CN112156117B - 垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用 - Google Patents

垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112156117B
CN112156117B CN202010993563.0A CN202010993563A CN112156117B CN 112156117 B CN112156117 B CN 112156117B CN 202010993563 A CN202010993563 A CN 202010993563A CN 112156117 B CN112156117 B CN 112156117B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sphagnum
alcohol extract
liver cancer
cells
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010993563.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112156117A (zh
Inventor
李金耀
马荣斌
周方方
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinjiang Qianjin Glory Investment Co ltd
Original Assignee
Xinjiang Qianjin Glory Investment Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinjiang Qianjin Glory Investment Co ltd filed Critical Xinjiang Qianjin Glory Investment Co ltd
Priority to CN202010993563.0A priority Critical patent/CN112156117B/zh
Publication of CN112156117A publication Critical patent/CN112156117A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112156117B publication Critical patent/CN112156117B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/10—Bryophyta (mosses)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明提供了垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用，属于医药领域。本发明的垂枝藓醇提物的制备方法通过无水乙醇对垂枝藓进行提取，得到垂枝藓醇提物。实施例结果表明，本发明得到的垂枝藓醇提物呈剂量依赖性地抑制肝癌细胞的生长，并且对小鼠脾脏细胞无毒性作用；垂枝藓醇提物通过线粒体途径及死亡受体途径激活caspase信号通路，诱导肝癌细胞凋亡；垂枝藓醇提物还能够显著增加小鼠脾脏指数和免疫细胞的数量，从而提高机体免疫力，能够进一步提高抗肿瘤效果。本发明制备的垂枝藓醇提物抗肿瘤效果显著，且为纯天然成分，安全无毒，为新型抗肝癌药物的研发奠定基础。

Description

垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药 物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及垂枝藓醇提物及其制备方法和垂 枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术
肝癌是发病率和死亡率高、预后极差的恶性肿瘤之一，主要包括 原发性肝癌和继发性肝癌，肝细胞癌(HCC)约占原发性肝癌的90％。 恶性肿瘤中肝癌发病率和死亡病例均较高，男性的肝癌发病率位居恶 性肿瘤的第三位，死亡率高居恶性肿瘤的第二位；女性肝癌发病率和 死亡率分别位居于恶性肿瘤的第七位和第三位。随着科学技术的不断 发展，目前在肝癌预防和诊断方面取得了进展。在肝癌早期，化疗、 手术切除、肝移植、局部消融等治疗方法可以提高患者的生存率；但 5年复发率很高，即使肝癌患者接受了潜在的治疗，复发率也可能高 达80％～90％，且80％HCC患者被诊断为晚期肝癌，中位生存期仅 6～8个月，缺乏有效的治疗方案。小分子靶向治疗药物索拉非尼和瑞 格拉非尼是目前FDA批准的标准治疗晚期肝癌方法，索拉非尼是目 前唯一可用于晚期肝癌的标准一线系统治疗药物，但中位生存期仅为 12.3个月；瑞格拉非尼是一种二线系统治疗药物，中位生存期仅为10.6个月；尽管索拉非尼和瑞格拉非尼能提高肝癌患者的整体生存 率，但时效短，易产生耐药性，预后仍然很差，患者抗肿瘤免疫无能 或低下，易复发。