한 대사 조절이다. MOTS3은 또한, 미토콘드리아 호흡, 글루코오스 활용, 인슐린 조절 및 세포 증식/생존에 영향을 주기 위해 시험관내에서와 생체내에서 다양한 방식으로 검사되었다.

게다가, MOTS3은 일반적인 물질대사 조절 역할을 갖는 미토콘드리아로부터 유래된 비독성 자연 펩티드이다. 이것은 강한 체중과 혈당 조절뿐만 아니라 mTOR 경로를 통한 당뇨병과 암에 대한 주요 약물 표적인 AMPK의 활성화를 제공하는 종류의 시초이다. 이것은 완전하게 신규한 범주의 약물, 다시 말하면, 단지 최근에 설명된 mtDNA-유래된 신호전달 펩티드로부터 유래된다. 따라서, MOTS3 및 이의 제약학적 제제는 많은 물질대사 함의를 갖는 다양한 연령-관련된 질환, 예를 들면, 암, 당뇨병, 비만, 그리고 신경변성 질환을 치료하는데 이용될 수 있지만, 상기 질환을 치유하는데 충분하지 않다.

따라서, 본 발명은 신규한 MOTS3 ORF 및 질환을 치료하기 위한 이들의 이용 방법을 개시한다.

발명의 간단한 요약

일정한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함한다. 일정한 구체예에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호:1에 80% 서열 동일성을 포함한다. 일정한 구체예에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호:1에 90% 서열 동일성을 포함한다. 일정한 구체예에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 번호:1의 서열을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 앞서 설명된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항체는 단일클론 항체이다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1에 80% 또는 90% 서열 동일성을 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1의 서열을 포함한다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 당뇨병을 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물의 치료 효과량을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1에 80% 또는 90% 서열 동일성을 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1의 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 당뇨병은 I형 당뇨병이다. 일정한 구체예에서, 당뇨병은 II형 당뇨병이다. 일정한 구체예에서, 개체는 인간이다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 비만 및/또는 지방간을 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물의 치료 효과량을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1에 80% 또는 90% 서열 동일성을 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1의 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 개체는 포유동물이다. 일정한 구체예에서, 개체는 인간이다.

일정한 구체예에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물의 치료 효과량을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1에 80% 또는 90% 서열 동일성을 포함한다. 일정한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호:1의 서열을 포함한다. 일정한 구체예에서, 개체는 인간이다. 일정한 구체예에서, 암은 유방암, 뇌암, 결장암, 흑색종, 백혈병 (가령, AML), 림프종, 췌장암, 전립선암, 난소암, 폐암, 그리고 위암으로 구성된 군에서 선택되는 암이다.

일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1을 인코딩하는 cDNA 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:2와 최소한 80%, 90% 또는 100% 동일한 cDNA를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:2와 최소한 80%, 90% 또는 100% 동일한 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명에서 본원에서 설명된 바와 같은 발현 벡터로 형질전환된 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.

도면의 간단한 설명
도면 1은 MOTS3이 미토콘드리아 12S rRNA로부터 폴리아데닐화된 전사체라는 것을 보여준다 (A). MOTS 3 서열은 다양한 생물체에서 충분히 보존된다 (B). 토끼 다중클론 항-MOTS3 항체는 과다발현된 MOTS3뿐만 아니라 세포에서 발현 벡터 내로 클로닝된 GFP 태그된 MOTS3을 인식한다 (C). MOTS3은 쥐 심장, 간, 그리고 고환에서 유사한 분자량에서 발견되지만, 뇌에서는 약간 더 높은 분자량에서 발견된다 (D). MOTS3은 미토콘드리아 DNA를 갖지 않는 Rho-0 세포에서 검출되지 않는다(E). CO I/II (시토크롬 옥시다아제 I/II)가 미토콘드리아 DNA의 결여를 실증하는데 이용되었다.
도면 2는 10%와 1% FBS 배양 조건 하에 미토콘드리아 활성에 대한 MOTS3의 효과를 묘사한다 (A). 미토콘드리아 환원효소 효소에 의한 MTT환원 및 산소 소모 비율 (OCR)과 세포외 산성화 비율 (ECAR; 젖산염 분비에 의해 만들어진 배지 내에서 pH 변화에 의한 당분해를 계측한다) (B).
도면 3은 미토콘드리아 호흡에 대한 외인성 MOTS3 처리의 효과를 묘사한다. 각 약물은 차트의 위쪽에서 설명된 특정한 물질대사 파라미터; 즉, 올리고마이신-ATP 회전, FCCP-최고 호흡 용량, 로테논-비-ATP 호흡을 조사하기 위해 처리되었다.
도면 4는 미토콘드리아 활성에 대한 형질감염에 의한 MOTS3 과다발현의 효과를 묘사한다. MOTS3의 다양한 이형이 클로닝되고 세포에서 발현되었다.
도면 5는 외인성 MOTS3의 효과를 묘사한다.
도면 6은 글루코오스 흡수와 당분해에 대한 외인성 MOTS3 처리의 효과를 묘사한다.
도면 7은 96 시간의 처리 이후에, MOTS3 (M3)이 대조 군 (C)과 비교하여 AMPK 활성화를 유의미하게 유도한다는 것을 보여준다. 이것은 도면 6에서, 96 시간의 처리 이후에 배지에서 글루코오스 이용가능성에서 급격한 감소와 상관한다.
도면 8은 MOTS3이 글루코오스 배지에서 세포 증식과 생존을 지연시키지만, 세포가 생존을 위해 미토콘드리아 기능에 주로 의지하도록 강제하는 갈락토오스 배지에서는 그렇지 않다는 것을 보여준다.
도면 9는 세포 증식에 대한 MOTS3의 세포내 발현의 효과를 묘사한다. MOTS3은 발현 벡터 내로 클로닝되고 세포 내로 형질감염되었다.
도면 10은 세포 노화에 대한 외인성 MOTS 3의 효과를 묘사한다. 노화는 노화 연관된 β-갈락토시다아제 수준에 의해 결정되었다 (청색).
도면 11은 MOTS3이 체중 및 간 미토콘드리아 호흡 능력을 감소시킨다는 것을 보여준다. 생쥐에서 4 일의 MOTS 3 주사 (i.p.; 0.5와 5.0 mg/kg/일)는 체중을 유의미하게 감소시켰지만 식품 섭취를 변화시키지 못하였다. 간 미토콘드리아 호흡 능력 또한, MOTS3의 양쪽 분량에서 감소되었다.
도면 12는 4 일 동안 MOTS3으로 처리된 생쥐가 감소된 혈당 수준 (A) 및 상승된 인슐린 수준 (B)을 보여준다는 것을 예증한다.
도면 13은 MOTS-c가 미토콘드리아 유전체에서 인코딩된 신규한 펩티드라는 것을 설명한다. a, MOTS-c는 미토콘드리아 유전체의 12S rRNA 내에서 51개 bp 개방 해독틀 (ORF)로서 인코딩된다. 미토콘드리아 유전자 코드의 이용은 탠덤 시작/종결 코돈을 산출하고, 반면 세포질 유전자 코드는 실용적인 펩티드를 산출한다. b, cDNA 단부의 3' 급속한 증폭 (3' RACE)은 MOTS-c와 휴마닌 전사체가 폴리아데닐화된다는 것을 보여준다. c, 미토콘드리아 DNA (mtDNA)에서 인코딩된 MOTS-c 및 진화를 통해 mtDNA로부터 이전된 핵 DNA (NUMT)에서 인코딩된 펩티드의 비교. d-e, 저분량 에티듐 브롬화물 (EtBr)에 연장된 노출을 통해 미토콘드리아 DNA를 결여하는 HeLa ρ0 세포는 d, qRT-PCR에 의해 12S rRNA와 MOTS-c 전사체, 그리고 e, MOTS-c뿐만 아니라 미토콘드리아-인코딩된 단백질 시토크롬 C 옥시다아제 I과 II (COI/II)의 검출할 수 없는 수준을 갖지만, 면역블롯팅에 의해 검출된 핵-인코딩된 GAPDH를 정상적으로 발현한다. f, HEK293 세포에서 MOTS-c (녹색)와 hsp60 (적색) 면역염색. 눈금자, 20μm. g-h, MOTS-c는 g, 생쥐와 쥐의 다양한 조직에서, 그리고 h, 인간과 설치류의 순환 (혈장)에서 검출된다. i-j, 공복, 물질대사 스트레스는 생쥐에서 i, 조직에서, 그리고 j, 혈장에서 내인성 MOTS-c의 발현을 변화시킨다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 도시된다. 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001
도면 14는 MOTS-c가 AICAR과 AMPK 신호전달을 통해 유전자 발현을 조정하고 물질대사를 조절한다는 것을 설명한다. a, 4-와 72-시간의 MOTS- c 처리 (10 μM; N=6) 후에 HEK293 세포에서 주성분 분석 (PCA). b, 유전자 세트 농축의 파라미터 분석 (PAGE)은 시간-의존성 전체 유전자 발현 변화를 더욱 보여주었다 (N=6). c, 상향조절된 유전자 (적색) 및 하향조절된 유전자 (청색)를 묘사하는 벤 다이어그램이 시점 마다 도시된다 (N=6). d, 물질대사와 염증에 관련된 다양한 유전자 세트에 대한 HEK293 세포 (10 μM; N=6)에서 72 시간의 MOTS-c 처리의 효과. e, 데노보 퓨린 생합성에 대한 MOTS-c의 효과. 펜토오스 인산염 경로 (PPP) 및 데노보 퓨린 생합성 경로 내로 NAD⁺ 공급 (N=5). 4-와 72- 시간의 MOTS-c에 의해 변화된 효소가 마이크로어레이 분석에 의해 결정되었다 (도면 18b). GAR: 글리신아미드 리보뉴클레오티드, FGAM: N-포르밀글리신아미딘 리보뉴클레오티드, AIR: 아미노이미다졸 리보뉴클레오티드, NCAIR: N5-카르복시아미노이미다졸 리보뉴클레오티드, SAICAR: N-숙시노카르복사미드-5-아미노이미다졸 리보뉴클레오티드. 칼라는 MOTS-c에 의한 변화를 지시한다; 적색: 상향조절, 청색: 하향조절, 그리고 회색: 계측되지 않음. f, MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293은 AICAR 수준을 유의미하게 증가시켰다 (N=5). g, MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포에서 데노보 퓨린 생합성 경로의 물질대사 중간체가 도시된다 (N=5). h, AICAR은 AMPK의 유력한 활성체이다. MOTS-c는 AMPK를 활성화시키고, 그리고 이의 하류 경로는 지방산 산화작용 (ACC와 CPT-1) 및 글루코오스 흡수 (GLUT-4)를 제어한다. i, MOTS-c는 AMPK와 Akt 인산화를 시간-과 용량 의존성 방식으로 증진한다. 데이터는 평균 ± SEM으로서 도시된다. 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001
도면 15는 MOTS-c가 세포 글루코오스, 미토콘드리아, 그리고 지방산 물질대사를 조정한다는 것을 설명하다. 다음의 계측: MOTS-c 처리 (10 μM; N=6) 후 세포 배양 배지에서 a, 글루코오스 및 b, 젖산염. c, 대사체학에 의해 검출된 MOTS-c-의존성 당분해 중간체 변화. d, 실시간 당분해 플럭스가 세포외 산성화 비율 (ECAR)에 의해 결정되었다 (N=6). 당분해, 당분해 능력, 그리고 당분해 예비력이 세포를 각각, 글루코오스, 올리고마이신, 그리고 2-데옥시글루코오스로 공격함으로써 추정되었다. e-f, 실시간 산소 소모 비율 (OCR)이 MOTS- c 처리 후 계측되었다 (N=6). e, ATP 회전, 그리고 최고 호흡 용량이 세포를 올리고마이신과 FCCP로 공격함으로써 추정되었고, 그리고 f, 여분의 호흡 용량, 양성자 누출, 그리고 커플링 효율이 계산되었다. g, 대사체학에 의해 결정된 MOTS-c 처리 후 TCA 중간체가 도시된다 (N=5). h, 세포 수가 글루코오스 또는 갈락토오스 배지 하에 MOTS-c 처리 후 계수되었다. 갈락토오스는 포유류 세포가 미토콘드리아 물질대사에 의존하도록 강제한다 (N=6). MOTS-c는 세포내 i, 아실-카르니틴 셔틀, j, 필수 지방산, 그리고 k, 대사체학에 의해 결정된 β-산화작용 중간체 미리스토일 CoA에서 변화를 유도하였다 (N=5). 데이터는 평균 ± SEM으로서 도시된다. 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001.
도면 16은 MOTS-c가 생쥐에서 중량, 물질대사 항상성, 그리고 인슐린 감수성을 조절한다는 것을 설명한다. a, 이계 교배된 CD-1 수컷 생쥐 (N=6)에서 주요 아디포킨 IL-6과 TNFα의 순환 수준에 대한 급성 4-일 MOTS-c (5 mg/kg/일; IP; BID) 처리의 효과. b-f, 고지방 식이 (칼로리로 60%) 또는 정합된 대조 식이 사양된 8- 주령 수컷 CD-1 생쥐 (N=10). MOTS-c가 매일 복막내 주사되었다 (0.5 mg/kg/일). b, 체중, c, 혈당, d, 인슐린, e, 간 H&E 염색, f, 골격근 AMPK 인산화와 GLUT4 수준. g, 수컷 C57BL/6 생쥐 (N=7)에서 수행된 복막내 내당성 검사 (IPGTT)에 대한 7 일 동안 급성 MOTS-c 처리 (5 mg/kg/일; IP)의 효과. h-j, 정상혈당-고혈당 클램프가 고지방 식이 (칼로리로 60%) 사양되고 7 일 동안 MOTS-c (5 mg/kg/일; IP)로 처리된 C57BL/6 생쥐 (N=6-8)에서 수행되었다. h, 전신 인슐린 감수성을 반영하는 글루코오스 주입 비율 (GIR), i, 근육 인슐린 감수성을 일차적으로 반영하는 인슐린-자극된 글루코오스 처분 비율 (IS-GDR), 그리고 j, 간 글루코오스 생산 (HGP). k-l, 어린 생쥐 (4-개월)와 늙은 생쥐 (32-개월) (N=3-4)에서 MOTS-c 수준은 k, 골격근에서, 그리고 l, 순환 (혈청)에서 감퇴한다. m, 어린 (3-개월) 및 더욱 나이든 (12-개월) 수컷 C57BL/6 생쥐 (N=6)의 가자미근 내로 인슐린-자극된 (60 μU/ml) 2-데옥시글루코오스 흡수에 대한 7 일 동안 급성 MOTS-c 처리 (5 mg/kg/일; IP)의 효과. n, MOTS-c 작용에 대해 제안된 모델. 데이터는 평균 ± SEM으로서 도시된다. 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001.
도면 17은 다음을 설명한다. a, MOTS-c 펩티드 서열이 고도로 보존된다. b, MOTS-c의 추정 번역후 수식. c, MOTS-c 항체가 산출되고 MOTS-c에 대한 특이성에 대해 면역블롯팅에 의해 검사되었다. pEV, pMOTS-c, pMOTS-c-EGFP, pEGFP로 형질감염된 HEK293 세포로부터 MOTS- c 검출을 보여주는 웨스턴 블롯. d, HEK293 세포가 단독으로 또는 MOTS-c 펩티드 (차단)의 존재에서 항-MOTS-c 항체 (녹색)로 염색되었다. e, HEK293 세포에서 MOTS-c (녹색)와 hsp60 (적색) 면역염색. 핵이 Hoechst 33258 (청색)로 염색되었다. 눈금자, 20μm. f, 혈장에서 MOTS-c를 계측하는데 이용된 인하우스 MOTS-c ELISA의 표준-곡선.
도면 18은 데노보 퓨린 생합성 경로에 대한 MOTS-c의 효과를 설명한다 (N=5). a, MOTS-c 처리 (10 μM; 24-와 72-시간 처리후)는 HEK293 세포에서 데노보 퓨린 생합성 경로를 조절한다. b, MOTS-c 처리 (10 μM)는 마이크로어레이 및 독창성 경로 분석 (IPA)에 의해 결정될 때 데노보 퓨린 생합성에 관련된 경로의 유전자 발현을 변경한다 (N=6). 대사체학 분석과의 오버레이에 대해 도면 14e를 참조한다. 적색: 상향조절, 녹색: 하향조절. 동일한 시점 내에서 군 간에 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001
도면 19는 아데닐산 시스템 성분과 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD) 주기 성분에 대한 MOTS-c의 효과를 설명한다. MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포에서 a, ATP, ADP, AMP, 그리고 환상 AMP (cAMP) 수준, 그리고 b, NAD⁺와 NADH 수준. EV: 빈 벡터로 안정되게 형질감염된 HEK293. 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001
도면 20은 대사체학에 의해 결정된, MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포에서 a, 퓨린 물질대사 및 b, 보조인자와 비타민 물질대사의 성분에 대한 MOTS-c의 효과를 설명한다 (N=5). EV: 빈 벡터로 안정되게 형질감염된 HEK293.
도면 21은 MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포에서 글루코오스와 젖산염의 세포외 (배양 배지) 수준 (N=6), 그리고 b, MOTS-c (10 μM; 72-시간)로 처리된 HEK293 세포에서, 형광 글루코오스 유사체 2-NBDG에 의해 결정된 세포내 글루코오스 섭취율 (N=3)에 대한 MOTS-c의 효과를 설명한다. 스튜던트 t 검증. ^*** P<0.001
도면 22는 대사체학에 의해 결정된, MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포에서 다양한 당 기질의 물질대사에 대한 MOTS-c의 효과를 설명한다 (N=5). EV: 빈 벡터로 안정되게 형질감염된 HEK293.
도면 23은 a, 당분해 및 b, HEK293 세포에서 24-와 72-시간의 외인성 MOTS-c (10 μM) 처리 이후에 펜토오스 인산염 경로 (PPP), 그리고 c, MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포에서 PPP의 대사체학에 의해 결정된 중간 대사산물을 설명한다 (N=5). EV: 빈 벡터로 안정되게 형질감염된 HEK293. 동일한 시점 내에서 군 간에 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001
도면 24는 대사체학에 의해 결정된, HEK293 세포에서 트리카르복실산 (TCA) 주기 중간체의 수준에 대한 외인성 MOTS-c 처리 (10 μM; 24- 또는 72-시간)의 효과를 설명한다 (N=5). 동일한 시점 내에서 군 간에 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001
도면 25는 HEK293 세포에서 산소 소모 비율 (OCR)에 대한 다양한 MOTS-c 발현 클론의 효과를 설명한다 (N=12). MOTS-c-HA: N 말단에서 HA로 태그된 MOTS-c; MOTS-c-IRES-GFP: 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)를 거쳐 GFP를 독립적으로 발현하는 발현 벡터 내로 클로닝된 MOTS-c; MOTS-c-HA-IRES-GFP: IRES-GFP와 함께 발현 벡터 내로 클로닝된 MOTS-c-HA. 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001
도면 26은 세포 산화환원 항상성이 글루타티온 시스템의 상태에 의해 결정되었다는 것을 설명한다. 환원된 형태 (GSH)와 산화된 형태 (GSSG)에서 글루타티온, 이들의 비율 (GSH/GSSG), 그리고 전체 글루타티온 수준 (GSH+GSSG)이 a, MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포에서 및 b, 외인성 MOTS-c (10 μM)로 처리된 HEK293 세포에서 24- 또는 72-시간 동안 결정되었다 (N=5), EV: 빈 벡터로 안정되게 형질감염된 HEK293. 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01
도면 27은 지질 물질대사에 대한 MOTS-c의 효과를 설명한다. a, MOTS-c는 MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포에서 지질 물질대사를 조절한다. 외인성 MOTS-c 처리 (10 μM; 24- 또는 72-시간)는 b, 카르니틴-셔틀 시스템 구성원, c, 필수 지방산, 그리고 d, β-산화작용 중간체 미리스토일-CoA의 수준을 조절한다. 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001
도면 28은 대사체학에 의해 결정된, a, MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포에서 및 b, 24- 또는 72- 시간 동안 외인성 MOTS-c (10 μM)로 처리된 HEK293 세포에서 긴 사슬 지방산의 수준을 설명한다 (N=5). EV: 빈 벡터로 안정되게 형질감염된 HEK293. 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001
도면 29는 CD-1 수컷 생쥐 (N=6)에서 a, 체중 변화 (%), b, 식품 섭취, c, 혈당, 그리고 d, 아디포킨에 대한 4 일 동안 급성 MOTS-c (5 mg/kg/일; IP; BID) 처리의 효과를 설명한다. e-f, 8 주 동안 고지방 식이 (칼로리로 60%) 사양된 생쥐의 e, 매일 식품 섭취 및 f, 전체 식품/칼로리 섭취에 대한 MOTS-c (0.5 mg/kg/일)의 효과. 동일한 시점 내에서 군 간에 스튜던트 t 검증. ^* P<0.05, ^** P<0.01
도면 30은 72-시간 동안 MOTS-c (10 μM)로 처리된 HEK293 세포에서 마이크로어레이 데이터를 설명한다 (N=6). 도면 14d를 참조한다.
도면 31은 외인성 MOTS-c 처리 (10 μM) 또는 안정되게 과다발현 MOTS-c 또는 빈 벡터 (EV) 후 24-와 72-시간에 유의미한 변화 (P≤0.05)와 경계선 유의미한 변화 (0.05<P<0.1)를 갖는 HEK293 세포에서 생화학물질 (대사산물)의 총수를 설명한다 (N=5). 적색: 증가된, 청색: 줄어든. Welch의 이표본 t 검증.
도면 32는 도면 16 h-j에서 정상혈당-고인슐린혈증 클램프 연구로부터 물질대사 파라미터와 순환 인자를 설명한다. 스튜던트 t 검증.
도면 33은 6 일자 공복 혈당을 설명한다. ZDF 당뇨병성 쥐는 그들의 혈당이 >300 ng/ml일 때까지 추적되었는데, 이러한 시점에서 처리는 6 일 동안 8 AM에서 IV 제공된 2회 분량의 MOTS-c 또는 인슐린 중에서 한 가지로 시작되었다. 군당 6마리 쥐가 이용되었다. 공복 혈당이 6-일 후에 계측되었다. ANOVA와 스튜던트 t 검증이 분석과 p-값에 이용되었다.
도면 34는 6 일자에 혈당에서 절대적 변화를 설명한다. 도면 33에서 설명된 동일한 실험에서, 혈당에서 절대적 변화가 도시된다. 식염수 처리된 ZDF 쥐는 그들의 혈당에서 100 ng/ml의 추가 상승을 전시한다. 매일 인슐린으로 처리된 쥐는 그들의 혈당을 기준선과 유사한 수준에서 안정시키는 반면, MOTS-c 처리된 쥐 (400 그램 쥐마다 1 mg)는 그들의 혈당의 실제적인 감소를 보여준다.
도면 35는 MOTS-c가 증가된 글루코오스 흡수와 젖산염 생산에 의해 증거된 당분해 플럭스를 자극한다는 것을 설명한다. MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 HEK293 세포의 배양 배지에서 세포외 (A) 글루코오스 및 (B) 젖산염 (N=6)
도면 36은 정상 사료 사양된 생쥐에서, MOTS-c가 시험관내에서 세포 글루코오스 플럭스를 증강하고 급성 처리가 글루코오스 수준을 감소시킨다는 것을 설명한다. 인슐린-감수성을 검사하기 위해, 우리는 생쥐를 7 일 동안 MOTS-c (5 mg/kg/일)의 복강내 주사로 처리하고, 그리고 이후, 이들을 수컷 C57BL/6 생쥐 (N=7)에서 내당성 검사 (GTT; 1g/kg 글루코오스)에 종속시켰다. 우리는 향상된 인슐린 감수성을 지시하는 유의미하게 증강된 글루코오스 소실을 확인하였다.
도면 37은 고지방 식이 (칼로리로 HFD 60%)의 배경에서 물질대사에 대한 MOTS-c (0.5 mg/kg/일; IP)의 효과의 검사를 설명한다 (N=10). 비록 MOTS-c 처리는 정상 사료가 사양될 때 체중에 대한 효과가 없었지만, HFD 사양된 생쥐에서 비만을 두드러지게 예방하였다 (A). (B-C) 체중에서 이러한 차이는 식품 섭취에 기인하지 않았는데, 그 이유는 칼로리 섭취가 군 간에 동일하였기 때문이다. (D-E) 부가적으로, MOTS-c 처리는 HFD-유도된 고인슐린혈증을 예방하였는데, 이것은 향상된 글루코오스 항상성을 지시하였다. (F) MOTS-c는 또한, 간 H&E 염색에 의해 결정된 HFD-유도된 지방간을 감소시켰다.
도면 38은 상이한 유전자 배경으로부터 생쥐, C57BL/6 (N=12)에서 고지방 식이 (칼로리로 HFD 60%)에 대한 MOTS-c (5.0 mg/kg/일; IP)의 효과의 검사를 설명한다. (A) CD-1 생쥐와 유사하게, MOTS-c 처리는 HFD 사양된 C57BL/6 생쥐에서 비만을 예방하였다. (B) 감소된 체중 증가는 내장 지방의 감소된 수준에 부분적으로 기인할 수 있다. (C) 체중에서 이러한 차이는 더욱 적은 식품 섭취에 기인하지 않았다. 게다가, MOTS-c 처리는 HFD-유도된 고인슐린혈증을 예방하였는데, 이것은 향상된 글루코오스 항상성을 지시하였다 (D-E). ND: 정상 식이, HFD: 고지방 식이.
도면 39는 정상 식이 사양되고 MOTS-c (5 mg/kg/일; BID, 4 일) 또는 운반제 대조로 처리된 이계 교배된 CD-1 수컷 생쥐 (N=6)에서 전신 물질대사에 대한 MOTS-c의 효과를 보여준다. MOTS-c로 처리 (4-일)는 체중, 식품과 혈당 수준을 감소시켰다. 또한, 비만과 인슐린 저항성의 병인에 연루되는 순환하는 IL-6과 TNFα (A)의 기저 수준이 MOTS-c 처리에 의해 유의미하게 감소되었다.
도면 40은 암 세포가 자신의 만연한 성장을 뒷받침하기 위해 정상이 아닌 물질대사를 갖는 것으로 알려져 있다는 것을 보여준다. MOTS-c는 물질대사 항상성의 조절인자이고, 그리고 악성 세포의 증식 능력에 영향을 준다. MOTS-c를 안정되게 과다발현하는 유방암 세포 (4T1)는 (A) 감소된 증식 비율 및 (B) 감소된 호흡을 보여준다. 또한, (C) MOTS-c 처리는 피하 동종이식 생쥐 모델에서 유방암 (4T1) 증식을 지연시켰다; (D) MOTS-c 처리는 안정된 체중 유지에 의해 반영된 바와 같이 독성이 아니었다.
도면 41은 유방암과 유사하게, MOTS-c가 전립선암 세포의 성장 역시 지연시키다는 것을 보여준다. (A) MOTS-c 처리는 시험관내에서 전립선암 세포 (22Rv1) 증식을 지연시켰다. (B-C) 또한, MOTS-c 처리는 피하 동종이식 생쥐 모델에서 전립선암 (22Rv1) 증식을 지연시켰다; (D) MOTS-c 처리는 안정된 체중 유지에 의해 반영된 바와 같이 독성이 아니었다.
도면 42는 MOTS-c 처리가 시험관내에서 4가지 상이한 전립선암 세포주의 증식을 용량 의존성 방식으로 지연시킨다는 것을 설명한다. MTT 환원이 세포 증식을 사정하는데 이용되었고, 그리고 대조에 대한 상대적 양 (RQ)이 제공된다. 세포는 최적 성장 조건에서 48-72 시간 동안 처리되었다.

