CN105705514A - 用于治疗艰难梭状芽孢杆菌相关疾病的组成物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明所描述的是一种单离的多肽，其含有一或多种艰难梭状芽孢杆菌(Cd)毒素A(tcdA)的受体结合区域，一种编码该多肽的核酸，及该多肽及核酸的使用方法。

Description

用于治疗艰难梭状芽孢杆菌相关疾病的组成物及方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年3月14日提交的、美国临时申请序列号为NO.61/782,390的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

背景技术

艰难梭状芽孢杆菌(Clostridiumdifficile，Cd)是在医院内进行机会性感染的新兴病原体，为造成人类抗生素相关疾病如伪膜性结肠炎及腹泻的主要原因。

艰难梭状芽孢杆菌的主要致病作用是透过两种大型蛋白毒素，毒素A(tcdA)及毒素B(tcdB)，会破坏肠上皮细胞。tcdA及tcdB，为具有多个功能域(domains)的大型蛋白毒素(250至308kDa)。于致病过程初期，艰难梭状芽孢杆菌(Cd)的受体结合域(RBD)首先与位于结肠上皮细胞表面的碳水化合物结合。tcdA和/或tcdB再经由受体介导的内胞饮作用进入细胞，并破坏维持细胞骨架所需的正常讯息传递途径，而最终导致发炎反应与腹泻。已知有各种寡糖(包括三糖类α-半乳糖-(1,3)-β-半乳糖-(1,4)-β-N-乙酰葡萄糖胺)可特异结合tcdA，但在人类中特异结合tcdA的配体尚未确定。

医院中接受抗生素治疗的患者，具有高度罹患艰难梭状芽孢杆菌感染的风险，尤其是儿童及65岁以上老人。艰难梭状芽孢杆菌相关疾病因而导致额外医疗费用支出并延长住院时间。因为致病毒株毒力的改变，使得艰难梭状芽孢杆菌相关疾病的发病率及死亡率显著地增加。

因此，迫切需要研发用于对抗艰难梭状芽孢杆菌感染及Cd相关疾病的预防与治疗的试剂。

发明内容

本发明是关于一种新颖多肽、融合多肽、编码所述多肽的核酸、含有所述多肽的免疫治疗组成物及使用所述多肽的方法。

本发明含有CdtcdA之一或多个功能域的多肽和/或脂多肽(lipo-ploypeptides)，可用于制备对抗由Cd感染所引起的疾病的疫苗，用于诊断是否遭到Cd感染，及用于制造免疫试剂。辨识结合此类多肽的单株或多株抗体，可用于诊断是否受到Cd感染，及用于免除或治疗与艰难梭状芽孢杆菌感染相关的疾病。

因此，本发明是关于一种含有一或多个CdtcdA的功能域，如tcdA-RBD的单离多肽。举例而言，所述的单离多肽可具有选自SEQIDNO:2、4、6及8-18任一者的氨基酸序列，或具有与前述序列具至少80％以上(例如，85％、90％、95％、98％或99％)同一性的序列。该多肽可进一步包含一脂质化序列。此类多肽可以脂质化形式表达。

本发明亦关于一种包含编码上述多肽序列的序列的单离核酸分子，及一种含有该核酸分子的载体。

本发明进一步是关于一种与上述多肽特异结合的抗体或其抗原性片段。一种用于诊断Cd感染或与该感染相关的疾病的套组，可包含一个或多种上述的抗体。

本发明亦关于一种包含所述tcdA-RBD或其片段的嵌合分子，其可连接到另一分子，例如多肽、多糖、核酸或小分子化合物。该连接的多肽可包括分离自致病细菌或病毒的抗原性表面蛋白质(antigenicsurfaceprotein)或多肽，如HIV膜蛋白、登革热病毒E蛋白、流感病毒血凝素蛋白、呼吸道细胞融合病毒F蛋白及副流感病毒HN蛋白。该连接的多糖可包括不同血清的寡糖分子，来自于细菌如肺炎球菌、脑膜炎球菌、流行性感冒嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌，或艰难梭状芽孢杆菌。

另一方面，本发明关于一种包含所述多肽、嵌合分子或核酸分子的免疫原性组成物。此类免疫原性组成物可用于预防或治疗Cd感染或与该感染相关的疾病，或可用于诱发免疫反应。

本发明亦关于一种含有一抗原及上述多肽作为佐剂的免疫原性组成物。

于以下的实施方式及伴随所附图式，将详加叙述一或多个具体实施例。其它特征、标的及优点从下列描述、图式及专利范围中将是显而易见的。

附图说明

图1为显示(A)tcdA的C-端重复性序列；及(B)合理设计RBD同一性序列(SEQIDNO：26)。假定的受体结合区以画底线的方式表示；

图2为在大肠杆菌系统表达rRBD或rlipo-RBD质体的示意图；

图3为SDS-PAGE(图3A及图3B)及西方墨点法分析结果，由镍亲和性管柱纯化大肠杆菌溶菌液中的重组tcdA-RBD(rRBD)；分子量标记为35kDa、48kDa、63kDa、75kDa、100kDa及135kDa；

图4为SDS-PAGE(图4A及图4B)及西方墨点法分析结果，由镍亲和性管柱纯化大肠杆菌溶菌液中的重组tcdA-RBD片段(rRBD-F1、-F2及-F3)。分子量标记为31kDa、42kDa、57kDa、72kDa、93kDa及125kDa；

图5为SDS-PAGE(图5A及图5B)及西方墨点法分析结果，由镍亲和性管柱纯化大肠杆菌溶菌液中的重组脂化tcdA-RBD(rlipo-RBD)；分子量标记为35kDa、48kDa、63kDa、75kDa、100kDa及135kDa；

图6为条型图显示酵素结合免疫分析的结果，不同剂量rRBD与rlipo-RBD作为疫苗注射于小鼠的血清，于不同时间点侦测IgG对于rRBD的效价；

图7为表示该rlipo-RBD在小鼠攻毒模式抵抗tcdA毒性，诱发剂量依赖性免疫性保护；

图8为rRBD及rlipo-RBD诱发剂量依赖型IgA全身性表现，并且rlipo-RBD比rRBD更为有效10倍；

图9显示rRBD及rlipo-RBD两者具有佐剂作用，于小鼠免疫性研究中提高辨识卵白蛋白(ovalbumin，OVA)，两者IgG(上图)和全身性IgA(下图)的效价；

图10为利用流式细胞仪分析，鉴定rRBD及其片段(F1、F2及F3)在活体外VERO细胞受体的结合活性；

图11显示tcdA-rRBD及其截短片段以环两色相性分光法进行结构性分析；

图12为测试tcdA及rRBD在兔子红血球细胞中血球凝集素的活性分析；

图13为测试rRBD其截短片段(rRBD-F1、-F2及-F3)在兔红血球细胞中血球凝集素的活性分析；

图14为西方墨点法显示不同RBD片段结合至宿主受体的亲和力；

图15显示天竺鼠血清对于不同合成多肽及其混合物，酵素结合免疫法分析的结果；图15A显示抗rRBD的抗肽血清IgG的效价；图15B显示抗个别多肽的抗肽血清IgG的效价。混合物包括P1、P2及P3；

图16为一系列西方墨点法分析天竺鼠抗血清中辨识合成多肽混合物的抗体；图16A及图16B为显示rRBD及其片段，分别抗小鼠抗rRBD血清及天竺鼠抗肽混合物；

图17显示天竺鼠抗肽血清在兔子红血球细胞抑制rRBD血球凝集素活性；

图18显示以个别RBD片段产生天竺鼠抗血清的血球凝集素抑制活性(hemagglutinininhibition，HAI)；

图19为共轭焦显微镜影像显示tcdA-RBD及其片段可在一分钟内快速地结合到宿主受体，然后10分钟内进入(internalize)细胞内与在细胞化去局部化(delocalize)，及之后30分钟内开始被降解；

图20显示从RBD片段免疫的小鼠中，产生生物性及免疫性功能的抗血清；

图21显示rRBD及其截短片段具有佐剂的活性；

图22是一组图显示在树突细胞活化研究中，rRBD及其片段增加表现T细胞反应器的生物标志物；

图23为显示rRBD及其片段在树突细胞中增加表现前发炎细胞激素。

具体实施方式

本发明是关于一种新颖多肽，其包含艰难梭状芽孢杆菌(Cd)毒素A(tcdA)的受体结合区(RBD)。出乎意料地，此类多肽(特别是当其以脂质化形式表达时)具有很强的免疫原性，且能够在动物模式中诱发可抵抗Cd攻毒的免疫力。

以下描述包含一或多种CdtcdA功能域的多肽，及编码该多肽的核酸。

一范例性多肽包含tcdA的C-端部分，其包括tcdA的受体结合域(RBD)，即tcdA-RBD或RBD。以下所列是编码tcdA-RBD的核酸序列(SEQIDNO：1)及tcdA-RBD的氨基酸序列(SEQIDNO：2)。RBD内的假定的受体结合区，以加网底标记方式显示于SEQIDNO：2。

tcdA-RBD核酸序列(SEQIDNO:1)

