TW201524513A - 植物萃取物及治療肝臟纖維化與肝癌之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種藉由包括以下之方法製備的石蓮花(Graptopetalum paraguayense)萃取物：用酒精溶劑萃取石蓮花(GP)起始物質，產生酒精萃取物及殘餘物；使該殘餘物與該酒精萃取物分離；用二申亞碸(DMSO)水溶液溶劑萃取該殘餘物，產生DMSO萃取物；該DMSO萃取物使用具有選定分子量截斷值之過濾器進行超過濾；乾燥由該過濾器截留的級分，獲得該石蓮花萃取物。本發明係關於石蓮花萃取物之用途，其用於治療或預防肝纖維化、肝臟硬化、肝癌、術後肝纖維化復發或術後肝癌復發。

Description

植物萃取物及治療肝臟纖維化與肝癌之方法
本發明係關於石蓮花Graptopetalum paraguayense(N.E.Br.)E.Walther之活性級分，尤其石蓮花萃取物及其生產之方法與其用途之領域。
石蓮花(GP)為外觀類似蓮花(蓮座叢)之藥用植物。然而，其葉子具有抗旱性。因此，其稱為石蓮花(stone lotus)或風車草(Cyperus alternifolius)。其屬於景天科風車草屬(Crassulaceae Graptopetalum)。其為多年生肉質植物。該植物光滑且厚實。顏色為粉白色且葉子聚集於莖之頂端；葉子不含莖，其中倒卵形之配置類似蓮花(蓮座叢)，給予其名稱石蓮花。植物在春季及秋季偶爾開出小白花。可出於觀賞目的或出於藥用用途栽培GP。
認為GP在減輕肝臟功能障礙、降低血壓、增白皮膚、緩解疼痛及感染、抑制炎症及改善大腦功能方面具有潛在有益的效果。
GP富含灰物質及各種養分，諸如膳食纖維、鈉、鈣、鉀、鎂、鐵、維生素C、維生素B1、維生素B2、維生素B6、葉酸、菸酸及β-胡蘿蔔素。其為可食用植物。其藥理活性包括復原肝細胞、改善免疫功能、減輕脆弱血管及異常滲透性、預防諸如高血壓、動脈硬化、慢性肝炎及肝硬化之各種疾病。
研究GP作為食品補充劑用於控制患有高脂血症之人中的脂質含量(J Sci Food Agric.2011年5月；91(7)：1230-5)。在臨床試驗中，每日給予18位高脂血症個體100g之新鮮GP。在八週之後，評估測試個體之血清指標及血液分析。結果顯示GP攝取可實質上增加身體中之抗氧化劑活性(血液中的抗壞血酸及α-生育酚之含量增加且丙二醛之含量降低；紅血球中的麩胱甘肽濃度增加；麩胱甘肽過氧化酶及過氧化氫酶活性亦增加)。已發現，來自GP之50%乙醇萃取物之乙酸乙酯再萃取的產物在患有中風之大鼠中具有神經保護作用(Am.J.Chin.Med.,2010,38(3)：495-516)。
臺灣研究人員亦發現GP可抑制肝炎及由二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine；DMN)或四氯化碳(CCl4)誘發之肝臟纖維化。在肝臟纖維化之活體外細胞研究中已發現：(1)GP-W可抑制肝臟星狀細胞(hepatic stellate cell；HSC)之生長或誘發其細胞凋亡；(2)GP萃取物與對照組相比可延遲庫普弗(Kupffer)細胞之老化；(3)GP萃取物可抑制庫普弗細胞中之脂多醣(lipopolysaccharide；LPS)誘發的炎症，導致TNF-α及IL-6之較低表現。
GP活性成分一直為若干專利申請案之主題，該等申請案包括TW專利申請公開案第TW200616655號(Pharmaceutical use of Graptopetalum and related plants)，其對應於美國專利第7,364,758號；美國專利申請公開案第US 2012/259004 A1號(Anti-cancer extract and compounds)；臺灣專利申請公開案第TW201219047號(Anti-cancer extract and compounds)；及中國專利申請公開案第CN103269706號(Anti-cancer extract and compounds)。
在美國專利第7,364,758號(「Pharmaceutical use of Graptopetalum and related plants」)中，使用水、乙醇、丙酮、甲醇或其混合物作為溶劑來獲得GP花萃取物，而醫藥用途為用於治療或預防選自由肝炎 症、肝臟脂肪變性、肝纖維化、肝臟硬化及B型肝炎組成之群的疾病。使用極性溶劑獲得'758專利中所揭示之萃取物。
專利申請案「Anti-cancer extract and compounds」主要涉及風車草屬(Graptopetalum sp.)、紅景天屬(Rhodiola sp.)或擬石蓮花屬(Echeveria sp.)。在此等申請案中，使用Sephadex LH20管柱層析法進一步純化DMSO萃取物以分離HH-F3，HH-F3為具有約18kD之分子重量的原花青素化合物。然而，使用管柱層析法使得具有大規模生產變得不切實際。另外，管柱溶離需要大量有機溶劑，且用以濃縮溶離份之必要方法亦為昂貴的。
雖然此等先前技術揭示內容顯示GP萃取物具有有益的藥用用途且先前技術方法可產生具有良好活性之GP萃取物，但仍需要用於製備GP萃取物之較好方法，尤其適用於經濟的大規模生產之方法。