정의

편의를 위해, 본 명세서, 실시예, 그리고 첨부된 청구항에서 이용된 일정한 용어와 관용구의 의미가 아래에 제공된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "당뇨병"은 손상된 인슐린 생산과 내당성에 의해 특징화되는 장애의 광범위한 부류를 지칭한다. 당뇨병은 1형과 2형 당뇨병 (또한, 각각 소아와 성체-개시 당뇨병으로 불린다), 임신성 당뇨병, 당뇨병전증, 인슐린 저항성, 대사 증후군, 그리고 내당성 장애를 포함한다. 통상적인 증상은 빈뇨, 과도한 갈증, 극심한 배고픔, 특이한 체중 감소, 증가된 피로, 자극감수성, 그리고 흐린 시야를 포함한다. 이들 개별 장애의 진단은 아래에 더욱 상세하게 설명된다.

I형 당뇨병은 또한, 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM), 1형 당뇨병, 그리고 소아 당뇨병으로서 알려져 있다. 이들 용어는 본원에서 교체가능하게 이용된다. 상기 질환의 치료와 진단은 아래에 더욱 상세하게 설명된다.

"췌장 베타 세포," "베타 도세포," 및 유사한 용어는 랑게르한스의 섬에서 발견된 췌장 내분비 세포의 개체군을 지칭한다. 베타 도세포는 인슐린과 아밀린을 생산하고 혈류 내로 분비한다.

본원에서 이용된 바와 같이, "세포 생존을 향상시키는"은 대조와 비교하여 소정의 조건에서 생존하는 세포의 숫자, 예를 들면, 치료의 부재에서 동일한 조건에서 생존할 세포의 숫자에서 증가를 지칭한다. 조건은 시험관내, 생체내, 탈체, 또는 원지일 수 있다. 향상된 세포 생존은 비교 값, 예를 들면, 세포 생존이 2-배 향상되면 생존하는 2배수의 세포로서 표현될 수 있다. 향상된 세포 생존은 아폽토시스에서 감소, 세포의 수명에서 증가, 또는 세포 기능과 상태의 향상으로부터 발생할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포 생존은 대조 수준과 비교하여, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 향상된다. 일부 구체예에서, 세포 생존은 대조 수준의 2-, 3-, 4-, 5-, 또는 10-배이다. 대안으로, 향상된 세포 생존은 아폽토시스에서 백분율 감소로서 표현될 수 있다. 일부 구체예에서, 예로서, 아폽토시스는 대조 표본과 비교하여, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%까지 감소된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "장애를 예방하는"은 절대적 용어로서 의도되지 않는다. 대신에, 예로서 1형 당뇨병의 예방은 개시의 지연, 증상의 감소된 빈도, 또는 장애와 연관된 증상의 감소된 심각도를 지칭한다. 예방은 이런 이유로, 당업자에 의해 이해될 광범위한 범위의 예방적 조치를 지칭한다. 일부 상황에서, 증상의 빈도와 심각도는 예로서, 개체가 전통적인 인슐린 보상 요법을 필요로 하지 않도록 비-병리학적 수준까지 감소된다. 일부 상황에서, 본 발명의 조성물을 투여 받는 개체의 증상은 장애를 앓는 치료되지 않은 개체에 의해 경험되는 증상의 빈도 또는 심각도의 단지 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 또는 1%이다.

유사하게, 용어 "장애를 치료하는"은 절대적 용어인 것으로 의도되지 않는다. 일부 양상에서, 본 발명의 조성물은 당뇨병성 증상을 야기하는 인슐린 생산 세포의 상실을 감소시키는 것을 탐색한다. 일부 상황에서, 본 발명의 조성물로 치료는 향상된 예후 또는 증상의 빈도 또는 심각도에서 감소를 야기한다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료 또는 예방이 필요한 개체"는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 당뇨병전증, 인슐린 저항성, 대사 증후군, 또는 내당성 장애로 진단된 개체, 또는 이들 장애 중에서 한 가지가 발달할 위험에 처해있는 개체를 지칭한다. 치료가 필요한 개체에는 또한, 췌장에 영향을 주는 손상, 질환, 또는 외과 시술을 겪은 개체, 또는 만약 그렇지 않으면, 인슐린을 만드는 능력에서 손상된 개체가 포함된다. 이런 개체는 임의의 포유동물, 예를 들면, 인간, 개, 고양이, 말, 돼지, 양, 소, 생쥐, 쥐, 토끼, 또는 영장류일 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성의 백분율"은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교 윈도우 위에서 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 이들 두 서열의 최적 정렬을 위해, 부가 또는 결실을 포함하지 않는 참고 서열 (가령, 본 발명의 폴리펩티드)와 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 숫자를 결정하여 정합된 위치의 숫자를 산출하고, 정합된 위치의 숫자를 비교 윈도우에서 위치의 총수로 나눗셈하고, 그리고 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.

본원에서 이용된 바와 같이, 2개 또는 그 이상 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 서열인 2개 또는 그 이상 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 서열은 다음의 서열 비교 알고리즘 중에서 한 가지를 이용하여 또는 수동 정렬과 시각적 검사에 의해 계측될 때 지정된 영역인 비교 윈도우 위에서, 또는 지시되지 않는 경우에 전체 서열에 걸쳐 최고 상응을 위해 비교되고 정렬될 때, 두 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정된 백분율 (즉, 특정된 영역에 걸쳐, 또는 특정되지 않으면, 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의선택적으로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성)을 가지면, "실제적으로 동일하다." 본 발명은 실제적으로 동일한 폴리펩티드를 인코딩하거나, 또는 본원에서 예시된 폴리펩티드 (가령, 휴마닌)와 실제적으로 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 정의는 또한, 뉴클레오티드 검사 서열의 보체를 지칭한다.

"당뇨병전증성 개체"는 110 mg/dl보다 크지만 126 mg/dl보다 적은 공복 혈당 수준 또는 140 mg/dl보다 크지만 200 mg/dl보다 적은 2 시간 PG 시도를 갖는 성체를 지칭한다. "당뇨병성 개체"는 126 mg/dl보다 큰 공복 혈당 수준 또는 200 mg/dl보다 큰 2 시간 PG 시도를 갖는 성체를 지칭한다.

