TW201431858A - 作爲蛋白質激酶抑制劑之新的氮雜吲哚衍生物 - Google Patents

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Abstract

本發明有關具下式(I)之化合物：□和/或其藥學上可接受之加成鹽、溶劑化物、鏡像異構物、非鏡像異構物以及混合物。本發明之標的因此亦包括式(I)化合物之製備、其等之用途，特別是在抑制與例如許多疾病(諸如癌症或免疫系統病症)有關聯之蛋白質激酶方面。

Description

作為蛋白質激酶抑制劑之新的氮雜吲哚衍生物 簡介
本發明有關作為蛋白質激酶抑制劑之化合物，其等之製備方法以及其等之治療應用。
發明背景
蛋白質激酶(PK)之功能不全/反常，是許多病變之原因，包括腫瘤、免疫、神經、代謝以及感染疾病。因此在研發用於治療此等病症之小分子以及生物激酶抑制劑方面，引起相當大的注意。
在腫瘤生成期間，許多PK特別地會反常。因此蛋白質激酶在抗癌藥物方面，是具吸引力的標的，該等抗癌藥物包括小分子抑制劑，其作用通常是阻斷ATP或基質結合至酪蛋白激酶之催化功能區；以及單株抗體，其可專一性地標靶受體酪蛋白激酶(RTK)以及其等之配位子。在實體惡性腫瘤中，單一激酶異常為疾病之唯一的原因並不常見，而腫瘤僅依靠一種不正常活化的訊號途徑亦是不太可能的。相反的，是多種訊號途徑的紊亂。此外，即使單一分子異常，可能具有多種的下游作用。使用會同時標靶許多訊號 途徑之單一分子之多標靶治療法(MTKI="多標靶激酶抑制劑")，比單一標靶治療法更有效。單一標靶治療法已顯示出僅對一些徵兆有作用，然而大部分的實體瘤出現多種訊號途徑反常。例如，結合血管內皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑以及血小板衍生生長因子受體(PDGFR)抑制劑，會產生累積的抗腫瘤效力(Potapova et al.,Mol Cancer Ther 5,1280-1289,2006)。
腫瘤不僅由腫瘤細胞構成。一重要的部分是由此等細胞產生之結締組織或間質(由間質細胞以及胞外基質構成)組成。間質細胞之例子是纖維母細胞、內皮細胞以及巨噬細胞。間質細胞在癌症發生中亦扮演重要角色，在此其等之特徵是向上調節或誘導生長因子以及其等之受體、黏附分子、細胞激素、趨化激素以及蛋白水解酵素(Hofmeister et al.,Immunotherapy 57,1-17,2007；Raman et al.,Cancer Letters 256,137-165,2007；Fox et al.,The Lancet Oncology 2,278-289,2001)。
內皮以及腫瘤細胞上，與酪蛋白激酶相關之受體VEGFR，因參與血管生成作用，所以在促進癌症方面扮演主要角色(Cébe-Suarez et al.,Cell Mol Life Sci 63,601-615,2006)。此外，由癌細胞分泌之生長因子TGF-β、PDGF以及FGF2，會將正常的纖維母細胞轉形成腫瘤相關的纖維母細胞，此使得其等之受體為適合激酶抑制劑之抑制作用的標的(Raman et al.,2007)。
再者，越來越多的證據提出EGF受體(EGFR)與 HER2途徑以及VEGF依賴性血管生成之間的關聯，以及臨床前研究顯示出，EGFR訊號具直接以及間接血管生成作用二者(Pennell and Lynch,The Oncologist 14,399-411,2009)。已有人提出，向上調節腫瘤促血管生成因子以及EGFR非依賴性腫瘤誘發的血管新生作用，為腫瘤細胞能克服EGFR抑制作用之可能的機制。
由EGFR之活化作用調節之主要訊號途徑是PI3K、MAPK以及Stat途徑，其會增加細胞增生、血管生成、抑制細胞凋亡以及細胞週期的進行。在大多數像是肺癌、乳癌、結直腸癌之實體瘤以及頭頸癌中，EGFR是過度表達的(Cook and Figg,CA Cancer J Clin 60,222-243 2010)。此外，已顯示出較高的EGFR表達，與轉移、存活率降低以及較差的預後有關聯。
c-Src，一種膜相關的非受體酪蛋白激酶，參與許多重要的訊號傳遞途徑，且在細胞功能上具有多效作用。c-Src會整合以及調節來自多重穿膜受體相關的酪胺酸激酶之訊號，像是EGFR、PDGFR、IGF1R、VEGFR、HER2。以及，此等作用會調控細胞的存活、增生、分化、血管生成、細胞活動性、黏附性以及侵入性(Brunton and Frame,Curr Opin Pharmacol 8,427-432,2008)。在許多類型之癌症中，包括結直腸癌、胃腸癌(肝、胰、胃與食道)、乳癌、卵巢癌以及肺癌，觀察到蛋白c-Src之過度表達以及其活性增加(Yeatman,Nat Rev Cancer 4,470-480,2004)。
在癌症中，EGFR或KRAS之活化，會引起Ras依 賴性Raf活化作用之位準大幅地提高。因此，預期除掉Raf之功能，可有效的治療許多由EGFR以及KRAS病變引發之癌症(Khazak et al.,Expert Opin.Ther.Targets 11,1587-1609,2007)。
在腫瘤中，除了Raf訊號之活化之外，許多研究亦暗示，Ras-Raf-MAPK訊號途徑之活化，為血管新生以及血管生成中之關鍵步驟。此活化作用係由諸如VEGFR2、FGFR2之生長因子受體誘發的，因此抑制Raf之活化作用，顯示為用於調控腫瘤血管生成以及血管化之合理的標靶。
雖然VEGFR、PDGFR、EGFR、c-Src以及Raf是腫瘤細胞以及腫瘤間質細胞二者上之重要的標靶，但諸如FGFR之其它激酶，僅作用在間質細胞上，而其它致癌基因常僅作用在腫瘤細胞上。
蛋白質激酶是多樣訊號途徑(包括免疫細胞)之基本組份。其等之基本功能，使得其等為有效的治療標的。一開始預期的是，高程度的選擇性可能是關鍵；然而，隨著時間的變化，開始使用"多激酶"抑制劑。此外，使用激酶抑制劑之疾病的範圍，亦擴大至不僅包括惡性腫瘤，且包括免疫調控的疾病/發炎性疾病。利用多鏈免疫辨識受體發出訊號的第一步驟，一開始是由Src家族蛋白酪蛋白激酶調控。涉及免疫功能之MTKI標靶激酶，為可能用於自體免疫疾病之藥物，諸如類風濕性關節炎、牛皮癬以及發炎性腸道疾病(Kontzias et al.,F1000 Medicine Reports 4,2012)
之前提到之蛋白質激酶亦為許多其它生理以及 病理機制之主要組份，諸如神經退化以及神經保護作用(Chico et al.,Nature Reviews Drug Discovery 8,892-909,2009)、動脈硬化、骨質疏鬆以及骨質再吸收、黃斑部退化、病理性纖維化、囊腫生成(人類體染色體顯性遺傳多囊腎疾病...)。
在WO2010/092489以及相關的專利/專利申請案中，吾人鑑定出許多展現出可供此等應用之特性之化合物。然而，吾人發現，此等化合物中某些之特性，可經由選擇性地作用在其等之結構的特別區域上而得到提升。然而，在WO2010/092489提申之時，並未精確地闡述此等結構在激酶上之作用機制，因此並無法預期吾人於本發明中所揭示的，發現高活性的結構。
本發明之標題是提供具有原始骨架之新穎的多標靶激酶抑制劑，其可用於治療與蛋白質激酶之反常相關的病理，包括腫瘤生成、人類免疫病症、發炎性疾病、血栓疾病、神經退化性疾病、骨病、黃斑部退化、纖維化、囊腫生成。
本發明之抑制劑可特別用於治療許多癌症，更特別的是下列之情況：液態瘤，諸如血液腫瘤(白血病)，或實體瘤，包括，但不限於，鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、胰臟癌、諸如膠質母細胞瘤以及神經纖維瘤之膠質細胞腫瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、黑色素瘤、結直腸癌、子宮內膜癌、涶腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肉瘤、星狀細胞瘤以及各 種類型之過度增生疾病。
發明概要
本發明有關具下式(I)之化合物，和/或其藥學上可接受之加成鹽、溶劑化物、鏡像異構物、非鏡像異構物，以及其等之混合物：
其特徵在於，- R1是C1-C6烷基，較佳地甲基、乙基或正-丙基，選擇性地，R1是氫原子，- X是CH2或C=O，- R2是氫、C1-C6烷基或鹵素，- Y是擇自於由下列所構成之群組：HNC(O)、HNC(S)、HNSO2、HNC(O)CH2、HNC(O)NH、HNC(S)NH、C(O)NH、C(O)NHCH2、CH2NHC(O)以及CH2NHC(S)，- R3是擇自於由下列所構成之群組：- 被下列單或多取代的苯基基團：- 羥基，- 鹵素，- C1-C6烷基胺，較佳地二級C1-C6烷基胺，- C1-C6烷氧基， - C1-C6三氟烷氧基，較佳地三氟甲氧基，- C1-C6烷基，較佳地甲基、異丙基，- C1-C6三氟烷基，較佳地三氟甲基，- 雜芳基片段，其任擇地被C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，其中該雜芳基片段係擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶以及較佳地被甲基單取代之噻唑基，- 咪唑，條件為Y是HNC(S)、HNSO2、HNC(O)CH2、HNC(O)NH、HNC(S)NH、C(O)NHCH2、CH2NHC(O)、CH2NHC(S)或C(O)NH，其中NH直接連接至R3，較佳地條件為Y是HNC(S)、HNSO2、HNC(O)CH2、HNC(O)NH、HNC(S)NH、C(O)NHCH2、CH2NHC(O)或CH2NHC(S)，更佳地條件為Y是HNC(S)，- 雜芳基基團，其較佳地擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶，任擇地經C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，- 非芳族單取代的環狀基團，較佳地為環狀C3-C10烷基，其係經羥基、鹵素、C1-C6烷基胺、C1-C6烷氧基、C1-C6三氟烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基單取代，以及- 擇自於由下列所構成之群組之片段： 。
本發明之另一態樣有關一種製備在此所定義之化合物之方法，其特徵在於，其包含至少一下列步驟：a)在X是CO之情況下，NH-CO鍵係利用胜肽偶合技術形成，其使用經NO2基團取代的芳族羧酸，較佳地使用碳化二亞胺或脲陽離子偶合劑，或假如X是CH2，則NH-CH2鍵是利用還原胺化反應形成，其使用經NO2基團取代的芳族醛，較佳地在氫化硼之存在下，b)將該NO2基團還原成NH2，較佳地利用氫化反應，諸如，例如在鈀碳之存在下，於氫環境下之催化氫化反應。
本發明之另一態樣有關一種製備在此所定義之化合物之方法，其特徵在於，該方法包含至少一下列步驟，較佳地在以上方法之步驟(a)和/或(b)之後：c1)在Y是HNC(O)NH之情況下，藉由步驟b)後獲得之化合物與異氰酸酯反應，形成尿素，c2)在Y是HNC(S)NH之情況下，藉由步驟b)後獲得之化合物與異硫氰酸酯反應，形成硫脲， c3)在Y是HNSO2之情況下，藉由步驟b)後獲得之化合物與鹵素磺醯基，諸如磺醯氯，之反應，形成磺醯胺，c4)在Y是HNCO或HNC(O)CH2之情況下，藉由使用胜肽偶合技術，使步驟b)後所獲得之化合物與羧酸反應，或與醯基氯反應，形成醯胺，或c5)在Y是HNCS之情況下，藉由步驟c4)後所獲得之化合物與Lawesson氏試劑之反應，形成硫醯胺。
又本發明亦有關一種在此定義之化合物，其特徵在於，其是藥物。
本發明亦有關一種在此所定義之化合物，在諸如下列之疾病中，用作為蛋白質激酶之抑制劑：癌症，更特別的是液態瘤，諸如血液腫瘤，諸如白血病、慢性或急性骨髓增生性疾病；或實體瘤，諸如鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、諸如膠質母細胞瘤與神經纖維瘤之膠質細胞腫瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、黑色素瘤、結直腸癌、子宮內膜癌、涶腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肉瘤和/或星狀細胞瘤以及其它激酶相關的疾病，較佳地免疫失調、發炎性疾病、血栓疾病、神經退化性疾病、骨病、黃斑部退化、纖維化、囊腫生成、過度增生疾病。
本發明亦有關一種藥學組成物，其特徵在於，其含有在此所定義之化合物作為有效成份，以及一藥學上可接受之賦形劑。
定義 大體上，使用下列定義：
本發明中之詞語“胜肽偶合”意指能夠形成醯胺-NH-C(O)-之反應。然而在此反應中使用之技術，在胜肽合成方面係常見的，即，活化羧酸，以便使胺與其反應。因此，雖然在本發明中沒有胜肽形成，但偶合反應係從胜肽合成衍生而來，且直接應用於本發明之標題。
該偶合反應可在冰冷卻之溫度或室溫下，較佳地在諸如二甲胺基吡啶(DMAP)、吡啶、N-羥苯並三唑(HOBt)、1-羥基-7-氮雜苯並三唑(HOAt)、N-羥丁二烯亞胺等等之醯化催化劑之存在下，使用下列配製於諸如乙醚、丙酮、氯仿、二氯甲烷、醋酸乙酯、DMF、四氫呋喃(THF)、乙腈、二甲基亞碸(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)之溶劑中之縮合試劑來進行：諸如N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)或1-乙基-3-(3'-二甲胺基丙基)碳化二亞胺氫氯化物(EDC)，即，水溶性碳化二亞胺、O-(1H-苯並三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)、苯並三唑-1-基-氧三(二甲胺基)膦六氟磷酸鹽(BOP)、O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-1,2,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)、O-苯並三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、O-苯並三唑-1-基-四甲基四氟硼酸鹽(TBTU)、N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二碳化二亞胺，或任何其它偶合劑。