本發明之實施例係關於新的藥劑，亦即，GP活性成分之萃取物，及其製備方法與用途。根據本發明之實施例，可藉由有機溶劑萃取、隨後使用切向流過濾(tangential flow filtration；TFF)系統純化來獲得GP萃取物。TFF純化方法依賴於透析，與特定透析溶液一起使用以製備活性植物萃取物。此方法與管柱純化相比較適用於大規模生產，且其因為其避免較大體積之溶劑的成本及在使用管柱層析法時與濃縮溶劑相關之成本而較經濟。
本發明之一些實施例係關於用於分離及純化之化學製備方法的用途及用於保護肝功能與預防肝損害、肝纖維化、肝臟硬化及用於治療肝癌之天然產物。
根據本發明之實施例，一種製備活性萃取物級分之方法可包括用甲醇萃取以移除可溶組分，且接著用30% DMSO萃取殘餘物以獲得活性萃取物。接著使用適合之分子量截斷膜(例如5kD截斷值)使活性 萃取物經歷超過濾，諸如切向流過濾(TFF)。濃縮由過濾膜截留之活性級分以獲得經部分純化之活性級分，其可用於保護肝功能且用於預防及治療肝損害、肝纖維化、肝(肝臟)硬化、術後肝纖維化復發及術後肝癌復發。
活性級分含有聚合鞣酸，該聚合鞣酸包含一或多種選自由(-)-表兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯及(-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯組成之群的酚類化合物，及一或多種選自由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、葡糖醛酸及半乳糖醛酸等組成之群的糖。
根據本發明之一些實施例，主要組分包括由具有(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為終端單元之化合物或具有(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為主要單元之化合物組成的聚合鞣酸。
在一個態樣中，本發明之實施例係關於製備石蓮花萃取物之方法。根據本發明之一個實施例的方法可包括以下步驟：用酒精溶劑(例如甲醇或乙醇)萃取石蓮花(GP)起始物質以產生酒精萃取物及殘餘物；使該殘餘物與該酒精萃取物分離；用二甲亞碸(DMSO)水溶液溶劑萃取該殘餘物以產生DMSO萃取物；使用具有選定的分子量截斷值之過濾器使該DMSO萃取物經歷超過濾；乾燥由該過濾器截留之級分以獲得該石蓮花萃取物。GP起始物可為GP之葉子的粉末。二甲亞碸(DMSO)水溶液溶劑含有約30% DMSO。在超過濾之前用水將DMSO萃取物稀釋至約10% DMSO。超過濾可使用切向流過濾系統來進行。選定的分子量截斷值可為約5kD。該方法可進一步包含在超過濾之前過濾DMSO萃取物。
在本發明之另一態樣中，本發明之實施例係關於石蓮花萃取物之用途，其用於治療或預防肝纖維化、肝臟硬化、肝癌、術後肝纖維化復發或術後肝癌復發。
鑒於附圖及以下描述，本發明之其他態樣將為顯而易見的。
圖1顯示根據本發明之一個實施例的GP活性萃取物之製備方法之流程圖。
圖2顯示與標準品相比的GP-T萃取物之HPLC概況。
圖3顯示根據本發明之一個實施例的GP-T活性級分之MALDI-TOF質譜。
圖4顯示根據本發明之一個實施例的GP-T活性級分之13C-NMR譜。
圖5A顯示根據本發明之一個實施例的GP-T活性級分之LC/MS分析。
圖5B顯示根據本發明之一個實施例的GP-T活性級分之MS/MS分析。
圖5C顯示GP-T活性級分之MS/MS分析的概述。
圖6A顯示陰離子層析中之標準碳水化合物之概況。
圖6B顯示根據本發明之一個實施例的GP-T之碳水化合物分析之概況。
圖7A顯示根據本發明之實施例的GP-T萃取物之肝癌細胞抑制。
圖7B顯示根據本發明之實施例的GP-T萃取物之腫瘤蛋白表現抑制。
圖7C顯示圖7A及圖7B之測試的概述結果。
圖8A顯示使用生物分析系統研究GP-T製備方法之結果。
圖8B顯示根據本發明之實施例使用生物分析來確認製備方法。
圖9A顯示根據本發明之實施例的在用GP-T治療期間之體重變化。
圖9B顯示根據本發明之實施例的GP-T萃取物抑制腫瘤形成之結 果。
圖10A顯示根據本發明之實施例使用各種藥劑治療之血清玻尿酸含量。
圖10B顯示根據本發明之實施例使用各種藥劑治療之血清層黏連蛋白含量。
圖10C顯示根據本發明之實施例之使用各種藥劑治療之血清原膠原-3N端肽(procollagen-3 N-terminal peptide；P3NP)含量。
圖11A顯示根據本發明之實施例藉由用GP-T治療的組織病理學評分之降低。
圖11B顯示病變之各個階段的病理染色。
圖12A顯示病理切片之α-SMA染色。
圖12B顯示α-SMA染色之定量及GP-T治療之效果。
圖13A顯示病理切片之H/E染色。
圖13B顯示各個治療組之肝病理症狀之概述。
圖14A為各個治療組之體重變化。
圖14B顯示各個治療組之白蛋白及膽紅素含量。
圖14C顯示各個治療組之血清肝酶標記。
圖14D顯示各個治療組之血清纖維化指標。
圖14E顯示各個治療組之腫瘤負荷。
本發明之實施例係關於自藥草、諸如石蓮花之粉末(新鮮物質可在低溫(例如<40℃)下粉碎且濃縮至較小體積，隨後冷凍乾燥)製備活性級分的方法。可用醇(例如甲醇)萃取起始物質(例如石蓮花之粉末)以移除甲醇可溶組分。接著，用30% DMSO萃取活性級分。在藉由過濾移除沈澱之後，使用適合之(例如5k)分子量截斷膜及含有10% DMSO及再蒸餾水之特定溶液在切向流過濾系統上純化濾液。此方法 提供經部分地純化及濃縮之活性級分之分離。在使參數最佳化之後，確認此方法適用於GP活性成分之大規模生產。習知管柱層析方法無法以相同規模產生本發明之活性級分GP-T。此外，習知方法將耗時較久且花費較高。
根據本發明之實施例，石蓮花之起始物質可使用地面以上的部分，諸如葉子。舉例而言，以下所描述之GP-T活性級分可使用石蓮花之葉子獲得，該等葉子經歷本文所描述之萃取及部分純化製程。石蓮花粉末起始物質可藉由磨碎葉子、濃縮及冷凍乾燥來製備，所獲得的活性級分稱為「GP-P」級分，「GP-T」為經部分純化之活性級分。
根據本發明之實施例之GP-T活性級分的活性比GP-P之彼等活性好(參見以下實例3)。在降解實驗之後，發現本發明之活性級分中的活性組分除了類黃酮單體之外含有多種單醣，且該活性組分之分子重量為約4-9kD，不同於先前技術之GP-P萃取物。此外，TFF系統比管柱層析法(例如Sephadex LH-20)簡易。TFF系統可每日加工10kg或10kg以上。其為更經濟的，因為其避免了與使用管柱層析法所需較大溶劑量相關之成本。此為TFF第一次用於GP萃取物之純化且由此獲得之萃取物顯示較高活性。因此，本申請案中所揭示之方法在較經濟及產物更具活性兩方面顯示出人意料的結果。
將使用以下特定實例說明本發明之實施例。然而，熟習此項技術者將理解，此等實例僅用於說明且其他修改或變化在不脫離本發明之範疇的情況下為可能的。
以下描述涵蓋四個部分。第一部分係關於活性級分分離及純化，其使用特定溶劑來萃取及分離活性級分。接著藉由使用適合之截斷膜(例如5kDa之截斷值)，使用超過濾來純化及濃縮萃取物。亦已確認大規模生產之參數。
第二部分係關於活體外測試。來自大鼠之肝臟星狀細胞株(HSC- T6)為肝癌細胞株。使用此細胞株，吾人可研究活性級分GP-T(已自GP-P萃取物分離)對TGF-β信號傳遞之調節及膠原蛋白形成、尤其關於累積抑制作用及抗癌活性之作用。此外，抗纖維化抗癌生物分析可用於探究及確認活性萃取物製備方法。
第三部分係關於活體內測試。二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine；DEN)可誘發肝纖維化、肝硬化及肝癌。在大鼠中使用此等活體內系統，吾人可分析GP萃取物GP-P及GP-T對抑制肝纖維化與肝癌形成及對肝功能保護之活性。此等測試可包括分析血清化學、血清纖維化因子、肝腫瘤結節數目、體重、存活率及病理切片。
第四部分係關於活性組分分析。此等分析可包括使用HPLC，諸如使用LiChrospher® Diol管柱及市售之單體與寡聚原花青素(DP2-DP10)作為參考標準品，來比較活性萃取樣本GP-T。該分析亦可包括13C-NMR與MALDI-TOF質譜分析及將結果與文獻中之資訊進行比較。此等分析指示活性組分為鞣酸。可在間苯三酚降解之後進一步分析此等鞣酸。可分析其組分之降解產物。亦可用TFA使GP-T水解以使用高效陰離子交換管柱(high performance anion exchange column；HPAEC)分析其糖組分以確認其活性組分之組成。
將藉由特定實例進一步說明本發明之實施例。熟習此項技術者將理解，此等實例僅用於說明且各種修改及變化在不脫離本發明之範疇的情況下為可能的。
製備方法 1.石蓮花粉末(GP-P)之萃取
GP-P為莊松榮製藥廠之產品，其係由金銥生命科學股份有限公司所提供的石蓮花凍乾粉末加工而成。
其他試劑及溶劑可來自任何商業來源。以下列舉各種試劑之非 限制性實例及圓括號中之其來源：甲醇及乙酸乙酯(Macron)；無水甲醇(Alfa Aesa)；(-)-表兒茶素、C15H14O6、(Sigma)；沒食子酸、C7H6O5(Fluka)；間苯三酚(C6H6O3)、L-抗壞血酸(C6H8O6)及三水合乙酸鈉(CH3COONa．3H2O)(Sigma-Aldrich)；硫酸鈉及乙酸(Merck)。
萃取方法
圖1顯示說明一種根據本發明實施例用於純化GP活性級分之方法的流程圖。如圖1中所示，將GP-P粉末浸沒於甲醇(10×GP-P粉末重量)中。藉由過濾移除甲醇可溶組分。接著，用30% DMSO(10×GP-P粉末重量)處理殘餘物。在萃取之後，可藉由離心(例如30min，8,000rpm)分離固體與液體部分。進一步過濾DMSO萃取物以獲得萃取物。用30% DMSO(10×)再處理殘餘物一次。藉由過濾來收集DMSO萃取物且與第一萃取物合併。
用再蒸餾水將經合併之DMSO萃取物稀釋至10% DMSO濃度，隨後使最終溶液經過切向流過濾(透析)。在此特定實例中，藉由Pellicon 2 MINI過濾器濾匣(5kD截斷值；來自Millipore)進行TFF透析。可藉由向濾匣中添加更多溶劑進行一次以上之透析。一旦透析完成，可收集截留之級分且乾燥(例如藉由冷凍乾燥)，得到經純化的GP-T之活性級分。
GP-T分析
可使用任何適合之分析儀器(諸如HPLC)分析產物。以下為使用HPLC分析以上經純化之活性級分的實例：
儀器及設備
‧管柱1：LiChrospher®100Diol，5μm，4.6×250mm，Merck
‧管柱1：Develosl 100Diol，5μm，4.6×250mm，Merck
‧樣本製備：GP-T(用AWA稀釋)
AWA：丙酮/水/乙酸=70/29.5/0.5
‧偵測：UV280nm
‧移動相A：CH3CN/HOAc=99/1
‧移動相B：CH3OH/H2O/HOAc=94/5/1
‧溶離移動相概況：
參考標準品：來自Sigma之原花青素(DP2-DP10)。
圖2顯示GP-T樣本與標準品(DP2-DP10)之HPLC概況。在此分析中，當用乙醇處理GP-T活性萃取物時，GP-T-1樣本為乙醇不可溶級分且GP-T-2樣本為乙醇可溶級分。該乙醇不可溶級分(GP-T-1)占總數之約90%，而該乙醇可溶級分(GP-T-2)占約10%。因此，根據本發明之實施例之GP-T活性級分含有實質上乙醇不可溶組分。如本文所用，術語「實質上不可溶」係指小於約20%之GP-T可溶於乙醇，較佳小於約15%可溶，且更佳小於約10%可溶。HPLC顯示GP-T活性級分中之組分的分子量高於原花青素DP-10(MW=2,890)。GP-T-1級分中之組分的分子量大於GP-T-2級分中之彼等組分的分子量。
MALDI-TOF質量分析確認此等組分之分子量大於DP-10之分子 量。如圖3中所示，MALDI-TOF中之主要峰主要包含約4.5kD、7.1kD及8.9kD之峰。
圖4顯示GP-T樣本之 13 C-NMR(在D2O+丙酮-d6中)譜。在與Phytochemical,67,2380-2391(2006)中之參考譜相比時，該譜指示活性級分主要包含鞣酸。
3.藥理學研究 活體外抗纖維化及抗癌測試
使用活體外系統測試GP萃取物之活性級分的藥理學特性。活體外培養肝臟星狀細胞(HSC或星形膠質細胞)及肝癌細胞(hepatoma carcinoma cell；HCC)株。使用此等細胞來評估各個批次候選GP萃取物在其抗纖維化及抗癌活性方面之活性。使用各種肝癌細胞株測試GP萃取物：GP-P及GP-T之活體外細胞毒性。對各萃取物，在五種不同濃度下進行該等測試。GP-P可抑制肝癌細胞株，例如Huh7、HepG2等。可藉由MTT細胞生存力分析觀測細胞生存力。此等細胞株之IC50值均<50μg/mL。另外，GP-P及GP-T可抑制經活化之肝臟星形膠質細胞HSC-T6的生長。
動物測試
除了活體外測試之外，亦使用活體內測試評估GP活性級分。使用威斯塔大鼠(Wistar rat)中二乙基亞硝胺(DEN)誘發之肝纖維化及肝癌模型進行動物測試。活體內測試GP萃取物抑制肝纖維化及肝癌之能力。
簡言之，向威斯塔大鼠餵食0.01% DEN飲用水持續9週以誘發肝纖維化、肝硬化及肝癌。在DEN治療之後的四週，經口給予大鼠不同劑量之GP-P及GP-T萃取物。在藥物治療之前及在藥物治療之後每兩週獲得血清樣本。使該等血清樣本經歷血液化學分析以評估血清纖維化因子濃度。在六週的藥物治療之後，處死大鼠且分析以下生物標 記。
˙血液化學分析：AST/ALT/r-GT/膽紅素/白蛋白/膽固醇；˙血漿纖維化因子分析：玻尿酸/P3NP/層黏連蛋白；˙肝臟結節數目、癌症發病率及存活率；及˙病理切片及評估。
特定言之，五週至六週齡的威斯塔大鼠係自國立臺灣大學醫學院(National Taiwan University Medical School)之動物中心獲得。給予大鼠100ppm DEN之飲用水，且每週在餵食時間對其稱重。基於體重之增加，DEN之濃度相應增加。DEN之餵食持續9週，其足以誘發肝硬化及肝癌發生。自大鼠移除肝癌用於癌症復發研究。
在兩種不同濃度下對測試樣本(GP-T)進行測試且向大鼠投與測試樣本四週(自第九週至第十三週)。使用吡非尼酮(pirfenidone)作為陽性對照物。在該等測試中，各組包括6-8隻大鼠。使用大鼠模型及食品中的GP測試樣本之不同濃度進行測試以評估其對肝纖維化及肝癌復發之作用。
以上描述本發明之實施例的各種態樣。以下將使用特定實例進一步說明本發明之實施例。實例1顯示純化GP-T活性級分之特定實例。實例2顯示GP萃取物之活性級分的組成分析。實例3顯示GP-T之抗纖維化及抗癌活性的分析。實例4顯示動物模型中之抗纖維化及抗癌活性。實例5顯示使用動物之醫藥評價，在該動物中已移除DEN誘發之腫瘤。此等特定實例僅用於說明。熟習此項技術者將理解，來自此等特定實例之其他修改及變化在不脫離本發明之範疇的情況下為可能的。
實例1：GP-T之製備
˙甲醇萃取：稱重450g之起始物質且置放於5L血清燒瓶中，且接著添加4,500mL甲醇。使該萃取進行兩天； ˙藉由抽吸過濾移除該甲醇萃取物，且將殘餘物置放於血清燒瓶中。添加4,500mL之30% DMSO且使該萃取進行5天；˙藉由在4℃、8,000rpm下離心30min來收集該30% DMSO萃取物。在4℃下儲存該萃取物；˙量出4,000mL之30% DMSO萃取物且將其置放於20L空桶中。添加8,000mL的milli-Q水且很好地混合以產生10% DMSO萃取物溶液，使其在4℃下靜置2天；˙經由具有1μm孔徑之過濾器過濾該萃取物溶液；˙接著，經由具有0.2μm孔徑之第二過濾器進一步過濾濾液；˙使用切向流過濾(TFF)系統及5kD截斷值過濾器匣，用泵循環以上濾液。調節流動速率且進料端壓力在約12.5psi下，而濾液端壓力在約10psi下。在此等條件下，該濾液以約90-100mL/min之速率流出；˙當將樣本濃縮至約500mL(約為原始樣本體積之1/20)時，使用蠕動泵(具有在約10-15下之流動速率)連續地添加以下溶劑：10% DMSO(2.5L，約為原始樣本體積之¼)及Milli-Q水(5L，約為該濃縮樣本體積的10倍)。持續透析直至該體積變為約原始樣本體積之1/20；˙最後，自保留物端將產物收集於燒杯中。凍乾該產物以得到冷凍乾燥之GP-T樣本。
