TW201509443A - 具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型（一） - Google Patents

Abstract

本發明係提供如式(3)之多歧狀胜肽構型，其中R1、R2與T如說明書中之定義。本發明揭示多歧狀胜肽之構型、製程，以及呈現礦質親和力之活性。 □

Description

具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型(一)

本發明係關於含天門冬胺酸之多歧狀化合物有利與生物礦質上鈣離子螯合配位之構型，以提高標靶生物礦質之潛力。

隨著人類生活品質之提升需求，近年來生物礦質化相關研究對於醫學領域進展已有一定的影響，例如骨骼疾患機制探討及治療模式開發，牙齒重建或口腔疾患治療，甚至其他體內異常礦質化顯影等等。生物礦質乃為生物體所產生之礦質產物，主要分為碳酸鹽和磷酸鹽兩大類，其組成中不僅包含無機性成分更包括有機性結構。生物礦質之基本礦質組成為氫氧磷灰石(hydroxylapatite,HAp)，其化學組成為Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂之結晶。

欲與生物礦質親和之分子，一般應含有可供鈣離子配位的基本結構如聚羧酸或聚磷酸。深入觀察生物界中的現象發現；除了膠原蛋白外，生物另分泌酸性物質以提供聚陰離子與礦質中的鈣結合，再經成核作用而形成骨、齒結構中所含的生物礦質，這些酸性的結合物質都是利用結構中具有豐富的羧酸、或經過磷酸化或硫化等轉譯後修飾所引入的官能機而提供結合鈣之能力。這些酸性物質包括多醣或蛋白聚醣，和蛋白質類。

文獻中用以親和骨質之仿生試劑多以聚天門冬胺酸模擬自然界生物礦質中富含天門冬胺酸的蛋白質。由於聚天門冬胺酸為已知的礦質親和胜肽，其所需長度也被明確的發現可由6 至12個天門冬胺酸組成即具有礦質親和效果。例如Wang D.等人於2003和2007發表在Bioconjugate Chem.論文中比較不同物質對於骨組織之親合力，其中發現以重覆出現的天門冬胺酸所組成的8胜肽對於骨質具有良好之親合力。他們利用含螢光物質之聚合物接合的該8胜肽以進行動物實驗，確實觀察到螢光物質大量附著於骨骼系統中。而在牙科之應用近年也日趨蓬勃，例如Liu,X.-M.等學者提出，在環糊精上鍵結一雙磷酸鹽類藥物(alendronate)以用口腔疾病之應用。

根據Ugliengo,P.團隊研究發現甘胺酸可經由其羧基和胺基與氫氧磷灰石形成錯合物，產生較穩定之結合結構。然生物系統中，蛋白質結構中，主要參與鈣離子結合之官能基為天門冬胺酸、穀胺酸及天冬醯胺和磷酸化絲胺酸側鏈上之氧原子、主要蛋白骨幹和水分子；其酸性胺基酸的數目提供了蛋白質之靜電特質，也直接影響了鈣離子結合。經研究證實，適當的胜肽序列安排，適當的胜肽序列不僅可以提供選擇性與鈣離子結合之能力，甚至對於生物礦質之堆疊和結合也會提供較專一性的表現。

自1970年，由Vögtle,F.等學者設計第一個發散合成的球狀樹狀型聚合物以來，即揭露了樹狀型聚合分子不同於線型聚合物的特色。樹狀型聚合物(dendrimer)顧名思義即是結構像樹枝狀的分子，為高分子聚合物之一分支；其分子為高度分歧的聚分子，且具精確單一分子量分佈。有別於傳統直鏈式聚合物，它所提供的構型呈現三維放射狀排列分佈，由核心分子開始，向外均勻延伸，達一層分歧點則定義為一代；樹狀型聚合物之中所定義的代數(generation)，通常是計算樹狀型聚合物從中心延伸到四周的分支情形，均是以相同層與層之間的交點(亦稱分支點)作為計算的依據，從核中心到四周的各個焦點稱為一個代數，有 五個交點可以表示為一個第五代樹狀型聚合物；如第一圖所示樹狀型聚合物，僅有一個核中心稱為第零代，這樣的結構沒有交點。

已知可應用之樹狀型聚合物，如聚乙二胺樹狀型聚合物(polyamindoamine dendrimer,PAMAM)，聚酯樹狀型聚合物(polyester type dendrimer)；聚甘油樹狀型聚合物(polyglycerol dendrimer)、三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propylene imine)dendrimer)、Newkome類樹狀型聚合物(Newkome-type dendrimers)、聚離胺酸類樹狀型聚合物(polylysine dendrimer)，以及其他混合型。

目前利用分歧分子之結構特色以及巨分子自主裝行為，造就許多不同於小分子的表現。許多小分子之間交互作用原不強烈，當分子與分子間距在單位面積下有程度上的接近時，將會助於提高其交互作用，意即單位面積濃度提高彌補了分子間作用弱之缺失；因此，透過分歧分子之多價與多位相鍵結促使提升結合能力。近年來，在生物醫學材料之運用逐漸涵蓋於藥物釋放、基因治療、細胞膜穿透、細胞結構之控制與醫學顯影等領域。

因此，本發明利用胺基酸之胺基與羧酸結合氫氧磷灰石之可行性，藉以天門冬胺酸單體或聚體短胜肽提供正電荷以螯合氫氧磷灰石，配合分歧型骨架提供之多價鍵結特性，發明多歧狀胜肽序列，給予生物礦質更佳的結合能力。欲提高結合生物礦質之構想，乃使用聚天門冬胺酸為結合標的，引入Percec,V.團隊之單位面積富多官能基之拓蹼安排概念，將天門冬胺酸或短肽結合於發散型骨架表面；所發明之分歧狀胜肽能因多價結合策略表現更突出的礦質親和能力。

生物體之骨頭係以膠原蛋白和酸性蛋白質所帶之負電荷端與骨內磷酸鈣產生結合。與生物礦質結合之蛋白質多富含天門冬胺酸、穀胺酸及天冬醯胺和磷酸化絲胺酸單體。2003年Johnson,G.A.等人和2008年LeGeros,R.Z.等人即闡述骨橋蛋白(osteopontin)在生物體的重要性。骨橋蛋白具有聚天門冬胺酸序列，因此，不僅可以結合骨頭還可以作用於骨細胞。

上述的研究也顯示，聚天門冬胺酸對於骨頭確實有結合的能力，如要發展骨頭藥物傳輸的系統，聚天門冬胺酸也是重要選項之一。觀察Rimola,A.等人於提出氫氧磷灰石的表面晶型構造；氫氧磷灰石含有鈣離子、磷酸根離子與氧原子，以甘胺酸研究結合氫氧磷灰石的能力，並且認為胺基酸同時擁有羧基與胺基，能提供結合位置給予鈣離子、磷酸根離子與氧原子；並推測螺旋狀胜肽更能有效地結合至氫氧磷灰石，且隨著各種序列的不同影響其結合能力。因此，為克服蛋白質二級結構所產生之結合差異，本發明所設計的分歧式胜肽，將提供與氫氧磷灰石表面結合之立體性，其結合能力差異乃取決於立體空間上的分佈。