本發明中之詞語"烷基基團"，若沒有特別指示，則意指具有1至6個碳原子之線性或分枝的飽和脂族基團。本發明之範圍涵蓋之烷基基團的例子為甲基、乙基、丙基、 丁基、叔丁基、異丙基基團等等。
本發明中之詞語"環烷基基團"意指具有3至10個碳原子之環烷基基團。本發明之範圍涵蓋之環烷基基團之例子為環丙基、環丁基、環戊基、環己基、甲環己基等等。
本發明中之詞語"芳基基團"意指包含5至10個碳原子之間之環狀(單-或多環)芳族基團。本發明之範圍涵蓋之芳基基團之例子為苯基、萘基等等。
本發明中之詞語"雜芳基基團"意指包含5至10個碳原子之間以及1至3個雜原子(諸如氮、氧或硫)之間之環狀(單-或多環)芳族基團。本發明之範圍涵蓋之雜芳基基團之例子為吡啶、噻吩、噻唑、咪唑、吡唑、吡咯、喹啉、吲哚、噠嗪、喹喔啉、二氫苯並呋喃等等。
本發明中之詞語"非芳族單取代的環狀基團"意指環烷基基團和/或雜環基團。
本發明中之詞語"雜環基團"意指包含5至10個碳原子之間，較佳地2至10個，以及1至3個雜原子(諸如氮、氧以及碳)之間之飽和環狀基團。本發明之範圍涵蓋之雜環基團之例子係嗎啉、四氫呋喃等等。
本發明中之詞語"鹵素原子"意指：氟、氯、溴或碘原子。
本發明中之詞語"烷氧基團"意指結合氧之烷基基團。本發明之範圍涵蓋之烷氧基基團之例子為甲氧基、乙氧基基團等等。
本發明中之詞語"芳氧基基團"意指結合氧原子 之芳基基團。本發明之範圍涵蓋之芳氧基基團之例子為苯氧基等等。
本發明中之詞語"磺醯胺基團"意指：
本發明中之詞語"N-甲基磺醯胺基團"意指：
本發明中之詞語"甲烷磺醯胺基團"意指：
本發明中之詞語"芳烷基基團"意指經芳基基團取代之烷基基團：
本發明中之詞語"C1-C6烷基胺基團"意指經胺基團取代的C1-C6烷基基團：
本發明中之詞語“二級C1-C6烷基胺基團”意指二級胺，即，其可被二個C1-C6烷基基團取代。
本發明中之詞語"羥基基團"意指：OH。
本發明中之詞語"烷氧烷基基團"意指烷基基團， 其較佳地被烷氧基基團取代：
本發明中之詞語"硫烷基基團"意指：
本發明中之詞語"脲基"為尿素或硫脲之通稱。
本發明中之詞語"取代的苯基"意指經下列單或多取代的苯基：- 鹵素原子、- 硝基基團-(NO2)、- 氰基基團(CN)、- 甲噻唑基基團、
- 烷氧基基團、- 芳氧基基團、- 烷基基團、- 磺醯胺基團、- N-甲基磺醯胺基團、- 甲烷磺醯胺基團、- 雜芳基基團、- 羥基基團、- 三級胺基團、 - 基團-CONH烷基、- 基團-NHCO烷基。
本發明之術語"吡啶基"意指從吡啶衍生而來之自由基：
本發明之術語"苯硫基"意指從噻吩衍生而來之自由基：
本發明之術語"噻唑基"意指從噻唑衍生而來之自由基：
本發明之術語"咪唑基"意指從咪唑衍生而來之自由基：
本發明之術語"吡唑基"意指從吡唑衍生而來之自由基：
本發明之術語"喹喔啉"意指：
本發明之術語"二氫苯並呋喃基"意指從二氫苯並呋喃衍生而來之自由基：
本發明之術語"吡咯基"意指從吡咯衍生而來之自由基：
本發明之術語"吲哚基"意指從吲哚衍生而來之自由基：
本發明之術語"噠嗪基"意指從噠嗪衍生而來之自由基：
本發明之術語"N-嗎啉基"意指從嗎啉衍生而來之自由基：
本發明之術語"苯並咪唑基"意指從苯並咪唑衍 生而來之自由基：
本發明之術語"嘧啶基"意指從嘧啶衍生而來之自由基：
本發明中之詞語"1H-吡咯[2,3-b]吡啶基"意指從1H-吡咯[2,3-b]吡啶衍生而來之自由基：
本發明中之詞語"藥學組成物"意指任何包含有效劑量之本發明化合物以及至少一種藥學上可接受之賦形劑之組成物。該賦形劑係依照藥學形式以及所欲投藥之方法，從熟悉此技藝之人士已知之一般賦形劑中選擇。
本發明中之詞語"藥學上可接受之加成鹽"意指如本發明之化合物之藥學上可接受之所有的鹽類，特別是弱酸以及弱鹼之鹽類，例如鹽酸鹽、溴酸鹽、三氟醋酸鹽等等。
本發明中之詞語"鏡像異構物之混合物"意指鏡像異構物之任何混合物。該混合物可為外消旋的，即各鏡像異構物具50/50重量(w/w)%；或非外消旋的，即，鏡像異構物中之一者含量較多，如此鏡像異構物中之一者與另一者相比之重量比率介於50/50%以及75/25%之間，介於 75/25%以及90/10%之間，或高於95%。
本發明中之詞語“非鏡像異構物之混合物”意指任何比例形式之非鏡像異構物之任何混合物。
詞語"治療"意圖針對所有類型之動物，較佳地哺乳動物，更佳地人類。在治療非人類之動物的情況下，指的是獸醫治療。
圖1是說明一些化合物在A549細胞上之抗增生活性之圖表。
圖2是說明一些化合物在HepG2細胞上之抗增生活性之圖表。
圖3是說明一些化合物在HuCCT1細胞上之抗增生活性之圖表。
圖4是說明一些化合物在HuH6選殖株5細胞上之抗增生活性之圖表。
圖5是說明一些化合物在HuH7細胞上之抗增生活性之圖表。
圖6是說明一些化合物在PC-3細胞上之抗增生活性之圖表。
圖7是說明一些化合物在Caki-2細胞上之抗增生活性之圖表。
圖8是說明一些化合物在MDA-MB-231細胞上之抗增生活性之圖表。
圖9是說明一些化合物在HT29細胞上之抗增生活性之 圖表。
圖10是說明一些化合物在BxPC-3細胞上之抗增生活性之圖表。
圖11是說明一些化合物在H1975細胞上之抗增生活性之圖表。
圖12是說明一些化合物在BaF3 BCR-ABL WT細胞上之抗增生活性之圖表。
圖13是說明一些化合物在BaF3 BCR-ABL T315I細胞上之抗增生活性之圖表。
圖14是說明一些化合物在BaF3 BCR-ABL G250A細胞上之抗增生活性之圖表。
圖15是說明一些化合物在BaF3 BCR-ABL G250E細胞上之抗增生活性之圖表。
圖16是說明一些化合物在BaF3 BCR-ABL G250A+E279N細胞上之抗增生活性之圖表。
圖17是說明一些化合物在BaF3 BCR-ABL E255K+M351T細胞上之抗增生活性之圖表。
圖18是說明一些化合物在HUVEC細胞上之抗增生活性之圖表。
圖19是說明腫瘤(BaF3 BCR-ABLT3151)體積(mm3)、小鼠體重隨著時間推進(接種後之天數)減少，以及實驗結束時之腫瘤重量(mg)之圖表。
圖20是說明腫瘤(HepG2)體積(mm3)、小鼠體重隨著時間推進(接種後之天數)減少，以及實驗結束時之腫瘤重量 (mg)之圖表。
圖21是說明腫瘤(H1975)體積(mm3)、小鼠體重隨著時間推進(接種後之天數)減少，以及實驗結束時之腫瘤重量(mg)之圖表。
圖22是說明腫瘤(BxPC-3)體積(mm3)、小鼠體重隨著時間推進(接種後之天數)減少，以及實驗結束時之腫瘤重量(mg)之圖表。
圖23是說明化合物OR0512與B-Raf之激酶功能區之活性位置胺基酸(依照其結晶結構(PDB id=1UWH))間之交互反應(疏水接觸、氫鍵以及芳環堆積)之概略圖。
圖24是說明化合物OR0512與VEGFR2之激酶功能區之活性位置胺基酸(依照其結晶結構(PDB id=4ASD))間之交互反應(疏水接觸、氫鍵以及芳環堆積)之概略圖。
圖25是說明化合物OR0512與EGFR之激酶功能區之活性位置胺基酸(依照此激酶之同源模型)間之交互反應(疏水接觸、氫鍵以及芳環堆積)之概略圖。
圖26是說明化合物OR0512與FGFR2之激酶功能區之活性位置胺基酸(依照此激酶之同源模型)間之交互反應(疏水接觸、氫鍵以及芳環堆積)之概略圖。
較佳實施例之詳細說明 產物
根據一具體例，本發明之式(I)化合物之特徵在於， - R3是擇自於由下列所構成之群組：- 被下列單或多取代的苯基基團：- 羥基，- 鹵素，- C1-C6烷基胺，較佳地二級C1-C6烷基胺，- C1-C6烷氧基，- C1-C6三氟烷氧基，較佳地三氟甲氧基，- C1-C6烷基，較佳地甲基、異丙基，- C1-C6三氟烷基，較佳地三氟甲基，- 雜芳基片段，其任擇地被C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，其中該雜芳基片段係擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶或較佳地被甲基單取代之噻唑基，和/或，- 咪唑，條件為Y是HNC(S)，- 雜芳基基團，其較佳地擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶，任擇地經C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，- 非芳族單取代的環狀基團，較佳地為環狀C3-C10烷基，其係經羥基、鹵素、C1-C6烷基胺、C1-C6烷氧基、C1-C6三氟烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基單取代，以及- 擇自於由下列所構成之群組之片段：
有利地，本發明之式(I)化合物之特徵在於，- X是CH2，- R2是C1-C6烷基或鹵素，以及R1、Y以及R3之定義如上。
根據一具體例，本發明之式(I)化合物之特徵在於，- X是CH2，- R2是C1-C6烷基或鹵素，以及- R3是擇自於由下列所構成之群組：- 被下列單或多取代的苯基基團：- 羥基，- 鹵素，- C1-C6烷基胺，較佳地二級C1-C6烷基胺，- C1-C6烷氧基，- C1-C6三氟烷氧基，較佳地三氟甲氧基，- C1-C6烷基，較佳地甲基、異丙基， - C1-C6三氟烷基，較佳地三氟甲基，- 雜芳基片段，其任擇地被C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，其中該雜芳基片段係擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶或較佳地被甲基單取代之噻唑基，- 咪唑，條件為Y是HNC(S)，- 雜芳基基團，其較佳地擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶，任擇地經C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，更佳地任擇地經甲基單取代之噻唑基，- 非芳族單取代的環狀基團，較佳地為環狀C3-C10烷基，其係經羥基、鹵素、C1-C6烷基胺、C1-C6烷氧基、C1-C6三氟烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基單取代，以及- 擇自於由下列所構成之群組之片段： 以及，R1以及Y是定義如上。
有利地，本發明之式(I)化合物之特徵在於， - R1是C1-C6烷基，較佳地甲基或正丙基，任擇地，R1是氫，- X是CH2，- R2是甲基、氟或氯原子，較佳地甲基或氯原子，- Y是擇自於由下列所構成之群組：HNC(O)、HNC(O)CH2、HNC(O)NH、HNC(S)NH、C(O)NH、C(O)NHCH2以及CH2NHC(O)，- R3是擇自於由下列所構成之群組：- 經下列單取代之苯基基團：C1-C6三氟烷基基團、C1-C6三氟烷氧基基團、C1-C6烷基基團、鹵素或任擇地經CF3和/或甲基基團單取代之噻唑基團，- 經C1-C6三氟烷基、C1-C6烷基胺和/或羥基基團多取代之苯基基團，- 吡啶基團，其任擇地經C1-C6烷基或C1-C6三氟烷基取代，較佳地經甲基和/或三氟甲基取代，- 擇自於環狀C3-C10烷基間之非芳族環狀基團，其經C1-C6烷基和/或C1-C6三氟烷基單取代，以及- 擇自於由下列所構成之群組之片段：
甚至更有利地，該化合物(I)之特徵在於，- R1是C1-C6烷基基團，較佳地甲基、乙基或正丙基，選擇性地，R1是氫原子，- X是CH2，- R2是甲基，- Y是HNC*(O)，其中C*連接至R3以及- R3係擇自於由下列所構成之群組：
根據本發明之較佳具體例，式(I)化合物明確地以式(II)化合物，和/或其藥學上可接受之加成鹽、鏡像異構物、非鏡像異構物，以及其等之混合物界定：
特徵在於，- R1是C1-C6烷基，選擇性地，R1是氫原子，- X是CH2或C=O，- R2是氫、C1-C6烷基或鹵素， - Y是擇自於由下列所構成之群組：HNC(O)、HNC(S)、HNSO2、HNC(O)CH2、HNC(O)NH、HNC(S)NH、C(O)NH、C(O)NHCH2、CH2NHC(O)以及CH2NHC(S)，- R3是擇自於由下列所構成之群組：- 由下列單或多取代之苯基基團：- 羥基，- 鹵素，- C1-C6烷基胺，較佳地二級C1-C6烷基胺，- C1-C6烷氧基，- C1-C6三氟烷氧基，較佳地三氟甲氧基，- C1-C6烷基，較佳地甲基、異丙基，- C1-C6三氟烷基，較佳地三氟甲基，- 雜芳基片段，其任擇地經C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，其中該雜芳基片段擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶或噻唑，較佳地經甲基單取代，和/或- 咪唑，條件為Y是HNC(S)，- 雜芳基團，其較佳地擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶，任擇地經C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，更佳地經甲基單取代之噻唑，- 非芳族單取代的環狀基團，較佳地為環狀C3-C10烷基，其係經羥基、鹵素、C1-C6烷基胺、C1-C6 烷氧基、C1-C6三氟烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基單取代，以及- 擇自於由下列所構成之群組之片段：
根據本發明之較佳具體例，式(II)化合物：
特徵在於，- R1是甲基，選擇性地，R1是氫原子，- X是CH2，- R2是甲基，- Y是HNC*(O)，其中C*連接至R3，以及- R3是擇自於由下列所構成之群組： ，較佳地R3是：
在本發明之另一具體例中，所有以上詳述之特定的具體例之特徵亦可為，X由CH2換成C=O。
在此所揭示之全部式(I)或(II)化合物，可為其藥學上可接受之加成鹽、鏡像異構物、非鏡像異構物，以及其等之混合物。
本發明中之所有的化合物可呈溶劑化形式以及非溶劑化形式。
產物之合成
本發明亦有關以上化合物之製備方法，從5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯開始。
在第一具體例中，本發明之方法示於圖解1中。主要中間產物胺化合物之一般的合成方法，甚至示於圖解1中：
a)該方法包含至少一種活化劑，諸如2-(7-氮雜-1H-苯並三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)，存在諸如二異丙基乙胺(DIEA)之鹼、諸如二環己基碳化二亞胺(DCC)之碳化二亞胺。此等偶合反應係熟悉此技藝之人士熟知的。