발명의 상세한 설명

도입

10년 전, 첫 번째 미토콘드리아-유래된 펩티드 (MDP), 휴마닌 (HN)이 알츠하이머 환자의 뇌의 영향을 받지 않은 분획물로부터 작제된 cDNA 라이브러리로부터 클로닝되고 미토콘드리아 16s rRNA 좌위에 지도화되었다. HN은 세포보호성과 항아폽토시스성 인자인 것으로 나타났다 (Bachar, A.R., et al., (2010). 휴마닌은 인간 혈관 벽에서 발현되고 산화된 LDL-유도된 산화 스트레스에 대항하여 세포보호성 효과를 갖는다. Cardiovascular research 88, 360-366; Guo, B., et al., (2003). 휴마닌 펩티드는 Bax 활성화를 간섭함으로써 아폽토시스를 억제한다. Nature 423, 456-461; Hashimoto, Y., et al.. (2001). 넓은 스펙트럼의 가족성 알츠하이머병 유전자와 Abeta에 의해 뉴런 세포 사멸을 전폐하는 구조 인자. Proc Natl Acad Sci USA 98, 6336-6341; Hoang, P.T., et al., (2010). 신경생존 인자 휴마닌은 신호 변환부 및 전사 3 활성화의 활성체를 거쳐 베타-세포 아폽토시스를 저해하고 비비만성 당뇨병성 생쥐에서 당뇨병을 지연하고 개선한다. Metabolism: clinical and experimental 59, 343-349; 그리고 Ikonen, M., et al. (2003). 알츠하이머의 생존 펩티드 휴마닌 및 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 3 사이에 상호작용은 세포 생존과 아폽토시스를 조절한다. Proc Natl Acad Sci USA 100, 13042-13047). 현재, HN 생물학의 다양한 양상을 설명하는 130여건의 간행물이 있다.

이전 관찰 결과를 구축하는, 12S rRNA 내에 인코딩되고 MOTS3 (12개 S rRNA 내에 미토콘드리아 개방 해독틀)으로 명명된 추가 MDP가 인실리코에서 발견되고 본원에서 개시된다 (표 1).

MOTS3의 서열과 위치 (서열 번호:1 및 서열 번호:2).

명칭	번역	위치	영역	서열	#AA
MOTS3	세포질	1343-1393	696-746	MRWQEMGYIFYPRKLR (서열 번호:1) ATGAGGTGGCAAGAAATGGGCTACATTTTCTACCCCAGAAAACTACGATAG (서열 번호:2)	16

본원에서 보고된 바와 같이, MOTS3은 미토콘드리아 기능/물질대사 및 글루코오스 활용을 조정함으로써 세포 물질대사 상태를 이동시킨다. 이것은 미토콘드리아가 질환의 병인 또는 유지/진행에서 주요한 역할을 수행하는 다양한 질환, 예를 들면, 암, 당뇨병, 지방간, 신경변성 질환, 고혈압, 그리고 노화에서 적용되는 많은 잠재력을 갖는다.

게다가, 미토콘드리아 기능장애는 알츠하이머병 (AD)을 비롯한 신경변성 장애뿐만 아니라 고혈압의 병인에서 핵심적인 역할을 수행한다.

암에서, 미토콘드리아는 특징 만연한 증식을 공급하는 생합성 전구체 생산을 위한 중심 소기관인데, 이것은 MOTS3-의존성 미토콘드리아 기능 억제 및 감소된 세포 증식에 의해 대항될 수 있다 (Ward and Thompson, (2012) Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate. Cancer cell 21, 297-308).

대사성 질환, 예를 들면, 비만과 지방간 역시 MOTS3으로 치료될 수 있었는데, 그 이유는 이것이 동일한 양의 식품 소비 하에 체중 및 간 미토콘드리아 호흡을 조절하는데 효과적이기 때문이다 (도면 11). 당뇨병에서, 아데노신 5′-일인산염 (AMP)-활성화된 단백질 키나아제 (AMPK)를 활성화시키는 약물, 예를 들면, 메트포르민과 AICAR은 글루코오스 항상성을 조절하는 것으로 충분히 방증되었고 현재 진료소에서 이용되고 있다 (Zhang et al., (2009) AMPK: an emerging drug target for diabetes and the metabolic syndrome. Cell metabolism 9, 407-416). 따라서, MOTS3은 또한, AMPK의 강한 활성체 (도면 6)일 뿐만 아니라 글루코오스 수준의 유의미한 조절인자 (도면 12A)이고, 따라서 당뇨병을 치료하는데 이용될 수 있었다.

당뇨병

II형 당뇨병 (인슐린 비의존성 당뇨병)은 특히 선진국에서 급속히 증가하고 있는 통상적인 대사 장애이다. 이것은 인슐린 저항성, 인슐린 결핍 및 과혈당증에 의해 특징화될 수 있다. II형 당뇨병과 연결되는 인자는 상승된 콜레스테롤, 비만과 고혈압을 포함한다.

II형 당뇨병은 여러 해 동안 진단되지 않을 수도 있는데, 그 이유는 증상이 산발적일 수 있고 I형 당뇨병과 연관된 것들보다 분명히 온건하기 때문이다. 하지만, 치료되지 않은 II형 당뇨병 환자에서 상승된 혈당 수준은 신장, 눈과 심혈관계의 기능적 장애를 야기할 수 있다.

게다가, II형 당뇨병은 베타 세포가 인슐린 저항성을 보상하지 못함에 의해 유발될 수 있다. 높은-칼로리 식이 및 불충분한 근육노동은 비만과 II형 당뇨병의 병인에 관련된 중요한 환경적 인자인 것으로 보인다. 환경적 인자는 2가지 주요 표적을 통해 행동하는 것으로 보인다. 한 가지는 대다수의 조직에서 인슐린 및 다른 호르몬에 의해 조절되는 바와 같이, 글루코오스, 지방산 및 다른 대사산물의 처리, 그리고 다른 것은 베타 세포 기능이다.

비만은 주요 공중 보건 문제가 되고 있다. 비만에 의해 유발된 또는 악화된 건강 상태는 고혈압, 진성 당뇨병, 수면 무호흡, 비만-관련된 호흡저하, 배부와 관절 문제, 심혈관 질환, 비알코올성 지방간 질환 및 위식도 역류병을 포함한다.

체질량 지수 (BMI) (신장 (미터 단위)의 제곱에 의해 나눠진 중량 (킬로그램 단위)로서 계산됨)는 체중과다 및/또는 비만에 대한 가장 흔히 인정되는 치수이다. 25를 초과하는 BMI는 체중과다인 것으로 고려되고, 반면 비만은 30 또는 그 이상의 BMI로서 규정되고, 35 또는 그 이상의 BMI는 심각한 동반이환으로서 고려되고, 그리고 40 또는 그 이상의 BMI는 병적 비만인 것으로 고려된다.

I형 당뇨병은 림프구에 의한 섬의 침윤 이후에 췌장 베타 세포의 진행성 파괴에 의해 특징화되는 자가면역 질환이다. 이것은 인슐린 결핍을 유발한다.

아폽토시스는 1형 당뇨병의 발달 동안 베타 세포 사멸의 주요 방식이다 (O'Brien et al. (1997) Diabetes 46:750-57). IL-1, TNF-알파와 IFN-감마가 이러한 자가면역 반응 동안 T 세포와 대식세포에 의해 방출되고, 그리고 베타 세포 파괴의 중요한 매개체이다 (Eizirik and Mandrup-Poulsen (2001) Diabetologia 44:2115-2133).

인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-3 (IGFBP-3)은 IGF 결합에 관련 없는 방식으로 아폽토시스를 유도한다 (Rajah et al. (1997) J Biol Chem. 272:12181-88). 친염증성 Th1 사이토킨은 내인성 IGFBP-3의 핵내 응집을 증가시키고, 그리고 베타 세포에 외인성 IGFBP-3의 첨가는 아폽토시스를 유도한다 (Shim et al. (2004) Growth Norm IGF Res. 14:216-25). IGFBP-3은 중추신경계에서 행동하여 글루코오스 물질대사를 조절하는 것으로 밝혀진, 인슐린, 렙틴, 아디포넥틴, 그리고 레시스틴을 비롯한 다수의 펩티드 중에서 한 가지이다 (Muse et al. (2007) J Clin Invest. 117:1670-78; Obici et al. (2002) Nat Med 8:1376-82). 아폽토시스에 의한 베타 세포 상실은 또한, 섬 이식 후에 발생한다 (Paraskevas et al. (1999) FEBS Lett. 455:203-8); Tobiasch et al. (2001) J Investig Med. 49:566-71). 최근 연구는 단리된 인간 섬이 항아폽토시스성 단백질 Bcl-2보다 친아폽토시스성 단백질 Bax를 더욱 높은 수준에서 발현한다는 것을 증명하였다 (Thomas et al. (2002) Transplantation 74:1489).

백만 명 이상의 미국 사람들이 I형 당뇨병을 앓고 있다. 미국 당뇨병 학회에 따르면, 상기 질환은 매년 수천 명의 사망 및 연간 $20 십억보다 많은 비용을 유발한다. I형 당뇨병에 대해 가용한 효과적인 치료적 또는 방지적 작용제가 요구된다.

I형과 II형 당뇨병을 치료하고 예방하는 방법을 개발하는 것이 요구된다. 따라서, 본 발명의 일정한 구체예에서, MOTS3 및 이의 제약학적 조성물은 I형과 II형 당뇨병을 치료하고 예방하는데 이용될 수 있다.

암

암은 현대 사회에 대한 심각한 위협이다. 전 세계적으로, 10 백만 이상의 사람들이 매년 암으로 진단되고, 그리고 이러한 숫자는 2020년까지 매년 15 백만 건의 새로운 사례로 증가할 것으로 추정된다. 암은 매년 6 백만 명의 사망 또는 전 세계적으로 사망의 12%를 유발한다.

악성 암성 성장은 그들의 독특한 특징으로 인해, 현대 의학에 대한 심각한 도전을 제기한다. 이들의 특징은 악성 조직의 조절되지 않은 성장을 유발하는 통제할 수 없는 세포 증식, 국부와 심지어 원위 조직을 침입하는 능력, 분화의 결여, 검출가능한 증상의 결여 및 가장 유의미하게는, 효과적인 요법과 예방의 결여를 포함한다.

암은 임의의 연령에서 임의의 장기의 임의의 조직에서 발달할 수 있다. 암의 병인은 명확하게 규정되지 않지만, 기전, 예를 들면, 유전적 감수성, 염색체 손상 장애, 바이러스, 환경적 인자 및 면역학적 장애 모두 악성 세포 성장과 형질전환에 연관되었다. 암은 전 세계적으로 수백 만 명의 개체에 영향을 주는 큰 범주의 의학적 장애를 포괄한다. 암 세포는 신체의 거의 모든 장기 및/또는 조직에서 발생할 수 있다. 암은 신체 부위 내에 세포가 통제불능으로 성장하거나 또는 분화하기 시작할 때 발달한다. 모든 암 유형은 비정상적인 세포의 통제불능 성장으로 시작한다.

뇌암, 결장암, 흑색종, 백혈병 (가령, AML), 림프종, 췌장암, 전립선암, 난소암, 폐암, 그리고 위암이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 많은 유형의 암이 있다.

현재, 가용한 주요 치료 중에서 일부는 수술, 방사선 요법, 그리고 화학요법이다. 수술은 종종 극단적인 조치이고 심각한 결과를 초래할 수 있다. 가령, 난소암에 대한 모든 치료는 불임을 유발할 수 있다. 자궁경부암과 방광암에 대한 일부 치료는 불임 및/또는 성기능장애를 유발할 수 있다. 췌장암을 치료하는 외과 시술은 췌장의 부분적인 또는 전체 제거를 유발할 수 있고, 그리고 유의미한 위험을 환자에게 동반할 수 있다. 유방암 수술은 부분 또는 전체 유방의 제거를 필연적으로 수반한다. 전립선암에 대한 일부 외과 시술은 요실금과 발기 불능의 위험을 동반한다. 폐암 환자에 대한 시술은 종종, 유의미한 수술후 통증을 유발하는데, 그 이유는 암성 폐 조직에 접근하고 이를 제거하기 위해 늑골이 갈라져야 하기 때문이다. 이에 더하여, 폐암 및 다른 폐 질환, 예를 들면, 기종 또는 만성 기관지염 둘 모두를 앓는 환자는 전형적으로, 수술 이후에 그들의 숨가쁨에서 증가를 경험한다. 방사선 요법은 암 세포를 사멸하는 이점을 갖지만, 이것은 또한, 비암성 조직을 동시에 손상시킨다. 화학요법은 환자에 다양한 항암제의 투여를 필요로 하지만, 종종 불리한 부작용을 동반한다.

따라서, 암을 치료하고 예방할 수 있는 방법이 여전히 요구된다. 이들 방법은 인간 및 다른 포유동물에서 암의 예방과 치료에서 유용한 제약학적 조성물에 대한 기초를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일정한 구체예에서, MOTS3 및 이의 제약학적 조성물은 암을 치료하고 예방하는데 이용될 수 있다. 구체적으로, 무제한적 실례로서, MOTS3 및 이의 제약학적 조성물은 뇌암, 결장암, 흑색종, 백혈병 (가령, AML), 림프종, 췌장암, 전립선암, 난소암, 폐암, 그리고 위암을 치료하고 예방하는데 이용될 수 있다.

지방간 및 비만

지방간 질환 (FLD)으로서 또한 알려져 있는 지방간은 트리글리세리드 지방의 공포가 간에서 축적하는 가역성 질환이다. 간 세포에서 지방 축적의 과정은 지방증으로서 알려져 있다.

비만은 너무 많은 체지방을 갖는 것을 설명하기 위한 일반 용어이다. 비만은 개체가 자신이 태울 수 있는 것보다 많은 칼로리를 섭취하고, 지방의 저장을 야기할 때 발생한다. 비만은 개체가 필요한 것보다 많은 칼로리를 섭취하고, 하지만 충분한 운동을 하지 않음으로써 유발된다. 비만을 사정하기 위한 가장 흔한 방법 중에서 2가지는 체질량 지수 (BMI) 및 허리 둘레이다. BMI는 신장과 체중을 이용하여 계산된다. 높은 BMI, 즉, 비만은 II형 당뇨병, 심장병, 그리고 뇌졸중의 위험을 증가시킨다.

따라서, 지방간 질환과 비만을 치료하고 예방할 수 있는 방법이 여전히 요구된다. 따라서, 본 발명의 일정한 구체예에서, MOTS3 및 이의 제약학적 조성물은 지방간 질환과 비만을 치료하고 예방하는데 이용될 수 있다.

폴리펩티드의 발현과 정제

본 발명의 자연발생, 합성, 또는 재조합 폴리펩티드는 조성물 및 기능적 검정에서 이용을 위해 정제될 수 있다. 본 발명의 자연발생 폴리펩티드는 임의의 공급원으로부터 정제될 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 임의의 적절한 발현 시스템 (가령, 포유류, 곤충, 효모, 또는 세균 세포 배양액)으로부터 정제될 수 있다.

본 발명의 펩티드 (즉, MOTS3 및 MOTS3 유사체)는 변형된 펩티드 및 합성 펩티드 유사체 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 펩티드는 서열 번호:1과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일한 펩티드이다. 일부 구체예에서, 펩티드는 서열 번호:1을 포함하는 펩티드이다. 일부 구체예에서, 펩티드는 서열 번호:1이다. 본원에서 설명된 바와 같은 펩티드는 비펩티드성 구조를 함입함으로써, 조제와 보관 성질을 향상시키거나, 또는 불안정 펩티드 결합을 보호하기 위해 변형될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 당분야에서 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 가령, 펩티드는 예로서, 고체상 기술 및/또는 자동화된 펩티드 합성장치를 이용한 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 일정한 사례에서, 펩티드는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 화학을 이용하여 자동화된 복수 펩티드 합성장치 (Abimed AMS 422)에서 고체상 전략을 이용하여 합성될 수 있다. 펩티드는 이후, 역상-HPLC에 의해 정제되고 동결건조될 수 있다.

재조합 접근법을 위해, 본 발명은 본원에서 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산, 이들 핵산을 포함하는 발현 벡터, 그리고 이들 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 MOTS3 펩티드 및 MOTS3 활성을 갖는 MOTS3 펩티드 유사체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공하고, 이들 펩티드에는 서열 번호:1이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일한 펩티드를 인코딩하는 cDNA 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1을 인코딩하는 cDNA 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:2와 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일한 cDNA를 포함한다.

