TW201439113A

TW201439113A - 用於治療艱難梭狀芽孢桿菌（Clostridium difficile）相關疾病之組成物及方法

Info

Publication number: TW201439113A
Application number: TW103109437A
Authority: TW
Inventors: Pele Choi-Sing Chong; Jui-Hsin Huang; Chih-Hsiang Leng
Original assignee: Nat Health Research Institutes
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2014-10-16
Also published as: US9493518B2; CN105705514A; EP2970402A1; TWI605056B; US20140271700A1; EP2970402A4; CA2906228A1; WO2014138924A1

Abstract

本發明係關於一種單離之多肽，其含有一或多種艱難梭狀芽孢桿菌(Cd)毒素A(tcdA)之受體結合區域。本發明亦關於編碼該等多肽之核酸，及該等多肽及核酸之使用方法。

Description

用於治療艱難梭狀芽孢桿菌( Clostridium difficile )相關疾病之組成物及方法

本發明係關於一種用於治療艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)相關疾病之組成物及方法；特別係關於一種新穎多肽、融合多肽、編碼該多肽之核酸，與含有該多肽之免疫治療組成物，及該多肽之使用方法。

艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile，Cd)是在醫院內進行機會性感染的新興病原體，為造成人類抗生素相關疾病如偽膜性結腸炎及腹瀉之主要原因。

艱難梭狀芽孢桿菌之主要致病作用係透過兩種大型蛋白毒素，毒素A(tcdA)及毒素B(tcdB)，會破壞腸上皮細胞。tcdA及tcdB，為具有多個功能域(domains)的大型蛋白毒素(250至308kDa)。於致病過程初期，艱難梭狀芽孢桿菌(Cd)的受體結合域(RBD)首先與位於結腸上皮細胞表面的碳水化合物結合。tcdA及/或tcdB再經由受體介導之內胞飲作用進入細胞，並破壞維持細胞骨架所需的正常訊息傳遞途徑，而最終導致發炎反應與腹瀉。已知有各種寡醣(包括三醣類α-半乳糖-(1,3)-β-半乳糖-(1,4)-β-N-乙醯葡萄糖胺)可特異結合tcdA，但在人類中特異結合tcdA之配體尚未確定。

醫院中接受抗生素治療的患者，具有高度罹患艱難梭狀芽孢桿菌感染的風險，尤其是兒童及65歲以上老人。艱難梭狀芽孢桿菌相關疾病因而導致額外醫療費用支出並延長住院時間。因為致病毒株毒力的改變，使得艱難梭狀芽孢桿菌相關疾病的發病率及死亡率顯著地增加。

因此，迫切需要研發用於對抗艱難梭狀芽孢桿菌感染及Cd相關疾病的預防與治療之試劑。

本發明係關於一種新穎多肽、融合多肽、編碼所述多肽之核酸、含有所述多肽之免疫治療組成物及使用所述多肽之方法。

本發明含有Cd tcdA之一或多個功能域的多肽及/或脂多肽(lipo-ploypeptides)，可用於製備對抗由Cd感染所引起之疾病的疫苗，用於診斷是否遭到Cd感染，及用於製造免疫試劑。辨識結合此類多肽之單株或多株抗體，可用於診斷是否受到Cd感染，及用於免除或治療與艱難梭狀芽孢桿菌感染相關的疾病。

因此，本發明係關於一種含有一或多個Cd tcdA的功能域，如tcdA-RBD之單離多肽。舉例而言，所述之單離多肽可具有選自SEQ ID NO：2、4、6及8-18任一者的胺基酸序列，或具有與前述序列具至少80%以上(例如，85%、90%、95%、98%或99%)同一性的序列。該多肽可進一步包含一脂質化序列。此類多肽可以脂質化形式表達。

本發明亦關於一種包含編碼上述多肽序列之序列的單離核酸分子，及一種含有該核酸分子之載體。

本發明進一步係關於一種與上述多肽特異結合之抗體或其抗原性片段。一種用於診斷Cd感染或與該感染相關之疾病之套組，可包含一個或多種上述之抗體。

本發明亦關於一種包含所述tcdA-RBD或其片段之嵌合分子，其可連接到另一分子，例如多肽、多醣、核酸或小分子化合物。該鏈結的多肽可包括分離自致病細菌或病毒的抗原性表面蛋白質(antigenic surface protein)或胜肽，如HIV膜蛋白、登革熱病毒E蛋白、流感病毒血凝素蛋白、呼吸道細胞融合病毒F蛋白及副流感病毒HN蛋白。該鏈結之多醣可包括不同血清的寡糖分子，來自於細菌如肺炎球菌、腦膜炎球菌、流行性感冒嗜血桿菌、鮑氏不動桿菌，或艱難梭狀芽孢桿菌。

另一方面，本發明關於一種包含所述多肽、嵌合分子或核酸分子之免疫原性組成物。此類免疫原性組成物可用於預防或治療Cd感染或與該感染相關的疾病，或可用於誘發免疫反應。

本發明亦關於一種含有一抗原及上述多肽作為佐劑的免疫原性組成物。

於以下之實施方式及伴隨所附圖式，將詳加敘述一或多個具體實施例。其它特徵、標的及優點從下列描述、圖式及專利範圍中將是顯而易見的。

圖1為顯示(A)tcdA之C-端重複性序列；及(B)合理設計RBD同一性序列(SEQ ID NO：26)。假定的受體結合區以畫底線之方式表示。

圖2為在大腸桿菌系統表達rRBD或rlipo-RBD質體之示意圖。

圖3為SDS-PAGE(圖3A及圖3B)及西方墨點法分析結果，由鎳親和性管柱純化大腸桿菌溶菌液中之重組tcdA-RBD(rRBD)。分子量標記為35kDa、48kDa、63kDa、75kDa、100kDa及135kDa。

圖4為SDS-PAGE(圖4A及圖4B)及西方墨點法分析結果，由鎳親和性管柱純化大腸桿菌溶菌液中之重組tcdA-RBD片段(rRBD-F1、-F2及-F3)。分子量標記為31kDa、42kDa、57kDa、72kDa、93kDa及125kDa。

圖5為SDS-PAGE(圖5A及圖5B)及西方墨點法分析結果，由鎳親和性管柱純化大腸桿菌溶菌液中之重組脂化tcdA-RBD(rlipo-RBD)。分子量標記為35kDa、48kDa、63kDa、75kDa、100kDa及135kDa。

圖6為條型圖顯示酵素結合免疫分析之結果，不同劑量rRBD與rlipo-RBD作為疫苗注射於小鼠之血清，於不同時間點偵測IgG對於rRBD之力價。

圖7為表示該rlipo-RBD在小鼠攻毒模式抵抗tcdA毒性，誘發劑量依賴性免疫性保護。

圖8為rRBD及rlipo-RBD誘發劑量依賴型IgA全身性表現，並且rlipo-RBD比rRBD更為有效10倍。

圖9顯示rRBD及rlipo-RBD兩者具有佐劑作用，於小鼠免疫性研究中提高辨識卵白蛋白(ovalbumin，OVA)，兩者IgG(上圖)和全身性IgA(下圖)之力價。

圖10為利用流式細胞儀分析，鑑定rRBD及其片段(F1、F2及F3)在活體外VERO細胞受體的結合活性。

圖11顯示tcdA-rRBD及其截短片段以環兩色相性分光法進行結構性分析。

圖12為測試tcdA及rRBD在兔子紅血球細胞中血球凝集素之活性分析。

圖13為測試rRBD其截短片段(rRBD-F1、-F2及-F3)在兔紅血球細胞中血球凝集素之活性分析。

圖14為西方墨點法顯示不同RBD片段結合至宿主受體之親和力。

圖15顯示天竺鼠血清對於不同合成胜肽及其混合物，酵素結合免疫法分析之結果。圖15A顯示抗rRBD之抗肽血清IgG之力價。圖15B顯示抗個別胜肽之抗肽血清IgG之力價。混合物包括P1、P2及P3。

圖16為一系列西方墨點法分析天竺鼠抗血清中辨識合成胜肽混合物之抗體。圖16A及圖16B為顯示rRBD及其片段，分別抗小鼠抗rRBD血清及天竺鼠抗肽混合物。

圖17顯示天竺鼠抗肽血清在兔子紅血球細胞抑制rRBD血球凝集素活性。

圖18顯示以個別RBD片段產生天竺鼠抗血清的血球凝集素抑制活性(hemagglutinin inhibition，HAI)。

圖19為共軛焦顯微鏡影像顯示tcdA-RBD及其片段可在一分鐘內快速地結合到宿主受體，然後10分鐘內進入(internaliz)細胞內與在細胞化去局部化(delocalize)，及之後30分鐘內開始被降解。

圖20顯示從RBD片段免疫之小鼠中，產生生物性及免疫性功能之抗血清。

圖21顯示rRBD及其截短片段具有佐劑之活性。

圖22係一組圖顯示在樹突細胞活化研究中，rRBD及其片段增加表現T 細胞反應器的生物標誌物。

圖23為顯示rRBD及其片段在樹突細胞中增加表現前發炎細胞激素。

本發明係關於一種新穎多肽，其包含艱難梭狀芽孢桿菌(Cd)毒素A(tcdA)的受體結合區(RBD)。出乎意料地，此類多肽(特別是當其以脂質化形式表達時)具有很強的免疫原性，且能夠在動物模式中誘發可抵抗Cd攻毒之免疫力。

以下描述包含一或多種CdtcdA功能域之多肽，及編碼該等多肽之核酸。

一範例性多肽包含tcdA之C-端部分，其包括tcdA之受體結合域(RBD)，即tcdA-RBD或RBD。以下所列係編碼tcdA-RBD之核酸序列(SEQ ID NO：1)及tcdA-RBD的胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。RBD內之假定的受體結合區，以加網底標記方式顯示於SEQ ID NO：2。

tcdA-RBD核酸序列(SEO ID NO：1)

tcdA-RBD胺基酸序列(SEQ ID NO：2)

本發明亦關於tcdA-RBD其三種片段，如F1、F2及F3。該片段的胺基酸序列及其編碼該等片段的核酸序列列示如下。假定的受體結合區以加網底方式標記。

F1核酸序列(SEQ ID NO：3)

F1胺基酸序列(SEQ ID NO：4)

F2核酸序列(SEQ ID NO：5)

F2胺基酸序列(SEQ ID NO：6)

F3核酸序列(SEQ ID NO：7)

F3胺基酸序列(SEQ ID NO：8)

此外，亦描述含有tcdA之潛在功能域的多肽，此類多肽之胺基酸序列係列示於表1中。

可於大腸桿菌表達系統製造含有上述其中一種多肽及一位於N-端之脂質化(lipidating)序列的融合蛋白。術語“脂質化序列”或“脂質前導序列”係指一胺基酸序列，其(a)包括一第一片段至少80%(85%、90%、95%或99%)與Ag473的SP具同一性及一第二片段至少有80%(85%、90%、95%或99%)與Ag473的域1具同一性，該第一片段位於N-端的脂質化序列，及(b)有利於大腸桿菌中，使其N-端具有該脂質化序列之多肽形成脂化。該脂質化序列中，該第一片段可直接連接或經由一胜肽連接到該第二片段。通常該序列最大長度具有40-100(如40-80)個胺基酸。

Ag473係腦膜炎雙球菌的脂蛋白其具有四個功能域，SP及域一至三。以下為其胺基酸序列(SEQ ID NO：19)及鑑別的四個功能域：

SP：胺基酸殘基1-17(畫底線)

域1：胺基酸殘基18-40(加網底標記)

域2：胺基酸殘基41-71(粗體)

域3：胺基酸殘基72-121(斜體)

舉例而言，在此所描述該脂質化序列包含SEQ ID NO：19殘基1-40，即KKLLIAAMMAAALAACSQEAKQEVKEAVQAVESDVKDTA(SEQ ID NO：20；Ag473的功能域一)。

上述該脂質化序列可以通過慣用重組技術被連接到目標多肽以形成一融合蛋白，在大腸桿菌中表達時為脂化形式。實施例如下，編碼該脂質化序列的DNA片段及一編碼該標的多肽的DNA片段被插入到一表達載體中，較佳地可攜帶強啟動子(例如T7、T5、T3或SP6)以構建表達質體。該強啟動子係可被誘導，例如由異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。然後該表達質體導入到一大腸桿菌宿主菌株，其陽性轉形株在合適條件下培養以表達蛋白質。較佳地該大腸桿菌宿主菌株對於過度表達外源蛋白所誘導的毒性作用具有抗性。該等大腸桿菌菌株可以美國專利編號6361966所描述之方法鑑別/生成。該大腸桿菌菌株之實施例包括但不限於C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)及C2014(DE3)(NCIMB 40884)。

該表達的融合蛋白因此可從大腸桿菌宿主細胞中單離及經由本領域習知方法證實其脂化狀態，例如以抗脂蛋白抗體進行免疫墨點法或質譜分析。

本發明亦關於一種包含一序列編碼該上述多肽或融合蛋白或者其互補序列的單離核酸分子。該核酸分子之實施例包括SEQ ID NO：1及其退化變異株，其退化變異株中一個或多個密碼子可由編碼相同殘基的其它密碼子所替代。

該核酸分子可以用於表達本說明書所述之多肽或融合蛋白，或作為一DNA疫苗。操作上可將該核酸分子連接至合適的調節序列以產生一表達載體。

載體實施例包含一質體、黏質體或病毒載體。該載體包括一在適宜的形式在宿主細胞中表達之核酸。該載體較佳的是包括連接到該表達之核酸序列的一個或多個調控序列。一調控序列包括啟動子、增強子及其他等表達控制元件(例如T7啟動子、花椰菜鑲嵌病毒35S啟動子或聚腺苷酸化信號)。該等調控序列包括其引導核苷酸序列的持續性表達，如組織特異性調節及/或誘導型序列。該表達載體之設計可取決於此類因素作為選擇該轉形的宿主細胞，所需蛋白質的表達水平等等。該表達載體可以被導入該宿主細胞以產生本發明之多肽或融合蛋白。該宿主細胞為，例如，大腸桿菌、百日咳桿菌、芽孢桿菌、非洲綠猴腎臟細胞、嗜血桿菌、真菌、酵母或中國倉鼠卵巢細胞。亦可使用桿狀病毒表達系統產生蛋白。

一種宿主細胞包含該上述核酸是可被生產的。實施例包括大腸桿菌、昆蟲細胞(例如使用桿狀病毒表達載體)、植物細胞、酵母菌細胞及哺乳動物細胞。參照例如Goeddel,(1990)Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA。

本發明關於一種多肽、融合蛋白或核酸分子可用於製備一免疫原性組成物(例如疫苗)，用以其易感染該致病菌或已被感染該致病菌之個體(例如人)，產生抗體及/或免疫反應抵抗艱難梭狀芽孢桿菌。該組成物可以經由例如以下所述之方式，或通過本領域任何已知其它方法製備。

例如，該組成物可包含一該多肽、融合蛋白或核酸分子之有效劑量及醫藥上可接受之載體如一磷酸鹽緩衝液，一碳酸氫鹽溶液。該組成物還可包含一佐劑。該載劑在某種意義上必須為“可接受的”，係指載劑與組成物活性成分相容，且不有害於待治療之患者。基於投藥方式途徑及標準醫藥實務程序之基礎上選擇載劑。適合之藥物載劑與稀釋劑及用於醫藥用品，已描述於雷明登製藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)。該組成物，如果需要，亦可包含一佐劑，如霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱型腸毒素(LT)、脂質體、免疫刺激性複合物(ISCOM)或免疫刺激性序列寡去氧核苷酸(ISS-ODN)。該組成物還可包括促進體內遞送之聚合物，參見Audran R.et al.Vaccine 21：1250-5,2003；及Denis-Mize et al.Cell Immunol.,225：12-20,2003。

本發明該多肽或融合多肽包含另一抗原，或鏈結到其他蛋白質(例如抗原)或多醣以一產生嵌合分子亦可作為一免疫原性組成物之佐劑。例如，其它抗原可為抗原性蛋白質或其來自病原體如人乳頭瘤病毒(HPV)，C型肝炎病毒(HCV)，非洲淋巴細胞瘤病毒(EBV)，單純皰疹病毒第1型(HSV-1)，單純皰疹病毒第2型(HSV-2)，巨細胞病毒(CMV)、呼吸道融合病毒(RSV)、副流感病毒第3型(PIV3)、流感病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒、諾羅病毒及SARS冠狀病毒之片段。

該免疫原性組成物可配製成一微粒製劑，膠囊劑或脂質體製劑。此外，此類免疫原性組成物可包含或連同一靶向分子以共同投藥方式，用於遞送至免疫系統或黏膜表面的特定細胞。

此外，本發明所述之該等多肽及融合多肽包含位於該RBD內一種或多種受體結合區可被用作藥物載劑。舉例而言，一藥物分子(例如，一多肽及一小分子化合物)可以連接到該等多肽。

本發明亦關於一種用於診斷Cd感染及與該感染相關疾病之套組。該套組包含一或多種抗體可特異辨識tcdA。例如，該套組之抗體可特異結合至一多肽，其組成之一序列選自由SEQ ID NO：2、4、6及8-18所組成之群。該抗體可以使用本領域習知方法產生。該套組可用於檢測疑似感染Cd之個體身上所獲得之樣品(如血液樣品)中tcdA之存在。

上述任何該藥物組成物可經由腸胃外用藥，例如皮下注射或肌內注射。相對地，亦可用於其他投藥模式包括栓塞劑及口服製劑。對於栓塞劑、黏合劑及載劑可包括，例如聚烯烴二醇或三酸甘油酯。口服製劑可包括初期常使用如藥物級之糖精、纖維素及碳酸鎂等。該等組成物採取溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊，緩釋製劑或粉末之形式。

“個體”係指人類及非人類之動物。非人類動物之實施例包括所有脊椎動物，例如哺乳動物，如非人類之靈長類動物(特別係高級靈長類動物)、狗、囓齒類動物(如小鼠或大鼠)、天竺鼠、貓及非哺乳動物如鳥類及兩棲類等。較佳地，個體為人。另一具體實施態樣中，個體為實驗動物或適合作為一疾病模式之動物。

在此所使用之術語“治療”係指應用或投與一組成物包含一或多種活性劑至一個體，其個體患有疾病，出現該疾病之症狀，或對該疾病易感性，其目的係治療、封口、緩解、減輕、改變、補救、改善，改良或影響疾病，疾病症狀，或對該疾病的易感性。本發明在此所使用“有效劑量”係指對該個體具治療效果所需該活性劑之劑量，單獨或與一或多種其他活性劑組合。有效劑量可由該領域習知技藝人士判斷並決定劑量多寡，取決於給藥途徑、賦形劑之使用及與其他活性劑共同使用。

術語“免疫反應”或“免疫原性反應”係指免疫系統反應於在一個體對於抗原的任何反應。脊椎動物的免疫反應實施例包括，但不限於，抗體產生，誘發細胞介導免疫力及補體活化。

“抗原”係指一分子含有一個或多個抗原決定基，其可刺激宿主免疫系統產生抗原特異性之免疫反應。術語“抗原”可與“免疫原”互換使用。在此所用術語“抗原決定基”係指抗原上的可與特異性抗體分子或T細胞受體結合之部位。本發明之該術語可與“抗原決定因子”或“抗原決定部位”互換使用。

“抗體”係指一免疫球蛋白分子或一免疫球蛋白分子含至少一種免疫活性部分，其具有特定胺基酸序列並僅結合到抗原或密切相關之抗原群組。抗體實施例包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。免疫球蛋白分子免疫活性部分之實施例包括Fab及F(ab)'.sub.2片段，其可以通過用酶例如胃蛋白酶處理抗體來產生。一抗體可以為單株抗體或多株抗體。

“佐劑”係指加入到免疫原性組成物之一物質，例如疫苗，雖然本身可具有或不具有任何特異抗原性效力，但可以刺激免疫系統並提高對該免疫原性組成物之免疫反應。佐劑之實施例包括，但不限於，明礬沉澱、弗朗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)、弗朗式不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)、單磷氧基-脂質A/海藻糖dicorynomycolate佐劑、含有短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)及tRNA之乳化油，及其他藉由模擬演化上保留性分子增加免疫反應之物質包括脂質體、脂多醣(LPS)、抗原之分子籠，細菌細胞壁，及經由內胞飲作用進入之核酸，如雙鏈RNA、單鏈DNA及含有未甲基化CpG雙核苷酸之DNA。其他實施例包括霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素、脂質體、免疫刺激複合物(immune-stimulating complex，ISCOM)、免疫刺激性寡去氧核苷酸序列及氫氧化鋁。

下述之實施例對於揭露內容其餘部分僅為說明性的，而非用以限制本發明。無需進一步詳盡說明，該技術領域具有通常知識者可基於本發明之描述，完全充分利用本發明。於本說明書引用之所有公開文件皆以其全文引用的方式納入本說明書作為參考文獻。

材料與方法

(1)同一性序列分析

吾等合理設計一段序列含有艱難梭狀芽孢桿菌酸毒素A的C-端結合域，經由NCBI資料庫以序列比對工具，如Vector NTI Advance 11.5比對細菌株VPI10463之序列，其序列具有高度保留性及重複性，該序列列示於圖1，以線上分析軟體偵測並比對其重複性蛋白質序列(參見網址ebi.ac.uk/Tools/pfa)。

(2)選殖及質體構築

將TcdA RBD之核苷酸序列經大腸桿菌表達密碼子最佳化，並利用化學方式合成以便進行基因選殖，序列如SEQ ID NO：1所示。為了選殖三個TcdA RBD片段(RBD-F1、RBD-F2及RBD-F3)，遂以PCR擴增該三片段之編碼區域，其所用引子如下：F1順向引子=TAA CAT ATG GGA TCC TTT AAT AGC GAG AAT GAA(SEQ ID NO：37)，F1反向引子=ATT CTC GAG TGC TTT TGA ATC GCT GCC(SEQ ID NO：38)，F2順向引子=TAA CAT ATG GGA TCC GCC GAA GCA GCC ACC GGC(SEQ ID NO：39)，F2反向引子=ATT CTC GAG GGC AAT ATA CGT GTT GGT(SEQ ID NO：40)，F3順向引子=TAA CAT ATG GGA TCC AAA GCC GTG ACC GGA TGG(SEQ ID NO：41)，F3反向引子=ATT CTC GAG GCC ATA AAT ACC CGG TGC(SEQ ID NO：42)。以NdeI及XhoI兩限制酶切位，將RBD-F1、RBD-F2、RBD-F3及RBD插入pET-22b載體(Novagen)中，並分別轉形至大腸桿菌BL21(+)RIL(Novagen)及JM109(DE3)(Agilent technologies)。將RBD之5’-端融合一脂質訊號序列，而獲得另一構築體，rlipo-RBD。將該質體轉形至大腸桿菌菌株C43(DE3)(Lucigen)。

該構築及選殖之序列更詳述如下(畫底線部分-限制酶切位；正規字型-RBD、F1、F2或F3序列；粗體字型-脂質前導序列(lipid leader sequence，LLS)。

將片段BamHI-RBD-XhoI插入選殖載體pET-22b，得到一質體(pET22b_rRBD)，見圖2。

NdeI-BamHI-RBD-XhoI(SEQ ID NO：21)

由SEQ ID NO：21編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：22)

將片段NdeI-LLS-BamHI-RBD-XhoI插入選殖載體pET-22b可得到一質體(pET22b_rlipo-RBD)，見圖2。

NdeI-LLS-BamHI-RBD-XhoI(SEQ ID NO：23)

由SEQ ID NO：23編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：24)

經由將一NdeI-F1-XhoI片段插入至選殖質體pET-22b，而構築得質體(pET22b_F1)。

NdeI-BamHI-F1-XhoI(SEQ ID

由SEQ ID NO：25編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：26)

經由將NdeI-LLS-BamHI-F1-XhoI片段插入至選殖質體 pET-22b，而構築得質體(pET22b_lipo-F1)。

NdeI-LLS-BamHI-F1-XhoI(SEQ ID NO：27)

由SEQ ID NO：27編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：28)

經由將NdeI-F2-XhoI片段插入至選殖質體pET-22b，而構築得質體(pET22b_F2)。

NdeI-BamHI-F2-XhoI(SEQ ID NO：29)

由SEQ ID NO：29編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：30)

經由將NdeI-LLS-BamHI-F2-XhoI片段插入至選殖質體pET-22b，而構築得質體(pET22b_lipo-F2)。

NdeI-LLS-BamHI-F2-XhoI(SEQ ID NO：31)

由SEQ ID NO：31編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：32)

經由將NdeI-F3-XhoI片段插入至選殖質體pET-22b，而構築得質體(pET22b_F3)。

NdeI-BamHI-F3-XhoI(SEQ ID NO：33)

由SEQ ID NO：33編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：34)

經由將NdeI-LLS-BamHI-F3-XhoI片段插入至選殖質體pET-22b，而構築得質體(pET22b_lipo-F3)。

NdeI-LLS-BamHI-F3-XhoI(SEQ ID NO：35)

由SEQ ID NO：35編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：36)

(3)重組蛋白表達與純化

將各別與一C-端多組胺酸標記融合之rRBD、F1、F2及F3多肽(亦即，分別包括SEQ ID NO：2、4、6及8之多肽)，經由1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside)誘導後在大腸桿菌BL21(+)RIL表達，以含有100ug/ml之盤尼西林之LB培養液於20℃下培養16小時。以離心方式自2公升培養菌液收取細胞，並儲存於-20℃，之後將其懸浮於含有250mM氯化鈉及5mM咪唑之50mM磷酸鈉緩衝液，pH 7.2。以法式壓碎機(French Press)打破菌體並收集上清液後，該上清液通過鎳離子樹脂純化。將RBD-截短之蛋白以含有50mM精胺酸及10%甘油之1X PBS，pH 7.2進行透析。將該四種蛋白質通過E膜以除去內毒素。融合至多組胺酸標記C-端的rlipo-RBD之純化步驟，係根據Tseng與Leng於Appl Microbiol Biotechnol.2012；93：1539-1552所敘述之方法。大致上，係將大腸桿菌C43(DE3)表達的rlipo-RBD在細胞裂解後，以含0.5% Triton X-100之50mM Tris-Cl，pH8.0從沉澱物進行萃取。將該萃取經由兩步驟親和性色層層析純化。首先，使用鎳離子樹脂進行分離。第二步，係將透析後所得之除去咪唑的溶析液通過其中以銅離子充填的固定化金屬離子親和性層析(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)(GE)，以除去LPS。

(4)胜肽合成

所有胜肽係購自台灣NIIDV胜肽合成設施中心。

(5)SDS-PAGE及西方墨點法分析

蛋白質樣本以10% SDS-PAG分析之前，先以BCA蛋白分析套組(Thermo Pierce)定量。於樣本轉移至PVDF(GE)後，將該PVDF薄膜以5%牛奶處理一小時。之後將薄膜與抗組胺酸標記抗體及特異抗艱難梭狀芽孢桿菌毒素A抗體反應，於含1%牛奶及0.05% Tween-20之磷酸鹽緩衝液反應一小時。最後，將該薄膜與山葵過氧化氫酶共軛之二級抗體(GeneTex)反應，於含1%牛奶及0.05% Tween-20之磷酸鹽緩衝液反應一小時。再以Luminata Crescendo受質(Merck Millipore)沖洗薄膜。

(6)在Vero細胞進行活體外中和分析

Vero細胞培養在75T細胞培養角瓶(Corning)，於37℃，5% CO₂下以含病毒生產無血清培養液(Virus production-serum free medium，VP-SFM)(Invitrogen)/4mM麩醯胺酸培養，直到細胞長滿。將2x10⁴細胞接種在96孔盤，於37℃，5% CO₂培養隔夜後，替換新鮮的VP-SFM培養液。將以rRBD或rlipo-RBD免疫或無免疫之小鼠血清連續兩倍稀釋後，以等體積混合毒素A並於室溫反應一小時。該混合物加入96孔盤以達到毒素A濃度為16ng/ml，並於37℃，5% CO₂反應24小時。以100%細胞變圓及顯微鏡上之相機捕捉細胞影像，測定毒素A之中和力價。

(7)動物免疫及tcdA攻毒模式

BALB/c小鼠及敘利亞黃金倉鼠(Syrian golden hamsters)購買自台灣國家動物中心，並飼養於台灣國家衛生研究院的實驗動物中心。BALB/c小鼠以0.3、3.0及30μg rRBD與rlipo-RBD每隔兩週免疫三次，倉鼠以10μg rRBD與rlipo-RBD每隔兩週免疫三次。免疫之前，小鼠及倉鼠個別以臉部及眼竇靜脈採血取樣，採集之血清藉由ELISA計算抗原特異IgG及IgA之力價。毒素A攻毒方式如先前Sergin SS et al.,2012.Vaccine 30：1492-1501所描述。簡而言之，BALB/c小鼠0.3及3μg rRBD以及rlipo-RBD經由肌肉注射，每隔兩週免疫三次，15週齡小鼠以腹膜注射150ng毒素A(NativeAntigen Inc.)。實驗室人員每隔6小時持續觀察記錄動物致死率。

(8)多肽免疫

天竺鼠購自台灣國家動物中心(National Animal Center)以單獨三多肽及其與不完全弗朗式佐劑(IFA)(Sigma)製備之混合物，每一個月以皮下注射免疫三次，飼養於國家衛生研究院實驗動物中心。

(9)細胞染色及流式細胞儀分析

Vero細胞在75T細胞培養角瓶，以含VP-SFM/4mM麩醯胺酸培養，於37℃，5% CO₂下至細胞長滿。5x10⁵細胞與1μg特異單株抗體(GeneTex)及抗組胺酸標記抗體(AbD Serotec)在冰上反應30分鐘。洗滌兩次之後，在冰上以FITC共軛之二級抗體(Sigma)處理30分鐘作表面染色。流式細胞儀分析之前，以碘化丙啶處理標記死亡細胞以排除死亡細胞。

(10)血液凝集素活性分析

血液凝集素(Hemagglutinin，HA)活性分析如Wren et al.(Infect.Immun.1991,59：3151-3155)所敘述。簡而言之，於25μL磷酸鹽緩衝液含有250pMoles rRBD，或rRBD-F1，或rRBD-F2，或rRBD-F3其中之一以磷酸鹽緩衝液連續兩倍稀釋，並置於96孔圓底盤中。以一比一比例，加入25μL兔紅血球細胞之懸浮液以磷酸鹽緩衝液再洗滌一次，以除去血清汙染。混合物在4℃培養至隔夜，以肉眼計算分析血液凝集素活性。

(11)酵素結合免疫分析

於酵素結合免疫分析盤(Costar)覆蓋抗體隔夜之後，以含5% BSA(Calbiochem)之磷酸鹽緩衝液阻塞。該盤以連續倍率稀釋之血清於室溫反應兩小時。以山葵過氧化氫酵素共軛之IgG(KPL)及IgA(Invitrogen)特異抗體與含1% BSA之磷酸鹽緩衝液在室溫下反應一小時。該盤再以TMB單孔過氧化氫酵素受質(KPL)處理於室溫黑暗條件下反應20分鐘。最後以分光光度計偵測OD_450nm吸光值以計算血清力價。

(12)黏膜免疫作用

6至8週齡之雌C57BL/6小鼠購買自台灣國家動物中心，並飼養於國家衛生研究院動物中心。所有實驗進行並遵循國家衛生院動物中心之準則，每一組的6隻小鼠每隔兩週接受三次鼻內免疫，每次施以2μg或10μg tcdA-RBD及其與10μg卵白蛋白配製之製劑。將10μg卵白蛋白分別與1μg霍亂毒素及PBS調配，作為陽性及陰性對照組。小鼠在每次免疫之前一週由臉部靜脈採血。用於鼻內注射之抗原製備於總反應體積40μL，最後一次免疫7天後，從小鼠採血並犧牲已採集其之氣管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)及位於小腸之糞便。採集其之氣管肺泡灌洗液以含有蛋白酶抑制混合物組(Protease Inhibitor Cooktail Set III)(Calbiochem,Darmstadt,Germany)之1mL磷酸鹽緩衝液清洗。糞便則再回溶於同樣清洗氣管肺泡灌洗液的緩衝液，濃度為1mg/ml。該氣管肺泡灌洗液之清洗液及含糞便溶液維持在冰上直到儲存於-20℃。小鼠血清IgG及IgA含量、BALF及臉部血清IgA含量以酵素結合免疫分析測定。

(13)樹突細胞(DC)成熟表面標幟及細胞激素分析

樹突細胞成熟之活體外分析，係如先前Takeuchi et al.,(J.Immunol(2002)169：10-14)所述。C57B/6小鼠購買自台灣國家動物中心，並飼養於國家衛生研究院動物中心。大致上，從6至8週齡雌鼠C57B/6之脛骨採集源自骨髓之樹突細胞(bone marrow-derived DCs，BMDCs)。以LCM(含有1%抗生素盤尼西林及鏈黴素，10%熱去活化FBS，50μM β-巰基乙醇及50mM HEPES之RPMI 1640)劇烈地清洗以單離出骨髓細胞，並且以裂解緩衝液處理除去紅血球細胞。BMDCs再回溶於LCM，濃度為2×10⁶細胞/毫升，並以20ng/mL重組顆粒細胞巨噬細胞群刺激因子(recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor，MoGM-CSF)於第0天及第3天處理。於第6天將BMDCs(2×10⁶/mL)種在24孔盤。加入結合或不結合10ng/mL多黏桿菌素B(polymyxin，PMB)之不同濃度的tcdA-RBD。LPS及毒素A作為陽性對照組。培養後16至18小時，源自骨隨之樹突細胞以流式細胞儀(FACSCalibur,BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)分析以評估是否增加調控細胞表面標幟蛋白。為了排除未成熟的樹突細胞，50%總體細胞族群組成中，CD11c+細胞族群以抗CD-40、CD-80、CD-86及MHC-II特異單株抗體用於表面標幟蛋白染色。此外，該處理之後收集細胞培養液，以分析在成熟樹突細胞中典型分泌的細胞激素包含IL-6，IL-12p40及TNF-α其表現量。

(14)tcdA-RBD之佐劑效力

用於測量tcdA-RBD其全身性佐劑效力的免疫手冊如以下敘述，四組(一組6隻)BALB/c小鼠以2μg卵白蛋白(ovalbumin，OVA)(Sigma,US)，與3μg或10μg tcdA-RBD，RBD-F1，RBD-F2，RBD-F3或氫氧化鋁配製後，經由肌肉注射免疫，僅以2μg卵白蛋白免疫作為免疫對照組。三組小鼠免疫前14天進行臉部靜脈採血取樣，收集血液樣本並於56℃去活化30分鐘，再進一步分析前儲存於-80℃。

(15)流式細胞儀(Fluorescence-activated cell sorting，FASC)分析

Vero細胞於37℃及5% CO₂條件下，於75T細胞培養角瓶以VP-SFM/4mM麩醯胺酸，培養至八成滿。5x10⁵細胞與1μg特異單株抗體(PCG-4)(GeneTex)及抗組胺酸標記抗體(AbD Serotec)混合，並在冰上反應30分鐘。洗滌兩次之後，加入FITC共軛二級抗體(Sigma)並且樣本於冰上反應30分鐘以進行表面染色。在流式細胞儀分析之前，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)作為存活細胞之標記以排除死亡細胞。

結果

(1)編碼tcdA-RBD的DNA之合理設計

藉由連接其含有前述同一性序列分析中序列的數個合成DNA片段產生的cDNA片段，產生特定編碼tcdA-RBD的質體。編碼含有lipo-box序列的tcdA-RBD核酸及其他個別tcdA-RBD片段，經由次選殖至載體pET-22b，而產生pET-22b-rlipo-RBD、pET-22b-rRBD-F1、pET-22b-rRBD-F2及pET-22b-rRBD-F3，並將彼等用於轉形至上述大腸桿菌BL21(+)RIL及/或JM109(DE3)。從大腸桿菌JM109(DE3)中兩個獨立菌落製備之質體DNA，以用於序列確認。使用染劑-終結子化學法(dye-terminator chemistry)於定序儀ABI DNA sequencer model 370A上進行定序，寡核苷酸引子則由ABI DNA synthesizer model 380B合成，並以色層層析純化。核酸序列分析tcdA-RBD及其片段顯示有1或2錯誤配對之鹼基對，該錯誤配對之鹼基對經由定點突變法校正。

(2)大腸桿菌系統中rRBD、rlipo-RBD及其片段之表達

由上所述3種蛋白片段(rRBD-F1、-F2及-F3)及rRBD融合至一C-端多組胺酸標記，由大腸桿菌BL21(+)RIL表達。rlipo-RBD特定由大腸桿菌C43(DE3)表達。如需要的話，tcdA-RBD及其片段可在CHO細胞或Vero細胞其中之一與Myc-His標記融合為融合蛋白，選殖至CHO細胞或昆蟲桿狀病毒表達系統。

rRBD-F1，-F2與-F3，及rRBD由上述方法純化。該重組抗體內含LPS內容物濃度為<3EU/mL，不具有佐劑之效應。該重組抗體純度由SDS-PAGE及西方墨點法分析。參照圖3及圖4。一全長，重組tcdA-RBD(911胺基酸)第一次由大腸桿菌表達並純化其含有些微LPS汙染。

rlipo-RBD經由上述方法純化。該純度同樣由SDS-PAGE及西方墨點法分析。參照圖5。該LPS內容物濃度為<30EU/mL，具有佐劑之效應。

(3)合成胜肽於天竺鼠之免疫原性研究

三組天竺鼠以RBD-P1，-P2，-P3(參照上述表1)或包含該三種其中之一等量之胜肽免疫。個別胜肽或其混合物以100毫克與完全弗朗式佐劑(completed Fruend’s adjuvant)製備並於第0天注射，於第14天及第56天之後以含有該胜肽或混合物之一半量之不完全弗朗式佐劑(Incompleted Fruend’s adjuvant)增進反應，並於第78天採血取樣。進行免疫之前，天竺鼠由耳靜脈採血，收集血清樣本由ELISA測定抗體特異之IgG力價。該血清對於胜肽及rRBD顯示無反應

所有3種合成胜肽各自誘發強烈抗肽IgG抗體之免疫反應。參照下述表2。該抗肽血清同樣於酵素結合免疫分析中與tcdA反應。參照表 2。

(4)小鼠對於不同rRBD及rlipo-RBD抗體之免疫原性研究

BALB/c小鼠購買自台灣國家動物中心，並飼養於國家衛生研究院動物中心。每一組6隻小鼠(6-8週齡)於第0天、第14天及第28天後，以磷酸鹽緩衝液、30μg rRBD或3μg rlipo-RBD免疫，第42天之後以毒素攻毒。小鼠進行免疫之前，從臉部靜脈採血並收集血清，由ELISA測定抗原特異IgG及IgA之力價，及其他上述生物活性。

rRBD及rlipo-RBD兩者具有高度免疫原性，並能誘發強烈抗RBD抗體，其力價高於10,000，參照圖6。由西方墨點法分析顯示，該等抗體會與rRBD及tcdA反應(數據未示)。單獨以單一劑量rlipo-RBD(3μg)及rRBD(30μg)相較之下具有至少10倍的效力，如下表3。在Vero細胞分析中，只有抗rlipo-RBD小鼠血清可顯著地抑制tcdA毒性(p<0.001)，參照表3。該結果顯示，單獨的rRBD雖可誘發抗體反應，但其抗體無法完全阻斷tcdA結合至Vero細胞並殺死細胞。

當TCID₅₀(抑制50%)作為反應終點，發現抗rRBD小鼠血清於Vero細胞毒性分析中，對於tcdA毒性具有明顯的抑制作用，參照表4。

(5)小鼠tcdA攻毒模式中rlipo-RBD誘發保護性效力

小鼠模式中以tcdA(毒素A)攻毒如上所述，大致上，BALB/c小鼠以30μg rRBD或rlipo-RBD每隔兩週以肌肉注射方式免疫三次，在第15週經由腹膜注射150ng毒素A(NativeAntigen Inc.)以攻毒。實驗室人員每隔六小時持續地觀察動物死亡率，如以下表五，其中30μg rRBD或rlipo-RBD之一能保護大於90%小鼠抵抗毒素A攻毒，而以磷酸鹽緩衝液免疫之小鼠則被毒素A殺死。

進一步實驗顯示0.3μg rlipo-RBD足以保護小鼠避免毒素A毒性，參照圖7及表6。rRBD較不具效力；3μg劑量僅能保護10%小鼠避免毒素A之毒性。該結果與上述Vero細胞抑制分析之結果一致。亦即rlipo-RBD可誘發對於毒素A強烈保護性之免疫反應。

(6)rlipo-RBD誘發強烈全身性IgA抗體反應

當小鼠產生抗rRBD或rlipo-RBD之抗血清用於測試其對於全身性IgA的反應性，吾等發現3μg rlipo-RBD誘發強烈全身性IgA力價(>10,000)，其效力同30μg rRBD，參照圖8。

(7)rRBD具有佐劑功能以增強對於非免疫原性蛋白之免疫反應

因為rRBD以30μg之劑量，無佐劑存在情況下具有高度免疫原性，因此欲瞭解rRBD及/或rlipo-RBD是否能增強對於非免疫原性蛋白的免疫反應。卵白蛋白為已知的弱免疫原，在無佐劑之情況下無法誘發良好IgG抗體反應，因此不同群之小鼠單獨以卵白蛋白，或卵白蛋白與rRBD及rlipo-RBD其中之一免疫，發現rRBD及rlipo-RBD兩者皆能增強抗卵白蛋白 IgG及全身性IgA之抗體反應，參照圖9。同樣以2次劑量(0.3μg)rlipo-RBD進行免疫，於四周後誘發IgA抗體之免疫反應明顯地(p<0.001)優於以3μg rRBD免疫所得抗體的免疫反應，而在三次劑量免疫下並無顯著差異(於六周產生之免疫反應)，參照圖9。

(8)tcdA-RBD的受體結合片段

rRBD及其片段(rRBD-F1、-F2與-F3)用上述流式細胞儀測試其結合至Vero細胞之能力，如圖10所示，發現rRBD-F3比rRBD、rRBD-F1及rRBD-F2更具有效力。該結果揭示與F1及F2相較之下，rRBD-F3該重複性序列含有一更高親和力受體結合位點。由環兩色相性分光法(Circular dichroism，CD)顯示，在F1及F3片段中可觀察到明顯β-摺疊結構，參照圖11。該F2片段與其他兩片段比較，則顯示較少β-摺疊結構的訊號。

(9)該tcdA功能域其血液凝集素活性(HA)

rRBD及其片段(rRBD-F1、-F2及-F3)如上所述用於測試兔紅血球細胞(rabbit red blood cells，RRBC)其血液凝集素活性。約1%兔紅血球細胞中發現rRBD比tcdA更具有效力凝集兔紅血球細胞，參照圖12。該HA測試指出濃度4pMoles的rRBD可輕易地凝集兔子紅血球細胞。此外，發現小鼠抗rlipo-RBD血清可更有效地中和rRBD其HA活性。

進一步實驗證實，rRBD-F3比rRBD和rRBD-F2在血液凝集素活性分析中更具有潛力，參照圖13。意外地，rRBD-F1顯示並無任何血液凝集素活性，但如上所述強烈地結合至Vero細胞。該結果顯示F1片段具有其他非碳水化合物結合位點，經由Vero細胞結合分析中更進一步證實。西方墨點法顯示RBD-F1強烈結合至Vero細胞，而RBD-F2及其他兩片段相較其結合的能力較差，參照圖14。合併以上所述結果可知RBD片段中其重複性序列微小的差異可影響其對宿主受體親和力及血液凝集素活性。

(10)天竺鼠抗肽抗體在兔紅血球細胞分析中抑制rRBD其血液凝集素活性

如上所述在天竺鼠免疫原性研究中，合成多肽RBD-P1、-P2及-P3可誘發抗rRBD抗體的免疫反應。參照圖15及圖16。吾等亦測試該等抗肽血清在兔紅血球細胞分析中，是否能抑制rRBD之血液凝集素(HA)活性。如圖17顯示，該等血清在兔紅血球細胞分析中，能有效抑制rRBD之血液凝集素活性。天竺鼠抗肽血清抑制RBD其血液凝集素活性之效力，係顯示於圖18。

(11)rRBD及其片段可作為藥物遞送載劑

流式細胞儀分析顯示及Vero細胞直接結合分析列述如上，rRBD及其片段可快速辨識並結合至該宿主細胞。共軛焦顯微鏡觀察之下，rRBD及其片段可在一分鐘內快速結合至宿主細胞。之後10分鐘內進入(internalized)細胞並在細胞內去局部化(delocalized)，並在30分鐘內開始降解，參照圖19。這些結果揭示rRBD及其片段可作為藥物遞送載體。

(12)比較rRBD及其片段的免疫原性

RBD-F1、-F2及-F3設計分別具有源自N-端、中間區域及C-端相同數目的重複性序列，但每一片段具有以上所述不同功能級別(level)及生物物理特徵。吾等評估其免疫原性及誘發抗體之免疫性質，小鼠免疫原性研究中個別以30μg RBD之片段進行測試。發現RBD-F1及-F3片段同樣與rRBD具有潛力，參見圖20。與其他片段相較，RBD-F2具較少之免疫原性 (p<0.05)。雖然RBD片段能誘發良好IgG抗體之反應，但在毒素A中和分析(TCID₅₀)中與抗rRBD抗體相較，其抗體的生物功能較不具有效力，參照圖7。由抗RBD-F3血清測得最佳之力價為16，而由抗rRBD抗體測得之力價為256。該結果揭示其RBD片段可以單獨地或以組合作為候選疫苗以抵抗Cd感染。

(13)RBD片段可作為免疫刺激劑，以提高對微弱免疫原性抗原的免疫反應

吾等測試RBD片段是否可以增強對非免疫原性蛋白的免疫反應。卵白蛋白同樣作為此研究的模型蛋白。不同組小鼠(每組6隻)單獨以卵白蛋白(10μg)免疫，或用明礬，rRBD(10μg)，或不同的RBD片段(每一片段為30μg)與卵白蛋白配製。有趣的是，RBD，其片段能有效提高抗卵白蛋白IgG抗體之反應。見圖21，吾等同樣以10μg劑量測試RDB每個片段其佐劑效力。這些結果表明，所有RBD片段可用作為佐劑以增強對微弱免疫原性抗原的免疫反應。

(14)經由rRBD或RBD片段可引發樹突細胞之成熟

艱難梭狀芽孢桿菌毒素A被指出可調控表面效應分子 (surface effect molecules)之增加及樹突細胞(DCs)趨化激素CXCL2之表達。吾等測試rRBD及其片段是否能促進樹突細胞成熟，該樹突細胞對於調制(modulate)免疫系統為重要的抗原呈現細胞。C57BL/6小鼠的BMDCs細胞以rRBD處理之後，分析與T-細胞活性相關的樹突細胞成熟標幟(CD40、CD80、CD86及MHC-II)及前發炎性細胞激素(IL-6、IL-12和TNF-α)。的確，rRBD處理之後T-細胞表面效力分子顯著地增加及在細胞培養液中可偵測到高含量的前發炎性細胞激素。參照圖22及圖23。

為排除LPS汙染的可能性，遂將LPS在rRBD溶液之濃度限制於0.03EU/μg。此外，每一測試以多黏桿菌素B中和LPS之功能，以排除LPS經由類鐸受體(Toll-like receptor)4途徑使樹突細胞活化。

該結果同樣證實，以多黏桿菌素b處理及沒有rRBD處理之實驗組中並無顯著差異。此外，rRBD溶液及LPS經水煮之後以變性並且破壞rRBD的生物功能。單獨以水煮LPS處理之後樹突細胞活性並無顯著影響，但在以水煮rRBD之後卻阻礙樹突細胞的活性。整體而言，數據清楚地證實所觀察到樹突細胞之活性是來自於rRBD。

單獨RBD片段同樣以樹突細胞活性分析，結果發現類似於rRBD。參照圖22及圖23。與其他片段相較，發現RBD-F3最具有效力。

綜合該結果吾等可以結論，該免疫區域樹突細胞之活化可來自rRBD及其截短片段的免疫性效力。

(15)從tcdA其他區域鑑定之免疫原性多肽

為了製備一用以有效偵檢艱難梭狀芽孢桿菌感染及與該感染相關之疾病之診斷套組，遂合成包含tcdA其他功能域(參照上述表1)之多肽(CdTx-CP、CdTx-GT1、CdTx-GT2、CdTx-GT3、CdTx-TM1、CdTx-TM2及CdTx-TM3)，並以天竺鼠測試此多肽在其他患病個體是否能誘發辨識tcdA抗體之免疫反應。如表8所示，從每一區域(GT、CP及TM)之該多肽混合物發現可誘發區域特異性之抗肽抗體，其力價大於10,000。該等抗血清在西方墨點法分析可特異結合tcdA而非RBD。該結果顯示該等多肽在病患樣本中具有能力誘發辨識tcdA抗體之免疫反應，可用於有效診斷艱難梭狀芽孢桿菌感染及與該感染相關之疾病。

其他具體實施態樣

所有本說明書所揭露之特徵可以任何組合進行，而揭露的每個特徵可被用於相同，等效或類似目的的替代特徵所代替。因此除非另有說明，否則揭露的每個特徵僅是一般等效或類似特徵的一個實施例。

從上列所述，本領域具通常知識者可以輕易地確定本說明書所述之實施例的必要特徵，在不脫離其精神及範圍之下，可以變化及修改所述實施例以適應各種用途及條件。因此，其它實施例亦涵蓋在專利範圍之內。

<110> 財團法人國家衛生研究院

<120> 用於治療艱難梭狀芽孢桿菌相關疾病之組成物及方法

<130> 218088-0081U

<150> US 61/782,390

<151> 2013-03-14

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2733

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<100> 1

<210> 2

<211> 911

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

<210> 3

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 3

<210> 4

<211> 411

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

<210> 5

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 5

<210> 6

<211> 385

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 6

<210> 7

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 7

<210> 8

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

<210> 9

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

<210> 10

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 10

<210> 11

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 11

<210> 12

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 12

<210> 13

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 13

<210> 14

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 14

<210> 15

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 15

<210> 16

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 16

<210> 17

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 17

<210> 18

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 18

<210> 19

<211> 121

<212> PRT

<213> 腦膜炎雙球菌

<400> 19

<210> 20

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 20

<210> 21

<211> 2751

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2751)

<400> 21

<210> 22

<211> 917

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 22

<210> 23

<211> 2868

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2868)

<400> 23

<210> 24

<211> 956

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 24

<210> 25

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1251)

<400> 25

<210> 26

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 26

<210> 27

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1368)

<400> 27

<210> 28

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 28

<210> 29

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1173)

<400> 29

<210> 30

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 30

<210> 31

<211> 1290

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1290)

<400> 31

<210> 32

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 32

<210> 33

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1182)

<400> 33

<210> 34

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 34

<210> 35

<211> 1299

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1299)

<400> 35

<210> 36

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 36

Claims

一種單離的多肽，其包含選自由SEQ ID NO：2、4、6及8-18所組成之群的胺基酸序列。
如請求項1所述之單離的多肽，其進一步包含一位於N-端之脂質化序列。
如請求項2所述之單離的多肽，其中該脂質化序列包括SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
如請求項1所述之單離的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO：22、26、30或34的胺基酸序列。
如請求項2所述之單離的多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO：24、28、32或36之胺基酸序列。
一種嵌合分子，其包含：(a)一選自如請求項1所述之多肽的第一多肽；及(b)一鏈結至該第一多肽之第二多肽或多醣。
如請求項6所述之嵌合分子，其中該第二多肽係一種抗原。
一種免疫原性組成物，其包含如請求項1所述之單離的多肽。
如請求項8所述之免疫原性組成物，其進一步包含一醫藥上可接受之載體。
一種單離之核酸分子，其包含一編碼如請求項1所述之多肽的核酸序列。
如請求項10所述之核酸分子，其中該核酸序列係選自由SEQ ID NO：1、3、5、7、21、25、29、33、23、27、31及35所組成之群。
一種載體，其包含如請求項10所述之核酸分子。
一種宿主細胞，其包含如請求項10所述之核酸分子。
一種免疫原性組成物，其包含一抗原及一佐劑，其中該佐劑係如請求項1所述之單離的多肽。
如請求項14所述之免疫原性組成物，其中該多肽具有SEQ ID NO：2、4、6或8的胺基酸序列。
一種用於診斷艱難梭狀芽孢桿菌感染或與該感染相關之疾病的套組，其包含一或多種各別與選自由SEQ ID NOs：2、4、6及8-18組成之群的任一序列之多肽特異結合的抗體。
一種用於在個體中誘導免疫反應之方法，其包含將如請求項8所述之免疫原性組成物投藥予該個體。
一種用於治療艱難梭狀芽孢桿菌感染或與該感染相關之疾病的方法，其包含將如請求項8所述之免疫原性組成物投藥予該個體。