TW201527533A - 藉由假囊酵母之發酵中過度表現脂肪酸運輸蛋白基因及編碼β氧化路徑酵素之基因以大量生產核黃素 - Google Patents

藉由假囊酵母之發酵中過度表現脂肪酸運輸蛋白基因及編碼β氧化路徑酵素之基因以大量生產核黃素 Download PDF

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TW201527533A
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Oskar Zelder
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Basf Se
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本發明係關於在假囊酵母屬(Eremothecium)之基因改造生物體中生產核黃素之方法，其中該基因改造係與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關，該方法包括使該等生物體在培養基中生長及自該培養基分離核黃素。本發明進一步關於藉由基因改造該生物體來提供屬於假囊酵母屬之核黃素積聚生物體之方法；藉由此類方法所獲得之生物體；及以此類基因改造生物體於提高核黃素之積聚上之用速。

Description

藉由假囊酵母之發酵中過度表現脂肪酸運輸蛋白基因及編碼β氧化路徑酵素之基因以大量生產核黃素
本發明係關於在阿舒囊黴(Ashbya)或亦稱為假囊酵母(Eremothecium)屬之基因改造生物體中生產核黃素之方法，其中該基因改造與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關，該方法包含使該等生物體在培養基中生長及自培養基分離核黃素。本發明進一步關於藉由基因改造該生物體來提供屬於假囊酵母屬之核黃素積聚生物體之方法；藉由此類方法所獲得之生物體；以及此類基因改造生物體用於提高核黃素之積聚之用途。
核黃素由所有植株及諸如真菌、酵母或細菌之多種微生物生產。核黃素為細胞代謝之主要組分，因為其用作黃素輔酶黃素單核苷酸(FMN)及黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)之前驅體，FMN及FAD為氧化還原反應中重要的電子載體且參與光感測、DNA保護等。包括人類之高級真核細胞無法合成核黃素，所以核黃素已獲得維生素之狀態(維生素B2)。人類中之維生素B2缺乏導致口腔及咽部黏膜發炎、皮膚褶皺瘙癢及發炎及皮膚損傷、結膜炎、視力下降及角膜渾濁。在嬰兒及 兒童中可能發生生長抑制及體重減輕。因此，必須將核黃素補充至人類或動物飲食中。因此將其添加至飼料及食物中且其亦可用作例如蛋黃醬或冰淇淋中之食用色素。
可以化學或微生物方式生產核黃素。合成核黃素之化學途徑係基於使用例如D-核糖作為起始材料之多步驟方法。生產核黃素之微生物途徑係基於數種微生物天然合成核黃素之潛能，尤其在諸如植物油之適合原料存在下。已知作為核黃素生產者之微生物包括無名假絲酵母(Candida famata)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)及假囊酵母屬(Stahmann,2010,Industrial Applications,The Mycota X，第2版，Springer,Berlin,Heidelberg，第235頁至第247頁)。
特定言之，假囊酵母屬(前述阿舒囊黴；屬於酵母菌科)之絲狀半子囊菌(filamentous hemiascomycete)真菌經鑑別為強力核黃素生產者。最近幾年已集中研究且分析生產棉假囊酵母(Eremothecium gossypii)屬之核黃素且其基因組已定序。
在棉假囊酵母(E.gossypii)(棉阿舒囊黴(Ashbya gossypii))中，發現核黃素生產階段與數種核黃素生物合成基因(例如RIB基因RIB 1、RIB 2、RIB 3、RIB 4、RIB 5及RIB 7)之轉錄顯著提高有關。因此，已開發生產核黃素之菌株，如WO 95/26406或WO 99/61623中所概述，其涉及例如藉由整合額外複本使此等基因過度表現。
此外，可闡明假囊酵母之核黃素生物合成路徑(Fischer及Bacher,2005,Nat Prod Rep,22，第324頁至第350頁)。基於對生物合成路徑之更好理解，可藉由編碼蘇胺酸醛縮酶之GLY1之過度表現及編碼細胞溶質絲胺酸羥甲基轉移酶之基因SHM之破裂來增加假囊酵母中之核黃素產量，該兩者均干擾對生產核黃素至關重要的GTP代謝(亦參見圖1及圖2)(Stahmann,2010,Industrial Applications,The Mycota X，第2版，Springer,Berlin,Heidelberg,235-247)。另一重要的調節基因為編碼 磷酸核糖焦磷酸醯胺轉移酶之ADE4，已發現其藉由干擾磷酸-核糖基胺合成來影響核黃素產量，其可以抗反饋型式提供(Jimenez等人，2005,Appl Environ Microbol,71,5743-5751)。所鑑別之核黃素路徑之經修改步驟至今主要受核黃素生物合成之最終步驟限制。
然而，儘管已有此等發展，但尤其在假囊酵母真菌之基因背景下，合成效率及核黃素產量仍非最佳，同時對食物及飼料級核黃素之需求不斷增長。
因此，存在對允許進一步提高諸如假囊酵母屬真菌之適合的生物體中核黃素產量及積聚之手段及方法的需求。
本發明針對此需求且提供在假囊酵母屬之基因改造生物體中生產核黃素之方法，其中該等修飾與脂肪酸攝取及β氧化有關，且該方法使得相較於在與基因改造生物體相同的條件下培養之無基因改造之生物體，核黃素產量提高。
因此，在第一態樣中，本發明提供在假囊酵母屬之基因改造生物體中生產核黃素之方法，其中該基因改造與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關，該方法包含使該等生物體在培養基中生長及自培養基分離核黃素。本發明尤其提供一種方法，其中該基因改造至少使得該生物體之AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性提高及/或AGOS_AER358Cp(Pox1)活性提高及/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)及/或AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)及/或AGOS_ABL018C(Faa 1、Faa 4)活性提高。
本發明人驚訝地發現，藉由提高假囊酵母之長鏈脂肪酸運輸裝置之組分活性，可實現核黃素之產量或積聚之提高。尤其，其發現藉由提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)之活性，可實現核黃素之產量或積聚之顯著提高，AGOS_ACL174Wp(Fat1)為假囊酵母之長鏈脂肪酸運輸 裝置之組分且亦被認為參與不同長鏈脂肪酸活化。本發明人進一步發現藉由提高參與假囊酵母β氧化路徑之酵素活動之活性，可實現核黃素之產量或積聚之顯著提高。特定言之，本發明人發現藉由提高AGOS_AER358Cp(Pox1)之活性，亦即，參與假囊酵母之β氧化路徑之過氧化體氧化酶之活性，可實現核黃素之產量或積聚之顯著提高。此外，其出人意料地發現藉由提高假囊酵母之β氧化路徑之AGOS_AGL060Wp(Fox2)及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)(分別亦即水合酶/去氫酶及3-酮醯基-CoA硫解酶)的活性，顯著提高核黃素之產量或積聚變得可能。本發明人亦發現藉由提高AGOS_ABL018C(Faa 1、Faa 4)(亦即，長鏈醯基-CoA合成酶，其介導脂肪酸之酯化且從而調節脂肪酸運輸)之活性，可實現核黃素之產量或積聚之顯著提高。
此等結果就迄今認為對產量具有影響之酵素活動而言為出人意料的，所生產之核黃素之效率或量典型地與核黃素生物合成之最終步驟或與使得甘胺酸或GTP用作核黃素合成之中間物(亦參見圖1)的回補反應有關，同時尤其在假囊酵母真菌之情形下尚未將諸如β氧化步驟或脂肪酸運輸活動之早期生物合成反應描述為生產核黃素之相關步驟。
相較於使用其他微生物，假囊酵母之使用另外提供數種優勢。已集中研究且分析代表性屬棉假囊酵母，其基因組已定序且存在數種允許基因操作及工程改造之可獲得的分子工具。此外，可證明假囊酵母能夠在不同油源及含油廢棄物(Park等人，2004,J Amer Oil Chem Soc,81：57-62)及甘油(Ribeiro等人，2012,J Basic Microbiol,52：582-589)中生長，因此允許高效率使用此等廉價能源作為生產核黃素之起始材料。
在一相關態樣中，本發明係關於在假囊酵母屬之生物體中生產核黃素之方法，該生物體經基因改造以相較於在與基因改造生物體相 同條件下培養之無該基因改造之生物體，提高與脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關之至少一種蛋白質的活性，該方法包含使該生物體在適合的培養基中生長及自培養基分離核黃素。
在另一態樣中，本發明係關於藉由基因改造該生物體來提供屬於假囊酵母屬之核黃素積聚生物體的方法，其中該基因改造與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關。
在又一態樣中，本發明係關於基因改造之屬於假囊酵母屬之核黃素積聚生物體，其中該基因改造與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關。
在一相關態樣中，本發明係關於屬於假囊酵母屬之核黃素積聚生物體，其經基因改造以相較於在與基因改造生物體相同條件下培養之無基因改造之生物體，提高與該生物體中之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關之至少一種蛋白質的活性。
在如上文所定義之方法或生物體之尤其較佳實施例中，該基因改造至少使得該生物體之AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性提高及/或AGOS_AER358Cp(Pox1)活性提高及/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)及/或AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)及/或AGOS_ABL018C(Faa 1、Faa 4)活性提高。
在如上文所定義之方法或生物體之另一較佳實施例中，與無基因改造之對等生物體相比，基因改造生物體能夠增加積聚至少5%至10%之核黃素。
在本發明之另一較佳實施例中，AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性之該提高歸因於AGOS_ACL174W基因(fat1)之過度表現；及/或AGOS_AER358Cp(Pox1)活性之該提高歸因於AGOS_AER358C基因(pox1)之過度表現；及/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及/或AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性之該提高歸因於AGOS_AGL060W 基因(fox2)及AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之過度表現及/或AGOS_ABL018C(Faa 1、Faa 4)活性之該提高歸因於AGOS_ABL018C基因(faa 1、faa 4)之過度表現。
在本發明之另一較佳實施例中，藉由較佳為GPD啟動子之強啟動子或藉由提供生物體之基因組中之AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、ABL018C基因(faa 1、faa 4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之至少一第二複本來傳達AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018C基因(faa 1、faa 4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之該過度表現。在尤其較佳實施例中，該強啟動子為組成型啟動子。視情況，啟動子亦可為可調節強啟動子。
在本發明之另一較佳實施例中，該fat1基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.2之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.1之多肽之核酸序列或其功能性部分或變異體；(c)可源於根據SEQ ID No.2之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；及(d)與根據SEQ ID No.2之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在本發明之另一較佳實施例中，該pox1基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.6之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.5之多肽之核酸序列或其功能性部分或變異體； (c)可源於根據SEQ ID No.6之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；及(d)與根據SEQ ID No.6之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在本發明之另一較佳實施例中，該fox2基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.8之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.7之多肽之核酸序列或其功能性部分或變異體；(c)可源於根據SEQ ID No.8之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；及(d)與根據SEQ ID No.8之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在本發明之另一較佳實施例中，該faa1/faa4基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.4之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.3之多肽之核酸序列或其功能性部分或變異體；(c)可源於根據SEQ ID No.4之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；及(d)與根據SEQ ID No.4之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在本發明之另一較佳實施例中，該pot1/fox3基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.10之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.9之多肽之核酸序列或其功能性部分 或變異體；(c)可源於根據SEQ ID No.10之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；及(d)與根據SEQ ID No.10之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在本發明之另一較佳實施例中，如上文所定義之該基因改造生物體包含至少一個額外基因改造。在一尤其較佳實施例中，該額外基因改造導致選自包含以下各者之群的至少一種活性之改變：(i)GLY1；(ii)SHM2；(iii)ADE4；(iv)PRS 2、PRS 4；(v)PRS 3；(vi)MLS1；(vii)BAS1；(viii)RIB 1；(ix)RIB 2；(x)RIB 3；(xi)RIB 4；(xii)RIB 5；(xiii)RIB 7；(xiv)ADE12；(xv)GUA1；及(xvi)IMPDH。
在另一較佳實施例中，該額外基因改造導致以下至少一種改變： (i)GLY1活性提高；及/或(ii)SHM2活性降低或消除；及/或(iii)ADE4活性提高及/或以抗反饋抑制型式提供；及/或(iv)PRS 2、PRS 4活性提高；及/或(v)PRS 3活性提高；及/或(vi)MLS1活性提高；及/或(vii)BAS1活性降低或消除；及/或(viii)RIB 1活性提高；及/或(ix)RIB 2活性提高；及/或(x)RIB 3活性提高；及/或(xi)RIB 4活性提高；及/或(xii)RIB 5活性提高；及/或(xiii)RIB 7活性提高；及/或(xiv)ADE12活性降低；及/或(xv)GUA1活性提高；及/或(xvi)IMPDH活性提高。
在另一態樣中，本發明係關於AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018Cp基因(faa 1、faa 4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之用途，其用於提高假囊酵母屬之生物體中之核黃素積聚。
在該用途之一較佳實施例中，藉由較佳為GPD啟動子之強啟動子或藉由提供生物體之基因組中之AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018Cp基因(faa 1、faa 4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之至少一第二複本來過度表現AGOS_ACL174W基因 (fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018Cp基因(faa 1、faa 4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)。在尤其較佳實施例中，該強啟動子為組成型啟動子。視情況，啟動子亦可為可調節強啟動子。
在該用途之另一較佳實施例中，該fat1基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.2之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.1之多肽之核酸序列或其功能性部分或變異體；(c)可源於根據SEQ ID No.2之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；及(d)與根據SEQ ID No.2之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在該用途之另一較佳實施例中，該pox1基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.6之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.5之多肽之核酸序列或其功能性部分或變異體；(c)可源於根據SEQ ID No.6之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；及(d)與根據SEQ ID No.6之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在該用途之另一較佳實施例中，該fox2基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.8之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.7之多肽之核酸序列或其功能性部分 或變異體；及(c)可源於根據SEQ ID No.8之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；(d)與根據SEQ ID No.8之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在該用途之另一較佳實施例中，該faa1/faa4基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.4之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.3之多肽之核酸序列或其功能性部分或變異體；(c)可源於根據SEQ ID No.4之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；及(d)與根據SEQ ID No.4之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在該用途之另一較佳實施例中，該pot1/fox3基因包含選自由以下組成之群的核酸序列：(a)根據SEQ ID No.10之核酸序列或其功能性部分；(b)編碼根據SEQ ID No.9之多肽之核酸序列或其功能性部分或變異體；(c)可源於根據SEQ ID No.10之核酸序列的作為遺傳密碼之簡併結果之核酸序列；及(d)與根據SEQ ID No.10之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列。
在另一態樣中，本發明係關於如上文所定義之生物體之用途，其用於生產核黃素。
在如上文所定義之方法、用途或生物體之尤其較佳實施例中， 屬於假囊酵母屬之該生物體為阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyi)、榛假囊酵母(Eremothecium coryli)、鐃鈸藤假囊酵母(Eremothecium cymbalariae)、棉假囊酵母、塞咔假囊酵母(Eremothecium sinecaudum)屬或假囊酵母屬CID1339。
在最終態樣中，本發明係關於來自如上文所定義之至少一種生物體之核黃素產物。
圖1描繪至核黃素(維生素B2)之代謝通量。核黃素由脂肪酸經乙醛酸循環、葡糖新生、磷酸戊糖路徑及嘌呤及核黃素合成路徑產生。
圖2展示核黃素(維生素B2)生物合成之最終步驟。核黃素自作為前驅體之GTP及核酮糖-5-磷酸合成，其涉及六種酵素活性。對應的酵素由RIB基因(RIB1、RIB2、RIB3、RIB4、RIB5及RIB7)編碼。
圖3描繪在包括β氧化路徑部分之棉假囊酵母中脂肪酸生物合成及降解的簡化圖式。虛線箭頭指示多步驟路徑。
圖4描繪為了脂肪酸運輸蛋白基因FAT1之過度表現所產生之質體pGPDp-FAT1的圖譜。縮寫：G418：KanMX抗性標記物；HomA及HomB：基因組整合位點；loxP：CRE重組酶重組位點；ORI-EC：大腸桿菌複製起點；ampR：安比西林(ampicillin)抗性基因；BseRI/BsgI：限制位點。
圖5展示為了編碼β氧化路徑之酵素之基因POX1之過度表現所產生之質體pGPDp-POX1的圖譜。縮寫：G418：KanMX抗性標記物；HomA及HomB：基因組整合位點；loxP：CRE重組酶重組位點；ORI-EC：大腸桿菌複製起點；kanR：康黴素抗性基因；SwaI：限制位點。
圖6展示為了編碼β氧化路徑之其他酵素之基因POT1及FOX2之過度表現所產生之質體pPOT1-FOX2的圖譜。縮寫：G418：KanMX抗性 標記物；HomA及HomB：基因組整合位點。
圖7展示相較於參考菌株PS3，在經工程改造之棉假囊酵母菌株中之核黃素產率。圖7A描繪在棉假囊酵母GPD啟動子控制下過度表現FAT1基因之兩個單獨產生的菌株中核黃素生產之定量。圖7B展示在棉假囊酵母GPD啟動子控制下過度表現POX1基因之兩個單獨產生的菌株中核黃素生產之定量。圖7C展示在含有POT1及FOX2基因之第二複本之兩個單獨產生的菌株中核黃素生產之定量。所有實驗均重複進行三次。