b)在氫化硼之存在下，5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯與各種芳族醛之還原胺化反應，獲得對應的苯甲基型胺類(Wang,Dong Mei et al Journal of Combinatorial Chemistry,2009,11(4.),556-575)
c)在氫環境下，於鈀碳之存在下，所產生之硝基化合物之催化氫化反應(Seela,F.,Gumbiowski,R.Heterocycles,1989,29(4),795-805)。
較佳地，該方法包含一或數個下列圖解2中更明確的步驟a)b)c)：
其中，R2之定義如前。
較佳的方法包含至少一下列步驟：a)使用2-(7-氮雜-1H-苯並三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)以及二異丙基乙胺(DIEA)之胜肽偶合反應，b)在氫化硼之存在下，5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯與各種芳族醛之還原胺化反應，獲得對應的苯甲基型胺類(Wang,Dong Mei et al Journal of Combinatorial Chemistry,2009,11(4),556-575)，c)在氫環境中，鈀碳之存在下，所產生之硝基化合物之催化氫化反應(Seela,F.,Gumbiowski,R.Heterocycles,1989,29(4),795-805)。
熟悉此技藝之人士自然能使用所有其它熟知之技術，來獲得此等類型之化合物。
在另一具體例中，該方法示於圖解3中。
關於以上所揭示之尿素或硫脲化合物之合成方法，其中之一示於圖解3中：
其中，R2、R3以及X之定義如上，而Y是O或S。
用於合成尿素或硫脲化合物之較佳的方法因此包含至少下列之步驟： d)該主要中間產物胺化合物與各種異氰酸酯或硫代異氰酸酯之反應。
熟悉此技藝之人士自然能使用所有其它已知的合成技術來獲得此等類型之(硫)脲化合物。
在另一具體例中，該方法示於圖解4中。
關於磺醯胺化合物之合成方法，其中之一方法示於圖解4中。
其中R2、R3以及X之定義如上。
此用於合成磺醯胺化合物之方法包含至少一下列步驟：e)該主要中間產物胺化合物與各種磺醯氯之反應。
熟悉此技藝之人士自然可以使用所有其它已知之合成技術，來獲得此等類型之磺醯胺化合物。
在另一具體例中，該方法示於圖解5中。
關於醯胺化合物之合成方法，其中之二種方法示於圖解5中： 圖解5
其中，R2、R3以及X之定義如上。
圖解5之方法包含至少一下列步驟：f)該主要中間產物胺化合物與各種醯基氯或羧酸類之反應(Mouaddib,A.,Joseph,B.et al.,Synthesis,2000,(4),549-556)。
熟悉此技藝之人士自然可以使用所有其它已知之合成技術，來獲得此等類型之醯胺化合物。
在另一具體例中，該方法示於圖解6中。
關於以下所揭示之硫脲化合物之合成方法，其中之一方法示於圖解6中：
用於合成該硫醯胺化合物之較佳的方法因此包含至少一下列步驟：g)該主要中間產物醯胺化合物與Lawesson氏試劑之反應。
第六個具體例有關依照下列圖解7、圖解8、圖解9和/或圖解10，用於合成非市售可得之羧酸類之方法。
4-胺乙基-3-三氟甲基-苯甲酸或4-胺甲基-3-氟苯甲酸
於本發明中，用於合成4-胺甲基-3-三氟甲基-苯甲酸或4-胺甲基-3-氟苯甲酸之方法示於圖解7中：
其中NR4R5代表：或
用於合成4-胺甲基-3-三氟甲基-苯甲酸以及4-胺甲基-3-氟苯甲酸之較佳的方法，包含至少一下列步驟：h)主要4-甲基-苯甲酸，較佳地於甲醇中，有利地於酸介中之酯化作用，獲得該含甲基之酯，i)較佳地利用N-溴琥珀醯亞胺(NBS)進行該甲基基團之自由基溴化反應，最好在作為自由基抑制劑之偶氮二異丁腈(AIBN)之存在下(Sun,Yewei et al,Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,16(19),8868-8874)，j)利用各種一級以及二級胺進行之溴取代反應，k)該酯，較佳地含甲基之酯的皂化反應。
熟悉此技藝之人士自然可以使用所有其它已知之合成技術，來獲得4-胺甲基-3-三氟甲基-苯甲酸或4-胺甲基-3-氟基-苯甲酸，然而該方法較佳地包含數個或甚至所 有的步驟g)、h)、i)以及j)。
3-胺基-5-三氟甲基-苯甲酸
用於合成3-胺基-5-三氟甲基-苯甲酸之方法示於圖解8中：
其中NR6R7代表：或
用於合成3-胺基-5-三氟甲基-苯甲酸之方法包含至少一下列步驟：l)利用各種一級以及二級胺之氟取代反應，m)將該腈官能基變成對應的羧酸之水解反應。
熟悉此技藝之人士自然可以使用所有其它已知之合成技術，來獲得3-胺基-5-三氟甲基-苯甲酸，然而該方法較佳地包含步驟l)以及m)二者。
5-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基苯甲酸
可於本發明中用於合成5-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基苯甲酸之方法示於圖解9中：
該方法包含至少一下列步驟： n)在作為自由基抑制劑之偶氮二異丁腈(AIBN)之存在下，利用N-溴琥珀醯亞胺(NBS)進行該甲基基團之自由基溴化反應(Sun,Yewei et al,Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,16(19),8868-8874)，o)利用N-甲基哌嗪之溴取代反應，p)將該腈官能基變成對應的羧酸之水解反應。
熟悉此技藝之人士自然可以使用所有其它已知之合成技術，來獲得5-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基苯甲酸，然而該方法較佳地包含數個或甚至全部的步驟n)、o)以及p)。
3-二甲胺基-5-三氟甲基-苯甲酸
可用於合成本發明中使用之3-二甲胺基-5-甲基-苯甲酸之方法示於圖解10中：
該方法包含至少一下列步驟：q)較佳地利用碘甲烷，進行酸以及胺官能基之全甲基化反應，r)所產生之酯之皂化反應，獲得對應的羧酸。
熟悉此技藝之人士自然可以使用所有其它已知之合成技術，來獲得3-二甲胺基-5-三氟甲基-苯甲酸，然而該方法較佳地包含步驟q)以及r)中之一者或二者。
另一具體例有關依照下列圖解11，合成5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸烷酯之方法：
較佳地，該方法包含至少一下列步驟：s)5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三甲基苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之皂化反應，獲得其羧酸衍生物，t)利用配製於烷醇中之亞硫醯氯或硫酸，進行所產生之羧酸之酯化反應。
熟悉此技藝之人士自然可以使用所有其它已知之合成技術，來獲得5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸烷酯，然而該方法較佳地包含步驟s)以及t)二者。
另一具體例有關依照下列圖解12合成5-(3-{[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-甲基}-苯甲醯胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯或5-{3-[(3-三氟甲基-硫代苯甲醯胺基)-甲基]-苯甲醯胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之方法： 其中R3代表：或圖解12
較佳地，該方法包含至少下列步驟：u)3-胺甲基-苯甲酸甲酯與羧酸之胜肽偶合反應，v)該主要中間產物醯胺化合物與Lawesson氏試劑之反應，w)所產生之酯之皂化反應，獲得對應的羧酸，x)該主要羧酸化合物與5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之胜肽偶合反應。
另一具體例有關依照下列圖解13合成5-[3-(3-三氟甲基-苯甲胺基甲醯基)-苯甲胺基]-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯或5-{3-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯胺甲醯基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之方法： 其中R4代表：依照Weijun Shen and al.(J.Am.Chem.Soc.,2013,135(5),pp 1669-1672)中所述之程序製得之或圖解13
較佳地，該方法包含至少下列步驟：y)3-氰基-苯甲酸與胺化合物之胜肽偶合反應，z)該所產生之腈變成對應的醛之還原反應，aa)主要的醛化合物與5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之還原胺化反應。
用途
本發明亦有關本發明之化合物，作為蛋白質激酶之抑制劑之用途。取決於癌症類型，標的可為一或數種激酶蛋白質。
在一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶BRAF之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用為蛋白質激酶EGFR(ErbB1)之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶EGFR(ErbB1)T790M L858R之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶FGFR2之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶KDR(VEGFR2)之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶PDGFRA(PDGFR α)之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶SRC之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶ABL之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶ABL T315I之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶FGFR1之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶VEGFR1之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶PDGFRB(PDGFR β)之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶ABL E255K之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶ABL G250E之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶ABL Y253F之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶ABL2之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶BLK之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶BMX之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶BRAF V600E之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶BTK之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶CSK之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶EPHA1之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶EPHA2之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶EPHA4之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶EPHB2之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶EPHB4之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶HER2之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶ERBB4之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶FES之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶FGR之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶FLT3之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶FMS之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶FRK之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶FYN之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶HCK之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶LCK之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶LYN之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶MAPK14之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶ERK2之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶PKC θ之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶RET之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶VEGFR3之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為蛋白質激酶YES之抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為A549癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為HepG2癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為HuCCT1癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為HuH6選殖株5癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為HuH7癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為PC-3癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為Caki-2癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為MDA-MB-231癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為HT29癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為BxPC-3癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為H1975癌細胞株之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為BaF3 WT之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為BaF3 T315I之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為BaF3 G250A之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為BaF3 G250E之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為BaF3 G250A+E279N之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為BaF3 E255K+M351T之增生的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為HUVEC原代細胞之增生以及移動的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為HRMEC原代細胞之增生以及移動的抑制劑。
在另一具體例中，本發明之化合物可用作為HeLa癌細胞株之增生以及移動的抑制劑。
本發明之化合物以及理所當然地包含此化合物之藥學組成物，可用於治療與蛋白質激酶反常相關之病理症狀：- 免疫病症、發炎性疾病、血栓疾病、神經退化性疾病、 骨病、黃斑部退化、纖維化、囊腫生成、過度增生疾病之情況，- 所有的癌症之情況，更特別地為諸如血癌之液態瘤，諸如白血病、慢性或急性骨髓增生病症，或實體瘤，諸如鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、膠細胞腫瘤，諸如膠質母細胞瘤以及神經纖維瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、黑色素瘤、結直腸癌、子宮內膜癌、涶腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肉瘤和/或星狀細胞瘤，- 慢性或急性骨髓增生病症之情況，諸如某些白血病，- 肝、肺、前列腺、腎、乳房、胰臟以及結直腸胃腸癌之情況。
有利地，本發明之化合物以及理所當然地包含此等化合物之藥學組成物，可用於治療疾病情況與蛋白質激酶反常相關之病理症狀，其中該等疾病是擇自於由下列所構成之群組：肝癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、白血病、腎癌、子宮內膜癌、結直腸癌、化療抗性癌以及黃斑部退化。
根據另一態樣，本發明有關一種包含如本發明之化合物作為活性成分之藥物。因此，如本發明之化合物可用作為用於治療與蛋白質激酶反常相關之病理病狀：- 免疫病症、發炎性疾病、血栓疾病、神經退化疾病、骨病、黃斑部退化、纖維化、囊腫生成、過度增生疾病之情況， - 所有的癌症之情況，更特別地為諸如血癌之液態瘤，諸如白血病、慢性或急性骨髓增生病症，或實體瘤，諸如鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、膠細胞腫瘤，諸如膠質母細胞瘤以及神經纖維瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、黑色素瘤、結直腸癌、子宮內膜癌、涶腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肉瘤和/或星狀細胞瘤，- 慢性或急性骨髓增生病症之情況，諸如某些白血病，- 肝、肺、前列腺、腎、乳房、胰臟以及結直腸胃腸癌之情況。
如本發明之組成物可用於治療與蛋白質激酶反常相關之病理病狀：
- 免疫病症、發炎性疾病、血栓疾病、神經退化性疾病、骨病、黃斑部退化、纖維化、囊腫生成、過度增生疾病之情況。
- 所有的癌症之情況，更特別地為諸如血癌之液態瘤，諸如白血病、慢性或急性骨髓增生病症，或實體瘤，諸如鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、膠細胞腫瘤，諸如膠質母細胞瘤以及神經纖維瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、黑色素瘤、結直腸癌、子宮內膜癌、涶腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肉瘤和/或星狀細胞瘤。
- 慢性或急性骨髓增生病症之情況，諸如某些白血病，
- 肝、肺、前列腺、腎、乳房、胰臟以及結直腸胃腸癌 之情況。
再者，有利地，如本發明之化合物可用於抑制涉及人類或動物疾病之細胞增生和/或血管生成。
相同地，如本發明之組成物可用抑制涉及人類或動物疾病之細胞增生和/或血管生成。
本發明之另一態樣有關一種基本上安全以及有效的使用如本發明之化合物，以提供資訊之活體外方法(活體外診斷元件或影像工具)。舉例而言，該方法使能夠預測需要治療，諸如出現癌症之病人，是否可能會對如本發明之化合物中之至少一個產生反應，其方法包含測定該病人之樣本中至少一種蛋白質激酶之蛋白的表達位準、基因修飾(擴增、突變)、活性狀態或突變形式之外觀，其中該蛋白質激酶係擇自於下列激酶列表：BRAF、EGFR、FGFR2、KDR、PDGFRA、SRC、ABL、FGFR1、VEGFR1、PDGFRB(PDGFR β)、ABL2、BLK、BMX、BTK、CSK、EPHA1、EPHA2、EPHA4、EPHB2、EPHB4、HER2、ERBB4、FES、FGR、FLT3、FMS、FRK、FYN、HCK、LCK、LYN、MAPK14、ERK2、PKC θ、RET、VEGFR3以及YES。
該蛋白質激酶之表達位準、基因修飾(擴增、突變)、活性狀態或突變形式之外觀，典型地係利用一般已知之方法測定(見例如經FDA核準之醫學設備之活體外影像工具：http：//www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)，諸如即時PCR、免疫組織化學、ELISA、原位雜交螢光(FISH)、色素原位雜交 (CISH)。
本發明之另一態樣有關一種用於預測本發明中至少一種可對需要治療，諸如出現癌症之病人投藥之化合物之活體外方法，其特徵在於，其包含下列步驟：a)使該化合物與人類組織或細胞之樣本接觸，b)透過例如IC50和/或透過所存在之蛋白質激酶之活性比較，測定化合物在該樣本上之活性，該蛋白質激酶可擇自於下列激酶列表：BRAF、EGFR、EGFR T790M L858R、FGFR2、KDR、PDGFRA、SRC、ABL、ABL T315I、FGFR1、VEGFR1、PDGFRB、ABL E255K、ABL G250E、ABL Y253F、ABL2、BLK、BMX、BRAF V600E、BTK、CSK、EPHA1、EPHA2、EPHA4、EPHB2、EPHB4、HER2、ERBB4、FES、FGR、FLT3、FMS、FRK、FYN、HCK、LCK、LYN、MAPK14、ERK2、PKC θ、RET、VEGFR3以及YES；c)任擇地以健康的細胞，諸如該病人之血液細胞或幹細胞或肝細胞，進行與步驟a)相同的試驗，測定如本發明之化合物對健康細胞之毒性(即，不會出現任何的病理態樣/特性)；d)在本發明中，選擇可投與至需要治療之病人，呈現最佳活性和/或實際上最低毒性之化合物。
用於測定蛋白質激酶之方法係傳統上已知的(如Rosen et al.,,J Biol Chem.,15；261(29),13754-9.1986；Ma et al.,Expert Opin Drug Discov.,3(6),607-621,2008中之記述)。
範例
閱讀下列範例後將能夠更了解本發明。
本發明之化合物係在多階段合成法中獲得之5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(可從OriBase Pharma公司購得)，需要時，可使用平行合成裝置("Synthesis 1"，Heidolph)。各種合成操作程序以及所獲得之7-氮雜吲哚類化合物之物化特性詳述於下。
合成以及分析方法以下列條件進行：
- 1H以及13C核磁共振：儀器：Bruker Avance 400(400MHz)；Bruker Avance 300(300MHz)；Bruker DPX 200(200MHz)
使用條件：室溫(RT)、化學位移以百萬分之部分(ppm)表示、偶合常數(J)以赫茲表示、內部參考三甲基矽烷(TMS)、訊號之多重性以小寫字母表示(單峰s、寬單峰bs、雙峰d、三峰t、四峰q、多重峰m)、二甲基亞碸d6、甲酶d4、氯仿d1為氘化溶劑。
- 高效能液相層析法(HPLC)：儀器：Agilent Technology 1260 Infinity
使用條件：Zorbax SB-C18，2.1 x 50mm，1.8μm；溫度：30℃、水/乙腈/甲酸洗提梯度(90%/10%/0.1%至0%/100%/0.1%)
- 質譜分析法(MS)：儀器：Quadripole Agilent Technologies 6120
使用條件：電噴射(ESI)，正和/或負模式。
- 稱重：儀器：Denver Instrument TP214(精密度0.1mg)
使用條件：重量稱至最接近的毫克值。
- 平行合成法：儀器：Heidolph Synthesis 1(16個反應器)
使用條件：16個平行反應，室溫，多效蒸發。
- 在壓力下的反應：儀器：Parr 300mL高壓反應器。
使用條件：在20或30巴氫氣下進行氫化反應。
合成方法 範例A：3步驟合成5-{2-甲基-5-[3-脲基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯，從OriBase Pharma公司購得之試劑開始
圖解14說明5-{2-甲基-5-[3-脲基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般的合成方法。
步驟1：用於製備5-(2-甲基-5-硝基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般的操作程序。
使5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(12.16g，63.7mol)以及2-甲基-5-硝苯甲醛(10.5g，63.7mol) 在配製於MeOH中之AcOH 10%中攪拌2個小時。之後，慢慢地加入NaBH3CN(7.9g，127.3mol)，以及該混合物在氬氣中攪拌48個小時。使溶劑蒸發掉，加入飽和NaHCO3溶液直到呈中性。過濾所形成之固體物，用石油醚/EtOAc 5/5清洗。獲得棕色固體物，5-(5-胺基-2-甲基苯甲硝基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(17.9g，53.9mmol)。產率=82%。ESI-MS：m/z 341([M+H]+)。HPLC純度：80%
步驟2：用於製備5-(5-胺基-2-甲基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般的操作程序。
將5-(2-甲基-5-硝基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(17.8g，53.9mmol)、甲醇(300mL)、7.2mL之HCl 12N以及10%之鈀碳(1.7g，10% w/w)，置於充填30巴氫氣之高壓反應器中，攪拌48個小時。在矽藻土上過濾混合物，用甲醇清洗。使溶劑蒸發掉，之後加入NaHCO3(水溶液)。過濾所獲得之固體物，用水清洗，獲得棕色固體物(14.4g，46.4mmol)。產率=96%。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ 12.03(s,1H),8.08(d,J=2.6Hz,1H),6.95(d,J=2.7Hz,1H),6.90(s,1H),6.83(d,J=8.0Hz,1H),6.57(d,J=2.3Hz,1H),6.36(dd,J=2.3Hz,1H),5.94(s,1H),4.77(s,2H),4.07(d,J=5.3Hz,2H),3.83(s,4H)。ESI-MS：m/z 311([M+H]+)。HPLC純度：95%。