化合物中，羧酸類、磷酸類或聚乙二胺樹狀型聚合物(G：1.5)、二亞乙基三胺五乙酸二酐(Diethylene triaminepenta acetic acid,DTPA)、亞乙基二氮基四乙酸(Ethylene dinitrilotetra acetic acid,EDTA)和聚丙烯酸甲酯(Propylene glycolmethylether acetate,PMA)等均可提供鈣離子之螯合配位。其中EDTA係廣泛之金屬螯合配位試劑，又如Keum,D.-K.等人於2003年在Bull.Chem.Soc.Jpn.提出，如第二圖所示半整數代(G：1.5)之聚乙二胺樹狀型聚合物亦運用結構分散性與金屬基團螯合配位作用。

Zaupa,G.等人利用離胺酸為單體開發一樹狀型聚 合物，提供立體空間的選擇。於序列中導入半光胺酸(cysteine)，利用雙硫鍵形成離胺酸樹枝型聚合物，並於聚合物外圍修飾上1,4,7-三氮雜環壬烷(1,4,7-triazacyclononane,TACN)，TACN將可螯合鋅離子。經測試第四代離胺酸樹枝型聚合物能有顯著切斷核醣核酸(RNA)之效，乃因其發揮了多價鍵結，因此，認為立體空間效應與多位向活性位置為促使活性發揮之主因。

過去研究均以單一聚天門冬胺酸胜肽與礦質產生幾近於一維之結合關係，但氫氧基磷灰石表面有多個鈣離子和磷酸根存在，因此其透過單一胜肽能呈現的親和力應有限，尤其當胜肽序列不長。如能創造多點，也就是提供二度空間之配位機會，應可透過群聚效應而增強結合；此觀念在Percec,V.團隊之成果中已可得到呼應。他們指出將活性官能基結合至相同骨架，可創造出單位面積富含多官能基，如此使單一分子呈現多官能基足以表現更佳的能力。

發明人經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型」，設計系列胜肽其能有效達到與氫氧磷灰石等擬生物礦質分子親和，提供未來生醫材料或醫藥開發之應用。透過聚羧酸或聚磷酸等結合要素之存在，設計發散構型與生物礦質產生適當二維結合關係，開發最小二維空間安排之結合模式，能夠更補充先前技術之不足。本案產出物將包括三類多岐性胜肽，透過觀察主結合單元存在的位置安排與運用篩選平臺分析生物礦質結能力，評估發明物未來之礦質親和潛力。以下為本案之簡要說明。

本案「具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型」之一構想係以聚乙二胺樹狀型聚合物和聚離胺酸所成之分歧型架構為基本骨幹，表面接合天門冬胺酸，形成不同代數。以提供二度或三 度空間之配位，可透過群聚效應而增強結合力。本發明利用胺基酸之胺基與羧基結合氫氧磷灰石之可行性，藉以天門冬胺酸單體或聚體短肽提供正電荷以螯合氫氧磷灰石，配合多歧型骨架提供之多價鍵結特性，形成分歧狀胜肽序列，給予生物礦質更佳的結合能力。

根據上述構想本發明係提供如式(1A)、式(1B)、式(2)與式(3)之分歧狀胜肽構型化合物，其中U係選自以下所組成之群組：U-Lys-、-Lys-(Asp-NHAc)_J、-NHAc、-Lys-(Asp-)_K-NHAc、(Asp-NHAc)_J；G與R2均係選自以下所組成之群組：聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)、聚酯樹狀型聚合物(polyester type dendrimer)、聚甘油樹狀型聚合物(polyglycerol dendrimer)、三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propyleneimine)dendrimer)、Newkome類a樹狀型聚合物(Newkome-type dendrimers)和聚離胺酸類樹狀型聚合物(polylysine dendrimer)；R1係為-(Asp-)_K；以及A、B、J、K、T與Y均係自然數，Y係代數(generation)之值，A與B之總和係(4 x 2^Y)，J=1或2，20≧K≧1，32≧T≧1。

於胺基酸係以Asp代表天門冬胺酸(aspartic acid)，Lys代表離胺酸(lysine)，Ala代表丙胺酸(alanine)，而Gly代表甘胺酸(glycine)。NHAc係代表氮-乙醯基(N-Acetyl)，而OH係代表羰基(hydroxyl)。

本發明之另一構想，係指一種藥物組合物，包括藥學上可接受之載體；以及一有效量之多歧狀胜肽構型化合物；該藥物組合物經由製劑方式之處理，可製成適宜投與哺乳類動物體內之各種劑型，而呈現上述之醫療功能。上述所稱哺乳類動物係指人類或生物學所稱之哺乳類動物。

本發明「具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型」之另一構想，係透過逐步合成步驟，得到可控制分子大小，及外圍具眾多官能基之三維分子，便於後續應用及衍生。與習知樹狀型聚合物或線性高分子之性質之特色，在於多歧狀胜肽之高分子具有以下特性：(1)結構穩定與顆粒小、(2)易調控親水性與疏水性、(3)構型近似為球狀、(4)可以依照不同代數的製備以控制大小和構型。

第一圖 樹狀型聚合物示意圖

1：核心 2：分歧端 3：末端官能基

第二圖 第1.5代之聚乙二胺樹狀型聚合物

第三圖 元件L1a與L1b之詳細結構

第四圖 化合物B3之氫原子核磁共振光譜。

磁場為200兆赫，溶劑為氧化氘

第五圖 化合物B1c之高效能液相層析分析

(橫軸為層析時間，縱軸為相對強度。沖提液為0.1%的三氟醋酸之甲醇溶液，流速為每分鐘0.4毫升，偵測波長為220nm。)

第六圖 化合物B1d之高效能液相層析分析

(橫軸為時間，縱軸為吸收強度。沖提液為0.1%的三氟醋酸之甲醇溶液，流速為每分鐘0.4毫升，偵測波長為220nm。)

第七圖 化合物L1c在氫氧磷灰石管柱的滯留時間

橫軸為時間，縱軸為吸收強度

第八圖 化合物B1d在氫氧磷灰石管柱的滯留時間

橫軸為時間，縱軸為吸收強度

第九圖 化合物B3在氫氧磷灰石管柱的滯留時間

橫軸為時間，縱軸為吸收強度

為達成上述構想，本發明係透過逐步合成步驟，得到可控制分子大小，及外圍具眾多官能基之三維分子。習知樹狀型聚合物雖具各式生醫應用，但並未具有礦質親和之應用；而線性多天門冬胺酸胜肽對照元件L1b(第三圖)已知具有與氫氧磷灰石結合之能力，但最適切數目或空間安排等性質尚未被揭露。本發明所開發的多歧狀胜肽高分子，可提供三維放射狀排列之構型 分佈，透過分歧分子之多位相鍵結提升結合能力，並且創造單位面積富多官能基之結合機會。

根據Almora-Barrios,N.等人和Capriotti,L.A.等人之研究，胜肽具有二級構型有助於產生礦質親和力，例如對照元件L1a。又George,A.等人於2008年發表在Chem.Rev.之記載，6-12個天門冬胺酸連續之短肽如對照元件L1b具有顯著骨質親和之能力。習知單一聚天門冬胺酸胜肽與礦質產生幾近於一維之結合關係，但氫氧基磷灰石表面有多個鈣離子和磷酸根存在，推斷單一胜肽能呈現的親和力應有限，提供二度空間之配位機會，可透過群聚效應而增強結合。同時，Masica,D.L.等人於2010在J.Am.Chem.Soc.中發表開發之蛋白質與HAp結合之官能基如適當安排應可提高其與HAp之表面親和。因此本發明以L1a和L1b作為對照，(第三圖)更以L1b作為結合基本態元件，修飾於多歧狀骨架，評估分歧狀胜肽構型化合物與氫氧磷灰石結合的最適當距離。

