CN105603033B - 为增加gmp合成酶活性的假囊酵母属遗传修饰 - Google Patents
为增加gmp合成酶活性的假囊酵母属遗传修饰 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105603033B CN105603033B CN201510784207.7A CN201510784207A CN105603033B CN 105603033 B CN105603033 B CN 105603033B CN 201510784207 A CN201510784207 A CN 201510784207A CN 105603033 B CN105603033 B CN 105603033B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- activity
- organism
- nucleic acid
- eremothecium
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 294
- 241001465321 Eremothecium Species 0.000 title claims abstract description 108
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000926 GMP synthase (glutamine-hydrolyzing) Proteins 0.000 title description 6
- 102100033452 GMP synthase [glutamine-hydrolyzing] Human genes 0.000 title description 6
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims abstract description 261
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 129
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims abstract description 129
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims abstract description 128
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 73
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims abstract description 66
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 49
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 43
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 134
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 105
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 105
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 105
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 95
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 95
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 62
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 53
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 52
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 50
- 241001465328 Eremothecium gossypii Species 0.000 claims description 47
- 101710197776 Serine hydroxymethyltransferase 2 Proteins 0.000 claims description 26
- 101150090370 ade4 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 101150100308 BAS1 gene Proteins 0.000 claims description 23
- 101100111953 Arabidopsis thaliana CYP734A1 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 101100165166 Barbarea vulgaris LUP5 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 101100337028 Arabidopsis thaliana GLX2-1 gene Proteins 0.000 claims description 21
- 101150108526 GLY1 gene Proteins 0.000 claims description 21
- 101150108970 ADE12 gene Proteins 0.000 claims description 20
- 101150078370 RIB3 gene Proteins 0.000 claims description 18
- 101150023562 RIB4 gene Proteins 0.000 claims description 18
- 101150098638 RNASE1 gene Proteins 0.000 claims description 17
- 101150076131 rib-1 gene Proteins 0.000 claims description 17
- 101100034382 Meyerozyma guilliermondii (strain ATCC 6260 / CBS 566 / DSM 6381 / JCM 1539 / NBRC 10279 / NRRL Y-324) RIB5 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101150087675 RIB5 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101150059964 RIB7 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 102100039832 Ribonuclease pancreatic Human genes 0.000 claims description 16
- 101150032602 mls-1 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 101150021392 rib-2 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- 101000741885 Homo sapiens Protection of telomeres protein 1 Proteins 0.000 claims description 13
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 13
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 13
- 102100038745 Protection of telomeres protein 1 Human genes 0.000 claims description 13
- 101150000555 FOX3 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 101100313649 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) POT1 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 12
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 12
- 101100009781 Danio rerio dmbx1a gene Proteins 0.000 claims description 11
- 101150064904 FOX2 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 101000824318 Homo sapiens Protocadherin Fat 1 Proteins 0.000 claims description 11
- 101150105372 POX1 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 102100022095 Protocadherin Fat 1 Human genes 0.000 claims description 11
- 102100038187 RNA binding protein fox-1 homolog 2 Human genes 0.000 claims description 11
- 101100194320 Zea mays PER1 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 101150007867 rbfox2 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100334009 Caenorhabditis elegans rib-2 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 4
- 241000723382 Corylus Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 108010039636 3-isopropylmalate dehydrogenase Proteins 0.000 claims 2
- 241001465323 Eremothecium ashbyi Species 0.000 claims 1
- 241001465310 Eremothecium coryli Species 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 136
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 118
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 70
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 28
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 25
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 24
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 24
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 21
- 101150109842 GUA1 gene Proteins 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 11
- 101710200424 Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 5'-xanthylic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 8
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 8
- 101150016674 prs2 gene Proteins 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 6
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 101150037371 BAS gene Proteins 0.000 description 5
- 101100260020 Caenorhabditis elegans mls-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100288173 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) prs1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 101100272204 Kalopanax septemlobus BAS1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100281518 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) fox-2 gene Proteins 0.000 description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 101100352341 Rubus idaeus PKS4 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000306 component Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 4
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 101001092200 Mus musculus RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 4
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 4
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 3
- 101100298222 Caenorhabditis elegans pot-1 gene Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 3
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 3
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100434663 Bacillus subtilis (strain 168) fbaA gene Proteins 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- 239000004470 DL Methionine Substances 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 101150095274 FBA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 101710122479 Isocitrate lyase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101150068888 MET3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100022915 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-11 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 2