재조합 단백질이 형질전환된 세균에 의해 대량으로 발현되는 경우에, 전형적으로 프로모터 유도 후, 비록 발현이 구조성일 수 있지만, 이들 단백질은 불용성 응집체를 형성할 수 있다. 단백질 봉입체의 정제에 적합한 여러 프로토콜이 있다. 가령, 응집 단백질 (아래에 봉입체로서 지칭됨)의 정제는 전형적으로, 하지만 제한 없이, 약 100-150 μg/ml 라이소자임 및 0.1% Nonidet P40, 비이온성 세정제의 완충액에서 배양에 의한 세균 세포의 붕괴에 의한 봉입체의 추출, 분리 및/또는 정제를 전형적으로 수반한다. 세포 현탁액은 Polytron 그라인더 (Brinkman Instruments, Westbury, N.Y.)를 이용하여 갈아질 수 있다. 대안으로, 이들 세포는 얼음 위에서 초음파처리될 수 있다. 세균을 용해하는 대안적 방법은 Ausubel et al. 및 Sambrook et al., (둘 모두 상기)에서 설명되고, 그리고 당업자에게 명백할 것이다.

세포 현탁액은 일반적으로 원심분리되고, 그리고 봉입체를 내포하는 펠렛은 봉입체를 용해시키지 않지만 세척하는 완충액, 예를 들면, 20 mM Tris-HCl (pH 7.2), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl 및 2% Triton-X 100, 비이온성 세정제에서 재현탁된다. 가능한 많은 세포 조직파편을 제거하기 위해 세척 단계를 반복하는 것이 필요할 수도 있다. 봉입체의 나머지 펠렛은 적절한 완충액 (가령, 20 mM 인산나트륨, pH 6.8, 150 mM NaCl)에서 재현탁될 수 있다. 다른 적절한 완충액은 당업자에게 명백할 것이다.

세척 단계 이후에, 봉입체는 강한 수소 수용자 및 강한 수소 공여자 둘 모두인 용매 (또는 이들 성질 중에서 한 가지를 각각 갖는 용매의 조합)의 첨가에 의해 가용화된다. 봉입체를 형성한 단백질은 이후, 양립성 완충액으로 희석 또는 투석에 의해 복원될 수 있다. 적합한 용매에는 요소 (약 4 M 내지 약 8 M), 포름아미드 (최소한 약 80%, 부피/부피 기초), 그리고 구아니딘 염산염 (약 4 M 내지 약 8 M)이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 응집체-형성 단백질을 가용화시킬 수 있는 일부 용매, 예를 들면, SDS (황산도데실나트륨) 및 70% 포름산은 면역원성 및/또는 활성의 결여를 동반하는, 이들 단백질의 비가역성 변성의 가능성으로 인해 이러한 절차에서 이용에 부적절하다. 비록 구아니딘 염산염 및 유사한 작용제가 변성제이긴 하지만, 이러한 변성은 비가역성이 아니고, 그리고 복원이 변성제의 제거 (가령, 투석에 의해) 또는 희석 시에 일어날 수 있고, 관심되는 면역학적으로 및/또는 생물학적으로 활성 단백질의 재형성을 가능하게 한다. 용해화 후, 단백질은 표준 분리 기술에 의해 다른 세균 단백질로부터 분리될 수 있다.

대안으로, 단백질을 세균 주변세포질로부터 정제하는 것이 가능하다. 단백질이 세균의 주변세포질 내로 이출되는 경우에, 세균의 주변세포질 분획물은 당업자에게 공지된 다른 방법에 더하여, 차가운 삼투압 충격에 의해 단리될 수 있다 (참조: Ausubel et al., 상기). 재조합 단백질을 주변세포질로부터 단리하기 위해, 세균 세포는 펠렛을 형성하도록 원심분리된다. 펠렛은 20% 수크로오스를 내포하는 완충액에서 재현탁된다. 세포를 용해하기 위해, 세균은 원심분리되고, 그리고 펠렛은 얼음같이 차가운 5 mM MgSO₄에서 재현탁되고 얼음 욕조에서 대략 10 분 동안 유지된다. 세포 현탁액은 원심분리되고, 그리고 상층액은 옮겨 부어지고 저장된다. 상층액 내에 존재하는 재조합 단백질은 당업자에게 널리 공지된 표준 분리 기술에 의해 숙주 단백질로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄과 같은 물질로 선별적인 침전; 칼럼 크로마토그래피, 면역정제 방법, 그리고 기타 등등을 비롯한 표준 기술에 의해 실제적인 순도까지 정제될 수 있다 (가령, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); U.S. 특허 번호 4,673,641; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 보충); 그리고 Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., (1989)를 참조한다).

폴리펩티드가 정제될 때 다수의 절차가 이용될 수 있다. 가령, 폴리펩티드는 이온 교환 또는 면역친화성 칼럼을 이용하여 정제될 수 있다.

종종 초기 단계로서, 그리고 단백질 혼합물이 복잡하면, 초기 염 분별은 원치 않는 숙주 세포 단백질 (또는 세포 배양 배지로부터 유래된 단백질) 중에서 다수를 관심되는 재조합 단백질로부터 분리할 수 있다. 바람직한 염은 황산암모늄이다. 황산암모늄은 단백질 혼합물에서 물의 양을 효과적으로 감소시킴으로써 단백질을 침전시킨다. 단백질은 이후, 그들의 용해도의 기초에서 침전된다. 단백질이 더욱 소수성일수록, 이것은 더욱 낮은 황산암모늄 농도에서 침전될 가능성이 더욱 높다. 전형적인 프로토콜은 결과의 황산암모늄 농도가 20 내지 30% 사이에 있도록, 포화된 황산암모늄을 단백질 용액에 첨가하는 것이다. 이것은 대부분의 소수성 단백질을 침전시킬 것이다. 침전물은 폐기되고 (관심되는 단백질이 소수성이 아니면), 그리고 황산암모늄이 관심되는 단백질을 침전시키는 것으로 공지된 농도까지 상층액에 첨가된다. 침전물은 이후, 완충액에서 가용화되고, 그리고 과잉 염은 필요하면, 투석 또는 정용여과를 통해 제거된다. 단백질의 용해도에 의존하는 다른 방법, 예를 들면, 차가운 에탄올 침전은 당업자에게 널리 공지되어 있고 복합적 단백질 혼합물을 분별하는데 이용될 수 있다.

계산된 분자량에 기초하여, 더욱 큰 크기와 더욱 작은 크기의 단백질은 상이한 구멍 크기의 막 (가령, Amicon 또는 Millipore 막)을 통한 한외여과를 이용하여 단리될 수 있다. 첫 번째 단계로서, 단백질 혼합물은 관심되는 단백질의 분자량보다 더욱 낮은 분자량 컷오프를 갖는 구멍 크기를 갖는 막을 통해 한외여과된다. 한외여과의 농축물은 이후, 관심되는 단백질의 분자량보다 큰 분자 컷오프를 갖는 막에 대하여 한외여과된다. 재조합 단백질은 막을 통과하여 여과액 내로 이동할 것이다. 여과액은 이후, 아래에 설명된 바와 같이 크로마토그래프될 수 있다.

관심되는 단백질은 또한, 그들의 크기, 순 표면 전하, 소수성 및 리간드에 대한 친화성의 기초에서 다른 단백질로부터 분리될 수 있다. 이에 더하여, 단백질에 대하여 조성된 항체가 칼럼 매트릭스에 접합될 수 있고, 그리고 이들 단백질은 면역정제될 수 있다. 이들 모든 방법은 당분야에서 널리 공지된다.

다양한 친화성 태그, 예를 들면, 적혈구응집소 (HA), FLAG, Xpress, Myc, 헥사히스티딘, 글루타티온 S 전달효소 (GST) 기타 등등에 대해 조성된 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피가 폴리펩티드를 정제하는데 이용될 수 있다. His 태그는 또한, 일정한 금속 (가령, Ni)에 대한 킬레이트화제로서 행동할 것이고, 따라서 이들 금속 역시 His-내포 폴리펩티드를 정제하는데 이용될 수 있다. 정제 후, 태그는 특정한 단백질분해 개열에 의해 임의선택적으로 제거된다.

크로마토그래피 기술이 임의의 척도에서, 그리고 많은 상이한 제조업체 (가령, Pharmacia Biotech)로부터 설비를 이용하여 수행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

제약학적 조성물

본 발명의 펩티드는 필요에 따라, 적합한 제약학적 부형제와 함께 투여될 수 있다. 당업자는 조성물이 투여 방식 및 복용 단위에 따라 변할 것이라는 것을 이해할 것이다.

조성물은 전형적으로, 전통적인 제약학적 담체 또는 부형제를 포함하고, 그리고 다른 약용 작용제, 담체, 어쥬번트, 희석제, 조직 침투 강화제, 용해화제, 기타 등등을 부가적으로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 중량으로 약 0.01% 내지 약 90%, 약 0.1% 내지 약 75%, 약 0.1% 내지 50%, 또는 약 0.1% 내지 10%의 본 발명의 접합체 또는 이들의 조합을 내포하고, 나머지는 적합한 제약학적 담체 및/또는 부형제로 구성될 것이다. 적절한 부형제는 당분야에서 널리 공지된 방법에 의해 특정 조성물과 투여 루트에 맞춤될 수 있다. 가령, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990)를 참조한다.

적합한 부형제의 실례에는 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스, 젤라틴, 규산칼슘, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 식염수, 시럽, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 그리고 폴리아크릴산, 예를 들면, 카르보폴, 예를 들면, 카르보폴 941, 카르보폴 980, 카르보폴 981 등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 조성물은 윤활제, 예를 들면, 활석, 마그네슘 스테아르산염, 그리고 무기질 오일; 적심제; 유화제; 현탁제; 보존제, 예를 들면, 메틸-, 에틸-, 그리고 프로필-히드록시-벤조산염 (즉, 파라벤); pH 조정제, 예를 들면, 무기와 유기 산과 염기; 감미제; 착색제; 그리고 풍미제를 부가적으로 포함할 수 있다. 조성물은 또한, 생물분해성 중합체 비드, 덱스트란, 그리고 시클로덱스트린 포접 복합체를 포함할 수 있다.

경구 투여의 경우에, 조성물은 정제, 로젠지, 캡슐, 유제, 현탁액, 용액, 시럽, 스프레이, 분말, 그리고 지속된 방출 제제의 형태일 수 있다. 경구 투여를 위한 적합한 부형제는 제약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아르산염, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로오스, 글루코오스, 젤라틴, 수크로오스, 탄산마그네슘 등을 포함한다.

일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 알약, 정제, 또는 캡슐의 형태를 취하고, 따라서, 조성물은 접합체 또는 접합체의 조합과 함께, 다음 중에서 한 가지를 내포할 수 있다: 희석제, 예를 들면, 락토오스, 수크로오스, 인산이칼슘 등; 붕괴제, 예를 들면, 전분 또는 이의 유도체; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아르산염 등; 그리고 결합제, 예를 들면, 전분, 아카시아 검, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 셀룰로오스 및 이들의 유도체. 접합체는 또한, 예로서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 담체에서 배치된 좌약으로 조제될 수 있다.

액체 조성물은 접합체 또는 접합체의 조합 및 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 어쥬번트를 담체, 예를 들면, 예로서, 수성 식염수 (가령, 0.9% w/v 염화나트륨), 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해하거나 또는 분산시켜 예로서, 경구, 국소, 또는 정맥내 투여를 위한 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 접합체는 또한, 정체 관장으로 조제될 수 있다.

국소 투여의 경우에, 본 발명의 조성물은 유제, 로션, 겔, 크림, 젤리, 용액, 현탁액, 연고, 그리고 경피 패치의 형태일 수 있다. 흡입에 의한 전달의 경우에, 조성물은 건조 분말로서 또는 연무기를 통한 액체 형태에서 전달될 수 있다. 비경구 투여의 경우에, 조성물은 무균 주사가능 용액 및 무균 포장된 분말의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 주사가능 용액은 약 4.5 내지 약 7.5의 pH에서 조제된다.

본 발명의 조성물은 또한, 동결건조된 형태에서 제공될 수 있다. 이런 조성물은 투여에 앞서 재구성을 위한 완충액, 예를 들면, 중탄산염을 포함할 수 있거나, 또는 완충액은 예로서, 물과의 재구성을 위해 동결건조된 조성물 내에 포함될 수 있다. 동결건조된 조성물은 적합한 혈관수축제, 예를 들면, 에피네프린을 더욱 포함할 수 있다. 동결건조된 조성물은 재구성된 조성물이 환자에 즉시 투여될 수 있도록, 재구성을 위한 완충액과 합동으로 임의선택적으로 포장된 주사기에 담겨 제공될 수 있다.

당업자는 투여된 분량이 투여되는 특정 펩티드 조성물, 투여 방식, 적용의 유형 (가령, 예방적, 치료적 등), 환자의 연령, 그리고 환자의 신체 조건이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 다수의 인자에 따라 변할 것이라는 것을 이해한다. 바람직하게는, 원하는 결과를 산출하는데 필요한 가장 적은 분량과 농도가 이용되어야 하다. 아동, 노인, 쇠약한 환자, 그리고 심장 및/또는 간 질환을 앓는 환자에 대한 용량은 적절하게 조정될 수 있다. 추가 보도는 용량을 평가하기 위한 실험 동물 모델을 이용한, 당분야에서 공지된 연구로부터 획득될 수 있다. MOTS3 또는 MOTS3 유사체는 특정 적용에 타당하면, 과도한 실험 없이 인간을 비롯한 포유동물에 투여용으로 조제될 수 있다. 부가적으로, 조성물의 적절한 용량은 표준 분량-반응 프로토콜을 이용하여 과도한 실험 없이 결정될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 펩티드 포함 조성물은 펩티드의 특정 분량에서 개체에 투여되거나 또는 개체에 펩티드의 단위 용량 투여를 위해 조제된다. 일부 구체예에서, 개체에 투여된 분량은 하루에 약 0.001 내지 약 1000 mg이다. 일부 구체예에서, 개체에 투여된 분량은 하루에 약 0.1 내지 약 500 mg이다. 일부 구체예에서, 개체에 투여된 분량은 하루에 약 0.5 내지 약 100 mg이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단위 용량 투여를 위해 조제되고, 여기서 단위 용량은 하루에 약 0.001 내지 약 1000 mg이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단위 용량 투여를 위해 조제되고, 여기서 단위 용량은 하루에 약 0.1 내지 약 500 mg이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단위 용량 투여를 위해 조제되고, 여기서 단위 용량은 하루에 약 0.5 내지 약 100 mg이다.

투여 방법

필요에 따라 적합한 제약학적 부형제와 함께 본 발명의 펩티드의 투여는 인정되는 투여 방식 중에서 한 가지를 통해 수행될 수 있다. 따라서, 투여는 예로서, 정맥내, 국소, 피하, 피부관통, 경피, 근육내, 경구, 관절내, 비경구, 소동맥내, 피내, 심실내, 두개내, 복막내, 병소내, 비내, 직장, 질, 또는 흡입에 의한 투여일 수 있다. 투여는 예로서, 주사를 통해 췌장 조직에 직접적으로 표적화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 반복적으로, 예를 들면, 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회, 또는 그 이상 투여될 수 있거나, 또는 조성물은 연속적 주입에 의해 투여될 수 있다. 적합한 투여 부위에는 진피, 점막, 기관지, 위장관, 항문, 질, 눈, 그리고 귀가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 제제는 가급적, 엄밀한 용량의 단순한 투여에 적합한 단위 약형에서 고체, 반고체, 동결건조된 분말, 또는 액체 약형, 예를 들면, 예로서, 정제, 알약, 로젠지, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액, 유제, 좌약, 정체 관장, 크림, 연고, 로션, 겔, 에어로졸, 또는 기타 유사한 것의 형태를 취할 수 있다 .

용어 "단위 약형"은 인간 개체를 위한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 구별된 단위를 지칭하고, 각 단위는 적합한 제약학적 부형제 (가령, 앰풀)와 공동으로, 원하는 개시, 내약성, 및/또는 치료 효과를 산출하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 물질을 내포한다. 이에 더하여, 더욱 농축된 조성물이 제조될 수 있는데, 이들로부터 더욱 묽은 단위 용량 조성물이 이후 생산될 수 있다. 더욱 농축된 조성물은 따라서, 실제적으로 보다 많은, 예를 들면, 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배, 또는 그 이상 양의 접합체 또는 접합체의 조합을 내포할 것이다.

이런 약형을 제조하기 위한 방법은 당업자에게 알려져 있다 (가령, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1990)를 참조한다. 투여되는 조성물은 베타 도세포 생존을 향상시키기 위한 제약학적 효과량에서 본 발명의 펩티드의 양을 내포한다. 이에 더하여, 본 발명의 펩티드의 제약학적으로 허용되는 염 (가령, 산 부가염)이 합성 유기화학의 당업자에게 공지되고 예로서, March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 4th Ed., New York, Wiley-Interscience (1992)에 의해 설명된 표준 절차를 이용하여 제조되고 조성물 내에 포함될 수 있다.

다른 접근법에서, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 시험관내와 생체내에서 세포의 형질감염에 이용된다. 이들 핵산은 아래에 설명된 바와 같이, 표적 세포와 생물체의 형질감염을 위한 다수의 널리 공지된 벡터 중에서 한 가지 내로 삽입될 수 있다. 이들 핵산은 탈체에서 또는 생체내에서, 벡터와 표적 세포의 상호작용을 통해 세포 내로 형질감염된다. 핵산은 프로모터의 제어 하에, 이후 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고, 따라서 감소된 인슐린 생산과 연관된 질환의 효과를 경감한다.