雖然以上程序報導了用於製備GP-T之特定參數，但提供特定參數用於最佳化生產。熟習此項技術者將理解，在不脫離本發明之範疇的情況下可改變或修改此等參數之一些或所有。
實例2：組成分析
間苯三酚降解可用於分析組成GP-T樣本之活性級分的組分。簡言之，在酸及間苯三酚存在下使GP-T樣本水解且接著藉由適合之分 析儀器(諸如LC/MS)分析降解產物。以下概述GP-T樣本降解之程序：˙向GP-T之樣本(30mg)中添加6mL之含有50mg/mL之間苯三酚的於MeOH中之0.1%鹽酸；˙向以上溶液中添加10mg/mL之抗壞血酸；˙在50℃下加熱所得溶液30min；˙向反應溶液中添加30mL之40mM CH3COONa；˙在蒸發MeOH之後，用乙酸乙酯(ethyl acetate，EA；以1：1之比率)分配剩餘含水混合物；及˙用LC-MS分析EA層。
對於使用LC/MS系統之分析，可使用以下例示性參數：˙管柱：Waters Associate；Symmetry Shield RP18，5μm，4.6mm×150mm；˙偵測器：UV 280nm及ESI-MS(負離子及正離子)；˙注入體積：10μL˙樣本：在MeOH中˙流動速率：1mL/min˙移動相梯度如下：
圖5A顯示來自LC/MS分析之結果。基於此分析，GP-T活性級分中之活性組分主要為聚合鞣酸類型之大分子。基於間苯三酚降解反應，已發現活性組分主要包含(-)-表兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯及(-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯作為構築單元。活性化合物主要為具有(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為終端單元之化合物或主要為具有(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為主 要單元之化合物。
為了進一步識別GP-T樣本中之化學實體，對樣本進行LC/MS/MS分析。LC管柱之條件為：˙UHPLC：dionex Ultimate 3000˙管柱：Thermo Hypersil Gold C18，50×2.1mm，1.9μm；˙樣本：溶解於0.1% TFA中；˙注入體積：5μl；˙梯度條件：
MS分析條件：˙質譜儀：Thermo Scientific Q-Exactive；˙電噴霧電壓：-3,500V；˙正規化碰撞能量：25V；˙解析度：140,000；˙萃取窗：5ppm。
圖5B顯示來自MS/MS分析之代表性譜及鞣酸化合物之預測結構。圖5C顯示幾個代表性峰及其可能的結構之概述表。
糖組成分析
亦使GP-T活性級分經歷糖分析。高效陰離子交換層析(High-performance anion-exchange chromatography；HPAEC)可基於陰離子交換層析用於分析多醣之糖組成。此技術利用單醣單元上之負電荷來 與管柱上之陰離子交換。可藉由不同離子強度之移動相自該等管柱溶離不同糖。可藉由脈衝安培型金電極使用電化學偵測器監測不同單糖組分之溶離。對於使用HPAEC之分析，可使用1N三氟乙酸(TFA)來使用於分析之樣本水解以產生單醣，隨後凍乾以移除TFA。
分析中所用之HPAEC移動相概況顯示於下表中。
A：8.75mM Ba(OH)2溶液，其平衡於17.5mM NaOH
B：100mM NaOH、100mM NaOAc、2mM Ba(OH)2
圖6A顯示HPAEC分析中之各種標準糖。在圖6A中，標記為1至7之峰如下：分別為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、內標、半乳糖醛酸、葡糖醛酸。
圖6B顯示GP-T樣本之TFA水解產物的HPAEC分析結果。自此等結果可得出以下結論：GP-T活性級分含有阿拉伯糖、半乳糖及葡萄糖作為主要糖份且含有鼠李糖、半乳糖醛酸及葡糖醛酸作為次要組分。
實例3：GP-T之抗纖維化及抗癌活性的分析
使用活體外分析來分析GP-T活性級分之生物活性。特定言之，使用肝星形膠質細胞及肝癌細胞(HCC)之活體外細胞培養物用於分析GP候選產物之抗纖維化及抗癌活性。使用此生物分析系統，研究GP萃取物製備程序且確認活性。
首先，使用HCC細胞株，比較由Huang(美國專利申請公開案第2012/0259004號)所揭示之GP-P萃取物(HH-F3)與本申請案之不同批次 GP-T萃取物的細胞毒性及其抑制HCC細胞株中癌蛋白表現(AURKA，CEP55)之能力。
隨後，使用生物分析平台評估GP-T製備方法及評估其抗纖維化與抗癌活性。舉例而言，使用HSC-T6與HCC細胞株中之AURKA/B(極光激酶A/B)、CEP55(55kDa中心體蛋白)、PTEN(磷酸酶及張力蛋白同源蛋白)及α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)來比較相等劑量之GP-C2(含DMSO)及GP-W2(DMSO去除))的活性。結果顯示，最後製程修改後GP-T藥物(GP-W2和GP-C2)與原先中榮、陽明石蓮花研發成果Huang(US 2012/0259004)中所揭示的HHF3相似，具有抗纖維化及抗癌細胞活性。
隨後，吾人可分析不同批次GP-T萃取物之抗纖維化活性。使用大鼠肝星形膠質細胞株HSC-T6，吾人可研究不同批次GP-T萃取物對TGF-β信號傳遞調節機制及膠原蛋白形成累積之抑制的作用。以兩種不同劑量使用兩個不同批次GP-T萃取物GP-8-4及GP-8-4-2以評估在TGF-β誘發存在或不存在下對HSC-T6細胞中之COL I與III及平滑肌α-肌動蛋白之表現量的作用。來自此研究之結果指示，在TGF-β誘發存在下，兩種萃取物均顯示約50ug/mL之有效劑量。因此，此兩個批次並未顯示其在抗纖維化活性方面的顯著差異。
圖7A顯示具有針對HCC細胞株之細胞毒性的各個批次GP-萃取物。圖7B顯示各種GP萃取物對HCC細胞株中之癌蛋白表現的作用。結果顯示GP萃取物具有抑制HCC細胞株(Huh7及Mahlavu)中之癌蛋白表現的能力。
此等測試結果概述於圖7C中所示之表中。在此表中，GP、GP-1、HH-F3、GP-7-1、GP-8-1、GP-8-2、GP-8-3、GP-8-4、GP-8-4-1、GP-8-4-2、GP-9、GP-F20及GP-F30分別表示GP-P(來自陽明醫科大學(Yang Ming Medical University),Taipei,Taiwan之參考樣本)、GP-P(來 自生物技術研發中心(Development Center for Biotechnology).Taipei.Taiwan)、來自陽明醫科大學之活性級分，且其餘為不同批次之GP-T萃取物。
圖7C中所示之結果指示GP-P及GP-T在殺死(細胞毒性)HCC細胞株Huh7及Mahlavu中均有效。IC50值相差約5倍，其中GP-T萃取物顯示之活性優於GP-P之活性。此等活性級分之整體作用可概述為：GP-9、HH-F3>GP-7-1、GP-8-1>GP-8-4-1、GP-8-4-2>GP-8-2、GP-8-3、GP-8-4>GP-F20>GP-F30。
生物分析系統(抗纖維化及抗癌分析)可用於監測或修改GP-T活性級分製備方法。舉例而言，圖8A顯示使用癌蛋白表現來監測不同批次GP-T萃取物。圖8A中所示之結果指示抗纖維化分析及抗癌分析可用於確認製備GP-T活性級分之最佳製備方法。在確認之製備條件下，兩個不同批次GP-T萃取物可具有相似或相同活性。
相似地，HSC-T6及癌細胞株(Huh 7)中之AURKA/B(極光激酶A/B)、CEP55(55kDa中心體蛋白)、PTEN(磷酸酶及張力蛋白同源蛋白)及a-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)蛋白表現可用於監測來自相同方法之不同批次GP-T、GP-Ta及GP-Tb以及藉由不同製備方法產生之萃取物：GP-T、GP-C2(含有DMSO)及GP-W2(其中DMSO移除)。結果顯示，使用最終確定之製備方法，GP-T活性萃取物(GP-W2及GP-C2)與HHF3相比具有相似抗纖維化及抗癌活性(參見圖8B)。
圖8B亦顯示，在TGF-β誘發存在及不存在下，吾人可分析HSC-T6中之COL I與III及α-平滑肌肌動蛋白表現量。結果顯示，在TGF-β誘發存在下，GP-8-4與GP-8-4-2均具有相似抗纖維化活性。兩者之有效劑量均為約50μg/ml(圖8B)。
實例4：動物模型中之抗纖維化及抗癌活性
實驗組：動物分組視實驗設計而定。通常，對照組包括N=6-8隻 大鼠；DEN組、藥物組及陽性對照組(例如索拉非尼(sorafenib)(30mg/kg)、GP-T 50mg/kg及150mg/kg)各包括平均10-12隻大鼠。剩餘大鼠可用作用於研究DEN誘發下之存活率的DEN誘發組。
統計分析：資料呈現為平均值±平均標準誤差(SEM)。使用Prism統計軟體用T-檢驗來計算p值，其中p<0.05指示顯著差異且由*指示；p<0.01指示高度顯著差異且由**指示；及p≦0.001指示極其顯著差異且由***指示。或者，可使用單因素方差分析(one way ANOVA)進行統計分析且用Turtkey進行分析。若不同組之間未指示相同符號，則其意謂其間差異為顯著的(p<0.05)。
4-1：GP萃取物之應用顯著地改善DEN大鼠之體重、肝腫瘤結節及腫瘤發病率。
可使用體重量測及肝結節尺寸與數目來分析GP-T萃取物是否可抑制DEN誘發肝癌之速率。處死持續六週餵食50mg/kg及150mg/kgGP-T萃取物之大鼠且評估肝之結節數目及結節長度與寬度，接著使用其基於V=L×W2/2來計算結節體積。有任何尺寸大於3mm之腫瘤結節視為結節。此等參數用於評估測試藥物預防DEN大鼠肝纖維化、肝硬化及肝癌發病率與癌症程度之能力。
體重變化與癌症發病率如下表：
圖9A顯示在治療時期期間之體重變化。圖9B顯示不同治療組之總表面結節體積。此等結果來自使用體重及肝腫瘤結節體積來評估GP-T是否可抑制大鼠中之DEN誘發肝癌的實驗。向大鼠經口餵食50 mg/kg或150mg/kg GP-T活性萃取物持續六週。接著，犧牲大鼠以量測結節數目及結節長度與寬度。基於V=L×W2/2計算結節之體積。對於任何尺寸大於3mm之任何結節，計數結節之數目。此等參數用於評估GP-T萃取物是否可抑制DEN誘發之肝癌形成的速率及程度。
顯而易見的是，GP萃取物可減少DEN誘發之大鼠肝結節體積、結節數目且維持體重增加。關於維持體重增加、存活率及腫瘤發病率，DEN治療組具有73%存活率，而GP-T治療組具有100%存活率。因此，GP顯示在預防DEN誘發之癌症死亡方面的極佳活性。關於維持體重增加，150mg/kg GP-T治療組顯示實質性體重增加，在相同六週治療時期期間，正常大鼠平均生長48g；DEN治療組失去32.9g；及30mg/kg索拉非尼(sorafenib)治療組增加19.5g(約為正常組之50%)。因此，與索拉非尼(sorafenib)組相比，GP-T治療組在維持體重增加方面具有較好效果。特定言之，用150mg/kg GP-T治療之組增加體重比正常組多10%以上。在150mg/kg GP-T治療組中，DEN治療的大鼠中之腫瘤發病率(12隻中之2隻)及腫瘤總體積(42.4mm3)指示GP-T治療顯著地抑制肝癌生長。
來自此等實驗的結果顯示，GP可顯著地減少由DEN治療誘發之肝損害及體重損失。用150mg/kg治療之組顯示最佳效果，甚至比用30mg/kg索拉非尼(sorafenib)治療之陽性對照組好。
4-2：GP治療顯著地改善DEN治療之大鼠中的血清纖維化因子
ELISA可用於分析血清纖維化因子含量，進而評估GP-T治療是否可抑制大鼠中DEN誘發之肝纖維化。實驗設計為藉由經口投與50mg/kg及150mg/kg之GP-T萃取物來治療具有肝損害之大鼠。該治療持續六週。在GP-T治療之前且在犧牲大鼠時獲得血清樣本。對血清樣本分析血清中之玻尿酸、原膠原-3N端肽(P3NP)及層黏連蛋白含量。
圖10A顯示在藉由各種藥劑治療之前及之後血清玻尿酸含量之變 化。圖10B顯示在藉由各種藥劑治療之前及之後血清層黏連蛋白含量之變化。圖10C顯示在藉由各種藥劑治療之前及之後血清原膠原-3 N端肽(P3NP)之變化。
此等結果顯示50mg/kg GP-T治療顯著地降低了血清HA、P3NP及層黏連蛋白含量(p<0.05，單因素方差分析)。另外，在六週治療時期期間，在150mg/kg GP-T治療組中，血清玻尿酸維持在接近正常組之含量的恆定含量下。此等結果清楚地顯示GP可顯著地減少DEN誘發之大鼠中的血清纖維化因子的增加。因此，GP萃取物可用作活體內抗纖維化劑。
4-3：GP-T抑制DEN誘發之肝纖維化
用馬森氏(Masson's)三色膠原染色(TRI染色)使石蠟包埋之肝組織切片染色以分析GP-T治療是否改善動物中DEN誘發之肝纖維化。結果顯示門管區周圍及中心靜脈與竇狀隙之間區域的膠原蛋白纖維沈澱。基於布倫特(Brunt)纖維化分級系統，將嚴重性分類為五個類別：0=未發生纖維化；1=門脈纖維化；2=纖維化門脈擴展；3=橋狀纖維化；及4=肝硬化(參見圖11B)。(Hepatology，第30卷，第241-246頁，2000)。
圖11A顯示樣本之組織病理學評分。圖11B顯示病變之各個階段的染色影像。如可看出，DEN誘發之大鼠中的纖維化通常屬於最嚴重類別：肝硬化。所有用GP-T治療之大鼠顯示動物中DEN誘發之肝纖維化的程度降低，特定言之，用150mg/kg GP-T治療之組顯示2或2以下之纖維化程度。此等結果指示GP可有效地減緩或停止肝纖維化之進程。
4-4：GP-T抑制DEN誘發之肝星形膠質細胞活化
組織切片染色之α-SMA特殊免疫化學染色可用於研究GP-T治療是否改善DEN誘發之肝星狀細胞活化的程度。另外，吾人可量化治療 效果。
如圖12A中所示，正常大鼠組織切片之病理學研究揭示僅在血管之平滑肌周圍發現經活化之星形膠質細胞。在經治療之大鼠組織切片中，大量經活化之星形膠質細胞分佈於門管區周圍及分佈於竇狀隙間隔周圍之組織中。然而，在以下所有經藥物治療之組中：索拉非尼(sorafenib)組(S)、GP-T 50mg/kg組(GP-T-L)及GP-T 150mg/kg組(GP-T-H)，存在數目顯著降低的經活化之星形膠質細胞。
圖12B顯示在藉由各種藥物治療之後的數量資料。其中，150mg/kg GP-T治療組顯示尤其良好的結果(p<0.001)。此等結果顯示GP可抑制DEN誘發之肝星形膠質細胞活化，進而減少膠原蛋白之合成及累積。
4-5：GP-T抑制DEN誘發的肝組織損害
藉由蘇木精及曙紅染色的石蠟包埋之肝組織切片可用於研究GP-T是否可改善DEN誘發之肝組織損害。可將肝組織損害分類成五個類別：1、2、3、4及5，分別表示極其輕微損害、輕微損害、中等損害、中等嚴重損害及嚴重損害，而0指示完全無損害。結果在各組中顯示為「中等」值。組合病理性檢查結果顯示DEN誘發之肝損害主要包括肝纖維化、肝結節復發、圓細胞增生、膽管增生、膽管囊腫、肝臟細胞突變等。
如圖13A中所示，GP-T(50mg/kg及150mg/kg)治療均減輕肝損害，尤其在用高劑量(其產生最少肝損害)的情況下。圖13B概述不同治療組之各種參數的結果。此等結果顯示GP在改善DEN誘發之肝損害中有效。
實例5：使用其中已移除DEN誘發之腫瘤的動物來進行的醫藥評價
自國立臺灣大學醫學院之動物中心獲得雄性五週至六週齡威斯塔大鼠。向大鼠餵食含有100ppm致癌物二乙基亞硝胺(DEN)之飲用 水。在餵食時期期間，每週對大鼠進行稱重。根據體重增加來增加DEN濃度。在連續餵食9週之後，DEN足以在大鼠中誘發肝硬化及肝癌。在9週時期之後藉由手術移除肝癌。接著，用兩種不同劑量之測試藥物(GP-T)治療大鼠四週(自第九週至第十三週)。給予一些大鼠吡非尼酮(pirfenidone)作為陽性對照物。在此實驗中，各組具有n=6-8隻大鼠。此實驗使用大鼠模型，伴隨使用不同劑量之測試藥物餵食大鼠，來評價測試藥物對肝硬化及肝癌之復發的影響。
圖14A顯示各個組之體重變化。圖14B顯示各個組之白蛋白及膽紅素的變化。
在腫瘤切除之後，由GST-p(+)密度呈現之癌發生在吡非尼酮(pirfenidone)組、GP-T(H)組及GP-T(L)組中降低。最終腫瘤負荷在GP-T(H)組及GP-T(L)組中降低(圖14E)。然而，吡非尼酮顯示對腫瘤移除之後的癌發生之復發無預防性作用。此等結果顯示，在預防肝纖維化及肝癌之復發的測試中，用每天50mg/kg及每天150mg/kg治療之大鼠顯示的結果比陽性對照組好。
白蛋白、總膽紅素、天冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase；AST)及丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase；ALT)含量之血清化學分析顯示GP治療具有肝功能保護作用(圖14C)。
圖14D顯示各個組之纖維化指標。肝中之羥脯胺酸含量(左圖)在吡非尼酮組、GP-T(H)組及GP-T(L)組中顯著降低。所有治療組之天狼星(Sirius)染色面積(右圖)顯著減小。基於纖維化指標，肝中之羥脯胺酸的含量及天狼星染色面積亦指示兩個GP治療組均具有改善肝纖維化之顯著效果，其中用每天150mg/kg GP-T治療顯示之結果優於用每天50mg/kg GP-T治療及用每天200mg/kg吡非尼酮治療之結果。此意謂此等組中之肝纖維化得到改善。基於腫瘤發生指數(GST-p(+)密度)及腫瘤負荷，GP-T顯示之結果亦比陽性對照物好。
雖然已相對於有限數目之實施例描述本發明，但具有本發明權益之熟習此項技術者將瞭解，可設計不脫離如本文所揭示之本發明範疇的其他實施例。因此，本發明之範疇應僅受所附申請專利範圍限制。

Claims (12)

  1. 一種製備石蓮花(Graptopetalum paraguayense)萃取物之方法，其包含：用酒精溶劑萃取石蓮花(GP)起始物質，產生酒精萃取物及殘餘物；使該殘餘物與該酒精萃取物分離；用二甲亞碸(DMSO)水溶液溶劑萃取該殘餘物，產生DMSO萃取物；該DMSO萃取物使用具有選定分子量截斷值之過濾器進行超過濾；乾燥由該過濾器截留之級分，獲得該石蓮花萃取物。
  2. 如請求項1之方法，其中該GP起始物質為GP之葉子的粉末。
  3. 如請求項1之方法，其中該二甲亞碸(DMSO)水溶液溶劑含有約30% DMSO。
  4. 如請求項3之方法，其中在超過濾之前，使用水稀釋該DMSO萃取物至約10% DMSO。
  5. 如請求項1之方法，其中該超過濾法係使用切向流過濾系統進行。
  6. 如請求項1之方法，其中該選定的分子量截斷值為約5kD。
  7. 如請求項1之方法，其中該酒精溶劑為甲醇。
  8. 如請求項1之方法，其進一步包含在超過濾之前過濾該DMSO萃取物。
  9. 一種石蓮花萃取物，其藉由如請求項1之方法製備。
  10. 如請求項9之萃取物，其中該萃取物包含聚合鞣酸，該聚合鞣酸包含一或多種選自由(-)-表兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素、(-)-表 沒食子兒茶素沒食子酸酯及(-)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯組成之群的酚類化合物，及一或多種選自由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、葡糖醛酸及半乳糖醛酸組成之群的糖化合物。
  11. 如請求項10之萃取物，其中該聚合鞣酸包含(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為終端單元，或其中該聚合鞣酸包含(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯作為主要單元酚類化合物。
  12. 一種治療或預防肝纖維化、肝臟硬化、肝癌、術後肝纖維化或肝癌復發之方法，其包括：向有需要之個體投與治療有效量的如請求項9之萃取物。
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