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 2
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 2
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 101100465401 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SCL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100022918 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sua1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 2
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 2
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 2
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 2
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- -1 i.e. Proteins 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N methionine Chemical compound CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 2
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 2
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 2
- 239000007244 sp - medium Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 5-O-phosphono-alpha-D-ribofuranosyl diphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 0.000 description 1
- 108010056443 Adenylosuccinate synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100038910 Alpha-enolase Human genes 0.000 description 1
- 102100039239 Amidophosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000012905 Brassica oleracea var viridis Nutrition 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 208000006069 Corneal Opacity Diseases 0.000 description 1
- 241000155172 Cymbaria Species 0.000 description 1
- KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N Cys-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000028937 DNA protection Effects 0.000 description 1
- 241000235036 Debaryomyces hansenii Species 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000190474 Eremothecium sinecaudum Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 101150102561 GPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150064643 GPD gene Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 102000009127 Glutaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010073324 Glutaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000002667 Glycine hydroxymethyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010043428 Glycine hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000882335 Homo sapiens Alpha-enolase Proteins 0.000 description 1
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 1
- 101001040808 Homo sapiens Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic Proteins 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010087227 IMP Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000006674 IMP dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000566150 Pandion haliaetus Species 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 101150016461 SHM2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 102100021225 Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic Human genes 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003471 Vitamin B2 Natural products 0.000 description 1
- 206010047612 Vitamin B2 deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- NRAUADCLPJTGSF-ZPGVOIKOSA-N [(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[[(3as,7r,7as)-7-hydroxy-4-oxo-1,3a,5,6,7,7a-hexahydroimidazo[4,5-c]pyridin-2-yl]amino]-5-[[(3s)-3,6-diaminohexanoyl]amino]-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl] carbamate Chemical compound NCCC[C@H](N)CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(N)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1\N=C/1N[C@H](C(=O)NC[C@H]2O)[C@@H]2N\1 NRAUADCLPJTGSF-ZPGVOIKOSA-N 0.000 description 1
- POOGXHSMLJDKRF-SOOFDHNKSA-N [(3R,4R,5R)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-phosphonooxyoxolan-3-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC[C@H]1OC(OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O POOGXHSMLJDKRF-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005130 adenylosuccinate synthetase Human genes 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000006053 animal diet Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000007590 ariboflavinosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- VLMZMRDOMOGGFA-WDBKCZKBSA-N festuclavine Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(C)[C@@H]2C2)C)=C3C2=CNC3=C1 VLMZMRDOMOGGFA-WDBKCZKBSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000002864 food coloring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000032965 negative regulation of cell volume Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000004223 riboflavin deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000019164 vitamin B2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011716 vitamin B2 Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
Abstract
本发明涉及在被遗传修饰为增加鸟苷一磷酸合成酶活性的假囊酵母属生物体中生产核黄素的方法，包括在合适的培养基中生长所述生物体和从培养基分离核黄素。本发明还涉及通过遗传修饰所述生物体来提供属于假囊酵母属的累积核黄素的生物体，由此方法获得的生物体以及这种遗传修饰的生物体在提高核黄素的累积中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及在被遗传修饰为增加鸟苷一磷酸合成酶活性的假囊酵母属的生物体中生产核黄素的方法，包括在合适的培养基中生长所述生物体和从培养基分离核黄素。本发明还涉及属于假囊酵母属的遗传修饰的生物体，以及这种遗传修饰的生物体在提高核黄素的累积中的用途。
背景技术
所有植物以及许多微生物都生产核黄素。核黄素是细胞代谢的重要组分，因为它充当黄素辅酶黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体，这两者是氧化还原反应中的重要电子载体并参与感光，DNA保护等。包括人类在内的高等真核生物不能合成核黄素，故而核黄素是以维生素(维生素B2)的状态获得的。人类的维生素B2缺乏导致口腔和咽部粘膜炎症，瘙痒和皮肤褶皱的炎症以及皮肤损伤，结膜炎，视力敏锐度减退和角膜混浊。在婴儿和儿童中，可能会出现生长抑制和体重减轻。因此，必须向人或动物膳食中补充核黄素。因而核黄素被添加到饲料和食品中并且也可以用作食品色素，例如在蛋黄酱或冰淇淋中。
核黄素可通过化学或生物技术生产。化学方法合成核黄素是基于使用例如D-核糖作为起始原料的多步骤过程。生物技术方法生产核黄素是基于几种微生物自然合成核黄素(特别是在合适的原料如植物油的存在下)的潜能。被称为核黄素生产者的微生物包括无名假丝酵母(Candida famata)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和假囊酵母属物种(Stahmann,2010,Industrial Applications,The Mycota X，第二版，Springer,Berlin,Heidelberg，第235–247页)。
特别地，假囊酵母属(先前的棉阿舒囊霉属(Ashbya)；属于酵母科(Saccharomycetaceae)家族)的丝状半子囊菌(hemiascomycete)真菌被鉴定为有效的核黄素生产者。在过去几年中，已对生产核黄素的物种棉假囊酵母(Eremothecium gossypii)进行了深入研究和分析，并且已对其基因组测序。
在棉假囊酵母(E.gossypii)中，发现核黄素生产阶段与几个核黄素生物合成基因(例如RIB基因RIB 1、2、3、4、5和7)的转录的强劲增加相关联。因此，例如通过整合另外的拷贝，已经开发出过表达这些基因的核黄素生产菌株，如在WO 95/26406或WO 99/61623中所概述的。
此外，已经阐明了假囊酵母属的核黄素生物合成途径(Fischer and Bacher(2005)Nat.Prod.Rep.22:324-350)。根据对生物合成途径的更佳理解，可通过过表达编码苏氨酸醛缩酶的GLY1(Monschau等人(1998)Appl.Environ.Microbiol.64(11):4283-4290)以及破坏编码胞质丝氨酸羟甲基转移酶的基因SHM(Schlüpen等人(2003)Biochem J.369:263-273)来提高在假囊酵母属中的核黄素生产，这两者都干扰对生产核黄素是至关重要的GTP代谢(也参见图1和图2)(Stahmann,2010,Industrial Applications,The Mycota X,第二版,Springer,Berlin,Heidelberg,235–247)。发现经由干扰磷酸核糖胺合成来影响核黄素生产的再一个重要的调节基因是编码磷酸核糖基焦磷酸酰胺转移酶的ADE4，其可以被提供为反馈抗性版本(Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:5743-5751)。
然而，尽管有这些发展，但合成效率和生产的核黄素的量(特别是在假囊酵母属真菌的遗传背景下)仍非最佳，而对于食品级和饲料级核黄素的需求不断提高。
因此，需要允许在合适的生物体如假囊酵母属的真菌中进一步增加核黄素产量和累积的手段和方法。
发明目的和内容
本发明解决了这一需要并提供了在假囊酵母属的遗传修饰的生物体中生产核黄素的方法，其中所述修饰增加了鸟苷一磷酸合成酶的活性，并使得相比于不具有遗传修饰的生物体而言核黄素生产得到增加，所述不具有遗传修饰的生物体与被遗传修饰的生物体在相同条件下培养。
因此，本发明在第一方面提供了在假囊酵母属的生物体中生产核黄素的方法，所述生物体被遗传修饰为相比于不具有遗传修饰且与所述被遗传修饰的生物体在相同条件下培养的生物体而言增加了鸟苷一磷酸合成酶的活性，所述方法包括在合适的培养基中生长所述生物体和从培养基分离核黄素。
本发明人出人意料地发现，通过增加鸟苷一磷酸合成酶的活性，核黄素的生产或累积的显著增加成为可能。
使用假囊酵母属比使用其它微生物提供了若干优点。已经深入研究并分析了代表性的物种棉假囊酵母，其基因组已被测序，并存在若干可用的允许对其遗传操作和工程改造的分子工具。此外，可以证实假囊酵母属能够在不同的油源和含油废物(Park等人(2004)J.Amer.Oil Chem.Soc.81:57-62)，以及甘油(Ribeiro等人(2012)J.Basic Microbiol.52:582-589)中生长，从而允许高效率使用这些廉价的能源作为生产核黄素的原料。
在又一个方面，本发明涉及一种属于假囊酵母属的累积核黄素的生物体，其被遗传修饰为在所述生物体中的鸟苷一磷酸合成酶活性相比于不具有遗传修饰的生物体得以增加，所述不具有遗传修饰的生物体与被遗传修饰的生物体在相同条件下培养。
在如上定义的方法或生物体的优选实施方案中，被遗传修饰的生物体相比于不具有遗传修饰的可比较的生物体能够累积更多的核黄素，所述不具有遗传修饰的生物体与被遗传修饰的生物体在相同条件下培养。
在本发明的进一步优选的实施方案中，所述鸟苷一磷酸合成酶活性的增加是由于编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子的过表达。
在更优选的实施方案中，所述编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子的过表达是由强启动子(优选GPD启动子)完成，或通过在生物体的基因组中提供至少第二拷贝的编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子来完成。
在本发明的另一优选实施方案，所述编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子包括选自以下组中的核酸序列：
(a)根据SEQ ID No.1的核酸序列或其功能性部分；
(b)编码根据SEQ ID No.2的多肽的核酸序列或其功能性部分；和
(c)与根据SEQ ID No.1的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列。
在本发明的另一优选实施方案中，如上文所定义的所述遗传修饰的生物体包括至少一种另外的遗传修饰。
在一个特别优选的实施方案中，所述另外的遗传修饰导致选自下组的至少一种活性的改变：
(i)GLY1；
(ii)SHM2；
(iii)ADE4；
(iv)PRS 2,4；
(v)PRS 3；
(vi)MLS1；
(vii)BAS1
(viii)RIB 1；
(ix)RIB 2；
(x)RIB 3；
(xi)RIB 4；
(xii)RIB 5；
(xiii)RIB 7；
(xiv)FAT1；
(xv)POX1；
(xvi)FOX2；
(xvii)POT1/FOX3；
(xviii)ADE12；和
(xix)IMPDH。
在进一步优选的实施方案中，所述另外的遗传修饰导致至少一种下述改变：
(i)GLY1活性增加；和/或
(ii)SHM2活性降低或消除；和/或
(iii)ADE4活性增加和/或提供作为反馈抑制抗性的版本；和/或
(iv)PRS 2,4活性增加；和/或
(v)PRS 3活性增加；和/或
(vi)MLS1活性增加；和/或
(vii)BAS1活性降低或消除；和/或
(viii)RIB 1活性增加；和/或
(ix)RIB 2活性增加；和/或
(x)RIB 3活性增加；和/或
(xi)RIB 4活性增加；和/或
(xii)RIB 5活性增加；和/或
(xiii)RIB 7活性增加；和/或
(xiv)FAT1活性增加；和/或；
(xv)POX1活性增加；和/或；
(xvi)FOX2活性增加；和/或；
(xvii)POT1/FOX3活性增加；和/或；
(xviii)ADE12活性降低或消除；和/或
(xix)IMPDH活性增加。
在进一步的方面，本发明涉及编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子在增加核黄素在假囊酵母属的生物体中的累积中的用途。
在所述用途的优选实施方案中，编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子通过强启动子过表达，或者通过在生物体的基因组中提供至少第二拷贝的编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子来过表达。
在所述应用的进一步优选的实施方案中，编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子包括选自以下组的核酸序列：
(a)根据SEQ ID No.1的核酸序列或其功能性部分；
(b)编码根据SEQ ID No.2的多肽的核酸序列或其功能性部分；和
(c)与根据SEQ ID No.1的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列。
在另一个方面，本发明涉及使用如上文所定义的生物体生产核黄素。
在如上文所定义的方法、用途或生物体的特别优选实施方案中，所述属于假囊酵母属的生物体是物种阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyi)，榛针孢酵母(Eremotheciumcoryli)，Eremothecium cymbalariae，棉假囊酵母，Eremothecium sinecaudum或假囊酵母属物种CID1339。
附图的简要说明
图1绘示了靶向核黄素(维生素B2)的代谢通量。核黄素是从脂肪酸通过乙醛酸循环，糖异生，戊糖磷酸途径以及嘌呤和核黄素合成途径来生产(根据Kato and Park(2012)Biotechnol.Letters 34:611-618进行修改)。
图2示出了在棉假囊酵母中的从头嘌呤途径的示意图。
简称：ADE4，磷酸核糖焦磷酸(PRPP)转酰胺酶；ADE12，腺苷酸琥珀酸合成酶；IMD3，IMP脱氢酶；GUA1，GMP合成酶；IMP，肌苷一磷酸；XMP，黄苷一磷酸；GMP，鸟苷一磷酸；GTP，鸟苷三磷酸；AMP，腺苷一磷酸
图3绘示了为特异性增加GUA1的活性于棉假囊酵母基因组整合所产生的GUA1过表达模块。
简称：KanMX4，遗传抗性标记；homA/homB，基因组整合位点；loxP1和loxP2，CRE重组酶的重组位点；GPDp，棉假囊酵母GPD基因的启动子；GUA1，编码GMP合成酶的基因的5'部分
图4示出了相比于没有遗传修饰的参照菌株ATCC 10895，在棉假囊酵母GPD启动子控制下，在过表达GUA1基因的棉假囊酵母工程改造菌株ATCC 10895::GPDp-GUA1中的核黄素产量。
发明详述
本发明涉及允许通过使用属于假囊酵母属(先前的棉阿舒囊霉属(Ashbya))的被遗传修饰为增加鸟苷一磷酸合成酶活性的生物体来生产核黄素的改进的方法和手段。
虽然将针对特定实施方案来描述本发明，这种描述不应在局限的意义上进行解释。
在详细描述本发明示例性的实施方案之前，给出对于理解本发明重要的定义。如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”和“一个”也包括相应的复数形式，除非上下文另有明确说明。在本发明的上下文中，术语“大约”和“近似”表示本领域技术人员能够理解的仍确保所讨论特征的技术效果的精确度的区间。该术语通常表示从所指示的数值偏差±20％，优选±15％，更优选±10％，甚至更优选±5％。但应该理解的是，术语“包括”不是限制性的。出于本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包括”的优选实施方案。如果在下文中将一个组定义为包括至少某个数量的实施方案，这意味着还包括优选仅由这些实施方案组成的组。此外，在说明书和在权利要求中的术语“第一”，“第二”，“第三”或“(a)”，“(b)”，“(c)”，“(d)”等之类的被用来区分相似的要素并且不一定描述次序或时序。应当理解的是，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的并且在此描述的本发明的实施方案能够以除了本文描述或说明以外的其他次序来操作。如果术语“第一”，“第二”，“第三”或“(a)”，“(b)”，“(c)”，“(d)”，“i”，“ii”等涉及方法或用途或测定法的步骤，那么在步骤之间没有时间或时间间隔连贯性，即步骤可以同时进行或者这些步骤之间有可以存在几秒钟，几分钟，几小时，几天，几周，几个月甚至几年的时间间隔，除非在本申请中另有说明，如在上下文中提出。但是应当理解，本发明并不限于在此描述的具体方法，方案，反应试剂等，因为这些都可以变化。也可以理解的是，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意图限制本发明，其仅由所附的权利要求限定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常的理解相同的含义。
正如上文提到的，本发明在一个方面涉及在假囊酵母属的被遗传修饰的生物体中生产核黄素的方法，其中所述遗传修饰使鸟苷一磷酸合成酶的活性相比不具有遗传修饰且与所述被遗传修饰的生物体在相同条件下培养的生物体得以增加，所述方法包括：
(ⅰ)在合适的培养基中生长所述生物体；和
(ii)从培养基分离核黄素。
优选地，生物体是在脂肪酸油的存在下和任选在非脂质碳源存在下生长。
如本文所用的术语“属于假囊酵母属的生物体”或“假囊酵母属生物体”指的是任何属于假囊酵母属的生物体，假囊酵母属以前被称为棉阿舒囊霉属和/或与棉阿舒囊霉属同义。这个组至少包括物种阿舒假囊酵母，榛针孢酵母，Eremothecium cymbalariae，棉假囊酵母(先前的Ashbya gossypii)，Eremothecium sinecaudum和假囊酵母属物种CID1339。进一步包括这些物种的变体、克隆或基于这些物种的修饰的生物体。
如本文所用的术语“修饰的生物体”指的是假囊酵母属的野生型物种通过诱变和选择和/或基因工程改造的修饰，或者指的是已被遗传修饰的生物体的进一步修饰，例如为增加核黄素的生产而之前工程改造过一个或多个基因的假囊酵母属菌株，或者为任何其他目的被修饰或工程改造过的假囊酵母属菌株。该术语具体包括通过普通的诱变方法如化学或UV诱变或差异诱变获得的假囊酵母属种。在优选的实施方案中，假囊酵母属的生物体是棉假囊酵母，而在更优选的实施方案中是棉假囊酵母的菌株ATCC 10895。
如本文使用的术语“不具有遗传修饰的生物体”指的是没有为了增加鸟苷一磷酸合成酶活性而进行过遗传修饰，并且除此之外，与本发明的被遗传修饰的生物体具有相同的遗传组成的生物体，即与本发明的被遗传修饰的生物体的唯一的遗传差异是本发明的遗传修饰。因此，不具有遗传修饰的生物体是引入本发明遗传修饰的亲本菌株，优选是棉假囊酵母菌株ATCC 10895。亲本菌株可以不包括任何遗传修饰，或者可以包括除本发明以外的遗传修饰。
如本文使用的术语“在合适的培养基中生长所述生物体”指的是使用任何本领域技术人员已知的、允许如本文所限定的生物体生长并且适合核黄素的合成和/或累积的合适的手段和方法。生长可以按分批工艺或连续发酵工艺进行。优选地，生物体是在脂肪酸油的存在下和任选在非脂质碳源存在下生长。
进行分批或连续发酵工艺的方法是本领域技术人员公知的，并在文献中有描述。培养可以在特定的温度条件下进行，如在15℃和45℃之间，优选在20℃至40℃或15℃和30℃，更优选在20℃和30℃之间，最优选在28℃。在另一个实施方案中，培养可以在广泛的pH范围进行，例如，在pH 6和pH 9之间，优选在pH 6.5和8.5之间，更优选在6.7和7.5之间，最优选在6.8和7之间。
如本文所用的术语“脂肪酸油”指的是废油、非食用油或廉价的种子油。这样的油的优选例子是大豆油或菜籽油。脂肪酸油可以任何合适的量或浓度存在于培养基中，例如以5％(v/v)至40％(v/v)的浓度，例如以5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％、25％、27.5％、30％、32.5％、35％、37.5％或40％的浓度。优选使用约10％的浓度。
如本文所用的术语“在非脂质碳源存在下”指的是培养是在尽管不属于脂质的组却提供碳原子源的营养物质的存在下进行。优选的是，培养可以在糖营养物质存在下进行，如在葡萄糖、蔗糖、果糖等存在下进行。
在进一步具体的实施方案中，培养基可包含附加物质。这种附加物质的一个例子是大豆粉。大豆粉可优选以1％(w/v)-5％(w/v)的浓度来提供，例如1％、2％、3％、4％、5％(w/v)。大豆粉是一种复合培养基，其典型地包括蛋白质、碳水化合物和盐。
附加物质的另一个例子是甘氨酸。甘氨酸优选以1％(w/v)-5％(w/v)的浓度来提供，例如1％、2％、3％、4％、5％(w/v)。
在一个非常具体的实施方案中，培养基可包含以下成分：酵母提取物、大豆粉、甘氨酸、谷氨酸钠、KH2PO4、MgSO4、DL-甲硫氨酸、肌醇、甲酸钠、尿素和大豆油。在特别优选的实施方案中，培养基可包含如下面实施例中所述的浓度和量的成分。
如本文所用的术语“从细胞和培养基中分离核黄素”指的是任何用于从细胞中提取核黄素并将核黄素与细胞碎片和培养基成分分离的适当的方法。在优选的实施方案中，分离可以按在Stahmann，Industrial Applications，第二版，The Mycota X,M.Hofrichter(编辑),Springer Verlag Berlin Heidelberg,2010，第235-247页中所述来进行。纯化方法也描述于US 4,165,250；Kale等人(2008)Biotechnology and Fermentation Process,Osprey Publishing；EP 0730034A1以及WO 2005/014594。
如本文所用的术语“生产核黄素”意指假囊酵母属生物体能够合成并累积核黄素。术语“累积核黄素”意指合成的核黄素被存储在细胞内和/或排出到周围介质中，在这两种情况下导致在细胞培养物中的核黄素浓度的整体增加。在具体的实施方案中，累积可在合适的分离工艺之后变得可辨别，在所述工艺中获得由细胞产生的所有核黄素，即包括储存在细胞内的核黄素和排出的核黄素。这样的工艺已经如上文所述。
在本发明的上下文中所指的核黄素生产，典型地与野生型生物体中的核黄素合成是不同的，也就是说，它指的是相比假囊酵母属的野生型菌株是核黄素高产。假囊酵母属的野生型菌株通常每升细胞培养物产生约50至100mg核黄素，特别是在如上文或在实施例中定义的细胞培养条件下。如本文所用的术语“高产”指的是每升细胞培养物的核黄素生产超过约50至100mg。术语“核黄素高产生物体”或“核黄素高产菌株”相应地指的是每升细胞培养物生产超过约50mg核黄素的假囊酵母属生物体或菌株。
如本文所用的术语“核黄素”指的是化合物7,8-二甲基-10-(D-1'-核糖醇基(ribityl)-)异咯嗪及其衍生物。术语“衍生物”指的是7,8-二甲基-10-(D-1'-核糖醇基-)异咯嗪的任何化学修饰形式。这样的衍生物可以是，例如酯、醚、酸、脂质、糖基化形式或盐形式。这些衍生物可以由假囊酵母属生物体本身提供，例如在另外的生化反应中，或可以形成在培养基中，例如由存在于所述培养基中的反应物提供。在具体的实施方案中，核黄素可以以结晶形式提供。这种核黄素晶体可以典型地在细胞中累积。
假囊酵母属细胞(或任何其它微生物细胞，例如其他来源的对照细胞)的核黄素含量的测定，以及在培养基中的核黄素含量的测定，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来进行。
在细胞培养物中的核黄素含量的测定(因而也指示每升培养物中以mg计的核黄素的量或累积(包括细胞中的核黄素量)，如上文或下文所述)在优选的测定方法中是基于培养过程和随后的测试过程，该过程包括以下步骤：通常将装有10ml预培养培养基(55g酵母提取物50，0.5g MgSO4，用NaOH调节至pH值7.0，并装入950ml H2O；9.5ml该培养基+0.5ml菜籽油)装入100ml没有挡板的锥形瓶中。烧瓶通常接种在SP培养基板生长了3-4天的遗传修饰的棉假囊酵母或野生型菌株的菌丝体(1cm2)。随后将烧瓶在约30℃和200rpm下孵育约40h。随后，用1ml预培养物接种在250ml有平挡板的锥形瓶中的约25ml主培养培养基(30g酵母提取物50，20g大豆粉，10g甘氨酸，7g谷氨酸钠，2g KH2PO4，0.5g MgSO4，1.1g DL-甲硫氨酸，0.2g肌醇，2.1g甲酸钠，用NaOH调节至pH7.0并装入965ml H2O；21.2ml主培养培养基+2.8ml菜籽油+0,83ml尿素溶液)。通常称量所有烧瓶以确定孵育前的质量。典型地将培养物在约30℃和200rpm培养约6天。孵育后，通常再次称量烧瓶以确定孵育后的质量，因此，能够计算在培养期间的蒸发效果。该方法可以以多个并行的次序进行，优选5个或更多，更优选10或更多个平行培养物或克隆。测量和进一步培养可优选以三个重复进行，或者至少两个重复以将在培养物中的统计差异考虑在内。
随后，可以通过合适的光度测定法来确定整个生产培养物的核黄素含量，即包括细胞的核黄素含量(也包括核黄素的任何结晶形式)以及从细胞排出的并存在于培养基中的核黄素。在优选的测定法中，可采用光度测定法，其基于根据上述过程(或根据任何其他培养过程)获得的培养基与烟酰胺溶液的反应。优选地，将250μL的培养物与约4.75mL的40％烟酰胺溶液混合。随后，可在升高的温度，如在约60至80℃，优选在约70℃，孵育混合物例如约30至60min，优选40min。培养优选在黑暗中进行。随后，可以冷却样品(例如约5min)，并与水(例如3ml水)混合。消光的光度测定可在440或450nm的波长进行。
在进一步的实施方案中，可以通过HPLC执行核黄素测定，例如按Schmidt等人(1996)Microbiology 142:419-426所描述的。
本发明也设想这种方法的替代和变型，以及与上面公开的方法不同的核黄素测定方法。这种进一步的替代法是本领域技术人员已知的并且可以从适合的教科书或文献来源获取。
如本文所用的术语“遗传修饰假囊酵母属生物体”或“假囊酵母属的遗传修饰的生物体”意指假囊酵母属生物体通过本领域技术人员已知的任何合适的遗传手段和方法被改变以生产核黄素，特别是增加核黄素的生产。类似地，如本文所用的术语“遗传修饰的假囊酵母属生物体”意指假囊酵母属生物体已通过本领域技术人员已知的任何合适的遗传手段和方法被修饰或改变，使得其合成并累积核黄素，尤其使得其增加核黄素的合成和累积。遗传修饰属于假囊酵母属的生物体的方法是本领域技术人员已知的，并且在文献中有描述。它们包括通常使用的用于向假囊酵母属引入遗传元件或材料以便其被容纳在假囊酵母属细胞中，整合到染色体或在染色体外的方法(参见，例如，Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:5743-5751)，或者除去或破坏或修饰存在于假囊酵母属基因组中的遗传元件或序列的方法(参见，例如.Wendland等人(2000)Gene 242:381-391和Mateos等人(2006)Appl.Environ.Microbiol.72:5052-5060)。
如本文所用的术语“遗传元件”意指任何能够输送遗传信息的分子单元。它相应地涉及基因，优选天然基因、嵌合基因、外源基因、转基因或密码子优化的基因。术语“基因”指的是表达特定蛋白的核酸分子或片段，优选它是指包括编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列的核酸分子。术语“天然基因”指的是在自然界(如在假囊酵母属的野生型菌株中)发现的具有自己的调控序列的基因。术语“嵌合基因”指的是任何不是天然基因且包括未在自然界中一起发现的调控序列和编码序列的基因。因此，嵌合基因可包括来自不同来源的调控序列和编码序列，以及来自相同来源但以不同于天然存在方式排列的调控序列和编码序列。根据本发明，“外源基因”指的是通常未在假囊酵母属宿主生物中发现、但通过基因转移被引入到假囊酵母属宿主生物中的基因。外源基因可以包括插入到非天然生物体的天然基因，或嵌合基因。术语“转基因”指的是已通过转化方法被引入到基因组中的基因。
“密码子优化的基因”是将其密码子使用频率设计为模拟在宿主细胞中优选的密码子使用频率的基因，优选该密码子使用频率已对属于假囊酵母属的生物体的密码子使用频率，更优选棉假囊酵母的密码子使用频率进行了改编。在本发明具体的实施方案中，也可以修饰密码子使用以建立某个基因的一级(核苷酸)编码序列与存在于假囊酵母属中的野生型序列的偏差，同时保持二级(氨基酸)序列相同或几乎相同。为增加基因的表达，可进行在这些实施方案中的密码子使用的修饰。另外，或备选地，密码子使用的修饰可以进一步用于最大化核苷酸序列水平的差异，即，为了保持氨基酸序列相同或几乎相同的同时，提供在核苷酸水平的最小相似序列。术语“几乎相同”意指可以存在相对于所编码的蛋白质的酶功能或生物功能而言，没有或仅有边际效应的氨基酸交换。这样的效应可以用本领域技术人员公知的适当的方法进行测试。
术语“编码序列”指的是编码特定的氨基酸序列的DNA序列。术语“调控序列”指的是位于编码序列上游(5’非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性，或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、增强子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
术语“启动子”指的是能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA节段。通常情况下，由于调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。本领域技术人员应理解的是，不同的启动子可以指导在不同发育阶段的基因表达或应答不同的环境或生理条件。致使基因在大部分时间、在大多数细胞类型中被表达的启动子通常被称为组成型启动子。另一方面，致使基因只在特定情况下，如基于特定因子的存在、生长阶段、温度、pH或特定代谢物等的存在下，才表达的启动子被理解为调控型启动子。
术语“3'非编码序列”指的是位于编码序列下游的DNA序列。它包括多腺苷酸化识别序列和其他编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。聚腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3'端。3'区可以影响转录，即RNA转录本的存在，RNA加工或稳定性，或相关编码序列的翻译。术语“RNA转录本”指的是从RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所得到的产物。当RNA转录本是DNA序列的完全互补拷贝时，它被称为初级转录本，或者它可以是源自初级转录本的转录后加工的RNA序列并且被称为成熟RNA。术语“mRNA”指的是信使RNA，即无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。
术语“有效连接”指的是在单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得一个的功能受到另一个的影响。在启动子的上下文中，该术语意指编码序列是在启动子的转录控制之下。用于驱动在假囊酵母属的生物体中的基因表达的调控元件是本领域技术人员已知的，并且在文献中被广泛描述(参见，例如，Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:5743-5751或Maeting等人(1999)FEBS Letters 444:15-21)。在优选的实施方案中，编码序列有效连接到GPD启动子。
在本发明的核心实施方案中，假囊酵母属生物体的遗传修饰增加了鸟苷一磷酸合成酶的活性。
如本文所用的术语“鸟苷一磷酸合成酶”是与诸如鸟苷酸合成酶，XMP氨基酶，黄苷5'-一磷酸氨基酶的术语是同义的。它指的是在谷氨酰胺和ATP的存在下催化黄苷5'-一磷酸的胺化以形成鸟苷一磷酸的酶。其产物鸟苷一磷酸被用于生产核黄素所需的GTP的从头合成。
在本发明的优选实施方案中，鸟苷一磷酸合成酶活性是通过包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者其功能性部分或片段，基本上由其组成或由其组成的多肽提供，或者由包含SEQ ID NO：1或其功能性部分或片段的核苷酸序列，基本上由其组成或者由其组成的核酸编码，或者是由包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其功能性部分或片段具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成的多肽提供，或者是由包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其功能性部分或片段具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸编码。
本文所公开的所有序列已从棉假囊酵母菌株ATCC 10895获得。
SEQ ID No.2的氨基酸序列的功能性片段具有至少200或250个氨基酸长度，优选为至少300或350个氨基酸，更优选至少400或450个氨基酸并且最优选至少480或500个氨基酸。来自不同生物体的鸟苷5'-一磷酸合成酶的结构分析表明，谷氨酰胺酶活性位点包含在蛋白质N末端部分的保守的Cys-His-Glu催化三联体。在根据SEQ ID No.2的鸟苷5'-一磷酸合成酶中，这三个氨基酸位于SEQ ID No.2的位置89，176和178，使得如上所定义的功能性片段优选地位于SEQ ID No.2的残基50和250之间，更优选功能性片段位于SEQ ID No.2的残基40和290之间或SEQ ID No.2的残基30和330之间，甚至更优选功能性片段位于SEQ IDNo.2的残基20和370之间或SEQ ID No.2的残基10和410之间，最优选功能性片段位于SEQID No.2的残基5和455之间或SEQ ID No.2的残基3和503之间。
在替代实施方案中，提供鸟苷5'-一磷酸合成酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且其包括在对应于SEQ ID NO：2的位置89的位置上的半胱氨酸残基，在对应于SEQ ID NO：2的位置176的位置上的组氨酸残基以及在对应于SEQ ID NO：2的位置178的位置上的谷氨酸残基。
在本发明的含义中，“序列同一性”表示一个核酸分子中相比于另一核酸分子在5'-3'序列的一致性程度。序列同一性可使用基于各种算法的一系列的程序来测定，如BLASTN，ScanProsite，激光基因软件等等。作为替代方案，可以默认参数使用美国国家生物技术信息中心的BLAST程序包(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此外，可采用使用“dirtydata”-算法进行序列比较的程序Sequencher(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI,USA)。
序列同一性指的是在根据SEQ ID No.1的核酸序列中超过300、400或500个核苷酸，优选600、700、800、900或1000个核苷酸，更优选1100、1200、1300、1400、1500或1550个核苷酸长度，最优选全长的序列同一性程度。
序列同一性指的是在根据SEQ ID No.2的核酸序列中超过150、200或250个氨基酸，优选300、330、350、380或400个氨基酸，更优选420、440、460、480、500、510或520个氨基酸长度，最优选全长的序列同一性程度。
如本文所用的术语“活性增加”或“量增加”指的是编码酶活性的遗传元件的任何修饰，例如，在分子基础上，由所述遗传元件表达的转录本，由所述遗传元件编码的蛋白或酶活性，这导致了所述酶活性的增加，所述酶活性在细胞中的浓度的增加和/或所述活性的功能的改善。活性可以用适当的测试或测定法测量，这是技术人员公知的，也可从适当的文献来源获取。为了测量鸟苷5'-一磷酸合成酶的活性，可以制备细胞裂解物并与鸟苷5'-一磷酸合成酶，ATP和谷氨酰胺孵育并且可以测定鸟苷5'一磷酸的生产速率。合适的测定法描述于Moyed and Magasanik(1957)J.Biol.Chem.226:351–363；Spector(1978)Meth.Enzvmol.51:219-224以及Bhat等人(2011)FEBS J.278:3756-3768。
编码酶活性的遗传元件的修饰，相比于不具有本发明遗传修饰的生物体，优选用作向其中引入本发明遗传修饰的亲本生物体的生物体，例如，可以致使酶活性增加约2％、5％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或超过1000％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，这种活性的增加是由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其如上文定义的同源序列所表示，包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其如上文定义的同源序列所表示，基本上由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其如上文定义的同源序列组成的氨基酸序列所表示，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其如上文定义的同源序列组成的氨基酸序列所表示。
在具体的实施方案中，活性的增加是由于产生如上所述的活性的遗传元件的表达，特别是过表达。如本文所用的术语“表达”指的是从源自本文所述的核酸分子或基因的有义链(mRNA)的转录和累积。更优选地，该术语还指mRNA翻译成多肽或蛋白质并在细胞内相应提供此类多肽或蛋白质。在典型的实施方案中，表达可以是过表达。术语“过表达”涉及在相同生物体的情境下，相比于表达产生所述多肽或蛋白质的遗传元件的内源拷贝的表达时，有更多转录本，特别是更多的多肽或蛋白质的累积。在进一步的替代实施方案中，该术语也可以是指相比于典型的适度表达的持家基因如β-肌动蛋白或β-微管蛋白的表达，有更多转录本，并且特别是更多的多肽或蛋白质的累积。
在特别优选实施方案中，鸟苷5'-一磷酸合成酶活性的增加是由于编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸分子的过表达。
在优选的实施方案中，相比于不具有本发明遗传修饰的生物体，优选用作向其中引入本发明遗传修饰的亲本生物体的生物体的转录率，如上所述的过表达可导致基因的转录率增加约2％、5％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或大于1000％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，这种基因的转录率的增加可以被提供给SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列的转录本。
在进一步优选的实施方案中，相比于不具有本发明遗传修饰的生物体，优选用作向其中引入本发明遗传修饰的亲本生物体的生物体，过表达可导致基因的mRNA的量增加约2％、5％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或大于1000％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，这种基因的mRNA的量的增加，可以被提供给用于SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列的转录本。在优选的实施方案中，增加的mRNA的量指的是包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列，基本上由其组成或由其组成的mRNA。
在又一个优选的实施方案中，相比于不具有本发明遗传修饰的生物体，优选用作向其中引入本发明遗传修饰的亲本生物体的生物体，过表达可导致由该过表达基因所编码的鸟苷5'-一磷酸合成酶多肽或蛋白的量增加约2％、5％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或大于1000％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，量增加的多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其如上文定义的同源序列表示，包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其如上文定义的同源序列所表示，基本上由SEQ IDNO：2的氨基酸序列或其如上文定义的同源序列组成的氨基酸序列所表示，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其如上文定义的同源序列组成的氨基酸序列所表示。
如上文所定义的过表达，在一个实施方案中，可以通过使用如上文定义的启动子而完成。本发明设想的可用于如本文所述的基因过表达的启动子可以是组成型启动子或调节型启动子。优选的启动子是内源性假囊酵母属启动子。在具体的实施方案中，启动子也可以是异源启动子或合成启动子，例如强异源启动子或调节型异源启动子。启动子可以有效连接至编码序列，例如编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸序列。在一个优选的实施方案中，“启动子”指的是能够控制编码序列的表达、其DNA序列在假囊酵母属，更优选在棉假囊酵母中是有活性的DNA序列。
可以在本发明的上下文中使用的合适的启动子包括组成型TEF1启动子、组成型CTS2启动子、组成型RIB3启动子和组成型GPD启动子。进一步设想合适的启动子的例子包括糖酵解途径的强组成型启动子如FBA1、PGK1、或ENO1启动子，或强组成型RIB4启动子。还优选的是使用调节型MET3启动子和葡萄糖阻遏ICL1启动子。特别优选的是GPD启动子。更优选地，GPD启动包括根据SEQ ID NO.45的序列或其与根据SEQ ID NO.45的启动子具有基本上相同的启动子活性的功能性片段。
所有上述优选的启动子都是内源性棉假囊酵母启动子。这些启动子在特定的实施方案中，也可以在假囊酵母属的其它生物体的情境中使用。进一步的细节是本领域技术人员已知的或者可从适当的文献来源获取，例如，Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:5743-5751。
在一个特别优选的实施方案中，编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸的过表达是由强启动子完成。在本发明的意义中，术语“强启动子”意在指的是具有比有效连接到待在野生型生物体中过表达的核酸分子的启动子活性更高的活性的启动子，如具有比内源性鸟苷5'-一磷酸合成酶基因的启动子更高的活性的启动子。优选的是，强启动子的活性比有效连接到要在野生型生物体中过表达的核酸分子的启动子活性高约2％、5％、8％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或大于1000％，例如具有比内源性鸟苷5'-一磷酸合成酶基因的启动子更高活性的启动子。本领域技术人员知晓如何测定启动子活性，并比较不同的启动子的活性。为了这个目的，启动子通常被有效连接到编码报告蛋白例如萤光素酶、绿色萦光蛋白或β-葡萄糖醛酸酶的核酸序列并且测定报告蛋白的活性。
用于本发明的强启动子的例子是TEF1启动子、CTS2启动子、RIB3启动子、GPD启动子、FBA1启动子、PGK1启动子、MET3启动子、ICL1启动子和RIB4启动子。特别优选GPD启动子。更优选地，GPD启动子包括根据SEQ ID NO.45的序列或其与根据SEQ ID NO.45的序列具有基本上相同的启动子活性的功能性片段。
在具体的实施方案中，启动子也可以是异源启动子或合成启动子，例如强异源启动子或调节型异源启动子。
如上文所定义的过表达，在进一步的实施方案中，可通过在基因组中提供遗传元件的一个以上的拷贝来完成。这样的第二、第三、第四、第五或更多拷贝的核酸序列可以是与内源的遗传结构完全或几乎相同的拷贝，或者它们可以构成其重组修饰。例如，被过表达的核酸序列如编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸序列可与其基因组环境一起获取，优选包括其启动子结构，任选地还包含如上文所定义的3'非编码序列或如上文所定义的额外的5'非编码序列，如增强子元件等，它们来自靶标假囊酵母属生物体的基因组，或来自近亲，例如如果靶标不是棉假囊酵母则来自棉假囊酵母。同源侧翼可以在大约100到500bp的范围内使用。然而，原则上也可以使用更小的侧翼或更大的侧翼，如高达1000bp或大于1000bp。
如上所述的第二或更多拷贝的基因可以随后被重新引入生物体中并放置在染色体上。整合位点可以是在原始拷贝附近，或者，优选地，在不同的位置。可以通过对整合所必需的同源侧翼的选择来预先选定插入。插入位点可以相应地根据基因组中已知的特征来确定，例如染色体区域的转录活性，染色体区域的甲基化状态，与第一拷贝(原始基因)的潜在距离，第一拷贝(原始基因)的方向，更多的插入基因的存在等等。优选的是插入位点是在基因间区域和/或使用转录活性位点。在某些实施方案中，优选不修饰已知基因(尤其是必需基因)的ORF和/或调节区。
在某些实施方案中，附加的拷贝可以以串联重复的形式提供，但优选使用非串联重复。由于在假囊酵母属的基因组中的重组过程，进一步优选的是保持原始拷贝和基因的第二或更多的拷贝尽可能不同和/或尽可能远。这种差异可以基于使用不同的启动子，基因的基因组侧翼的修饰，或者，在特定的实施方案中，基因的第二拷贝相对于第一拷贝(原始版本)的核苷酸序列修饰，或基因的第三拷贝相对于第二拷贝和/或第一拷贝(原始版本)的核苷酸序列修饰等。这种核苷酸序列的修饰可以被完成，例如，经由基因的密码子使用的修饰，例如，如上文所定义。具体而言，可以以增加或最大化核苷酸序列水平的差异为目的来修饰密码子使用，即，为了在保持氨基酸序列相同或几乎相同的同时，提供在核苷酸水平不太相似或最小相似的序列。在要将同一基因的两个以上拷贝引入基因组的情况下，可调整被引入的所有拷贝的密码子使用使得所有拷贝之间的差异最大化，例如原始版本与拷贝2以及与拷贝3之间的差异最大化。在超过3个拷贝的情况下亦可如此。
在特别优选的实施方案中，鸟苷5'-一磷酸合成酶核酸分子的过表达是通过在假囊酵母属的基因组中提供鸟苷5'-一磷酸合成酶核酸分子的至少第二拷贝来完成。
如上文所定义的过表达，在进一步的实施方案中，可由密码子使用的优化来完成，例如通过如上文定义的基因的密码子使用对在生物体中被转录或表达最多，或者最高度表达的基因(相比于持家基因如β-肌动蛋白或β-微管蛋白)的密码子使用进行改编。此类高度表达的基因的密码子使用的实例可以包括假囊酵母属生物体，优选棉假囊酵母的一组5、10、15、20、25或30或更多的最高度表达的基因的密码子使用。
过表达可进一步通过相对于假囊酵母属生物体，优选棉假囊酵母，的所有或几乎所有，或90％或80％或75％或70％的转录基因的整体密码子使用来优化密码子使用而实现。这样的方法可以涉及基因的密码子使用的检查和与衍生自假囊酵母属生物体优选棉假囊酵母，的基因组序列(特别是生物体如棉假囊酵母的注释的基因组序列)的整体密码子使用的比较。
过表达可以进一步通过双密码子使用的改编，即ORF内所有两个连续密码子的频率改编来实现。靶基因的双密码子使用可相应地改编于在生物体中高度表达的基因(相比于持家基因如β-肌动蛋白或β-微管蛋白)的双密码子使用。这样的高度表达的基因的双密码子使用的实例可以包括假囊酵母属生物体优选棉假囊酵母的一组5、10、15、20、25或30个或更多最高度表达的基因的双密码子使用。双密码子使用的改编可有助于避免mRNA的降解信号或其它影响转录本的稳定性的转录本部分，因为这样的基序通常超过3个核苷酸长，因此可以在双密码子中被识别，而它们可能逃过密码子的注意。
过表达可以进一步通过三密码子使用的改编，即ORF内三个连续的密码子的频率改编来实现。靶基因的三密码子使用可相应地改编于在生物体中高度表达的基因(相比于持家基因如β-肌动蛋白或β-微管蛋白)的三密码子使用。这样的高度表达的基因的三密码子使用的实例可以包括假囊酵母属生物体优选棉假囊酵母的一组5、10、15、20、25或30个或更多最高度表达的基因的三密码子使用。
也设想的是提供靶基因的两个密码子修饰的版本，即原始的内源性拷贝和任何进一步的拷贝可以都被修饰，使得在修饰方法后在基因组中不存在基因的原始版本。这种方法可导致核苷酸序列的进一步的区分和/或增加靶基因的表达力或转录。
在特别优选的实施方案中，鸟苷5'-一磷酸合成酶核酸分子的过表达是由在假囊酵母属的基因组中的第二拷贝的鸟苷一磷酸合成酶核酸序列的密码子使用、二密码子使用或三密码子使用的改编来完成。
为了提高鸟苷5'-一磷酸合成酶的活性的遗传修饰，例如导致如上文或下文所述的基因过表达的修饰，可通过本领域技术人员公知的任何适当的方法来进行。
可用于此上下文中的典型的方法是靶向同源重组。例如，鸟苷5'-一磷酸合成酶基因的修饰版本，例如包括代替了原始启动子的组成型启动子的版本，或包含原始启动子或不同的启动子(例如，如上文所提及的组成型启动子)的另外的拷贝的鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸序列，其侧翼可以是与在其位置应该发生插入的内源性靶多核苷酸序列(例如，基因的编码区或调节区)同源的DNA。这样的构建体可以具有或没有选择标记和/或具有或没有阴性选择标记来转化假囊酵母属细胞。通过靶向同源重组而进行的DNA构建体的插入可以导致靶基因的修饰版本插入到原始基因的座位，或靶基因的另外的拷贝插入到基因组的不同位置。在后一种情况下，应整合第二或更多拷贝的位置处的同源序列可以用于转化构建体。在具体的实施方案中，同源转化也可用于基因失活，例如通过引入抗性标记或其他敲除盒来替换基因组中原始存在的ORF。
术语“转化”指的是遗传元件，通常是核酸分子(例如包含用于同源重组的构建体的特定盒)，或者是染色体外元件(例如载体或质粒)转移到假囊酵母属细胞，即进入如上文所限定的假囊酵母属的生物体中，其中所述转移造成基因稳定的遗传。假囊酵母属细胞转化条件和相应的技术是本领域技术人员已知的。这些技术包括化学转化，优选乙酸锂转化，如，例如，获取自Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:5743-5751，原生质体融合，弹道冲击转化，电穿孔，显微注射，或任何其他将目的基因或核酸分子导入真菌细胞的方法。
转化的细胞可具有至少一个拷贝的引入的遗传元件，或者可具有两个或更多个拷贝，这取决于遗传元件在何处以及如何整合到基因组中。在过表达构建体的上下文中，优选的是转化导致单拷贝的过表达构建体或表达盒插入基因组中。还设想的是导入两个或更多个拷贝。这种第二或第三拷贝的特定基因或基因表达构建体应优选与第一拷贝在其核苷酸序列上不同，但编码相同氨基酸序列或基本上相同的氨基酸序列。
优选地，转化的细胞可以通过选择在引入的遗传元件上包含的标记来进行鉴定。备选地，单独的标记构建体可以与所需的遗传元件共转化。通常，可选择被转化的细胞在选择培养基上生长的能力。选择培养基可掺入抗生素或缺乏未转化的细胞生长所必需的因子，例如营养或生长因子。导入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化的宿主中表达时，允许在选择培养基上生长。如果可以直接或间接地检测被表达的标记蛋白，那么可通过检测标记蛋白来选择转化的细胞。
标记蛋白可以单独表达或与另一种蛋白质融合表达。标记蛋白可以被检测，例如，通过其酶活性。备选地，抗体可用于检测标记蛋白，或者例如，目的蛋白上的分子标签。表达标记蛋白或标签的细胞，可以，例如，在视觉上，或通过诸如FACS或使用抗体的淘选技术来选择。优选地，也可以使用任何在假囊酵母属的细胞中发挥功能的适当的标记，如本领域技术人员已知的。更优选地，可采用提供抗卡那霉素、潮霉素、氨基糖苷G418或诺尔丝菌素(也称为NTC或ClonNAT)抗性，以及具有在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸或色氨酸的培养基上生长能力的标记。当使用如上所述的选择标记，如G418或ClonNAT抗性标记，或者任何其他合适的标记时，可使用Cre-lox体系的序列，其是标记两端的侧翼。在Cre重组酶表达时，该体系允许在遗传元件(例如，过表达盒)插入后的选择标记消除和随后的再利用。还设想的是使用本领域技术人员应该公知的其他类似的重组酶体系。
在具体的实施方案中，标记也可以与位点特异性核酸酶的靶位点结合，如锌指核酸酶(ZFN)或能够在体内切割特异的DNA靶序列的大范围核酸酶。这种体系的具体的例子是TALEN(转录激活子样效应子核酸酶)体系，即人工限制酶，它是由将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合产生的。TAL效应子是通常由黄单胞菌或相关物种分泌的，或由其衍生的并已被修饰的蛋白质。TAL效应子的DNA结合结构域可包含高度保守的序列，例如约33-34个氨基酸，除了高度可变的第12和第13个氨基酸(重复可变区(Repeat VariableDiresidue)或RVD)，并且通常显示出与特定核苷酸识别的很强的相关性。在这个原则的基础上，DNA结合结构域可以通过选择含有对应于过表达靶基因DNA序列的重复可变区的重复节段的组合来设计。TALEN DNA切割结构域可以衍生自合适的核酸酶。例如，可使用来自FokI内切核酸酶或者来自FokI内切核酸酶变体的DNA切割结构域来构建杂交核酸酶。由于以二聚体发挥功能的FokI结构域的特殊性，TALENS可以优选地提供为独立的实体。
在具体的实施方案中，TALEN DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数目和两个个体TALEN结合位点之间的碱基数目可以根据插入到假囊酵母属基因组中的构建体的序列进行修饰或优化，以提供高水平的活性。TALENS或TALEN组分可被工程改造或修饰，以靶向任何所需的DNA序列，如包括在要过表达的基因的同源端之间的选择标记的DNA序列。重组所需的酶活性可以或者按这样提供(例如类似于在假囊酵母属中已建立的REMI法)，或者它可以与在构建体中的选择盒一起提供，导致其在核酸酶活性开始时被除去。工程改造可以按照适当的方法进行，例如描述于Zhang等人(2011)NatureBiotechnology 29:143–148或Reyon等人(2012)Nature Biotechnology 30:460–465。
另一种用于从假囊酵母属细胞的基因组中除去标记序列的系统是CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)/CAS(CRISPR关联的)系统，其已经显示出促进RNA指导的位点特异性DNA切割并且其可以用于基因组工程改造(参见，例如，Sander and Young(2014)NatureBiotechnol.32:347-355)。该系统采用Cas9作为核酸酶，其由crRNA和tracrRNA指导来切割特定的DNA序列。成熟的crRNA：tracrRNA复合物经由在crRNA上的间隔序列和在靶DNA上的前间区序列(protospacer)之间的碱基配对，将Cas9引导至靶DNA，所述靶DNA毗邻前间区序列邻近基序(PAM)。Cas9然后介导靶DNA的切割以产生前间区序列内的双链断裂。代替crRNA和tracrRNA，可将导向RNA设计成包括模仿tracrRNA-crRNA复合物的发夹(Jinek等人(2012)Science 337(6096):816-821)。
在本发明的一个优选实施方案中，可以按在下文的实施例中的描述进行同源重组。特别优选的是使用过表达盒，其包含G418或ClonNAT抗性标记与loxP序列的组合，如下所述。
典型地，遗传元件可以在转化盒或表达盒的帮助下被引入到假囊酵母属细胞中。按照本发明，术语“转化盒”指的是含有外源基因，并且除了外源基因外还具有促进假囊酵母属细胞转化的元件的特定载体。术语“表达盒”指的是含有外源基因并且除了外源基因外还具有使该基因在外源宿主(特别是在假囊酵母属细胞)中的表达增强的元件的特定载体。
可在采用如上文定义的表达盒或转化盒的形式的遗传元件上相应地提供如本文所定义的编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸序列，特别是制备用于通过同源重组而进行基因组整合的表达盒或转化盒。还设想的是提供质粒或载体。术语“质粒”和“载体”指的是经常携带不属于细胞中心代谢部分的基因，并且常常是环状双链DNA片段形式的染色体外元件。更优选地，术语质粒指的是适于本领域技术人员已知的假囊酵母属转化，特别是适合于在假囊酵母属中表达蛋白质的任何质粒，例如能够在其他生物体(优选细菌，特别是大肠杆菌)中自主复制的质粒，并且其可以被制备，例如被消化用于假囊酵母属的基因组插入转化。
这样的表达盒或转化盒，或载体或质粒可以包含编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸序列。这些盒向基因组的整合可能会在基因组内随机发生或者可以通过使用含有与宿主基因组同源足以向宿主基因座中进行靶向重组的区的构建体来被靶向，如上文所定义。当构建体靶向内源性基因座时，全部或部分转录和翻译调节区可以由内源性基因座提供。备选地，转录和翻译调节区可以由构建体提供。
如果假囊酵母属的生物体被遗传修饰为由独立的复制载体增加一种以上的蛋白质的活性，理想的是每个载体或质粒都具有不同的选择手段并且应该缺乏与其他构建体的同源性，以维持稳定的表达并防止构建体中的元件的重新排列组合。
在具体的实施方案中，遗传元件可以包括微生物表达系统。此类表达系统和表达载体可以包含指导外源蛋白的高水平表达的调控序列。
在本发明的优选的实施方案中，如上文所定义的遗传修饰的生物体，例如，包括为增加在所述生物体中的鸟苷5'-一磷酸合成酶活性的修饰的生物体，例如其中编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸分子过表达，和/或其中鸟苷5'-一磷酸合成酶多肽以增加的量提供，和/或其中鸟苷5'-一磷酸合成酶的活性增加的生物体，能够比未被遗传修饰的可比较的生物体累积更多的核黄素。如本文所用的术语“可比较的生物体”指的是与用作遗传修饰的起始生物体的生物体具有相同或非常相似的遗传背景的生物体。优选地，可比较的生物体可以是用于如本文所述的遗传修饰的生物体。如果遗传修饰是在野生型生物体中进行，该野生型生物体可以被认为是可比较的生物体。在进一步的实施方案中，如果遗传修饰是在任何其他或相同的野生型生物体中进行，那么任何野生型生物体都可以被认为是可比较的生物体。如果遗传修饰是在如上文定义的核黄素高产生物体或菌株中进行，没有本发明的遗传修饰的所述核黄素高产生物体可以被认为是可比较的生物体。
如本文所述的基因修饰可导致由生物体生产或累积的核黄素量的增加。在具体的实施方案中，增加可取决于在其中进行修饰的生物体的遗传背景，和/或修饰的数量，和/或过表达技术的类型，和/或存在的拷贝数和/或其它因素，例如培养条件，培养基条件等，或任何上述参数和因素的组合。在具体的实施方案中，相比不具有遗传修饰且与所述被遗传修饰的生物体在相同条件下培养的生物体，增加可以是至少0.3％、0.5％、0.7％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或大于200％。
核黄素生产或累积以及因此相比于可比较的生物体，该生产在修饰的生物体中的增加的测定可以按上述进行，即通过基于特定的培养条件及使用如上文所述的基于烟酰胺的光度测定法，遵照细胞培养核黄素测定方法。在具体的实施方案，测定可以按在下面提供的实施例中的描述来执行。本发明也设想了进一步的测定方法或程序，包括可能在将来被开发的方法或方法的改善。
在进一步的实施方案中，本发明涉及如上文定义的遗传修饰的生物体或使用所述遗传修饰的生物体生产或累积核黄素的方法，其中所述生物体优选包含导致编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸分子过表达和/或其中的鸟苷5'-一磷酸合成酶多肽以增加的量提供，和/或其中的鸟苷5'-一磷酸合成酶的活性增加的遗传修饰，优选如上文详细限定，并且其中所述生物体包括至少一个另外的遗传修饰。
如本文所用的术语“另外的遗传修饰”指的是除了本发明的遗传修饰外，如上所定义的生物体的任何进一步的遗传或生化修饰，如，例如基因或基因组区域的缺失，基因或基因片段的过表达等修饰。
在一个优选的实施方案中，如上所定义的生物体的另外的遗传修饰涉及影响核黄素生产的元件。这样的元件可能已经是公知的，或者可能在将来被发现。优选地，另外的遗传修饰可以涉及对在假囊酵母属，更优选棉假囊酵母中生产核黄素有公知影响的活性。已知具有这样的影响的活性的例子，包括GLY1；SHM2；ADE4；PRS 2，4；PRS 3；MLS1；BAS1；RIB1；RIB 2；RIB 3；RIB 4；RIB 5；RIB 7；FAT1；POX1；FOX2；POT1/FOX3；ADE12；和IMPDH。
相应地，遗传修饰可对假囊酵母属优选棉假囊酵母的基因gly1；shm2；ade4；prs2,4；prs 3；mls1；bas1；rib 1；rib 2；rib 3；rib 4；rib 5；rib7；fat1；pox1；fox2；pot1/fox3；ade12；和/或imd3中的一个或多个进行遗传修饰。
在进一步优选的实施方案中，另外的遗传修饰可以导致以下改变中的至少一种：(i)GLY1活性增加；和/或(ii)SHM2活性降低或消除；和/或(iii)ADE4活性增加和/或提供作为反馈抑制抗性的版本；和/或(iv)PRS 2,4活性增加；和/或(v)PRS 3活性增加；和/或(vi)MLS1活性增加；和/或(vii)BAS1活性降低或消除；和/或(viii)RIB1活性增加；和/或(ix)RIB2活性增加；和/或(x)RIB3活性增加；和/或(xi)RIB4活性增加；和/或(xii)RIB5活性增加；和/或(xiii)RIB 7活性增加；和/或(xiv)FAT1活性增加；和/或(xv)POX1活性增加；和/或(xvi)FOX2活性增加；和/或(xvii)POT1/FOX3活性增加；和/或(xviii)ADE12活性降低或消除；和/或(xix)IMPDH活性增加。
在进一步优选的实施方案中，GLY1的活性是由包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少约70％，71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：8的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，SHM2的活性是由包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：10的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，ADE4的活性是由包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：12的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，PRS 2,4的活性是由包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ IDNO：14的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：14的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，PRS 3的活性是由包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：16的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：16的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，MLS1的活性是由包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：18的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，BAS1的活性是由包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：20的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，RIB1的活性是由包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：22的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：22的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，RIB2的活性是由包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：24的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：24的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，RIB3的活性是由包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：26的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：26的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，RIB4的活性是由包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：28的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：28的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，RIB5的活性是由包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：30的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：30的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，RIB7的活性是由包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：32的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：32的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在优选的实施方案中，FAT1的活性是由包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：34的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：34的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在优选的实施方案中，POX1的活性是由包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：36的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：36的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，FOX2的活性是由包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：38的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：38的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，POT1/FOX3的活性是由包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQID NO：40的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：39的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：40的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，ADE12的活性是由包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：42的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：42的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
在进一步优选的实施方案中，IMPDH的活性是由包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQ ID NO：44的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQ IDNO：43的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQ ID NO：44的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。
如在本文描述的序列的上下文中使用的术语“其功能性部分或片段”指的是多肽和编码核苷酸序列的连续节段或部分，它们分别是能够执行与全长多肽基本相同的酶反应或是编码能够执行与全长多肽基本相同的酶反应的多肽。多肽的功能性部分或片段的酶活性是全长多肽的酶活性的至少10％、20％、30％或40％、优选至少45％、50％、55％或60％、更优选至少65％、70％、75％或80％、甚至更优选至少82％、85％、88％或90％，最优选至少92％、94％、96％、98％或100％。
鸟苷5'-一磷酸合成酶或其片段或部分的酶活性可以按上述来测定，即通过在合适的反应条件下，孵育包含鸟苷5'-一磷酸合成酶或其片段或部分的提取物与底物XMP，谷氨酰胺和ATP，并测量所产生的鸟苷一磷酸的量。为按上文所述测定其他酶的活性，通常是将纯化的酶或含有酶的细胞裂解物，与酶的底物一起孵育，并最终测定对于其活性所需的任何辅助因子以及酶反应产物的量。
在具体的实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，或(ii)PRS 2,4活性，或(iii)PRS3活性，或(iv)MLS1，或(v)FAT1活性，或(vi)POX1活性，或(vii)FOX2活性；或(viii)POT1/FOX3活性或(ix)IMPDH活性可以增加。
在进一步的具体实施方案中，GLY1活性和(i)RIB1活性，或(ii)RIB2活性，或(iii)RIB3活性，或(iv)RIB4活性，或(v)RIB5活性，或(vi)RIB7活性可以增加。
在进一步的具体实施方案中，GLY1活性可以增加和(i)SHM2活性，或(ii)BAS1活性，或(iii)ADE12活性可以降低或消除。
在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和/或(ii)PRS2,4活性，和/或(iii)PRS 3活性，和/或(iv)MLS1活性可以增加。在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)RIB1活性，和/或(ii)RIB2活性和/或(iii)RIB3活性，和/或(iv)RIB4活性，和/或(v)RIB5活性，和/或(vi)RIB7活性可以增加。
在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和/或(ii)PRS 2,4活性，和/或(iii)PRS 3活性，和/或(iv)MLS1活性和/或(v)RIB1活性，和/或(vi)RIB2活性和/或(vii)RIB3活性，和/或(viii)RIB4活性，和/或(ix)RIB5活性，和/或(x)RIB7活性可以增加。
在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和/或(ii)PRS 2,4活性，和/或(iii)PRS 3活性，和/或(iv)MLS1活性和/或(v)RIB1活性，和/或(vi)RIB2活性和/或(vii)RIB3活性，和/或(viii)RIB4活性，和/或(ix)RIB5活性，和/或(x)RIB7活性可以增加和/或(x)SHM2活性可以降低或消除，和/或(xi)BAS1活性可以降低或消除。
在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和(ii)PRS 2,4活性，以及(iii)PRS 3活性可以增加。
在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和(ii)PRS 2,4活性，以及(iii)PRS 3活性可以增加，(iv)SHM2活性可以降低或消除，和(v)BAS1活性可以降低或消除。
在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)RIB1活性，和(ii)RIB2活性和(iii)RIB3活性，和(iv)RIB4活性，和(v)RIB5活性，以及(vi)RIB7活性可以增加。
在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)RIB1活性，和(ii)RIB2活性和(iii)RIB3活性，和(iv)RIB4活性，和(v)RIB5活性，以及(vi)RIB7活性可以增加，(vii)SHM2活性可以降低或消除，和(viii)BAS1活性可以降低或消除。
在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和(ii)PRS 2,4活性，以及(iii)PRS 3活性可以增加，(iv)MLS1活性和(v)RIB1活性，和(vi)RIB2活性和(vii)RIB3活性，和(viii)RIB4活性，和(ix)RIB5活性，以及(x)RIB7活性可以增加。
在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和(ii)PRS 2,4活性，以及(iii)PRS 3活性可以增加，和(iv)MLS1活性和(v)RIB1活性，和(vi)RIB2活性和(vii)RIB3活性，和(viii)RIB4活性，和(ix)RIB5活性，以及(x)RIB7活性可以增加并且(x)SHM2活性可以降低或消除，以及(xi)BAS1活性可以降低或消除。
GLY1活性的增加可能是由于编码GLY1的核酸分子的过表达。ADE4活性的增加可能是由于编码ADE4的核酸分子的过表达。PRS 2,4活性的增加可能是由于编码PRS 2,4的核酸分子的过表达。PRS 3活性的增加可能是由于编码PRS 3的核酸分子的过表达。MLS1活性的增加可能是由于编码MLS1的核酸分子的过表达。RIB1活性的增加可能是由于编码RIB1的核酸分子的过表达。RIB2活性的增加可能是由于编码RIB2的核酸分子的过表达。RIB3活性的增加可能是由于编码RIB3的核酸分子的过表达。RIB4活性的增加可能是由于编码RIB4的核酸分子的过表达。RIB5活性的增加可能是由于编码RIB5的核酸分子的过表达。RIB7活性的增加可能是由于编码RIB7的核酸分子的过表达。FAT1活性的增加可能是由于编码FAT1的核酸分子的过表达。POX1活性的增加可能是由于编码POX1的核酸分子的过表达。FOX2活性的增加可能是由于编码FOX2的核酸分子的过表达。POT1/FOX3活性的增加可能是由于编码POT1/FOX3的核酸分子的过表达。IMPDH活性的增加可能是由于编码IMPDH的核酸分子的过表达。SHM2活性的降低或消除可能是由于shm2基因的失活。BAS1活性的降低或消除可能由于bas1基因的失活。ADE12活性的降低或消除可能由于ade12基因的失活。
编码GLY1、ADE4、PRS 2、4、PRS 3、MLS1、RIB1、RIB2、RIB3、RIB4、RIB5、RIB7、FAT1、POX1、FOX2、POT1/FOX3和/或IMPDH的核酸分子的过表达可根据如本发明上面概述的过程、方法和工艺来进行，优选通过使用强启动子，例如组成型启动子如GDP启动子。在具体的实施方案中，启动子也可以是异源启动子或合成启动，如强异源启动子或调节型异源启动子。
如本文所用的术语“失活”指的是编码酶活性的遗传元件的修饰，如在分子基础上，由遗传元件表达的转录本或由所述遗传元件编码的蛋白质或酶活性的修饰，所述修饰导致活性功能的全部或部分丧失。部分失活或活性功能的部分丧失，例如，可导致野生型或全酶活性的约95％、90％、85％、80％、75％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％或小于3％或在所提及数值之间的任何值的残余酶活性。设想的失活的实例是SHM2、ADE12和BAS1中的至少一个的至少一个基因组拷贝，优选全部基因组拷贝的功能性破坏或缺失。在优选的实施方案中，待删除的遗传元件或基因组拷贝是SEQ ID NO：10、42和/或20的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列，包括SEQ ID NO：10、42和/或20的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列，部分地包含SEQ IDNO：10、42和/或20的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列，基本上由SEQ ID NO：10、42和/或20的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列组成，或由SEQ ID NO：10、42和/或20的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列组成。删除可以包括遗传元件的编码区(ORF)或非编码部分的两个或更多个残基的任何区域，例如从两个残基到整个基因或基因座。在具体的实施方案中，缺失也可以影响较小的区域，如结构域，蛋白质子部分，重复序列或少于约50个连续碱基对的片段，但是也可以出现较大的缺失。删除可以包括一个蛋白质亚基或一个蛋白质亚基以上的区域，例如在蛋白质或酶是由几个亚基组成的情形下。缺失或功能破坏优选在SHM2、ADE12或BAS1的编码序列或ORF中发生。也设想的是，如上文所定义的SHM2、ADE12或BAS1的3'非编码序列，如上文所定义的SHM2、ADE12或BAS1的启动子序列(也是5'非编码区)，或如上文所定义的与SHM2、ADE12或BAS1相关联的调控序列被功能破坏。这样的功能破坏或修饰可导致，例如，转录本的表达降低或不稳定性，转录起始困难等，从而提供减少量的酶活性的或完全不存在酶活性。在进一步的实施方案中，失活也可以是由于SHM2、ADE12或BAS1的遗传元件的编码区(ORF)和/或非编码区中的突变、重排和/或插入，例如在调控序列中。突变可以，例如是点突变或2-或3-核苷酸交换，这导致所编码的氨基酸序列的修饰，或将一个或多个移框引入ORF，或引入过早终止密码子，或从ORF中除去终止密码子，和/或引入用于细胞机制(machinery)的识别信号，例如聚腺苷酸化机制或引入用于蛋白质降解机制的破坏信号等。这样的修饰的序列部分可以产生不再提供蛋白质的野生型版本的活性的蛋白。蛋白质可以相应地，例如，在相关的酶核心区中具有取代，从而导致功能丧失，或可以由不同的氨基酸(由于移框)组成，因而不能正常工作。所述修饰的序列部分可以进一步引起不稳定的转录而易于降解。此外，蛋白质的靶向可能会受到影响。
如上概述的遗传元件的功能破坏或缺失，以及在这些遗传元件中引入点突变可以通过本领域技术人员公知的任何适当的方法来执行，例如，通过如上文所述的同源重组。
在进一步的具体实施方案中，失活可能是由于发生在RNA转录本水平的特定失活过程。这样的失活可能是由于SHM2、ADE12和/或BAS1的RNA转录本的序列特异性识别以及这些转录本的随后降解。对于这种方法，可使用来自高等真核生物的已知的RNA干扰或反义方法。虽然真菌如假囊酵母属被假定为缺乏RNAi的必要活性，本发明设想通过基因工程引入所需活性。如何能够类似于酿酒酵母的情况，建立用于假囊酵母属的RNAi的一个例子获自Drinnenberg等人(2009)Science 326(5952):544–550。因此，本发明设想提供特异于SHM2、ADE12或BAS1的任何一个转录本的siRNA种类，或它们的组合。
术语“siRNA”指的是特定类型的反义分子，即诱导RNA干扰(RNAi)途径的小抑制性RNA双链。这些分子的长度可以变化，并且可以是在长度约18-28个核苷酸之间，例如具有18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸的长度。优选地，该分子具有21、22或23个核苷酸的长度。根据本发明的siRNA分子可与它们的靶mRNA，优选在反义链上含有不同程度的互补性。siRNA可能在有义链和/或反义链的5'或3'端具有未配对的突出碱基。术语“siRNA”包括两个独立链的双链，以及可以形成包含双链区的发夹结构的单链。优选地，siRNA可以是双链，其中双链的siRNA分子包含第一和第二条链，siRNA分子的每条链长度为约18至约23个核苷酸的长度，siRNA分子的第一条链包含通过RNA干扰与靶RNA具有足够的互补性的核苷酸序列，并且siRNA分子的第二条链包括与第一条链互补的核苷酸序列。这种干扰分子的生产可以通过从调节型启动子生产siRNA而进一步受到控制和调节。
在本发明的又一个具体实施方案中，失活可能是由于在蛋白质或酶水平发生的特异性失活过程。这种失活可能是由于特异性结合分子，如小分子与SHM2、ADE12和/或BAS1的酶或蛋白质的结合。
在本发明的上下文中的“小分子”指的是有机小化合物，优选具有生物活性的，即生物分子，但优选不是聚合物。这样的有机化合物可具有任何合适的形式或化学性质。所述化合物可以是天然化合物(例如次级代谢物)或从头设计并生成的人工化合物。在本发明的一个实施方案中，小分子能够阻断SHM2、ADE12和/或BAS1与底物的结合，或能够阻断SHM2、ADE12和/或BAS1的活性。例如，小分子可以结合到SHM2、ADE12和/或BAS1并由此诱导分子和蛋白质之间的紧密的或不可逆的相互作用，从而导致蛋白质或酶的正常(野生型)功能的丧失或减少，例如，如果涉及酶的核心或结合口袋。鉴定和制备此种小分子的方法和技术，以及检测小分子的检测法是本领域技术人员公知的并且也是本文设想的。
在进一步优选的实施方案中，ADE4的活性通过ADE4的反馈抑制版本降低。ADE4活性由包括SEQ ID NO：45的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或由包括SEQ ID NO：46的核苷酸，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或由包括与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或由包括与SEQ ID NO：46的核苷酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列的核酸，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。ADE4的反馈抑制版本的进一步的细节可获取自Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71:5743-5751。
本发明还设想编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸分子增加核黄素在假囊酵母属的生物体中的累积的用途。可以使用编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的核酸分子，使得在细胞中所编码的多肽和活性可以以增加的量或浓度提供，例如，通过过表达核酸分子。核酸分子可经由强启动子，优选组成型，和任选调节型启动子来过表达，或通过在生物体的基因组中提供至少第二拷贝的编码鸟苷5'-一磷酸合成酶的基因来过表达。用于提供第二拷贝的启动子和方法等已经如上文所述。在某些实施方案中，增加核黄素的累积也可包括核黄素的生产，例如如上文所定义。
在进一步的具体实施方案中，额外的基因可用于增加核黄素在假囊酵母属的生物体中的累积。这些基因可包括如上文定义的假囊酵母属，优选棉假囊酵母的gly1；shm2；ade4；prs 2,4；prs 3；mls1；bas1；rib 1；rib2；rib 3；rib 4；rib 5；fat1；pox1；fox2；pot1/fox3；imd3；ade12和/或rib 7。特别优选gly1过表达，使得GLY1活性增加；shm2失活，使得SHM2活性降低或消除；ade4过表达，或ade4反馈抗性突变体表达或过表达，使得ADE4活性增加和/或提供作为反馈抑制抗性的版本；prs 2,4过表达，使得PRS 2,4活性增加；mls1过表达，使得MLS1活性增加；bas1失活，使得BAS1活性降低或消除；rib1过表达，使得RIB 1活性增加；rib2过表达，使得RIB 2活性增加；rib3过表达，使得RIB3活性增加；rib4过表达，使得RIB4活性增加；rib5过表达，使得RIB5活性增加；fat1过表达，使得FAT1活性增加；pox1过表达，使得POX1活性增加；fox2过表达，使得FOX2活性增加；pot1/fox3过表达，使得POT1/FOX3活性增加；imd3过表达，使得IMPDH活性增加和/或rib7过表达，使得RIB 7活性增加。在具体的实施方案中，这些基因可以过表达或按上文定义的形式提供，例如以不同的组合和量。
生物体可以是如上文所述的任何假囊酵母属物种，优选棉假囊酵母。使用假囊酵母属来增加核黄素的累积可以包括使用适宜的发酵环境，营养，自发酵容器的核黄素提取等。本发明因此设想了相应的生产核黄素，或其如上文所定义的衍生物的方法。在具体的实施方案中，作为用于本发明遗传修饰的起始生物体的假囊酵母属物种是每升培养基能够累积50mg核黄素，更优选超过50mg核黄素的生物体。在进一步的实施方案中，假囊酵母属物种可以是已被遗传修饰的生物体。遗传修饰可以是如本文所述的修饰，例如对核黄素的生产或累积有直接的影响，或者可以具有不同的效果，例如在其它途径中，或关注于生产除了核黄素以外的其它生化实体如PUFA、脂肪酸、氨基酸、糖等，关注于使用某些碳源的可能性，关注于使用某些氮源等的可能性，关注于基因组或基因组区域的稳定性，允许或改善同源重组的步骤，允许异源基因或启动子等的表达，提高细胞培养行为如成丝，菌丝体片段化，pH耐受性，密度耐受性，盐的使用，盐耐受性，关注于细胞的生产速率，关注于对抗生素的抗性或其他任何可能对核黄素生产或核黄素和其他产品共生产有利的性状。
在进一步的方面，本发明涉及如上文定义的用于核黄素生产的生物体的用途，特别是被遗传修饰的生物体的用途，所述被遗传修饰的生物体包括上述造成鸟苷5'-一磷酸合成酶活性增加的遗传修饰和任选的进一步的遗传修饰，例如，如上文所定义的基因gly1；shm2；ade4；prs 2,4；prs 3；mls1；bas1；rib 1；rib 2；rib 3；rib 4；rib 5；fat1；pox1；fox2；pot1/fox3；imd3；ade12和/或rib7的修饰。
来自如上文定义的至少一种生物体的核黄素产品可以是为符合其用途而已被修饰和调整的制品。这样的制品可以包括适合作为动物饲料或作为人类食品产品，作为膳食补充剂或药物制剂，真菌片剂，婴儿和儿童食品产品等的可食用制品。核黄素制品可进一步包括用于工业化生产的核黄素。进一步设想用于化学合成工艺，药理用途等的核黄素制品。
以下实施例和附图是用于说明的目的。因此可以理解，所述实施例和附图不应被解释为限制。本领域技术人员将显然能够设想本文中提出的原则的进一步的变形。
实施例1
用于棉假囊酵母的GUA1过表达构建体的产生
在棉假囊酵母中，将GUA1基因(AER350Wp)(SEQ ID No.1)鉴定为编码鸟苷一磷酸(GMP)合成酶(SEQ ID No.2)，该酶在嘌呤途径中催化由黄苷单磷酸(XMP)到GMP的反应(图2)。为了评价嘌呤途径的高通量对关于在棉假囊酵母中的核黄素生物合成的靶向优化的影响，产生用于GUA1基因过表达的构建体。为了这个目的，将GUA1基因置于棉假囊酵母的强组成型GPD启动子(GPDp)的控制下。
对于具有GPD启动子的基因的过表达，使用模板质粒JR3684(SEQ ID No.3)，其含有融合到修饰的loxPM-kanMX标记的3'端的AgGPD1基因的启动子序列(核苷酸-1至-343)。此标记已被缩短，以消除原始kanMX4盒的一些限制性位点。loxPM-kanMX标记也包含两个lox序列，它们能使抗性标记基因在CRE介导的重组后有效回收(Guldener等人(1996)Nucl.Acids Res.24:2519-2524)。
质粒JR3684用作PCR扩增的模板，设计100-120nt长的寡核苷酸以在基因组的正确位点提供用于PCR扩增子整合的同源重组端(homA和homB)。在GUA1过表达盒的情况下，5'重组序列被设计为缺失来自核苷酸-1至-85的天然GUA1启动子序列。对于GPDp-GUA1盒的扩增，使用寡核苷酸loxPK-GPDp-GUA1-ins5(SEQ ID No.4)和loxPK-GPDp-GUA1-ins3(SEQ IDNo.5)。
然后纯化所得的2212bp的PCR扩增子(图3，SEQ ID No.6)，并用于棉假囊酵母菌株ATCC 10895的转化。通过分析PCR和测序来确认过表达模块的基因组整合(也参见实施例2)。
实施例2
过表达GUA1基因的棉假囊酵母菌株的生成和分析
如上所述来构建在棉假囊酵母GPD启动子控制下，携带GUA1基因的过表达盒(参见实施例1)。使用棉假囊酵母菌株ATCC 10895的孢子，按照Schlüpen等人(2003)Biochem.J.369:263-273and Jimenez等人(2005)Appl.Environm.Microbiol.71:5743-5751提供的方案转化经纯化的片段。将所得的转化体在28℃生长并在含有250μg/mL遗传霉素(G418，Sigma Aldrich)的MA2培养基(10g/L细菌用蛋白胨，10g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，0.3g/L Myoinosit，20g/L琼脂)中筛选。
随后，使用DNeasy Plant Maxi Kit(Qiagen,Germany)，根据制造商的推荐，分离每一转化体的基因组DNA。然后将基因组DNA用于不同的PCR分析，检测在5'-和3'-整合位点处GUA1过表达模块的适当整合。此外，对所有扩增子进行DNA测序以验证正确的整合事件。
为单孢子分离选择阳性转化体以确保获得同型核菌株。单孢子分离如下：在将转化体的菌丝体溶解于500μL盐水-Triton溶液(9g/L NaCl，600μL/L Triton X-100)后，加入500μL正己烷并混合。将混合物在14000rpm离心1min，并且将包含于上层相中的单孢子于含有250μg/mL遗传霉素(G418)的SP培养基平板(3g/L大豆粉，3g/L酵母提取物，3g/L麦芽提取物，20g/L玉米粉，1g/L消泡剂，10g/L葡萄糖，30g/L琼脂，pH6.8)上铺板。
再次如上所述用PCR分析来测试从单孢子分离得到的菌株。阳性菌株用于CRE重组以消除KanMX选择标记。按照Guldener等人(1996)Nucl.Acids Res.24:2519-2524所述进行用于CRE重组的转化。所得的菌株进行PCR分析以确认选择标记删除事件。选择已显示出删除了选择标记并且同时具有GUA1过表达模块的适当整合的菌株用于摇瓶实验以测试核黄素生产，并测定与参照棉假囊酵母菌株ATCC 10895相比的相应产率(参见实施例3)。
实施例3
在过表达GUA1基因的棉假囊酵母菌株中的核黄素生产分析
进行在GPD启动子控制下的GUA1过表达，以便显著增加GMP合成酶活性以及因此通过嘌呤途径的流量，从而提供足够用于核黄素生产的GTP前体。为了分析基因过表达对核黄素生产的影响，在摇瓶实验中检测上述菌株并测定核黄素滴度。作为参照，对亲本菌株ATCC10895进行并行分析。
使用分光光度法测定法来测量总(细胞内和细胞外的)核黄素生产水平。在28℃，150rpm下，在MA2培养基中以回转振荡培养用于核黄素分析的菌株。向1mL培养物中加入1M体积的HCl并在100℃培养30min。冷却样品后，用0.5mm玻璃珠(Sigma-Aldrich)和剧烈涡流来裂解菌丝体。离心后，在Varioskan微量滴定板读数器(Thermo Scientific)上通过分光光度(λexc＝450nm)来测定上清液中的核黄素浓度。校准曲线是用纯的核黄素(Sigma-Aldrich)进行，并以与样本相同的方式处理。
在图4中所示的结果示出了每个菌株的三个独立摇瓶的平均滴度。在棉假囊酵母的GPD启动子的控制下，过表达GUA1基因的菌株ATCC 10895::GPDp-GUA1显示出比参照菌株ATCC 10895多2倍的核黄素生产(图4)。因此，通过GMP合成酶催化的XMP向GMP的有效转化是核黄素生产的关键步骤，故而是菌株优化的合适的靶标。这些结果表明，嘌呤途径活性的靶向增加是显著提高工业核黄素生产的适当的策略。
Claims (15)
1.一种在假囊酵母属的生物体中生产核黄素的方法，所述生物体被遗传修饰为相比于不具有遗传修饰的生物体其鸟苷一磷酸合成酶的活性增加，所述不具有遗传修饰的生物体与所述被遗传修饰的生物体在相同条件下培养，所述方法包括：
(i)在合适的培养基中生长所述生物体；和
(ii)从所述培养基分离核黄素。
2.一种属于假囊酵母属的累积核黄素的生物体，其被遗传修饰，从而鸟苷一磷酸合成酶在所述生物体中的活性相比于不具有遗传修饰且与所述被遗传修饰的生物体在相同条件下培养的生物体中得以增加。
3.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2所述的生物体，其中与没有所述遗传修饰且与所述被遗传修饰的生物体在相同的条件下培养的可比较的生物体相比，所述被遗传修饰的生物体能够累积更多的核黄素。
4.根据权利要求1或3所述的方法，或根据权利要求2或3所述的生物体，其中所述鸟苷一磷酸合成酶的活性增加是由于编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子的过表达。
5.根据权利要求4所述的方法或生物体，其中所述编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子的过表达是由强启动子来完成或通过在生物体的基因组中提供至少第二拷贝的编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子来完成。
6.根据权利要求5所述的方法或生物体，其中所述强启动子是GPD启动子。
7.根据权利要求4所述的方法或生物体，其中所述编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子包括选自以下组的核酸序列：
(a)根据SEQ ID No.1的核酸序列或其功能性部分，其中所述功能性部分至少包括对应于SEQ ID No.1的第150-750位核苷酸的600个核苷酸；和
(b)编码根据SEQ ID No.2的多肽或其功能性部分的核酸序列，其中所述功能性部分至少包括对应于SEQ ID No.2第50-250位残基的200个残基。
8.根据权利要求1和5至7中任一项所述的方法或根据权利要求2和5至7中任一项所述的生物体，其中所述生物体包括至少一个另外的遗传修饰。
9.根据权利要求8所述的方法或生物体，其中所述另外的遗传修饰导致选自下组的至少一种活性的改变：
(i)GLY1；
(ii)SHM2；
(iii)ADE4；
(iv)PRS 2,4；
(v)PRS 3；
(vi)MLS1；
(vii)BAS1
(viii)RIB 1；
(ix)RIB 2；
(x)RIB 3；
(xi)RIB 4；
(xii)RIB 5；
(xiii)RIB 7；
(xiv)FAT1；
(xv)POX1；
(xvi)FOX2；
(xvii)POT1/FOX3；
(xviii)ADE12；和
(xix)IMDH。
10.根据权利要求9所述的方法或生物体，其中所述另外的遗传修饰导致以下改变中的至少一种：
(i)GLY1活性增加；和/或
(ii)SHM2活性降低或消除；和/或
(iii)ADE4活性增加和/或提供作为反馈抑制抗性的版本；和/或
(iv)PRS 2,4活性增加；和/或
(v)PRS 3活性增加；和/或
(vi)MLS1活性增加；和/或
(vii)BAS1活性降低或消除；和/或
(viii)RIB 1活性增加；和/或
(ix)RIB 2活性增加；和/或
(x)RIB 3活性增加；和/或
(xi)RIB 4活性增加；和/或
(xii)RIB 5活性增加；和/或
(xiii)RIB 7活性增加；和/或
(xiv)FAT1活性增加；和/或；
(xv)POX1活性增加；和/或；
(xvi)FOX2活性增加；和/或；
(xvii)POT1/FOX3活性增加；和/或；
(xviii)ADE12活性降低或消除；和/或
(xix)IMDH活性增加。
11.编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子在增加核黄素在假囊酵母属的生物体中的累积的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子是由强启动子过表达或通过在生物体的基因组中提供至少第二拷贝的编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子来过表达。
13.根据权利要求11或12所述的用途，其中编码鸟苷一磷酸合成酶的核酸分子包括选自以下组的核酸序列：
(a)根据SEQ ID No.1的核酸序列或其功能性部分，其中所述功能性部分至少包括对应于SEQ ID No.1的第150-750位核苷酸的600个核苷酸；和
(b)编码根据SEQ ID No.2的多肽或其功能性部分的核酸序列，其中所述功能性部分至少包括对应于SEQ ID No.2第50-250位残基的200个残基。
14.根据权利要求2至10中任一项所限定的生物体在生产核黄素中的用途。
15.根据权利要求1、3、5-7、9和10中任一项所述的方法，根据权利要求2、3、5-7、9和10中任一项所述的生物体，或者根据权利要求11至14中任一项所述的用途，其中所述属于假囊酵母属的生物体是物种阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyi)，榛针孢酵母(Eremothecium coryli)，Eremothecium cymbalariae，棉假囊酵母(Eremothecium gossypii)，Eremothecium sinecaudum或假囊酵母属物种CID1339。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14193845 | 2014-11-19 | ||
| EP14193845.6 | 2014-11-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105603033A CN105603033A (zh) | 2016-05-25 |
| CN105603033B true CN105603033B (zh) | 2021-07-02 |
Family
ID=51904800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510784207.7A Active CN105603033B (zh) | 2014-11-19 | 2015-11-16 | 为增加gmp合成酶活性的假囊酵母属遗传修饰 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102583349B1 (zh) |
| CN (1) | CN105603033B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112574934B (zh) * | 2020-10-12 | 2022-05-06 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 高产鸟苷的工程菌及其构建方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998029539A2 (de) * | 1996-12-31 | 1998-07-09 | Basf Aktiengesellschaft | Teilsequenzen von genen der purinbiosynthese aus ashbya gossypii und deren verwendung in der mikrobiellen riboflavinsynthese |
| CN1227870A (zh) * | 1997-12-23 | 1999-09-08 | Basf公司 | 来自棉铃腐阿氏酵母的嘌呤生物合成基因及在微生物核黄素合成中的应用 |
-
2015
- 2015-11-13 KR KR1020150159993A patent/KR102583349B1/ko active IP Right Grant
- 2015-11-16 CN CN201510784207.7A patent/CN105603033B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998029539A2 (de) * | 1996-12-31 | 1998-07-09 | Basf Aktiengesellschaft | Teilsequenzen von genen der purinbiosynthese aus ashbya gossypii und deren verwendung in der mikrobiellen riboflavinsynthese |
| CN1227870A (zh) * | 1997-12-23 | 1999-09-08 | Basf公司 | 来自棉铃腐阿氏酵母的嘌呤生物合成基因及在微生物核黄素合成中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Metabolic Engineering of the Purine Pathway for Riboflavin Production in Ashbya gossypii;Alberto Jiménez et al.;《Applied and Environmental Microbiology》;20051030;第71卷(第10期);5743-5751 * |
| Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase activity affects growth and riboflavin production in Ashbya gossypii;Alberto Jiménez et al.;《BMC Biotechnology》;20080909(第8期);1-12 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160059961A (ko) | 2016-05-27 |
| CN105603033A (zh) | 2016-05-25 |
| KR102583349B1 (ko) | 2023-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Averianova et al. | Production of vitamin B2 (riboflavin) by microorganisms: an overview | |
| US11807888B2 (en) | Production of steviol glycoside in recombinant hosts | |
| Arondel et al. | Isolation and functional expression in Escherichia coli of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1. 1.17) from Rhodobacter sphaeroides | |
| JP5787089B2 (ja) | リボフラビンの改善された生産 | |
| Commichau et al. | Overexpression of a non-native deoxyxylulose-dependent vitamin B6 pathway in Bacillus subtilis for the production of pyridoxine | |
| JP7240329B2 (ja) | 目的分子を産生するための遺伝的に最適化された微生物 | |
| AU2015266785A1 (en) | Increasing lipid production and optimizing lipid composition | |
| CN106906176A (zh) | 提高nadph可用性用于甲硫氨酸产生 | |
| US20090221027A1 (en) | Use of a bacillus meti gene to improve methionine production in microorganisms | |
| CN113564193B (zh) | 一种微生物基因表达命运共同体及其构建方法和应用 | |
| KR20140135622A (ko) | 발효에 의한 감마-글루타밀시스테인 및 이 디펩티드의 유도체의 과다 생산을 위한 미생물 및 방법 | |
| WO2018213796A1 (en) | Genomic engineering of biosynthetic pathways leading to increased nadph | |
| CN106414760B (zh) | 过量表达脂肪酸转运蛋白基因和编码β-氧化途径酶的基因以通过假囊酵母发酵产生更多核黄素 | |
| CN105603033B (zh) | 为增加gmp合成酶活性的假囊酵母属遗传修饰 | |
| KR101371954B1 (ko) | 신규 방법 | |
| CN105603035B (zh) | 为增加imp脱氢酶活性的假囊酵母属的遗传修饰 | |
| CN105603034B (zh) | 使用rib7启动子下调基因表达的假囊酵母属的遗传修饰 | |
| KR20020064788A (ko) | 관능기에 의해 수식된 이차 대사산물을 생산하는형질전환체 및 신규 생합성 유전자 | |
| US20230399647A1 (en) | Engineered biosynthetic pathways for production of ectoine by fermentation | |
| CN110869503A (zh) | 甲硫氨酸生产酵母 | |
| TW201527533A (zh) | 藉由假囊酵母之發酵中過度表現脂肪酸運輸蛋白基因及編碼β氧化路徑酵素之基因以大量生產核黃素 | |
| WO2016016805A1 (en) | Gene construct for the transformation of yeast strains | |
| Zhang et al. | Extended toolboxes enable efficient biosynthesis of valuable chemicals directly from CO2 in fast-growing Synechococcus sp. PCC 11901 | |
| WO2023285585A2 (en) | Microbial cell factories producing vitamin b compounds | |
| CN117897476A (zh) | 生产维生素b化合物的微生物细胞工厂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |