CN105418734B - 肽mdp-1及其在制备抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肽MDP‑1及其在制备抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症药物中的应用。其中肽MDP‑1的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明通过动物体内构建的内毒素血症及脓毒症模型验证了肽MDP‑1能够提高内毒素血症及脓毒症动物的生存率，抑制促炎性细胞因子的分泌，能够应用于制备抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症的治疗药物。

Description

肽MDP-1及其在制备抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症药物中 的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及肽MDP-1及其在制备抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症药物中的应用。

背景技术

内毒素是革兰阴性菌的细胞外壁溶解后释放出的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，而内毒素血症是由于血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液，或输入内毒素污染的液体而引起。内毒素的主要毒性反应包括：发热、白细胞显著增加，肝脏损害，严重者可导致内毒素休克。目前，因内毒素血症未得到及时诊断和治疗导致死亡的患者有逐年增多的趋势。

脓毒症(sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合征(SIRS)，是严重创伤、烧伤、休克、外科大手术后常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征甚至死亡。脓毒症在全球的发病率正逐年递增，脓毒症及其后续症已成为病人死亡的首要原因。在美国，每年至少有750000人罹患脓毒症，脓毒症患者的死亡率为34％。在中国，脓毒症在外科加强监护病房的发生率为8.68％，死亡率为48.7％，人均治疗费用约为100000元。因此，脓毒症不仅严重威胁人类的健康，而且给个人和社会造成了沉重的负担。

脓毒症的发病机制十分复杂，其中感染和炎症反应在脓毒症的发生发展中起着至关重要的作用。病原微生物入侵后，机体产生大量促炎性因子以清除入侵的病原微生物，若炎症反应得到及时控制，脓毒症将痊愈。但是，感染源若持续存在，炎症反应将被“瀑布样”级联放大，机体组织器官受损，甚至引起死亡；同时免疫细胞大量凋亡、失活，其数量和功能下降，机体很快进入免疫抑制状态，不仅对原发病原微生物的清除能力明显下降，而且容易发生机会致病菌引起的二重感染，最终影响脓毒症预后。尽管新的疗法不断出现，但是脓毒症患者的死亡率仍居高不下。美国食品药品管理局批准的唯一用于严重脓毒症治疗的药物重组活化蛋白C由于在临床应用不能取得满意的结果而撤出市场；eritoran(抗TLR-4的化合物)虽然在I期临床试验有效，但是却在临床II期试验中未发现明确效果而终止。目前临床上对内毒素所致的内毒素血症及多种微生物感染性脓毒症的治疗策略主要仍依赖于各种辅助治疗方法，缺乏特异、有效的治疗手段。

目前，没有任何肽MDP-1应用于抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症治疗的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肽MDP-1及其在制备抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症药物中的应用。本发明首次发现一种新肽MDP-1对内毒素血症及脓毒症动物模型具有保护作用，能够用于制备抗感染，抗内毒素血症及抗脓毒症药物。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种肽MDP-1，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

编码所述肽MDP-1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

肽MDP-1在制备抗感染药物中的应用。

肽MDP-1在制备抗内毒素血症药物和抗脓毒症药物中的应用。

所述的抗内毒素血症药物为能够降低内毒素血症的病死率的药物。

所述的抗脓毒症药物为能够降低脓毒症的病死率的药物。

所述的抗内毒素血症药物为能够抑制内毒素血症动物体内促炎性细胞因子分泌的药物。

所述的抗脓毒症药物为能够抑制脓毒症动物体内促炎性细胞因子分泌的药物。

所述的促炎性细胞因子为TNF-α和IL-6。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明采用化学合成的方法获得了一种由16个氨基酸组成的新型肽MDP-1，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，并提供了该肽MDP-1在制备抗感染、抗内毒素血症及脓毒症药物中的应用。本发明通过合成肽MDP-1，并首次发现MDP-1对内毒素血症及脓毒症动物模型具有保护作用，能够应用于制备抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症药物。

进一步的，通过实验证明，本发明提供的新型肽MDP-1在治疗LPS诱发的致死性内毒素血症及盲肠结扎穿孔术(CLP)构建的脓毒症小鼠动物模型过程中，能够有效提高动物的生存率，并且显著降低了小鼠血清及腹腔中促炎性细胞因子TNF-α和IL-6的水平，说明肽MDP-1具有良好的治疗内毒素血症及脓毒症的效果。

附图说明

图1为肽MDP-1降低LPS诱导的小鼠内毒素血症的死亡率的统计结果图，*代表p<0.05。

图2为肽MDP-1抑制采用盲肠结扎穿孔术构建的小鼠脓毒症的死亡率的统计结果图，*代表p<0.05。

图3为肽MDP-1抑制LPS诱导的内毒素血症小鼠血浆中促炎性细胞因子的分泌的统计结果图，其中(a)为促炎性细胞因子TNF-α，(b)为促炎性细胞因子IL-6，*代表p<0.05，**代表p<0.01。

图4为肽MDP-1抑制盲肠结扎穿孔术构建的脓毒症小鼠血浆中促炎性细胞因子的分泌的统计结果图，其中(a)为促炎性细胞因子TNF-α，(b)为促炎性细胞因子IL-6，**代表p<0.01。

图5为肽MDP-1抑制盲肠结扎穿孔术构建的脓毒症小鼠腹腔中促炎性细胞因子分泌的统计结果图，其中(a)为促炎性细胞因子TNF-α，(b)为促炎性细胞因子IL-6，*代表p<0.05，**代表p<0.01。

具体实施方式

下面结合附图和具体实验结果对本发明作进一步详细说明。

本发明采用化学合成的方法获得了一种由16个氨基酸组成的新型肽MDP-1，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，发明人检测了肽MDP-1对LPS刺激的小鼠巨噬细胞的炎性因子的分泌的影响，发现肽MDP-1具有抑制炎性细胞因子分泌的功能。因此，将肽MDP-1进一步用于内毒素血症和脓毒症的治疗研究，发现肽MDP-1对内毒素血症和脓毒症动物模型具有保护作用，能够显著降低小鼠的病死率，改善小鼠的生存，同时能够明显抑制小鼠体内促炎性细胞因子的水平。

本发明合成的肽MDP-1的氨基酸序列如下：

MRWQEMGYIFYPRKLR(同SEQ.ID.NO.1)

编码所述肽MDP-1的核苷酸序列如下：

ATG AGG TGG CAA GAA ATG GGC TAC ATT TTC TAC CCC AGA AAA CTA CGA(SEQ.ID.NO.2)

下面对本发明提供的肽MDP-1作用于内毒素血症和脓毒症动物模型的具体实验和结果进行详细说明。

1、肽MDP-1治疗对LPS诱导的内毒素血症小鼠的生存率影响实验：

将清洁级C57雄性小鼠40只，随机分为四组：(1)正常对照组；(2)腹腔注射10mg/kg的LPS组；(3)腹腔注射10mg/kg的LPS+肽MDP-1(5mg/kg)治疗组；(4)腹腔注射10mg/kg的LPS+肽MDP-1(15mg/kg)治疗组，治疗组在注射LPS后1小时，腹腔注射肽MDP-1治疗。每12小时观察并记录小鼠生存情况，持续7天。

实验结果如图1所示，从图1中可以看出，与模型对照组，即腹腔注射10mg/kg的LPS组相比，注射15mg/kg肽MDP-1的治疗组的内毒素血症小鼠的生存率显著提高(p<0.05)。

2、肽MDP-1治疗对盲肠结扎穿孔术(CLP)诱导的小鼠脓毒症的生存率影响实验：

将40只6-8周的清洁级健康C57雄性小鼠，随机分为四组：(1)假手术对照组；(2)CLP组；(3)CLP+肽MDP-1(5mg/kg)治疗组；(4)CLP+肽MDP-1(15mg/kg)治疗组。所有动物术前均禁食，自由饮水。脓毒症模型由盲肠结扎穿孔手术诱导。实验小鼠秤重后，用戊巴比妥钠70mg/kg腹腔注射麻醉，消毒，在腹正中线中下部行1.5cm切口，以4号线结扎盲肠，避免结扎回肠及盲肠血管，用22号穿刺针穿刺盲肠1次。随后盲肠还纳入腹腔，逐层缝合关腹。手术完成后皮下注射1ml生理盐水以补充体液。小鼠麻醉清醒后自由进食、饮水。假手术组小鼠除不进行盲肠结扎穿孔外，其余手术步骤与脓毒症组完全相同。每12小时观察并记录小鼠生存情况，直至手术后7天。