이런 유전자 요법 절차는 다수의 배경에서 후천성과 유전된 유전적 결함, 암, 그리고 다른 질환을 교정하는데 이용되었다. 인간에서 인공 유전자를 발현하는 능력은 다른 요법에 의한 치료에 순응하지 않는 많은 질환을 비롯하여, 많은 중요한 인간 질환의 예방 및/또는 치유를 용이하게 한다 (유전자 요법 절차의 검토를 위해, Anderson, Science, 256:808-813 (1992); Nabel et al., TIBTECH, 11:211-217 (1993); Mitani et al., TIBTECH, 11:162-166 (1993); Mulligan, Science, 926-932 (1993); Dillon, TIBTECH, 11:167-175 (1993); Miller, Nature, 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology, 6(10):1149-1154 (1998); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience, 8:35-36 (1995); Kremer et al., British Medical Bulletin, 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology (Doerfler & Bohm eds., 1995); 그리고 Yu et al., Gene Therapy, 1:13-26 (1994)을 참조한다).

핵산의 전달을 위해, 바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 적합한 벡터는 예로서, Lilley et al., Curr. Gene Ther., 1(4):339-58 (2001)에서 설명된 바와 같은 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 예로서 Polo et al., Dev. Biol. (Basel), 104:181-5 (2000)에서 설명된 바와 같은 알파바이러스 DNA와 입자 레플리콘, 예로서 Mazda, Curr. Gene Ther., 2(3):379-92 (2002)에서 설명된 바와 같은 엡스타인-바르 바이러스 (EBV)-기초된 플라스미드 벡터, 예로서 Otomo et al., J. Gene Med., 3(4):345-52 (2001)에서 설명된 바와 같은 EBV 레플리콘 벡터 시스템, 예로서 Gao et al., PNAS USA, 99(18):11854 (2002)에서 설명된 바와 같이 붉은털 원숭이로부터 아데노바이러스 연관된 바이러스, 예로서 Nicklin et al., Curr. Gene Ther., 2(3):273-93 (2002)에서 설명된 바와 같은 아데노바이러스와 아데노 연관된 바이러스 벡터를 포함한다. 다른 적합한 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터 시스템은 당분야에서 널리 공지된 기술을 이용하여 쉽게 작제될 수 있다 (가령, U.S. 특허 번호 5,173,414와 5,139,941; PCT 공개 번호 WO 92/01070과 WO 93/03769; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 8:3988-3996 (1988); Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 (1992); Muzyczka, Current Topics in Microbiol. and Immunol., 158:97-129 (1992); Kotin, Human Gene Therapy, 5:793-801 (1994); Shelling et al., Gene Therapy, 1:165-169 (1994); 그리고 Zhou et al., J. Exp. Med., 179:1867-1875 (1994)를 참조한다). 추가 적합한 벡터는 예로서 Kim et al., Cancer Gene Ther., 9(9):725-36 (2002)에서 설명된 E1B 유전자-약화된 복제 아데노바이러스 및 예로서 Pascual et al., J. Immunol., 160(9):4465-72 (1998)에서 설명된 비복제성 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 예시적인 벡터는 Okayama et al., Mol. Cell. Biol., 3:280 (1983)에 의해 개시된 바와 같이 작제될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일한 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:2와 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100% 동일한 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.

분자 접합체 벡터, 예를 들면, Michael et al., J. Biol. Chem., 268:6866-6869 (1993) 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6099-6103 (1992)에서 설명된 아데노바이러스 키메라 벡터 역시 본 발명의 방법에 따른 유전자 전달에 이용될 수 있다.

한 예시적인 구체예에서, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템에 대한 편의하고 효과적인 플랫폼을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 선별된 뉴클레오티드 서열은 당분야에서 공지된 기술을 이용하여, 벡터 내로 삽입되고 레트로바이러스 입자에서 포장된다. 재조합 바이러스는 이후, 단리되고 개체에 전달될 수 있다. 적합한 벡터는 예로서 Scherr et al., Curr. Gene Ther., 2(1):45-55 (2002)에서 설명된 바와 같은 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 추가 예시적인 레트로바이러스 시스템이 설명되었다 (가령, U.S. 특허 번호 5,219,740; Miller et al., BioTechniques, 7:980-990 (1989); Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14 (1990); Scarpa et al., Virology, 180:849-852 (1991); Bums et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8033-8037 (1993); 그리고 Boris-Lawrie et al., Curr. Opin. Genet. Develop., 3:102-109 (1993).

다른 공지된 바이러스-기초된 전달 시스템은 예로서, Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:317-321 (1989); Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 569:86-103 (1989); Flexner et al., Vaccine, 8:17-21 (1990); U.S. 특허 번호 4,603,112, 4,769,330, 그리고 5,017,487; WO 89/01973; U.S. 특허 번호 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques, 6:616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science, 252:431-434 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219 (1994); Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502 (1993); Guzman et al., Circulation, 88:2838-2848 (1993); Guzman et al., Cir. Res., 73:1202-1207 (1993); 그리고 Lotze et al., Cancer Gene Ther., 9(8):692-9 (2002)에서 설명된다.

치료적 적용 및 예방적 적용

일정한 양상에서, 본 발명의 조성물은 치료 또는 예방이 필요한 개체에서 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 이용된다. 본원에서 설명된 MOTS3 또는 MOTS3 유사체 조성물로 치료에 적합한 질환 또는 장애의 실례에는 1형과 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 당뇨병전증, 인슐린 저항성, 대사 증후군, 내당성 장애, 암 (가령, 유방암, 뇌암, 결장암, 흑색종, 백혈병 (가령, AML), 림프종, 췌장암, 전립선암, 난소암, 폐암, 그리고 위암), 비만, 그리고 지방간 질환이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 장애를 치료하고 예방하는 것이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 조성물은 예로서, 당뇨병에 대한 유전적 소인을 갖는 개체에 대해 예방적으로 이용될 수 있다.

당업자는 본 발명의 MOTS3 펩티드와 유사체가 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지의 치료 또는 예방을 위해 다른 치료적 작용제와 공동투여될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 공동투여는 예로서, 단일 제약학적 조성물 또는 별개의 조성물에서 동시적일 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 예로서 독립된 투약 일정에서 다른 치료적 작용제(들)와 별개로 투여될 수 있다.

실시예

실시예 1.

3' RACE 분석은 MOTS3이 HN과 유사하게 폴리아데닐화된다는 것을 드러냈다 (도면 1A). 아래에 설명된 바와 같은 초기 선별검사 후, MOTS 3은 유력한 생물학적 활성을 갖는 것으로 결정되었고, 그리고 이의 펩티드 서열은 다양한 종에서 충분히 보존된다 (도면 1B). 우리는 ORF를 세포 배양 동안 발현 벡터 내로 클로닝함으로써 내인성과 과다발현된 MOTS3뿐만 아니라 GFP-태그된 MOTS3을 검출할 수 있는 항-MOTS3 다중클론 토끼 항체를 산출하였다 (도면 1C). 이들 검증된 항체를 이용하여, 우리는 유사한 분자량에서 쥐 심장, 간과 고환에서 및 약간 더 높은 분자량에서 뇌에서 MOTS3을 검출할 수 있다 (도면 1D). 발현 수준은 가장 높은 미토콘드리아 밀도 중에서 하나를 갖는 장기인 심장에서 가장 높은 것으로 보인다. 게다가, 에티듐 브롬화물을 이용하여 미토콘드리아 DNA가 일소된 rho-O HeLa 세포는 MOTS3 뿐만 아니라 다른 충분히 설명된 미토콘드리아-인코딩된 단백질, 예를 들면, 시토크롬 옥시다아제 I과 II (COI과 COII)를 발현하지 않고, 이의 미토콘드리아 기원을 확증한다 (도면 1E).

실시예 2.

합성 MOTS3의 외인성 처리는 Seahorse 기술뿐만 아니라 MTT 환원 (10%와 1% FBS 조건 하에)에 의해 계측된 산소 소모 비율 (OCR)에 의해 계측된 미토콘드리아-의존성 물질대사 이동을 유발한다 (도면 2). 합성 펩티드로 외인성 MOTS 3 처리 (도면 3)뿐만 아니라 클로닝에 의한 내인성 발현 (도면 4) 둘 모두 미토콘드리아 활성을 저해하였다. 특히, 외인성 MOTS3 처리는 세포 ATP 수준과 미토콘드리아 활성 (MTT)을 감소시켰는데, 이것은 증가된 자가포식현상과 동시에 일어났다 (도면 5).

MOTS3 처리는 배양 배지에서 잔여 글루코오스 수준에 의해, 그리고 형광-표지화된 글루코오스 유사체 흡수에 의해 계측될 때, 글루코오스 흡수에서 증가를 유도하였다 (도면 6A와 도면 6B). 예상한 대로, 젖산염 분비는 상승된 글루코오스 소비와 조화하여 증가되었다 (도면 6A). 특히, 배지 내에 대부분의 글루코오스가 소비된 96 시간의 MOTS3 처리에 의해, AMPK 활성화는 MOTS3 처리된 세포에서 훨씬 높고 (도면 7), 도면 5에 나타나 있는 바와 같이 세포 ATP 수준에서 예리한 감소 및 증가된 자가포식현상과 일치한다. 외인성 MOTS3에 의해 유도된 손상된 세포 물질대사는 글루코오스 배지 하에 감소된 세포 증식과 생존을 야기하지만 갈락토오스 배지 하에서는 그렇지 않았다 (도면 8); 갈락토오스는 세포가 생존을 위해 미토콘드리아 물질대사에 의존하도록 강제한다.

발현 클론을 형질감염시킴으로써 세포내 MOTS3 과다발현은 또한, 세포 증식을 지연시켰다 (도면 9). 흥미롭게도, 8 일의 외인성 MOTS 3 처리는 노화 연관된 β-갈락토시다아제 염색에 의해 계측될 때 세포 노화를 유도하였다 (도면 10).

실시예 3.

생쥐에서, 4 일의 MOTS3 주사 (i.p.; 0.5 또는 5.0 mg/kg/일)는 식품 섭취의 유의미한 변경 없이 유의미한 체중 감소를 야기하였다 (도면 11). 게다가, 우리의 시험관내 연구에 따라서, 간 미토콘드리아 호흡 능력이 양쪽 검사된 분량에서 MOTS3 처리 이후에 축소되었다 (도면 11). 특히, MOTS3 처리는 혈당 수준을 유의미하게 감소시키고 (도면 12A), 그리고 또한, 더욱 높은 인슐린 수준을 가졌는데 (도면 12B), 이들은 세포 배양 동안 관찰된 것과 유사한 증가된 글루코오스 흡수를 암시하였다 (도면 6).

실시예 4.

MOTS-c: 비만을 예방하고 물질대사 항상성을 조절하는 미토콘드리아 유전체 내에 인코딩된 신규한 펩티드

요약

미토콘드리아 유전체는 단지 13개 단백질을 인코딩하는 것으로 전통적으로 공지되는데, 이들은 미토콘드리아-특이적 유전자 코드를 이용하여 번역된다. 이것은 최근에, 미토콘드리아 16S rRNA 내에 인코딩된 펩티드인 휴마닌의 발견으로 시험대에 올랐다. 휴마닌은 생리활성 펩티드를 발생시키는 전인미답의 미토콘드리아 유전자의 가능한 실존을 암시한다 (C. Lee, K. Yen, P. Cohen, Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides? Trends in endocrinology and metabolism: TEM, (Feb 7, 2013)). 본원에서 우리는 MOTS-c (12개 SrRNA c의 미토콘드리아 개방 해독틀)로 명명된, 미토콘드리아 12S rRNA 내에 인코딩된 신규한 펩티드를 보고하고, 이것은 다양한 조직에서 및 순환에서 검출되었다. MOTS-c는 뉴클레오티드, 글루코오스, 미토콘드리아, 그리고 지방산 물질대사를 조정함으로써, 물질대사 항상성의 핵심 조절인자로서 행동한다. 특히, MOTS-c는 데노보 퓨린 생합성 경로를 통해 내인성 AICAR 수준에서 >20-배 증가를 유발하였고, 그리고 또한, 생쥐에서 HEK293 세포와 골격근에서 AMPK 신호전달을 활성화시켰다. 생쥐에서 MOTS-c 처리는 고지방 식이-유도된 체중 증가와 인슐린 저항성을 예방하였다. 게다가, 근육에서 연령-의존성 인슐린 저항성과 부합하게, MOTS-c 수준은 혈장과 근육에서 연령에 따라 감퇴하는 것으로 밝혀졌고, 그리고 MOTS-c 처리는 더욱 나이든 생쥐에서 인슐린 감수성을 충분히 복원하였다. 휴마닌과 함께 MOTS-c의 발견은 물질대사를 비롯한 결정적인 세포 과정을 조정하는데 있어서 미토콘드리아에 대한 이전에 알려지지 않은 조절 역할을 암시한다. 우리의 조사 결과는 MOTS-c를 포함하는 미토콘드리아-유래된 펩티드 (MDP)가 신규한 미토콘드리아 생물학을 해명할 뿐만 아니라, 노화 및 연령-관련된 만성 질환과 연관된 물질대사 기능장애를 개선하는데 활용될 수 있는 신규한 진단적 생물마커와 치료 표적을 제공할 수 있다는 것을 암시한다.

미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 12S rRNA 영역 내에 생리활성 펩티드를 인코딩하는 잠재적 개방 해독틀 (ORFs)에 대한 인실리코 검색이 수행되었다. MOTS-c는 16개 아미노산 펩티드로 번역되는 51bp 개방 해독틀 (ORF)로서 확인되었는데 (도면 13a), 이것은 고도로 보존된다 (도면 17a). 이러한 펩티드는 여러 추정 번역후 수식에 또한 종속된다 (도면 17b). MOTS-c의 번역은 이론적으로 미토콘드리아 또는 세포질일 수 있었지만, 미토콘드리아 유전자 코드가 탠덤 시작/종결 코돈을 산출하기 때문에 (도면 13a), MOTS-c는 세포질 번역을 겪어야 하는데, 이것은 이의 폴리아데닐화된 전사체 (도면 13b)가 현재 알려지지 않은 기전에 의해 미토콘드리아로부터 이출된다는 것을 지시한다 (Y. Ninomiya, S. Ichinose, Subcellular distribution of mitochondrial ribosomal RNA in the mouse oocyte and zygote. PloS one 2, e1241 (2007) 및 R. Amikura, M. Kashikawa, A. Nakamura, S. Kobayashi, Presence of mitochondria-type ribosomes outside mitochondria in germ plasm of Drosophila embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 9133 (Jul 31, 2001)).

MOTS-c가 또한, 핵 미토콘드리아 DNA 전달 (NUMT)로서 알려져 있는 현상으로 인해 핵 기원일 수 있었을 가능성 (M. Ricchetti, F. Tekaia, B. Dujon, Continued colonization of the human genome by mitochondrial DNA. PLoS biology 2, E273 (Sep, 2004))이 인식되었다. NCBI 뉴클레오티드 기본 국부 정렬 검색 도구 (BLAST)를 이용하여, 이들 NUMT 또는 그들의 펩티드 산물 중에서 어느 것도 미토콘드리아 MOTS-c 서열에 완전한 상동성을 갖지 못하는 것으로 밝혀졌다 (도면 13c). 미토콘드리아 기원을 더욱 확증하기 위해, 미토콘드리아 DNA가 선별적으로 고갈된 (ρ0) HeLa 세포에서 MOTS-c 발현이 계측되었다. HeLa-ρ0 세포에서, 12S rRNA와 MOTS-c 전사체 둘 모두 qRT- PCR에 의해 검출될 수 없었고 (도면 13d), 그리고 MOTS-c 특이적 항체를 이용한 면역블롯 (도면 17c)은 검출할 수 없는 수준의 미토콘드리아-인코딩된 시토크롬 옥시다아제 I과 II (COI/II) 및 MOTS-c, 하지만 핵-인코딩된 GAPDH의 변함없는 발현을 보여주었다 (도면 13e). 이의 세포이하 분포 패턴을 연구하기 위해, HEK293 세포가 MOTS-c에 대해 면역염색되고 미토콘드리아 동시국지화가 관찰되었다 (도면 13f; 도면 17d, 17e). MOTS-c는 생쥐와 쥐에서 다양한 조직에서 (도면 13g)뿐만 아니라 인간과 설치류 혈장에서 순환에서 (도면 13h; 도면 17f) 검출되었다. 특히, 공복은 일정한 대사작용에 의해 활성 조직에서 (도면 13i), 그리고 혈장에서 (도면 13j) MOTS-c의 내인성 발현을 변화시켰다.