步驟3：製備5-{2-甲基-5-[3-脲基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般操作程序。
於5-(5-胺基-2-甲基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b] 吡啶-2-羧酸甲酯之溶液中，加入異氰酸酯或異硫氰酸酯衍生物(1當量)。令該混合物在室溫下攪拌一整夜。移除溶劑，用矽膠色層分析法純化粗製產物。
表1顯示各種依照以上圖解14中所述之合成法合成之化合物。
範例B：1階段合成5-[2-甲基-5-(磺醯胺基)-苯甲胺基]-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
圖解15說明從在範例A中敘述之胺基衍生物，合成5-[2-甲基-5-(磺醯胺基)-苯甲胺基]-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般方法。
步驟1：合成5-[2-甲基-5-(磺醯胺基)-苯甲胺基]-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
將20μL之三甲胺(1.1當量)，加至配製於2mL無水DMF中之5-(5-胺基-2-甲基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(40mg，0.13mmol)冰溶液中。之後逐滴加入配製於2mL無水DMF中之磺醯氯衍生物(1.2當量)冰溶液。使反應物在0℃下攪拌30分鐘，且在室溫下一整夜。使DMF蒸發掉，之後加入飽和的NaHCO3溶液。過濾所獲得之固體物，用水清洗，獲得黃色固體物。
表2顯示依照以上所述之合成圖解15合成之化合物。
範例C：1階段合成5-{2-甲基-5-[3-醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
圖解16說明1步驟合成5-{2-甲基-5-[3-醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般方法。此步驟包含5-(5-胺基-2-甲基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯與醯基氯化物，或者是羧酸之反應。
選項1：利用與醯基氯化物之反應，合成5-{2-甲基-5-[3-醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
將55μL之三甲胺(3當量)以及1.5當量之醯基氯化物，加至配製於無水DMF中之5-(5-胺基-2-甲基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(40mg，0.13mmol)溶液中。在室溫下攪拌反應混合物一整夜。使DMF蒸發掉；取出固體物，置於醋酸乙酯中。用飽和NaHCO3溶液清洗有機層，透過Na2SO4乾燥，且在減壓下蒸發，獲得黃色固體狀物。
表3顯示依照上述合成圖解16，選項1，合成之化合物(即，醯基氯化物之反應)。
選項2：利用與羧酸之反應，合成5-{2-甲基-5-[3-醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
涉及此合成反應之所有的羧酸均不是市面上可購得的。首先，先說明合成此等所需的羧酸之方法：
合成4-胺甲基-3-取代的苯甲酸
圖解17說明用於合成4-胺甲基-3-取代的苯甲酸之一般方法。
酯化反應之一般程序：
攪拌配製於甲醇(50mL)中之4-甲基-3-取代的苯甲酸(24mmol)以及H2SO4(0.260mL，4.8mmol)，以及加熱至回流，歷時一整夜。使甲醇蒸發掉，在pH=7下，以EtOAc萃取產物。
4-甲基-3-三氟甲基-苯甲酸甲酯。
產率=95%。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.25(s,1H),8.04(dd,J=1.2,8.0,1H),7.33(d,J=8.0,1H),3.91(s,3H),2.51(d,J=1.5,3H)。
4-甲基-3-氟基-苯甲酸甲酯。
產率=83%(4.0g)，HPLC：98%，ESI-MS：[M+H]+=169Da。
溴化反應之一般程序：
攪拌配製於帶有NBS(3.9g，22mmol)之CCl4(40mL)以及帶有25%水之過氧化苯甲醯(0.55g，1.7mmole)中之4-甲基-3-取代的苯甲酸甲酯(18.3mmol)，然後加熱至回流，歷時6個小時。使溶劑蒸發掉，加入K2CO3水溶液，用EtOAc萃取產物，獲得淡黃色固體物。
4-(溴甲基)-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯
產率=140%(粗製)。
4-(溴甲基)-3-氟基苯甲酸甲酯
產率=數量(5.9g)，ESI-MS：[M+H]+=247Da。在溴甲基上親核取代之一般程序：攪拌配製於帶有K2CO3(1.5當量)以及胺衍生物(1.05當量)之乙腈(5mL)中之4-(溴甲基)-3-取代的苯甲酸甲酯(200mg)，且在氬氣中加熱至回流一整夜。使乙腈蒸發掉，加入(30mL)之水，用AcOEt萃取產物。用水清洗有機層，乾燥、過濾以及濃縮。利用矽膠色層分析法進行進一步的純化，獲得所預期的產物。
4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲酸甲酯：產率=54%(1.75g)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.28(s,1H),8.16(d,J=8.1,1H),7.91(d,J=8.1,1H),3.93(s,3H),3.70(s,2H),2.53(s,8H),2.32(s,3H)。ESI-MS：[M+H]+=317Da。
3-氟基-4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-苯甲酸甲酯：產率=49%(1.48g)。HPLC：88%，ESI-MS：[M+H]+=267Da。
4-(4-甲氧羰基-2-三氟甲基-苯甲基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
產率：56%(1.89g)。HPLC：97%。ESI-MS：[M+H]+=403Da。
4-嗎啉-4-基甲基-3-三氟甲基-苯甲酸甲酯
產率：23%(343mg)。HPLC：95%。ESI-MS：[M+H]+=305Da。
4-(4-羥基-哌啶-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲酸甲酯
產率：39%(84mg)。ESI-MS：[M+H]+=318.1Da。
4-{[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙胺基]-甲基}-3-三氟甲基-苯甲酸甲酯
產率：20%(50mg)。ESI-MS：[M+H]+=360.1Da。
4-(4-甲基-咪唑-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲酸甲酯
產率：44%(90mg)。HPLC：87% ESI-MS：[M+H]+=299Da。
4-(3-二甲胺基-吡咯烷-1-基甲基)-3-氟基-苯甲酸甲酯
產率：60%(2g)。HPLC：85% ESI-MS：[M+H]+=281Da。
皂化反應之一般程序：
將酯衍生物溶於THF(0.8mol/L)中，然後加入LiOH(3當量)之水溶液。將混合物加熱至回流，歷時4個小時。使THF蒸發掉，用EtOAc，在pH=12下萃取雜質。用NaCl(s)飽和水層，用HCl 6N酸化直到pH=3。用丁-1-醇萃取產物。使丁-1-醇蒸發掉，用EtOAc清洗所獲得之固體物，以便移除鹽以及雜質。獲得白色固體物。
4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲酸：產率=100%(1.21g)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ 10.44(m,1H),8.19(s,1H),8.18(m,1H),7.93 (m,1H),3.79(s,2H),2.75(s,3H)。ESI-MS：[M+H]+=303Da。
3-氟基-4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-苯甲酸：產率=65%(0.91g)。HPLC：>99%，ESI-MS：[M+H]+=253Da。
4-(4-羧基-2-三氟甲基-苯甲基)-哌嗪-1-羧酸
產率：57%(265mg)。HPLC：97% ESI-MS：[M+H]+=389Da。
4-嗎啉-4-基甲基-3-三氟甲基-苯甲酸
產率：35%(114mg)。ESI-MS：[M+H]+=290Da。
4-(4-羥基-哌啶-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲酸
產率：94%(128mg)。ESI-MS：[M+H]+=304.1Da。
4-{[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙胺基]-甲基}-3-三氟甲基-苯甲酸
產率：95%(176mg)。ESI-MS：[M+H]+=346.1Da。
4-(4-甲基-咪唑-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲酸
產率：99%(224mg)。ESI-MS：[M+H]+=285Da。
4-(3-二甲胺基-吡咯烷-1-基甲基)-3-氟基-苯甲酸
產率：36%(687mg)。ESI-MS：[M+H]+=267Da。
合成3-胺甲基-5-三氟甲基-苯甲酸
圖解18說明用於合成[3-胺基]-5-三氟甲基-苯甲酸之一般方法。
新核取代反應之一般程序：
使配製於DMA中之3-氟基-5-三氟甲基-苯甲腈(1當量)以及對應的胺(3當量)在145℃下攪拌，期間3個小時。加入NaCl(水溶液)。取出產物，置於醋酸乙酯中。用水清洗有機層二次，之後透過Na2SO4乾燥，在減壓下蒸發，得到黃色固體物。
3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-三氟甲基-苯甲腈
產率：數量。HPLC：94% ESI-MS：[M+H]+=270Da。
3-(1H-吡唑-3-基胺基)-5-三氟甲基-苯甲腈
產率：83%。HPLC：92% ESI-MS：[M+H]+=253Da。
腈之水解反應之一般程序：
於配製於二噁烷(0,13M)中之腈衍生物之溶液中，加入配製於H2O中之NaOH(10當量，1g/L)。在回流溫度下加熱該混合物一整夜。在二噁烷蒸發後，用AcOEt清洗水相，之後用HCl 2N酸化，用AcOEt萃取。透過Na2SO4乾燥有機層，過濾以及濃縮。
3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-5-三氟甲基-苯甲酸
產率：60%。HPLC：100%。ESI-MS：[M+H]+=289 Da。
3-(1H-吡唑-3-基胺基)-5-三氟甲基-苯甲酸
黃色固體物。產率：76%(85mg)。HPLC：100%。ESI-MS：[M+H]+=272Da。
合成3-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯甲酸
圖解19說明3步驟合成3-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯甲酸之一般方法，從3-甲基-5-三氟甲基-苯甲腈開始。
3-溴甲基-5-三氟甲基-苯甲腈
攪拌配製於帶有AIBN(0,017當量)之MeCN(0,42mol/L，1當量)中之3-甲基-5-三氟甲基-苯甲腈，在氬氣中在85℃下加熱。每15分鐘加入0,25當量之NBS以及0,005當量之AIBN，加6次(每次之添加在50℃下進行，之後再於85℃下加熱混合物)。添加後，攪拌混合物，保持在85℃下2個小時。在減壓下使MeCN蒸發掉，用Et2O清洗固體狀物，而溴化物衍生物在濾液中。在減壓下使Et2O蒸發掉，獲得粉紅色固體狀物。直接將粗製之產物用於下個步驟。產率：沒有測定。HPLC純度：沒有測定。ESI-MS：[M+H]+=264Da。
3-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯甲腈
攪拌配製於帶有K2CO3(2,5當量)以及甲基哌嗪 (1,5當量)之MeCN(0,17mol/L，1當量)中之3-溴甲基-5-三氟甲基-苯甲腈，然後在氬氣中回流下加熱一整夜。加入水。取出產物，置於醋酸乙酯中。透過Na2SO4乾燥有機層，且在減壓下蒸發。粗製產物直接用於下個步驟。粗製產率：21%。
3-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯甲酸
於配製於二噁烷(0,13M)中之3-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-5-三氟甲基-苯甲腈溶液中，加入配製於H2O中之NaOH(10當量，1g/L)，在回流溫度下加熱該混合物一整夜。在減壓下使二噁烷蒸發，過濾在H2O中之沈澱物，用H2O清洗。重新取回濾液，然後移除水，獲得白色固體物。用MeOH清洗，取回濾液，在減壓下濃縮。在40g之矽膠上，用帶有1% NEt3之CH2Cl2至帶有1% NEt3之MeOH，純化粗製產物。在減壓下濃縮取回的區段，用石油醚/AcOEt(1/1)之混合物清洗獲得之固體物。產率：83%。HPLC純度：100%。ESI-MS：[M+H]+=303Da。
合成3-二甲胺基-5-三氟甲基-苯甲酸
用於合成3-二甲胺基-5-甲基-苯甲酸之方法示於圖解20之2步驟中：
3-二甲胺基-5-三氟甲基-苯甲酸甲酯
將K2CO3(400mg，3當量)以及甲基碘(0.6mL，7 當量)，加至配製於乙腈(8mL)中之3-胺基-5-三氟甲基-苯甲酸(200mg，0.96mmol)溶液中。在回流溫度下加熱反應混合物2天。溶劑蒸發後得到230mg之粗製3-二甲胺基-5-三氟甲基-苯甲酸甲酯，其在沒有進一步純化之情況下使用。
LC/MS：97%，[M+H]+=248.1Da。
3-二甲胺基-5-三氟甲基-苯甲酸
於配製於THF(2mL)中之3-二甲胺基-5-三氟甲基-苯甲酸甲酯(240mg)溶液中，加入配製於水(2ml)中之LiOH(3當量)溶液。在回流溫度下攪拌混合物4個小時。之後使THF蒸發掉；加入更多的水，以及用HCl 2N酸化。用AcOEt萃取產物、透過Na2SO4乾燥以及濃縮，獲得白色固體物。
產率：82%(183mg)，LC/MS：90%，[M+H]+=234Da。
用於製備5-{2-甲基-5-[3-醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般操作程序
將酸衍生物溶於帶有DIEA(5當量)以及HATU(2當量)之無水DMF(0.06mol/L)中。15分鐘後，慢慢地加入5-{2-甲基-5-[3-胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯，在室溫下攪拌混合物12個小時。使DMF蒸發，加入飽和NaHCO3溶液。用EtOAc萃取產物、乾燥、過濾以及蒸發，獲得暗色混合物。藉由用MeOH或EtOAc清洗或用二氧化矽管柱純化後，獲得呈淡黃色或橘色粉末狀之預期產物。
表4顯示依照以上所述合成圖解16，選項2，合成 之化合物(即，羧酸之反應)。
範例D：3階段合成5-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯，從由OriBase Pharma公司購得之試劑開始
圖解21說明3步驟合成5-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般方法。
步驟1：製備5-(3-硝基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般操作程序
使5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(100mg)以及硝基苯甲醛衍生物(1當量)，在MeOH以及AcOH(10%)之混合物中攪拌2個小時。之後慢慢加入NaBH3CN(2當量)，在氬氣中，室溫下攪拌該混合物一整夜。 使溶劑蒸發掉，加入NaHCO3之飽和溶液直到中和。用EtOAc萃取水層。透過Na2SO4乾燥有機層，過濾以及濃縮，得到所欲期之產物。
5-(2-氯基-5-硝基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
黃色粉末。產率：85%(158mg)。HPLC：80%。MS：361(M+1)。
5-(2-氟基-5-硝基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
黃色固體物。產率：74%(800mg)。HPLC：>99%。MS：345(M+1)。
5-(3-硝基-4-甲基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
黃色固體物。產率：86%(152mg)。HPLC：85%。MS：341(M+1)。
5-(3-硝基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
棕色粉末。產率：87%(443mg)。HPLC：94%。MS：327(M+1)。
步驟2：製備5-(3-胺基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般操作程序
將5-(硝基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯衍生物(200mg)、甲醇(150mL)以及10%鈀碳(10% w/w)，置於充填有30巴氫氣之高壓反應器中，攪拌48個小時。在矽藻土上過濾混合物，用甲醇清洗。使溶劑蒸發掉， 獲得預期的產物。
5-(5-胺基-3-氯基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
黃色粉末。產率：99%(183mg)。HPLC：77%。MS：331(M+1)。
5-(5-胺基-3-氟基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
棕色粉末。產率：43%(311mg)。HPLC：93%。MS：315(M+1)。
5-(3-胺基-4-甲基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
黃色粉末。產率：90%(240mg)。HPLC：85%。MS：311(M+1)。
5-(3-胺基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
灰白色粉末。產率：87%(351mg)。HPLC：99%。MS：297(M+1)。
步驟3：製備5-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般操作程序
將4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲酸，溶於帶有DIEA(5當量)以及HATU(2當量)之無水DMF(0.06mol/L)中。15分鐘後，慢慢加入胺衍生物，在室溫下攪拌混合物12個小時。使DMF蒸發掉，加入NaHCO3(水溶液)。用EtOAc萃取產物、乾燥、過濾以及蒸發，獲得深色 混合物。藉由用EtOAc清洗以及矽膠管柱純化後，獲得呈淡黃色或橘色粉末之預期產物。
表5顯示依照以上所述之合成圖解21合成之化合物。
範例E：3階段合成5-{2-甲基-5-[3-醯胺基]-苯甲醯胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯，從由OriBase Pharma公司購得之試劑開始
圖解22說明合成5-{2-甲基-5-[3-醯胺基]-苯甲醯胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般方法。
步驟1：製備5-(2-甲基-5-硝基-苯甲醯胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般操作程序。
將5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(5.74g，30mmol)、2-甲基-5-硝苯甲基酸(5.44g，30mmol)、HATU(11.42g，30mmol)、DIEA(26mL，150mmol)溶於無水DMF(300L)中，在室溫下攪拌48個小時。使DMF蒸發掉，加入NaHCO3(水溶液)，沈澱發生，過濾，用水以及石油醚/Et2O清洗。獲得預期的產物(9.94g，28mmol)。產率=93%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ 8.53(s,2H),8.37(d,J=2.5,1H),8.26(dd,J=2.5,8.4,1H),7.63(d,J=8.5,1H),7.16(s,1H),3.86(s,3H),3.17(s,1H),2.54(s,3H)。ESI-MS：m/z 355([M+H]+)。HPLC純度：95%。
步驟2：製備5-(5-胺基-2-甲基-苯甲醯胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般操作程序。
將5-(2-甲基-5-硝基-苯甲胺基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(9.8g，27.7mmol)、甲醇(300mL)以及10%鈀碳(0.95g，10%w/w)置於充填30巴氫氣之高壓反應器中，攪拌24個小時。在矽藻土上過濾混合物，用甲醇清洗。使溶劑蒸發掉，獲得棕色固體物(7.35g，22.7毫莫耳)。產率= 81%。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ 10.29(s,1H),8.55(s,2H),7.15(s,1H),6.94(d,J=8.2,1H),6.71(d,J=2.3,1H),6.60(m,1H),5.08(s,2H),3.86(s,3H),2.21(s,3H)。ESI-MS：m/z 325([M+H]+)。HPLC純度：95%。
步驟3：製備5-{2-甲基-5-[3-醯胺基]-苯甲醯胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般操作程序
將酸衍生物溶於帶有DIEA(5當量)以及HATU(2當量)之無水DMF(0.06mol/L)中。15分鐘後，慢慢加入5-{2-甲基-5-[3-胺基]-苯甲醯胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯，且在室溫下攪拌混合物12個小時。使DMF蒸發掉，加入NaHCO3(水溶液)。用EtOAc萃取產物、乾燥、過濾以及蒸發，獲得暗色混合物。藉由用MeOH或EtOAc清洗或藉由矽膠管柱純化後，獲得呈淡黃色或橘色粉末狀之預期產物。
表6顯示依照以上所述合成圖解20合成之化合物。
範例F：合成5-{2-甲基-5-[5-硫代苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
合成5-{2-甲基-5-[5-硫代苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般方法，示於圖解23中。
從醯胺衍生物合成硫醯胺之一般程序：
在130℃下，加熱5-{2-甲基-5-[5-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(100mg)以及Lawesson氏試劑(圖解23中之“LR”)(1.8當量)配製於5mL氯苯中之懸浮液2個小時。使溶劑蒸發，用矽膠色層分析法(水+1%TFA/乙腈+1% TFA)純化殘留物。溶劑蒸發後，將殘留物溶於水中，用NaHCO3鹼化至pH 7-8，且用AcOEt萃取。之後透過Na2SO4乾燥有機層，移除溶劑，獲得黃色固體物。
範例G：合成5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸丙酯
合成5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸丙或乙酯之方法，示於圖解24之2步驟中。
步驟1：合成5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸(OR0623)
在65℃下，加熱5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(580mg)以及氫氧化鉀(5當量)配製 於水(3mL)以及甲醇(3mL)中之懸浮液18個小時。使甲醇蒸發掉，以及利用HCl 6N將pH中和至pH 7。在溶劑蒸發後，用矽膠色層分析法(水/乙腈)純化粗製的殘留物，獲得棕色固體物。
產率：54%(305mg)
1H NMR(300MHz,DMSO)δ 11.24(s,1H),10.39(s,1H),8.22-8.15(m,2H),7.94(d,J=2.5,1H),7.87(d,J=8.0,1H),7.71-7.64(m,2H),7.18(d,J=8.8,1H),6.95(d,J=2.3,1H),6.54(s,1H),5.94-5.73(m,1H),4.21(s,2H),3.65(s,2H),2.46-2.24(m,11H),2.16(s,3H)。
HPLC：100%；MS：581(M+1)
步驟2(選項1)：合成5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸丙酯(OR0697)
於配製於3.5mL丙醇中之5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸(80mg)懸浮液中，加入亞硫醯氯(3當量)。在100℃下加熱混合物一整夜。在溶劑蒸發後，利用矽膠色層分析法(乙腈+1% TFA)純化粗製殘留物。溶劑蒸發後，將殘留物溶於水中，用NaHCO3鹼化直到pH 9，然後用AcOEt萃取。之後透過Na2SO4乾燥有機層，移除溶劑，獲得棕色固體物。
產率：44%(32mg)
1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)11.98(s,1H),10.33 (s,1H),8.20(s,1H),8.20(s,1H),8.15(d,J=8.1,1H),8.10(d,J=2.5,1H),7.88(d,J=8.1,1H),7..71-7.63(m,2H),7.01(d,J=2.5,1H),6.90(d,J=2.1,1H),6.03(t,J=5.4,1H),4.26-4.18(m,4H),3.66(s,2H),2.48-2.38(m,8H),2.34(s,3H),2.18(s,3H),0.97(t,3H)
HPLC：96%；MS：623.3(M+1)
步驟2(選項2)：合成5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸乙酯(OR1082)
於配製於4mL乙醇中之5-{2-甲基-5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸(90mg)懸浮液中，加入硫酸95%(0.5當量)。在回流之溫度下加熱混合物6個小時。溶劑蒸發後，用矽膠色層分析法(乙腈+1% TFA)純化粗製殘留物。溶劑蒸發後，將殘留物溶於水中，用NaHCO3鹼化至pH 9，然後用AcOEt萃取。之後透過Na2SO4乾燥有機層，移除溶劑，獲得黃色固體物。
產率：37%(35mg)
1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)1H NMR(400MHz,DMSO)δ 11.99(s,1H),10.34(s,1H),8.20-8.14(m,2H),8.09(d,J=2.6,1H),7.87(d,J=8.1,1H),7.66(d,J=9.5,2H),7.19(d,J=8.1,1H),6.99(d,J=2.5,1H),6.88(d,J=2.0,1H),6.05(t,J=5.4,1H),4.29(q,J=7.1,2H),4.23(d,J=5.4,2H),3.65(s,2H),2.46-2.33(m,3H),2.30(s, 3H),2.15(s,3H),1.30(t,J=7.1,3H).
HPLC：96%；MS：609(M+1)
範例H：合成5-[3-(苯甲醯胺基-甲基)-苯甲胺基]-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯以及5-[3-(硫代苯甲醯胺基-甲基)-苯甲胺基]-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯
用於合成5-[3-(苯甲醯胺基-甲基)-苯甲胺基]-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯以及5-[3-(硫代苯甲醯胺基-甲基)-苯甲胺基]-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般方法，示於圖解25之3或4步驟中。
步驟1：製備3-(苯甲醯胺基-甲基)-苯甲酸甲酯之一般操作程序
將3-胺甲基-苯甲酸甲酯鹽酸鹽(1當量)、HOBt(1.2當量)、DIEA(1.2當量)以及EDCI.HCl(1.2當量)溶於乾DMF(0.17M)中，在室溫下氬氣中攪拌30分鐘。加入胺衍生物(1當量)，在室溫下攪拌混合物一整夜。使DMF蒸發掉，加入飽和NaHCO3溶液。用EtOAc萃取產物，透過Na2SO4乾燥，過濾以及蒸發。利用矽膠色層分析法純化粗製物，在溶劑蒸發後，獲得預期的產物。
3-[(3-三氟甲基-苯甲醯胺基)-甲基]-苯甲酸甲酯
白色粉末。產率：45%(528mg)。HPLC：93%。MS：338(M+1)。
3-{[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-甲基}-苯甲酸甲酯
黑色粉末。產率：數量(1.55g)。HPLC：91%。MS：450(M+1)。
步驟2：合成3-[(3-三氟甲基-硫代苯甲醯胺基)-甲基]-苯甲酸甲酯
在110℃下，加熱配製於26mL甲苯中之3-[(3-三氟甲基-苯甲醯胺基)-甲基]-苯甲酸甲酯(528mg)以及Lawesson氏劑(圖解23中之“LR”)(1.8當量)之懸浮液3個小時。使溶劑蒸發掉，於粗製產物中加入飽和NaHCO3溶液。用EtOAc萃取產物，透過Na2SO4乾燥、過濾以及蒸發。用矽膠色層分析法純化粗製油狀物，在溶劑蒸發後，獲得預期的產物。
黃色油狀物。產率：94%(518mg)。HPLC：>99%。MS：354(M+1)。
步驟3：皂化甲酯之一般操作程序
將甲酯(1當量)懸浮於溶劑(THF/水或MeOH/水_1/1)之混合物中。加入鹼性基(LiOH或KOH，3當量)，在回流溫度下加熱混合物直到反應完全(TLC控制)。使有機溶劑蒸發掉，中和混合物，用有機溶劑萃取產物。
3-[(3-三氟甲基-硫代苯甲醯胺基)-甲基]-苯甲酸
黃色粉末。產率：88%(438mg)。HPLC：98%。 MS：340(M+1)。
3-{[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯甲醯胺基]-甲基}-苯甲酸
產率：54%(792mg)。HPLC：93%。MS：436(M+1)。
步驟4：似胜肽偶合反應之一般操作程序
將酸衍生物以及HATU(2當量)溶於無水DMF(0.1-0.2mol/L)中。30分鐘後，加入5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(1當量)以及DIEA(3-4當量)，在室溫下攪拌混合物一整夜。使DMF蒸發掉，加入飽和NaHCO3溶液。用EtOAc萃取產物，透過Na2SO4乾燥、過濾以及蒸發。在逆相(H2O 1%TFA/MeCN 1%TFA 100/0，0/100)中純化粗製產物。使MeCN蒸發掉，將產物懸浮於H2O中，以及用飽和NaHCO3溶液鹼化直至pH=8-9。用AcOEt萃取水層三次。使有機層蒸發，獲得最後化合物。
範例I：3階段合成5-{3-(苯胺甲醯基)-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯，從3-氰基-苯甲酸開始。
圖解26說明合成5-{3-(苯胺甲醯基)-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般方法
步驟1：製備3-氰基-苯甲醯胺化合物之一般操作程序
在氬氣中，將3-氰基-苯甲酸(1.2當量)、胺衍生物(1當量)、HOBt(1.2當量)、DIEA(1.2當量)以及EDCI.HCl(1.2當量)溶於乾DMF(0.15M)中。在室溫下攪拌該混合物一整夜。使DMF蒸發掉，加入飽和NaHCO3溶液。用EtOAc萃 取產物，透過Na2SO4乾燥、過濾以及蒸發。在逆相(H2O 1%TFA/MeCN 1%TFA 100/0，0/100)上純化粗製產物。使MeCN蒸發掉。將產物懸浮在H2O中，且用飽和NaHCO3溶液鹼化，直到pH=8-9。用AcOEt萃取水層三次。使有機層蒸發，獲得最後的化合物。
3-氰基-N-(3-三氟甲基-苯甲基)-苯甲醯胺
白色粉末。產率：76%(334mg)。HPLC：>99%。MS：305(M+1)。
3-氰基-N-吡啶-3-基-苯甲醯胺
棕色粉末。產率：47%(563mg)。HPLC：>99%。MS：224(M+1)。
3-氰基-N-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-苯甲醯胺
黃色油狀物。產率：22%(52mg)。HPLC：92%。MS：403(M+1)。
步驟2：製備3-甲醯基-苯甲醯胺化合物之一般操作程序
在氬氣中，將3-氰基-苯甲醯胺中間產物(1當量)溶於吡啶/水/醋酸(2/1/1；0.01M)之混合物中。加入配製於水中之雷氏鎳(~0.03 vol)，在大氣壓力、氫環境、室溫下，攪拌該混合物一整夜。之後，透過矽藻土床過濾該混合物，用甲醇清洗。使溶劑蒸發掉。加入飽和NaHCO3溶液。用EtOAc萃取產物、透過Na2SO4乾燥、過濾以及蒸發，獲得最終的化合物。
3-甲醯基-N-(3-三氟甲基-苯甲基)-苯甲醯胺
黃色油狀物。產率：79%(40mg)。HPLC：89%。MS：308(M+1)。
3-甲醯基-N-吡啶-3-基-苯甲醯胺
黃色油狀物。產率：66%(166mg)。HPLC：>99%。MS：227(M+1)。
3-甲醯基-N-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-3-三氟甲基-苯基]-苯甲醯胺
黃色油狀物。產率：57%(30mg)。HPLC：75%。MS：406(M+1)。
步驟3：製備5-{3-(苯胺甲醯基)-苯甲胺基}-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯之一般操作程序
使5-胺基-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-2-羧酸甲酯(1當量)以及3-甲醯基-苯甲醯胺化合物(1.1當量)於MeOH/AcOH(10/1；0.06M)之混合物中攪拌2個小時。之後，慢慢加入NaBH3CN(1.2當量)，在氬氣中室溫下攪拌該混合物一整夜。添加飽和NaHCO3溶液直到中和，使反應驟止。使MeOH以及醋酸蒸發掉。過濾粗製產物，在於逆相(H2O 1%TFA/MeCN 1%TFA 100/0，0/100)上純化之前，用水以及Et2O清洗。使MeCN蒸發掉。使產物懸浮在H2O中，且用飽和NaHCO3溶液鹼化直到pH=8-9。用AcOEt萃取水層三次。透過Na2SO4乾燥有機層，過濾以及濃縮，獲得預期之產物。
生物試驗 材料以及方法： 1)活體外激酶分析(表B1至B13)
化合物在包括BRAF、EGFR(ErbB1)、EGFR(ErbB1)T790M L858R、FGFR2、KDR(VEGFR2)、PDGFRA(PDGFR α)、SRC以及其它之數種激酶上之抑制活性，係使用Invitrogen之Z'-LYTE®技術評估。簡言之，Z'-LYTE®生化分析法係使用螢光為基礎，結合酵素之設計，以及以磷酸化以及非磷酸化胜肽對蛋白水解作用斷裂之不同的敏感度為基礎。用二種螢光團標記胜肽基質一在各端上一其建立一FRET對。比例量測法是用於定量反應的進程，其計算在供者螢光團激發之後，在400nm下供者發射對受者發射之比率(發射比率)。
在1% DMSO(最終)孔中篩選化合物。進行10個點的滴定，從起始濃縮開始，進行3倍連續稀釋。將所有的胜肽/激酶混合物，在適當的激酶緩衝液中稀釋成2X工作濃度。將所有的ATP溶液，在激酶緩衝液(50mM HEPES pH 7.5，0.01% BRIJ-35，10mM MgCl2，1mM EGTA)中稀釋至4X工作濃度。事先使用Z'-LYTE®分析法測定ATP Km表觀(ATP Km apparent)。
各化合物在100nM濃度下培育(用於試驗對抗ABL以及ABL T315I之活性的除外，其化合物在10μM之濃度下培育)，而表B1至B12總結所獲得之結果，其顯示化合物之抑制能力。亦使用相同的分析法研究OR0512之抑制活 性，以及在100nM OR0512濃度下，活性被抑制超過50%之激酶，列於表B13中。
2)活體外細胞增生分析(表B14至B33)
將癌細胞株(5x103細胞/孔)或HUVEC(1x104細胞/孔)或HRMEC(1x104細胞/孔)分配於96孔培養皿中，用逐步提高濃度之化合物(10nM至3μM)培育72個小時，一式二份。使用MTT(3[4,5-二甲噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑)測量細胞增生。使用Graph-Pad Software(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)之Prism 5.0，從S型劑量-反應曲線計算EC50值，值按該等DMSO-處理的對照孔(0%)以及1% SDS對照孔(100%)正規化。
3)活體內研究(表B34)
製備數種異體移植之小鼠模型：
1)在雄性裸鼠(HSD，6-7周大)之右側腹中，皮下植入Ba/F3 T315I細胞(1x108細胞/mL，配製在無菌PBS中)，引發伊馬替尼(imatinib)抗性白血病。當腫瘤體積達到大約50mm3時，隨機分配小鼠進行單獨載體處理或OR0512處理群組(每群組五隻小鼠)。用載體(DMSO)或OR0512(40mg/kg，一天四次；經口，連續11天)處理小鼠。
2)在雄性裸鼠(HSD，6-7周大)之右側腹中，皮下植入BxPC-3細胞(1x107細胞l/mL，配製在無菌PBS中)，引發人類胰腺癌模型。當腫瘤體積達到大約100mm3時，隨機分配小鼠進行單獨載體處理或OR0512處理群組(每群組五隻小鼠)。用載體(DMSO)或OR0512(20mg/kg一天四次；經口， 連續32天)處理小鼠。
3)在雄性裸鼠(HSD，6-7周大)之右側腹中，皮下植入HepG2細胞(1x107細胞l/mL，配製在無菌PBS中)，引發人類肝細胞癌模型。當腫瘤體積達到大約100mm3時，隨機分配小鼠進行單獨載體處理或OR0512處理群組(每群組五隻小鼠)。用載體(DMSO)或OR0512(20mg/kg一天四次；經口，連續15天)處理小鼠。
4)在雄性裸鼠(HSD，6-7周大)之右側腹中，皮下植入H1975細胞(1x107細胞l/mL，配製在無菌PBS中)，引發帶有EGFR突變之人類NSCLC。當腫瘤體積達到大約100mm3時，隨機分配小鼠進行單獨載體處理或OR0512處理群組(每群組五隻小鼠)。用載體(DMSO)或OR0512(20mg/kg一天四次；經口，連續22天)處理小鼠。
每周用數位卡尺以mm3為單位測定腫瘤體積三次，以及使用下列方程式計算：腫瘤體積(mm3)=長(mm)x寬(mm)x高(mm)x½。一周測量體重三次，且每日觀察壓力之監視述象，以便檢測可能的毒性。使用單向ANOVA進行統計比較。用Prism 5.0b(GraphPad Software)之單向ANOVA之Bonferroni事後檢定，分析數據。腫瘤生長抑制(TGI)之計算，是OR0512處理群組之研究結束時之腫瘤生長，與單獨載體處理群組之腫瘤生長相比，減少之百分比。
生物學結果：
活體外激酶分析法透露出許多激酶抑制分子結構。超過20個化合物能夠抑制至少4種測試的激酶(在各個 此等激酶上，因為在100nM濃度時抑制百分比超過50%，因此預期IC50應小於100nM，但ABL以及ABL T315I例外，其IC50預期小於10μM)。應注意，此等化合物在代表不同以及疏遠的激酶家族(絲胺酸/酥胺酸或酪胺酸激酶)上，展現出抑制活性，而該等激酶涉及簡介部分中敘述之腫瘤進展的多重途徑(血管生成、移動、轉移、腫瘤生長)。此等化合物是大範圍多重標靶激酶抑制劑。
化合物之抗增生強度，係在模仿血管生成過程之惡性癌細胞株或原代內皮細胞上評估。測定對應於抑制細胞生長50%位準之化合物濃度之EC50。所獲得之結果示於表B14至B233。
在該等實驗中，吾人視EC50高於3μM之化合物為在試驗細胞類型上為無活性。具EC50介於1μM以及3μM之間之化合物視為有活性，如索拉非尼(Sorafenib)，其目前在市場用於治療肝細胞癌，在此之4種肝癌細胞株(HepG2、HuH7、HuCCT1以及HuH6選殖株5)上，呈現EC50介於1μM以及3μM之間。
許多化合物在各試驗的細胞類型中係細胞生長之高強度抑制劑。所有的試驗化合物，除了OR0616外，在HUVEC上展現抗血管生成特性。用該等化合物處理之肝母細胞癌以及膽管癌之癌細胞株(HuCCT1以及HuH6選殖株5)，生長的降低，小於其它細胞類型。對所有其它的癌細胞株而言，許多化合物會高度抑制細胞的生長。總體而言，此等結果指出，本發明之化合物能夠阻斷腫瘤生長之至少二 個途徑(表皮細胞增生以及血管生成)。
在帶有腫瘤之異體移植的小鼠之活體內試驗中，OR0512會顯著地引起人類胰腺癌、人類NSCLC(具有突變形式之EGFR)、人類肝細胞癌模型中之腫瘤生長降低，以及表達突變的Bcr-Abl T315I蛋白之伊馬替尼抗性CML模型中之腫瘤生長稍微降低。
皮細胞上之抗增生活性。

Claims (17)

  1. 一種具下式(I)之化合物，和/或其藥學上可接受之加成鹽、溶劑化物、鏡像異構物、非鏡像異構物，以及其等之混合物： 其特徵在於，- R1是C1-C6烷基，較佳地為甲基、乙基或正-丙基，- X是CH2或C=O，- R2是氫原子、烷基基團或鹵素原子，- Y是擇自於由下列所構成之群組：HNC(O)、HNC(S)、HNSO2、HNC(O)CH2、HNC(O)NH、HNC(S)NH、C(O)NH、C(O)NHCH2、CH2NHC(O)以及CH2NHC(S)，以及- R3是擇自於由下列所構成之群組：- 被下列單或多取代的苯基基團：- 羥基，- 鹵素，- C1-C6烷基胺，較佳地為二級C1-C6烷基胺，- C1-C6烷氧基，- C1-C6三氟烷氧基，較佳地為三氟甲氧基， - C1-C6烷基，較佳地為甲基、異丙基，- C1-C6三氟烷基，較佳地三氟甲基，- 雜芳基片段，其任擇地被C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，其中該雜芳基片段係擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶或較佳地被甲基單取代之噻唑基，- 咪唑，條件為Y是HNC(S)、HNSO2、HNC(O)CH2、HNC(O)NH、HNC(S)NH、C(O)NHCH2、CH2NHC(O)、CH2NHC(S)或C(O)NH，其中NH直接連接至R3，較佳地Y是HNC(S)，- 雜芳基基團，其較佳地擇自於由下列所構成之群組：二氫苯並呋喃、吲哚、苯並二噁茂、苯並三唑、吡啶，其任擇地經C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基、鹵素和/或羥基取代，- 非芳族單取代的環狀基團，較佳地為環狀C3-C10烷基，其係經羥基、鹵素、C1-C6烷基胺、C1-C6烷氧基、C1-C6三氟烷氧基、C1-C6烷基、C1-C6三氟烷基單取代，以及- 擇自於由下列所構成之群組之片段：
  2. 如請求項1之化合物，其特徵在於，- X是CH2，以及- R2是烷基或鹵素。
  3. 如請求項1或2之化合物，其特徵在於，- R1是C1-C6烷基，較佳地為甲基、乙基或正丙基，- X是CH2，- R2是甲基或氯原子，- Y是擇自於由下列所構成之群組：HNC(O)、HNC(O)CH2、HNC(O)NH、HNC(S)NH、C(O)NH、C(O)NHCH2以及CH2NHC(O)，- R3是擇自於由下列所構成之群組：- 經下列單取代之苯基基團：C1-C6三氟烷基基團、C1-C6三氟烷氧基基團、C1-C6烷基基團、鹵素或任擇地經CF3和/或甲基基團單取代之噻唑基團，，- 經C1-C6三氟烷基、C1-C6烷基胺和/或羥基基團多取代之苯基基團， - 吡啶基團，其任擇地經C1-C6烷基或C1-C6三氟烷基取代，較佳地經甲基和/或三氟甲基取代，- 非芳族環狀基團，其係擇自於經C1-C6烷基和/或C1-C6三氟烷基單取代之環狀C3-C10烷基之間，以及- 擇自於由下列所構成之群組之片段：
  4. 如請求項1至3項中任一項之化合物，其特徵在於，- R1是C1-C6烷基基團，較佳地為甲基、乙基或正丙基，- X是CH2，- R2是甲基，- Y是HNC*(O)，其中C*連接至R3以及- R3係擇自於由下列所構成之群組：
  5. 如請求項1至4項中任一項之化合物，其具有通式(II)： 其特徵在於，- R1是甲基，- X是CH2，- R2是甲基，- Y是HNC*(O)，其中C*連接至R3，以及- R3是擇自於由下列所構成之群組： ，較佳地R3是：
  6. 如請求項2-5項中任一項之化合物，其特徵在於，X由CH2換成C=O。
  7. 一種製備如請求項1-6項之化合物之方法，其特徵在於，其包含至少一下列步驟：a)在X是CO之情況下，NH-CO鍵係利用胜肽偶合技術形成，其使用經NO2基團取代的芳族羧酸，較佳地使用碳化二亞胺或脲陽離子偶合劑，或假如X是CH2，則NH-CH2鍵是利用還原胺化反應形成，其使用經NO2基團取代的芳族醛，較佳地在氫化硼之存在下，b)將該NO2基團還原成NH2，較佳地利用氫化反應，諸如，例如在鈀碳之存在下，於氫環境下之催化氫化反應。
  8. 一種製備如請求項1-6項中任一項之化合物之方法，其特徵在於，該方法包含一下列步驟，較佳地在如請求項7之方法的步驟(a)和/或(b)之後：c1)在Y是HNC(O)NH之情況下，藉由將步驟b)後獲得之化合物與異氰酸酯反應以形成尿素，c2)在Y是HNC(S)NH之情況下，藉由將步驟b)後獲得之化合物與異硫氰酸酯反應以形成硫脲，c3)在Y是HNSO2之情況下，藉由將步驟b)後獲得之化合物與諸如磺醯氯之鹵素磺醯基反應以形成磺醯胺，c4)在Y是HNCO之情況下，藉由將步驟b)後獲得之化合物與諸如醯基氯之活化的羧酸反應以形成醯胺，或 c5)在Y是HNCS之情況下，藉由將步驟c4)後獲得之化合物與Lawesson氏試劑反應以形成硫醯胺，以及d)任擇地皂化該所獲得之產物，其較佳地係藉由使用KOH。
  9. 如請求項1-6項中任一項之化合物，其特徵在於，其為藥物。
  10. 如請求項1-6項中任一項之化合物，其用於抑制涉及人類或動物疾病之細胞增生和/或血管生成。
  11. 如請求項1-6項中任一項之化合物，其係於諸如下列疾病中作為蛋白質激酶之抑制劑之用途：癌症，更特別的是諸如血液腫瘤之液態瘤，諸如白血病、慢性或急性骨髓增生性疾病；或實體瘤，諸如鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、諸如膠質母細胞瘤與神經纖維瘤之膠質細胞腫瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、黑色素瘤、結直腸癌、子宮內膜癌、涶腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肉瘤和/或星狀細胞瘤以及其它激酶相關的疾病，其較佳地為免疫失調、發炎性疾病、血栓疾病、神經退化性疾病、骨病、黃斑部退化、纖維化、囊腫生成、過度增生疾病。
  12. 如請求項11之化合物的用途，其中該疾病係擇自於由下列所構成之群組：肝癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、白血病、腎癌、子宮內膜癌、結直腸癌、化療抗性癌、黃斑部退化。
  13. 一種藥學組成物，其特徵在於，其含有如請求項1至6項中任一項之化合物作為活性主要成份，以及一藥學上可接受之賦形劑。
  14. 如請求項13之藥學組成物，其用作為諸如下列疾病中之蛋白質激酶之抑制劑：癌症，更特別的是諸如血液腫瘤之液態瘤，諸如白血病、慢性或急性骨髓增生性疾病；或實體瘤，諸如鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、諸如膠質母細胞瘤與神經纖維瘤之膠質細胞腫瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、黑色素瘤、結直腸癌、子宮內膜癌、涶腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肉瘤和/或星狀細胞瘤以及其它激酶相關的疾病，其較佳地為免疫失調、發炎性疾病、血栓疾病、神經退化性疾病、骨病、黃斑部退化、纖維化、囊腫生成、過度增生疾病。
  15. 如請求項14之藥學組成物，其中該疾病係擇自於由下列所構成之群組：肝癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、白血病、腎癌、子宮內膜癌、結直腸癌、化療抗性癌、黃斑部退化。
  16. 一種活體外方法，其用於預測對如請求項1至6項中任一項之化合物有需要之諸如出現癌症之病人，其是否可能會該化合物中之至少一種產生反應，該方法包含測定該病人之樣本中蛋白質激酶之表達位準、基因修飾、活性狀態或突變形式之外觀，其中該蛋白質激酶係擇自於下列激酶列表：BRAF、EGFR、FGFR2、KDR、PDGFRA、 SRC、ABL、FGFR1、VEGFR1、PDGFRB、ABL2、BLK、BMX、BTK、CSK、EPHA1、EPHA2、EPHA4、EPHB2、EPHB4、HER2、ERBB4、FES、FGR、FLT3、FMS、FRK、FYN、HCK、LCK、LYN、MAPK14、ERK2、PKC θ、RET、VEGFR3以及YES。
  17. 一種活體外方法，其用於預測如請求項1-6項中任一項之化合物中該至少一種可投與至一對該化合物有需要之病人，該病人係諸如出現癌症之病人，其特徵在於，其包含下列步驟：e)使該化合物與人類組織或細胞之樣本接觸，f)透過例如IC50和/或透過所存在之蛋白質激酶之活性比較，測定該化合物在該樣本上之活性，該蛋白質激酶可例如擇自於下列激酶列表：BRAF、EGFR、EGFR T790M L858R、FGFR2、KDR PDGFRA、SRC、ABL、ABL T315I、FGFR1、VEGFR1、PDGFRB、ABL E255K、ABL G250E、ABL Y253F、ABL2、BLK、BMX、BRAF V600E、BTK、CSK、EPHA1、EPHA2、EPHA4、EPHB2、EPHB4、HER2、ERBB4、FES、FGR、FLT3、FMS、FRK、FYN、HCK、LCK、LYN、MAPK14、ERK2、PKC θ、RET、VEGFR3以及YES；g)任擇地以健康的細胞，諸如該病人之血液細胞或幹細胞或肝細胞，進行與步驟e)相同的試驗，測定如請求項1至6項中任一項之化合物對健康細胞之毒性；h)在請求項1至6項中任一項之化合物中選擇呈現 最佳活性和/或實際上最低毒性之化合物，其係要投與至對該化合物有需要之病人。
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