晚期肝癌患者对于化疗药物的不敏感、肿瘤细胞易 对化疗产生耐受成为亟待解决的问题，因此寻找安全、高效低毒且逆 转耐药的新型肝癌治疗或辅助型药物迫在眉睫。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了垂枝藓醇提物及其制备方法和 垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明的垂枝藓醇提物的 制备方法得到的醇提物可显著抑制肝癌细胞的生长、诱导肝癌细胞的 凋亡和坏死，同时还可以增强机体免疫力，抗肝癌细胞效果显著，且 为纯天然成分，安全无毒，为新型抗肝癌药物的研发奠定基础。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种垂枝藓醇提物的制备方法，包括如下步骤：
采用无水乙醇对垂枝藓进行提取，得垂枝藓醇提物；所述垂枝藓 的质量与无水乙醇的体积比为1g：(10～20ml)。
优选的，所述提取的温度为50～60℃，所述提取的时间为2～3h。
本发明提供了上述技术方案中所述制备方法得到的垂枝藓醇提 物，所述垂枝藓醇提物包括多糖和黄酮，所述多糖的质量百分含量为 25％～35％，所述黄酮的质量百分含量为3％～5％。
本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。
本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备抗肝癌细胞H22、 BEL-7404和HepG2药物中的应用。
本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备阻滞肝癌细胞周期于 G0/G1期药物中的应用。
本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备诱导肝癌细胞凋亡和 坏死药物中的应用。
本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备降低肝癌细胞线粒体 膜电位药物中的应用。
本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备提高机体免疫力药物 中的应用。
本发明提供了一种抗肝癌药物，包括垂枝藓醇提物和辅料。
有益效果：
本发明提供了垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制 备抗肝癌药物中的应用。本发明的垂枝藓醇提物的制备方法通过无水 乙醇对垂枝藓进行提取，得到垂枝藓醇提物。实施例结果表明，垂枝 藓醇提物呈剂量依赖性地抑制肝癌细胞H22、BEL-7404和HepG2的 生长，并且对小鼠脾脏细胞无毒性作用；可通过阻滞H22细胞周期 于G0/G1期，从而抑制H22细胞的增殖；另外，垂枝藓醇提物还能 够显著诱导肝癌细胞的凋亡和坏死，垂枝藓醇提物可显著降低线粒体 膜电位，提高肝癌细胞的活性氧的水平，提高促凋亡蛋白Bax和细胞 色素C的蛋白水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白水平，通过线粒体 途径及死亡受体途径激活caspase信号通路，诱导肝癌细胞凋亡；垂 枝藓醇提物还能够显著增加小鼠脾脏指数和免疫细胞的数量，从而提 高机体免疫力，能够进一步提高抗肿瘤效果。垂枝藓醇提物抗肿瘤效 果显著，且为纯天然成分，安全无毒，为新型抗肝癌药物的研发奠定 基础。
附图说明
图1为实施例4垂枝藓醇提物对肝癌细胞H22生长的影响图；
图2为实施例5垂枝藓醇提物对H22细胞周期的影响图；
图3为实施例6垂枝藓醇提物对肝癌细胞凋亡影响图；
图4为实施例7垂枝藓醇提物对线粒体膜电位的影响图；
图5为实施例7垂枝藓醇提物对H22细胞活性氧水平的影响图；
图6为实施例7垂枝藓醇提物对凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)及 细胞色素c蛋白水平的影响图；
图7为实施例7垂枝藓醇提物对H22细胞caspase信号通路相关 蛋白(Caspase 9、Cleaved caspase 9、Caspase 8、Cleaved caspase 8、 PARP、Cleaved PARP)的影响图；
图8为在caspase 3抑制剂Z-VAD-CHO预处理后垂枝藓醇提物对 H22细胞凋亡的影响图；
图9为实施例8垂枝藓醇提物对小鼠体重的影响图；
图10为实施例8垂枝藓醇提物对小鼠器官指数(肝脏指数、心脏 指数、肾脏指数、肺脏指数、脾脏指数及胸腺指数)的影响图；
图11为实施例8垂枝藓醇提物对小鼠脾脏中T细胞、B细胞、NK细胞及活化的CD4+及CD8+T细胞数量的影响图。
图12为实施例8垂枝藓醇提物对小鼠脾脏中巨噬细胞、树突状细 胞数量及其成熟的影响图。
具体实施方式
本发明提供了一种垂枝藓醇提物的制备方法，包括如下步骤：
采用无水乙醇对垂枝藓进行提取，得垂枝藓醇提物；所述垂枝藓 的质量与无水乙醇的体积比为1g：(10～20ml)。