圖8展示為了編碼β氧化路徑之酵素之基因FAA1、FAA4之過度表現所產生之質體pFAA1、pFAA4之圖譜。縮寫：G418：KanMX抗性標記物；HomA及HomB：基因組整合位點；loxP：CRE重組酶重組位點；ORI-EC：大腸桿菌複製起點；ampR：安比西林抗性基因；URA3：針對釀酒酵母中之選擇之編碼乳清酸核苷5'-磷酸去羧酶之基因；2μm ori：釀酒酵母複製起點；SwaI：限制位點。
圖9展示相較於野生型菌株ATCC10895，在過度表現FAT1、POX1、FAA1/FAA4或POT1或FOX2之經工程改造之棉假囊酵母菌株中之核黃素產率。所有實驗均重複進行三次。
本發明係關於允許藉由使用經基因改造之屬於假囊酵母屬(前述阿舒囊黴)之生物體生產核黃素之改良手段及方法，且其中該等修飾與脂肪酸攝取及β氧化路徑有關。
雖然將根據特定實施例描述本發明，但不應在限制性意義上理解本說明書。
在詳細描述本發明之例示性實施例之前，提供對理解本發明而言重要的定義。如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外明確指定，否則「一(a)」及「一(an)」之單數形式亦包括對應 的複數。在本發明之上下文中，術語「約(about)」及「大約(approximately)」表示具有熟習此項技術者將理解為仍確保所討論之特徵之技術效果之準確性的間隔。該術語典型地指示±20%，較佳±15%，更佳±10%且甚至更佳±5%之與指定數值的偏差。應理解術語「包含」不具限制性。出於本發明之目的，術語「由......組成(consisting of)」被視為術語「包含(comprising of)」之一較佳實施例。若在下文中定義一群組包含至少一定數量之實施例，則此意謂亦包涵較佳僅由此等實施例組成之群組。此外，說明書及申請專利範圍中之術語「第一」、「第二」、「第三」或「(a)」、「(b)」、「(c)」、「(d)」等及其類似術語用於類似要素之間的區分且未必用於描述順序或時間次序。應理解，如此使用之術語在適當情況下可互換，且本文所描述之本發明之實施例能夠以本文所描述或說明的順序之外的其他順序操作。除非如上文或下文所闡述在本申請案中另外指示，否則倘若術語「第一」、「第二」、「第三」或「(a)」、「(b)」、「(c)」、「(d)」、「i」、「ii」等係關於方法或用途或分析法之步驟，該等步驟之間無時間或時間間隔相干性，亦即，該等步驟可同時進行或此類步驟之間可存在數秒、數分鐘、數小時、數天、數週、數月或甚至數年的時間間隔。應理解，本發明不限於本文所描述之特定方法、方案、試劑等，因為此等方法、方案、試劑可變化。亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且並不意欲限制本發明之範疇，本發明之範疇將僅受隨附申請專利範圍限制。除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有如一般熟習此項技術者通常理解之相同意義。
如上文已陳述，在一個態樣中，本發明係關於在假囊酵母屬之基因改造生物體中生產核黃素之方法，其中該基因改造與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關，該方法包含(i)較佳在脂肪酸油存在 下且視情況在非脂質碳源存在下，使該等生物體在培養基中生長；及(ii)自培養基分離核黃素。
如本文所使用之術語「屬於假囊酵母屬之生物體」或「假囊酵母生物體」意謂屬於假囊酵母屬之任何生物體，其為先前已知的及/或與阿舒囊黴屬同義。此群組至少包含阿舒假囊酵母、榛假囊酵母、鐃鈸藤假囊酵母、棉假囊酵母(先前為棉阿舒囊黴)、塞咔假囊酵母屬及假囊酵母屬CID1339。進一步包括此等屬之變異體、基於此等屬之純系或經修飾生物體。如本文所使用之術語「經修飾生物體」係指藉由突變誘發及選擇及/或基因工程改造實現的野生型假囊酵母屬之修飾或指已基因改造生物體之修飾，例如，先前經工程改造以提高核黃素產量或出於任何其他目的經修飾或工程改造之假囊酵母菌株。該術語特定地包括假囊酵母屬，其係藉由諸如化學或UV突變誘發或不同突變誘發之一般突變誘發方法獲得。在一較佳實施例中，假囊酵母屬之生物體為棉假囊酵母，且在一更佳實施例中，其為菌株ATCC 10895之棉假囊酵母。
如本文所使用之術語「無基因改造之生物體」係指未經基因改造以提高與脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關之蛋白質之活性的生物體，尤其AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及/或AGOS_AER358Cp(Pox1)活性及/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及/或AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性及/或AGOS_ABL018C(Faa 1、Faa 4)活性，且除此之外，其具有與本發明之基因改造生物體相同的基因構造，亦即，其與本發明之基因改造生物體之唯一的基因差異為本發明之基因改造。因此，無基因改造之生物體為本發明內其中引入基因改造之親代菌株且其較佳為菌株ATCC 10895之棉假囊酵母。親代菌株可不包含任何基因改造或其可包含除本發明之彼等基因改造外之基因改造。
如本文所使用之術語「使該生物體在培養基中生長」係指熟習 此項技術者已知之任何適合手段及方法之使用，其允許如本文所定義之生物體之生長且其適合於合成及/或積聚核黃素。生長可以分批製程或在連續發酵製程中進行。生物體較佳在脂肪酸油存在下且視情況在非脂質碳源存在下生長。
用於進行分批或連續發酵製程之方法為熟習此項技術者所熟知且描述於文獻中。培養可在特定的溫度條件下進行，例如在15℃與45℃之間，較佳在20℃與40℃或15℃與30℃之間，更佳在20℃與30℃之間，且最佳在28℃下進行。在另一實施例中，培養可在廣泛pH範圍下進行，例如在pH 6與pH 9之間，較佳在pH 6.5與8.5之間，更佳在6.7與7.5之間，且最佳在6.8與7之間進行。
如本文所使用之術語「脂肪酸油」係指廢油、非可食用油或廉價種子油。此類油之較佳實例為大豆油或菜籽油。脂肪酸油可以任何適合的量或濃度存在於培養基中，例如濃度為5%(v/v)至40%(v/v)，例如濃度為5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%、27.5%、30%、32.5%、35%、37.5%或40%。較佳可使用約10%之濃度。
如本文所使用之術語「在非脂質碳源存在下」意謂在不屬於脂質群組之養分存在下進行培養。培養較佳可在糖養分存在下，例如在葡萄糖、蔗糖、果糖等存在下進行。
在其他特定實施例中，培養基可包含額外物質。此類額外物質之實例為大豆粉。可較佳以1%(w/v)至5%(w/v)，例如1%、2%、3%、4%、5%(w/v)之濃度提供大豆粉。大豆粉為複合培養基，其典型地包含蛋白質、碳水化合物及鹽。
額外物質之另一實例為甘胺酸。可較佳以1%(w/v)至5%(w/v)，例如1%、2%、3%、4%、5%(w/v)之濃度提供甘胺酸。
在極其特定實施例中，培養基可包含以下成分：酵母萃取物、 大豆粉、甘胺酸、麩胺酸鈉、KH2PO4、MgSO4、DL-甲硫胺酸、肌醇、甲酸鈉、脲及菜籽油或大豆油。在尤其較佳實施例中，培養基可包含呈如以下實例中所描述之濃度及量之成分。
如本文所使用之措辭「自細胞及培養基分離核黃素」係指自細胞提取核黃素及自細胞碎片及培養基成分分離核黃素之任何適合的方法。在一較佳實施例中，分離可如Stahmann,Industrial Applications,第2版，The Mycota X,M.Hofrichter(編)，Springer Verlag Berlin Heidelberg,2010，第235頁至第247頁中所描述進行。
如本文所使用之術語「生產核黃素」意謂假囊酵母生物體能夠合成及積聚核黃素。術語「積聚核黃素」意謂所合成之核黃素儲存於細胞內及/或分泌於周圍培養基中，在兩種情況下均導致細胞培養物中之核黃素濃度總體升高。在特定實施例中，積聚可在適合的分離製程之後變得可辨別，在該製程中獲得細胞所生產之所有核黃素，亦即，包括細胞內所儲存之核黃素及分泌的核黃素。此類製程已描述於上文中。
如本發明之上下文中所意謂之生產核黃素典型地不同於在野生型生物體中合成核黃素，亦即，其係指相比於假囊酵母之野生型菌株過度生產核黃素。尤其在如上文或實例中所定義之細胞培養物條件下，假囊酵母之野生型菌株每公升細胞培養物典型地生產約50mg至100mg核黃素。如本文所使用之術語「過度生產」係指細胞培養物生產超過約50mg/l至100mg/l之核黃素。因此，術語「核黃素過度生產生物體」或「核黃素過度生產菌株」係指每公升細胞培養物生產超過約50mg至100mg之核黃素的假囊酵母生物體或菌株。
如本文所使用之術語「核黃素」係指化合物7,8-二甲基-10-(D-1'-核糖醇基-)異咯嗪以及其衍生物。術語「衍生物」係指7,8-二甲基-10-(D-1'-核糖醇基-)異咯嗪之任何經化學修飾之形式。此類衍生物可為 例如酯、醚、酸、脂質、糖基化形式或鹽形式。此等衍生物可藉由假囊酵母生物體自身提供，例如在額外生物化學反應中，或可在培養基中進行，例如藉由存在於該培養基中之反應物來提供。在特定實施例中，核黃素可以結晶形式提供。此類核黃素晶體可典型地在細胞中積聚。
可藉由熟習此項技術者已知之任何適合的方法進行假囊酵母細胞(或任何其他微生物細胞，例如其他起源之對照細胞)之核黃素含量之測定以及培養基中之核黃素含量之測定。
細胞培養物中之核黃素含量之測定(且因此如上文或下文所提及亦指示每公升培養物(包括細胞中核黃素之量)以毫克計之核黃素的量或積聚)採用基於培育程序及後續測試程序之較佳測定方法，其包括以下步驟：典型地將10ml預培養基(55g酵母萃取物50，0.5g MgSO4，在NaOH之情況下pH 7.0，且填充有950ml H2O；9.5ml此培養基+0.5ml菜籽油)填入100mL愛倫美氏(Erlenmeyer)無隔板燒瓶中。燒瓶典型地接種有在SP培養基盤上生長3至4天的棉假囊酵母菌絲體(1cm2)。隨後在約30℃及200rpm下培育燒瓶約40h。隨後，使用1ml預培養物來接種填入250mL具有扁平隔板之愛倫美氏燒瓶中之約25ml主培養基(30g酵母萃取物50，20g大豆粉，10g甘胺酸，7g麩胺酸鈉，2g KH2PO4，0.5g MgSO4，1.1g DL-甲硫胺酸，0.2g肌醇，2.1g甲酸鈉，在NaOH之情況下pH 7.0，且填充有965ml H2O；21.2ml主培養基+2.8ml菜籽油+0.83ml脲溶液)。典型地稱重所有燒瓶以測定培育之前的質量。典型地在約30℃及200rpm下培育培養物約6天。在培育之後，典型地再次稱重燒瓶以測定培育後質量且因此能夠包括培育期間之蒸發效應。該方法可較佳用5種或5種以上，更佳10種或10以上的並列培養物或純系以多種並列順序進行。量測及進一步培育可較佳重複兩次或至少重複三次進行以考慮培養物之統計差 異。
隨後，可藉由適合的光學量測分析法測定整個生產培養物之核黃素含量，亦即，包括細胞之核黃素含量(亦包括核黃素之任何結晶形式)及自細胞分泌且存在於培養基中之核黃素。在一較佳測定方法中，可採用光學量測分析法，其係基於如根據上述程序(或根據任何其他培養程序)所獲得之培養基與菸鹼醯胺溶液之反應。較佳地，將250μL培養物與約4.75mL 40%菸鹼醯胺溶液混合。隨後，可在高溫下，例如約60℃至80℃下，較佳約70℃下培育混合物持續例如約30min至60min，較佳持續40min。培育應較佳在黑暗中進行。隨後，可冷卻樣品持續例如約5min，且將其與水，例如3ml水混合。可在440nm或450nm之波長處進行消光之光學量測測定。尤其較佳為如實例中所描述之方法，例如下文之實例5中所描述之方法。
在另一實施例中，可藉由HPLC，如例如Schmidt等人，Microbiology,1996,142,419-426中所描述進行核黃素測定。
本發明亦設想此方法之替代方案及變體以及不同於上文所揭示之方法的核黃素測定方法。此類其他替代方案將為熟習此項技術者所知且可源於適合的教科書或文獻來源。
如本文所使用之術語「基因改造假囊酵母生物體」或「假囊酵母屬之基因改造生物體」意謂藉由熟習此項技術者已知之任何適合的基因手段及方法改變假囊酵母生物體以生產核黃素，尤其以便提高核黃素之產量。類似地，如本文所使用之術語「經基因改造之假囊酵母生物體」意謂假囊酵母生物體已經熟習此項技術者已知之任何適合的基因手段及方法修飾或改變以使其合成且積聚核黃素，尤其以使其合成及積聚核黃素得到提高。在本發明中，假囊酵母生物體經基因改造以提高與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關的一或多種蛋白質之活性。
用於基因改造屬於假囊酵母屬之生物體之方法為熟習此項技術者所知且描述於文獻中。其包含以下常用方法：將遺傳元件或材料引入假囊酵母中以便含於假囊酵母細胞中，以便整合於染色體中或染色體外(參見例如Jimenez等人，2005,Applied and Environmental Microbiology 71,5743-5751)或將存在於假囊酵母之基因組中之遺傳元件或序列移除或破壞或修飾(參見例如Wendland等人，2000,Gene 242,381-391；及Mateos等人，2006,Applied and Environmental Microbiology 72,5052-5060)。
如本文所使用之術語「遺傳元件」意謂能夠運輸基因資訊之任何分子單元。因此，其係關於基因，較佳關於內源基因、嵌合基因、異體基因、轉殖基因或密碼子最佳化基因。術語「基因」係指表現特異蛋白質之核酸分子或片段，其較佳係指包括編碼序列之前(5'非編碼序列)及之後(3'非編碼序列)的調節序列之核酸分子。術語「內源基因」係指如自然界中所發現之基因，例如在假囊酵母之野生型菌株中，其具有其自身的調節序列。術語「嵌合基因」係指任何非內源基因之基因，包含在自然界中未一起發現的調節及編碼序列。因此，嵌合基因可包含來源於不同來源之調節序列及編碼序列或來源於相同來源但以與自然界中所見不同的方式排列之調節序列及編碼序列。根據本發明，「異體基因」係指在假囊酵母宿主生物體中不常見但藉由基因轉移引入假囊酵母宿主生物體中之基因。異體基因可包含插入至非原生生物體中之內源基因或嵌合基因。術語「轉殖基因」係指已藉由轉化程序引入基因組中之基因。
「密碼子最佳化基因」為其密碼子使用頻率經設計以模擬宿主細胞之較佳密碼子使用頻率的基因，該密碼子使用較佳已根據屬於假囊酵母屬之生物體的密碼子使用，更佳根據棉假囊酵母之密碼子使用進行調適。在本發明之特定實施例中，密碼子使用亦可經修飾以建立 相較於假囊酵母中所存在之野生型序列，某一基因之主要(核苷酸)編碼序列之偏差，同時保持次要(胺基酸)序列一致或幾乎一致。在此等實施例中，可進行密碼子使用之修飾以便增加基因表現。另外，或替代地，密碼子使用之修飾可進一步用於使核苷酸序列層面上之差異最大化，亦即，以便提供核苷酸層面上之最少類似序列，同時保持胺基酸序列一致或幾乎一致。術語「幾乎一致」意謂可存在相對於經編碼蛋白質之酵素或生物功能不具有或僅具有邊緣效應之胺基酸交換。可使用熟習此項技術者已知之適合的方法測試此類效應。
術語「編碼序列」係指編碼特異胺基酸序列之DNA序列。術語「調節序列」係指位於編碼序列之上游(5'非編碼序列)、編碼序列之內或編碼序列下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，且其影響轉錄、RNA加工或穩定性或相關編碼序列之轉譯。調節序列可包括啟動子、強化子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點及莖環結構。
術語「啟動子」係指能夠控制編碼序列或功能性RNA之表現的DNA序列。典型地，編碼序列位於3'至啟動子序列處。啟動子可整體來源於內源基因或由來源於自然界中可見之不同啟動子之不同元件構成或甚至包含合成DNA區段。熟習此項技術者應理解，不同啟動子可在不同發育階段或回應於不同環境或生理條件引導基因表現。使基因在大部分時間在大部分細胞類型中表現之啟動子通常被稱作組成型啟動子。典型地，因為調節序列之準確界限尚未完全界定，所以不同長度之DNA片段可具有相同的啟動子活性。另一方面，使基因在例如僅基於特定因素、生長階段、溫度、pH之存在或特定代謝物等之存在的特定情形中表現之啟動子應理解為可調節啟動子。
術語「3'非編碼序列」係指位於編碼序列之下游的DNA序列。此包括聚腺苷酸化識別序列及編碼能夠影響mRNA加工或基因表現之調 節信號的其他序列。聚腺苷酸化信號通常藉由影響聚腺苷酸鏈添加至mRNA前驅體之3'端來表徵。3'區域可影響轉錄，亦即影響RNA轉錄物之存在、RNA加工或穩定性或相關編碼序列之轉譯。術語「RNA轉錄物」係指由DNA序列之RNA聚合酶催化轉錄所產生之產物。當RNA轉錄物為DNA序列之完全互補複本時，其被稱作初級轉錄物或其可為來源於初級轉錄物之轉錄後加工之RNA序列且被稱作成熟RNA。術語「mRNA」係指信使RNA，亦即無內含子且可由細胞轉譯至蛋白質中之RNA。
術語「可操作地連接」係指單一核酸片段上之核酸序列結合以使得一者之功能受另一者影響。在啟動子之上下文中，該術語意謂使得編碼序列能夠影響彼編碼序列之表現，亦即，編碼序列處於啟動子之轉錄控制下。驅動假囊酵母屬之生物體中之基因表現的調節元件為熟習此項技術者所知且廣泛描述於文獻(參見例如Jimenez等人，2005,Appl Environ Microbol,71,5743-5751或Maeting等人，1999,FEBS letters,444：15-21)中。在一較佳實施例中，編碼序列與GPD啟動子可操作地連接。
在本發明之中心實施例內，假囊酵母生物體之基因改造與假囊酵母之脂肪酸攝取有關。
如本文所使用之「脂肪酸攝取」係指運輸過程，其使脂肪酸、尤其長鏈脂肪酸穿過細胞膜進入假囊酵母細胞中。此過程典型地為涉及數種活動之多層面過程。一般認為脂肪酸運輸過程再分為數個步驟，包括將脂肪酸遞送至膜，將脂肪酸移位穿過膜，提取脂肪酸及自該膜移出脂肪酸。在酵母脂肪酸運輸過程中，典型地至少需要Fat1p、Faa1p及Faa4p活性。由於Faa1p或Faa4p，脂肪酸運輸過程明顯由脂肪酸之酯化驅動。據推測，尤其Fat1p及Faa1p展示功能性結合且從而介導外源性長鏈脂肪酸之經調節運輸。
假囊酵母生物體之脂肪酸攝取似乎與釀酒酵母之脂肪酸攝取高度相似。在棉假囊酵母中鑑別出AGOS_ACL174W基因(蛋白質形式AGOS_ACL174Wp)，其為釀酒酵母Fat1基因之同線同源物。Fat1p為雙功能蛋白質，其在長鏈脂肪酸運輸及極長鏈脂肪酸活化層面上之脂肪酸運輸中發揮中心作用。含有Fat1p結構基因缺失之酵母菌株基於多種生長及生物化學表型不同於野生型細胞。此等菌株1)在含有脂肪酸合成抑制劑淺藍菌素(cerulenin)及長鏈脂肪酸之培養基上生長之能力受損；2)展示放射性標記之長鏈脂肪酸之攝取減少(亦參見Zou等人，2002,Journal Biological Chemistry,277,31062-31071)。此外，在棉假囊酵母中鑑別出AGOS_ABL018C(蛋白質形式AGOS_ABL018Cp)，其為釀酒酵母Faa1及Faa4基因之同線同源物。
因此，如本文所使用之術語「與脂肪酸攝取有關之基因改造」係關於基因改造，其影響參與如上文所定義之假囊酵母中之脂肪酸攝取的基因或基因產物之功能及/或量。較佳地，該術語意謂例如藉由參與如上文所定義之假囊酵母中之脂肪酸攝取的基因之過度表現，參與如上文所定義之假囊酵母中之脂肪酸攝取的基因或基因產物之功能可得到改良及/或基因表現或表現的基因產物之量或活性(表現的蛋白質)可得到提高。較佳地，可至少提高AGOS_ACL174Wp活性及視情況亦提高AGOS_ABL018Cp活性，例如，其量升高。在其他實施例中，AGOS_ACL174Wp活性及AGOS_ABL018Cp活性得到提高，例如其量升高。
在本發明之另一中心實施例中，假囊酵母生物體之基因改造與假囊酵母之β氧化路徑有關。
如本文所使用之「β氧化路徑」係指生物化學過程，藉由該過程使得脂肪酸分子分解產生乙醯基-CoA，其進入檸檬酸循環中。不同生物體類別之β氧化路徑不同。舉例而言，哺乳動物β氧化依賴於過氧 化體及粒線體活性，而數種真菌系統僅展示過氧化體β氧化。
假囊酵母生物體之β氧化路徑似乎與受過氧化體(亦參見Hiltunen等人，2003,FEMS Microbiology Reviews,27,35-64)限制之釀酒酵母之β氧化高度相似(亦參見Vorapreeda等人，2012,Microbiology,158,217-228)。典型地，過氧化體中之β氧化包含可被視為三羧酸(TCA)循環步驟之變化形式的核心反應，三羧酸循環步驟參與藉由一系列去氫酶、水合酶及去氫酶將丁二酸酯轉化成草醯乙酸。在酵母群組之真菌中之β氧化過程以藉由表示過氧化體中之醯基-CoA氧化酶之FAD酵素將醯基-CoA受質氧化為反2-烯醯基-CoA開始。釀酒酵母中之此等過氧化體氧化酶Pox1p/Fox1p直接將電子傳送至氧以產生H2O2。來自釀酒酵母之醯基-CoA氧化酶亦接受短鏈受質，從而完成β氧化。在酵母群組之真菌系統中，藉由均二聚多功能性酵素Mfe2p/Fox2p之活性催化後續水合酶2及(3R)-羥基-特異去氫酶反應。已展示該酵素亦水合短鏈受質。在β氧化循環之下一個反應中，藉由表示3-酮醯基-CoA硫解酶之Pot1p/Fox3p，酮醯基-CoA中間物經歷硫醇裂解。此最後步驟之產物為乙醯基-CoA及C2-縮短式醯基-CoA，後者充當Pox1p/Fox1p之受質。該過程可繼續直至脂肪酸中之所有碳轉變為乙醯基CoA。
關於假囊酵母生物體，已描述生物化學活性，其類似於釀酒酵母活性。過氧化體氧化酶活性由Pox1類似物AGOS_AER358C(蛋白質形式AGOS_AER358Cp)提供。類似於均二聚多功能性酵素Mfe2p/Fox2p之水合酶及去氫酶活性由AGOS_AGL060W(蛋白質形式AGOS_AGL060Wp)提供。類似於Pot1p/Fox3p之3-酮醯基-CoA硫解酶活性由AGOS_AFR302W(蛋白質形式AGOS_AFR302Wp)提供。參與假囊酵母生物體、尤其棉假囊酵母之β氧化的額外活性包括醯基-CoA-去氫酶AGOS_AFL213W(蛋白質形式AGOS_AFL213Wp)及乙醯基-CoA乙醯基轉移酶AGOS_ADR165C(蛋白質形式AGOS_ADR165Cp)。
過氧化體中之β氧化之有效效能可能需要額外活性。此等活性包括對應於釀酒酵母之Pex5活性的AGOS_AFR453W(蛋白質形式AGOS_AFR453Wp)，亦即，特定類型之過氧化體靶向信號(PTS)之受體。進一步包括AGOS_ACR128C(蛋白質形式AGOS_ACR128Cp)，其為釀酒酵母Pxa1之同源物，亦即，過氧化體脂肪酸運輸蛋白；及AGOS_AER091W(蛋白質形式AGOS_AER091Wp)，其為釀酒酵母Pxa2之同源物，亦即另一過氧化體脂肪酸運輸蛋白。
因此，如本文所使用之術語「與β氧化路徑有關之基因改造」係關於基因改造，其影響參與如上文所定義之假囊酵母中之β氧化路徑的基因或基因產物之功能及/或量。較佳地，該術語意謂例如藉由參與如上文所定義之假囊酵母中之β氧化路徑的基因之過度表現，參與如上文所定義之假囊酵母中之β氧化路徑的基因或基因產物之功能可得到改良及/或基因表現或表現的基因產物之量或活性(表現之蛋白質)可得到提高。較佳地，可提高AGOS_AER358Cp(Pox1)、AGOS_AGL060Wp(Fox2)及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性中之至少一者，例如其量升高。
在較佳實施例中，AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性由包含SEQ ID NO：1胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：1胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：2之核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：2之核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：1之胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提 供，或由包含與SEQ ID NO：2之核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在較佳實施例中，AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性由包含SEQ ID NO：3胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：3胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：4核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：4核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：3胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：4核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在較佳實施例中，AGOS_AER358Cp(Pox1)活性由包含SEQ ID NO：5胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：5胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：6核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：6核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：5胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：6核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性由包含SEQ ID NO：7胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：7胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：8核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：8核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：7胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：8核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性由包含SEQ ID NO：9胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：9胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：10核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：10核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：9胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：10核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
本文所揭示之所有序列均獲自棉假囊酵母菌株ATCC 10895。
SEQ ID No.1之胺基酸序列之功能性片段或功能性部分的長度為至少300個或350個胺基酸，較佳為至少400個或450個胺基酸，更佳為至少500個或550個胺基酸，且最佳為至少600個或620個胺基酸。
SEQ ID No.3之胺基酸序列之功能性片段或功能性部分的長度為至少300個或350個胺基酸，較佳為至少400個或450個胺基酸，更佳為至少500個或550個胺基酸，且最佳為至少580個或600個胺基酸。
SEQ ID No.5之胺基酸序列之功能性片段或功能性部分的長度為 至少400個或450個胺基酸，較佳為至少500個或550個胺基酸，更佳為至少600個或650個胺基酸，且最佳為至少700個或720個胺基酸。
SEQ ID No.7之胺基酸序列之功能性片段或功能性部分的長度為至少450個或500個胺基酸，較佳為至少550個或600個胺基酸，更佳為至少650個或700個胺基酸，且最佳為至少750個、800個或850個胺基酸。
SEQ ID No.9之胺基酸序列之功能性片段或功能性部分的長度為至少150個或200個胺基酸，較佳為至少250個或300個胺基酸，更佳為至少320個或340個胺基酸，且最佳為至少360個或380個胺基酸。
「功能性片段」或「功能性部分」與全長蛋白質具有基本上相同的活性，亦即，其活性為全長蛋白質活性之至少50%、55%、60%或65%，較佳至少70%、75%或80%，更佳至少85%、90%或95%且最佳100%。
在本發明之意義內，「序列一致性」表示關於核酸分子內之5'-3'序列相比於另一核酸分子的一致性程度。可使用基於各種算法之一系列程式，諸如BLASTN、ScanProsite、雷射基因軟體等來測定序列一致性。作為替代，國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)之BLAST程式包可與預設參數一起使用。另外，可採用使用「髒數據(dirtydata)」算法之程序Sequencher(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI,USA)進行序列比較。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.1之胺基酸序列之150個、200個或250個胺基酸，較佳300個、350個、400個、450個或500個胺基酸，更佳550個或600個胺基酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.2之核酸序列之500個、600個 或700個核苷酸，較佳800個、900個、1000個、1100個或1200個核苷酸，更佳1300個、1400個、1500個、1600個、1700個或1800個核苷酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.3之胺基酸序列之150個、200個或250個胺基酸，較佳300個、350個、400個、450個或500個胺基酸，更佳550個或600個胺基酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.4之核酸序列之500個、600個或700個核苷酸，較佳800個、900個、1000個、1100個或1200個核苷酸，更佳1300個、1400個、1500個、1600個、1700個、1800個或1900個核苷酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.5之胺基酸序列之250個、300個或350個胺基酸，較佳400個、450個、500個、550個或600個胺基酸，更佳650個或700個胺基酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.6之核酸序列之600個、700個或800個核苷酸，較佳900個、1000個、1100個、1200個或1300個核苷酸，更佳1400個、1500個、1600個、1700個、1800個、1900個、2000個或2100個核苷酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.7之胺基酸序列之350個、400個或450個胺基酸，較佳500個、550個、600個、650個或700個胺基酸，更佳750個、800個或850個胺基酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.8之核酸序列之800個、900個或1000個核苷酸，較佳1100個、1200個、1300個、1400個、1500個、1600個或1700個核苷酸，更佳1800個、1900個、2000個、2100個、 2200個、2300個、2400個或2500個核苷酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.9之胺基酸序列之150個、180個或200個胺基酸，較佳220個、240個、260個、280個或300個胺基酸，更佳320個、340個、360個或380個胺基酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
序列一致性係指在根據SEQ ID No.10之核酸序列之400個、500個或550個核苷酸，較佳600個、650個、700個或750個核苷酸，更佳800個、850個、900個、950個、1000個、1050個、1100個或1150個核苷酸，且最佳全長的長度內之序列一致性程度。
具有與根據SEQ ID No.1、3、5、7及9中之任一者之序列具有至少70%之序列一致性的胺基酸序列之多肽具有與根據SEQ ID No.1、3、5、7及9中之任一者之蛋白質基本上相同的活性，亦即，其活性為根據SEQ ID No.1、3、5、7及9中之任一者之蛋白質活性的至少50%、55%、60%或65%，較佳至少70%、75%或80%，更佳至少85%、90%或95%且最佳100%。
與根據SEQ ID No.2、4、6、8及10中之任一者之核酸序列具有至少70%之序列一致性的核酸序列編碼與根據SEQ ID No.2、4、6、8及10中之任一者之核酸序列所編碼之蛋白質具有基本上相同的活性之蛋白質，亦即，其活性為根據SEQ ID No.2、4、6、8及10中之任一者之核酸序列所編碼之蛋白質活性的至少50%、55%、60%或65%，較佳至少70%、75%或80%，更佳至少85%、90%或95%且最佳100%。
另外或或者，在本發明之情形下，假囊酵母中之β氧化路徑之其他活性中之至少一者可經修飾(例如提高)，該等活性諸如AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)或AGOS_AER091Wp(Pxa2)。
在較佳實施例中，AGOS_AFL213Wp活性由包含SEQ ID NO：11胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：11胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：12核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：12核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：11胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：12核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_ADR165Cp活性由包含SEQ ID NO：13胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：13胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：14核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：14核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：13胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提 供，或由包含與SEQ ID NO：14核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AFR453Wp(Pex5)活性由包含SEQ ID NO：15胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：15胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：16核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：16核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：15胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：16核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_ACR128Cp(Pxa1)活性由包含SEQ ID NO：17胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：17胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：18核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由 SEQ ID NO：18核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：17胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：18核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AER091Wp(Pxa2)活性由包含SEQ ID NO：19胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：19胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：20核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：20核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：19胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、.92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：20核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
因此，如本文所使用之術語「與β氧化路徑有關之基因改造」係關於基因改造，其影響參與如上文所定義之假囊酵母中之β氧化路徑的基因或基因產物之功能及/或量。較佳地，該術語意謂例如藉由參與如上文所定義之假囊酵母中之β氧化路徑的基因之過度表現，參與如上文所定義之假囊酵母中之β氧化路徑的基因或基因產物之功能可得到改良及/或基因表現或表現的基因產物之量或活性(表現之蛋白質)可得到提高。較佳地，可至少提高AGOS_AER358Cp(Pox1)活性或AGOS_AGL060Wp(Fox2)或AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性，或其量升高。在其他較佳實施例中，可提高AGOS_AGL060Wp(Fox2)及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性或其量升高。在又一較佳實施例中，可提高AGOS_AER358Cp(Pox1)活性及AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性或其量升高。
在其他實施例中，如上文所描述之β氧化路徑之基因改造可關於影響參與β氧化路徑之其他基因或基因產物之功能及/或量的基因改造。此類額外基因或基因產物可為AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)及/或AGOS_AER091Wp(Pxa2)。尤其較佳為可提高AGOS_AER358Cp(Pox1)活性及/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及/或AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性或其量升高的基因改造，且其中另外提高AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)或AGOS_AER091Wp(Pxa2)活性中之一或多者或其量升高。
在其他較佳實施例中，一基因改造可與脂肪酸攝取有關且另一基因改造可與如上文所描述之β氧化路徑有關。經相應修飾之生物體 可因此包含可與脂肪酸攝取有關之基因改造且同時包含與β氧化路徑有關之基因改造。較佳地，例如藉由參與如上文所定義之假囊酵母中之β氧化路徑的基因及參與如上文所定義之假囊酵母中之脂肪酸攝取的基因之過度表現，參與如上文所定義之假囊酵母中之β氧化路徑的基因或基因產物之功能及參與脂肪酸攝取的基因之功能可得到改良及/或基因表現或表現的基因產物之量或活性(表現蛋白)可得到提高。舉例而言，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及(i)AGOS_AER358Cp(Pox1)活性或(ii)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性或(iii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。
或者，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及(i)AGOS_AER358Cp(Pox1)活性及(ii)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性。在另一替代方案中，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及(i)AGOS_AER358Cp(Pox1)活性及(iii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。在又一替代方案中，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及(ii)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及(iii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。在其他實施例中，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及(ii)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及(iii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。
在又一類型之實施例中，可提高AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及(i)AGOS_AER358Cp(Pox1)活性或(ii)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性或(iii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。
或者，可提高AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及(i)AGOS_AER358Cp(Pox1)活性及(ii)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性。在另一替代方案中，可提高AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及(i)AGOS_AER358Cp(Pox1)活性及(ii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。在又一替代方案中，可提高AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及 (i)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及(ii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。在其他實施例中，可提高AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及(i)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及(ii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。
在又一類型之實施例中，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及(i)AGOS_AER358Cp(Pox1)活性或(ii)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性或(iii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。
或者，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及(i)AGOS_AER358Cp(Pox1)活性及(ii)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性。在另一替代方案中，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及(i)AGOS_AER358Cp(Pox1)活性及(ii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。在又一替代方案中，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及(i)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及(ii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。在其他實施例中，可提高AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性及(i)AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性及(ii)AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及(iii)AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性。
AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性提高可歸因於AGOS_ACL174W(fat1)基因之過度表現。AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性提高可歸因於AGOS_ABL018C(faa1/faa4)基因之過度表現。AGOS_AER358Cp(Pox1)活性提高可歸因於AGOS_AER358C(pox1)基因之過度表現。AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性提高可歸因於AGOS_AGL060W(fox2)基因之過度表現。AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性提高可歸因於AGOS_AFR302W(pot1/fox3)基因之過度表現。進一步特定地設想 AGOS_AGL060W(fox2)基因與AGOS_AFR302W(pot1/fox3)基因共同過度表現以便提高AGOS_AGL060Wp(Fox2)及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)之活性。在較佳實施例中，Fat1、Faa1/Faa4、Pox1、Fox2或Pot1/Fox3活性由如上文所定義之特異多肽提供及/或由如上文所定義之特異核酸編碼。在其他較佳實施例中，fat 1基因、faa1/faa4基因、pox1基因、fox 2基因或fox 3基因分別對應於SEQ ID NO：2、4、6、8或10之序列或如上文所定義之其同源序列，包含前述序列、基本上由或由前述序列組成。
進一步設想以上基因中之任一者之多個過度表現事件。舉例而言，可過度表現AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AGL060W(fox2)，或可過度表現AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)，或可過度表現AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)，或可過度表現AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之任一者，或可過度表現AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)中之任一者，或可過度表現AGOS_AER091W(pxa2)或AGOS_AFR302W(pot1/fox3)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)中之任一者。
在其他實例中，可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AGL060W(fox2)，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AER358C(pox1)及 AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之任一者，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)中之任一者，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AER091W(pxa2)，或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)中之任一者。
在其他實例中，可過度表現AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AGL060W(fox2)，或可過度表現AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)，或可過度表現AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)，或可過度表現AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之任一者，或可過度表現AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)中之任一者，或可過度表現AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AER091W(pxa2)，或AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)中之任一者。
在其他實例中，可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AGL060W(fox2)，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及 AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之任一者，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)中之任一者，或可過度表現AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AER091W(pxa2)，或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)中之任一者。
在較佳實施例中，Fat1、Faa1/Faa4、Pox1、Fox2或Pot1/Fox3或AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)或AGOS_AER091Wp(Pxa2)活性由如上文所定義之特異多肽提供及/或由如上文所定義之特異核酸編碼。
進一步設想AGOS_AFL213W及AGOS_ADR165C之過度表現；或AGOS_AFL213W及AGOS_AFR453W(pex5)之過度表現；或AGOS_AFL213W及AGOS_ACR128C(pxa1)之過度表現；或AGOS_AFL213W及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現；或AGOS_ADR165C及AGOS_AFR453W(pex5)之過度表現；或AGOS_ADR165C及AGOS_ACR128C(pxa1)之過度表現；或AGOS_ADR165C及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現；或 AGOS_AFR453W(pex5)及AGOS_ACR128C(pxa1)之過度表現；或AGOS_AFR453W(pex5)及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現；或AGOS_ACR128C(pxa1)及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現。進一步設想AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AFL213W及AGOS_ADR165C之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AFL213W及AGOS_AFR453W(pex5)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AFL213W及AGOS_ACR128C(pxa1)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AFL213W及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ADR165C及AGOS_AFR453W(pex5)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ADR165C及AGOS_ACR128C(pxa1)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ADR165C及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AFR453W(pex5)及AGOS_ACR128C(pxa1)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AFR453W(pex5)及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ACR128C(pxa1)及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現。亦設想AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFL213W及AGOS_ADR165C之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFL213W及AGOS_AFR453W(pex5)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFL213W及AGOS_ACR128C(pxa1)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFL213W及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_ADR165C及AGOS_AFR453W(pex5)之過度表現；或 AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_ADR165C及AGOS_ACR128C(pxa1)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_ADR165C及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFR453W(pex5)及AGOS_ACR128C(pxa1)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFR453W(pex5)及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_ACR128C(pxa1)及AGOS_AER091W(pxa2)之過度表現。在較佳實施例中，AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)活性由如上文所定義之特異多肽提供及/或由如上文所定義之特異核酸編碼。
進一步設想特定過度表現情形，諸如AGOS_AER358C(pox1)、AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)之過度表現；或AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)活性中之兩者之過度表現；或AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之兩者之過度表現；或AGOS_AFR302W(pot1/fox3)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)活性中之兩者之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W (pxa2)中之兩者之過度表現；或AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之兩者之過度表現；或AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之兩者之過度表現。進一步設想過度表現情形，其中過度表現AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之一者；或其中過度表現AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之一者；或其中過度表現AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之一者；或其中過度表現AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_ACL174W(fat1)及/或AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之一者；或其中過度表現AGOS_AER358C(pox1)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)及AGOS_ACL174W(fat1)及/或AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之一者；或其中過度表現AGOS_AGL060W(fox2)及AGOS_AFR302W(pot1/fox3)及AGOS_ACL174W(fat1)及/或AGOS_ABL018C(faa1/faa4)及 AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之一者。進一步設想4種、5種、6種、7種或8種過度表現情形，其中過度表現參與如上文所定義之假囊酵母中之β氧化的4個、5個、6個、7個或8個基因及/或參與脂肪酸攝取之該等基因中之1者或2者。在較佳實施例中，Fat1、Faa1/Faa4、Pox1、Fox2或Pot1/Fox3或AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)或AGOS_AER091Wp(Pxa2)活性由如上文所定義之特異多肽提供及/或由如上文所定義之特異核酸編碼。
如本文所使用之術語「活性提高」或「量之增加」係指編碼酵素活性之遺傳元件之任何修飾，例如在分子基礎上遺傳元件所表現之轉錄物或該遺傳元件所編碼之蛋白質或酵素活性，其導致該酵素活性提高、該酵素活性在細胞中之濃度升高及/或該活性之功能改良。活性可使用熟習此項技術者將已知或可源於適合的文獻來源之適合的測試或分析法量測，該等文獻來源諸如Small等人，Biochem.J,1985,227,205-210，其揭示過氧化體醯基-CoA氧化酶活性之分析法；Watkins等人，The Journal of Biological Chemistry,1998,273(29),18210-18219，其揭示量測醯基-CoA合成酶活性之方法；Hiltunen等人，The Journal of Biological Chemistry,1992,267(10),6646-6653，其揭示Fox2活性之分析法；或Lee等人，BMB reports,2009,42(5),281-285，其揭示Pot1活性之分析法。
在相同生物體之情形下，相比於對應野生型或初始活性(無修飾)，編碼酵素活性之遺傳元件之修飾可例如使活性提高約2%、5%、8%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或1000%以上或此等值之間的任 何值。在較佳實施例中，可針對AGOS_ACL174Wp(Fat1)、AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)、AGOS_AER358Cp(Pox1)、AGOS_AGL060Wp(Fox2)、AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)、AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)及AGOS_AER091Wp(Pxa2)中之至少一者或一者以上，例如2者、3者、4者、5者、6者或6者以上或所有提供此類活性提高。在較佳實施例中，活性提高者由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17及/或19之胺基酸序列或如上文所定義之其同源序列中之一者，例如2者、3者、4者、5者、6者或6者以上或所有表示，包含前述序列、基本上由或由前述序列組成。
在特定實施例中，活性提高歸因於表現且尤其歸因於其表現產生如上文所提及之活性的遺傳元件之過度表現。如本文所使用之術語「表現」係指源於核酸分子之有義鏈(mRNA)或如本文所提及之基因的轉錄及積聚。更佳地，該術語亦指mRNA轉譯至多肽或蛋白質中及在細胞內相應提供此類多肽或蛋白質。在典型的實施例中，表現可為過度表現。術語「過度表現」係關於在相同生物體之情形下，與產生該多肽或蛋白質之遺傳元件之內源性複本表現後相比，較多轉錄物積聚且尤其較多多肽或蛋白質積聚。在其他替代性實施例中，該術語亦可指與諸如β肌動蛋白或β微管蛋白之典型適當表現管家基因表現後相比，較多轉錄物積聚且尤其較多多肽或蛋白質積聚。
在尤其較佳實施例中，AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性提高歸因於AGOS_ACL174W基因(fat1)之過度表現；及/或AGOS_AER358Cp(Pox1)活性提高歸因於AGOS_AER358C基因(pox1)之過度表現；及/或AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)活性提高歸因於AGOS_ABL018C基因(faa1/faa4)之過度表現；及/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性提高歸因於AGOS_AGL060W基因 (fox2)及AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之過度表現。
在較佳實施例中，在相同生物體之情形下，相比於對應野生型或初始轉錄(無修飾或過度表現)，如上文所提及之過度表現可使基因轉錄率提高約2%、5%、8%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或1000%以上或此等值之間的任何值。在較佳實施例中，可針對AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AER358C(pox1)、AGOS_AGL060W(fox2)、AGOS_AFR302W(pot1/fox3)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)及AGOS_AER091W(pxa2)中之至少一者或一者以上，例如2者、3者、4者、5者、6者或6者以上或所有提供此類基因轉錄率提高。在較佳實施例中，轉錄率提高者係指SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18及/或20之核苷酸序列或如上文所定義之其同源序列的轉錄物中之一者，例如2者、3者、4者、5者、6者或6者以上或所有。
在其他較佳實施例中，在相同生物體之情形下，相比於對應野生型或初始轉錄(無修飾或過度表現)，過度表現可使基因之mRNA量提高約2%、5%、8%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或1000%以上或此等值之間的任何值。在較佳實施例中，可針對AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AER358C(pox1)、AGOS_AGL060W(fox2)、AGOS_AFR302W(pot1/fox3)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)及AGOS_AER091W(pxa2)中之至少一者或一 者以上，例如2者、3者、4者、5者、6者或6者以上或所有提供此類基因之mRNA量提高。在較佳實施例中，mRNA量提高者係指包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18及/或20之核苷酸序列或如上文所定義之其同源序列中之一者，例如2者、3者、4者、5者、6者或6者以上或所有、基本上由或由該等序列組成的mRNA。
在又一較佳實施例中，在相同生物體之情形下，相比於對應野生型或多肽或蛋白質之初始量(無修飾或過度表現)，過度表現可使過度表現基因所編碼之多肽或蛋白質之量提高約2%、5%、8%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或1000%以上或此等值之間的任何值。在較佳實施例中，可針對AGOS_ACL174Wp(Fat1)、AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)、AGOS_AER358Cp(Pox1)、AGOS_AGL060Wp(Fox2)、AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)、AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)及AGOS_AER091Wp(Pxa2)中之至少一者或一者以上，例如2者、3者、4者、5者、6者或6者以上或所有提供過度表現基因所編碼之多肽或蛋白質之量提高。在較佳實施例中，多肽量提高者由SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17及/或19之胺基酸序列或如上文所定義之其同源序列中之一者，例如2者、3者、4者、5者、6者或6者以上或所有表示，包含前述序列、基本上由或由前述序列組成。
在一個實施例中，如上文所定義之過度表現可藉由使用如上文所定義之啟動子來傳達。本發明所設想之啟動子可用於如本文所描述之基因之過度表現，其可為組成型啟動子或可調節啟動子。啟動子較佳為內源性的，亦即，假囊酵母啟動子。在特定實施例中，啟動子亦可為異源啟動子或合成啟動子，例如異源強啟動子或可調節異源啟動 子。啟動子可與編碼序列可操作地連接。在一較佳實施例中，術語「啟動子」係指能夠控制編碼序列之表現的DNA序列，其在假囊酵母中，更佳在棉假囊酵母中具有活性。
可用於本發明之情形下的適合的啟動子包括組成型TEF1啟動子、組成型CTS2啟動子、組成型RIB3啟動子及組成型GPD啟動子。適合的啟動子之進一步設想的實例包括糖酵解路徑之組成型強啟動子，諸如FBA1啟動子、PGK1啟動子或ENO1啟動子；或組成型RIB4強啟動子。亦較佳使用可調節Met3啟動子及葡萄糖阻遏ICL1p啟動子。尤其較佳為GPD啟動子。更佳地，GPD啟動子包含根據SEQ ID NO.68或其功能性片段之序列，其與根據SEQ ID NO.68之啟動子具有基本上相同的啟動子活性。
如上文所提及之所有較佳啟動子均為內源性棉假囊酵母啟動子。在特定實施例中，此等啟動子亦可用於假囊酵母屬之其他生物體之情形下。其他細節將為熟習此項技術者所知或可源於適合的文獻來源，諸如Jimenez等人，2005,Appl Environ Microbol,71,5743-5751。
啟動子可與如上文所定義之欲表現基因或序列可操作地連接。
在尤其較佳實施例中，藉由強啟動子傳達AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之過度表現。在本發明之意義內，術語「強啟動子」意欲指啟動子，其活性高於與欲在野生型生物體中過度表現之核酸分子可操作地連接的啟動子(例如與內源性fat1、faa1/faa4、pox1、fox 2或pot1/fox3基因之啟動子相比具有更高活性之啟動子)之活性。較佳地，強啟動子之活性比與欲在野生型生物體中過度表現之核酸分子可操作地連接的啟動子(例如與內源性fat1、faa1/faa4、pox1、fox 2或pot1/fox3基因之啟動子相比具有更高活性之啟動子)之活性高約2%、5%、8%、10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或1000%以上。熟習此項技術者知道如何測定啟動子活性及比較不同啟動子之活性。出於此目的，啟動子典型地與編碼諸如螢光素酶、綠色螢光蛋白或β葡糖醛酸酶之報導蛋白之核酸序列可操作地連接且測定報導蛋白之活性。