TTTAATAGCGAGAATGAACTGGATCGTGATCATCTGGGCTTCAAAATCATCGATAATAAAACCTATTATTATGATGAAGATAGCAAACTGGTGAAAGGCCTGATTAACATTAACAACAGCCTGTTTTACTTCGATCCGATTGAAAGCAATCTGGTTACCGGTTGGCAGACCATTAACGGCAAAAAATATTATTTTGATATTAATACCGGTGCAGCCAGCACCAGCTATAAAATTATCAACGGCAAGCATTTCTATTTCAATAATAATGGCGTGATGCAGCTGGGCGTTTTTAAAGGTCCGGATGGTTTTGAATATTTTGCACCGGCAAATACCCAGAACAATAATATTGAAGGTCAGGCCATTGTGTATCAGAGCAAATTTCTGACCCTGAACGGTAAAAAATACTACTTCGACAACGATAGCAAAGCAGTGACCGGTTGGCGCATTATTAACAACGAGAAATATTATTTCAATCCGAATAACGCCATTGCAGCAGTTGGTCTGCAGGTTATTGACAACAATAAATATTACTTTAACCCGGACACCGCCATTATTAGCAAAGGCTGGCAGACCGTTAATGGTAGCCGTTATTATTTCGATACCGATACCGCGATTGCCTTTAATGGCTATAAAACCATCGACGGCAAACACTTCTATTTTGATAGCGATTGCGTGGTGAAAATTGGTGTTTTTAGCGGTAGCAACGGCTTTGAATACTTTGCCCCTGCCAATACCTACAACAACAACATCGAAGGCCAGGCAATCGTTTATCAGTCAAAATTCCTGACGCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGACAATAACAGCAAAGCCGTTACGGGATGGCAGACAATTGATAGCAAAAAATACTACTTCAATACCAATACCGCAGAAGCAGCAACAGGTTGGCAGACGATCGATGGTAAAAAATATTATTTCAACACGAACACAGCCGAAGCAGCCACCGGCTGGCAAACCATTGATGGAAAAAAATATTACTTCAATACAAATACGAGCATTGCCAGCACCGGTTATACCATTATCAACGGCAAATATTTCTACTTCAACACCGATGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTCAAAGTGCCGAATGGCTTTGAGTATTTCGCTCCGGCTAACACCCATAATAACAATATTGAGGGCCAGGCGATCCTGTATCAGAATAAATTCCTGACACTGAACGGCAAAAAATACTATTTCGGCAGCGATTCAAAAGCAATTACAGGTTGGCAAACAATTGACGGGAAAAAGTACTATTTTAATCCGAACAATGCGATCGCAGCAACCCATCTGTGTACCATTAATAACGATAAATACTACTTTAGCTATGACGGCATCCTGCAGAATGGCTATATCACCATTGAACGCAACAACTTTTACTTTGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGTGACCGGTGTTTTTAAAGGCCCTAATGGCTTCGAATACTTCGCACCAGCGAATACGCATAACAATAACATCGAGGGTCAAGCGATTGTCTACCAGAATAAATTTCTGACTCTGAATGGTAAAAAATATTACTTCGATAATGATTCAAAAGCCGTGACCGGATGGCAAACTATCGATTCAAAAAAATACTACTTTAACCTGAACACCGCAGTTGCAGTTACAGGGTGGCAAACCATCGACGGTGAGAAATACTACTTCAATCTGAATACAGCCGAAGCCGCTACTGGATGGCAGACGATTGACGGAAAACGCTATTATTTTAATACCAACACCTATATTGCGAGCACAGGCTATACCATCATTAATGGTAAACACTTCTACTTTAACACGGACGGTATCATGCAAATCGGCGTGTTTAAAGGCCCAGACGGTTTCGAGTACTTTGCGCCAGCAAACACCCACAATAATAACATCGAAGGACAAGCCATCCTGTATCAAAACAAATTTCTGACGCTGAATGGCAAAAAATACTACTTCGGTAGTGATAGCAAAGCTGTTACAGGTCTGCGTACCATCGACGGAAAAAAATATTACTTTAATACTAACACGGCAGTGGCAGTGACGGGCTGGCAAACGATCAACGGGAAAAAATACTACTTCAACACCAACACGTATATTGCCTCAACCGGCTATACAATTATCAGCGGTAAACACTTTTATTTCAATACAGATGGGATCATGCAGATCGGAGTTTTCAAAGGACCTGATGGATTCGAGTATTTTGCTCCTGCGAATACCGATGCCAATAACATTGAGGGACAGGCAATTCGCTATCAGAATCGTTTTCTGTATCTGCACGATAATATTTATTATTTTGGCAATGATTCCAAAGCGGCAACCGGTTGGGCCACCATTGATGGTAATCGTTATTATTTTGAGCCGAATACCGCAATGGGTGCCAATGGTTATAAAACGATTGATAACAAAAACTTTTATTTTCGCAACGGCCTGCCGCAGATTGGCGTATTCAAAGGTCCTAACGGTTTTGAGTACTTCGCTCCAGCCAATACAGATGCAAATAATATCGACGGCCAGGCCATCCGCTACCAGAACCGCTTCCTGCATCTGCTGGGTAAAATCTATTATTTCGGCAACAACAGCAAAGCGGTAACTGGTTGGCAAACCATCAATAGCAAAGTGTATTATTTCATGCCGGATACAGCAATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGTGTGATCTATTTCTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCACCGGGTATTTATGGC

tcdA-RBD氨基酸序列(SEQIDNO:2)

FNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIESNLVTGWQTINGKKYYFDINTGAASTSYKIINGKHFYFNNNGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPDTAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCVVKIGVFSGSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWQTIDSKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAITGWQTIDGKKYYFNPNNAIAATHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNDSKAATGWATIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGPNGFEYFAPVTGWQTINSKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYG

本发明亦关于tcdA-RBD其三种片段，如F1、F2及F3。该片段的氨基酸序列及其编码该片段的核酸序列列示如下。假定的受体结合区以加网底方式标记。

F1核酸序列(SEQIDNO:3)

TTTAATAGCGAGAATGAACTGGATCGTGATCATCTGGGCTTCAAAATCATCGATAATAAAACCTATTATTATGATGAAGATAGCAAACTGGTGAAAGGCCTGATTAACATTAACAACAGCCTGTTTTACTTCGATCCGATTGAAAGCAATCTGGTTACCGGTTGGCAGACCATTAACGGCAAAAAATATTATTTTGATATTAATACCGGTGCAGCCAGCACCAGCTATAAAATTATCAACGGCAAGCATTTCTATTTCAATAATAATGGCGTGATGCAGCTGGGCGTTTTTAAAGGTCCGGATGGTTTTGAATATTTTGCACCGGCAAATACCCAGAACAATAATATTGAAGGTCAGGCCATTGTGTATCAGAGCAAATTTCTGACCCTGAACGGTAAAAAATACTACTTCGACAACGATAGCAAAGCAGTGACCGGTTGGCGCATTATTAACAACGAGAAATATTATTTCAATCCGAATAACGCCATTGCAGCAGTTGGTCTGCAGGTTATTGACAACAATAAATATTACTTTAACCCGGACACCGCCATTATTAGCAAAGGCTGGCAGACCGTTAATGGTAGCCGTTATTATTTCGATACCGATACCGCGATTGCCTTTAATGGCTATAAAACCATCGACGGCAAACACTTCTATTTTGATAGCGATTGCGTGGTGAAAATTGGTGTTTTTAGCGGTAGCAACGGCTTTGAATACTTTGCCCCTGCCAATACCTACAACAACAACATCGAAGGCCAGGCAATCGTTTATCAGTCAAAATTCCTGACGCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGACAATAACAGCAAAGCCGTTACGGGATGGCAGACAATTGATAGCAAAAAATACTACTTCAATACCAATACCGCAGAAGCAGCAACAGGTTGGCAGACGATCGATGGTAAAAAATATTATTTCAACACGAACACAGCCGAAGCAGCCACCGGCTGGCAAACCATTGATGGAAAAAAATATTACTTCAATACAAATACGAGCATTGCCAGCACCGGTTATACCATTATCAACGGCAAATATTTCTACTTCAACACCGATGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTCAAAGTGCCGAATGGCTTTGAGTATTTCGCTCCGGCTAACACCCATAATAACAATATTGAGGGCCAGGCGATCCTGTATCAGAATAAATTCCTGACACTGAACGGCAAAAAATACTATTTCGGCAGCGATTCAAAAGCA

F1氨基酸序列(SEQIDNO:4)

FNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIESNLVTGWQTINGKKYYFDINTGAASTSYKIINGKHFYFNNNGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPDTAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCVVKIGVFSGSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWQTIDSKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKA

F2核酸序列(SEQIDNO:5)

GCCGAAGCAGCCACCGGCTGGCAAACCATTGATGGAAAAAAATATTACTTCAATACAAATACGAGCATTGCCAGCACCGGTTATACCATTATCAACGGCAAATATTTCTACTTCAACACCGATGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTCAAAGTGCCGAATGGCTTTGAGTATTTCGCTCCGGCTAACACCCATAATAACAATATTGAGGGCCAGGCGATCCTGTATCAGAATAAATTCCTGACACTGAACGGCAAAAAATACTATTTCGGCAGCGATTCAAAAGCAATTACAGGTTGGCAAACAATTGACGGGAAAAAGTACTATTTTAATCCGAACAATGCGATCGCAGCAACCCATCTGTGTACCATTAATAACGATAAATACTACTTTAGCTATGACGGCATCCTGCAGAATGGCTATATCACCATTGAACGCAACAACTTTTACTTTGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGTGACCGGTGTTTTTAAAGGCCCTAATGGCTTCGAATACTTCGCACCAGCGAATACGCATAACAATAACATCGAGGGTCAAGCGATTGTCTACCAGAATAAATTTCTGACTCTGAATGGTAAAAAATATTACTTCGATAATGATTCAAAAGCCGTGACCGGATGGCAAACTATCGATTCAAAAAAATACTACTTTAACCTGAACACCGCAGTTGCAGTTACAGGGTGGCAAACCATCGACGGTGAGAAATACTACTTCAATCTGAATACAGCCGAAGCCGCTACTGGATGGCAGACGATTGACGGAAAACGCTATTATTTTAATACCAACACCTATATTGCGAGCACAGGCTATACCATCATTAATGGTAAACACTTCTACTTTAACACGGACGGTATCATGCAAATCGGCGTGTTTAAAGGCCCAGACGGTTTCGAGTACTTTGCGCCAGCAAACACCCACAATAATAACATCGAAGGACAAGCCATCCTGTATCAAAACAAATTTCTGACGCTGAATGGCAAAAAATACTACTTCGGTAGTGATAGCAAAGCTGTTACAGGTCTGCGTACCATCGACGGAAAAAAATATTACTTTAATACTAACACGGCAGTGGCAGTGACGGGCTGGCAAACGATCAACGGGAAAAAATACTACTTCAACACCAACACGTATATTGCC

F2氨基酸序列(SEQIDNO:6)

AEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAITGWQTIDGKKYYFNPNNAIAATHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIA

F3核酸序列(SEQIDNO:7)

AAAGCCGTGACCGGATGGCAAACTATCGATTCAAAAAAATACTACTTTAACCTGAACACCGCAGTTGCAGTTACAGGGTGGCAAACCATCGACGGTGAGAAATACTACTTCAATCTGAATACAGCCGAAGCCGCTACTGGATGGCAGACGATTGACGGAAAACGCTATTATTTTAATACCAACACCTATATTGCGAGCACAGGCTATACCATCATTAATGGTAAACACTTCTACTTTAACACGGACGGTATCATGCAAATCGGCGTGTTTAAAGGCCCAGACGGTTTCGAGTACTTTGCGCCAGCAAACACCCACAATAATAACATCGAAGGACAAGCCATCCTGTATCAAAACAAATTTCTGACGCTGAATGGCAAAAAATACTACTTCGGTAGTGATAGCAAAGCTGTTACAGGTCTGCGTACCATCGACGGAAAAAAATATTACTTTAATACTAACACGGCAGTGGCAGTGACGGGCTGGCAAACGATCAACGGGAAAAAATACTACTTCAACACCAACACGTATATTGCCTCAACCGGCTATACAATTATCAGCGGTAAACACTTTTATTTCAATACAGATGGGATCATGCAGATCGGAGTTTTCAAAGGACCTGATGGATTCGAGTATTTTGCTCCTGCGAATACCGATGCCAATAACATTGAGGGACAGGCAATTCGCTATCAGAATCGTTTTCTGTATCTGCACGATAATATTTATTATTTTGGCAATGATTCCAAAGCGGCAACCGGTTGGGCCACCATTGATGGTAATCGTTATTATTTTGAGCCGAATACCGCAATGGGTGCCAATGGTTATAAAACGATTGATAACAAAAACTTTTATTTTCGCAACGGCCTGCCGCAGATTGGCGTATTCAAAGGTCCTAACGGTTTTGAGTACTTCGCTCCAGCCAATACAGATGCAAATAATATCGACGGCCAGGCCATCCGCTACCAGAACCGCTTCCTGCATCTGCTGGGTAAAATCTATTATTTCGGCAACAACAGCAAAGCGGTAACTGGTTGGCAAACCATCAATAGCAAAGTGTATTATTTCATGCCGGATACAGCAATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGTGTGATCTATTTCTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCACCGGGTATTTATGGC

F3氨基酸序列(SEQIDNO:8)

KAVTGWQTIATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNDSKAATGWATIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGPNGFEYFAP VTGWQTINSKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYG

表1

此外，亦描述含有tcdA的潜在功能域的多肽，此类多肽的氨基酸序列系列示于表1中。

可于大肠杆菌表达系统制造含有上述其中一种多肽及一位于N-端的脂质化(lipidating)序列的融合蛋白。术语“脂质化序列”或“脂质前导序列”是指一氨基酸序列，其(a)包括一第一片段至少80％(85％、90％、95％或99％)与Ag473的SP具同一性及一第二片段至少有80％(85％、90％、95％或99％)与Ag473的域1具同一性，该第一片段位于N-端的脂质化序列，及(b)有利于大肠杆菌中，使其N-端具有该脂质化序列的多肽形成脂化。该脂质化序列中，该第一片段可直接连接或经由一多肽连接到该第二片段。通常该序列最大长度具有40-100(如40-80)个氨基酸。

Ag473系脑膜炎双球菌的脂蛋白其具有四个功能域，SP及域一至三。以下为其氨基酸序列(SEQIDNO：19)及鉴别的四个功能域：MetLysLysLeuLeuIleAlaAlaMetMetAlaAlaAlaLeuAlaAlaCys AlaValThrGluAlaLysGluAlaValThrGluAlaLysGluAlaValThrGluAlaLysGluAlaValThrGluAlaAlaLysAspThrLeuAsnLysAlaAlaAspAlaThrGlnGluAlaAlaAspLysMetLysAspAlaAlaLys(SEQIDNO:19)

SP:氨基酸残基1-17(画底线)

域1:氨基酸残基18-40(加网底标记)

域2:氨基酸残基41-71(粗体)

域3:氨基酸残基72-121(斜体)

举例而言，在此所描述该脂质化序列包含SEQIDNO：19残基1-40，即KKLLIAAMMAAALAACSQEAKQEVKEAVQAVESDVKDTA(SEQIDNO：20；Ag473的功能域一)。

上述该脂质化序列可以通过惯用重组技术被连接到目标多肽以形成一融合蛋白，在大肠杆菌中表达时为脂化形式。实施例如下，编码该脂质化序列的DNA片段及一编码该标的多肽的DNA片段被插入到一表达载体中，较佳地可携带强启动子(例如T7、T5、T3或SP6)以构建表达质体。该强启动子系可被诱导，例如由异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。然后该表达质体导入到一大肠杆菌宿主菌株，其阳性转形株在合适条件下培养以表达蛋白质。较佳地该大肠杆菌宿主菌株对于过度表达外源蛋白所诱导的毒性作用具有抗性。该大肠杆菌菌株可以美国专利编号6361966所描述的方法鉴别/生成。该大肠杆菌菌株的实施例包括但不限于C43(DE3)(ECCCB96070445)、C41(DE3)(ECCCB96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB40885)及C2014(DE3)(NCIMB40884)。

该表达的融合蛋白因此可从大肠杆菌宿主细胞中单离及经由本领域习知方法证实其脂化状态，例如以抗脂蛋白抗体进行免疫墨点法或质谱分析。

本发明亦关于一种包含一序列编码该上述多肽或融合蛋白或者其互补序列的单离核酸分子。该核酸分子的实施例包括SEQIDNO：1及其退化变异株，其退化变异株中一个或多个密码子可由编码相同残基的其它密码子所替代。

该核酸分子可以用于表达本说明书所述的多肽或融合蛋白，或作为一DNA疫苗。操作上可将该核酸分子连接至合适的调节序列以产生一表达载体。

载体实施例包含一质体、黏质体或病毒载体。该载体包括一在适宜的形式在宿主细胞中表达的核酸。该载体较佳的是包括连接到该表达的核酸序列的一个或多个调控序列。一调控序列包括启动子、增强子及其他等表达控制组件(例如T7启动子、花椰菜镶嵌病毒35S启动子或聚腺苷酸化信号)。该调控序列包括其引导核苷酸序列的持续性表达，如组织特异性调节和/或诱导型序列。该表达载体的设计可取决于此类因素作为选择该转形的宿主细胞，所需蛋白质的表达水平等等。该表达载体可以被导入该宿主细胞以产生本发明的多肽或融合蛋白。该宿主细胞为，例如，大肠杆菌、百日咳杆菌、芽孢杆菌、非洲绿猴肾脏细胞、嗜血杆菌、真菌、酵母或中国仓鼠卵巢细胞。亦可使用杆状病毒表达系统产生蛋白。

一种宿主细胞包含该上述核酸是可被生产的。实施例包括大肠杆菌、昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达载体)、植物细胞、酵母菌细胞及哺乳动物细胞。参照例如Goeddel,(1990)GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA。

本发明关于一种多肽、融合蛋白或核酸分子可用于制备一免疫原性组成物(例如疫苗)，用以其易感染该致病菌或已被感染该致病菌的个体(例如人)，产生抗体及/或免疫反应抵抗艰难梭状芽孢杆菌。该组成物可以经由例如以下所述的方式，或通过本领域任何已知其它方法制备。

例如，该组成物可包含一该多肽、融合蛋白或核酸分子的有效剂量及医药上可接受的载体如一磷酸盐缓冲液，一碳酸氢盐溶液。该组成物还可包含一佐剂。该载剂在某种意义上必须为“可接受的”，是指载剂与组成物活性成分相容，且不有害于待治疗的患者。基于投药方式途径及标准医药实务程序的基础上选择载剂。适合的药物载剂与稀释剂及用于医药用品，已描述于雷明登制药科学(Remington'sPharmaceuticalSciences)。该组成物，如果需要，亦可包含一佐剂，如霍乱毒素、大肠杆菌不耐热型肠毒素(LT)、脂质体、免疫刺激性复合物(ISCOM)或免疫刺激性序列寡脱氧核苷酸(ISS-ODN)。该组成物还可包括促进体内递送的聚合物，参见AudranR.etal.Vaccine21:1250-5,2003；及Denis-Mizeetal.CellImmunol.,225:12-20,2003。

本发明该多肽或融合多肽包含另一抗原，或连接到其他蛋白质(例如抗原)或多糖以一产生嵌合分子亦可作为一免疫原性组成物的佐剂。例如，其它抗原可为抗原性蛋白质或其来自病原体如人乳头瘤病毒(HPV)、C型肝炎病毒(HCV)、非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)、单纯疱疹病毒第1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒第2型(HSV-2)、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道融合病毒(RSV)、副流感病毒第3型(PIV3)、流感病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、诺罗病毒及SARS冠状病毒的片段。

该免疫原性组成物可配制成一微粒制剂，胶囊剂或脂质体制剂。此外，此类免疫原性组成物可包含或连同一靶向分子以共同投药方式，用于递送至免疫系统或黏膜表面的特定细胞。

此外，本发明所述的该多肽及融合多肽包含位于该RBD内一种或多种受体结合区可被用作药物载剂。举例而言，一药物分子(例如，一多肽及一小分子化合物)可以连接到该多肽。

本发明亦关于一种用于诊断Cd感染及与该感染相关疾病的套组。该套组包含一或多种抗体可特异辨识tcdA。例如，该套组抗体可特异结合至一多肽，其组成之一序列选自由SEQIDNO：2、4、6及8-18所组成的群。该抗体可以使用本领域习知方法产生。该套组可用于检测疑似感染Cd的个体身上所获得的样品(如血液样品)中tcdA的存在。

上述任何该药物组成物可经由肠胃外用药，例如皮下注射或肌内注射。相对地，亦可用于其他投药模式包括栓塞剂及口服制剂。对于栓塞剂、黏合剂及载剂可包括，例如聚烯烃二醇或三酸甘油酯。口服制剂可包括初期常使用如药物级的糖精、纤维素及碳酸镁等。该组成物采取溶液、悬浮液、锭剂、丸剂、胶囊，缓释制剂或粉末的形式。

“个体”是指人类及非人类的动物。非人类动物的实施例包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，如非人类的灵长类动物(特别是高级灵长类动物)、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、天竺鼠、猫及非哺乳动物如鸟类及两栖类等。较佳地，个体为人。另一具体实施态样中，个体为实验动物或适合作为一疾病模式的动物。

在此所使用的术语“治疗”是指应用或投与一组成物包含一或多种活性剂至一个体，其个体患有疾病，出现该疾病的症状，或对该疾病易感性，其目的是治疗、封口、缓解、减轻、改变、补救、改善，改良或影响疾病，疾病症状，或对该疾病的易感性。本发明在此所使用“有效剂量”是指对该个体具治疗效果所需该活性剂的剂量，单独或与一或多种其他活性剂组合。有效剂量可由该领域习知技艺人士判断并决定剂量多寡，取决于给药途径、赋形剂的使用及与其他活性剂共同使用。

术语“免疫反应”或“免疫原性反应”是指免疫系统反应于在一个体对于抗原的任何反应。脊椎动物的免疫反应实施例包括，但不限于，抗体产生，诱发细胞介导免疫力及补体活化。

“抗原”是指一分子含有一个或多个抗原决定基，其可刺激宿主免疫系统产生抗原特异性的免疫反应。术语“抗原”可与“免疫原”互换使用。在此所用术语“抗原决定基”系指抗原上的可与特异性抗体分子或T细胞受体结合的部位。本发明的该术语可与“抗原决定因子”或“抗原决定部位”互换使用。

“抗体”是指一免疫球蛋白分子或一免疫球蛋白分子含至少一种免疫活性部分，其具有特定胺基酸序列并仅结合到抗原或密切相关的抗原群组。抗体实施例包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。免疫球蛋白分子免疫活性部分的实施例包括Fab及F(ab)'.sub.2片段，其可以通过用酶例如胃蛋白酶处理抗体来产生。一抗体可以为单株抗体或多株抗体。

“佐剂”是指加入到免疫原性组成物之一物质，例如疫苗，虽然本身可具有或不具有任何特异抗原性效力，但可以刺激免疫系统并提高对该免疫原性组成物的免疫反应。佐剂的实施例包括，但不限于，明矾沉淀、弗朗氏完全佐剂(Freund’scompleteadjuvant)、弗朗式不完全佐剂(Freund’sincompleteadjuvant)、单磷氧基-脂质A/海藻糖dicorynomycolate佐剂、含有短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)及tRNA的乳化油，及其他藉由模拟演化上保留性分子增加免疫反应的物质包括脂质体、脂多醣(LPS)、抗原的分子笼、细菌细胞壁，及经由内胞饮作用进入的核酸，如双链RNA、单链DNA及含有未甲基化CpG双核苷酸的DNA。其他实施例包括霍乱毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素、脂质体、免疫刺激复合物(immune-stimulatingcomplex，ISCOM)、免疫刺激性寡脱氧核苷酸序列及氢氧化铝。

下述的实施例对于揭露内容其余部分仅为说明性的，而非用以限制本发明。无需进一步详尽说明，该技术领域具有通常知识者可基于本发明的描述，完全充分利用本发明。于本说明书引用的所有公开文件皆以其全文引用的方式纳入本说明书作为参考文献。

材料与方法

(1)同一性序列分析

我们合理设计一段序列含有艰难梭状芽孢杆菌酸毒素A的C-端结合域，经由NCBI数据库以序列比对工具，如VectorNTIAdvance11.5比对细菌株VPI10463的序列，其序列具有高度保留性及重复性，该序列列示于图1，以在线分析软件侦测并比对其重复性蛋白质序列(参见网址ebi.ac.uk/Tools/pfa)。

(2)选殖及质体构筑

将TcdARBD的核苷酸序列经大肠杆菌表达密码子优化，并利用化学方式合成以便进行基因选殖，序列如SEQIDNO：1所示。为了选殖三个TcdARBD片段(RBD-F1、RBD-F2及RBD-F3)，遂以PCR扩增该三片段的编码区域，其所用引子如下：F1顺向引子＝TAACATATGGGATCCTTTAATAGCGAGAATGAA(SEQIDNO:37)，F1反向引子＝ATTCTCGAGTGCTTTTGAATCGCTGCC(SEQIDNO:38)，F2顺向引子＝TAACATATGGGATCCGCCGAAGCAGCCACCGGC(SEQIDNO:39)，F2反向引子＝ATTCTCGAGGGCAATATACGTGTTGGT(SEQIDNO:40)，F3顺向引子＝TAACATATGGGATCCAAAGCCGTGACCGGATGG(SEQIDNO:41)，F3反向引子＝ATTCTCGAGGCCATAAATACCCGGTGC(SEQIDNO:42)。以NdeI及XhoI两限制酶切位，将RBD-F1、RBD-F2、RBD-F3及RBD插入pET-22b载体(Novagen)中，并分别转形至大肠杆菌BL21(+)RIL(Novagen)及JM109(DE3)(Agilenttechnologies)。将RBD的5’-端融合一脂质讯号序列，而获得另一构筑体，rlipo-RBD。将该质体转形至大肠杆菌菌株C43(DE3)(Lucigen)。

该构筑及选殖的序列更详述如下(画底线部分-限制酶切位；正规字型-RBD、F1、F2或F3序列；粗体字型-脂质前导序列(lipidleadersequence，LLS)。

将片段BamHI-RBD-XhoI插入选殖载体pET-22b，得到一质体(pET22b_rRBD)，见图2。

NdeI-BamHI-RBD-XhoI(SEQIDNO：21)

CATATGGGATCCTTTAATAGCGAGAATGAACTGGATCGTGATCATCTGGGCTTCAAAATCATCGATAATAAAACCTATTATTATGATGAAGATAGCAAACTGGTGAAAGGCCTGATTAACATTAACAACAGCCTGTTTTACTTCGATCCGATTGAAAGCAATCTGGTTACCGGTTGGCAGACCATTAACGGCAAAAAATATTATTTTGATATTAATACCGGTGCAGCCAGCACCAGCTATAAAATTATCAACGGCAAGCATTTCTATTTCAATAATAATGGCGTGATGCAGCTGGGCGTTTTTAAAGGTCCGGATGGTTTTGAATATTTTGCACCGGCAAATACCCAGAACAATAATATTGAAGGTCAGGCCATTGTGTATCAGAGCAAATTTCTGACCCTGAACGGTAAAAAATACTACTTCGACAACGATAGCAAAGCAGTGACCGGTTGGCGCATTATTAACAACGAGAAATATTATTTCAATCCGAATAACGCCATTGCAGCAGTTGGTCTGCAGGTTATTGACAACAATAAATATTACTTTAACCCGGACACCGCCATTATTAGCAAAGGCTGGCAGACCGTTAATGGTAGCCGTTATTATTTCGATACCGATACCGCGATTGCCTTTAATGGCTATAAAACCATCGACGGCAAACACTTCTATTTTGATAGCGATTGCGTGGTGAAAATTGGTGTTTTTAGCGGTAGCAACGGCTTTGAATACTTTGCCCCTGCCAATACCTACAACAACAACATCGAAGGCCAGGCAATCGTTTATCAGTCAAAATTCCTGACGCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGACAATAACAGCAAAGCCGTTACGGGATGGCAGACAATTGATAGCAAAAAATACTACTTCAATACCAATACCGCAGAAGCAGCAACAGGTTGGCAGACGATCGATGGTAAAAAATATTATTTCAACACGAACACAGCCGAAGCAGCCACCGGCTGGCAAACCATTGATGGAAAAAAATATTACTTCAATACAAATACGAGCATTGCCAGCACCGGTTATACCATTATCAACGGCAAATATTTCTACTTCAACACCGATGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTCAAAGTGCCGAATGGCTTTGAGTATTTCGCTCCGGCTAACACCCATAATAACAATATTGAGGGCCAGGCGATCCTGTATCAGAATAAATTCCTGACACTGAACGGCAAAAAATACTATTTCGGCAGCGATTCAAAAGCAATTACAGGTTGGCAAACAATTGACGGGAAAAAGTACTATTTTAATCCGAACAATGCGATCGCAGCAACCCATCTGTGTACCATTAATAACGATAAATACTACTTTAGCTATGACGGCATCCTGCAGAATGGCTATATCACCATTGAACGCAACAACTTTTACTTTGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGTGACCGGTGTTTTTAAAGGCCCTAATGGCTTCGAATACTTCGCACCAGCGAATACGCATAACAATAACATCGAGGGTCAAGCGATTGTCTACCAGAATAAATTTCTGACTCTGAATGGTAAAAAATATTACTTCGATAATGATTCAAAAGCCGTGACCGGATGGCAAACTATCGATTCAAAAAAATACTACTTTAACCTGAACACCGCAGTTGCAGTTACAGGGTGGCAAACCATCGACGGTGAGAAATACTACTTCAATCTGAATACAGCCGAAGCCGCTACTGGATGGCAGACGATTGACGGAAAACGCTATTATTTTAATACCAACACCTATATTGCGAGCACAGGCTATACCATCATTAATGGTAAACACTTCTACTTTAACACGGACGGTATCATGCAAATCGGCGTGTTTAAAGGCCCAGACGGTTTCGAGTACTTTGCGCCAGCAAACACCCACAATAATAACATCGAAGGACAAGCCATCCTGTATCAAAACAAATTTCTGACGCTGAATGGCAAAAAATACTACTTCGGTAGTGATAGCAAAGCTGTTACAGGTCTGCGTACCATCGACGGAAAAAAATATTACTTTAATACTAACACGGCAGTGGCAGTGACGGGCTGGCAAACGATCAACGGGAAAAAATACTACTTCAACACCAACACGTATATTGCCTCAACCGGCTATACAATTATCAGCGGTAAACACTTTTATTTCAATACAGATGGGATCATGCAGATCGGAGTTTTCAAAGGACCTGATGGATTCGAGTATTTTGCTCCTGCGAATACCGATGCCAATAACATTGAGGGACAGGCAATTCGCTATCAGAATCGTTTTCTGTATCTGCACGATAATATTTATTATTTTGGCAATGATTCCAAAGCGGCAACCGGTTGGGCCACCATTGATGGTAATCGTTATTATTTTGAGCCGAATACCGCAATGGGTGCCAATGGTTATAAAACGATTGATAACAAAAACTTTTATTTTCGCAACGGCCTGCCGCAGATTGGCGTATTCAAAGGTCCTAACGGTTTTGAGTACTTCGCTCCAGCCAATACAGATGCAAATAATATCGACGGCCAGGCCATCCGCTACCAGAACCGCTTCCTGCATCTGCTGGGTAAAATCTATTATTTCGGCAACAACAGCAAAGCGGTAACTGGTTGGCAAACCATCAATAGCAAAGTGTATTATTTCATGCCGGATACAGCAATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGTGTGATCTATTTCTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCACCGGGTATTTATGGCCTCGAG

由SEQIDNO：21编码的氨基酸序列(SEQIDNO：22)

HMGSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIESNLVTGWQTINGKKYYFDINTGAASTSYKIINGKHFYFNNNGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPDTAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCVVKIGVFSGSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWQTIDSKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINGKYFYFNTDGIMQIGVFKVPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAITGWQTIDGKKYYFNPNNAIAATHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDSKKYYFNLNTAVAVTGWQTIDGEKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNDSKAATGWATIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIDGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINSKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGLE

将片段NdeI-LLS-BamHI-RBD-XhoI插入选殖载体pET-22b可得到一质体(pET22b_rlipo-RBD)，见图2。

NdeI-LLS-BamHI-RBD-XhoI(SEQIDNO：23)

CATATG GGATCCTTTAATAGCGAGAATGAACTGGATCGTGATCATCTGGGCTTCAAAATCATCGATAATAAAACCTATTATTATGATGAAGATAGCAAACTGGTGAAAGGCCTGATTAACATTAACAACAGCCTGTTTTACTTCGATCCGATTGAAAGCAATCTGGTTACCGGTTGGCAGACCATTAACGGCAAAAAATATTATTTTGATATTAATACCGGTGCAGCCAGCACCAGCTATAAAATTATCAACGGCAAGCATTTCTATTTCAATAATAATGGCGTGATGCAGCTGGGCGTTTTTAAAGGTCCGGATGGTTTTGAATATTTTGCACCGGCAAATACCCAGAACAATAATATTGAAGGTCAGGCCATTGTGTATCAGAGCAAATTTCTGACCCTGAACGGTAAAAAATACTACTTCGACAACGATAGCAAAGCAGTGACCGGTTGGCGCATTATTAACAACGAGAAATATTATTTCAATCCGAATAACGCCATTGCAGCAGTTGGTCTGCAGGTTATTGACAACAATAAATATTACTTTAACCCGGACACCGCCATTATTAGCAAAGGCTGGCAGACCGTTAATGGTAGCCGTTATTATTTCGATACCGATACCGCGATTGCCTTTAATGGCTATAAAACCATCGACGGCAAACACTTCTATTTTGATAGCGATTGCGTGGTGAAAATTGGTGTTTTTAGCGGTAGCAACGGCTTTGAATACTTTGCCCCTGCCAATACCTACAACAACAACATCGAAGGCCAGGCAATCGTTTATCAGTCAAAATTCCTGACGCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGACAATAACAGCAAAGCCGTTACGGGATGGCAGACAATTGATAGCAAAAAATACTACTTCAATACCAATACCGCAGAAGCAGCAACAGGTTGGCAGACGATCGATGGTAAAAAATATTATTTCAACACGAACACAGCCGAAGCAGCCACCGGCTGGCAAACCATTGATGGAAAAAAATATTACTTCAATACAAATACGAGCATTGCCAGCACCGGTTATACCATTATCAACGGCAAATATTTCTACTTCAACACCGATGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTCAAAGTGCCGAATGGCTTTGAGTATTTCGCTCCGGCTAACACCCATAATAACAATATTGAGGGCCAGGCGATCCTGTATCAGAATAAATTCCTGACACTGAACGGCAAAAAATACTATTTCGGCAGCGATTCAAAAGCAATTACAGGTTGGCAAACAATTGACGGGAAAAAGTACTATTTTAATCCGAACAATGCGATCGCAGCAACCCATCTGTGTACCATTAATAACGATAAATACTACTTTAGCTATGACGGCATCCTGCAGAATGGCTATATCACCATTGAACGCAACAACTTTTACTTTGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGTGACCGGTGTTTTTAAAGGCCCTAATGGCTTCGAATACTTCGCACCAGCGAATACGCATAACAATAACATCGAGGGTCAAGCGATTGTCTACCAGAATAAATTTCTGACTCTGAATGGTAAAAAATATTACTTCGATAATGATTCAAAAGCCGTGACCGGATGGCAAACTATCGATTCAAAAAAATACTACTTTAACCTGAACACCGCAGTTGCAGTTACAGGGTGGCAAACCATCGACGGTGAGAAATACTACTTCAATCTGAATACAGCCGAAGCCGCTACTGGATGGCAGACGATTGACGGAAAACGCTATTATTTTAATACCAACACCTATATTGCGAGCACAGGCTATACCATCATTAATGGTAAACACTTCTACTTTAACACGGACGGTATCATGCAAATCGGCGTGTTTAAAGGCCCAGACGGTTTCGAGTACTTTGCGCCAGCAAACACCCACAATAATAACATCGAAGGACAAGCCATCCTGTATCAAAACAAATTTCTGACGCTGAATGGCAAAAAATACTACTTCGGTAGTGATAGCAAAGCTGTTACAGGTCTGCGTACCATCGACGGAAAAAAATATTACTTTAATACTAACACGGCAGTGGCAGTGACGGGCTGGCAAACGATCAACGGGAAAAAATACTACTTCAACACCAACACGTATATTGCCTCAACCGGCTATACAATTATCAGCGGTAAACACTTTTATTTCAATACAGATGGGATCATGCAGATCGGAGTTTTCAAAGGACCTGATGGATTCGAGTATTTTGCTCCTGCGAATACCGATGCCAATAACATTGAGGGACAGGCAATTCGCTATCAGAATCGTTTTCTGTATCTGCACGATAATATTTATTATTTTGGCAATGATTCCAAAGCGGCAACCGGTTGGGCCACCATTGATGGTAATCGTTATTATTTTGAGCCGAATACCGCAATGGGTGCCAATGGTTATAAAACGATTGATAACAAAAACTTTTATTTTCGCAACGGCCTGCCGCAGATTGGCGTATTCAAAGGTCCTAACGGTTTTGAGTACTTCGCTCCAGCCAATACAGATGCAAATAATATCGACGGCCAGGCCATCCGCTACCAGAACCGCTTCCTGCATCTGCTGGGTAAAATCTATTATTTCGGCAACAACAGCAAAGCGGTAACTGGTTGGCAAACCATCAATAGCAAAGTGTATTATTTCATGCCGGATACAGCAATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGTGTGATCTATTTCTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCACCGGGTATTTATGGCCTCGAG

由SEQIDNO:23编码的氨基酸序列(SEQIDNO：24)

HM GSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIESNLVTGWQTINGKKYYFDINTGAASTSYKIINGKHFYFNNNGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPDTAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCVVKIGVFSGSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWQTIDSKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINGKYFYFNTDGIMQIGVFKVPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAITGWQTIDGKKYYFNPNNAIAATHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDSKKYYFNLNTAVAVTGWQTIDGEKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNDSKAATGWATIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIDGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINSKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGLE

经由将一NdeI-F1-XhoI片段插入至选殖质体pET-22b，而构筑得质体(pET22b_F1)。

NdeI-BamHI-F1-XhoI(SEQIDNO:25)

CATATGGGATCCTTTAATAGCGAGAATGAACTGGATCGTGATCATCTGGGCTTCAAAATCATCGATAATAAAACCTATTATTATGATGAAGATAGCAAACTGGTGAAAGGCCTGATTAACATTAACAACAGCCTGTTTTACTTCGATCCGATTGAAAGCAATCTGGTTACCGGTTGGCAGACCATTAACGGCAAAAAATATTATTTTGATATTAATACCGGTGCAGCCAGCACCAGCTATAAAATTATCAACGGCAAGCATTTCTATTTCAATAATAATGGCGTGATGCAGCTGGGCGTTTTTAAAGGTCCGGATGGTTTTGAATATTTTGCACCGGCAAATACCCAGAACAATAATATTGAAGGTCAGGCCATTGTGTATCAGAGCAAATTTCTGACCCTGAACGGTAAAAAATACTACTTCGACAACGATAGCAAAGCAGTGACCGGTTGGCGCATTATTAACAACGAGAAATATTATTTCAATCCGAATAACGCCATTGCAGCAGTTGGTCTGCAGGTTATTGACAACAATAAATATTACTTTAACCCGGACACCGCCATTATTAGCAAAGGCTGGCAGACCGTTAATGGTAGCCGTTATTATTTCGATACCGATACCGCGATTGCCTTTAATGGCTATAAAACCATCGACGGCAAACACTTCTATTTTGATAGCGATTGCGTGGTGAAAATTGGTGTTTTTAGCGGTAGCAACGGCTTTGAATACTTTGCCCCTGCCAATACCTACAACAACAACATCGAAGGCCAGGCAATCGTTTATCAGTCAAAATTCCTGACGCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGACAATAACAGCAAAGCCGTTACGGGATGGCAGACAATTGATAGCAAAAAATACTACTTCAATACCAATACCGCAGAAGCAGCAACAGGTTGGCAGACGATCGATGGTAAAAAATATTATTTCAACACGAACACAGCCGAAGCAGCCACCGGCTGGCAAACCATTGATGGAAAAAAATATTACTTCAATACAAATACGAGCATTGCCAGCACCGGTTATACCATTATCAACGGCAAATATTTCTACTTCAACACCGATGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTCAAAGTGCCGAATGGCTTTGAGTATTTCGCTCCGGCTAACACCCATAATAACAATATTGAGGGCCAGGCGATCCTGTATCAGAATAAATTCCTGACACTGAACGGCAAAAAATACTATTTCGGCAGCGATTCAAAAGCACTCGAG

由SEQIDNO:25编码的氨基酸序列(SEQIDNO:26)

HMGSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIESNLVTGWQTINGKKYYFDINTGAASTSYKIINGKHFYFNNNGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPDTAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCVVKIGVFSGSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWQTIDSKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINGKYFYFNTDGIMQIGVFKVPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKALE

经由将NdeI-LLS-BamHI-F1-XhoI片段插入至选殖质体pET-22b，而构筑得质体(pET22b_lipo-F1)。

NdeI-LLS-BamHI-F1-XhoI(SEQIDNO:27)

CATATG GGATCCTTTAATAGCGAGAATGAACTGGATCGTGATCATCTGGGCTTCAAAATCATCGATAATAAAACCTATTATTATGATGAAGATAGCAAACTGGTGAAAGGCCTGATTAACATTAACAACAGCCTGTTTTACTTCGATCCGATTGAAAGCAATCTGGTTACCGGTTGGCAGACCATTAACGGCAAAAAATATTATTTTGATATTAATACCGGTGCAGCCAGCACCAGCTATAAAATTATCAACGGCAAGCATTTCTATTTCAATAATAATGGCGTGATGCAGCTGGGCGTTTTTAAAGGTCCGGATGGTTTTGAATATTTTGCACCGGCAAATACCCAGAACAATAATATTGAAGGTCAGGCCATTGTGTATCAGAGCAAATTTCTGACCCTGAACGGTAAAAAATACTACTTCGACAACGATAGCAAAGCAGTGACCGGTTGGCGCATTATTAACAACGAGAAATATTATTTCAATCCGAATAACGCCATTGCAGCAGTTGGTCTGCAGGTTATTGACAACAATAAATATTACTTTAACCCGGACACCGCCATTATTAGCAAAGGCTGGCAGACCGTTAATGGTAGCCGTTATTATTTCGATACCGATACCGCGATTGCCTTTAATGGCTATAAAACCATCGACGGCAAACACTTCTATTTTGATAGCGATTGCGTGGTGAAAATTGGTGTTTTTAGCGGTAGCAACGGCTTTGAATACTTTGCCCCTGCCAATACCTACAACAACAACATCGAAGGCCAGGCAATCGTTTATCAGTCAAAATTCCTGACGCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGACAATAACAGCAAAGCCGTTACGGGATGGCAGACAATTGATAGCAAAAAATACTACTTCAATACCAATACCGCAGAAGCAGCAACAGGTTGGCAGACGATCGATGGTAAAAAATATTATTTCAACACGAACACAGCCGAAGCAGCCACCGGCTGGCAAACCATTGATGGAAAAAAATATTACTTCAATACAAATACGAGCATTGCCAGCACCGGTTATACCATTATCAACGGCAAATATTTCTACTTCAACACCGATGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTCAAAGTGCCGAATGGCTTTGAGTATTTCGCTCCGGCTAACACCCATAATAACAATATTGAGGGCCAGGCGATCCTGTATCAGAATAAATTCCTGACACTGAACGGCAAAAAATACTATTTCGGCAGCGATTCAAAAGCACTCGAG

由SEQIDNO:27编码的氨基酸序列(SEQIDNO:28)

HM GSFNSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIESNLVTGWQTINGKKYYFDINTGAASTSYKIINGKHFYFNNNGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPDTAIISKGWQTVNGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCVVKIGVFSGSNGFEYFAPANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWQTIDSKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINGKYFYFNTDGIMQIGVFKVPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKALE

经由将NdeI-F2-XhoI片段插入至选殖质体pET-22b，而构筑得质体(pET22b_F2)。

NdeI-BamHI-F2-XhoI(SEQIDNO:29)

CATATGGGATCCGCCGAAGCAGCCACCGGCTGGCAAACCATTGATGGAAAAAAATATTACTTCAATACAAATACGAGCATTGCCAGCACCGGTTATACCATTATCAACGGCAAATATTTCTACTTCAACACCGATGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTCAAAGTGCCGAATGGCTTTGAGTATTTCGCTCCGGCTAACACCCATAATAACAATATTGAGGGCCAGGCGATCCTGTATCAGAATAAATTCCTGACACTGAACGGCAAAAAATACTATTTCGGCAGCGATTCAAAAGCAATTACAGGTTGGCAAACAATTGACGGGAAAAAGTACTATTTTAATCCGAACAATGCGATCGCAGCAACCCATCTGTGTACCATTAATAACGATAAATACTACTTTAGCTATGACGGCATCCTGCAGAATGGCTATATCACCATTGAACGCAACAACTTTTACTTTGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGTGACCGGTGTTTTTAAAGGCCCTAATGGCTTCGAATACTTCGCACCAGCGAATACGCATAACAATAACATCGAGGGTCAAGCGATTGTCTACCAGAATAAATTTCTGACTCTGAATGGTAAAAAATATTACTTCGATAATGATTCAAAAGCCGTGACCGGATGGCAAACTATCGATTCAAAAAAATACTACTTTAACCTGAACACCGCAGTTGCAGTTACAGGGTGGCAAACCATCGACGGTGAGAAATACTACTTCAATCTGAATACAGCCGAAGCCGCTACTGGATGGCAGACGATTGACGGAAAACGCTATTATTTTAATACCAACACCTATATTGCGAGCACAGGCTATACCATCATTAATGGTAAACACTTCTACTTTAACACGGACGGTATCATGCAAATCGGCGTGTTTAAAGGCCCAGACGGTTTCGAGTACTTTGCGCCAGCAAACACCCACAATAATAACATCGAAGGACAAGCCATCCTGTATCAAAACAAATTTCTGACGCTGAATGGCAAAAAATACTACTTCGGTAGTGATAGCAAAGCTGTTACAGGTCTGCGTACCATCGACGGAAAAAAATATTACTTTAATACTAACACGGCAGTGGCAGTGACGGGCTGGCAAACGATCAACGGGAAAAAATACTACTTCAACACCAACACGTATATTGCCCTCGAG

由SEQIDNO:29编码的氨基酸序列(SEQIDNO:30)

HMGSAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINGKYFYFNTDGIMQIGVFKVPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAITGWQTIDGKKYYFNPNNAIAATHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDSKKYYFNLNTAVAVTGWQTIDGEKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIALE

经由将NdeI-LLS-BamHI-F2-XhoI片段插入至选殖质体pET-22b，而构筑得质体(pET22b_lipo-F2)。

NdeI-LLS-BamHI-F2-XhoI(SEQIDNO:31)