本发明采用无水乙醇对垂枝藓进行提取，得垂枝藓醇提物。在本 发明中，所述垂枝藓优选为垂枝藓粉末，以垂枝藓粉末作为提取的原 料可以使垂枝藓中的有效成分更加充分的释放，提高垂枝藓醇提物有 效成分的含量，提高垂枝藓醇提物抗肝癌细胞的效果。本发明采用无 水乙醇对垂枝藓进行提取，所述垂枝藓的质量与无水乙醇的体积比为 1g：(10～20ml)，进一步优选为50～60℃，更进一步优选为60℃。 在本发明中，所述垂枝藓优选以粉末的形式进行提取，有利于活性物 质的溶出。在本发明中，所述提取的温度优选为50～65℃，进一步优 选为50～60℃，更进一步优选为60℃；所述提取的时间优选为2～3h， 进一步优选为2h。提取后，本发明优选将提取液进行离心，所述离 心的转速优选为6000～8000rpm，进一步优选为8000rpm；所述离心 的时间优选为10～20min，进一步优选为15min。离心后，将沉淀继续 提取2～4次，将多次提取、离心后的上清液合并。得到合并后的上清液后，本发明优选将合并后的上清液进行过滤，得到滤液。本发明优 选将得到的滤液进行浓缩，得到垂枝藓醇提物。本发明通过无水乙醇 对垂枝藓进行提取，可有效提取垂枝藓中的活性物质，使得到的垂枝 藓醇提物具有显著的抗肝癌细胞的效果，同时，还能够增强机体免疫 力，提高抗癌效果，且为纯然天提取物，对机体无毒副作用，安全性 能高。进一步的，本发明控制提取过程中垂枝藓和提取剂的相对用量、 提取温度和提取时间，可以使有效成分更加充分的溶出，提高醇提物 有效成分的含量，进而提高醇提物抗肝癌细胞的效果。
本发明提供了上述技术方案中所述制备方法得到的垂枝藓醇提 物，所述垂枝藓醇提物包括多糖和黄酮。在本发明中所述垂枝藓醇提 物中多糖的质量百分含量为25％～35％，进一步优选为30％；所述黄 酮的质量百分含量为3％～5％，进一步优选为4％。本发明提供的垂枝 藓醇提物对肝癌细胞具有良好的抑制作用，垂枝藓醇提物通过线粒体 途径及死亡受体途径激活了caspase信号通路，诱导了肝癌细胞凋亡； 同时，垂枝藓醇提物能够提高机体免疫力，能够进一步提高抗肿瘤效 果。
本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。在 本发明中，所述垂枝藓醇提物优选本发明所述制备方法得到的垂枝藓 醇提物。
本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备抗肝癌细胞H22、 BEL-7404和HepG2药物中的应用。
本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备阻滞肝癌细胞周期于 G0/G1期药物中的应用。
本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备诱导肝癌细胞凋亡和坏 死药物中的应用。
本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备降低肝癌细胞线粒体膜 电位药物中的应用。
本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备提高机体免疫力药物中 的应用。
在上述应用中，所述垂枝藓醇提物制备方式与前述垂枝藓醇提物 制备方法的技术方案一致，在此不再赘述。
本发明提供了一种抗肝癌药物，包括垂枝藓醇提物和辅料。在本 发明中，所述抗肝癌药物中的垂枝藓醇提物优选为前述垂枝藓醇提物 制备方法得到的垂枝藓醇提物。本发明对药物的剂型、药物的敷料和 药物的制备方法无特殊要求，采用本领域技术人员熟知的即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的垂枝藓 醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用进 行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
垂枝藓醇提物的制备
垂枝藓采集于新疆木垒林场和乌鲁木齐南山小渠子林场，取干燥 垂枝藓植物体，粉碎得到粉末；将垂枝藓粉末与无水乙醇按质量体积 比为1g：20ml在60℃水浴回流提取2h；然后将提取液在8000rpm 条件下离心15min，取上清，沉淀继续回流提取3次。离心、合并上 清；将合并后的上清过滤，滤液经旋蒸浓缩至无乙醇味，干燥，得垂 枝藓醇提物(Rhytidium rugosum ethanol extract，RREE)。将RREE 用二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为30mg/ml，采用苯酚-硫酸法测 定多糖含量，其多糖质量百分含量为28.9％；采用碱性法测定黄酮含 量，其黄酮的质量百分含量为4.6％。
苯酚-硫酸法的参考文献为：Dubois M,Gilles KA,Hamilton J K, etal.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry,1956,28(3):350-356.