MOTS-c의 생물학적 역할을 해명하기 위해, 4-와 72- 시간의 MOTS-c (10 μM) 처리 이후에 HEK293 세포에서 마이크로어레이 분석이 수행되었다. 주요 성분 분석 (PCA)은 MOTS-c가 72 시간까지 명확한 전체 유전자 발현 프로필 이동을 증진한다는 것을 보여주었다 (도면 14a). MOTS-c에 의해 변형된 기능적 경로 사이에 차이를 더욱 강조하기 위해, 유전자 세트 농축의 파라미터 분석 (PAGE)이 이용되었는데, 이것은 유전자 발현이 MOTS-c 처리 후에 4 시간까지 유의미하게 변경되고, 72 시간까지 두드러지게 뚜렷해진다는 것을 보여주었다 (도면 14b). 4-와 72-시간에서 유전자 서명 사이에 약간의 중복이 있었는데, 이것은 MOTS-c 처리에 대한 응답으로 시간-의존성 진행을 암시하였다 (도면 14c). MOTS-c는 세포 물질대사와 염증에 관련된 경로에서 유전자 발현에 대한 심대한 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (도면 14d; 도면 30).

그 다음, 전체 물질대사에 대한 MOTS-c의 효과가 24-와 72-시간 동안, MOTS-c 또는 비어 있는 발현 클론으로 안정되게 형질감염된 (각각, MOTS-c-ST와 MOTS-c-EV 세포) 또는 합성 MOTS-c (10 uM)로 외인성으로 처리된 HEK293 세포에서 선입견 없는 대사체학 프로파일링을 이용하여 조사되었다. 356개의 명명된 대사산물 중에서, 194개는 MOTS-c-ST 세포에서 유의미하게 변경되는 것으로 밝혀졌고, 그리고 각각 49개와 177개는 24-와 72-시간까지 유의미하게 변경되었다 (도면 31). 흥미롭게도, 데노보 퓨린 생합성 경로는 72-시간의 외인성 MOTS-c 처리 후 내인성 AICAR (5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 리보뉴클레오티드) 농도에서 >20-배 증가 (도면 18a)를 비롯하여, 유의미하게 변경되는 것으로 밝혀졌다 (도면 14e, 도면 20a). 대사체학 조사 결과와 부합하게, 마이크로어레이 분석 역시 MOTS-c가 빠르면 처리후 4 시간까지 퓨린 데노보 생합성을 변경한다는 것을 보여주었다 (도면 18b). 퓨린은 펜토오스 인산염 경로 (PPP)로부터 생산된 리보오스-5-인산염 (R5P)으로부터, 그리고 또한, NAD⁺로부터 유래된 ADP-리보오스에 의해 합성된다 (도면 14e). MOTS-c 처리된 세포에서 가속된 당분해/PPP 및 증가된 수준의 NAD⁺ (도면 18a, 19b), 하지만 감소된 수준의 ADP-리보오스와 R5P가 밝혀졌다. 이들 데이터는 감소된 글루타민 및 증가된 피로인산염 (PPi) 수준 (도면 14g)에 의해 더욱 뒷받침되는데, 이들은 MOTC-s가 HEK293 세포에서 이들 경로의 증가된 플럭스를 자극한다는 것을 지시한다. AICAR에서 빌드업은 하류 중간체, 예를 들면, 이노신, 아데닐로숙신산염, AMP, 그리고 또한, 아데닌, 구아닌과 크산틴을 비롯한 퓨린 최종 산물을 결과적으로 차단하고 감소시켰다 (도면 14g, 18과 20a). MOTS-c는 엽산염 물질대사를 변경함으로써 AICAR에서 빌드업을 증진할 수 있다. 5-메틸-테트라히드로폴레이트 (5Me-THF)의 유의미한 감소가 관찰되었는데 (도면 20b), 이것은 AICAR의 하류 중간체 F-AICAR로의 포르밀화를 촉매작용하는데 필요하다. 실제로 이전 보고는 메토트렉사트에 의해 엽산염 물질대사를 저해하는 것이 세포내 AICAR 수준을 증가시킨다는 것을 보여준다 (E. S. Chan, B. N. Cronstein, Methotrexate--how does it really work? Nature reviews. Rheumatology 6, 175 (Mar, 2010)). 손상된 엽산염 물질대사, 특히 5Me-THF는 또한, 항당뇨병성 약물 메트포르민에 의한 AMPK의 활성화의 기초가 되는 기전으로서 연루되었다 (B. Corominas-Faja et al., Metabolomic fingerprint reveals that metformin impairs one-carbon metabolism in a manner similar to the antifolate class of chemotherapy drugs. Aging 4, 480 (Jul, 2012)).

AICAR은 β-산화작용을 위한 지방산의 미토콘드리아 내로 중심 운반 기전인, 카르니틴 팔미토일전달효소 1 (CPT-1)의 알로스테릭 저해를 완화하는 아세틸-CoA 카르복실라아제 (ACC)의 인산화-유도된 비활성화를 통해 지방산 산화작용을 자극하는 것으로 밝혀진, 마스터 에너지 조절인자 AMPK의 유력한 활성체이다. (G. Hasko, B. Cronstein, Regulation of inflammation by adenosine. Frontiers in immunology 4, 85 (2013)). AICAR-유도된 AMPK 활성화는 부분적으로, 운동에 의해 달성된 것에 필적하게 GLUT4 전사를 증가시킴으로써, 근육에서 글루코오스 흡수를 증강한다 (G. R. Steinberg, B. E. Kemp, AMPK in Health and Disease. Physiological reviews 89, 1025 (Jul, 2009)). 72-시간의 MOTS-c 처리 (10 μM)는 AMPKα (Thr172)와 ACC (Ser79)의 인산화를 야기하고, 그리고 또한, 시간과 용량 의존성 방식 (도면 14i)에서 CPT-1과 GLUT4 단백질 수준 (도면 14h)을 증가시켰다. 게다가, MOTS-c는 Ser-473에서 Akt의 인산화를 증진하는 것으로 밝혀졌다 (도면 14i). 특히, AMPK 활성화는 낮은 AMP 수준 및 높은 ADP와 ATP 수준에서 관찰되었다 (도면 19a, 20a). 증가된 ATP는 증강된 당분해에 기인할 수 있는데, 이것은 ATP 생산의 급속하지만 비효율적 방법이다 (P. S. Ward, C. B. Thompson, Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate. Cancer cell 21, 297 (Mar 20, 2012)). 이들 조사 결과는 MOTS-c가 살리실산염 (K. Hashiguchi, Q. M. Zhang-Akiyama, Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in molecular biology 554, 383 (2009)), 렙틴 (T. Ohta et al., Untargeted metabolomic profiling as an evaluative tool of fenofibrate-induced toxicology in Fischer 344 male rats. Toxicologic pathology 37, 521 (Jun, 2009)), 그리고 메트포르민 (N. Fujii, N. Jessen, L. J. Goodyear, AMP-activated protein kinase and the regulation of glucose transport. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 291, E867 (Nov, 2006))에 의해 달성된 것과 유사하게, AMPK의 AMP- 독립된 활성화를 증진한다는 것을 암시한다.

그 다음, 글루코오스와 지방산 물질대사와 세포 호흡에 집중하는 세포 물질대사에 대한 MOTS-c의 효과가 조사되었다. MOTS-c 자극된 당분해는 증가된 글루코오스 흡수 (도면 15a; 도면 21a, b)와 젖산염 생산 (도면 15b; 도면 21a)에 의해 반영되는 것으로 밝혀졌다. 부가적으로, 세포내 글루코오스 수준은 다른 당분해 중간체와 함께 줄어들었는데 (도면 15c; 도면 22), 이것은 증가된 당분해 플럭스를 더욱 뒷받침하였다. MOTS-c는 또한, 다른 당 기질의 활용을 변화시켰다 (도면 22). 당분해의 비율을 실시간으로 직접적으로 검사하기 위해, 세포외 산성화 비율 (ECAR)이 계측되었다. MOTS-c-ST 세포는 글루코오스로 자극될 때, 더욱 높은 비율의 기저 당분해를 갖고 향상된 당분해 반응을 보여주었다 (도면 15d). 또한, 올리고마이신 처리에 의해 추정된 전체 당분해 능력이 이들 세포에서 더욱 높았다 (도면 15d). 세포내 젖산염 수준은 MOTS-c-ST와 MOTS-c-EV 세포 사이에 동일하였는데 (도면 15c), 그 이유는 MOTS-c-ST 세포에 의한 과잉 생산이 배지 내로 방출되었기 때문이다 (도면 15b; 도면 21a). MOTS-c-ST 세포에서 관찰 결과와 부합하게, 질량 분광분석법 분석은 24 시간의 MOTS-c 처리 이내에 HEK293 세포에서 증가된 당분해의 추가 증거를 제공하였다 (도면 23a). 당분해의 대안적 분지인 펜토오스 인산염 경로 (PPP)는 데노보 퓨린 생합성을 위한 R5P를 제공한다. R5P를 비롯한 감소된 수준의 PPP 중간체가 72-시간의 외인성 MOTS-c 처리 (10 μM) 후, MOTS-c-ST 세포 및 또한 MOTS-c-EV 세포에서 관찰되었다 (도면 23b, c).

그 다음, 미토콘드리아 호흡이 계측되었는데, 그 이유는 당분해 최종 산물이 산화 인산화를 통한 추가 에너지 추출을 위해 미토콘드리아 내로 왕복되기 때문이다. 증가된 당분해와 부합하게, MOTS-c 처리는 HEK293 세포에서 기저 산소 소모 비율 (OCR)뿐만 아니라 최고 호흡 용량을 감소시켰다 (도면 15e). 이것은 암 세포, 림프구, 줄기 세포, 그리고 정자를 비롯한 급속히 분할하는 세포가 높은 글루코오스 농도에 대한 응답으로 억제된 호흡을 전시하는 현상인 "크랩트리 효과"와 일치한다 (K. H. Ibsen, The Crabtree effect: a review. Cancer research 21, 829 (Aug, 1961); T. Wang, C. Marquardt, J. Foker, Aerobic glycolysis during lymphocyte proliferation. Nature 261, 702 (Jun 24, 1976); 그리고 V. Gogvadze, S. Orrenius, B. Zhivotovsky, Mitochondria in cancer cells: what is so special about them? Trends in cell biology 18, 165 (Apr, 2008)). 줄어든 전자 운반 사슬 활성은 또한, 감소된 양성자 누출에 의해 지시되었다 (M. Jastroch, A. S. Divakaruni, S. Mookerjee, J. R. Treberg, M. D. Brand, Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry 47, 53 (2010)) (도면 15f). 감소된 산화 능력은 외인성 MOTS-c로 처리된 MOTS-c-ST 세포에서 및 HEK293 세포에서 TCA 주기 중간체의 고갈과 연관되었다 (도면 15g; 도면 24). HEK293 세포에서 MOTS-c 발현 클론의 일시적인 형질감염 역시 OCR을 줄였다 (도면 25). 감소된 미토콘드리아 물질대사에도 불구하고, MOTS-c는 환원된 대 산화된 글루타티온 (GSH/GSSG)의 비율에 의해 결정될 때 세포 산화환원 항상성을 섭동하지 않았지만, 전체 글루타티온 수준이 MOTS-c 처리 후 72-시간에 MOTS-c-ST 세포에서 및 HEK293 세포에서 줄어들었다 (도면 26). MOTS-c가 당분해 플럭스를 증가시킴으로써 또는 미토콘드리아 물질대사 그 자체를 표적으로 함으로써 미토콘드리아 호흡을 억제하는 지를 검사하기 위해, HEK293 세포가 글루코오스 또는 갈락토오스를 주요 탄소 공급원으로서 포함하는 배지에서 배양되었다. 포유류 세포에서, 갈락토오스는 미토콘드리아에 의해 주로 물질대사되고, 에너지 생산을 위한 산화 인산화에 대한 의존을 이동시킨다 (L. D. Marroquin, J. Hynes, J. A. Dykens, J. D. Jamieson, Y. Will, Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicological sciences: an official journal of the Society of Toxicology 97, 539 (Jun, 2007)). MOTS-c는 풍부한 글루코오스의 조건 하에 세포 증식을 감소시켰지만, 갈락토오스 배지에서 배양된 세포에는 영향을 주는데 실패하였다. 이들 데이터는 MOTS-c-유도된 호흡성 억제가 아마도, 증가된 글루코오스 흡수에 이차성이라는 것을 암시한다 (도면 15h).

지질 물질대사 역시 MOTS-c에 의해 유의미하게 영향을 받았다 (도면 27a). MOTS-c-ST 세포는 MOTS-c-EV 세포와 비교하여, 더욱 높은 수준의 카르니틴 왕복뿐만 아니라 증가된 농도의 카르니틴과 데옥시카르니틴을 전시하였다 (도면 15i). 이들 조사 결과는 또한, 정도가 덜하긴 하지만, 외인성 MOTS-c로 처리된 세포에서 관찰되었다 (도면 27b). 증가된 카르니틴 왕복과 부합하게, 우리는 MOTS-c-ST 세포 (도면 15j)에서 뿐만 아니라 MOTS-c로 처리된 HEK293 세포 (도면 27c)에서 감소된 수준의 필수 지방산을 발견하였다. 미토콘드리아에 들어간 후에, 지방산은 환원 전위 및 아세틸-CoA를 뽑아내는 β-산화작용을 겪는다. 초기 β-산화작용 중간체인 미리스토일-CoA는 MOTS-c-ST 세포 (도면 15k)에서 뿐만 아니라 MOTS-c (10 uM)로 외인성으로 처리된 HEK293 세포 (도면 27d)에서 유의미하게 증가되었다. 게다가, 다른 긴 사슬 지방산 또한 유의미하게 감소되었는데, 이것은 증가된 지방산 활용을 암시하였다 (도면 28). 특히, β-산화작용 그 자체는 호기성 반응이 아니고, 그리고 증가된 지방산 산화작용이 AICAR (L. D. Marroquin, J. Hynes, J. A. Dykens, J. D. Jamieson, Y. Will, Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology 97, 539 (Jun, 2007)) 및 메트포르민 (A. Martin-Montalvo et al., Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nature communications 4, 2192 (Jul 31, 2013))으로 처리 동안 감소된 호흡 하에 관찰되었다.

이계 교배된 CD-1 수컷 생쥐에서 4 일 동안 MOTS-c의 급성 처리 (5 mg/kg/일; BID)는 체중, 식품 섭취, 그리고 혈당 수준에서 근소한 감소를 유발하였지만 (도면 29a-c), 비만과 인슐린 저항성에 관여하는 혈장 IL-6과 TNFα (M. F. Gregor, G. S. Hotamisligil, Inflammatory mechanisms in obesity. Annual review of immunology 29, 415 (2011))의 기저 수준을 유의미하게 감소시켰다 (도면 16a; 도면 29d). 배양된 세포에서 우리의 조사 결과를 고려하여, 고지방 식이 (HFD; 칼로리로 60%) 사양된 이계 교배된 CD-1 생쥐에서 물질대사에 대한 MOTS-c의 효과가 검사되었다 (L. A. Scrocchi, D. J. Drucker, Effects of aging and a high fat diet on body weight and glucose tolerance in glucagon-like peptide-1 receptor -/- mice. Endocrinology 139, 3127 (Jul, 1998) 및 W. L. Breslin, K. Strohacker, K. C. Carpenter, L. Esposito, B. K. McFarlin, Weight gain in response to high-fat feeding in CD-1 male mice. Laboratory animals 44, 231 (Jul, 2010)). 8-주의 MOTS-c 처리는 정상 식이 사양된 생쥐에서 체중에 대한 효과가 없었지만, HFD-유도된 비만을 두드러지게 예방하였다 (도면 16b). 체중에서 이러한 차이는 식품 섭취에 기인하지 않았는데, 그 이유는 칼로리 소비가 군 간에 동일하였기 때문이다 (도면 29e-f). 고지방 사양은 말초 인슐린 저항성을 극복하여 글루코오스 항상성을 유지하려는 시도에서 고인슐린혈증을 증진한다 (M. Hou et al., Protective effect of metformin in CD1 mice placed on a high carbohydrate-high fat diet. Biochemical and biophysical research communications 397, 537 (Jul 2, 2010)). 중요하게는, MOTS-c 처리는 HFD 사양된 생쥐에서 고인슐린혈증을 예방하고 (도면 16c, d), 그리고 간 지질 축적을 개선하였다 (도면 16e). 특히, 우리의 시험관내 연구와 부합하게, MOTS-c는 이들 HFD 사양된 생쥐의 근육에서 AMPK 활성화 및 GLUT4 발현을 증진하였다 (도면 16f).

그 다음, 통상적으로 연구된, 비만 경향성 C57BL/6 생쥐 계통에서 글루코오스 항상성에 대한 MOTS-c의 효과가 내당성 검사 (GTT)를 수행함으로써 검사되었다. MOTS-c 처리된 생쥐는 급속한 글루코오스 소실을 보여주었는데, 이것은 증강된 인슐린 감수성을 암시하였다 (도면 16g). 그 다음, 고인슐린혈증-정상혈당 클램프 연구가 연장된 치료 지속 시간에서 발생하는 체중에서 변화와는 독립적으로 전신 인슐린 감수성에 대한 MOTS-c로 7-일 처리의 효과를 정량하기 위해 수행되었다. MOTS-c는 인슐린 자극 동안 정상혈당을 유지하는데 필요한 외인성 글루코오스 주입 비율 (GIR)에서 ~30% 증가에 의해 반영된 바와 같이, 전신 인슐린 감수성을 향상시켰다 (도면 16h). 인슐린은 말초 조직 내로 글루코오스 처분을 증진하고, 그리고 간 글루코오스 생산 (HGP)을 억제하여 증가된 글루코오스 이용가능성의 기간 동안 항상성을 유지한다 (C. R. Kahn, Banting Lecture. Insulin action, diabetogenes, and the cause of type II diabetes. Diabetes 43, 1066 (Aug, 1994)). 인슐린 감수성에 대한 MOTS-c 작용의 조직 특이성을 결정하기 위해, 삼중수소 글루코오스가 클램프 동안 주입되었다. 비록 MOTS-c 처리가 인슐린-자극된 글루코오스 처분 비율 (IS-GDR)을 유의미하게 증강시키는 (도면 16i) 것으로 관찰되었지만, 간 인슐린 감수성에 대한 MOTS-c의 어떤 효과도 검출되지 않았는데, 그 이유는 간 글루코오스 생산 (HGP)의 비율이 군 간에 필적하였기 때문이다 (도면 16j). 인슐린-자극된 글루코오스의 70-85%가 골격근 내로 처분되는 것을 고려하면, 인슐린 감수성과 글루코오스 항상성을 증강하는 MOTS-c 작용이 이러한 조직에서 매개될 수 있다. 실제로 이러한 개념은 MOTS-c 처리 이후에, HFD-사양된 생쥐의 골격근에서 강한 AMPK 활성화 및 증가된 GLUT4 발현에 의해 뒷받침되었다 (도면 16f). 게다가, MOTS-c는 또한, 탈체에서 생리학적 분량의 인간 인슐린으로 자극된 가자미근 내로 글루코오스 흡수를 증강시켰다. 근육 (도면 16k)에서 및 순환 (도면 16l)에서 MOTS-c 수준이 노화 동안 인슐린 저항성의 발달에 부수적으로 감퇴하기 때문에 (C. R. Kahn, Banting Lecture. Insulin action, diabetogenes, and the cause of type II diabetes. Diabetes 43, 1066 (Aug, 1994)), 중년 (12 개월)과 어린 (3 개월) 수컷 C57BL/6 생쥐의 가자미근 내로 인슐린-자극된 글루코오스 (2-데옥시글루코오스) 흡수를 계측함으로써 MOTS-c가 인슐린 작용에서 연령-의존성 장애를 반전시킬 수 있는 지가 결정되었다. 인슐린 저항성의 징후는 C57BL/6 생쥐에서 대략 12 개월의 연령에서 나타나기 시작한다 (C. R. Kahn, Banting Lecture. Insulin action, diabetogenes, and the cause of type II diabetes. Diabetes 43, 1066 (Aug, 1994)). 실제로 더욱 나이든 생쥐로부터 근육은 더욱 인슐린 내성이었지만, 7 일의 MOTS-c 처리는 어린 동물에 필적하는 감수성을 복원하였다 (도면 16m).

논의

기술적인 진전은 미토콘드리아 DNA에서 작은 ORF의 실존을 암시하는 미토콘드리아 유전학의 이전에 알려지지 않은 성질을 밝혀냈다 (T. R. Mercer et al., The human mitochondrial transcriptome. Cell 146, 645 (Aug 19, 2011)). 특히, 핵 유전체에서 다양한 생리활성 작은 ORF가 초파리 (Drosophila)에서 보고되었다 (E. G. Magny et al., Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames. Science 341, 1116 (Sep 6, 2013); J. Savard, H. Marques-Souza, M. Aranda, D. Tautz, A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell 126, 559 (Aug 11, 2006); T. Kondo et al., Small peptides switch the transcriptional activity of Shavenbaby during Drosophila embryogenesis. Science 329, 336 (Jul 16, 2010).; 그리고 M. I. Galindo, J. I. Pueyo, S. Fouix, S. A. Bishop, J. P. Couso, Peptides encoded by short ORFs control development and define a new eukaryotic gene family. PLoS biology 5, e106 (May, 2007)). 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 내에서 인코딩된 인자의 잠재적 실존을 논의하는 기존 문헌의 증거가 있다. 가령, 폴리아데닐화된 미토콘드리아 rRNA 클론이 1980년대 초반에, 인터페론-유도된 인간 골수모세포 세포로부터 작제된 cDNA 라이브러리의 일부로서 클로닝되었는데 (J. Villegas, P. Araya, E. Bustos-Obregon, L. O. Burzio, Localization of the 16S mitochondrial rRNA in the nucleus of mammalian spermatogenic cells. Molecular human reproduction 8, 977 (Nov, 2002)), 이것은 mtDNA에서 인코딩된 강한 인터페론-유도된 인자를 암시하였다. 또한, 인간에서, 16S rRNA는 인간 정자발생 세포의 핵에서 국부화되어 발견되고 (J. Durieux, S. Wolff, A. Dillin, The cell-non-autonomous nature of electron transport chain- mediated longevity. Cell 144, 79 (Jan 7, 2011)), 반면 초파리 (Drosophila)에서, 미토콘드리아 rRNA는 그들이 생식세포 확립에서 일정한 역할을 수행하는 세포질에서 발견되었다 (R. Amikura, M. Kashikawa, A. Nakamura, S. Kobayashi, Presence of mitochondria-type ribosomes outside mitochondria in germ plasm of Drosophila embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 9133 (Jul 31, 2001)).

MOTS-c는 이의 번역이 포유류 유전자 코드를 필요로 한다는 점을 특히 고려하여, 미토콘드리아 및 세포 또는 멀리 떨어진 장기, 예를 들면, 골격근 사이에 효과적인 양측성 의사소통을 위한 적응의 산물일 수 있다. MOTS-c, 그리고 휴마닌을 전체 생리학을 조절하는 내재성 미토콘드리아 신호의 신규한 부류로서 암시하는 충분한 증거가 본원에서 제공된다 (C. Lee, K. Yen, P. Cohen, Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides? Trends in endocrinology and metabolism: TEM, (Feb 7, 2013)). 선충 예쁜꼬마선충 (C. elegans)을 이용한 최근 보고는 뉴런에서 미토콘드리아 교란이 장에서 미토콘드리아 접히지 않은-단백질 반응 (UPR)을 유발하고, 그리고 스트레스의 장기간 의사소통을 허용하는 미확인된 순환 신호에 의해 매개된 효과로서 수명을 연장한다는 것을 보여주었다 (D. K. Woo, G. S. Shadel, Mitochondrial stress signals revise an old aging theory. Cell 144, 11 (Jan. 7, 2011) 및 C. Cheadle, M. P. Vawter, W. J. Freed, K. G. Becker, Analysis of microarray data using Z score transformation. The Journal of molecular diagnostics : JMD 5, 73 (May, 2003)).

비록 MOTS-c 작용의 특정한 기계적인 상세가 아직 완전히 확인된 것은 아니지만, 물질대사에 대한 이의 충격은 아마도, 노화 및 당뇨병, 암, 죽상경화증과 신경변성을 비롯한 연령-관련된 질환에 대한 주요한 함의를 가질 것이다. MDP의 급부상하는 생물학 및 MOTS-c 작용에서 AICAR과 AMPK의 독특한 관여 (도면 16n)는 생리학적 및 병리학적 장애에서 미토콘드리아의 역할에 관한 우리의 이해를 확대할 뿐만 아니라 신규한 진단적 및 치료적 표적을 확인하는 흥미로운 기회를 제공한다.

방법

세포 배양

HEK293과 HeLa 세포는 37 ℃와 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM)에서 일과적으로 배양되었다. 미토콘드리아 DNA를 결여하는 ρ0 세포는 이전에 설명된 바와 같이 저분량의 에티듐 브롬화물 (EtBr; 100ng/mL)에서 HeLa 세포를 배양함으로써 산출되었다 (K. Hashiguchi, Q. M. Zhang-Akiyama, Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in molecular biology 554, 383 (2009)). MOTS-c-ST 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 선별 및 G418에서 유지 (500 μM; Sigma)에 의해 산출되었다.

생쥐

모든 동물 작업은 University of Southern California and University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee에 따라 수행되었다. MOTS-c (Genscript, USA)는 모든 생체내 실험에서 복강내 주사에 의해 매일 주사되었다. 8-주령 CD-1 (ICR) 생쥐는 Harlan으로부터 구입되었다. C57BL/6 생쥐는 Jackson Laboratories로부터 구입되었다. 생쥐는 Research Diets로부터 구입된 고지방 식이 (칼로리로 60%)와 정합 대조 식이 (각각, Cat# D12492와 D12450J)가 8 주 동안 사양되었다. 펠렛은 주 2회 대체되고, 그리고 체중과 식품 소비가 매일 기록되었다 (N=10).

클로닝

제한 효소 EcoRI (5')와 XhoI (3')을 이용한 지향성 클로닝이 MOTS-c 발현 클론을 작제하기 위해 수행되었다. 이들 제한 효소에 의해 접하는 MOTS-c와 MOTS-c-HA 뉴클레오티드 서열이 합성되고 5' 인산화되고 (IDT, USA), 혼성화되고, 그리고 소화된 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, USA), 또는 pcDNA-IRES GFP (AECOM에서 Nir Barzilai로부터 선의적 선물)로 결찰되었다. 모든 효소는 달리 명시되지 않으면, NEB (USA)로부터 구입되었다.

면역세포화학

커버슬립 상에 도말된 HEK293 세포는 실온에서 15 분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정되었다. 고정 후, 이들 세포는 실온에서 10 분 동안 인산염 완충된 식염수 (PBS)에서 0.2% Triton X-100으로 투과화되고, 그리고 실온에서 1 시간 동안 0.2% Triton X-100과 1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 내포하는 PBS에서 차단되었다. 세포는 이후, 4 ℃에서 하룻밤 동안 0.2% Triton X-100과 1% BSA를 내포하는 PBS에서 토끼 항-MOTS-c 항체 (1:50) 및 염소 항-hsp60 항체 (1:100; Santa Cruz Biotechnology, USA)와 함께 배양되었다. PBS로 3회 세척 후, 이들 세포는 실온에서 1 시간 동안 0.2% Triton X-100과 1% BSA를 내포하는 PBS에서 Alexa Fluor 488-접합된 당나귀 항-토끼 IgG (1:200; Invitrogen, US) 및 Alexa Fluor 568-접합된 당나귀 항-염소 IgG (1:200; Invitrogen)와 함께 더욱 배양되었다. 핵은 실온에서 5 분 동안 Hoechst 33258 (2mg/ml; Invitrogen)을 내포하는 PBS에서 염색되었다. 면역염색의 특이성은 실온에서 1 시간 동안, 69 μg/ml MOTS-c 펩티드 (Genscript, USA)와 함께 배양 후 MOTS-c 항체를 이용함으로써 증명되었다. 커버슬립은 ProLong Gold 안티페이드 시약 (Invitrogen)으로 적재되고 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Germany) 하에 레이저 광역을 이용하여 관찰되었다. 구조화된 조명 현미경검사 (SIM) 이미지를 위해, Z-스택 섹션이 회절격자의 5회 회전으로 수집되고, 그리고 이미지가 ELYRA PS.1 소프트웨어를 이용하여 재구성되었다.

면역검정

전체 MOTS-c 펩티드가 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 접합되고 토끼 내로 주사되었다. IgG 정제된 혈청은 웨스턴 블롯팅 및 ELISA에 이용되었다. 순환하는 MOTS-c 수준은 USC에서 개발된 인하우스 샌드위치 ELISA에 의해 혈청, 혈장, 그리고 CSF로부터 계측되었다. 맞춤 토끼 항-MOTS-c 다중클론 항혈청이 YenZym Antibodies, LLC (South San Francisco, CA)에서 생산되었다. 단백질 A/G 칼럼 크로마토그래피 (Pierce, Rockford, IL)로 정제된 IgG 하위부류가 포획 항체로서 이용되었다. 항-MOTS-c IgG가 비오틴으로 표지화되고 검출 항체로서 이용되었다. 내인성 MOTS-c 수준을 계측하기 위해, 합성 MOTS-c (GenScript)가 25 pg/mL 내지 6400 pg/mL의 범위에서 표준으로서 이용되었다. 검정에 앞서, MOTS-c가 90% 아세토니트릴과 10% 1N HCl에서 추출되었다. 간단히 말하면, 200μL의 추출 시약이 100 μL의 혈장에 첨가되고, 부드럽게 혼합되고, 그리고 실온에서 30 분 동안 배양되었다. 혼합물은 원심분리되고, 그리고 상층액이 제거되고 건조되었다. 건조된 추출물은 0.5% Tween 20을 포함하는 200 μL의 인산염 완충액으로 재구성되고, 그리고 이후, 검정에 이용되었다. 96-웰 마이크로역가 평판은 0.5 μg/웰에서 포획 항체로 코팅되고 진탕기에서 실온에서 4 시간 동안 배양되었다. 표준, 대조 또는 추출된 표본 및 전적정된 검출 항체가 적절한 웰에 첨가되고 세척 완충액으로 2회 세척 및 Superblock 완충액 (Pierce Chemicals, Rockford, IL)으로 2회 세척 후 하룻밤 동안 배양되었다. 웰은 3 회 세척되고, 그리고 이후, 스트렙타비딘-HRP이 첨가되고 실온에서 30 분 동안 더욱 배양되었다. 세척 후, 200 μL/웰의 OPD 용액 (과산화수소 기질에서 1 mg/mL)이 첨가되고 10-20 분 동안 배양되었다. 반응은 2N H₂SO₄의 첨가에 의해 종결되고, 그리고 흡광도는 490 nm에서 평판 분광광도계 (Molecular Designs, Sunnyvale, CA)에서 계측되었다. 검정내와 검정간 계수 변동 (CV)은 10%보다 적었다. 혈장 인슐린 수준은 생쥐 인슐린 검정 키트 (MSD; Cat# K112BZC-1) 및 섹터 영상장치 2400A (MSD, USA)를 이용하여 검출되었다.

웨스턴 블롯팅을 위해, 단백질 표본이 EDTA-없는 프로테아제와 포스파타아제 저해제를 포함하는 1% Triton X-100 (Roche, USA)에서 제조되고, 95 ℃에서 5 분 동안 가열되고, 4-20% 구배 트리스-글리신 겔 (TGX; Bio-Rad, USA) 상에서 이동되고, 그리고 9V에서 15-30 분 동안 터보 반건성 전달 시스템 (Transblot Turbo; Biorad)을 이용하여 PVDF 막 (Bio-Rad)으로 이전되었다. 막은 30 분 동안 5% BSA로 차단되고 4 ℃에서 하룻밤 동안 일차 항체, 그 이후에 실온에서 1 시간 동안 이차 HRP-접합된 항체와 함께 배양되었다. 화학발광은 증강된 ECL (Immun-Star WesternC; Bio-Rad) 및 Chemidoc XRS 시스템 (Bio-Rad)을 이용하여 검출되고 영상화되었다.

마이크로어레이

RNA는 RNeasy 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 단리되고, 그리고 이후, BD-103-0603 Illumina Beadchips에 혼성화되었다. 미가공 자료는 이전에 설명된 바와 같이, Z-정규화에 종속되었다 (C. Cheadle, M. P. Vawter, W. J. Freed, K. G. Becker, Analysis of microarray data using Z score transformation. The Journal of molecular diagnostics : JMD 5, 73 (May, 2003)). 표본 내에 모든 검출가능한 프로브의 정규화된 Z-점수에서 수행된 주요 성분 분석은 DIANE 6.0 소프트웨어 (http://www.grc.nia.nih.gov/branches/rrb/dna/diane_software.pdf)를 이용함으로써 수행되었다. 유의미한 유전자는 z-검사 < 0.05, 오류 발견율 < 0.30뿐만 아니라 양쪽 방향에서 z-비율 > 1.5 및 ANOVA p 값 < 0.05에 의해 선별되었다. 유전자 세트 농축의 파라미터 분석 (PAGE)은 이전에 설명된 바와 같이 분석되었다 (S. Y. Kim, D. J. Volsky, PAGE: parametric analysis of gene set enrichment. BMC bioinformatics 6, 144 (2005)). 유전자 조절 네트워크와 캐노닉 경로 분석은 Ingenuity Pathways Analysis^® (Ingenuity Systems; Redwood City, CA) (N=6)를 이용하여 수행되었다.