CATATG GGATCCGCCGAAGCAGCCACCGGCTGGCAAACCATTGATGGAAAAAAATATTACTTCAATACAAATACGAGCATTGCCAGCACCGGTTATACCATTATCAACGGCAAATATTTCTACTTCAACACCGATGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTCAAAGTGCCGAATGGCTTTGAGTATTTCGCTCCGGCTAACACCCATAATAACAATATTGAGGGCCAGGCGATCCTGTATCAGAATAAATTCCTGACACTGAACGGCAAAAAATACTATTTCGGCAGCGATTCAAAAGCAATTACAGGTTGGCAAACAATTGACGGGAAAAAGTACTATTTTAATCCGAACAATGCGATCGCAGCAACCCATCTGTGTACCATTAATAACGATAAATACTACTTTAGCTATGACGGCATCCTGCAGAATGGCTATATCACCATTGAACGCAACAACTTTTACTTTGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGTGACCGGTGTTTTTAAAGGCCCTAATGGCTTCGAATACTTCGCACCAGCGAATACGCATAACAATAACATCGAGGGTCAAGCGATTGTCTACCAGAATAAATTTCTGACTCTGAATGGTAAAAAATATTACTTCGATAATGATTCAAAAGCCGTGACCGGATGGCAAACTATCGATTCAAAAAAATACTACTTTAACCTGAACACCGCAGTTGCAGTTACAGGGTGGCAAACCATCGACGGTGAGAAATACTACTTCAATCTGAATACAGCCGAAGCCGCTACTGGATGGCAGACGATTGACGGAAAACGCTATTATTTTAATACCAACACCTATATTGCGAGCACAGGCTATACCATCATTAATGGTAAACACTTCTACTTTAACACGGACGGTATCATGCAAATCGGCGTGTTTAAAGGCCCAGACGGTTTCGAGTACTTTGCGCCAGCAAACACCCACAATAATAACATCGAAGGACAAGCCATCCTGTATCAAAACAAATTTCTGACGCTGAATGGCAAAAAATACTACTTCGGTAGTGATAGCAAAGCTGTTACAGGTCTGCGTACCATCGACGGAAAAAAATATTACTTTAATACTAACACGGCAGTGGCAGTGACGGGCTGGCAAACGATCAACGGGAAAAAATACTACTTCAACACCAACACGTATATTGCCCTCGAG

由SEQIDNO:31编码的氨基酸序列(SEQIDNO:32)

HM GSAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTSIASTGYTIINGKYFYFNTDGIMQIGVFKVPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAITGWQTIDGKKYYFNPNNAIAATHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDSKKYYFNLNTAVAVTGWQTIDGEKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIALE

经由将NdeI-F3-XhoI片段插入至选殖质体pET-22b，而构筑得质体(pET22b_F3)。

NdeI-BamHI-F3-XhoI(SEQIDNO:33)

CATATGGGATCCAAAGCCGTGACCGGATGGCAAACTATCGATTCAAAAAAATACTACTTTAACCTGAACACCGCAGTTGCAGTTACAGGGTGGCAAACCATCGACGGTGAGAAATACTACTTCAATCTGAATACAGCCGAAGCCGCTACTGGATGGCAGACGATTGACGGAAAACGCTATTATTTTAATACCAACACCTATATTGCGAGCACAGGCTATACCATCATTAATGGTAAACACTTCTACTTTAACACGGACGGTATCATGCAAATCGGCGTGTTTAAAGGCCCAGACGGTTTCGAGTACTTTGCGCCAGCAAACACCCACAATAATAACATCGAAGGACAAGCCATCCTGTATCAAAACAAATTTCTGACGCTGAATGGCAAAAAATACTACTTCGGTAGTGATAGCAAAGCTGTTACAGGTCTGCGTACCATCGACGGAAAAAAATATTACTTTAATACTAACACGGCAGTGGCAGTGACGGGCTGGCAAACGATCAACGGGAAAAAATACTACTTCAACACCAACACGTATATTGCCTCAACCGGCTATACAATTATCAGCGGTAAACACTTTTATTTCAATACAGATGGGATCATGCAGATCGGAGTTTTCAAAGGACCTGATGGATTCGAGTATTTTGCTCCTGCGAATACCGATGCCAATAACATTGAGGGACAGGCAATTCGCTATCAGAATCGTTTTCTGTATCTGCACGATAATATTTATTATTTTGGCAATGATTCCAAAGCGGCAACCGGTTGGGCCACCATTGATGGTAATCGTTATTATTTTGAGCCGAATACCGCAATGGGTGCCAATGGTTATAAAACGATTGATAACAAAAACTTTTATTTTCGCAACGGCCTGCCGCAGATTGGCGTATTCAAAGGTCCTAACGGTTTTGAGTACTTCGCTCCAGCCAATACAGATGCAAATAATATCGACGGCCAGGCCATCCGCTACCAGAACCGCTTCCTGCATCTGCTGGGTAAAATCTATTATTTCGGCAACAACAGCAAAGCGGTAACTGGTTGGCAAACCATCAATAGCAAAGTGTATTATTTCATGCCGGATACAGCAATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGTGTGATCTATTTCTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCACCGGGTATTTATGGCCTCGAG

由SEQIDNO:33编码的氨基酸序列(SEQIDNO:34)

HMGSKAVTGWQTIDSKKYYFNLNTAVAVTGWQTIDGEKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNDSKAATGWATIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIDGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINSKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGLE

经由将NdeI-LLS-BamHI-F3-XhoI片段插入至选殖质体pET-22b，而构筑得质体(pET22b_lipo-F3)。

NdeI-LLS-BamHI-F3-XhoI(SEQIDNO:35)

CATATG GGATCCAAAGCCGTGACCGGATGGCAAACTATCGATTCAAAAAAATACTACTTTAACCTGAACACCGCAGTTGCAGTTACAGGGTGGCAAACCATCGACGGTGAGAAATACTACTTCAATCTGAATACAGCCGAAGCCGCTACTGGATGGCAGACGATTGACGGAAAACGCTATTATTTTAATACCAACACCTATATTGCGAGCACAGGCTATACCATCATTAATGGTAAACACTTCTACTTTAACACGGACGGTATCATGCAAATCGGCGTGTTTAAAGGCCCAGACGGTTTCGAGTACTTTGCGCCAGCAAACACCCACAATAATAACATCGAAGGACAAGCCATCCTGTATCAAAACAAATTTCTGACGCTGAATGGCAAAAAATACTACTTCGGTAGTGATAGCAAAGCTGTTACAGGTCTGCGTACCATCGACGGAAAAAAATATTACTTTAATACTAACACGGCAGTGGCAGTGACGGGCTGGCAAACGATCAACGGGAAAAAATACTACTTCAACACCAACACGTATATTGCCTCAACCGGCTATACAATTATCAGCGGTAAACACTTTTATTTCAATACAGATGGGATCATGCAGATCGGAGTTTTCAAAGGACCTGATGGATTCGAGTATTTTGCTCCTGCGAATACCGATGCCAATAACATTGAGGGACAGGCAATTCGCTATCAGAATCGTTTTCTGTATCTGCACGATAATATTTATTATTTTGGCAATGATTCCAAAGCGGCAACCGGTTGGGCCACCATTGATGGTAATCGTTATTATTTTGAGCCGAATACCGCAATGGGTGCCAATGGTTATAAAACGATTGATAACAAAAACTTTTATTTTCGCAACGGCCTGCCGCAGATTGGCGTATTCAAAGGTCCTAACGGTTTTGAGTACTTCGCTCCAGCCAATACAGATGCAAATAATATCGACGGCCAGGCCATCCGCTACCAGAACCGCTTCCTGCATCTGCTGGGTAAAATCTATTATTTCGGCAACAACAGCAAAGCGGTAACTGGTTGGCAAACCATCAATAGCAAAGTGTATTATTTCATGCCGGATACAGCAATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGTGTGATCTATTTCTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCACCGGGTATTTATGGCCTCGAG

由SEQIDNO:35编码的氨基酸序列(SEQIDNO:36)

HM GSKAVTGWQTIDSKKYYFNLNTAVAVTGWQTIDGEKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKRYYFNTNTYIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTHNNNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTYIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNDSKAATGWATIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIDGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINSKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGLE

(3)重组蛋白表达与纯化

将与一C-端多组胺酸标记融合的rRBD、F1、F2及F3多肽(亦即，分别包括SEQIDNO:2、4、6及8的多肽)的每个，经由1mMIPTG(isopropyl-β-D-thiogalacto-pyranoside)诱导后在大肠杆菌BL21(+)RIL表达，以含有100μg/ml的盘尼西林的LB培养液于20℃下培养16小时。以离心方式自2公升培养菌液收取细胞，并储存于-20℃，之后将其悬浮于含有250mM氯化钠及5mM咪唑的50mM磷酸钠缓冲液，pH7.2。以法式压碎机(FrenchPress)打破菌体并收集上清液后，该上清液通过镍离子树脂纯化。将RBD-截短的蛋白以含有50mM精胺酸及10％甘油的1XPBS，pH7.2进行透析。将该四种蛋白质通过E膜以除去内毒素。融合至多组胺酸标记C-端的rlipo-RBD的纯化步骤，是根据Tseng与Leng于ApplMicrobiolBiotechnol.2012；93:1539-1552所叙述的方法。大致上，是将大肠杆菌C43(DE3)表达的rlipo-RBD在细胞裂解后，以含0.5％TritonX-100的50mMTris-Cl，pH8.0从沉淀物进行萃取。将该萃取经由两步骤亲和性色层层析纯化。首先，使用镍离子树脂进行分离。第二步，是将透析后所得的除去咪唑的溶析液通过其中以铜离子充填的固定化金属离子亲和性层析(immobilizedmetalaffinitychromatography，IMAC)(GE)，以除去LPS。

(4)多肽合成

所有多肽是购自NIIDV多肽合成设施中心。

(5)SDS-PAGE及西方墨点法分析

蛋白质样本以10％SDS-PAG分析之前，先以BCA蛋白分析套组(ThermoPierce)定量。于样本转移至PVDF(GE)后，将该PVDF薄膜以5％牛奶处理一小时。之后将薄膜与抗组胺酸标记抗体及特异抗艰难梭状芽孢杆菌毒素A抗体反应，于含1％牛奶及0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液反应一小时。最后，将该薄膜与山葵过氧化氢酶共轭的二级抗体(GeneTex)反应，于含1％牛奶及0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液反应一小时。再以LuminataCrescendo受质(MerckMillipore)冲洗薄膜。

(6)在Vero细胞进行活体外中和分析

Vero细胞培养在75T细胞培养角瓶(Corning)，于37℃，5％CO₂下以含病毒生产无血清培养液(Virusproduction-serumfreemedium，VP-SFM)(Invitrogen)/4mM麸酰胺酸培养，直到细胞长满。将2x10⁴细胞接种在96孔盘，于37℃，5％CO₂培养隔夜后，替换新鲜的VP-SFM培养液。将以rRBD或rlipo-RBD免疫或无免疫的小鼠血清连续两倍稀释后，以等体积混合毒素A并于室温反应一小时。该混合物加入96孔盘以达到毒素A浓度为16ng/ml，并于37℃，5％CO₂反应24小时。以100％细胞变圆及显微镜上的相机捕捉细胞影像，测定毒素A的中和效价。

(7)动物免疫及tcdA攻毒模式

BALB/c小鼠及叙利亚黄金仓鼠(Syriangoldenhamsters)购买自实验动物中心，并饲养于财团法人卫生研究院的实验动物中心。BALB/c小鼠以0.3、3.0及30μgrRBD与rlipo-RBD每隔两周免疫三次，仓鼠以10μgrRBD与rlipo-RBD每隔两周免疫三次。免疫之前，小鼠及仓鼠每个以脸部及眼窦静脉采血取样，采集的血清藉由ELISA计算抗原特异IgG及IgA的效价。毒素A攻毒方式如先前SerginSSetal.,2012.Vaccine30:1492-1501所描述。简而言之，BALB/c小鼠0.3及3μgrRBD以及rlipo-RBD经由肌肉注射，每隔两周免疫三次，15周龄小鼠以腹膜注射150ng毒素A(NativeAntigenInc.)。实验室人员每隔6小时持续观察记录动物致死率。

(8)多肽免疫

天竺鼠购自实验动物中心(NationalAnimalCenter)以单独三多肽及其与不完全弗朗式佐剂(IFA)(Sigma)制备的混合物，每一个月以皮下注射免疫三次，饲养于财团法人卫生研究院的实验动物中心。

(9)细胞染色及流式细胞仪分析

Vero细胞在75T细胞培养角瓶，以含VP-SFM/4mM麸酰胺酸培养，于37℃，5％CO₂下至细胞长满。5x10⁵细胞与1μg特异单株抗体(GeneTex)及抗组胺酸标记抗体(AbDSerotec)在冰上反应30分钟。洗涤两次之后，在冰上以FITC共轭的二级抗体(Sigma)处理30分钟作表面染色。流式细胞仪分析之前，以碘化丙啶处理标记死亡细胞以排除死亡细胞。

(10)血液凝集素活性分析

血液凝集素(Hemagglutinin，HA)活性分析如Wrenetal.(Infect.Immun.1991,59:3151-3155)所叙述。简而言之，于25μL磷酸盐缓冲液含有250pMolesrRBD，或rRBD-F1，或rRBD-F2，或rRBD-F3其中之一以磷酸盐缓冲液连续两倍稀释，并置于96孔圆底盘中。以一比一比例，加入25μL兔红血球细胞的悬浮液以磷酸盐缓冲液再洗涤一次，以除去血清污染。混合物在4℃培养至隔夜，以肉眼计算分析血液凝集素活性。

(11)酵素结合免疫分析

于酵素结合免疫分析盘(Costar)覆盖抗体隔夜之后，以含5％BSA(Calbiochem)的磷酸盐缓冲液阻塞。该盘以连续倍率稀释的血清于室温反应两小时。以山葵过氧化氢酵素共轭的IgG(KPL)及IgA(Invitrogen)特异抗体与含1％BSA的磷酸盐缓冲液在室温下反应一小时。该盘再以TMB单孔过氧化氢酵素受质(KPL)处理于室温黑暗条件下反应20分钟。最后以分光亮度计侦测OD_450nm吸光值以计算血清效价。

(12)黏膜免疫作用

6至8周龄的雌C57BL/6小鼠购买自实验动物中心，并饲养于财团法人卫生研究院的实验动物中心。所有实验进行并遵循财团法人卫生研究院的实验动物中心的准则，每一组的6只小鼠每隔两周接受三次鼻内免疫，每次施以2μg或10μgtcdA-RBD及其与10μg卵白蛋白配制的制剂。将10μg卵白蛋白分别与1μg霍乱毒素及PBS调配，作为阳性及阴性对照组。小鼠在每次免疫之前一周由脸部静脉采血。用于鼻内注射的抗原制备于总反应体积40μL，最后一次免疫7天后，从小鼠采血并牺牲已采集其气管肺泡灌洗液(broncho-alveolarlavagefluid，BALF)及位于小肠的粪便。采集其气管肺泡灌洗液以含有蛋白酶抑制混合物组(ProteaseInhibitorCooktailSetIII)(Calbiochem,Darmstadt,Germany)的1mL磷酸盐缓冲液清洗。粪便则再回溶于同样清洗气管肺泡灌洗液的缓冲液，浓度为1mg/ml。该气管肺泡灌洗液的清洗液及含粪便溶液维持在冰上直到储存于-20℃。小鼠血清IgG及IgA含量、BALF及脸部血清IgA含量以酵素结合免疫分析测定。

(13)树突细胞(DC)成熟表面标帜及细胞激素分析

树突细胞成熟的活体外分析，是如先前Takeuchietal.,(J.Immunol(2002)169:10-14)所述。C57B/6小鼠购买自实验动物中心，并饲养于财团法人卫生研究院的实验动物中心。大致上，从6至8周龄雌鼠C57B/6的胫骨采集源自骨髓的树突细胞(bonemarrow-derivedDCs，BMDCs)。以LCM(含有1％抗生素盘尼西林及链霉素，10％热去活化FBS，50μMβ-巯基乙醇及50mMHEPES的RPMI1640)剧烈地清洗以单离出骨髓细胞，并且以裂解缓冲液处理除去红血球细胞。BMDCs再回溶于LCM，浓度为2×10⁶细胞/毫升，并以20ng/mL重组颗粒细胞巨噬细胞群刺激因子(recombinantgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，MoGM-CSF)于第0天及第3天处理。于第6天将BMDCs(2×10⁶/mL)种在24孔盘。加入结合或不结合10ng/mL多黏杆菌素B(polymyxin，PMB)的不同浓度的tcdA-RBD。LPS及毒素A作为阳性对照组。培养后16至18小时，源自骨随的树突细胞以流式细胞仪(FACSCalibur,BDBiosciences,FranklinLakes,NJ,USA)分析以评估是否增加调控细胞表面标帜蛋白。为了排除未成熟的树突细胞，50％总体细胞族群组成中，CD11c+细胞族群以抗CD-40、CD-80、CD-86及MHC-II特异单株抗体用于表面标帜蛋白染色。此外，该处理之后收集细胞培养液，以分析在成熟树突细胞中典型分泌的细胞激素包含IL-6，IL-12p40及TNF-α的表现量。

(14)tcdA-RBD的佐剂效力

用于测量tcdA-RBD其全身性佐剂效力的免疫手册如以下叙述，四组(一组6只)BALB/c小鼠以2μg卵白蛋白(ovalbumin，OVA)(Sigma,US)，与3μg或10μgtcdA-RBD，RBD-F1，RBD-F2，RBD-F3或氢氧化铝配制后，经由肌肉注射免疫，仅以2μg卵白蛋白免疫作为免疫对照组。三组小鼠免疫前14天进行脸部静脉采血取样，收集血液样本并于56℃去活化30分钟，再进一步分析前储存于-80℃。

(15)流式细胞仪(Fluorescence-activatedcellsorting，FASC)分析

Vero细胞于37℃及5％CO₂条件下，于75T细胞培养角瓶以VP-SFM/4mM麸酰胺酸，培养至八成满。5x10⁵细胞与1μg特异单株抗体(PCG-4)(GeneTex)及抗组胺酸标记抗体(AbDSerotec)混合，并在冰上反应30分钟。洗涤两次之后，加入FITC共轭二级抗体(Sigma)并且样本于冰上反应30分钟以进行表面染色。在流式细胞仪分析之前，加入碘化丙啶(propidiumiodide，PI)作为存活细胞的标记以排除死亡细胞。

结果

(1)编码tcdA-RBD的DNA的合理设计

藉由连接其含有前述同一性序列分析中序列的数个合成DNA片段产生的cDNA片段，产生特定编码tcdA-RBD的质体。编码含有lipo-box序列的tcdA-RBD核酸及其他个别tcdA-RBD片段，经由次选殖至载体pET-22b，而产生pET-22b-rlipo-RBD、pET-22b-rRBD-F1、pET-22b-rRBD-F2及pET-22b-rRBD-F3，并将彼等用于转形至上述大肠杆菌BL21(+)RIL及/或JM109(DE3)。从大肠杆菌JM109(DE3)中两个独立菌落制备的质体DNA，以用于序列确认。使用染剂-终结子化学法(dye-terminatorchemistry)于定序仪ABIDNAsequencermodel370A上进行定序，寡核苷酸引子则由ABIDNAsynthesizermodel380B合成，并以色层层析纯化。核酸序列分析tcdA-RBD及其片段显示有1或2错误配对的碱基对，该错误配对的碱基对经由定点突变法校正。

(2)大肠杆菌系统中rRBD、rlipo-RBD及其片段的表达

由上所述3种蛋白片段(rRBD-F1、-F2及-F3)及rRBD融合至一C-端多组胺酸标记，由大肠杆菌BL21(+)RIL表达。rlipo-RBD特定由大肠杆菌C43(DE3)表达。如需要的话，tcdA-RBD及其片段可在CHO细胞或Vero细胞其中之一与Myc-His标记融合为融合蛋白，选殖至CHO细胞或昆虫杆状病毒表达系统。

rRBD-F1，-F2与-F3，及rRBD由上述方法纯化。该重组抗体内含LPS内容物浓度为<3EU/mL，不具有佐剂的效应。该重组抗体纯度由SDS-PAGE及西方墨点法分析。参照图3及图4。一全长，重组tcdA-RBD(911胺基酸)第一次由大肠杆菌表达并纯化其含有些微LPS污染。

rlipo-RBD经由上述方法纯化。该纯度同样由SDS-PAGE及西方墨点法分析。参照图5。该LPS内容物浓度为<30EU/mL，具有佐剂的效应。

(3)合成多肽于天竺鼠的免疫原性研究

3组天竺鼠以RBD-P1，-P2，-P3(参照上述表1)或包含该三种其中之一等量的多肽免疫。每个多肽或其混合物以100毫克与完全弗朗式佐剂(completedFruend’sadjuvant)制备并于第0天注射，于第14天及第56天之后以含有该多肽或混合物之一半量的不完全弗朗式佐剂(IncompletedFruend’sadjuvant)增进反应，并于第78天采血取样。进行免疫之前，天竺鼠由耳静脉采血，收集血清样本由ELISA测定抗体特异的IgG效价。该血清对于多肽及rRBD显示无反应

所有3种合成多肽各自诱发强烈抗肽IgG抗体的免疫反应。参照下述表2。该抗肽血清同样于酵素结合免疫分析中与tcdA反应。参照表2。

表2

最终采血血清抗肽与人工合成肽的反应(IgG效价乘以log¹⁰)

(4)小鼠对于不同rRBD及rlipo-RBD抗体的免疫原性研究

BALB/c小鼠购买自实验动物中心，并饲养于财团法人卫生研究院的实验动物中心。每一组6只小鼠(6-8周龄)于第0天、第14天及第28天后，以磷酸盐缓冲液、30μgrRBD或3μgrlipo-RBD免疫，第42天之后以毒素攻毒。小鼠进行免疫之前，从脸部静脉采血并收集血清，由ELISA测定抗原特异IgG及IgA的效价，及其他上述生物活性。

rRBD及rlipo-RBD两者具有高度免疫原性，并能诱发强烈抗RBD抗体，其效价高于10,000，参照图6。由西方墨点法分析显示，该抗体会与rRBD及tcdA反应(数据未示)。单独以单一剂量rlipo-RBD(3μg)及rRBD(30μg)相较之下具有至少10倍的效力，如下表3。在Vero细胞分析中，只有抗rlipo-RBD小鼠血清可显著地抑制tcdA毒性(p<0.001)，参照表3。该结果显示，单独的rRBD虽可诱发抗体反应，但其抗体无法完全阻断tcdA结合至Vero细胞并杀死细胞。

表3

当TCID₅₀(抑制50％)作为反应终点，发现抗rRBD小鼠血清于Vero细胞毒性分析中，对于tcdA毒性具有明显的抑制作用，参照表4。

表4

(5)小鼠tcdA攻毒模式中rlipo-RBD诱发保护性效力

小鼠模式中以tcdA(毒素A)攻毒如上所述，大致上，BALB/c小鼠以30μgrRBD或rlipo-RBD每隔两周以肌肉注射方式免疫三次，在第15周经由腹膜注射150ng毒素A(NativeAntigenInc.)以攻毒。实验室人员每隔六小时持续地观察动物死亡率，如以下表五，其中30μgrRBD或rlipo-RBD之一能保护大于90％小鼠抵抗毒素A攻毒，而以磷酸盐缓冲液免疫的小鼠则被毒素A杀死。

表5

进一步实验显示0.3μgrlipo-RBD足以保护小鼠避免毒素A毒性，参照图7及表6。rRBD较不具效力；3μg剂量仅能保护10％小鼠避免毒素A的毒性。该结果与上述Vero细胞抑制分析的结果一致。亦即rlipo-RBD可诱发对于毒素A强烈保护性的免疫反应。

表6

免疫原	存活百分比(％)
		磷酸盐缓冲液	0％
0.3μg rRBD	0％
		3μg rRBD	10％
0.3μg rlipo-RBD	90％
		3μg rlipo-RBD	100％

毒素A攻毒剂量:150ng(5XLD50)

(6)rlipo-RBD诱发强烈全身性IgA抗体反应

当小鼠产生抗rRBD或rlipo-RBD的抗血清用于测试其对于全身性IgA的反应性，我们发现3μgrlipo-RBD诱发强烈全身性IgA效价(>10,000)，其效力同30μgrRBD，参照图8。

(7)rRBD具有佐剂功能以增强对于非免疫原性蛋白的免疫反应

因为rRBD以30μg的剂量，无佐剂存在情况下具有高度免疫原性，因此欲了解rRBD及/或rlipo-RBD是否能增强对于非免疫原性蛋白的免疫反应。卵白蛋白为已知的弱免疫原，在无佐剂的情况下无法诱发良好IgG抗体反应，因此不同群的小鼠单独以卵白蛋白，或卵白蛋白与rRBD及rlipo-RBD其中之一免疫，发现rRBD及rlipo-RBD两者皆能增强抗卵白蛋白IgG及全身性IgA的抗体反应，参照图9。同样以2次剂量(0.3μg)rlipo-RBD进行免疫，于四周后诱发IgA抗体的免疫反应明显地(p<0.001)优于以3μgrRBD免疫所得抗体的免疫反应，而在三次剂量免疫下并无显著差异(于六周产生的免疫反应)，参照图9。

(8)tcdA-RBD的受体结合片段

rRBD及其片段(rRBD-F1、-F2与-F3)用上述流式细胞仪测试其结合至Vero细胞的能力，如图10所示，发现rRBD-F3比rRBD、rRBD-F1及rRBD-F2更具有效力。该结果揭示与F1及F2相较之下，rRBD-F3该重复性序列含有一更高亲和力受体结合位点。由环两色相性分光法(Circulardichroism，CD)显示，在F1及F3片段中可观察到明显β-折迭结构，参照图11。该F2片段与其他两片段比较，则显示较少β-折迭结构的讯号。

(9)该tcdA功能域其血液凝集素活性(HA)

rRBD及其片段(rRBD-F1、-F2及-F3)如上所述用于测试兔红血球细胞(rabbitredbloodcells，RRBC)其血液凝集素活性。约1％兔红血球细胞中发现rRBD比tcdA更具有效力凝集兔红血球细胞，参照图12。该HA测试指出浓度4pMoles的rRBD可轻易地凝集兔子红血球细胞。此外，发现小鼠抗rlipo-RBD血清可更有效地中和rRBD其HA活性。

进一步实验证实，rRBD-F3比rRBD和rRBD-F2在血液凝集素活性分析中更具有潜力，参照图13。意外地，rRBD-F1显示并无任何血液凝集素活性，但如上所述强烈地结合至Vero细胞。该结果显示F1片段具有其他非碳水化合物结合位点，经由Vero细胞结合分析中更进一步证实。西方墨点法显示RBD-F1强烈结合至Vero细胞，而RBD-F2及其他两片段相较其结合的能力较差，参照图14。合并以上所述结果可知RBD片段中其重复性序列微小的差异可影响其对宿主受体亲和力及血液凝集素活性。

(10)天竺鼠抗肽抗体在兔红血球细胞分析中抑制rRBD其血液凝集素活性

如上所述在天竺鼠免疫原性研究中，合成多肽RBD-P1、-P2及-P3可诱发抗rRBD抗体的免疫反应。参照图15及图16。吾等亦测试该等抗肽血清在兔红血球细胞分析中，是否能抑制rRBD的血液凝集素(HA)活性。如图17显示，该等血清在兔红血球细胞分析中，能有效抑制rRBD的血液凝集素活性。天竺鼠抗肽血清抑制RBD其血液凝集素活性的效力，系显示于图18。

(11)rRBD及其片段可作为药物递送载剂

流式细胞仪分析显示及Vero细胞直接结合分析列述如上，rRBD及其片段可快速辨识并结合至该宿主细胞。共轭焦显微镜观察之下，rRBD及其片段可在一分钟内快速结合至宿主细胞。之后10分钟内进入(internalized)细胞并在细胞内去局部化(delocalized)，并在30分钟内开始降解，参照图19。这些结果揭示rRBD及其片段可作为药物递送载体。

(12)比较rRBD及其片段的免疫原性

RBD-F1、-F2及-F3设计分别具有源自N-端、中间区域及C-端相同数目的重复性序列，但每一片段具有以上所述不同功能级别(level)及生物物理特征。吾等评估其免疫原性及诱发抗体的免疫性质，小鼠免疫原性研究中每个以30μgRBD的片段进行测试。发现RBD-F1及-F3片段同样与rRBD具有潜力，参见图20。与其他片段相较，RBD-F2具较少的免疫原性(p<0.05)。虽然RBD片段能诱发良好IgG抗体的反应，但在毒素A中和分析(TCID50)中与抗rRBD抗体相较，其抗体的生物功能较不具有效力，参照图7。由抗RBD-F3血清测得最佳的效价为16，而由抗rRBD抗体测得的效价为256。该结果揭示其RBD片段可以单独地或以组合作为候选疫苗以抵抗Cd感染。

表7

(13)RBD片段可作为免疫刺激剂，以提高对微弱免疫原性抗原的免疫反应

我们测试RBD片段是否可以增强对非免疫原性蛋白的免疫反应。卵白蛋白同样作为此研究的模型蛋白。不同组小鼠(每组6只)单独以卵白蛋白(10μg)免疫，或用明矾，rRBD(10μg)，或不同的RBD片段(每一片段为30μg)与卵白蛋白配制。有趣的是，RBD，其片段能有效提高抗卵白蛋白IgG抗体的反应。见图21，我们同样以10μg剂量测试RDB每个片段其佐剂效力。这些结果表明，所有RBD片段可用作为佐剂以增强对微弱免疫原性抗原的免疫反应。

(14)经由rRBD或RBD片段可引发树突细胞的成熟

艰难梭状芽孢杆菌毒素A被指出可调控表面效应分子(surfaceeffectmolecules)的增加及树突细胞(DCs)趋化激素CXCL2的表达。我们测试rRBD及其片段是否能促进树突细胞成熟，该树突细胞对于调制(modulate)免疫系统为重要的抗原呈现细胞。C57BL/6小鼠的BMDCs细胞以rRBD处理之后，分析与T-细胞活性相关的树突细胞成熟标帜(CD40、CD80、CD86及MHC-II)及前发炎性细胞激素(IL-6、IL-12和TNF-α)。的确，rRBD处理之后T-细胞表面效力分子显著地增加及在细胞培养液中可侦测到高含量的前发炎性细胞激素。参照图22及图23。

为排除LPS污染的可能性，遂将LPS在rRBD溶液的浓度限制于0.03EU/μg。此外，每一测试以多黏杆菌素B中和LPS的功能，以排除LPS经由类铎受体(Toll-likereceptor)4途径使树突细胞活化。

该结果同样证实，以多黏杆菌素b处理及没有rRBD处理的实验组中并无显著差异。此外，rRBD溶液及LPS经水煮之后以变性并且破坏rRBD的生物功能。单独以水煮LPS处理之后树突细胞活性并无显著影响，但在以水煮rRBD之后却阻碍树突细胞的活性。整体而言，数据清楚地证实所观察到树突细胞的活性是来自于rRBD。

单独RBD片段同样以树突细胞活性分析，结果发现类似于rRBD。参照图22及图23。与其他片段相较，发现RBD-F3最具有效力。

综合该结果我们可以结论，该免疫区域树突细胞的活化可来自rRBD及其截短片段的免疫性效力。

(15)从tcdA其他区域鉴定的免疫原性多肽

为了制备一用以有效侦检艰难梭状芽孢杆菌感染及与该感染相关的疾病的诊断套组，遂合成包含tcdA其他功能域(参照上述表1)的多肽(CdTx-CP、CdTx-GT1、CdTx-GT2、CdTx-GT3、CdTx-TM1、CdTx-TM2及CdTx-TM3)，并以天竺鼠测试此多肽在其他患病个体是否能诱发辨识tcdA抗体的免疫反应。如表8所示，从每一区域(GT、CP及TM)的该多肽混合物发现可诱发区域特异性的抗肽抗体，其效价大于10,000。该等抗血清在西方墨点法分析可特异结合tcdA而非RBD。该结果显示该等多肽在病患样本中具有能力诱发辨识tcdA抗体的免疫反应，可用于有效诊断艰难梭状芽孢杆菌感染及与该感染相关的疾病。

表8

其他具体实施态样

所有本说明书所揭露的特征可以任何组合进行，而揭露的每个特征可被用于相同，等效或类似目的的替代特征所代替。因此除非另有说明，否则揭露的每个特征仅是一般等效或类似特征的一个实施例。

从上列所述，本领域具通常知识者可以轻易地确定本说明书所述的实施例的必要特征，在不脱离其精神及范围之下，可以变化及修改所述实施例以适应各种用途及条件。因此，其它实施例亦涵盖在专利范围之内。

Claims (18)

1.一种单离的多肽，其包含选自由SEQIDNO：2、4、6及8-18所组成的群的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的单离的多肽，其进一步包含一位于N-端的脂质化序列。

3.如权利要求2所述的单离的多肽，其中该脂质化序列包括SEQIDNO：20的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的单离的多肽，其中该多肽包括SEQIDNO：22、26、30或34的氨基酸序列。

5.如权利要求2所述的单离的多肽，其中该多肽包括SEQIDNO：24、28、32或36的氨基酸序列。

6.一种嵌合分子，其包含：

(a)一选自如权利要求1所述的多肽的第一多肽；及

(b)一连接至该第一多肽的第二多肽或多糖。

7.如权利要求6所述的嵌合分子，其中该第二多肽是一种抗原。

8.一种免疫原性组成物，其包含如权利要求1所述的单离的多肽。

9.如权利要求8所述的免疫原性组成物，其进一步包含一医药上可接受的载体。

10.一种单离的核酸分子，其包含一编码如权利要求1所述的多肽的核酸序列。

11.如权利要求10所述的核酸分子，其中该核酸序列是选自由SEQIDNO：1、3、5、7、21、25、29、33、23、27、31及35所组成的群。

12.一种载体，其包含如权利要求10所述的核酸分子。

13.一种宿主细胞，其包含如权利要求10所述的核酸分子。

14.一种免疫原性组成物，其包含一抗原及一佐剂，其中该佐剂是如权利要求1所述的单离的多肽。

15.如权利要求14所述的免疫原性组成物，其中该多肽具有SEQIDNO：2、4、6或8的氨基酸序列。

16.一种用于诊断艰难梭状芽孢杆菌感染或与该感染相关的疾病的套组，其包含一或多种各别与选自由SEQIDNO：2、4、6及8-18组成的群的任一序列的多肽特异结合的抗体。

17.一种如权利要求8所述的免疫原性组成物用于在个体中诱导免疫反应的用途。

18.一种如权利要求8所述的免疫原性组成物用于治疗艰难梭状芽孢杆菌感染或与该感染相关的疾病的用途。