碱性法测定黄酮的参考文献为：Swamy M K,Sinniah U R,Akhtar M.In vitropharmacological activities and GC-MS analysis of different solvent extractsof Lantana camara leaves collected from tropical region of Malaysia[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2015,2015:506413.
实施例2
垂枝藓醇提物的制备
制备过程同实施例1，不同之处在于：垂枝藓粉末与无水乙醇按 质量体积比为1g：10ml在60℃水浴回流提取3h；然后将提取液在 6000rpm条件下离心20min，取上清，沉淀继续回流提取4次。
得到的垂枝藓醇提物经DMSO溶解后，浓度为30mg/ml；多糖 质量百分含量为25.4％；黄酮的质量百分含量为4.1％。
实施例3
垂枝藓醇提物的制备
制备过程同实施例1，不同之处在于：垂枝藓粉末与无水乙醇按 质量体积比为1g：20ml在50℃水浴回流提取3h；然后将提取液在 8000rpm条件下离心20min，取上清，沉淀继续回流提取3次。
得到的垂枝藓醇提物经DMSO溶解后，浓度为30mg/ml；多糖 质量百分含量为32.5％；黄酮的质量百分含量为3.2％。
实施例4
垂枝藓醇提物体对肝癌细胞生长的影响
1垂枝藓醇提物体对肝癌细胞H22生长的影响
将肝癌细胞培养至对数生长期，以实施例1制备得到的垂枝藓醇 提物(RREE)在体外处理H22细胞(购自American Type Culture Collection)，其中RREE的浓度分别为50、100、200、400μg/ml。 以未做任何处理的细胞作为空白对照1，以DMSO处理的细胞作为空 白对照2，以顺铂(cisplatin，临床上的一种常用化疗药物)处理的细 胞作为阳性对照，顺铂的浓度为30μg/ml。各实验组处理24h后，在 显微镜下观察细胞数量，结果见图1；采用MTT法(Sigma-Aldrich， 美国)检测H22细胞的增殖活性，结果见表1。
表1垂枝藓醇提物对H22细胞活细胞比例(％)的影响
时间 Untreated DMSO Cisplatin 50ug/ml 100ug/ml 200ug/ml 400ug/ml
24h 100±0.00 91.11±8.17 38.56±3.26 64.96±5.75 50.07±4.24 34.33±2.57 12.60±1.21
48h 100±0.00 109.82±12.13 4.87±0.57 56.98±5.16 31.04±3.58 19.41±6.14 5.842±0.53
由图1可知，RREE呈剂量依赖性的减少了H22细胞的数量，抗 肝癌细胞H22的效果显著；由表1可知，RREE显著抑制了H22细 胞的增殖活性(p<0.001)，并呈现剂量和时间依赖性，RREE在24h 的IC50值为95.51μg/ml；当RREE的浓度为400μg/ml时，24h抑制 H22细胞的效果显著高于cisplatin(阳性对照)，48h的抑制效果与 cisplatin相当，说明RREE对H22细胞的抑制作用见效更快，效果优 于cisplatin。
2垂枝藓醇提物对肝癌细胞BEL-7404和HepG2生长的影响
处理方法同H22细胞，采用MTT法(Sigma-Aldrich，美国)检 测BEL-7404及HepG2细胞的增殖活性，结果见表2和表3。
表2垂枝藓醇提物对BEL-7404细胞24h活细胞比例(％)的影响
Figure BDA0002691738210000071
Figure BDA0002691738210000081
表3垂枝藓醇提物对HepG2细胞24h活细胞比例(％)的影响
Untreated DMSO Cisplatin 50ug/ml 100ug/ml 400ug/ml
重复1 100.00 97.46 39.58 67.91 55.98 44.19
重复2 100.00 112.64 42.97 69.67 60.45 50.02
重复3 100.00 118.74 39.04 67.37 62.89 52.59
重复4 100.00 94.27 39.72 67.05 55.08 43.82
重复5 100.00 115.62 43.10 67.90 60.52 49.02
重复6 100.00 118.98 46.22 70.01 63.73 54.00
平均值 100.00 109.62 41.77 68.32 59.78 48.94