대사체학

HEK293 세포는 24-와 72-시간 동안 MOTS-c (10 μM) 또는 물 (운반제)로 처리되었다. 또한, 검증된 MOTS-c 발현 벡터, 또는 빈 벡터 (대조)로 안정되게 형질감염된 HEK293 세포가 이용되었다. 세포는 10-cm 접시에서 10% FBS로 보충된 7-mL의 페놀-없는 DMEM에서 배양되었다. 수집을 위해, 세포는 얼음같이 차가운 인산염 완충된 식염수 (PBS)로 2회 세척되고 즉시 긁어내지고, 원심분리되고, 그리고 상층액 흡인 후 즉시 동결된다. 동결된 펠렛은 대사체학 분석 (Metabolon)에 이용되었다. 비표적화된 물질대사 프로파일링 기계장치는 3가지 독립된 플랫폼의 조합을 이용하였다: 염기성 종류에 대해 최적화된 최고 성과 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분광분석법 (UHPLC/MS/MS²), 산성 종류에 대해 최적화된 UHPLC/MS/MS², 그리고 가스 크로마토그래피/질량 분광분석법 (GC/MS). 표본은 본질적으로 기존에 설명된 바와 같이 처리되었다 (T. Ohta et al., Untargeted metabolomic profiling as an evaluative tool of fenofibrate-induced toxicology in Fischer 344 male rats. Toxicologic pathology 37, 521 (Jun, 2009) 및 A. M. Evans, C. D. DeHaven, T. Barrett, M. Mitchell, E. Milgram, Integrated, nontargeted ultrahigh performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry platform for the identification and relative quantification of the small-molecule complement of biological systems. Analytical chemistry 81, 6656 (Aug 15, 2009)). 최소 부피의 물에서, 세포는 Covaris 적응성 집중된 음향학 E-시리즈 조직 교란물질/균질기를 이용하여 용해되었다. 균질액으로부터, 100μL 분취량이 차후 질량 분광분석법을 위해 빼내지고 25μL이 전체 단백질의 계측에 이용되었다 (Bradford Assay). 자동화된 액체 취급기 (Hamilton LabStar, Salt Lake City, UT)를 이용하여, 단백질은 추출 효율에 관해 보고하기 위한 4가지 표준을 내포하는 메탄올로 균질액으로부터 침전되었다. 결과의 상층액은 이들 3가지 플랫폼에서 분석을 위해 동등한 분취량으로 분할되었다. 질소 하에 건조되고 진공-건조된 분취량은 차후에, 2가지 UHPLC/MS/MS² 분석을 위해 물에서 50μL 0.1% 포름산 (산성 조건)에서 또는 물에서 50μL 6.5mM 암모늄 중탄산염, pH 8 (염기성 조건)에서 재구성되거나, 또는 동등한 분율 비스트리메틸-실릴-트리플루오로아세트아미드 및 용매 혼합물 아세토니트릴: 디클로로메탄: 시클로헥산 (5:4:1)을 이용한 GC/MS 분석을 위해 60 ℃에서 1 시간 동안 5% 트리에틸아민으로 50μL의 최종 부피까지 유도체화되었다. 이에 더하여, 3가지 유형의 대조가 이들 실험적 표본과 협력하여 분석되었다: 모아진 실험적 표본 분취량으로부터 유래된 표본의 분취량은 데이터 세트 전역에서 기술적인 복제물로서 역할하였고, 추출된 물 표본은 과정 블랭크로서 역할하였고, 그리고 모든 분석된 표본 내로 스파이크된 표준의 칵테일은 기기 성과 모니터링을 허용하였다. 실험적 표본과 대조는 플랫폼 실행 일자 전체에서 무작위화되었다.

UHLC/MS/MS² 분석을 위해, 분취량은 Waters Acquity UPLC (Waters, Millford, MA)를 이용하여 분리되고, 그리고 전기분무 이온화 (ESI) 공급원 및 선형 이온 트랩 (LIT) 질량 분석기로 구성되는 LTQ 질량분광계 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA)를 이용하여 분석되었다. MS 기기는 99-1000 m/z를 스캔하고, 그리고 초당 대략 6회 스캔의 역동적 배제를 이용하여 MS와 MS² 스캔 사이에서 교대되었다. GC/MS를 위한 유도체화된 표본은 담체 가스로서 헬륨 및 60 ℃ 내지 340 ℃의 온도 램프로 5% 페닐디메틸 실리콘 칼럼에서 분리되고, 그리고 이후, 전자 충격 이온화 및 50-750 원자 질량 단위 스캔 범위로 단위 질량 분해능에서 작동된 Thermo-Finnigan Trace DSQ MS (Thermo Fisher Scientific, Inc.)에서 분석되었다.

대사산물은 체류 시간, 분자량 (m/z), 바람직한 부가물, 그리고 인소스 단편뿐만 아니라 연관된 MS 스펙트럼을 비롯한, 화학적 표준 진입의 참고 라이브러리에 대한 실험적 표본에서 이온 특질의 자동화된 비교에 의해 확인되었고, 그리고 Metabolon에서 개발된 소프트웨어를 이용한 품질 관리를 위해 시각적 검사에 의해 관장되었다 (C. D. Dehaven, A. M. Evans, H. Dai, K. A. Lawton, Organization of GC/MS and LC/MS metabolomics data into chemical libraries. Journal of cheminformatics 2, 9 (2010)).

통계학적 분석과 자료 전시 목적을 위해, 임의의 결측 값은 검출 한계 미만인 것으로 추정되고, 그리고 이들 값은 화합물 최소에 귀속되었다 (최소 값 귀속). 이에 더하여, 각 값은 표본당 기초에서 전체 단백질 값에 대해 정규화되었다. 로그-변환된 데이터의 통계학적 분석은 "R" (http://cran.r-project.org/)을 이용하여 수행되었는데, 이것은 자유롭게 가용한, 오픈-소스 소프트웨어 패키지이다. 실험 군 사이에 데이터를 비교하기 위해 스튜던트 t 검증이 수행되었다.

글루코오스와 젖산염 검정

세포 배양 배지로부터 세포외 글루코오스와 젖산염은 제조업체의 사용설명서 (Eton Bioscienes, USA)에 따라서, 글루코오스와 D-젖산염 검정 키트를 이용하여 계측되었다. 세포내 글루코오스는 제조업체의 사용설명서에 따라서, 2-NBDG (Invitrogen, USA)를 이용한 현미경검사에 의해 결정되었다.

산소 소모와 세포외 산성화 비율

실시간 산소 소모 비율 (OCR)은 XF24/96 세포외 플럭스 분석기 (Seahorse Bioscience)를 이용하여 계측되었다. ATP 회전, 그리고 최고 호흡 용량은 세포를 올리고마이신 및 FCCP로 공격함으로써 추정되었다. 여분의 호흡 용량은 '최고 호흡률/기저 호흡률', 'ATP 회전 OCR - 비-미토콘드리아 OCR (로테논/안티마이신 A)'에 의한 양성자 누출, 그리고 '1 - (ATP 회전 OCR/기저 호흡률)'에 의한 커플링 효율에 의해 결정되었다. 당분해 비율은 세포외 산성화 비율 (ECAR)을 이용하여 결정되었다. 세포는 활성 당분해 비율을 결정하기 위해 글루코오스로, 그리고 최고 당분해 능력을 결정하기 위해 올리고마이신으로, 그리고 당분해 능력을 결정하기 위해 2-DG로 자극되었다.

탈체 가자미근 스트립 글루코오스 흡수

전체 근육 탈체 글루코오스 흡수는 기존에 설명된 것을 약간 변화시켜, 2- 데옥시 글루코오스 (Perkin Elmer) 및 60μl/ml 인간 인슐린 (Novo Nordisk Pharmaceutical Industries)을 이용하여 12 주령 생쥐에서 사정되었다 (V. Ribas et al., Myeloid-specific estrogen receptor alpha deficiency impairs metabolic homeostasis and accelerates atherosclerotic lesion development. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 16457 (Sep 27, 2011) 및 C. E. McCurdy, G. D. Cartee, Akt2 is essential for the full effect of calorie restriction on insulin- stimulated glucose uptake in skeletal muscle. Diabetes 54, 1349 (May, 2005)). 간단히 말하면, 가자미근과 EDL 근육은 마취된 동물로부터 조심스럽게 절제되고, 그리고 35 ℃에서 60μU/ml 인슐린과 함께 또는 이것 없이, 완전한 Krebs-Henseleit 완충액에서 30 분 동안 즉시 배양되었다. 근육은 이후, 3mCi/ml ³H-2-데옥시글루코오스 및 0.053mCi/ml ¹⁴C-만니톨을 내포하는 동일한 완충액으로 이전되고, 그리고 스냅 동결에 앞서 20 분 동안 배양되었다. 근육은 용해 완충액에서 균질화되고 방사성에 대해 계수되거나 또는 웨스턴 블롯팅에 종속되었다. 글루코오스 흡수는 만니톨의 비특이적 흡수에 표준화되고 가자미근 그램당 글루코오스 흡수의 mmol로서 추정되었다.

고인슐린혈증-정상혈당 클램프 연구

이중 카테터가 오른쪽 경정맥 내에 외과적으로 배치되고, 그리고 글루코오스 클램프 연구가 기존에 설명된 바와 같이 수술후 3 일에 수행되었다 (V. Ribas et al., Myeloid-specific estrogen receptor alpha deficiency impairs metabolic homeostasis and accelerates atherosclerotic lesion development. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 16457 (Sep 27, 2011); A. L. Hevener et al., Muscle-specific Pparg deletion causes insulin resistance. Nature medicine 9, 1491 (Dec, 2003); 그리고 A. L. Hevener et al., Macrophage PPAR gamma is required for normal skeletal muscle and hepatic insulin sensitivity and full antidiabetic effects of thiazolidinediones. J Clin Invest 117, 1658 (Jun, 2007)). 모든 동물은 6 시간 동안 단식되고, 그리고 최종 MOTS-c 분량이 클램프에 4 시간 앞서 투여되었다. 동물은 의식 상태에서 연구되었다. 기저 글루코오스 회전은 (5.0 μCi/시간, 0.12 ml/시간)의 [3-³H] D-글루코오스 (Perkin Elmer)의 90-분 일정한 주입 이후에 결정되었다. 기저 기간 후, 글루코오스 (50% 덱스트로스, Abbott Laboratories) 및 인슐린 (8 mU/kg/분), Novo Nordisk Pharmaceutical Industries) 플러스(+) 추적자 (5.0 μCi/시간) 주입이 동시에 시작되고, 그리고 글루코오스 수준이 가변적 글루코오스 주입 비율 (GIR)을 이용하여 정상혈당에서 클램핑되었다. 추적자 희석 기술에 의해 계측된, 항정 상태에서 전체 글루코오스 처분 비율 (GDR)은 내인성 또는 간 글루코오스 생산 (HGP)의 비율 및 외인성 (차가운) 글루코오스 주입 비율 (GIR)의 합에 필적한다 (A. L. Hevener et al., Muscle-specific Pparg deletion causes insulin resistance. Nature medicine 9,1491 (Dec, 2003); A. L. Hevener et al., Macrophage PPAR gamma is required for normal skeletal muscle and hepatic insulin sensitivity and full antidiabetic effects of thiazolidinediones. J Clin Invest 117,1658 (Jun, 2007); 그리고 R. Steele, Influences of glucose loading and of injected insulin on hepatic glucose output. Ann N Y Acad Sci 82, 420 (Sep 25, 1959)). 전체 GDR의 인슐린-자극된 성분 (IS-GDR)은 전체 GDR 마이너스(-) 기저 글루코오스 회전율에 필적한다.

내당성 검사 (GTT)

혈당은 혈당측정기 (Freestyle, Abbott)를 이용하여 계측되었다. 12-주령 수컷 C57BL/6 생쥐는 7 일 동안 매일, MOTS-c (0.5mg/kg/일; IP), 또는 무균 순수한 물 (운반제)로 처리되었다. 이후, 생쥐는 D-글루코오스 (1g/kg; IP)로 주사되고, 그리고 혈액이 글루코오스 주사후 0, 15, 30, 60, 90, 그리고 120 분에 꼬리로부터 표본추출되었다.

상기 진술된 실시예는 본 발명의 조성물, 시스템과 방법의 구체예를 만들고 이용하는 방법에 관한 완전한 개시와 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제공되고, 그리고 본 발명자들이 그들의 개시로서 간주하는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 당업자에게 명백한, 본 발명을 실행하기 위한 상기-설명된 방식의 변형은 다음 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허와 간행물은 본 발명이 관련되는 당해 분야의 평균적 기술자의 기술 수준을 지시한다. 본 발명에서 인용된 모든 참고문헌은 마치 각 참고문헌이 전체적으로 개별적으로 참조로서 편입된 것처럼 동일한 정도로 참조로서 편입된다.

모든 표제와 섹션 지정은 단지 명료함과 참고 목적으로만 이용되고 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 고려되지 않는다. 가령, 당업자는 본원에서 설명된 발명의 사상과 범위에 따라 타당하면, 상이한 표제와 섹션으로부터 다양한 양상을 합동하는 유용성을 인지할 것이다.

본원에서 인용된 모든 참고문헌은 마치 각 개별 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 점에서 전체적으로 참조로서 편입되는 것으로 특이적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼 동일한 정도로 본원에서 전체적으로 그리고 모든 점에서 참조로서 편입된다.

당업자에게 명백할 본 출원의 많은 변형과 변이는 이의 사상과 범위로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있다. 본원에서 설명된 특정한 구체예와 실시예는 단지 실례로서 제공되고, 그리고 본 발명은 첨부된 청구항의 조건 및 이들 청구항에 정당하게 부여되는 등가물의 전체 범위에 의해서만 제한될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California <120> Mitochondrial-Derived Peptide MOTS3 Regulates Metabolism and Cell Survival <130> 008074-5058-US <140> 14/213,617 <141> 2014-03-14 <150> 61/801,474 <151> 2013-03-15 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Trp Gln Glu Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Pro Arg Lys Leu Arg 1 5 10 15 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgaggtggc aagaaatggg ctacattttc taccccagaa aactacgata g 51 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Canis lupus <400> 3 Met Arg Trp Met Gly Tyr Tyr Arg Thr His Cys Tyr Lys Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 4 Met Lys Trp Met Gly Tyr Thr Tyr Arg Tyr Asn Val Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Lys Trp Met Gly Tyr 1 5 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Met Lys Arg Lys Met Gly Tyr Ser Arg Thr Arg Asn Tyr Thr Lys Gly 1 5 10 15 Arg Arg <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Panthera leo <400> 7 Met Arg Trp Glu Ala Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Asn 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOTS-c Ch. 17a <400> 8 Met Arg Trp Gln Glu Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Pro Arg Lys Phe Tyr 1 5 10 15 Asp <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOTS-c Ch. 17b <400> 9 Met Arg Trp Gln Glu Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Pro Arg Lys Phe Tyr 1 5 10 15 Asn <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOTS-c Ch. 11 <400> 10 Met Arg Trp Gln Glu Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Phe Arg Lys Leu Arg 1 5 10 15 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOTS-c Ch. 1 <400> 11 Met Arg Trp Gln Glu Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Thr Gln Lys Ile Leu 1 5 10 15 Leu <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOTS-c Ch. 4 <400> 12 Met Arg Trp Gln Glu Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Ile Arg Gln Ile Ser 1 5 10 15 Gln <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOTS-c Ch. 17c <400> 13 Met Arg Trp Gln Glu Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Thr Gln Lys Ile Ser 1 5 10 15 Arg <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOTS-c Ch. X <400> 14 Met Arg Trp Gln Glu Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Val Gln Lys Leu Ser 1 5 10 15 Arg <210> 15 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MOTS-c Ch. 17d <400> 15 Met Arg Trp Gln Glu Met Gly Tyr Ile Phe Tyr Thr Gln Lys Ile Ser 1 5 10 15 Arg Val Arg Asn Thr Val Asp Ser Arg Val Pro Pro Lys Pro Ser Phe 20 25 30 Gly Ser Arg Leu Thr Asn Gln Leu Ile Pro Val Leu Arg Thr Cys Val 35 40 45 Ala Gly Ser Gly Arg Ser Leu 50 55

Claims (24)

1. 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
2. 청구항 1에 있어서, 서열 번호:1에 80% 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 청구항 1에 있어서, 서열 번호:1에 90% 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 청구항 1에 있어서, 서열 번호:1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
5. 청구항 1, 2, 3 또는 4의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
6. 청구항 5에 있어서, 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
7. 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:1에 80% 또는 90% 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 청구항 7에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 당뇨병을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물의 치료 효과량을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:1에 80% 또는 90% 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 청구항 10에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 청구항 10에 있어서, 당뇨병은 I형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 청구항 10에 있어서, 당뇨병은 II형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 청구항 10에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 비만 및/또는 지방간을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물의 치료 효과량을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:1에 80% 또는 90% 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 청구항 16에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 청구항 16에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 서열 번호:1에 70% 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 제약학적 조성물의 치료 효과량을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 청구항 20에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:1에 80% 또는 90% 서열 동일성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 청구항 20에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:1의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 청구항 20에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 청구항 20에 있어서, 암은 유방암, 뇌암, 결장암, 흑색종, 백혈병 (가령, AML), 림프종, 췌장암, 전립선암, 난소암, 폐암, 그리고 위암으로 구성된 군에서 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 방법.
    

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