基於A+B=4 x 2^Y，當A和B總和為32，所形成之多歧狀胜肽構型為3代數，其直徑約達4奈米。A和B總和為64，所形成之多歧狀胜肽構型為4代數，其直徑約達5奈米。A和B總和為128，所形成之多歧狀胜肽構型為5代數，其直徑約達6奈米。A和B總和為256，所形成之多歧狀胜肽構型為6代數，其直徑約達7奈米。式(3)之R1係代表-(Asp-)_K，其中K值可顯示所連接之Asp數量。雖然曾經報導8-12個天門冬胺酸所組成的胜肽對於骨質具有良好之親合力，唯依照氫氧磷灰石管柱測試(hydroxylapatite column test,HAp column test)評估礦質親和能力，如表一所示，依照本發明實施例所製備多歧狀胜肽構型於氫氧磷灰石管柱所滯留時間大體上區分為12，13和14分鐘。

表1氫氧磷灰石管柱的滯留時間

直線型胜肽中，文獻已知具有礦質親和能力之對照元件L1b，其基本架構為HO-Gly-(Asp)₆-NHAc滯留時間為13.3分鐘。而本發明所製備隸屬於式(1B)胜肽之L1c其基本架構為₂HN-(Gly)₃-(Asp)₃-NHAc，滯留時間為13.0分鐘。L1c之天門冬胺酸數量較僅L1b之半數，所呈現之結合力僅有13.0分鐘與13.3分鐘之略有差異。

直線形胜肽對照元件L1a雖不具可與鈣離子產生結合之官能基(羧基)，其二級螺旋結構仍可提供優異結合力，滯留時間可達14.1分鐘，因此證實構型安排相較於連續排列之多天門冬胺酸數目對氫氧磷灰石結合更具有貢獻度。

經比較式(1A)分歧狀胜肽構型化合物於氫氧磷灰石管柱之滯留時間，發現：(1)相同分支數量，如化合物B1b其離胺酸分支鏈結2個天門冬胺酸比化合物B1a僅鍵結單個天門冬胺酸並未呈現明顯增加對於礦質之親和力(2)天門冬胺酸總數相同之情況，於式(1A)胜肽之離胺酸樹枝型聚合物骨架(HO-Gly-Lys{NHAc}-Lys{Asp-NHAc}-Asp-NHAc)，第2代數化合物B1c擁有4分支而第3代數化合物B1d擁有8分支，兩者所修飾之Asp總數包括骨架均具有8個羧基酸，滯留時間分別為 13.6和14.5分鐘(表一)，顯然分支較多之B1d結合表現較優異。

於式(2)化合物中，聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)之第3代數B2a擁有32分支，第6代數B2b擁有256分支，二者滯留時間分別為14.1和13.9分鐘，差異不大，但B2a之滯留時間較長。因合成困難度之別，B2a化合物單個天門冬胺酸修飾之分支佔表面官能基數量46%，B2b化合物單個天門冬胺酸之分支佔21%，然二者均比直線形對照元件L1b(13.3分鐘)具有較強之結合力，顯示多歧性空間之安排可提升與氫氧磷灰石之結合能力有關。

以對照元件L1b耦合於第3代數骨架以構合16分支6天門冬胺酸-甘胺酸短肽((Asp)₆-Gly-OH)修飾之式(3)化合物B3，而15分支天門冬胺酸(Asp)修飾於相同代數骨架合成製備之化合物B2a，結果顯示B3滯留時間為12.5分鐘而B2a為14.1分鐘，對照元件L1b為13.3分鐘。化合物B2a之每一分支僅修飾單個之天門冬胺酸，而化合物B3與對照元件L1b之每一分支修飾之天門冬胺酸擁有6個，或許從多歧性空間上安排適量天門冬胺酸之化合物，B2a可顯示較佳之氫氧磷灰石結合能力。理論上代表逐步修飾所合成天門冬胺酸(Asp)總數之K值可高達50或100甚至於更高，然而考量天門冬胺酸對於結合能力之發揮較適宜K值為20≧K≧1，更佳為15≧K≧1。T值隨代數而更動，但因合成技術因素可能讓理論可達分支數目≧T值。

式(2)與式(3)之骨架均可選用相同樹狀型聚合物，如聚乙二胺樹狀型聚合物，式(2)之A與B總和與式(3)之T最大值均表示各代數之表面官能機數目，其中B和T值表示修飾數目，因而A+B≧T≧1。

根據上述構想所稱「具礦質親和能力之多歧狀胜肽 構型」之另一構想，係透過該多歧狀胜肽之分子多價與多位相鍵結促使提升分子與分子間之結合能力。令多歧狀胜肽構型在生物醫學材料之運用面涵蓋於藥物釋放、基因治療、細胞膜穿透、細胞結構之控制與醫學顯影等領域。因此多歧狀胜肽構型能因多價之結合作用，表現更突出之礦質親和能力。

本發明「具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型」化合物式(2)之G值與式(3)之R2均係代表聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)，根據上述構想，依照本發明實施例所製備多歧狀胜肽構型，均可運用已知之樹狀型聚合物骨架，例如Fréchet開發之聚酯樹狀型聚合物(polyester type dendrimer)；Frey和Haag之聚甘油樹狀型聚合物(polyglycerol dendrimer)、Simanek之三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、Meijer之聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propyleneimine)dendrimer)、Newkome類樹狀型聚合物(Newkome-type dendrimers)、聚離胺酸類樹狀型聚合物(polylysine dendrimer)，以及其他型。而以聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)，三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propyleneimine)dendrimer)和聚離胺酸類樹狀型聚合物(polylysine dendrimer)等骨架較適於直接應用；其他類型或混合型聚合物骨架若表面官能基非胺基(NH₂)，須經適當化學處理再進行反應。

根據上述構想，本發明之”具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型”之胜肽製備係修正標準固相胜肽合成策略所得之製備方法，(流程1)係於固相胜肽合成儀(Phase Peptide Synthesis,SPPS)進行包括下列步驟：(1)選用適當樹脂為起始原料，浸泡於有機溶媒；(2)以去保護試劑(deprotection reagent,DEP)，移除芴甲氧 羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl,Fmoc)之氮端保護基；(3)取胺基酸與耦合試劑如六氟磷酸苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(Benzotriazole-1-yl-oxytrispyrrolidinophosphoniumhexafluoro-phosphate,PyBOP)，添加活化溶液(active reagent,ACT)，進行耦合；(4)反應結束後，以終止試劑(capping reagent,CAP)終止反應未完全之樹脂；(5)重複上述步驟(2)、(3)與(4)。

上述之胺基酸合成原料，可運用市售品如芴甲氧羰醯-丙氨酸-羧基(N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl-alanine,Fmoc-Ala-OH)、芴甲氧羰醯-離氨酸(叔丁氧羰基)-羧基(Fmoc-Lys(Boc)-OH)、芴甲氧羰醯-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(Fmoc-Asp(tBu)-OH)、芴甲氧羰醯-離氨酸【4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基】乙基)-羧基(Fmoc-Lys(ivDde)-OH)、芴甲氧羰醯-離氨酸(芴甲氧羰醯)-羧基(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)、尚可使用4-羧酸苯甲醛(4-carboxybenzaldehyde)進行耦合反應，獲得所需之多歧 狀胜肽構型。

浸泡原料之有機溶媒，係選用二甲基甲醯胺(N,N-dimethylformamide,DMF)或其他脂溶性溶媒，以促使樹脂潤濕與膨脹協助後續反應之進行。反應之程度係經由胺基檢測試劑(Kaiser test)確認；而反應結束後，以終止試劑(CAP)終止未反應之樹脂。隨著序列長度與胺基酸特性，重複上述耦合反應可獲得需求之多歧狀胜肽構型，唯其間去保護試劑(DEP)與活化溶液(ACT)之操作時間隨序列長度獲胺基酸種類各異。

考量立體空間效應與多價效應，本發明開發不同代數的離氨酸樹枝型聚合物；第3代至第6代聚乙二胺樹狀型聚合物則運用市售品原料。於所需骨架末端氨基(NH₂)上修飾天門冬氨酸，合成如表2所示之式(1A)化合物B1a、B1b、B1c、B1d；式(1B)化合物B1e；式(2)化合物B2a、B2b與式(3)B3等多歧型胜肽。

續表2式(1B)之化合物

合成元件L1a合成之設計，係比照流程1步驟以芴甲氧羰醯-丙氨酸-羧基(Fmoc-Ala-OH)作為胺基酸原料，依序再接合5個丙氨酸(Alanine)於序列上，隨著個數的增加而反應時間亦增加，可以獲得產物2；經芴甲氧羰醯-離胺酸(叔丁氧羰基)羧基(Fmoc-Lys(Boc)-OH)與PyBOP耦合，可獲得產物3；藉由95%三氟乙酸(trifluoro acetic acid,TFA)自樹脂取下，可獲得產物L1a。(流程2)

流程2

合成L1b之方式比照產物L1a之步驟，如流程3所載。使用預置入芴甲氧羰醯-甘氨酸之王樹脂，去保護後與芴甲氧羰醯-天門冬氨酸進行耦合反應，連續合成6個天門冬氨酸於序列上，可以獲得產物5；最後將胜肽由樹脂上斷切下，可獲得產物L1b。

比照上述步驟，將樹脂去保護後，連續導入3次芴甲氧羰醯-甘氨酸-羧基(Fmoc-Gly-OH)耦合和3次芴甲氧羰醯-天門冬氨酸-羧基(Fmoc-Asp(tBu)-OH)耦合，再將胜肽由樹脂上移出，則可以順利獲得產物L1c。(流程4)

本發明「具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型」式(1A)或式(1B)化合物之製備乃依胜肽合成之基本策略(流程1)加以調整。

如流程5-1所示，移除樹脂的芴甲氧羰醯(Fmoc)保護基後，與芴甲氧羰醯-離氨酸(【4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基】乙基)-羧基(Fmoc-Lys(ivDde)-OH)偶合完成後，再移除產物6的芴甲氧羰醯(Fmoc)保護基，使用芴甲氧羰醯-離氨酸(芴甲氧羰醯)-羧基(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)進行下一步耦合反應，獲得含有2個芴甲氧羰醯(Fmoc)保護基的產物7，此時出現樹狀型聚合物的第一個分歧點；隨後移除芴甲氧羰醯(Fmoc)保護基，加入 芴甲氧羰醯-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(Fmoc-Asp(tBu)-OH)進行耦合，可獲得產物8，經移除移除保護基，移除樹脂可獲得B1a。如需增加天門冬氨酸之個數，可在移除產物8的芴甲氧羰醯(Fmoc)保護基後，繼續重複上述之胜肽合成步驟，加入芴甲氧羰醯-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(Fmoc-Asp(tBu)-OH)即可獲得含有2個天門冬氨酸連續之B1b。

序列上如需修飾多歧式胜肽骨架，如流程5-2所示則於移除產物7的芴甲氧羰醯(Fmoc)保護基後，以芴甲氧羰醯-離氨酸(芴甲氧羰醯)-羧基(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)進行耦合，可獲得新的骨架分支點，一此方式反覆進行反應可得到各種代數之多歧性離氨酸聚合物骨架。依目標所需，在適當的分支點處，每一支鏈均比照前述合成步驟修飾上1-2個芴甲氧羰醯-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(Fmoc-Asp(tBu)-OH)，則可獲得具有多歧性離氨酸聚合物為骨架之聚天門冬氨酸聚合物，例如化合物B1c和B1d。

流程5-1或5-2中如利用離胺酸側鏈及氨端保護基相同與否可獲得單個或一對加成之產物。例如選用芴甲氧羰醯-離氨酸(芴甲氧羰醯)-羧基(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)則可在呱啶(piperidine)處理下，同時移除側鏈及氨端保護基，後續可獲得一對加成之式(1B)化合物，也可經由當量數控制單個加成之式(1A)化合物；如以芴甲氧羰醯-離氨酸(【4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基】乙基)-羧基(Fmoc-Lys(ivDde)-OH)為原料，其芴甲氧羰醯和【4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基】乙基可分別利用呱啶(piperidine)和聯胺(hydrazine)去除，可運用於獲取各位置單個加成之化合物。

流程5-1

於液相均質條件下可製備本發明”具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型“之式(2)胜肽化合物。

為使反應完全，導入微波系統協助合成化合物B2a與B2b。將不同代數之聚乙二胺樹枝型聚合物(PAMAM)與芴甲氧羰醯-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(Fmoc-Asp(tBu)-OH)混合，在甲基嗎啉(N-methyl morpholine)之二甲基甲醯胺(DMF)溶液中反應，可添加少量乙醇協助樹狀型聚合物順利溶解，在微波反應槽中反應5小時。隨後移去所有保護基，利用透析膜進行初步純化，所得粗產物再以Sephadex G50膠體滲透層析進行純化，以水當作移動相進行沖提分離，即可獲得黃色油狀物之化合物B2a。同比照B2a之合成與純化模式可獲得B2b，但是微波總反應時間為9小時。

本發明之另一構想為含有多天門冬氨酸短肽之聚乙二胺樹狀型聚合物之製備，係指式(3)多歧狀胜肽構型之製備步驟，先製備重複6個天門冬氨酸的胜肽產物5。移除產物5的芴甲氧羰醯(Fmoc)保護基，將4-羧酸苯甲醛(4-carboxylbenzaldehde)連接上胜肽，再與第三代聚乙二胺樹狀型聚合物反應，最後由樹脂上斷切下來，可獲得化合物B3。

本發明之合成終產物均依高效能液相層析判斷其純度，並以質譜檥和核磁共振鑑定其結構，以該數據確認所獲取之化合物。例如化合物B3，如第三圖之圖譜顯示，10~8ppm之間沒有醛基的訊號，8~7ppm之間有兩組雙分裂的訊號，其為雙取代苯環上的氫的訊號，3.2~2.8ppm之間有許多組訊號，認為係聚乙二胺樹狀型聚合物的訊號，而2.8~2.6ppm之間有天門冬氨酸的beta位置氫的訊號。

根據上述構想，本發明之寡胜肽衍生物在投予給個體時可與可接受之製藥載體、佐劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑組合為藥學組合物一併投予，以提供療效。前述多胜肽可使用傳統方法調配成可供不同服用路徑使用之劑型，例如該藥物組合物可直接抵達藥用部位。劑型係依投藥途徑、配方性質、疾病狀況、病患體型、重量、表面積、年齡及性別、以及其他配伍藥物判定。藥物組合物之功效可初步於體外評估，而後投藥至動物體內，評估該組合物對藥用部位之功效。

上述賦形劑或稱為『藥學上可接受之載體或賦形劑』、『生物可利用之載體或賦形劑』，係包括溶媒、分散劑、包衣、抗菌或抗真菌劑，保存或延緩吸收劑等任何習知用於製備成劑型之適當化合物。通常此類載體或賦形劑，本身不具備治療疾病之活性，且將本發明所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，製備之各劑型，投與動物或人類不致於造成不良反應、過敏或其它不適當反應。因而本發明所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，係適用於臨床及人類。運用本發明化合物之劑型經由靜脈、口服、吸入或經由鼻、直腸、陰道等局部或舌下等方式投藥，可達到治療效果。

該載體隨各劑型而不同，無菌注射之組成物可將溶液或懸浮於無毒之靜脈注射稀釋液或溶劑中，此類溶劑如1,3-丁二醇。其間可接受之載體可為甘露醇(Mannitol)或水。此外固定油或以合成之單或雙苷酸油酯懸浮介質，係一般習用之溶劑。脂肪酸，如油酸(Oleic acid)、橄欖油或蓖麻油等與其苷酸油酯衍生物，尤其經多氧乙基化之型態皆可作為製備注射劑並為天然醫藥可接受之油類。此等油類溶液或懸浮液可包含長鏈酒精稀釋液或分散劑、羧甲基纖維素或類似之分散劑。其他一般使用之介面活性劑如Tween、Spans或其他相似之乳化劑或係一般醫藥製造業所使用於醫藥可接受之固態、液態或其他可用於劑型開發之生物可利用增強劑。

用於口服投藥之組合物則係採用任何一種口服可接受之劑型，其型式包括膠囊、錠劑、片劑、乳化劑、液狀懸浮液、分散劑、溶劑。口服劑型一般所使用之載體，以錠劑為例可為乳糖、玉米澱粉、潤滑劑，如硬脂酸鎂為基本添加物。而膠囊使用之稀釋液包括乳糖與乾燥玉米澱粉。製成液狀懸浮液或乳化劑劑型，係將活性物質懸浮或溶解於結合乳化劑或懸浮劑之油狀介面，視需要添加適度之甜味劑，風味劑或係色素。

鼻用氣化噴霧劑或吸入劑組成物，可根據已知之製劑技術進行製備。例如，將組成物溶於生理食鹽水中，添加苯甲醇或其他適合之防腐劑，或促吸收劑以增強生物可利用性。本發明化合物之組合物亦可製成栓劑，進行經直腸或陰道之投藥方式。

本發明化合物亦可運用『靜脈投藥』，其係包括經由皮下、腹腔、靜脈、肌肉，或關節腔內、顱內、關節液內、脊髓內注射，主動脈注射，胸腔注射，疾病部位內注射，或其他適合之投藥技術。

因此，本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。

本案所提出之「具礦質親和能力之多歧狀胜肽構型」將可由下列實施例之說明而得到充分瞭解，使得熟諳本技藝領域之人士可據以完成。然而本案之實施例係為證實，非受該實施型態所限制，熟習本技藝之人士當可依既揭露實施例之精神推演出其他實施例，則該等實施例皆當屬於本發明所附申請專利範圍之所保護範疇。

I.藥品與器材：

一般化學品均購自TEDIA、ACROS和Merck公司。所有化學品沒有進一步的純化，除非有特別的描述。所有胺基酸、六氟磷酸苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和預先置入甘氨酸的王氏樹脂(preloaded Glycine Wang resin)購買自Novabiochem公司。聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)購買自Dendritech公司。粒子孔洞為20微米之第二型磷酸鈣氫氧磷灰石(Hydrohxylapaptite)購買自Bio-Rad公司。從Merck公司購買順式與薄層層析板(reversed-phase thin-layer chromatography,RP-TLC)吸附碳18與矽粉。從GE Healthcare公司購買LH20和G75膠體當作液相層析(Liquid Chromatography,LC)的靜相物質。使用Varian 公司的400MHz的核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance spectrum,NMR)分析產物。以Bruker公司之Autoflex III的輔助基質雷射質譜(MALDI-TOF/MS spectra)鑑定產物分子量。採用Agilent公司之1100系列的高效液相層析(High-performance Liquid Chromatography,HPLC)搭配碳5反式管柱分析產物純度。

II.其他試劑

1. 芴甲氧羰醯-丙氨酸-羧基(Fmoc-Ala-OH)

2. 芴甲氧羰醯-離氨酸(叔丁氧羰基)-羧基(Fmoc-Lys(Boc)-OH)

3. 芴甲氧羰醯-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(Fmoc-Asp(tBu)-OH)

4. 芴甲氧羰醯-離氨酸(【4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基】乙基)-羧基(Fmoc-Lys(ivDde)-OH)

5. 芴甲氧羰醯-離氨酸(芴甲氧羰醯)-羧基(Fmoc-Lys(Fmoc)-OH)

6. 4-羧酸苯甲醛(4-carboxybenzaldehyde)

7. 六氟磷酸苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)

III.試劑配製

1. 去保護試劑(簡稱DEP)，係含有20%呱啶(piperidine)之二甲基甲醯胺(N,N-dimethylformamide,DMF)。

2. 活化溶液(簡稱ACT)，係配製成10% N-甲基-N-氧化嗎啉(N-methylmorpholine)之二甲基甲醯胺(DMF)。

3. 終止試劑(簡稱CAP)，係以5毫升二甲基甲醯胺與1毫升乙酸酐(Ac ₂ O)配製。

4. 凱薩檢測(Kaiser test)亦稱為胺基檢測或茚三酮檢測，係以0.28M茚三酮(ninhydrin)之乙醇溶液、吡啶(pyridine)與42.37M酚(phenol)之乙醇溶液和吡啶等三溶液，各等比例滴入至樹脂，加熱至120℃觀察顯現之顏色變化；藍紫色表有胺基，淡黃色表無胺基殘餘。除特殊說明外，本發明中之去芴甲氧羰酰保護步驟以藍紫色為成功；胺基酸耦合步驟以淡黃色為成功。

氫氧磷灰石管柱測試(HAp column test)

使用管柱內填充氫氧磷灰石粒子進行結合測試，氫氧磷灰石管柱直徑與長度分別為0.7和5公分，以高效能液相層析系統進行實驗，沖提液為0.5mM PBS(pH 7.4)，流速設定為每分鐘 0.25毫升，偵測波長為220nm。各化合物之滯留時間整理於表1；而代表性滯留時間，如L1b、L1c、B1d和B3，則為圖6-8所示。

實施例一 合成元件L1a之製備

置入0.2毫莫爾(0.328克)之rink amide樹酯，使用去保護試劑反應五分鐘，再加入0.125克之芴甲氧羰酰-丙胺酸-羧基(0.4毫莫爾)和0.208克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.4毫莫爾)，及活化溶液進行反應30分鐘。確定耦合成功後，加入終止試劑反應25分鐘。以相同的劑量和步驟進行隨後連續五次丙胺酸加成，反應時間依序為40、50、60、60與60分鐘。之後，移除末端芴甲氧羰酰保護基，再以0.187克之芴甲氧羰酰-離氨酸(叔丁氧羰基)-羧基(0.4毫莫爾)與0.208克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.4毫莫爾)進行合成，反應90分鐘後，移除末端芴甲氧羰酰保護基，再以1毫升乙醋酸酐添加入已有3毫升的二甲基甲醯胺浸泡之樹酯，反應20分鐘，取出樹酯，使用95%的三氟醋酸反應兩小時，移除固體，將濾液減壓濃縮獲得所需L1a胜肽。

藉由高效能液相層析分析純度，選擇使用碳18管柱，移動相為重量百分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間6.5分鐘有主要單一的訊號。

實施例二 合成元件L1b之製備

置入0.2毫莫爾(0.328克)之先置入甘胺酸的王樹酯，使用去保護試劑反應五分鐘，再加入0.165克之芴甲氧羰酰-天門冬胺酸(叔丁酯)-羧基(0.4毫莫爾)和0.208克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.4毫莫爾)，及活化溶液進行反應30分鐘，加入終止試劑反應25分鐘。以相同的劑量和步驟進 行之後連續四個天門冬胺酸之加成，反應時間依序為45、60、60與60分鐘；移除末端芴甲氧羰酰保護基，再以1毫升乙醋酸酐添加入已有3毫升的二甲基甲醯胺浸泡之樹酯，反應20分鐘，取出樹酯，以重量百分比為95的三氟醋酸反應兩小時，移除固體，將濾液減壓濃縮獲得所需胜肽，即L1b。

將粗產物溶解於混合溶液中(MeOH：H₂O：MeCN=2：1：1)，使用中壓液相層析系統分離純化，採用碳18反式極性管柱，管柱流速為每分鐘0.5毫升，經由碳18反式極性薄層層析板鑑定，獲得主斑點比移值(retention factor,Rf)為0.3的主產物。藉由高效能液相層析分析其純度，選擇使用碳5管柱，移動相為重量百分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間6.1分鐘有主要單一的訊號；基質輔助雷射質譜分析L1b獲得788(L1b理論分子量+鈉)訊號。

實施例三 化合物L1c之製備

置入0.2毫莫爾(0.328克)之rink amide樹酯，使用去保護試劑反應五分鐘，再加入0.119克之芴甲氧羰酰-甘胺酸(0.4毫莫爾)和0.208克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.4毫莫爾)，並且搭配活化溶液進行反應30分鐘，之後，加入終止試劑反應25分鐘。比照相同的劑量和步驟進行隨後兩次甘胺酸加成，反應時間均為45分鐘。隨後，移除末端的芴甲氧羰酰保護基，再以0.165克之芴甲氧羰酰-天門冬胺酸(叔丁酯)-羧基(0.4毫莫爾)進行耦合，反應50分鐘，添加終止試劑，完成第四個氨基酸之加成；以相同的劑量和步驟進行隨後兩次天門冬胺酸加成，時間均為60分鐘。將芴甲氧羰酰保護基移除後，以1毫升乙醋酸酐添加入已有3毫升的二甲基甲醯胺浸泡之樹酯，反應20分鐘 後，取出樹酯，以重量百分比為95的三氟醋酸反應兩小時，移除固體，將濾液減壓濃縮獲得所需胜肽，即L1c。

將粗產物溶解於混合溶液中(MeOH：H₂O：MeCN=2：1：1)，使用中壓液相層析系統分離純化，採用碳18反式極性管柱，管柱流速為每分鐘0.5毫升，經由碳18反式極性薄層層析板鑑定，獲得主斑點比移值(retention factor,Rf)為0.3的主產物。藉由高效能液相層析分析其純度，選擇使用碳5管柱，移動相為重量百分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間6.5分鐘有主要單一的訊號。

實施例四 化合物B1a之製備

置入0.2毫莫爾(0.328克)之先置入甘胺酸王樹酯，去保護五分鐘，再加入0.236克之芴甲氧羰酰-離氨酸(【4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基】乙基)-羧基(0.4毫莫爾)和0.208克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.4毫莫爾)，於活化溶液中反應40分鐘，隨後加入終止試劑反應25分鐘。第一個氨基酸之加成。移除末端的芴甲氧羰酰保護基後，與0.236克之芴甲氧羰酰-離氨酸(芴甲氧羰酰)-羧基(0.4毫莫爾)進行耦合，反應70分鐘後加入終止試劑。移除末端離胺酸上兩個芴甲氧羰酰保護基後，利用0.247克之芴甲氧羰酰-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(0.6毫莫爾)和0.312克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.6毫莫爾)反應60分鐘；隨後，移除末端的芴甲氧羰酰保護基後，即以重量百分比為95的三氟醋酸反應兩小時，移除固體，將濾液減壓濃縮獲得所需B1a胜肽。

將粗產物溶於比例為1：9的甲醇與水之混合溶液，以碳18反式極性管柱進行分離，經由反式極性碳18之薄層層析板 偵測與檢驗，可以獲得單一主要產物。藉由高效能液相層析分析其純度，選擇使用碳5反式極性管柱，移動相為重量百分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間8.0分鐘有主要單一的訊號。

實施例五 化合物B1b之製備

置入0.2毫莫爾(0.328克)之先置入甘胺酸王樹酯，以去保護試劑反應五分鐘，再加入0.236克之芴甲氧羰酰-離氨酸(【4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基】乙基)-羧基(0.4毫莫爾)和0.208克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.4毫莫爾)，加入活化溶液進行反應40分鐘，加入終止試劑反應25分鐘。移除末端芴甲氧羰酰保護基後，以0.236克之芴甲氧羰酰-離氨酸(芴甲氧羰酰)-羧基(0.4毫莫爾)進行耦合反應70分鐘，接著加入終止試劑反應25分鐘；移除離胺酸兩個芴甲氧羰酰保護基後，利用0.247克之芴甲氧羰酰-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(0.6毫莫爾)和0.312克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.6毫莫爾)反應60分鐘後，加入終止試劑反應25分鐘。接著依相同步驟、試劑和劑量進行後續天門冬氨酸加成，反應時間為80分鐘。移除末端所有的芴甲氧羰酰保護基，即以重量百分比為95的三氟醋酸反應兩小時，移除固體，將濾液減壓濃縮獲得所需B1b胜肽。將粗產物溶於比例為3：7的甲醇與水之混合溶液，以碳18反式極性管柱進行分離，經由碳18反式極性之薄層層析板偵測與檢驗，可以獲得單一主要產物；再以醋酸酐進行乙烯化反應，反應30分鐘且確認茚三酮顯色為淡黃色，即獲得B1b。

藉由高效能液相層析分析其純度，選擇使用碳5反式極性管柱，移動相為重量百分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵 測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間8.1分鐘有主要單一的訊號。

實施例六 化合物B1c之製備

置入0.2毫莫爾(0.328克)之先置入甘胺酸王樹酯，以去保護試劑反應五分鐘，隨後加入0.236克芴甲氧羰酰-離氨酸(【4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基】乙基)-羧基(0.4毫莫爾)和0.208克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.4毫莫爾)，於活化溶液進行中反應40分鐘，之後加入終止試劑反應25分鐘。移除末端芴甲氧羰酰保護基後，以0.236克之芴甲氧羰酰-離氨酸(芴甲氧羰酰)-羧基(0.4毫莫爾)進行耦合反應70分鐘，再加入終止試劑反應25分鐘。依相同步驟進行後續氨基酸加成，劑量與時間分別為0.354克(0.6毫莫爾)芴甲氧羰酰-離氨酸(芴甲氧羰酰)-羧基和90分鐘。移除所有芴甲氧羰酰保護基後，以0.329克之芴甲氧羰酰-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(0.8毫莫爾)和0.416克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.8毫莫爾)反應90分鐘，在以終止試劑反應25分鐘。再比照上述合成步驟進行後續氨基酸加成，其胺基酸劑量與反應時間分別為0.329克之芴甲氧羰酰-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(0.8毫莫爾)和120分鐘。最後，移除末端芴甲氧羰酰保護基，再以1毫升乙醋酸酐添加入已有3毫升的二甲基甲醯胺浸泡之樹酯，反應20分鐘後濾除液體，隨後加入4%的聯胺二甲基醯胺，反應10分鐘，過濾取出樹酯，以重量百分比為95的三氟醋酸反應兩小時，移除固體，將濾液減壓濃縮獲得所需B1c胜肽。

將粗產物溶解於水中，搭配碳18反式極性管柱與高效能液相層析儀的紫外光偵測器，其中波長設定為320；採多批產 物進行分離，首批管柱進樣為55毫克，波長設定為220，流速為每分鐘0.5毫升，可以獲得主要分離物。藉由高效能液相層析分析其純度(第四圖)，選擇使用碳5反式極性管柱，移動相為重量百分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間9.6分鐘有主要單一的訊號。基質輔助雷射質譜分析L1b獲得1740(B1c理論分子量+鈉)訊號。¹H-NMR(solvent：D-acetone；400MHz)：δ 4.62(m,4H),4.21(m,2H),4.10(m,6H),3.64(s,2H),3.13(m,8H),2.84(m,16H),2.34(s,3H),1.97(s,9H),1.90(s,3H),1.7(m,8H),1.43(m,8H),1.30(m,8H).

實施例七 化合物B1d之製備

置入0.2毫莫爾(0.328克)之先置入甘胺酸王樹酯，使用去保護試劑反應五分鐘後，再加入0.236克芴甲氧羰酰-離氨酸(【4,4-二甲基-2,6-二氧代環己-1-亞基】乙基)-羧基(0.4毫莫爾)和0.208克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.4毫莫爾)，及活化溶液反應40分鐘，再加入終止試劑完成此-步驟之合成；移除末端的芴甲氧羰酰保護基，加入0.236克之芴甲氧羰酰-離氨酸(芴甲氧羰酰)-羧基(0.4毫莫爾)耦合反應70分鐘，隨後加入終止試劑完成此一步驟之合成；如同上步驟之胺基酸與步驟分別耦合兩次，唯有劑量上為多一次步驟兩倍當量用量。移除末端芴甲氧羰酰保護基後，加入0.412克之芴甲氧羰酰-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(1.0毫莫爾)和0.521克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(1.0毫莫爾)反應120分鐘，再加入終止試劑反應25分鐘。移除末端芴甲氧羰酰保護基後，加入已有3毫升的二甲基甲醯胺浸泡之樹酯，25分鐘反應後移除樹酯上液體，再加入重量百分比為4的聯胺二甲基醯胺，反應10分鐘後，取出 樹酯使用重量百分比為95的三氟醋酸反應兩小時，移除固體，將濾液減壓濃縮獲得所需B1d胜肽。

將粗產物B1d溶解於水中，使用中壓液相層析系統分離純化，搭配碳18反式管柱與高效能液相層析儀的紫外光偵測器，其中波長設定為320；採多批產物進行分離，每批管柱進樣為55毫克，波長設定為320，流速為每分鐘0.5毫升，收集訊號為41至58分鐘的分離物，可以獲得主要分離物。藉由高效能液相層析分析其純度(第五圖)，選擇使用碳5反式極性管柱，移動相為重量百分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間9.4分鐘有主要單一的訊號。¹H-NMR(solvent：D₂O；400MHz)：δ 4.60(m,6H),4.16(m,8H),3.92(m,2H),3.62(s,2H),3.11(br,16H),2.77(m,16H),1.96(s,24H),1.88(s,3H),1.68(s,16H),1.42(m,14H),1.28(m,18H).

實施例八 化合物B1e之製備

置入0.2毫莫爾(0.328克)之rink amide樹酯，使用去保護試劑反應五分鐘，再加入0.481克之芴甲氧羰酰-離氨酸(芴甲氧羰酰)-羧基(0.8毫莫爾)和0.416克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.4毫莫爾)，及活化溶液進行反應60分鐘，加入終止試劑完成此一步驟之合成；如前述做法重複進行2次離氨酸之耦合，反應時間分別為90、120分鐘；移除末端芴甲氧羰酰保護基，再以1毫升乙醋酸酐添加入已有3毫升的二甲基甲醯胺浸泡之樹酯，反應25分鐘，取出樹酯，使用重量百分比為95的三氟醋酸反應兩小時，移除固體，將濾液減壓濃縮獲得所需B1e胜肽。

實施例九 化合物B2a之製備

10毫升試管中放入0.261克之六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.5毫莫爾)和0.206克之芴甲氧羰酰-天門冬氨酸(叔丁酯)-羧基(0.5毫莫爾)，及活化溶液混合30分鐘後，添加0.053克第三代聚乙二胺樹狀型聚合物(7.6毫莫爾)與0.1毫升乙醇；隨後移入微波反應器中，設定瓦數為200W、溫度為80℃及反應時間為五小時。粗產物添加體積百分比為20之哌啶的二甲基甲醯胺溶液，反應隔夜後。移除溶劑後再添加重量百分比為95之三氟乙酸水溶液，反應兩小時，移除溶劑獲得黃色粗產物。粗產物以10%二甲基亞楓之水溶液溶解後，移入阻隔分子量3500之透析膜，外液為5%甲醇之水溶液，四天之中每天換三次水後，移除溶劑獲得油狀粗產物；選用Sephadex G75的膠體當做靜相，以水溶解該粗產物，置入管柱後，以水當作移動相進行沖提分離，分管收集之液體以碳18反式薄層層析板進行鑑定，收集相同主斑點比移值(retention factor,Rf)之化合物，經濃縮後獲得黃色油狀物之化合物B2a。

藉由高效能液相層析分析其純度，選擇使用碳5反式極性管柱，移動相為重量百分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間4.7分鐘有主要單一的訊號。(圖8)¹H-NMR(solvent：D₂O；200MHz)：4.10(t,J=7Hz,17H),3.55(m,74H),3.26(m,64H),3.05(m,80),2.80(m,78H),2.43(m,43H),2.25(m,44H).

實施例十 化合物B2b之製備

在第六代數狀型聚合物的表面上合成上天門冬氨酸，如同B2a的製備方式，唯反應時間九小時。藉由高效能液相層析分析其純度，選擇使用碳5反式極性管柱，移動相為重量百 分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間2.4分鐘有主要單一的訊號。

實施例十一 化合物B3之製備

如實施例二記載步驟先合成L1b元件，隨後移除末端芴甲氧羰酰保護基，加入4-羧酸苯甲醛(0.061毫克，0.4毫莫爾)反應100分鐘。加入終止試劑反應25分鐘後，添加第三代聚乙二胺樹狀型聚合物(0.021克，0.1毫莫爾)於已浸泡在二甲基甲醯胺的樹酯，反應30分鐘後再加入0.315克的三乙醯氧基硼氫化鈉(3毫莫爾)，持續反應兩天後確定合成結束。濾除反應液，再以重量百分比為95的三氟乙酸水溶液反應兩個小時，移除固體後，抽乾的濾液多次以甲苯協助三氟乙酸的移除，獲得黃色粗產物；選用 Sephadex G75的膠體當做靜相，以水溶解該粗產物，置入管柱後，以水當作移動相進行沖提分離，分管收集之液體以碳18反式薄層層析板進行鑑定，收集相同主斑點比移值(retention factor,Rf)之化合物，經濃縮後獲得黃色油狀物之化合物B3。

藉由高效能液相層析分析其純度，選擇使用碳5反式極性管柱，移動相為重量百分比為0.1的三氟乙酸甲醇溶液，偵測波長設定為220，層析環境溫度設定為25℃，流速設為每分鐘0.4毫升，經由層析分析，發現滯留時間7.8分鐘有主要單一的訊號。¹H-NMR(solvent：D₂O；400MHz)：7.72(d,J=6Hz,32H),7.43(d,J=8Hz,32H),4.11(m,96H),3.89(s,48H),3.28(m,276H),2.83(m,192H),1.14(m,208H).

其他類似之實施例

1.一種化合物，具有如式(1A)、式(1B)所示之結構，

其中U係選自以下所組成之群組：U-Lys-、-Lys-(Asp-NHAc)_J、-NHAc、-Lys-(Asp-)_K-NHAc、(Asp-NHAc)_J；；以及J與K均係自然數，J=1或2，20≧K≧1，Asp代表天門冬胺酸(aspartic acid)，Lys代表離胺酸(Lysine)，Gly代表甘胺酸(glycine)。

2.一種化合物，具有如式(2)所示之結構，

其中G係選自以下所組成之群組：聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)、聚酯樹狀型聚合物 (polyester type dendrimer)、聚甘油樹狀型聚合物(polyglycerol dendrimer)、三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propyleneimine)dendrimer)、Newkome類樹狀型聚合物(Newkome-type dendrimers)：以及A、B與Y均係自然數，Y係代數(_generation)之值，A與B之總和係(4 x 2^Y)，Asp代表天門冬胺酸(aspartic acid)。

3.一種化合物，具有如式(3)所示之結構，

其中R1係-(Asp-)_K；R2係選自以下所組成之群組：聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)、聚酯樹狀型聚合物(polyester type dendrimer)、聚甘油樹狀型聚合物(polyglycerol dendrimer)、三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propyleneimine)dendrimer)、Newkome類樹狀型聚合物(Newkome-type dendrimers)和聚離氨酸類樹狀型聚合物(polylysine dendrimer)：以及T與K均係自然數，64≧T≧1，20≧K≧1，Asp代表天門冬胺酸(aspartic acid)，Gly代表甘胺酸(glycine)。

5.如上述之化合物，具有如式(2)所示之結構，

其中R係聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)。

6.如上述之化合物，具有如式(3)所示之結構，

其中R2係聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)。

7.一種藥物組合物，包括：藥學上可接受之載體；以及一有效量之式(1A)或式(1B)所示主成分，

其中U係選自以下所組成之群組：U-Lys-、-Lys-(Asp-NHAc)_J、-NHAc、-Lys-(Asp-)_K-NHAc、(Asp-NHAc)_J；；以及J與K均係自然數，J=1或2，20≧K≧1，Asp代表天門冬胺酸(aspartic acid)，Lys代表離胺酸(Lysine)，Gly代表甘胺酸(glycine)。

8.一種藥物組合物，包括：

藥學上可接受之載體；以及一有效量之式(2)所示主成分，其中G係選自以下所組成之群組：聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)、聚酯樹狀型聚合物(polyester type dendrimer)、聚甘油樹狀型聚合物(polyglycerol dendrimer)、三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propyleneimine)dendrimer)、Newkome類樹狀型聚合物(Newkome-type dendrimers)和聚離氨酸類樹狀型聚合物(polylysine dendrimer)：以及A、B與Y均係自然數，Y係代數(generation)之 值，A與B之總和係(4 x 2^Y)，Asp代表天門冬胺酸(aspartic acid)。

9.一種藥物組合物，包括：藥學上可接受之載體；以及一有效量之式(3)所示主成分，

其中R1係-(Asp-)_K；R2係選自以下所組成之群組：聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)、聚酯樹狀型聚合物(polyester type dendrimer)、聚甘油樹狀型聚合物(polyglycerol dendrimer)、三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propyleneimine)dendrimer)、Newkome類樹狀型聚合物(Newkome-type dendrimers)和聚離氨酸類樹狀型聚合物(polylysine dendrimer)：以及T與K均係自然數，64≧T≧1，20≧K≧1，Asp代表天門冬胺酸(aspartic acid)，Gly代表甘胺酸(glycine)。

10.如上述實施例之藥物組合物，具有如式(2)所示之主成分， 其中R係聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)。

11.如上述實施例之藥物組合物，具有如式(3)所示 之主成分， 其中R2係聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)。

12.一種化合物之製備方法，係包括下列步驟 (1)選用Rink amide或先置入胺基酸之樹酯(resin)為合成原料，浸泡於有機溶媒，(2)以去保護試劑(簡稱DEP)，移除保護基，(3)取胺基酸與耦合試劑，添加活化溶液(簡稱ACT)(4)反應結束後，以終止試劑(簡稱CAP)終止未反應之樹酯(5)重複上述步驟(2)、(3)與(4)。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

參考文獻

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Claims (4)

1. 一種化合物，具有如式(3)所示之結構， 其中R1係-(Asp-)_K；R2係選自以下所組成之群組：聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)、聚酯樹狀型聚合物(polyester type dendrimer)、聚甘油樹狀型聚合物(polyglycerol dendrimer)、三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propyleneimine)dendrimer)、Newkome類樹狀型聚合物(Newkome-type dendrimers)和聚離氨酸類樹狀型聚合物(polylysine dendrimer)：以及T與K均係自然數，64≧T≧1，20≧K≧1，Asp代表天門冬胺酸(aspartic acid)，Gly代表甘胺酸(glycine)。
2. 如申請專利範圍第1項之化合物，具有如式(3)所示之結構， 其中R2係聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)。
3. 一種藥物組合物，包括：藥學上可接受之載體；以及一有效量之式(3)所示主成分， 其中R1係-(Asp-)_K；R2係選自以下所組成之群組：聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)、聚酯樹狀型聚合物(polyester type dendrimer)、聚甘油樹狀型聚合物(polyglycerol dendrimer)、三嗪類樹狀型聚合物(triazine based dendrimer)、聚丙烯亞胺樹狀型聚合物(Poly(propyleneimine)dendrimer)、Newkome類樹狀型聚合物(Newkome-type dendrimers)和聚離氨酸類樹狀型聚合物(polylysine dendrimer)：以及T與K均係自然數，64≧T≧1，20≧K≧1，Asp代表天門冬胺酸(aspartic acid)，Gly代表甘胺酸(glycine)。
4. 如申請專利範圍第3項之藥物組合物，具有如式(3)所示之結構， 其中R2係聚乙二胺樹狀型聚合物(PAMAM)。