标准差 0.00 10.95 2.81 1.23 3.54 4.22
由表2和表3的结果可知，RREE显著抑制了BEL-7404及HepG2 细胞的增殖活性(p<0.001)，并呈现剂量依赖性，RREE在24h的 IC50值分别为282.7μg/ml及328μg/ml。
3垂枝藓醇提物对小鼠脾脏细胞生长的影响
处理方法同H22细胞，采用MTT法(Sigma-Aldrich，美国)检 测小鼠脾脏细胞(从
Figure BDA0002691738210000082
C57BL/6小鼠分离得到)的增殖活性，结 果见表4。
表4垂枝藓醇提物对小鼠脾脏活细胞比例(％)的影响
时间 Untreated DMSO Cisplatin 50ug/ml 100ug/ml 200ug/ml 400ug/ml
24h 100±0.00 98.22±11.53 98.73±6.31 109.67±8.55 118.32±12.51 126.21±7.70 135.62±10.24
48h 100±0.00 101.42±7.98 98.82±6.14 112.56±2.90 121.80±7.12 123.93±7.91 130.10±6.89
由表4的结果可知，RREE促进了脾脏细胞的增殖，对脾脏细胞 的没有毒性作用。
综上所述，RREE呈剂量依赖性地抑制H22、BEL-7404及HepG2 肝癌细胞的生长，并且对小鼠脾脏细胞无毒性作用。
实施例5
垂枝藓醇提物体对肝癌细胞周期的影响
采用实施例1制备得到的垂枝藓醇提物(RREE)处理H22细胞， RREE的浓度分别为25、50、100μg/ml。以未做任何处理的细胞作 为空白对照1，以DMSO处理的细胞作为空白对照2，以顺铂 (cisplatin)处理的细胞作为阳性对照，顺铂的浓度为30μg/ml。各实 验组处理24h后，H22细胞经PI染色(Sigma-Aldrich，美国)后用 流式细胞仪进行分析，结果见图2。
由图2可知，100μg/ml RREE显著增加了G0/G1细胞比例 (p<0.001)。这些结果说明，RREE通过阻滞H22细胞周期于G0/G1 期，从而抑制H22细胞的增殖。
实施例6
垂枝藓醇提物体对肝癌细胞凋亡和坏死的影响
采用实施例1制备得到的垂枝藓醇提物(RREE)处理H22、 BEL-7404及HepG2细胞，RREE的浓度分别为50、100、200μg/ml。 以未做任何处理的细胞作为空白对照1，以DMSO处理的细胞作为空 白对照2，以地钱提取物(MPEE)或顺铂(cisplatin)处理的细胞作 为阳性对照，地钱提取物的浓度为25μg/ml，顺铂的浓度为30μg/ml。 各实验组处理24h后，用PI和AnnexinV(翊圣，中国)对BEL-7404 及HepG2细胞染色并采用流式细胞仪进行分析，考察垂枝藓醇提取 对肝癌细胞凋亡(PI-Annexin+和PI+Annexin+)和坏死(PI+Annexin-) 的影响，具体结果见图3。
由图3可知，RREE显著诱导了H22、BEL-7404及HepG2细胞的 凋亡及坏死(p<0.001)，但是高浓度RREE主要诱导了H22和 BEL-7404细胞坏死及HepG2细胞的凋亡。这些结果显示，RREE诱 导肝癌细胞的凋亡及坏死，不同肝癌细胞的坏死及凋亡比例不同。
实施例7
垂枝藓醇提物体对肝癌细胞凋亡和坏死机理的研究
1垂枝藓醇提物体对肝癌细胞线粒体膜电位及活性氧的影响
采用实施例1制备得到的垂枝藓醇提物(RREE)处理H22细胞、 BEL-7404及HepG2细胞，RREE的浓度分别为50、100、200μg/ml。 以未做任何处理的细胞作为空白对照1，以顺铂(cisplatin)处理的细 胞作为阳性对照，顺铂的浓度为30μg/ml。
各实验组处理24h后，检测如下项目：
用JC-1(碧云天，中国)对细胞进行染色，通过流式细胞仪检测， 考察对线粒体膜电位的影响，当线粒体膜电位降低，JC-1多聚体(红 色荧光)会分解成单体(绿色荧光)，检测结果见图4。
用DCFH-DA探针(碧云天，中国)对细胞进行染色，DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，在细胞内被水解成DCFH， DCFH不能穿过细胞膜，在活性氧存在的情况下，DCFH被氧化成荧 光物质DCF，绿色荧光强度与活性氧水平成正比，然后，通过流式 细胞仪检测细胞荧光强度即可反应细胞内的活性氧的水平，结果见图 5。