此類強啟動子之適合的實例為TEF1啟動子、CTS2啟動子、RIB3啟動子、GPD啟動子、FBA1啟動子、PGK1啟動子、Met3啟動子、ICL1啟動子及RIB4啟動子。尤其較佳為GPD啟動子。更佳地，GPD啟動子包含根據SEQ ID NO.68或其功能性片段之序列，其與根據SEQ ID NO.68之啟動子具有基本上相同的啟動子活性。
在另一尤其較佳實施例中，藉由組成型強啟動子傳達AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018C基因(faa1/faa4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之過度表現。此類組成型強啟動子之適合的實例為CTS2啟動子、TEF1啟動子、RIB3啟動子、GPD啟動子及RIB4啟動子。尤其較佳為GPD啟動子。更佳地，GPD啟動子包含根據SEQ ID NO.68或其功能性片段之序列，其與根據SEQ ID NO.68之啟動子具有基本上相同的啟動子活性。
在特定實施例中，啟動子亦可為異源啟動子或合成啟動子，例如異源強啟動子或可調節異源啟動子。
在另一實施例中，可藉由提供在基因組中過度表現之遺傳元件之一個以上複本來傳達如上文所定義之過度表現。此類第二、第三、第四、第五或其他基因複本可為內源性基因結構之完全或幾乎一致的複本，或其可構成其重組修飾。舉例而言，例如AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AER358C(pox1)、 AGOS_AGL060W(fox2)、AGOS_AFR302W(pot1/fox3)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)中之一者之欲過度表現之基因可連同其基因組上下文一起衍生，較佳包括其啟動子結構，視情況進一步包含如上文所定義之3'非編碼序列或如上文所定義之額外5'非編碼序列，例如來自目標假囊酵母生物體之基因組之強化子元件等，或若目標不為棉假囊酵母，則形成例如來自棉假囊酵母之近緣種。可使用在約100bp至500bp範圍內之同源側接序列。然而，原則上亦可使用較小側接序列或較大側接序列，例如至多1000bp或1000bp以上。
如上文所提及之基因之第二或其他複本可隨後再引入生物體中且置於染色體中。整合位點可在初始複本附近或較佳在不同位置處。可藉由選擇整合所必需之同源側接序列來預先選擇插入。插入位點可相應地根據基因組之已知特徵確定，該等特徵例如染色體區域之轉錄活性、染色體區域之甲基化狀態、距第一複本(初始基因)之潛在距離、第一複本(初始基因)之定向、其他插入基因之存在等。較佳地，插入位點處於基因間區域中及/或使用轉錄活性位點。在某些實施例中，較佳不在特定或必需基因中修飾已知基因之ORF及/或調節區域。
在某些實施例中，可以串聯重複形式提供額外複本。較佳使用非串聯重複序列。歸因於假囊酵母之基因組中之重組過程，更佳使基因之初始複本及第二或其他複本保持儘可能地不同及/或無關。此類差異可基於不同啟動子之使用；基因之基因組側接序列之修飾；或在特定實施例中，基於基因之第二複本對比第一複本(初始版本)或基因之第三複本對比第二複本及/或對比第一複本(初始版本)的核苷酸序列之修飾。此類核苷酸序列修飾可例如藉由如例如上文所定義之基因之 密碼子使用之修飾來傳達。特定言之，密碼子使用可經修飾，目的在於在核苷酸序列層面上增加或最大化差異，亦即，以便提供在核苷酸層面上更不類似或最不類似的序列，同時保持胺基酸序列一致或幾乎一致。倘若相同基因之兩個以上複本將被引入基因組中，則欲引入之所有複本之密碼子使用均可經調適以使得所有複本之差異最大化，例如初始版本對比第2複本對比第3複本之間的差異最大化。在3個以上複本之情況下可進行相同操作。
在尤其較佳實施例中，藉由提供假囊酵母之基因組中之AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018C基因(faa1/faa4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之至少一第二複本來傳達AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018C基因(faa1/faa4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之過度表現。
在另一實施例中，可藉由密碼子使用之最佳化，例如藉由將如上文所定義之基因之密碼子使用調適成生物體中最常轉錄或表現之基因或最高度表現基因(相比於管家基因，諸如β肌動蛋白或β微管蛋白)之密碼子使用來傳達如上文所定義之過度表現。此類高度表現基因之密碼子使用之實例可包含5種、10種、15種、20種、25種或30種或30種以上假囊酵母生物體(較佳棉假囊酵母)之最高度表現基因之群組的密碼子使用。
可藉由相對於在所有或幾乎所有或90%或80%或75%或70%之假囊酵母生物體(較佳棉假囊酵母)之轉錄基因中之總密碼子使用使密碼子使用最佳化來進一步實現過度表現。此類方法可涉及檢查基因之密碼子使用，及與如可源於假囊酵母生物體(較佳為棉假囊酵母)之基因組序列，尤其例如棉假囊酵母之生物體之註解基因組序列的總密碼子 使用進行比較。
可藉由調適雙密碼子使用，亦即，藉由調適ORF內所有兩個相連密碼子之頻率來進一步實現過度表現。可相應地將標靶基因之雙密碼子使用調適成生物體中高度表現基因之雙密碼子使用(相比於管家基因，諸如β肌動蛋白或β微管蛋白)。此類高度表現基因之雙密碼子使用之實例可包含5種、10種、15種、20種、25種或30種或30種以上假囊酵母生物體(較佳棉假囊酵母)之最高度表現基因之群組的雙密碼子使用。雙密碼子使用之調適可幫助避免影響轉錄物穩定性之mRNA降解信號或其他轉錄部分，因為此類目標典型地超過3個核苷酸長且可因此在雙密碼子中鑑別出，同時其可在密碼子中被忽略。
可藉由調適三密碼子使用，亦即，藉由調適ORF內所有兩個相連密碼子之頻率來進一步實現過度表現。可相應地將標靶基因之三密碼子使用調適成生物體中高度表現基因之三密碼子使用(相比於管家基因，諸如β肌動蛋白或β微管蛋白)。此類高度表現基因之三密碼子使用之實例可包含5種、10種、15種、20種、25種或30種或30種以上假囊酵母生物體(較佳棉假囊酵母)之最高度表現基因之群組的三密碼子使用。
亦設想提供標靶基因之兩種經密碼子修飾型式，亦即初始內源性複本及任何其他複本均可經修飾以使得在修飾方法之後基因組中不存在基因之初始型式。此方法可產生核苷酸序列之另一區別及/或提高標靶基因之表現性或轉錄。
在尤其較佳實施例中，藉由調適假囊酵母之基因組中之AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018C基因(faa1/faa4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之第二複本的密碼子使用或雙密碼子使用或三密碼子使用來傳達AGOS_ACL174W基因(fat1)、 AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018C基因(faa1/faa4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之過度表現。
可藉由熟習此項技術者已知之任何適合的方法進行基因改造以便提高β氧化路徑或脂肪酸攝取路徑之成員之活性，該基因改造例如導致如上文或下文所提及之基因之過度表現的修飾。
可用於此情形中之典型的方法為目標同源重組。舉例而言，AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AER358C(pox1)、AGOS_AGL060W(fox2)、AGOS_AFR302W(pot1/fox3)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)之經修飾型式，例如包含組成型啟動子而非初始啟動子之型式或包含初始啟動子或不同啟動子(例如，如上文所提及之組成型啟動子)之AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AER358C(pox1)、AGOS_AGL060W(fox2)、AGOS_AFR302W(pot1/fox3)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)之另一複本可側接在應插入之位置處與標靶內源性聚核苷酸序列(例如基因之編碼區或調節區)同源之DNA。可在存在或不存在可選擇性標記物及/或存在或不存在陰性可選擇性標記物之情況下使用此類構築體以轉化假囊酵母細胞。藉由目標同源重組插入DNA構築體之結果可導致在初始基因之基因座處插入標靶基因之經修飾型式或在基因組中之不同位置處插入標靶基因之另一複本。在後一情境中，第二或另一複本應整合之位置之同源序列可用於轉化構築體。在特定實施例中，同源轉化亦可用於使基因不活化，例如藉由引入抗性標記物或其他基因剔除卡匣以置換基因組中最初存在之ORF。
術語「轉化」係指將典型地為核酸分子之遺傳元件(例如包含同源重組構築體之特異性卡匣)或諸如載體或質體之染色體外元件轉移至假囊酵母細胞中，亦即轉移至如上文所定義之假囊酵母屬之生物體中，其中該轉移產生基因穩定遺傳。假囊酵母細胞之轉化條件及對應技術為熟習此項技術者所知。此等技術包括化學轉化，較佳為乙酸鋰轉化，如例如可源於Jimenez等人，2005,Applied and Environmental Microbiology 71,5743-5751；原生質體融合；彈道衝擊轉化；電穿孔；顯微注射或將相關基因或核酸分子引入真菌細胞中之任何其他方法。
經轉化之細胞可具有所引入遺傳元件之至少一個複本且可具有兩個或兩個以上複本，視在何處及如何將遺傳元件整合於基因組中或例如呈擴增形式而定。在過度表現構築體之情形中，轉化較佳使過度表現構築體或卡匣之單個複本插入基因組中。亦設想引入兩個或兩個以上複本。特定基因或基因表現構築體之該等第二或第三複本就其來自第一複本之核苷酸序列而言應較佳為不同的，同時編碼相同的胺基酸序列或基本上相同的胺基酸序列。
較佳地，藉由選擇所引入遺傳元件上所含有之標記物，可鑑別經轉化細胞。或者，各別標記物構築體可用所需遺傳元件共轉化，因為多種轉化技術將多種DNA分子引入宿主細胞中。典型地，可針對經轉化細胞在選擇性培養基上生長之能力選擇經轉化細胞。選擇性培養基可併有抗生素或缺乏未轉化細胞生長所必需之因子，諸如養分或生長因子。當在經轉化宿主中表現時，所引入之標記基因可賦予抗生素抗性或編碼必需的生長因子或酵素，從而允許在選擇性培養基上生長。亦可在可直接或間接偵測到經表現之標記蛋白時進行經轉化細胞之選擇。
標記蛋白可單獨或作為與另一蛋白質之融合物表現。標記蛋白 可例如藉由其酵素活性偵測。或者，可使用抗體來偵測標記蛋白或例如相關蛋白質上之分子標籤。可例如目測或藉由諸如FACS之技術或使用抗體之淘選來選擇表現標記蛋白或標籤之細胞。較佳地，如熟習此項技術者所知，可使用在假囊酵母屬之細胞中起作用之任何適合的標記物。更佳地，可採用提供康黴素(kanamycin)、潮黴素(hygromycin)、胺基糖苷G418或諾爾絲菌素(nourseothricin)(亦稱為NTC或ClonNAT)抗性以及在缺乏尿嘧啶、白胺酸、組胺酸、甲硫胺酸、離胺酸或色胺酸之培養基上生長之能力的標記物。當使用如上文所提及之選擇標記物，例如G418或ClonNat抗性標記物或任何其他適合的標記物時，除標記物以外亦可使用Cre-lox系統之序列。在插入例如過度表現卡匣之遺傳元件之後，此系統允許Cre重組酶表現後消除及隨後再次使用選擇標記物。亦設想使用熟習此項技術者將已知之其他類似重組酶系統。
在特定實施例中，標記物亦可與位點特異性核酸酶之標靶位點組合，該等核酸酶例如能夠活體內裂解特異性DNA標靶序列之鋅指核酸酶(ZFN)或大核酸酶。此類系統之特定實例為TALEN(轉錄活化樣效應子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease))系統，亦即人工限制酶，其係藉由將TAL效應子DNA結合結構域與DNA裂解結構域融合而產生。TAL效應子為典型地由黃單胞菌細菌或相關屬分泌或由其衍生及已經修飾的蛋白質。TAL效應子之DNA結合結構域可包含高度保守序列，例如，除高度可變之第12個及第13個胺基酸(重複可變雙殘基(Repeat Variable Diresidue)或RVD)外具有約33至34個胺基酸之序列，且典型地展示與特異性核苷酸識別之強相關性。基於此原理，藉由選擇含有對應於過度表現標靶基因DNA序列之重複可變雙殘基的重複區段之組合，可工程改造DNA結合結構域。TALEN DNA裂解結構域可源自適合的核酸酶。舉例而言，來自FokI核酸內切酶或 FokI核酸內切酶變異體之DNA裂解結構域可用於構築雜交核酸酶。歸因於充當二聚體之FokI結構域之特性，TALEN可較佳以各別實體形式提供。
在特定實施例中，可根據欲插入假囊酵母基因組中之構築體之序列修飾或最佳化TALEN DNA結合結構域與FokI裂解結構域之間的胺基酸殘基數目及兩個個別TALEN結合位點之間的鹼基數目以便提供高水準之活性。TALEN或TALEN組件可經工程改造或修飾以便靶向任何所需DNA序列，例如包含欲過度表現基因之同源末端之間的選擇標記物之DNA序列。重組所需的酵素活性可照此提供(例如類似於假囊酵母中已建立之REMI方法)，或其可與構築體上之選擇卡匣一起提供，使得在核酸酶活性開始後將其移除。工程改造可根據適合的方法進行，例如Zhang等人，Nature Biotechnology,1-6(2011)，或Reyon等人，Nature Biotechnology,30,460-465(2012)。
用於自假囊酵母細胞之基因組移除標記物序列之另一系統為CRISPR(成簇規律間隔的短回文重複序列)/Cas(CRISPR相關)系統，其已展示出有助於RNA導引之位點特異性DNA裂解且其可用於基因組工程改造(參見例如Sander及Young(2014)Nature Biotechnol.32：347-355)。此系統使用Cas9作為核酸酶，其係藉由crRNA及tracrRNA導引以裂解特異DNA序列。成熟crRNA：tracrRNA複合物藉由crRNA上之間隔基與緊鄰前間隔基鄰近基序(PAM)之標靶DNA上之前間隔基之間的鹼基配對來將Cas9引導至標靶DNA。Cas9隨後介導標靶DNA裂解以在前間隔基內形成雙鏈斷鏈。導引RNA而非crRNA及tracrRNA可經設計以包括模擬tracrRNA-crRNA複合物之髮夾(Jinek等人(2012)Science 337(6096)：816-821)。
在本發明之一較佳實施例中，可如下文之實例中所描述進行同源重組。尤其較佳使用包含與loxP序列組合之G418或ClonNAT抗性標 記物的過度表現卡匣。
典型地，藉助於轉化卡匣或表現卡匣可將遺傳元件引入假囊酵母細胞中。根據本發明，術語「轉化卡匣」係指含有異體基因且除異體基因外亦具有促進假囊酵母細胞轉化之元件的特異性載體。術語「表現卡匣」係指含有異體基因且除異體基因外亦具有使彼基因在異體宿主中、尤其在假囊酵母細胞中之表現增強之元件的特異性載體。
如本文所定義之脂肪酸攝取路徑或β氧化路徑之基因可相應地提供於呈如上文所定義之表現卡匣或轉化卡匣形式的遺傳元件上，尤其經製備以用於藉由同源重組之基因組整合的表現卡匣或轉化卡匣。亦設想提供於質體或載體上。術語「質體」及「載體」係指通常攜帶非細胞中心代謝部分之基因的額外染色體元件且其通常呈環狀雙鏈DNA片段形式。更佳地，術語質體係指熟習此項技術者已知適合於假囊酵母轉化之任何質體且尤其指適合於在假囊酵母中表現蛋白質之任何質體，例如能夠在其他生物體中，較佳在細菌中，尤其大腸桿菌中自主複製之質體，且其可經製備(例如消化)以用於假囊酵母之基因組插入型轉化。
此類表現卡匣或轉化卡匣或載體或質體可包含1種、2種、3種、4種或4種以上或所有參與如上文所定義之脂肪酸攝取路徑及/或β氧化路徑之基因或遺傳元件。舉例而言，其可包含AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AER358C(pox1)、AGOS_AGL060W(fox2)、AGOS_AFR302W(pot1/fox3)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)及AGOS_AER091W(pxa2)中之1者、2者、3者、4者或4者以上或所有。
可在基因組內隨機將此等卡匣整合於基因組中，或可經由使用構築體(含有與宿主基因組具有足以靶向如上文所定義之宿主基因座 內之重組之同源性的區域)靶向整合。在構築體靶向內源性基因座之情況下，所有或一些轉錄及轉譯調節區域可由內源性基因座提供。或者，轉錄及轉譯調節區域可由構築體提供。
在兩種或兩種以上參與來自各別複製載體之脂肪酸攝取路徑及/或β氧化路徑之活性表現的情況下，各載體或質體需要具有不同的選擇手段且應與其他構築體不具有同源性以維持穩定表現且防止構築體中之元件重配。
在特定實施例中，遺傳元件可包含微生物表現系統。此類表現系統及表現載體可含有引導異體蛋白高水準表現之調節序列。
在本發明之一較佳實施例中，如上文所定義之基因改造生物體，例如包含與脂肪酸攝取有關之遺傳元件及/或與β氧化路徑有關之遺傳元件之修飾的生物體，例如過度表現基因AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AER358C(pox1)、AGOS_AGL060W(fox2)、AGOS_AFR302W(pot1/fox3)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)及AGOS_AER091W(pxa2)中之一或多者的生物體；及/或以提高量提供AGOS_ACL174Wp(Fat1)、AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)、AGOS_AER358Cp(Pox1)、AGOS_AGL060Wp(Fox2)、AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)、AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)及/或AGOS_AER091Wp(Pxa2)之多肽中之一或多者的生物體；及/或AGOS_ACL174Wp(Fat1)、AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)、AGOS_AER358Cp(Pox1)、AGOS_AGL060Wp(Fox2)、AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)、AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)及/或AGOS_AER091Wp(Pxa2)活性中之一或多者提高的生物 體，與無基因改造之對等生物體相比能夠積聚更多的核黃素。如本文所使用之術語「對等生物體」係指與用作基因改造之起始生物體之生物體具有相同或極其類似的基因背景之生物體。較佳地，對等生物體可為用於如本文所描述之基因改造之生物體。若基因改造在野生型生物體中進行，則該野生型生物體可視為對等生物體。在其他實施例中，任何野生型生物體均可視為對等生物體，只要基因改造在任何其他或相同野生型生物體中進行。若基因改造在如上文所定義之核黃素過度生產生物體或菌株中進行，則無基因改造之該核黃素過度生產生物體可視為對等生物體。
如本文所描述之基因改造可使得生物體所生產或積聚之核黃素之量增加。在特定實施例中，該增量可視其中進行修飾之生物體之基因背景及/或修飾數目及/或過度表現技術之類型及/或存在的複本數目及/或諸如培養條件、培養基條件等之其他因素或以上參數及因素中之任一者之組合而定。舉例而言，相較於在與本發明之基因改造生物體相同的條件下培養之無基因改造生物體，增量可為至少0.3%、0.5%、0.7%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或100%以上。
可如上文所描述，亦即藉由根據基於特定培養條件之細胞培養物核黃素測定方案及使用如上文所描述之基於菸鹼醯胺之光學量測分析法測定核黃素產量或積聚且因此亦測定相比於對等生物體，經修飾生物體中此產量之增量。在特定實施例中，該測定可如下文所提供之實例中所描述進行。本發明亦設想其他測定方案或程序，包括可在將來研發之方案或方案改良。
在另一實施例中，本發明係關於如上文所定義之基因改造生物 體或使用該基因改造生物體生產或積聚核黃素的方法，其中該生物體較佳包含使得以下至少一者過度表現的基因改造：AGOS_ACL174W(fat1)、AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AER358C(pox1)、AGOS_AGL060W(fox2)、AGOS_AFR302W(pot1/fox3)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)；及/或其中以提高量提供以下多肽中之至少一者：AGOS_ACL174Wp(Fat1)、AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)、AGOS_AER358Cp(Pox1)、AGOS_AGL060Wp(Fox2)、AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)、AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)及AGOS_AER091Wp(Pxa2)；及/或其中提高以下活性中之至少一者：AGOS_ACL174Wp(Fat1)、AGOS_ABL018Cp(Faa1/Faa4)、AGOS_AER358Cp(Pox1)、AGOS_AGL060Wp(Fox2)、AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)、AGOS_AFL213Wp、AGOS_ADR165Cp、AGOS_AFR453Wp(Pex5)、AGOS_ACR128Cp(Pxa1)及AGOS_AER091Wp(Pxa2)，較佳如上文所詳細定義，且其中該生物體包含至少一個額外基因改造。
如本文所使用之術語「額外基因改造」係指如上文所定義之生物體之任何其他基因或生物化學修飾，例如，諸如基因或基因組區域缺失、基因或基因片段等之過度表現之修飾。
在一較佳實施例中，如上文所定義之生物體之額外基因改造係關於對核黃素產量具有影響之元件。此類元件可為已知的或可見於將來。較佳地，額外基因改造可關於對假囊酵母中，更佳棉假囊酵母中之核黃素產量具有已知影響之活性。已知具有此類影響之活性之實例包含GLY1；SHM2；ADE4；PRS 2、PRS 4；PRS 3；MLS1；BAS1；RIB 1；RIB 2；RIB 3；RIB 4；RIB 5；GUA1；ADE12；IMPDH；及 RIB 7。
因此，可使用假囊酵母、較佳為棉假囊酵母之基因gly1、shm2、ade4、prs 2、prs 4、prs 3、mls1、bas1、rib 1、rib 2、rib 3、rib 4、rib 5、gua1、ade12、impdh及/或rib 7中之一或多者進行基因改造。
在其他較佳實施例中，額外基因改造可導致以下至少一種改變：(i)GLY1活性提高；及/或(ii)SHM2活性降低或消除；及/或(iii)ADE4活性提高及/或以抗反饋抑制型式提供；及/或(iv)PRS 2、PRS 4活性提高；及/或(v)PRS 3活性提高；及/或(vi)MLS1活性提高；及/或(vii)BAS1活性降低或消除；及/或(viii)RIB 1活性提高；及/或(ix)RIB 2活性提高；及/或(x)RIB 3活性提高；及/或(xi)RIB 4活性提高；及/或(xii)RIB 5活性提高；及/或(xiii)RIB 7活性提高；及/或(xiv)GUA 1活性提高；及/或(xv)ADE12活性降低；及/或(xvi)IMPDH活性提高。
在其他較佳實施例中，AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性由包含SEQ ID NO：21胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：21胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：22核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：22核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：21胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：22核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AEL188Wp(SHM2)活性由包含SEQ ID NO：23胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：23胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：24核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：24核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：23胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：24核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性由包含SEQ ID NO：25胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：25胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：26核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：26核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：25胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：26核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性由包含SEQ ID NO：27胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：27胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：28核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：28核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：27胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：28核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性由包含 SEQ ID NO：29胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：29胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：30核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：30核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：29胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：30核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_ACR268Cp(MLS1)活性由包含SEQ ID NO：31胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：31胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：32核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：32核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：31胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：32核苷酸序列或其功能 性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AFR297Wp(BAS1)活性由包含SEQ ID NO：33胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：33胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：34核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：34核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：33胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：34核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性由包含SEQ ID NO：35胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：35胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：36核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：36核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼， 或由包含與SEQ ID NO：35胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：36核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性由包含SEQ ID NO：37胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：37胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：38核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：38核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：37胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：38核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列 組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性由包含SEQ ID NO：39胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：39胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：40核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：40核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：39胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：40核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性由包含SEQ ID NO：41胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：41胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：42核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：42核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：41胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：42核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AGR241Wp(RIB5)活性由包含SEQ ID NO：43胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：43胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：44核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：44核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：43胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：44核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，AGOS_AER037Cp(RIB7)活性由包含SEQ ID NO：45胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：45胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含 SEQ ID NO：46核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：46核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：45胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：46核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，GUA1活性由包含SEQ ID NO：69胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：69胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：70核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：70核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：69胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：70核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，ADE12活性由包含SEQ ID NO：71胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：71胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：72核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：72核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：71胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：72核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
在其他較佳實施例中，IMPDH活性由包含SEQ ID NO：73胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：73胺基酸序列或其功能性部分或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：74核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：74核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：73胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：74核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。
如本文所描述之序列之情形中所使用之術語「其功能性部分或片段」係指能夠進行特異酶促反應之多肽及編碼核苷酸序列的區段或部分。
在特定實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性及/或(ii)AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性及/或(iii)AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性及/或(iv)AGOS_ACR268Cp(MLS1)活性及/或(v)AGOS_AER350W(GUA1)活性及/或(vi)AGOS_AER117W(IMPDH)活性。
在其他特定實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性或(ii)AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性或(iii)AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性或(iv)AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性或(v)AGOS_AGR241Wp(RIB5)活性或(vi)AGOS_AER037Cp(RIB7)活性。
在其他特定實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性；及可降低或消除(i)AGOS_AEL188Wp(SHM2)活性；及/或可降低或消除(ii)AGOS_AFR297Wp(BAS1)活性；及/或可降低或消除(iii)AGOS_ABL186W(ADE12)活性。
在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性及/或(ii)AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性及/或(iii)AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性及/或(iv)AGOS_ACR268Cp(MLS1)活性。在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性及/或(ii)AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性及/或(iii)AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性及/或(iv)AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性及/或(v)AGOS_AGR241Wp(RIB5)活性及/或(vi)AGOS_AER037Cp(RIB7)活性。
在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性及/或(ii)AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性及/或(iii)AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性及/或(iv)AGOS_ACR268Cp(MLS1)活性及/或(v)AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性及/或(vi)AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性及/或(vii)AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性及/或(viii)AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性及/或(ix)AGOS_AGR241Wp(RIB5)活性及/或(x)AGOS_AER037Cp(RIB7)活性。
在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性及/或(ii)AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性及/或(iii)AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性及/或(iv)AGOS_ACR268Cp(MLS1)活性及/或(v)AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性及/或(vi)AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性及/或(vii)AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性及/或(viii)AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性及/或(ix)AGOS_AGR241Wp(RIB5)活性及/或(x)AGOS_AER037Cp(RIB7)活性；及/或可降低或消除(x)AGOS_AEL188Wp(SHM2)活性；及/或可降低或消除(xi)AGOS_AFR297Wp(BAS1)活性；及/或可降低或消除 (xii)AGOS_ABL186W(ADE12)活性。
在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性及(ii)AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性及(iii)AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性。
在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性及(ii)AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性及(iii)AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性；且可降低或消除(iv)AGOS_AEL188Wp(SHM2)活性；且可降低或消除(v)AGOS_AFR297Wp(BAS1)活性。
在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性及(ii)AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性及(iii)AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性及(iv)AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性及(v)AGOS_AGR241Wp(RIB5)活性及(vi)AGOS_AER037Cp(RIB7)活性。
在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性及(ii)AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性及(iii)AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性及(iv)AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性及(v)AGOS_AGR241Wp(RIB5)活性及(vi)AGOS_AER037Cp(RIB7)活性；且可降低或消除(vii)AGOS_AEL188Wp(SHM2)活性；且可降低或消除(viii)AGOS_AFR297Wp(BAS1)活性。
在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性及(ii)AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性及(iii)AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性；且可提高(iv)AGOS_ACR268Cp(MLS1)活性及(v)AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性及(vi)AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性及(vii)AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性及(viii)AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性及(ix)AGOS_AGR241Wp (RIB5)活性及(x)AGOS_AER037Cp(RIB7)活性。
在又一組實施例中，可提高AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性及(i)AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性及(ii)AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性及(iii)AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性；且可提高(iv)AGOS_ACR268Cp(MLS1)活性及(v)AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性及(vi)AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性及(vii)AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性及(viii)AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性及(ix)AGOS_AGR241Wp(RIB5)活性及(x)AGOS_AER037Cp(RIB7)活性；且可降低或消除(x)AGOS_AEL188Wp(SHM2)活性；且可降低或消除(xi)AGOS_AFR297Wp(BAS1)活性。
AGOS_AFR366Wp(GLY1)活性提高可歸因於AGOS_AFR366W(gly1)基因之過度表現。AGOS_AGL334Wp(ADE4)活性提高可歸因於AGOS_AGL334W(ade4)基因之過度表現。AGOS_AGR371Cp(PRS 2、PRS 4)活性提高可歸因於AGOS_AGR371C(prs 2、prs 4)基因之過度表現。AGOS_AGL080Cp(PRS 3)活性之提高可歸因於AGOS_AGL080C(prs 3)基因之過度表現。AGOS_ACR268Cp(MLS1)活性提高可歸因於AGOS_ACR268C(mls1)基因之過度表現。AGOS_ADL296Cp(RIB1)活性提高可歸因於AGOS_ADL296C(rib1)基因之過度表現。AGOS_AEL091Cp(RIB2)活性提高可歸因於AGOS_AEL091C(rib2)基因之過度表現。AGOS_ADR118Cp(RIB3)活性提高可歸因於AGOS_ADR118Cp(rib3)基因之過度表現。AGOS_AGR396Wp(RIB4)活性提高可歸因於AGOS_AGR396W(rib4)基因之過度表現。AGOS_AGR241Wp(RIB5)活性提高可歸因於AGOS_AGR241W(rib5)基因之過度表現。AGOS_AER037Cp(RIB7)活性提高可歸因於AGOS_AER037C(rib7)基因之過度表現。AGOS_AEL188Wp(SHM2)活性降低或消除可歸因於AGOS_AEL188W (shm2)基因之不活化。AGOS_AFR297Wp(BAS1)活性降低或消除可歸因於AGOS_AFR297W(bas1)基因之不活化。GUA1活性提高可歸因於AGOS_AER350W(gua1)基因之過度表現。IMPDH活性提高可歸因於AGOS_AER117W(impdh)基因之過度表現。ADE12活性降低或消除可歸因於AGOS_ABL186W(ade12)基因之不活化。
可較佳藉由使用例如組成型啟動子(諸如GDP啟動子)之強啟動子，根據如上文所概述之途徑、方法及製程進行AGOS_AFR366W(gly1)基因、AGOS_AGL334W(ade4)基因、AGOS_AGR371C(prs 2、prs 4)基因、AGOS_AGL080C(prs 3)基因、AGOS_ACR268C(mls1)基因、AGOS_ADL296C(rib1)基因、AGOS_AEL091C(rib2)基因、AGOS_ADR118Cp(rib3)基因、AGOS_AGR396Wp(rib4)基因、AGOS_AGR241W(rib5)基因、AGOS_AER350W(gua 1)基因、AGOS_AER117W(impdh)基因及/或AGOS_AER037C(rib7)基因之過度表現。在特定實施例中，啟動子亦可為異源啟動子或合成啟動子，例如異源強啟動子或可調節異源啟動子。
如本文所使用術語「不活化」係指編碼酵素活性之遺傳元件之修飾，例如在分子基礎上遺傳元件所表現之轉錄物或該遺傳元件所編碼之蛋白質或酵素活性，其導致活性之功能完全或部分中止。部分不活化或活性功能之部分中止可例如產生野生型或完全酵素活性之約95%、90%、85%、80%、75%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、3%或3%以下或所提及之值之間的任何值的殘餘酵素活性。所設想之不活化之實例為AGOS_AEL188W(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)及AGOS_AFR297W(BAS1)中之至少一者的至少一個基因組複本，較佳所有基因組複本之功能性破裂或缺失。在較佳實施例中，欲缺失之遺傳元件或基因組複本為SEQ ID NO：24、72及/或34之核苷酸序列或如 上文所定義之其同源序列，包含、部分包含、基本上由或由前述序列組成。缺失可包涵遺傳元件之編碼(ORF)或非編碼部分中之兩個或兩個以上殘基之任何區域，例如兩個殘基至整個基因或基因座。在特定實施例中，缺失亦可影響較小區域，諸如結構域、蛋白質次部分、具有少於約50個相連鹼基對之重複序列或片段，不過較大缺失亦可存在。例如在蛋白質或酵素由數個次單元構成之情況下，缺失可包含一個蛋白質次單元或一個以上蛋白質次單元之區域。缺失或功能性破裂較佳在AGOS_AEL188W(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297W(BAS1)之編碼序列或ORF內發生。亦設想如上文所定義之AGOS_AEL188W(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297W(BAS1)基因之3'非編碼序列中之功能性破裂；如上文所定義之AGOS_AEL188W(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297W(BAS1)之啟動子序列(亦5'非編碼區)中之功能性破裂；或與如上文所定義之AGOS_AEL188W(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297W(BAS1)相關之調節序列中之功能性破裂。此類功能性破裂或修飾可例如導致表現減少或轉錄物不穩定、轉錄起始障礙等，因此提供酵素活性之降低的量或完全不存在。在其他實施例中，不活化亦可歸因於AGOS_AEL188W(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297W(BAS1)之遺傳元件之編碼(ORF)及/或非編碼區域中之突變、重排及/或插入，例如調節序列中。突變可為例如點突變或2-核苷酸或3-核苷酸交換，其產生經編碼之胺基酸序列之修飾；或將一或多個框移引入ORF中；或引入過早終止密碼子；或自ORF移除終止密碼子；及/或引入例如聚腺苷酸化機器之細胞機器之識別信號；或引入蛋白質降解機器之破壞信號等。此類經修飾之序列部分可產生不再提供蛋白質野生型型式之活性的蛋白質。蛋白質可相應地例如在相關酵素核心區域中具有取 代，從而使功能中止；或可由不同胺基酸(歸因於框移)構成且因此無法恰當地起作用。經修飾之序列部分可進一步產生易於降解之不穩定轉錄物。此外，蛋白質之靶向可能受損。
如上文所概述之遺傳元件n之功能性破裂或缺失以及此等遺傳元件中之點突變之引入可藉由熟習此項技術者已知之任何適合的方法進行，例如藉由如上文所描述之同源重組進行。
在其他特定實施例中，不活化可歸因於在RNA轉錄物層面上發生之特異不活化過程。此類不活化可歸因於AGOS_AEL188W(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297W(BAS1)之RNA轉錄物之序列特異性識別及此等轉錄物之後續降解。就此方法而言，可使用如自高級真核細胞已知之RNA干擾或反義方法。雖然假定諸如假囊酵母之真菌缺乏RNAi所必需之活性，但本發明設想藉由基因工程改造引入所需活性。一實例為如何類似於釀酒酵母之情形建立假囊酵母之RNAi，其可源於Drinnenberg等人，2009,Science 326(5952),544-550。因此，本發明設想提供對AGOS_AEL188W(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297W(BAS1)或其組合之轉錄物中之任一者具有特異性的siRNA屬。
術語「siRNA」係指特定類型之反義分子，亦即，誘發RNA干擾(RNAi)路徑之小抑制性RNA雙螺旋體。此等分子之長度可變化且長度可在約18個至28個核苷酸之間，例如長度為18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個或28個核苷酸。較佳地，該分子之長度為21個、22個或23個核苷酸。根據本發明之siRNA分子可含有對其標靶mRNA之不同程度之互補，較佳呈反義鏈形式。siRNA在有義鏈及/或反義鏈之5'端或3'端上可具有不成對的懸垂鹼基。術語「siRNA」包括兩個各別鏈之雙螺旋體以及可形成包含雙螺旋區之髮夾結構的單鏈。較佳地，siRNA可為雙鏈，其中雙鏈siRNA 分子包含第一鏈及第二鏈，siRNA分子之各鏈之長度為約18個至約23個核苷酸，siRNA分子之第一鏈包含藉由RNA干擾對標靶RNA具有足夠的互補性之核苷酸序列，且該siRNA分子之第二鏈包含與第一鏈互補之核苷酸序列。此類干擾分子之產生可進一步藉由產生來自可調節啟動子之siRNA來進行控制及調節。
在本發明之又一特定實施例中，不活化可歸因於在蛋白質或酵素層面上發生之特異不活化過程。此不活化可歸因於諸如小分子之特異性結合分子與AGOS_AEL188Wp(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297Wp(BAS1)之酵素或蛋白質的結合。
在本發明之上下文中，「小分子」係指較佳具有生物活性之小有機化合物，亦即，生物分子，但較佳不為聚合物。此類有機化合物可具有任何適合的形式或化學性質。化合物可為天然化合物，例如已經設計及重新產生之二級代謝物或人工化合物。在本發明之一個實施例中，小分子能夠阻斷AGOS_AEL188Wp(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297Wp(BAS1)與受質之結合，或能夠阻斷AGOS_AEL188Wp(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297Wp(BAS1)之活性。舉例而言，小分子可與AGOS_AEL188Wp(SHM2)、AGOS_ABL186W(ADE12)或AGOS_AFR297Wp(BAS1)結合，且從而誘發分子與蛋白質之間緊密或不可逆的相互作用，因此例如在涉及酵素核心或結合袋之情況下導致蛋白質或酵素之一般(野生型)功能中止或受損。用於鑑別及製備此類小分子之方法及技術以及用於測試小分子之分析法為熟習此項技術者所知且亦於本文中設想。
在另一較佳實施例中，AGOS_AGL334Wp(ADE4)之活性為ADE4之反饋抑制型式，其由包含SEQ ID NO：47胺基酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：47胺基酸序列或其功能性部分 或片段組成之多肽提供，或由包含SEQ ID NO：48核苷酸序列或其功能性部分或片段、基本上由或由SEQ ID NO：48核苷酸序列或其功能性部分或片段組成之核酸編碼，或由包含與SEQ ID NO：47胺基酸序列或其功能性部分或片段具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的胺基酸、基本上由或由該胺基酸組成之多肽提供，或由包含與SEQ ID NO：48核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少約95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的核苷酸序列、基本上由或由該核苷酸序列組成之核酸編碼。ADE4之反饋抑制型式之其他細節可源於Jimenez等人，2005,Applied Environmental Microbiology 71,5743-5751。
本發明進一步設想參與如上文所定義之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑之基因編碼活性之用途，其用於提高假囊酵母屬之生物體中之核黃素的積聚。欲用於此方法之基因可為上文所提及之基因中之任一者，例如AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)。在其他實施例中，諸如AGOS_ABL018C(faa1/faa4)、AGOS_AFL213W、AGOS_ADR165C、AGOS_AFR453W(pex5)、AGOS_ACR128C(pxa1)或AGOS_AER091W(pxa2)之額外基因可用於假囊酵母屬之生物體中的核黃素積聚。可使用所提及之基因，從而可以提高的量或濃度在細胞中提供經編碼之多肽及活性。該等基因可以任何適合的組合或連接使用，較佳如上文所描述。較佳的是至少過度表現AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)。在某些實施例中，提高核黃素之積聚亦可包括生產核黃素，例如如上文所定義。
在其他特定實施例中，可使用額外基因來提高假囊酵母屬之生 物體中之核黃素積聚。此等基因可包括假囊酵母之gly1；shm2；ade4；prs 2、prs 4；prs 3；mls1；bas1；rib 1；rib 2；rib 3；rib 4；rib 5；gua1；ade12；impdh及/或rib 7，該假囊酵母較佳為如上文所定義之棉假囊酵母。尤其較佳的是，過度表現gly1，以提高GLY1活性；使shm2不活化，以降低或消除SHM2活性；過度表現ade4或表現或過度表現ade4抗反饋突變型，以提高ADE4活性及/或以抗反饋抑制型式提供其活性；過度表現prs 2、prs 4，以提高PRS 2、PRS 4活性；過度表現mls1，以提高MLS1活性；使bas1不活化，以降低或消除BAS1活性；過度表現rib 1，以提高RIB 1活性；過度表現rib 2，以提高RIB 2活性；過度表現rib 3，以提高RIB 3活性；過度表現rib 4，以提高RIB 4活性；過度表現rib 5，以提高RIB 5活性；過度表現gua1，以提高GUA1活性；使ade12不活化，以降低ADE12活性；過度表現impdh，以提高IMPDH活性；及/或過度表現rib 7，以提高RIB 7活性。在特定實施例中，此等基因可過度表現或以如上文所定義之形式提供，例如呈不同組合及量。
生物體可為如上文所描述之任何假囊酵母屬，較佳為棉假囊酵母。假囊酵母用於提高核黃素之積聚之用途可包括使用適合的發酵環境、營養、自發酵容器提取核黃素等。本發明因此設想用於生產核黃素或如上文所定義之其衍生物之對應的方法。在特定實施例中，假囊酵母屬為已能夠積聚50mg/l至100mg/l培養基之核黃素，更佳超過50mg/l至100mg/l培養基之核黃素之生物體。在其他實施例中，假囊酵母屬可為已經基因改造之生物體。基因改造可為如本文所描述之修飾，例如對核黃素之生產或積聚具有直接影響；或可例如在其他路徑中具有不同的作用；或涉及生產除核黃素外之其他生物化學實體，諸如PUFA、脂肪酸、胺基酸、糖等；涉及使用某些碳源之可能性；涉及使用某些氮源等之可能性；涉及基因組或基因組區域之穩定性；允 許或改良同源重組之步驟；允許異源基因或啟動子等之表現；改良細胞之培養物狀態，諸如斷絲化、菌絲斷裂、pH耐受性、密度耐受性、鹽之使用、鹽耐受性；涉及細胞之產生速率；涉及抗生素抗性或對於生產核黃素或共同生產核黃素及另一產物可為有利的任何其他特點。
本發明進一步設想參與如上文所定義之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑之基因編碼活性之用途，其用於提高假囊酵母屬之生物體中之核黃素的積聚。用於此方法之基因可為上文所提及之基因中之任一者，例如AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018C基因(faa1/faa4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)。
在一尤其較佳實施例中，可使用AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018C基因(faa1/faa4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)以使得藉由強(較佳為組成型)且視情況可調節的啟動子或藉由提供生物體之基因組中之AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、AGOS_AGL060W基因(fox2)、AGOS_ABL018C基因(faa1/faa4)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)的至少一第二複本來使其過度表現。用於提供第二複本等之啟動子及方法已描述於上文中。
在另一態樣中，本發明係關於如上文所定義之生物體之用途，其用於生產核黃素，該生物體尤其為經基因改造之生物體，例如包含上文所提及之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑中之基因改造及視情況存在之其他基因改造，諸如如上文所定義之基因gly1、shm2、ade4、prs 2、prs 4、prs 3、mls1、bas1、rib 1、rib 2、rib 3、rib 4、rib 5、gua1、ade12、impdh及/或rib 7之修飾。
在另一態樣中，本發明係關於來自如上文所定義之至少一種生物體之核黃素產物。術語「來自如上文所定義之至少一種生物體之核黃素產物」意謂包含一定比例核黃素或其衍生物之任何產物，其來自如上文所定義之本發明生物體中之任一者。該產物可進一步為已依照其目的經修飾及調整之產物。此類產物可包括適合作為動物飼料或作為人類食品、作為膳食補充劑或醫療製劑、真菌錠劑、嬰兒及兒童之食品等之可食用產品。本發明產物可進一步包括用於工業生產之核黃素。進一步設想適用於化學合成製程、藥理學目的及其類似用途之核黃素產物。
出於說明之目的提供以下實例及圖式。因此，應理解，該等實例及圖式不應理解為限制性的。熟習此項技術者將顯然能夠進一步設想本文所規定之原理之修改。
實例 實例1
產生用於棉假囊酵母中之FAT1過度表現構築體
為了工業生產核黃素，在作為主要碳源之油上進行棉假囊酵母之發酵。核黃素隨後由脂肪酸經乙醛酸循環、葡糖新生、磷酸戊糖路徑及嘌呤及核黃素合成路徑產生。因此，長鏈脂肪酸攝取繼而脂肪酸活化以及β氧化路徑為關鍵步驟以提供乙醯基-CoA作為高核黃素產量所必需之前驅體中之一者。
在棉假囊酵母中，鑑別出FAT1(ACL174W、SEQ ID NO：2)基因，其為釀酒酵母Fat1基因之同線同源物。在釀酒酵母中，Fat1p為雙功能蛋白質，其在長鏈脂肪酸運輸及極長鏈脂肪酸活化層面上之脂肪酸運輸中發揮中心作用(Zou等人，2002,Journal of Biological Chemistry,277,31062-31071)。
為了評估關於棉假囊酵母中之核黃素生物合成之靶向最佳化的 脂肪酸攝取及活化之影響，產生編碼脂肪酸運輸蛋白之FAT1基因之過度表現的構築體。出於此目的，藉由棉假囊酵母之強且組成型GPD啟動子置換天然FAT1啟動子。
使用四個重疊片段，藉由CPEC選殖方法(Quan等人，2009,PLOS ONE 4：e6441)組裝用於啟動子置換之過度表現質體pGPDp-FAT1(SEQ ID NO：49，參見圖4)。所有片段均藉由PCR使用特異性且重疊的引子產生。一個片段表示含有大腸桿菌複製起點以及針對大腸桿菌中之選擇之安比西林抗性基因之3025bp載體骨架。片段2及片段3為來自棉假囊酵母之300bp或296bp長基因組整合位點，故稱為hom-位點A及hom-位點B，且1959bp之片段4含有loxP-KanMX-loxP抗性卡匣以及棉假囊酵母GPD基因之啟動子序列。
藉由表現如Guldener等人，1996,Nucleic Acids Research,24,2519-2524中所描述之CRE重組酶，重複反轉之loxP序列使得能夠去除及隨後再次使用選擇標記物。
使用質體Maxi套組(Qiagen,Germany)分離大量所得質體pGPDp-FAT1。使用BsgI及BseRI消化，自質體pGPD-FAT1分離含有基因組整合位點A及B、KanMX抗性標記物以及GPD啟動子序列之片段。根據製造商之說明書，使用Wizard SV凝膠及PCR淨化系統(Promega,Germany)凝膠純化所得2419bp之片段。經純化之片段隨後用於棉假囊酵母菌株PS3及野生型菌株ATCC10895之轉化。藉由分析型PCR確認過度表現模組之基因組整合(亦參見實例4及實例7)。
實例2
產生用於棉假囊酵母中之POX1過度表現構築體
棉假囊酵母具有一個定位於過氧化體之β氧化路徑(參見Vorapreeda等人，2012,Microbiology,158,217-228)。根據假囊酵母/阿舒囊黴基因組資料庫(http：//agd.vital-it.ch/index.html)，基因AER358C (POX1)、AGL060W(FOX2)及AFR302W(POT1/FOX3)分別為釀酒酵母基因POX1、FOX2及POT1/FOX3之同線同源物，其編碼β氧化路徑之酵素活性。
為了評估關於棉假囊酵母中之核黃素生物合成之靶向最佳化的β氧化路徑之影響，產生用於編碼醯基-CoA氧化酶之POX1基因(SEQ ID NO：6)之過度表現的構築體。出於此目的，藉由棉假囊酵母之強且組成型GPD啟動子置換天然POX1啟動子。
使用四個重疊片段，藉由CPEC選殖方法(參見Quan等人PLOS ONE 4：e6441)組裝用於啟動子置換之過度表現質體pGPDp-POX1(SEQ ID NO：50，參見圖5)。所有片段均藉由PCR使用特異性且重疊的引子產生。一個片段表示含有大腸桿菌複製起點以及針對大腸桿菌中之選擇之安比西林抗性基因之3026bp載體骨架。片段2及片段3為來自棉假囊酵母之302bp及285bp長基因組整合位點，故稱為hom-位點A及hom-位點B，且1960bp之片段4含有loxP-KanMX-loxP抗性卡匣以及棉假囊酵母GPD基因之啟動子序列。
藉由表現如Guldener等人，1996,Nucleic Acids Research,24,2519-2524中所描述之CRE重組酶，重複反轉之loxP序列使得能夠去除及隨後再次使用選擇標記物。
使用質體Maxi套組(Qiagen,Germany)分離大量所得質體pGPDp-POX1。使用BsgI及BseRI消化，自質體pGPD-POX1分離含有基因組整合位點A及B、KanMX抗性標記物以及GPD啟動子序列之片段。根據製造商之說明書，使用Wizard SV凝膠及PCR淨化系統(Promega,Germany)凝膠純化所得2412bp之片段。經純化之片段隨後用於棉假囊酵母菌株PS3及野生型菌株ATCC10895之轉化。藉由分析型PCR確認過度表現模組之基因組整合(亦參見實例4及實例7)。
實例3
產生用於棉假囊酵母中之POT1-FOX2過度表現構築體
棉假囊酵母具有一個定位於過氧化體之β氧化路徑(參見Vorapreeda等人，2012,Microbiology,158,217-228)。根據阿舒囊黴基因組資料庫(http：//agd.vital-it.ch/index.html)，基因AER358C(POX1)、AGL060W(FOX2)及AFR302W(POT1/FOX3)分別為釀酒酵母基因POX1、FOX2及POT1之同線同源物，其編碼β氧化路徑之酵素活性。
為了提高棉假囊酵母中之β氧化路徑之活性，產生用於POT1/FOX3(SEQ ID NO：10)及FOX2(SEQ ID NO：8)基因之同步過度表現的構築體。POT1編碼3-酮醯基-CoA硫解酶，而FOX2蛋白質展現水合酶及去氫酶活性。關於過度表現，將兩種基因之第二複本整合排列於棉假囊酵母中之NOP12(ACR274W)基因座之串聯上游中。
使用六個重疊片段，藉由CPEC選殖方法(參見Quan等人PLOS ONE 4：e6441)組裝過度表現質體pPOT1-FOX2(SEQ ID NO：51，參見圖6)。所有片段均藉由PCR使用特異性且重疊的引子產生。一個片段表示含有大腸桿菌複製起點以及針對大腸桿菌中之選擇之康黴素抗性基因之2330bp載體骨架。片段2及片段3為來自棉假囊酵母之296bp或297bp長基因組整合位點，故稱為hom-位點A及hom-位點B，且1620bp之片段4含有loxP-KanMX-loxP抗性卡匣。片段5包涵POT1開放閱讀框架以及啟動子及終止子序列且其尺寸為2118bp。包括對應的啟動子及終止子之FOX2基因之PCR擴增產生尺寸為3247bp之片段6。
藉由表現如Guldener等人，1996,Nucleic Acids Research,24,2519-2524中所描述之CRE重組酶，重複反轉之loxP序列使得能夠去除及隨後再次使用選擇標記物。
使用質體Maxi套組(Qiagen,Germany)分離大量所得質體pPOT1-FOX2。使用SwaI消化，自質體POT1-FOX2分離含有基因組整合位點 A及B、KanMX抗性標記物以及POT1及FOX2基因之片段。根據製造商之說明書，使用Wizard SV凝膠及PCR淨化系統(Promega,Germany)凝膠純化所得7373bp之片段。經純化之片段隨後用於棉假囊酵母菌株PS3及野生型菌株ATCC10895之轉化。藉由分析型PCR確認過度表現模組之基因組整合(亦參見實例4及實例7)。
實例4
產生且分析過度表現FAT1、POX1或POT1及FOX2之棉假囊酵母菌株
如上文所描述(亦參見實例1至實例3)構築且分離攜帶棉假囊酵母GPD啟動子控制下之FAT1或POX1或POT1及FOX2基因之第二複本的過度表現卡匣。根據Jimenez等人，2005,Applied Environmental Microbiology 71,5743-5751中所提供之方案，使用棉假囊酵母菌株PS3之芽孢轉化經純化之片段。在含有200mg/L遺傳黴素(Geneticin)(G418)之MA2培養基(10g/L細菌蛋白腖、10g/L葡萄糖、1g/L酵母萃取物、0.3g/L肌醇(Myoinosit)、20g/L瓊脂)上選擇所得轉化體。
為了接收足夠的菌絲體以便分離基因組DNA，將轉化體接種於含有200mg/L遺傳黴素(G418)之SP培養基盤(3g/L大豆粉、3g/L酵母萃取物、3g/L麥芽萃取物、20g/L玉米麵、1g/L消泡劑、10g/l L葡萄糖、30g/L瓊脂，pH 6.8)上。
隨後，根據製造商之建議，使用DNeasy植物微型套組(Qiagen,Germany)分離各轉化體之基因組DNA。隨後在不同PCR分析中使用基因組DNA以測試過度表現構築體之恰當整合。
進行以下PCR分析以測試在5'-及3'整合位點處過度表現構築體之適當整合。進行另一PCR反應作為天然對照組以分析同核背景之菌株。
選擇陽性轉化體用於單孢分離以確保獲得同核菌株。如下分離單孢：在500μL生理食鹽水-曲拉通(Triton)溶液(9g/L NaCl、600μl/L曲拉通X-100)中溶解轉化體之菌絲體之後，添加500μL正己烷且混合。使混合物離心持續1min及14000rpm，且將上層相中所含有之單孢接種於含有200mg/L遺傳黴素(G418)之SP培養基盤上。
使用如上文所描述之PCR分析再次測試自單孢分離獲得之菌株。將陽性菌株用於CRE重組以去除KanMX選擇標記物。如Guldener等人，1996,Nucleic Acids Research,24,2519-2524中所描述進行針對CRE重組之轉化。對所得菌株進行PCR分析以驗證選擇標記物缺失事件。PCR反應進行如下：
選擇已展示選擇標記物缺失且同時展示過度表現模組之恰當整合的菌株以用於震盪燒瓶實驗，從而測試核黃素產量且測定相比於參考棉假囊酵母菌株PS3(亦參見實例5)之對應產率。
實例5
產生且分析過度表現FAT1、POX1或POT1及FOX2之棉假囊酵母菌株
因為脂肪酸之攝取及活化及經由β氧化路徑之有效通量為提供足夠前驅體用於核黃素生產之重要步驟，所以進行FAT1、POX1、POT1及FOX2之過度表現。為了分析基因過度表現對核黃素產量之效應， 在菜籽油作為主要碳源之震盪燒瓶實驗中測試上述菌株且測定核黃素效價。所有震盪燒瓶實驗均重複進行三次以評估對應菌株之核黃素效能。
使填充於100mL愛倫美氏無隔板燒瓶中之10ml預培養基接種有在SP培養基盤上生長3至4天的棉假囊酵母菌絲體(1cm2)。在30℃及200rpm下培育燒瓶持續40h。1ml預培養物用於接種填充於250mL具有扁平隔板之愛倫美氏燒瓶中之24.83mL主培養基。在培育之前稱重所有燒瓶以測定質量，且隨後在30℃及200rpm下培育6天。在生長之後，再次稱重所有燒瓶以測定培育後質量且因此能夠包括培育期間之蒸發效應。
使用光學量測分析法分析上述培養物之核黃素產量。出於此目的，將250μL培養物與4.75mL 40%菸鹼醯胺溶液混合且在黑暗中在70℃下培育40min。將樣品冷卻5min。隨後，將40μL樣品與3mL H2O混合且量測在440nm處之消光。使用3mL H2O作為空白試樣。所有樣品均量測兩次。
隨後根據以下公式計算核黃素效價：效價核黃素[g/L]=(消光[444nm]×M核黃素×菸鹼醯胺稀釋度×((V光析管+V樣品)/V樣品))/莫耳消光係數/1000
M核黃素=376.37mol/L
莫耳消光係數=12216L/mol/cm
考慮培育期間之蒸發的公式：((25.83-(m培育前-m培育後))/21.93)×效價核黃素[g/L]
如圖7中所描繪之結果展示三個單獨的震盪燒瓶中每一菌株之平均效價。
相較於參考菌株PS3，在棉假囊酵母之GPD啟動子下過度表現FAT1基因之菌株展示核黃素產量提高6%至8%(參見圖7A)，得出以下結論：脂肪酸攝取及活化之較高活性為核黃素生產中之關鍵步驟且因此為菌株最佳化之適合的標靶。
此外，已發現POX1以及POT1及FOX2過度表現菌株中之核黃素效價明顯高於參考菌株背景下之效價。在GPD啟動子下POX1之過度表現使核黃素產量提高4%至6%(參見圖7B)，而藉由引入第二基因複本實現之POT1及FOX2之同時過度表現使核黃素產率提高10%(參見圖7C)。
此等結果展示β氧化路徑活性之靶向提高為顯著提高工業核黃素產量之適當的策略。
實例6
產生用於棉假囊酵母中之FAA1、FAA4過度表現構築體
在棉假囊酵母中，鑑別出faa1/faa4(ABL018C，SEQ ID No.4)基因，其為釀酒酵母Faa1及Faa4基因之同線同源物。在酵母中，脂肪酸運輸典型地至少需要Fat1p、Faa1p及Faa4p活性。由於Faa1p或Faa4p，脂肪酸運輸過程明顯由脂肪酸之酯化驅動。據推測，尤其Fat1p及 Faa1p展示功能性締合且從而介導外源性長鏈脂肪酸之經調節運輸。
為了評估關於棉假囊酵母中之核黃素生物合成之靶向最佳化的脂肪酸攝取及活化之影響，產生編碼長鏈醯基-CoA合成酶之faa1/faa4基因之過度表現的構築體。關於過度表現，將第二基因複本整合於棉假囊酵母中之MPT5(ADL056W)基因座之下游。
使用七個重疊片段，藉由釀酒酵母中與轉化相關之重組選殖(參見Kouprina及Larionov,2008,Nature Protocols 3：371-377)組裝過度表現質體pFAA1、pFAA4(SEQ ID NO：75，參見圖8)。所有片段均藉由PCR使用特異性且重疊的引子產生。一個片段表示含有大腸桿菌複製起點以及針對大腸桿菌中之選擇之安比西林抗性基因之1885bp載體骨架。片段2及片段3為釀酒酵母中用於選擇之URA3基因(1107bp)及2μm複製起點(1551bp)。片段4及片段5表示來自棉假囊酵母之305bp或350bp長基因組整合位點，故稱為hom-位點A及hom-位點B，且1581bp之片段6含有loxP-KanMX-loxP抗性卡匣。藉由表現如Guldener等人，1996,Nucleic Acids Research,24,2519-2524中所描述之CRE重組酶，重複反轉之loxP序列使得能夠去除及隨後再次使用選擇標記物。片段7包涵FAA1、FAA4開放閱讀框架以及啟動子及終止子序列且其尺寸為2757bp。
如先前所描述(參見Kouprina及Larionov,2008,Nature Protocols 3：371-377)在釀酒酵母中轉化所有片段且針對相應質體pFAA1、pFAA4之存在藉由菌落PCR篩選所得酵母菌落。除使用特殊酵母細胞溶解緩衝液(0.5g SDS、292mg NaCl、0.5ml 1M Tris/HCl(pH 8)、1g曲拉通X-100加50ml H2O)之細胞溶解步驟之外，根據製造商之說明書，使用Wizard Plus SV Minipreps DNA純化套組(Promega,Germany)自所選陽性酵母菌落分離質體DNA。隨後在大腸桿菌中轉化經分離之質體以便擴增。使用質體Maxi套組(Qiagen,Germany)分離大量所得質體 pFAA1、pFAA4。
使用SwaI消化，自質體pFAA1、pFAA4分離含有基因組整合位點A及B、KanMX抗性標記物以及FAA1、FAA4基因之片段。根據製造商之說明書，使用Wizard SV凝膠及PCR淨化系統(Promega,Germany)凝膠純化所得5001bp之片段。經純化之片段隨後用於棉假囊酵母野生型菌株ATCC10895之轉化。藉由分析型PCR確認過度表現模組之基因組整合(亦參見實例7)。
實例7
在野生型ATCC10895背景下產生及分析過度表現FAT1、POX1、FAA1、FAA4或POT1及FOX2之棉假囊酵母菌株
如上文所描述(亦參見實例1至實例3及實例6)構築且分離攜帶棉假囊酵母GPD啟動子控制下之FAT1或POX1或POT1/FOX2及FAA1、FAA4基因之第二複本的過度表現卡匣。根據Jimenez等人，2005,Applied Environmental Microbiology 71,5743-5751中所提供之方案，使用棉假囊酵母野生型菌株ATCC10895之芽孢轉化經純化之片段。在含有200mg/L遺傳黴素(G418)之MA2培養基(10g/L細菌蛋白腖、10g/L葡萄糖、1g/L酵母萃取物、0.3g/L肌醇、20g/L瓊脂)上選擇所得轉化體。
為了接收足夠的菌絲體以便分離基因組DNA，將轉化體接種於含有200mg/L遺傳黴素(G418)之SP培養基盤(3g/L大豆粉、3g/L酵母萃取物、3g/L麥芽萃取物、20g/L玉米麵、1g/L消泡劑、10g/l L葡萄糖、30g/L瓊脂，pH 6.8)上。
隨後，根據製造商之建議，使用DNeasy植物微型套組(Qiagen,Germany)分離各轉化體之基因組DNA。隨後在不同PCR分析中使用該基因組DNA以測試過度表現構築體之恰當整合。
進行以下PCR分析以測試在5'及3'整合位點處過度表現構築體之 正確整合。進行另一PCR反應作為天然對照組以分析同核背景之菌株。
選擇陽性轉化體用於單孢分離以確保獲得同核菌株。如下分離單孢：在500μL生理食鹽水-曲拉通溶液(9g/L NaCl、600μl/L曲拉通X-100)中溶解轉化體之菌絲體之後，添加500μL正己烷且混合。將混合物離心持續1min及14000rpm，且將上層相中所含有之單孢接種於含有200mg/L遺傳黴素(G418)之SP培養基盤上。
使用如上文所描述之PCR分析再次測試自單孢分離獲得之菌株。將陽性菌株用於CRE重組以去除KanMX選擇標記物。如Guldener等人，1996,Nucleic Acids Research,24,2519-2524中所描述進行針對CRE重組之轉化。對所得菌株進行PCR分析以驗證選擇標記物缺失事件。PCR反應進行如下：
選擇已展示選擇標記物缺失且同時展示過度表現模組之恰當整合的菌株以用於震盪燒瓶實驗來測試核黃素產量且測定相比於參考棉 假囊酵母菌株ATCC10895(亦參見實例8)之對應產率。
實例8
在野生型ATCC10895背景下分析過度表現FAT1、POX1、FAA1/FAA4或POT1及FOX2之棉假囊酵母菌株中之核黃素產量
因為脂肪酸之攝取及活化及經由β氧化路徑之有效通量為提供足夠前驅體用於核黃素生產之重要步驟，所以進行FAT1、POX1、FAA1/FAA4、POT1及FOX2之過度表現。為了分析在野生型背景下基因過度表現對核黃素產量之影響，在震盪燒瓶實驗中測試上述菌株且測定核黃素效價。並行分析親代菌株ATCC 10895作為參考。
使用分光光度分析法量測總(胞內及胞外)核黃素生產水準。培養菌株以用於在28℃下在MA2培養基中藉由在150rpm下迴轉震盪進行核黃素分析。將一定體積之1M HCl添加至1mL培養物中且在100℃下培育30min。在冷卻樣品之後，使用0.5mm玻璃珠(Sigma-Aldrich)及劇烈渦旋使菌絲體溶解。在離心之後，在Varioskan微量滴定盤讀取器(Thermo Scientific)上，以分光光度法(λexc=450nm)測定上清液中之核黃素濃度。使用純核黃素(Sigma-Aldrich)製作校準曲線且以與樣品相同的方式處理。
如圖9中所描繪之結果展示三個單獨的震盪燒瓶中每一菌株之平均效價。野生型菌株ATCC10895展示約70mg/L之平均核黃素效價。在棉假囊酵母之GPD啟動子下過度表現FAT1基因之ATCC10895菌株展示相較於參考菌株，核黃素產量提高約3倍。此外，FAA1/FAA4基因之過度表現使核黃素效價提高2倍，從而得出以下結論：脂肪酸攝取及活化之較高活性為核黃素生產中之關鍵步驟且因此為菌株最佳化之適合的標靶。
另外，已發現POX1以及POT1及FOX2過度表現菌株中之核黃素效價比野生型菌株背景下之效價高2倍以上。
此等結果展示β氧化路徑活性之靶向提高為顯著提高工業核黃素產量之適當的策略。
<110> 德商巴地斯顏料化工廠
<120> 藉由假囊酵母之發酵中過度表現脂肪酸運輸蛋白基因及編碼β氧化路徑酵素之基因以大量生產核黃素
<130> B 13791/DB
<150> ep13196262.3
<151> 2013-12-09
<160> 79
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 引子p21
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Claims (24)

  1. 一種在假囊酵母(Eremothecium)屬之基因改造生物體中生產核黃素之方法，其中該基因改造與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關，該方法包含：(i)使該等生物體在培養基中，較佳在脂肪酸油存在下且視情況在非脂質碳源存在下生長；及(ii)自該培養基分離核黃素。
  2. 一種藉由基因改造屬於假囊酵母屬之生物體來提供核黃素積聚生物體的方法，其中該基因改造與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該基因改造結果至少使得該生物體之AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性提高及/或AGOS_AER358Cp(Pox1)活性提高及/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性提高。
  4. 如請求項1或2之方法，其中與無該基因改造之對等生物體相比，該基因改造生物體能夠增加積聚至少5%至10%之核黃素。
  5. 如請求項3之方法，其中(i)該AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性之提高歸因於AGOS_ACL174W基因(fat1)之過度表現；及/或(ii)該AGOS_AER358Cp(Pox1)活性之提高歸因於AGOS_AER358C基因(pox1)之過度表現；及/或(iii)該AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性之提高歸因於AGOS_AGL060W基因(fox2)及AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之過度表現。
  6. 如請求項5之方法，其中該AGOS_ACL174W基因(fat1)、該 AGOS_AER358C基因(pox1)、該AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或該AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之該過度表現藉由強力(較佳係組成型)且視情況可調節之啟動子，或藉由提供該生物體之基因組中該AGOS_ACL174W基因(fat1)、該AGOS_AER358C基因(pox1)、該AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或該AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之至少一第二複本來傳達。
  7. 如請求項1或2之方法，其中該基因改造生物體包含至少一個額外基因改造。
  8. 如請求項7之方法，其中該額外基因改造導致選自包含以下各者之群的至少一種活性改變：(i)GLY1；(ii)SHM2；(iii)ADE4；(iv)PRS 2、PRS 4；(v)PRS 3；(vi)MLS1；(vii)BAS1；(viii)RIB 1；(ix)RIB 2；(x)RIB 3；(xi)RIB 4；(xii)RIB 5；及(xiii)RIB 7。
  9. 如請求項7之方法，其中該額外基因改造導致以下至少一種改變：(i)GLY1活性提高；及/或 (ii)SHM2活性降低或消除；及/或(iii)ADE4活性提高及/或以抗反饋抑制型式提供；及/或(iv)PRS 2、PRS 4活性提高；及/或(v)PRS 3活性提高；及/或(vi)MLS1活性提高；及/或(vii)BAS1活性降低或消除；及/或(viii)RIB 1活性提高；及/或(ix)RIB 2活性提高；及/或(x)RIB 3活性提高；及/或(xi)RIB 4活性提高；及/或(xii)RIB 5活性提高；及/或(xiii)RIB 7活性提高。
  10. 如請求項1或2之方法，其中屬於假囊酵母屬之該生物體為阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyi)、榛假囊酵母(Eremothecium coryli)、鐃鈸藤假囊酵母(Eremothecium cymbalariae)、棉假囊酵母(Eremothecium gossypii)、塞咔假囊酵母(Eremothecium sinecaudum)屬或假囊酵母屬CID1339。
  11. 一種屬於假囊酵母屬之核黃素積聚生物體，其經過基因改造，其中該基因改造與該生物體之脂肪酸攝取及/或β氧化路徑有關。
  12. 如請求項11之核黃素積聚生物體，其中該基因改造結果至少使得該生物體之AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性提高及/或AGOS_AER358Cp(Pox1)活性提高及/或AGOS_AGL060Wp(Fox2)及AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性提高。
  13. 如請求項11或12之核黃素積聚生物體，其中與無該基因改造之對等生物體相比，該基因改造生物體能夠增加積聚至少5%至10%之核黃素。
  14. 如請求項12之核黃素積聚生物體，其中(i)該AGOS_ACL174Wp(Fat1)活性之該提高歸因於AGOS_ACL174W基因(fat1)之過度表現；及/或(ii)該AGOS_AER358Cp(Pox1)活性之該提高歸因於AGOS_AER358C基因(pox1)之過度表現；及/或(iii)該AGOS_AGL060Wp(Fox2)活性及該AGOS_AFR302Wp(Pot1/Fox3)活性之該提高歸因於AGOS_AGL060W基因(fox2)及AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之過度表現。
  15. 如請求項14之核黃素積聚生物體，其中該AGOS_ACL174W基因(fat1)、該AGOS_AER358C基因(pox1)、該AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或該AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之該過度表現係藉由強力(較佳係組成型)且視情況可調節之啟動子，或藉由提供該生物體之基因組中該AGOS_ACL174W基因(fat1)、該AGOS_AER358C基因(pox1)、該AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或該AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之至少一第二複本來傳達。
  16. 如請求項11或12之核黃素積聚生物體，其中該基因改造生物體包含至少一種額外基因改造。
  17. 如請求項16之核黃素積聚生物體，其中該額外基因改造導致選自包含以下各者之群的至少一種活性改變：(xiv)GLY1；(xv)SHM2；(xvi)ADE4；(xvii)PRS 2、PRS 4；(xviii)PRS 3；(xix)MLS1； (xx)BAS1；(xxi)RIB 1；(xxii)RIB 2；(xxiii)RIB 3；(xxiv)RIB 4；(xxv)RIB 5；及(xxvi)RIB 7。
  18. 如請求項16之核黃素積聚生物體，其中該額外基因改造導致以下至少一種改變：(xiv)GLY1活性提高；及/或(xv)SHM2活性降低或消除；及/或(xvi)ADE4活性提高及/或以抗反饋抑制型式提供；及/或(xvii)PRS 2、PRS 4活性提高；及/或(xviii)PRS 3活性提高；及/或(xix)MLS1活性提高；及/或(xx)BAS1活性降低或消除；及/或(xxi)RIB 1活性提高；及/或(xxii)RIB 2活性提高；及/或(xxiii)RIB 3活性提高；及/或(xxiv)RIB 4活性提高；及/或(xxv)RIB 5活性提高；及/或(xxvi)RIB 7活性提高。
  19. 如請求項11或12之核黃素積聚生物體，其中屬於假囊酵母屬之該生物體為阿舒假囊酵母、榛假囊酵母、鐃鈸藤假囊酵母、棉假囊酵母、塞咔假囊酵母屬或假囊酵母屬CID1339。
  20. 一種AGOS_ACL174W基因(fat1)、AGOS_AER358C基因(pox1)、 AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之用途，其用於提高假囊酵母屬之生物體中之核黃素積聚。
  21. 如請求項20之用途，其中該AGOS_ACL174W基因(fat1)、該AGOS_AER358C基因(pox1)、該AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或該AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)係藉由強力(較佳係組成型)且視情況可調節之啟動子，或藉由提供該生物體之基因組中該AGOS_ACL174W基因(fat1)、該AGOS_AER358C基因(pox1)、該AGOS_AGL060W基因(fox2)及/或該AGOS_AFR302W基因(pot1/fox3)之至少一第二複本來過度表現。
  22. 一種如請求項11至19中任一項所定義生物體的用途，其用於生產核黃素。
  23. 如請求項20至22中任一項之用途，其中屬於假囊酵母屬之該生物體為阿舒假囊酵母、榛假囊酵母、鐃鈸藤假囊酵母、棉假囊酵母、塞咔假囊酵母屬或假囊酵母屬CID1339。
  24. 一種來自至少一種如請求項11至19中任一項所定義生物體的核黃素產物。
TW103142656A 2013-12-09 2014-12-08 藉由假囊酵母之發酵中過度表現脂肪酸運輸蛋白基因及編碼β氧化路徑酵素之基因以大量生產核黃素 TW201527533A (zh)

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TW103142656A TW201527533A (zh) 2013-12-09 2014-12-08 藉由假囊酵母之發酵中過度表現脂肪酸運輸蛋白基因及編碼β氧化路徑酵素之基因以大量生產核黃素

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