实验结果如图2所示，从图2中可以看出，与模型对照组，即CLP组相比，注射15mg/kg肽MDP-1的治疗组，脓毒症小鼠的生存率显著提高(p<0.05)。

3、肽MDP-1治疗对LPS诱导的内毒素血症小鼠血浆促炎性细胞因子的分泌影响实验：

如前述方法构建LPS诱导的内毒素血症小鼠模型。分别于模型建立后不同时间点釆用眼球摘除法收集小鼠血样于EDTA抗凝釆血管，1500rpm、4℃离心5min后取上层血浆，-80℃超低温冰箱保存待用。

采用ELISA方法检测血浆中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6的水平，具体方法如下：

1)样品准备：将待测血浆样本从冰箱中取出，室温融化，混匀；

2)标准品的制备：按试剂盒说明书将标准品分别稀释为1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml和7.8pg/ml的标准液，待用；

3)准备ELISA版，做好标记，每孔加入50μl检测稀释液；

4)每孔加入50μl标准液或待测血浆样本，并设置对照孔；

5)室温放置2小时，倒出孔内液体，加入400μl洗涤液，洗涤4次；

6)每孔加入100μl TNF-αconjugate或IL-6conjugate；

7)室温放置2小时，倒出孔内液体，加入400μl洗涤液，洗涤4次；

8)每孔加入100μl底物液，避光放置10-30min；

9)每孔加入100μl终止液，在酶标仪450nm处读取吸光度值及浓度值。

实验结果如图3所示，从图3中可以看出，在LPS注射后2小时和10小时，与模型对照组，即LPS组相比，注射15mg/kg肽MDP-1的治疗组的小鼠血浆中的促炎性因子TNF-α(图3a)和IL-6(图3b)的水平显著下降(p<0.05)。

4、肽MDP-1治疗对盲肠结扎穿孔术诱导的脓毒症小鼠血浆及腹腔灌洗液中促炎性细胞因子的分泌影响实验：

如前述方法构建CLP诱导的脓毒症小鼠模型。分别于模型建立后不同时间点处死小鼠，消毒胸腹部，遵循无菌操作原则，注射PBS对小鼠腹腔进行灌洗，重复2次，得到腹腔灌洗液，置于冰上待用。然后釆用眼球摘除法收集小鼠血样于EDTA抗凝釆血管，1500rpm、4℃离心5min后取上层血浆，-80℃超低温冰箱保存待用。之后，采用ELISA法检测腹腔灌洗液及血浆中促炎性细胞因子TNF-α和IL-6的水平，具体操作方法同上。

实验结果分别如图4和图5所示，从图4中可以看出，与模型对照组，即CLP组相比，手术后24小时，注射15mg/kg肽MDP-1的治疗组的小鼠血浆中的促炎性因子TNF-α(图4a)的水平显著下降(p<0.01)，而IL-6的水平并无显著差异(图4b)。从图5中可以看出，与模型对照组，即CLP组相比，手术后6小时，注射15mg/kg肽MDP-1的治疗组的小鼠腹腔中的促炎性因子TNF-α(图5a)(p<0.01)和IL-6的水平显著下降(图5b)(p<0.05)；手术后24小时，腹腔中的TNF-α水平显著下降(p<0.01)，而IL-6并无显著差异。

本发明提供的肽MDP-1具有渗透性好，毒副作用小，易于合成等优点，肽MDP-1能够提高LPS诱导的内毒素血症及CLP诱导的脓毒症小鼠的生存率，并且抑制动物血浆及腹腔中促炎性细胞因子的分泌，因此，能够用于制备抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症的药物。

Claims (4)

1.肽MDP-1在制备抗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述肽MDP-1的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，编码所述肽MDP-1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗脓毒症药物为能够降低脓毒症的病死率的药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗脓毒症药物为能够抑制脓毒症动物体内促炎性细胞因子分泌的药物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的促炎性细胞因子为TNF-α和IL-6。