将处理后的细胞采用RIPA裂解液(北京康为世纪生物科技有限 公司)提取总蛋白，用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2(抗凋亡 蛋白，Cell Signaling Technology，USA)和Bax(促凋亡蛋白，Cell Signaling Technology，USA)及细胞色素C(碧云天，中国)的蛋白水 平的变化，结果见图6。
由图4可知，RREE显著增加了绿色荧光强度(p<0.001)，说明 RREE显著降低了线粒体膜电位。
由图5可知，RREE显著增加了绿色荧光强度(p<0.001)，说明 RREE显著提高了肝癌细胞的活性氧的水平，而活性氧水平增高能够 促进细胞凋亡。
由图6可知，RREE提高了促凋亡蛋白Bax和细胞色素C的蛋白 水平，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白水平，抗凋亡蛋白Bcl-2和促 凋亡蛋白Bax均参与调控线粒体膜的完整性，线粒体膜电位降低导致 细胞色素C释放，细胞色素C释放可诱导细胞凋亡。
2垂枝藓醇提物体对肝癌细胞凋亡途径的影响
采用实施例1制备得到的垂枝藓醇提物(RREE)处理H22细胞， RREE的浓度分别为50、100、200μg/ml。以未做任何处理的细胞作 为空白对照1，以顺铂(cisplatin)处理的细胞作为阳性对照，顺铂的 浓度为30μg/ml。
各实验组处理24h后，将处理后的细胞提取总蛋白，用Western blot 检测caspase信号通路相关蛋白caspase-9(Cell Signaling Technology， USA)、PARP(Cell SignalingTechnology，USA)和caspase-8(Cell Signaling Technology，USA)的蛋白水平的变化，结果见图7。
本发明还通过caspase-3抑制剂(Z-VAD-CHO)(碧云天，中国) 对H22细胞进行预处理，然后再对细胞进行上述处理，考察caspase-3 抑制剂对各处理组细胞凋亡情况的影响，结果如图8。
由图7可知，RREE激活了caspase-9和caspase-8，促进了PARP 的切割，说明RREE激活了caspase信号通路，诱导了肝癌细胞凋亡。
由图8可知，Z-VAD-CHO能够部分逆转RREE诱导的H22细胞 的凋亡，说明RREE通过caspase信号通路诱导了H22细胞凋亡。
综上所述，RREE通过线粒体途径及死亡受体途径激活了caspase 信号通路，诱导了肝癌细胞凋亡。
实施例8
垂枝藓醇提物体对体内免疫作用的影响
为了评估RREE的免疫调节作用，将实施例1制备的RREE通过 腹腔注射(i.p.)或灌胃(i.g.)的方式对
Figure BDA0002691738210000111
昆明白小鼠进行给药， 检测RREE对
Figure BDA0002691738210000112
小鼠的体重、各脏器指数及脾脏中免疫细胞的比 例及数量的影响。
Figure BDA0002691738210000113
昆明白小鼠随机分为6组，分别为腹腔注射 50mg/kg(小鼠体重)、100mg/kg RREE，灌胃给药50mg/kg、100mg/kg RREE，腹腔注射DMSO(二甲基亚砜，RREE溶剂)及未给药组(对 照)，每组4只小鼠，药物每隔1天给药1次，共5次。体重每隔1 天称重1次，待给药完毕，次日处死小鼠，取小鼠心、胸腺、脾、肝、 肺、肾等器官，称重并计算脏器指数；免疫器官指数计算公式如下： 免疫器官重量(mg)/小鼠体重(g)。对小鼠脾脏细胞进行染色，共3组，CD3/CD19/CD49b、CD11c/CD11b/CD40、CD4/CD8/CD44(BDBiosciences，USA)，采用流式细胞仪法进行检测。检测结果见图9～12。
由图9可知，与对照组相比，RREE对小鼠体重没有影响。
由图10可知，RREE对小鼠肝脏指数、心脏指数、肾脏指数、肺 脏指数及胸腺指数均没有影响，说明所选剂量的RREE具有较好的安 全性，但显著增加小鼠脾脏指数(p<0.05)。
由图11～12可知，50mg/kg RREE灌胃组显著增加小鼠脾脏中 CD19+B细胞，腹腔注射组显著增加了CD49+NK细胞数量，腹腔注 射及灌胃组显著增加了CD8+CD44+T细胞的数量(p<0.05)，灌胃组 显著增加了CD11c+树突状细胞、CD11c+CD40+树突状细胞、 CD11b+CD40+巨噬细胞的数量(p<0.05)。以上结果表明，RREE能 增加小鼠脾脏指数和免疫细胞的数量，从而提高小鼠免疫力。
对实施例2和3制备得到的垂枝藓醇提物对肝癌细胞生长和对体 内免疫作用进行检测，结果实施例2和3的垂枝藓醇提物对肝癌细胞 具有良好的抑制作用，且可以提高机体的免疫力，同实施例1制备得 到的垂枝藓醇提物得到的结果一致。
由上述实施例的结果可知，垂枝藓醇提物对肝癌细胞具有良好的 抑制作用，垂枝藓醇提物通过线粒体途径及死亡受体途径激活了 caspase信号通路，诱导了肝癌细胞凋亡；同时，垂枝藓醇提物能够 提高机体免疫力，能够进一步提高抗肿瘤效果。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明 一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用；
所述垂枝藓醇提物的制备方法包括如下步骤：
采用无水乙醇对垂枝藓进行提取，得垂枝藓醇提物；所述垂枝藓的质量与无水乙醇的体积比为1g：(10～20ml)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取的温度为50～60℃，所述提取的时间为2～3h。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述垂枝藓醇提物包括多糖和黄酮，所述多糖的质量百分含量为25％～35％，所述黄酮的质量百分含量为3％～5％。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为抗肝癌细胞H22、BEL-7404和HepG2药物。
5.权利要求1～3任一项所述应用中的垂枝藓醇提物在制备阻滞肝癌细胞周期于G0/G1期药物中的应用。
6.权利要求1～3任一项所述应用中的垂枝藓醇提物在制备诱导肝癌细胞凋亡和坏死药物中的应用。
7.权利要求1～3任一项所述应用中的垂枝藓醇提物在制备降低肝癌细胞线粒体膜电位药物中的应用。
8.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括辅料。
CN202010993563.0A 2020-09-21 2020-09-21 垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用 Active CN112156117B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010993563.0A CN112156117B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010993563.0A CN112156117B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112156117A CN112156117A (zh) 2021-01-01
CN112156117B true CN112156117B (zh) 2021-11-30

Family

ID=73863164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010993563.0A Active CN112156117B (zh) 2020-09-21 2020-09-21 垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112156117B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109692190A (zh) * 2019-01-28 2019-04-30 新疆前进荣耀投资有限公司 地钱醇提物在制备抗肝癌药物的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109662983A (zh) * 2019-01-28 2019-04-23 新疆前进荣耀投资有限公司 中亚苦蒿提取物在制备抗肝癌药物中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109692190A (zh) * 2019-01-28 2019-04-30 新疆前进荣耀投资有限公司 地钱醇提物在制备抗肝癌药物的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antiproliferative and Antimicrobial Activities of Selected Bryophytes;Martin Vollár et al.;《Molecules》;20180623;第23卷;第3页第3段第7行、第5页表1倒数第6行 *
CHEMICAL COMPOSITION OF THE ESSENTIAL OIL AND ETHER EXTRACT FROM Rhytidium rugosum;Ling-he Li et al.;《Chemistry of Natural Compounds》;20081231;第44卷(第6期);全文 *
Martin Vollár et al..Antiproliferative and Antimicrobial Activities of Selected Bryophytes.《Molecules》.2018,第23卷第3页第3段、表1. *
大灰藓与桧叶金发藓醇提物体外抗肝癌作用初步探究;杨羽茜等;《分子植物育种》;20191231;第17卷(第9期);摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112156117A (zh) 2021-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101074158B1 (ko) 간 보호 또는 간 질환의 예방 및 치료용 인삼다당체 조성물
CN109662983A (zh) 中亚苦蒿提取物在制备抗肝癌药物中的应用
EP3064212B1 (en) Paliurus ramosissimus (lour.) poir extract and preparation method and uses thereof
CN104042623A (zh) 一种黑根霉胞外多糖在制备治疗或预防消化道肿瘤药物中的应用
WO2015192758A1 (zh) 瓦草五环三萜皂苷类化合物抗肿瘤的药物用途
TWI542357B (zh) 植物萃取物及治療肝臟纖維化與肝癌之方法
CN101537036A (zh) 一种皂荚皂苷提取物及其制备方法与应用
CN113694085A (zh) 蛞蝓提取物在制备癌症化疗方案的联用药物中的应用
CN112156117B (zh) 垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用
CN108434223A (zh) 一种用于治疗胰腺癌的中药提取物的组合物
CN101904892B (zh) 苏木提取物制备灌注液制备工艺及其在治疗膀胱癌上的用途
CN101647794B (zh) 芒果叶中裂环芒果苷及含有裂环芒果苷的芒果叶提取物的用途
AU2016204180A1 (en) Mogrosides and the salts thereof, the preparing method and the use of the same and pharmaceutical compositions comprising the mogrosides and the salts thereof
CN106309758B (zh) 一种抗胃肠癌的药物组合物
CN109172549B (zh) 一种抗肿瘤活性组合物及其应用
CN109481502B (zh) 一种香椿提取物的制备方法
CN103520229B (zh) 一种芒果提取物在制备抗肿瘤药物中的应用
CN102580065A (zh) 虎眼万年青皂甙osw-i口服抗癌制剂及其制备方法
EP4248964A1 (en) Pharmaceutical composition for treating sepsis, and use thereof
CN103301167B (zh) 满天星异荭草苷在制备治疗酒精性肝损伤药物中的应用
WO2017013477A1 (en) A novel method to isolate inoscavin a from fulviformes fastuosus and medicinal preparation thereof to treat rhabdomyosarcoma cancer conditions
CN101357212B (zh) 一种复方斑蝥注射制剂及其制备方法
US20150366921A1 (en) Herbal extract and a method of treating liver cancer
CN1919258B (zh) 五味子在制备预防、降低抗肿瘤药毒副作用的药物中的应用
CN101040885A (zh) 含达玛烷型四环三萜类皂苷的中药提取物及用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant