TW201402600A - ｅＩＦ－５Ａ之同功異型物：老化誘發之ｅＩＦ－５Ａ；創傷誘發之ｅＩＦ－５Ａ；生長ｅＩＦ－５Ａ；及ＤＨＳ - Google Patents

ｅＩＦ－５Ａ之同功異型物：老化誘發之ｅＩＦ－５Ａ；創傷誘發之ｅＩＦ－５Ａ；生長ｅＩＦ－５Ａ；及ＤＨＳ Download PDF

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Abstract

本發明係關於真核生物起始因子5A(「eIF-5A」)的獨特同功異型物：老化誘發之eIF-5A；創傷誘發之eIF-5A；及生長eIF-5A；以及編碼該三種因子的聚核苷酸。本發明亦係關於涉及調節該等因子表現的方法。本發明亦係關於脫氧羥腐胺離胺酸(deoxyhypusine)合成酶(「DHS」)、編碼DHS之聚核苷酸，及涉及調節DHS表現的方法。

Description

eIF-5A之同功異型物：老化誘發之eIF-5A；創傷誘發之eIF-5A；生長eIF-5A；及DHS
本申請案為2000年11月29日申請之第09/725,019號的部分接續申請案，該第09/725,019號為2000年6月19日申請之第09/597,771號，現為美國專利第6,538,182號的部分接續申請案，該第09/597,771號為1999年7月6日申請而現在已經放棄之第09/348,675號的部分接續申請案。本申請案主張2003年6月20日申請之美國臨時申請案第60/479,968號及第60/479,969號，以及2004年5月14日申請之美國臨時申請案第60/570,833號及第60/570,835號的優先權，並且該等臨時申請案以引用的方式併入本文中。
本發明係關於真核生物起始因子5A(「eIF-5A」)的獨特同功異型物及編碼eIF-5A的聚核苷酸，以及脫氧羥腐胺離胺酸合成酶(「DHS」)及編碼DHS的聚核苷酸，以及涉及調節同功異型物eIF-5A及DHS表現的方法。
老化為在植物壽命中生物發育的終期。其預示死亡，並在生物組織化的各種層面出現，包括整個植物、器官、花及果實、組織以及個別細胞。
死亡的開始可藉由不同的內部與外部因素誘發。老化為植物或植物組織，諸如果實、花及葉片壽命中複雜且受高度調控的發育階段。老化導致細胞膜及大分子的協調瓦解，以及隨後代謝產物移動至植物的其他部分。
除了在正常植物發育期間發生的程式化老化之外，細胞及組織的死亡以及代謝產物的隨後再移動作為對外部環境因素之協調反應而發生。誘發老化之過早開始(亦將其稱為壞死或細胞凋亡)的外部因素包括環境逆境，諸如溫度、乾旱、不足光線或營養供應，以及病原體侵襲。暴露在環境逆境下的植物組織亦產生乙烯，通常稱為逆境乙烯(Buchanan-Wollaston,V.,1997,J.Exp.Botany,48：181-199；Wright,M.,1974,Plant,120：63-69)。已知乙烯在一些植物中引起老化。
老化並非被動的過程，反而為一受主動調控的過程，其涉及特定基因的協調表現。在老化期間，總RNA的含量降低，並關閉許多基因的表現(Bate等人，1991,J.Exper.Botany,42,801-11；Hensel等人，1993,The Plant Cell,5,553-64)。然而，愈來愈多的證據證明老化過程依賴核基因的重新轉錄。例如，藉由mRNA及蛋白質合成的抑制劑以及去核阻斷老化。出於活體外轉譯實驗，使用來自老化葉片及綠葉之mRNA進行分子研究，顯示在老化葉片中葉片蛋白質產物的模式改變(Thomas等人，1992,J.Plant Physiol.,139,403-12)。使用差示篩選及扣除雜交技術，已自多種不同植物中鑑別出代表老化誘發基因的許多cDNA純系，該等植物包括單子葉及雙子葉植物，諸如擬南芥(Arabidopsis)、玉黍蜀、黃瓜、蘆筍、番茄、稻穀及馬鈴薯。在老化期間特異性表現之基因的鑑別，是欲進行之老化需要重新轉錄的堅定證據。
在老化期間發生的事件似乎高度協調，容許細胞組份在壞死及死亡發生之前最大程度地使用。必須發生涉及特定信號感知的複雜交互作用及基因表現級聯的誘導，來調控該過程。編碼老化相關蛋白質之 基因的表現或許經由共同的活化劑蛋白質調控，而該等活化劑蛋白質又受荷爾蒙信號直接或間接活化。關於涉及該過程之初始信號傳導或後續協調的機制所知不多。
協調的基因表現需要涉及轉錄及轉譯的因子，包括起始因子。已經在多種生物，包括植物中分離並表徵轉譯起始因子基因。轉譯起始因子可控制mRNA群體自核中移出的速率，其與核糖體締合的速率，並在一定程度上可影響特定mRNA之穩定性。(Zuk等人，EMBO J.17：2914-2925(1998)。實際上，咸信一種不為整體轉錄活性所需的此類轉錄起始因子使mRNA的特定子集自核穿梭至細胞質以供轉譯。Jao等人，J.Cell.Biochem.86：590-600,(2002)；Wang等人，J Biol Chem 276：17541-17549(2001)；Rosorius等人，J.Cell Sci.,112,2369-2380(1999)。已知該轉譯因子為真核生物起始因子5A(eIF-5A)，並為唯一已知含有胺基酸羥腐胺離胺酸的蛋白質。Park等人，J Biol Chem 263：15264-15269(1988)。
真核生物轉譯起始因子5A(eIF-5A)為尺寸約為17KDa的必要蛋白質因子，其參與真核生物細胞蛋白質合成的起始。其特徵在於存在羥腐胺離胺酸[N-(4-胺基-2-羥丁基)離胺酸]，一種獨特的經修飾胺基酸，已知僅存在於eIF-5A中。羥腐胺離胺酸係經由丁胺基自多元胺亞精胺轉移至eIF-5A中之特定離胺酸殘基的側鏈胺基並發生羥基化，在轉譯後形成。eIF-5A的活化涉及亞精胺之丁胺基轉移至eIF-5A的離胺酸，形成羥腐胺離胺酸，並活化eIF-5A。在真核生物中，脫氧羥腐胺離胺酸合成酶(DHS)介導eIF-5A中羥腐胺離胺酸之轉譯後合成。使用甲硫胺醯基-嘌呤黴素檢定，顯示羥腐胺離胺酸修飾在活體外對於eIF-5A活性而言為必要的。
在轉譯後藉由脫氧羥腐胺離胺酸合成酶(DHS；EC 1.1.1.249)及脫氧羥腐胺離胺酸羥基化酶(DHH；EC 1.14.99.29)的作用，轉化保守性 離胺酸殘基，在eIF-5A上形成羥腐胺離胺酸。已自數個植物物種中分離出DHS，包括番茄(GenBank寄存編號AF296077)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)(AT-DHS；GenBank寄存編號AF296078)、菸草(Ober及Hartmann,1999)、康乃馨(GenBank寄存編號AF296079)及香蕉(GenBank寄存編號AF296080)，但DHH之基因尚未獲得公認。
DHS經由添加衍生自亞精胺之丁胺基，將eIF-5A之保守性離胺酸殘基轉變為脫氧羥腐胺離胺酸。隨後藉由DHH將eIF-5A之該中間物形式羥基化成為羥腐胺離胺酸。Park等人，Biol.Signals 6,115-123(1997)。eIF-5A的脫氧羥腐胺離胺酸及羥腐胺離胺酸兩種形式，均能夠在活體外結合mRNA。Liu等人，Biol Signals 6,166-174(1997)。雖然不完全瞭解eIF-5A的功能，但有一些證據表明其可調控細胞分裂(Park等人，J Biol Chem 263：15264-15269(1998)；Tome等人，Biol Signals 6：150-156,(1997))及老化。(Wang等人，J.Biol.Chem.276(20)：17541-17549(2001))。亦參見美國專利第6,538,182號及美國專利申請案第09/725,019號，全部以引用的方式併入本文中。似乎已知數種生物體具有一種以上的eIF-5A同功異型物符合每個同功異型物為可在涉及諸如細胞分裂及老化之過程的特定mRNA組的穿梭工具的前提。
Wang等人證實增加DHS mRNA的含量，與番茄之果實軟化及天然及逆境誘發之葉片老化有關。Wang等人，J.Biol.Chem.276(20)：17541-17549(2001)。此外，當在轉殖基因番茄植物中，藉由引入受組成性啟動基因調控之DHS反義cDNA片段來抑制DHS的表現時，如藉由延遲果實軟化及腐敗所證實，得自該等轉殖基因植物的番茄果實顯示老化顯著延遲。參見2003年11月29日申請之美國專利第6,538,182號及美國專利申請案第09/725,019號，全部以引用的方式併入本文中。因為已知DHS活化eIF-5A，該等資料表明羥腐胺離胺酸修 飾之eIF-5A(活性eIF-5A)可經由選擇性轉譯老化所需之mRNA種類來調控老化。此可經由在擬南芥(「AT」)中，受組成性啟動基因控制的全長或3'UTRcDNA的反義使DHS向下調節而進一步證實。藉由向下調節擬南芥DHS(「AT-DHS」)表現，並使其較不可供eIF-5A活化作用利用，使老化延遲約2週(參見美國專利第6,538,182號)。在轉殖基因植物中不僅可觀察到老化延遲，而且亦可觀察到種子產量增加，逆境耐受性增加及生物質量增加，其中每個表現型的程度由DHS向下調節的程度決定。因為如藉由南方墨點法(Southern blot)(Wang等人，2001)及BLAST分析所示，番茄及擬南芥在其基因組中僅有一個DHS複本，所以為了靶向負責使老化轉錄物穿梭出核外的特定eIF-5A同功異型物，必須鑑別出eIF-5A的老化特異性同功異型物，並經由(3'UTR的)老化誘發之eIF-5A的反義構築體，或藉由利用植物向下調節過度表現之基因(亦即經由使用有義聚核苷酸的使用產生過度表現)的天然能力，特異性地向下調節該同功異型物。
植物缺乏免疫系統，並因此具有應付病毒的獨特方法-稱為共抑制，該作用導致病毒RNA的序列特異性降解。當轉殖基因受強有力之組成性啟動基因的控制時，如花椰菜花葉病毒雙35S啟動基因，其對植物表現為病毒轉錄物，並發生序列特異性降解，但不僅針對轉殖基因，亦會針對內源性基因。(在Fagard及Vaucheret,Annual Review.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,June；51：167-194(2000)中回顧)。有一些證據證明共抑制可能是有效的，即使並不比反義抑制內源性基因之表現以便向下調節更有效。
本發明提供真核生物起始因子5A(「eIF-5A」)的同功異型物：老化誘發之eIF-5A；創傷誘發之eIF-5A；及生長eIF-5A；以及編碼該三種因子的聚核苷酸。本發明提供該三種eIF-5A同功異型物的反義聚核 苷酸。本發明亦提供包括該三種eIF-5A同功異型物之有意義及反義聚核苷酸的表現載體。本發明亦關於涉及調節(增加/向上調節或抑制)該等因子表現的方法。
本發明亦關於脫氧羥腐胺離胺酸合成酶(「DHS」)，以及編碼DHS之聚核苷酸。本發明亦提供DHS的反義聚核苷酸。本發明亦提供包括DHS之有意義及反義聚核苷酸的表現載體。本發明亦關於涉及調節(增加/向上調節或抑制)DHS表現的方法。
圖1顯示eIF-5A的三種同功異型物：經分離之擬南芥老化誘發之eIF-5A(第1行)(SEQ ID NO：58)(之前在美國專利第6,538,182號及正在申請中的第09/725,019號中描述)；創傷誘發之eIF-5A(第2行)(SEQ ID NO：59)；以及生長eIF-5A(第行3)(SEQ ID NO：60)的比對。以虛線(----)強調相同的胺基酸，並以實線(--)指出用於肽設計的區域。每個肽含有11個來自eIF-5A序列的胺基酸，以及在N端的額外半胱胺酸殘基，以便與KLH進行共軛。
圖2顯示該三種擬南芥同功異型物之密碼區的比對。第1行為老化誘發的eIF-5A(SEQ ID NO：61)。第2行為創傷誘發的eIF-5A(SEQ ID NO：62)。第3行為生長eIF-5A(SEQ ID NO：63)。以盒子指出在所有三種同功異型物中相同的鹼基對。序列僅包括子甲硫胺酸(ATG)到終止密碼子的密碼區。1=老化誘發之eIF-5A；2=創傷誘發之eIF-5A；及3=生長eIF-5A。
圖3提供擬南芥之老化誘發eIF-5A的基因組序列(SEQ ID NO：78)。以虛底線(----)指示用來設計引子的區域。5'末端引子亦含有HindIII限制性位點，且3'末端引子含有SacI限制性位點，以便在連接至二元載體中時確保蛋白質方位。盒子區域指示用作北方墨點之探針的3'末端。
圖4提供擬南芥之創傷誘發eIF-5A的基因組序列(SEQ ID NO：79)。以虛底線(----)指示用來設計引子的區域。5'末端引子亦含有XhoI限制性位點，且3'末端引子含有SacI限制性位點，以便在連接至二元載體中時確保蛋白質方位。盒子區域指示用作北方墨點之探針的3'末端。
圖5提供擬南芥之生長eIF-5A的基因組序列(SEQ ID NO：52)。以虛底線(----)指示用來設計引子的區域。5'末端引子亦含有XhoI限制性位點，且3'末端引子含有SacI限制性位點，以便在連接到二元載體中時確保蛋白質方位。盒子區域指示用作北方墨點之探針的3'末端。
圖6為二元載體pKYLX71-35S2的輿圖(SEQ ID NO：80)。二元載體pKYLX71-35S2含有在大腸桿菌中用來進行轉型體選擇的四環素抗性，以及在含有康黴素的MS培養盤上，進行種子轉型體選擇的康黴素抗性。
圖7為二元載體pGEM®-T Easy載體的輿圖。在多重選殖位置中間的T突出物，提供PCR產物的插入位點。Ampr基因適用於基於在胺芐青黴素存在下生長來篩選轉型體。
圖8顯示在哥倫比亞生態型之擬南芥野外型的不同組織中，eIF-5A之所有三種同功異型物的西方墨點。泳道說明於下：標記2、3、4、5、6、7的泳道為在2、3、4、5、6、7週齡時收集的總叢生葉，Tr為來自以5% PEG處理之植物的葉片，U為來自澆水之PEG對照組植物的葉片，B為緊閉未綻放的花苞，Fl為範圍自緊閉花苞到老化花朵之所有年齡的花，Si為在6週時收集的果莢，Se為浸潤1天的種子，且St為在6週時收集的莖。
圖9為在哥倫比亞生態型之擬南芥野外型的72小時之後，被感染葉片的老化誘發之eIF-5A及創傷誘發之eIF-5A的西方墨點。泳道1：對照組植物(未處理)，泳道2：模倣處理，泳道3：Avr處理，泳道4：Vir 處理。老化誘發之AteIF-5A的表現量保持恆定，因為該等植物均為共4週齡。創傷誘發之AteIF-5A的表現在病毒處理的植物中增加。生長AteIF-5A的表現不可偵測，並因此未納入本圖中。
圖10為在哥倫比亞生態型之擬南芥野外型的72小時之後，在受傷葉片中eIF-5A之三種同功異型物的北方墨點。利用止血鉗使葉片受傷，並在0小時、處理後即刻、受傷後1小時，及在受傷後9小時收集。創傷誘發之AteIF-5A轉錄物的表現，是唯一在受傷後9小時增加的。生長AteIF-5A的表現儘管低，但在受傷事件中開始減少。
圖11描繪分別在泳道1、2及3中，得自老化誘發之AteIF-5A、創傷誘發之AteIF-5A及生長AteIF-5A的基因組DNA的PCR產物。切下並純化單一上方譜帶，以便連接到pGEM中。
圖12顯示分別在泳道1、2及3中具有pGEM中之老化誘發之AteIF-5A、創傷誘發之AteIF-5A及生長AteIF-5A基因組序列的瓊脂糖凝膠。pGEM：老化誘發之AteIF-5A、pGEM：創傷誘發之AteIF-5A及pGEM：生長AteIF-5A均以EcoRI消化，以便鑑別出含有適當尺寸插入物的陽性轉型體菌落。隨後將該等純系送去定序，證實序列在植物中過度表現的適合性。
圖13顯示具有pKYLX71中之創傷誘發之AteIF-5A、生長AteIF-5A基因組序列的瓊脂糖凝膠。經由利用適當酶進行二元消化(D)，以及利用適當引子進行PCR(P)，針對創傷誘發之AteIF-5A插入物或生長AteIF-5A插入物，篩選能夠在含有四環素之培養盤上生長的菌落。
圖14為利用具有有意義創傷誘發之AteIF-5A的構築體轉型之植物的T1培養盤的照片。在該培養盤上，以黑色圈起兩個轉型體，並對應於植株13及14。以白色圈起野外型對照組。
圖15為四週齡之利用有意義創傷誘發的AteIF-5A轉型之T1植物的照片。以P標籤指示轉殖基因植株，以W標籤指示野外型植物，並以 Y標籤指示二元載體對照組植物，植株6、8、10、13及14未產生種子。
圖16為5.5週齡之利用有意義創傷誘發的AteIF-5A轉型之T1植物的照片。在本圖中只包括極小的植株。植株1、4及12均產生種子，剩下的最後死亡，未產生種子。
圖17為在播種後10天利用有意義創傷誘發之AteIF-5A轉型之T2植物的照片。藉由康黴素抗性(深色植物)與缺乏康黴素抗性之非轉型體(淺色植物)的混合，指出所有T2植株均仍然為異型接合子。以白色圓圈指示野外型對照組植物。植株12未被納入本圖中，因為其僅有1個轉型體生長，且尚待移植。
圖18為在播種後10天利用有意義生長AteIF-5A轉型之T1植物的照片。對本培養盤，以黑色圓圈指示三個轉型體，並對應於植株6、7及8。以白色圓圈指示野外型對照組植物。
圖19為四週齡之利用有意義生長AteIF-5A轉型之T1植物的照片。以B標籤指示轉型體植株，並以W標籤或缺少標籤指示野外型對照組。在圖的下方包括空的二元對照組(Y標籤)，顯示其看起來與野外型沒有差異。
圖20為利用有意義生長AteIF-5A株轉型之T2植物的西方墨點。使用每個母植株的代表物，以測定在每個植株中的一般表現量。
圖21為在四週齡(上方)、五週齡(下左)及六週齡(下右)，利用有意義生長AteIF-5A(1A-1D株)轉型的T2植物。以B標籤(灰色圓圈)指示轉型體植株，並以W標籤(白色橢圓)指示野外型對照組。以Y標籤(黑色圓圈)指示空的二元對照組。植株1A(以黑色盒子指示)將繼續生長為T3。
圖22為在四週齡(上方)、五週齡(下左)及六週齡(下右)，利用有意義生長AteIF-5A(2A-1D株)轉型的T2植物。以B標籤(灰色圓圈)指示轉型體植株，並以W標籤(白色橢圓)指示野外型對照組。以Y標籤(黑色 圓圈)指示空的二元對照組。植株2D(以黑色盒子指示)將繼續生長為T3。
圖23為在四週齡(上方)、五週齡(下左)及六週齡(下右)，利用有意義生長AteIF-5A(4A-D株)轉型的T2植物。以B標籤(灰色圓圈)指示轉型體植株，並以W標籤(白色橢圓)指示野外型對照組。以Y標籤(黑色圓圈)指示空的二元對照組。植株4D(以黑色盒子指示)將繼續生長為T3。
圖24為在四週齡(上方)、五週齡(下左)及六週齡(下右)，利用有意義生長AteIF-5A(15A-D株)轉型的T2植物。以B標籤(灰色圓圈)指示轉型體植株，並以W標籤(白色橢圓)指示野外型對照組。以Y標籤(黑色圓圈)指示空的二元對照組。植株15A(以黑色盒子指示)將繼續生長為T3。
圖25為在四週齡(上方)、五週齡(下左)及六週齡(下右)，利用有意義生長AteIF-5A(8A-D株)轉型的T2植物。藉由藍色標籤指示轉型體植株，並藉由白色標籤指示野外型對照組。藉由黃色標籤指示空的二元對照組。植株8D(以黑色盒子指示)將繼續生長為T3。
圖26為在四週齡(上方)、五週齡(下左)及六週齡(下右)，利用有意義生長AteIF-5A(9E-H株)轉型的T2植物。以B標籤(灰色圓圈)指示轉型體植株，並以W標籤(白色橢圓)指示野外型對照組。以Y標籤(黑色圓圈)指示空的二元對照組。植株9H(以黑色盒子指示)將繼續生長為T3。
圖27為在四週齡(上方)、五週齡(下左)及六週齡(下右)，利用有意義生長AteIF-5A(11A-D株)轉型的T2植物。以B標籤(灰色圓圈)指示轉型體植株，並以W標籤(白色橢圓)指示野外型對照組。以Y標籤(黑色圓圈)指示空的二元對照組。植株11C(以黑色盒子指示)將繼續生長為T3。
圖28為在四週齡(上方)、五週齡(下左)及六週齡(下右)，利用有意義生長AteIF-5A(16A-D株)轉型的T2植物。以B標籤(灰色圓圈)指示轉 型體植株，並以W標籤(白色橢圓)指示野外型對照組。以Y標籤(黑色圓圈)指示空的二元對照組。植株16C(以黑色盒子指示示)將繼續生長為T3。
圖29為來自各種植株(包括野外型對照組及已經有意義生長AteIF-5A轉型的植株)的擬南芥種子的照片。野外型(WT)、二元對照組(二元)及來自T3有意義生長AteIF-5A種子的植株11C、16C、2D、2H。植株11C及16C僅為平均野外型種子尺寸的88及87%，而植株2D及2H分別比野外型大273及299%。
圖30為每個已經用有意義生長AteIF-5A轉型之植物亞株的平均種子尺寸(立方毫微米)的柱狀圖。每個植株具有在圖中未分開標記之亞株A-H。二元對照組及野外型對照組對應於最後兩個柱條。按n=10計算以誤差柱表示的標準誤差。
圖31為每個已用有意義生長AteIF-5A轉型之植物亞株的個別種子重量(毫克)的柱狀圖。二元對照組及野外型對照組對應於最後兩個柱條。
圖32為顯示在個別種子重量對個別種子體積之間的比例關係的圖。
圖33為顯示每個已用有意義生長AteIF-5A轉型之植物亞株，每個植物之種子產量(毫克)的柱狀圖。每個植株具有亞株A-H。二元對照組及野外型對照組對應於最後兩個柱條。
圖34為在有意義生長AteIF-5A植物中展現之表現型的概述。如藉由西方墨點法所測定的表現量為基礎，將表現型分類。顯示高表現量的植株以深藍色框起，顯示中等表現量的植株以()框起，顯示低表現量的植株以()框起，且顯示可能由於共抑制而無表現的植株以白色框起。
圖35顯示11週齡擬南芥SAG12-反義全長老化誘發之eIF-5A植物 (在左)對野外型植物(在右)的表現型：轉殖基因植物為矮小的，具有增加數目的小叢生葉，並顯示出延遲的老化。
圖36-38顯示植物(利用反義生長eIF-5A轉型)的照片。
圖39顯示用來建構產生反義擬南芥3'DHS之載體的引子(分別為SEQ ID NO：81-82)。擴大之擬南芥的序列分別顯示於SEQ ID NO：83-84。
圖40顯示載體構築體，其中插入物為反義擬南芥DHS的3'-UTR。
圖41顯示分離自擬南芥之創傷因子eIF-5A的序列(DNA顯示於SEQ ID NO：54，胺基酸顯示於SEQ ID NO：55)，以及反義構築體的位置。引子序列分別顯示於SEQ ID NO：85-86。
圖42顯示載體構築體(核苷酸序列分別顯示於SEQ ID NO：87-89)。
圖43顯示接種假單胞菌之葉片圓盤的培養盤計數。以丁香假單胞菌感染反義DHS擬南芥。表1：以有毒力或無毒力之丁香假單胞菌接種之擬南芥葉片培養盤的標準培養盤計數。
圖44顯示在反義轉殖基因植物對野外型中之CFU的圖表(丁香假單胞菌感染)。
圖45描繪番茄葉片DHS cDNA序列(SEQ ID NO：1)之核苷酸序列，以及獲自番茄葉片cDNA庫的衍生胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。
圖46描繪藉由將番茄DHS序列與在擬南芥基因銀行中尚未鑑別出之基因組序列比對獲得的擬南芥DHS基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。預測在胺基酸序列之間的間隙為內含子。圖46B描繪衍生的擬南芥DHS胺基酸序列(SEQ ID NO：6)。圖46C描繪藉由PCR獲得的擬南芥DHS cDNA之600個鹼基對的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。圖46D描繪擬南芥DHS cDNA片段之衍生的胺基酸序列(SEQ ID NO：92)。
圖47為衍生之全長番茄葉片DHS胺基酸序列(SEQ ID NO：2)與帶有人類(SEQ ID NO：3)、酵母菌(SEQ ID NO：45)、真菌(SEQ ID NO：44) 及古原細菌(Archaeobacteria(SEQ ID NO：46)之DHS蛋白質序列的衍生之全長擬南芥(SEQ ID NO：6)老化誘發之DHS胺基酸序列的比對。在三或四個序列中相同的胺基酸被圍住。
圖48為番茄DHS cDNA的限制圖。
圖49為分離自番茄葉片並利用經32P-dCTP-標記之全長番茄DHS cDNA探測之基因組DNA的南方墨點。
圖50為分離自不同發育階段之番茄花的RNA的北方墨點。上方的圖為總RNA的溴化乙錠染色凝膠。每條泳道含有10微克RNA。下方的圖為以經32P-dCTP-標記之全長番茄DHS cDNA探測之北方墨點的自動放射照片。
圖51為自各種成熟階段之番茄果實分離之RNA的北方墨點，其係利用經32P-dCTP-標記之全長番茄DHS cDNA探測。每條泳道含有10微克RNA。
圖52為分離自藉由以2 M山梨糖醇處理6小時進行乾旱逆境脅迫的番茄葉片之RNA的北方墨點。每條泳道含有10微克RNA。以經32P-dCTP-標記之全長番茄DHS cDNA探測墨點。
圖53為分離自已暴露在寒冷的溫度下的番茄葉片之RNA的北方墨點。圖53A為總RNA的溴化乙錠染色的凝膠。每條泳道含有10微克RNA。圖53B為以經32P-dCTP-標記之全長番茄DHS cDNA探測之北方墨點的自動放射照片。圖53C顯示根據葉片滲出液之傳導性所量測的相應洩漏資料。
圖54為康乃馨DHS全長(1384個鹼基對)cDNA純系核苷酸序列(SEQ ID NO：9)，不包括聚A尾及5'末端非密碼區。在核苷酸序列下方顯示衍生的胺基酸序列(373個胺基酸)(SEQ ID NO：10)。
圖55為得自正老化之擬南芥葉片的總RNA的北方墨點，以經32P-dCTP-標記之全長擬南芥DHS cDNA探測。上方為自動放射照片， 下方為乙錠染色的凝膠。
圖56為分離自各種階段之康乃馨花花瓣的總RNA的北方墨點。利用經32P-dCTP-標記之全長康乃馨DHS cDNA探測墨點。上方為自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。
圖57為番茄果實老化誘發之eIF-5A基因的核苷酸(上方)(SEQ ID NO：1)及衍生的胺基酸(下方)(SEQ ID NO：12)序列。
圖58為康乃馨老化誘發之eIF-5A基因的核苷酸(上方)(SEQ ID NO：13)及衍生的胺基酸(下方)(SEQ ID NO：14)序列。
圖59為擬南芥老化誘發之eIF-5A基因的核苷酸(上方)(SEQ ID NO：15)及衍生的胺基酸(下方)(SEQ ID NO：16)序列。
圖60為分離自處於各種發育階段之擬南芥植物之葉片的總RNA的北方墨點。利用經32P-dCTP-標記之全長擬南芥DHS cDNA及全長的老化誘發之eIF-5A探測墨點。上方為自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。(野外型AT DHS及老化誘發之eIF-5A的北方分析。)
圖61為分離自處於發育之破色期果實(BK)、紅-硬(RF)及紅-軟(RS)階段的番茄果實之總RNA的北方墨點。利用經32P-dCTP-標記之全長DHS cDNA及全長老化誘發之eIF-5A探測墨點。在紅-軟果實中，DHS及eIF-5A與果實成熟同時平行地獲得向上調節。上方為自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。
圖62為分離自以山梨糖醇處理以便誘發乾旱逆境的番茄葉片之總RNA的北方墨點。C為對照組；S為以山梨糖醇處理。利用經32P-dCTP-標記之全長DHS cDNA及全長老化誘發之eIF-5A探測墨點。eIF-5A及DHS兩者回應於乾旱逆境而向上調節。上方為自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。
圖63為分離自番茄植物之花芽及正老化之綻放花的總RNA的北方墨點。利用經32P-dCTP-標記之全長老化誘發之DHS cDNA及全長老 化誘發之eIF-5A探測墨點。在綻放/老化的花中，eIF-5A及DHS兩者受到向上調節。上方為自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。
圖64為分離自受寒冷傷害之番茄葉片的總RNA的北方墨點。利用經32P-dCTP-標記之全長DHS cDNA及全長老化誘發之eIF-5A探測墨點。在再升溫期間，隨著寒冷傷害之發展eIF-5A及DHS兩者受到向上調節。上方為自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。
圖65為3.1週齡之擬南芥野外型(左)及以反義方向表現DHS基因之3'末端的轉殖基因植物(在圖80中所示之序列)的照片，顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加。
圖66為4.6週齡之擬南芥野外型(左)及以反義方向表現DHS基因之3'末端的轉殖基因植物(在圖80中所示之序列)的照片，顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加。
圖67為5.6週齡之擬南芥野外型(左)及以反義方向表現DHS基因之3'末端的轉殖基因植物(在圖80中所示之序列)的照片，顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加。
圖68為6.1週齡之擬南芥野外型(左)及以反義方向表現DHS基因之3'末端的轉殖基因植物(在圖80中所示之序列)的照片，顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加。
圖69為顯示在三種以反義方向表現DHS基因的T1轉殖基因擬南芥植株中種子產量增加的圖。以種子的體積表示種子產量。至於野外型植物，顯示n=30的SE。
圖70為以反義方向表現DHS基因之3'末端(在圖80中所示之序列)的轉殖基因番茄植物(左)及野外型植物(右)的照片，顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加且植物尺寸增加。照片係在將植株移至土壤之後18天拍攝。
圖71為以反義方向表現DHS基因之3'末端(在圖36中所示之序列) 的轉殖基因番茄植物(左)及野外型植物(右)的照片，顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加且植物尺寸增加。照片係在將植株移至土壤之後32天拍攝。
圖72到79為野外型(上方圖)及以反義方向表現全長DHS基因之轉殖基因植物(下方圖)的番茄果實的照片。在發育之破色期果實階段收穫果實，並在生長室中使其成熟。在每個圖的左上角指出在收穫之後的天數。
圖80為擬南芥老化誘發之DHS基因的3'末端的核苷酸(上方)(SEQ ID NO：30)及衍生之胺基酸(下方)(SEQ ID NO：90)序列，該序列以反義的方向用來轉型植物。
圖81為番茄DHS基因之3'末端的核苷酸(上方)(SEQ ID NO：31)及衍生之胺基酸(下方)(SEQ ID NO：91)序列，該序列以反義的方向用來轉型植物。
圖82為600個鹼基對之擬南芥DHS探針的核苷酸(上方)(SEQ ID NO：26)及衍生之胺基酸(下方)(SEQ ID NO：92)序列，用來分離全長的擬南芥基因。
圖83為483個鹼基對之康乃馨DHS探針的核苷酸(上方)(SEQ ID NO：27)及衍生之胺基酸(下方)(SEQ ID NO：93)序列，用來分離全長的康乃馨基因。
圖84(a)及(b)為以反義方向表現DHS基因之3'末端(在圖81中所示之序列)的轉殖基因番茄植物之番茄果實(右)，以及野外型植物之番茄果實(左)的照片。野外型果實顯示出頂腐病，轉殖基因的果實則否。
圖85顯示來自數個植物物種之eIF-5A的各種同功異型物的比對。亦提供羥腐胺離胺酸保守區的比對。依出現順序分別參見SEQ ID NO：4及94-125。
圖86提供番茄老化誘發之eIF-5A聚核苷酸(SEQ ID NO：126)及胺 基酸(SEQ ID NO：127)序列。
圖87提供擬南芥老化誘發之eIF-5A及pKYLX71-有意義老化誘發之eIF-5A的建構。引子序列分別顯示於SEQ ID NO：128-129，而載體序列分別顯示於SEQ ID NO：130-132。
圖88提供番茄老化誘發之eIF-5A及pKYLX71-有意義老化誘發之eIF-5A的建構。引子序列分別顯示於SEQ ID NO：133-134，而載體序列分別顯示於SEQ ID NO：135-137。
圖89提供比較擬南芥對照組及包括有意義聚核苷酸老化誘發之eIF-5A之轉殖基因植物的照片。轉殖基因植物具有較粗的花梗，勝過對照組植物。(比較對照組與At-eIF5A1-轉殖基因植物(5週齡)。(A)：花梗；(B)：整個植物。)
圖90及91顯示包括有意義聚核苷酸老化誘發之eIF-5A的轉殖基因植物(圖90-擬南芥及圖91-番茄)，如藉由在轉殖基因植物中木質部增加所指示，具有增加的木質部生成(xylogenesis)。((A)對照組僅具有啟動基因35S。(B)轉殖基因具有啟動基因35S：：At-eIF5A1。以根皮酸苯三酚一酯-Hcl將木質部帶染成灰色，條柱=100微米。)
圖92提供比較擬南芥對照組及包括有意義聚核苷酸老化誘發之eIF-5A之擬南芥轉殖基因植物的照片。在擬南芥中使用番茄有意義聚核苷酸老化誘發之eIF-5A。轉殖基因植物具有較粗的花梗，勝過對照組植物。((A)花梗；(B)整個植物。)
圖93及94為在包括有意義聚核苷酸老化誘發之eIF-5A的轉殖基因植物中，顯示木質部生成增加的柱狀圖。圖94係關於番茄有意義聚核苷酸老化誘發之eIF-5A。
圖95提供油菜生長eIF-5A胺基酸及聚核苷酸序列。
圖96提供油菜生長eIF-5A及pKYLX71-有意義生長eIF-5A的建構。引子序列顯示於SEQ ID NO：138，而載體序列分別顯示於SEQ ID NO：139-141。
圖97提供油菜DHS胺基酸(SEQ ID NO：71)及聚核苷酸(SEQ ID NO：70)序列。
圖98提供油菜DHS及pKYLX71-有意義DHS的建構。3'UTR序列顯示於SEQ ID NO：142，而載體序列分別顯示於SEQ ID NO：143-145。
圖99以柱狀圖形式顯示在油菜中抑制DHS表現(T1-T4重量)增加種子產量(12月28日-3月18日)。
圖100以柱狀圖形式顯示eIF-5A之生長同功異型物的向上調節，自左到右為擬南芥、油菜、番茄，以及番茄DHS的向上調節(12月28日-3月18日)。
圖101提供番茄生長eIF-5A胺基酸(SEQ ID NO：65)及聚核苷酸(SEQ ID NO：64)序列。
圖102提供番茄生長eIF-5A，以及pKYLX71-有意義番茄生長eIF-5A的建構。引子序列分別顯示於SEQ ID NO：146-147，而載體序列分別顯示於SEQ ID NO：148-150。
圖103提供番茄創傷誘發之eIF-5A胺基酸(SEQ ID NO：57)及聚核苷酸(SEQ ID NO：56)序列。(TeIF-5A3(創傷))
圖104A及B提供番茄創傷誘發之eIF-5A，以及pKLYX71-有意義番茄創傷誘發之eIF-5A的建構。引子序列分別顯示於SEQ ID NO：151-152，而載體序列分別顯示於SEQ ID NO：153-155。
圖105提供部分的萵苣DHS聚核苷酸序列。引子序列分別顯示於SEQ ID NO：156-157，而萵苣序列分別顯示於SEQ ID NO：158-159。
圖106提供pTA7001-3'UTR反義萵苣DHS的構築體，其中插入物為反義萵苣DHS的3'-UTR。
圖107A及B提供紫花苜蓿DHS胺基酸(SEQ ID NO：73)及聚核苷酸(SEQ ID NO：72)序列。
圖108A及B提供香蕉DHS胺基酸(SEQ ID NO：75)及聚核苷酸(SEQ ID NO：74)序列。
圖109A及B提供白楊DHS胺基酸(SEQ ID NO：77)及聚核苷酸(SEQ ID NO：76)序列。
圖110提供部分的香蕉葉斑病菌(mycosphaerella fijiensis)DHS胺基酸及聚核苷酸序列。依出現順序分別參見SEQ ID NO：68、160、69、161-164、163及165、47、163及53。
當在本文中使用「植物」一詞時，係指完整的植物、植物部分、植物細胞或一群植物細胞。可在本發明之方法中使用的植物類型，包括但不限於例如對乙烯敏感及對乙烯不敏感的植物；有果實之植物，諸如杏、蘋果、柑橘、香蕉、葡萄、梨、番茄、草莓、酪梨等等；蔬菜植物，諸如胡蘿蔔、豌豆、萵苣、甘藍、蕪菁、馬鈴薯、花椰菜、蘆筍等等；花，諸如康乃馨、玫瑰、菊花等等；農作植物，諸如玉米、稻穀、大豆、紫花苜蓿及其類似物，以及諸如落葉樹、針葉樹、常綠樹等等的森林物種，及通常可接受並表現本發明之DNA分子的任何植物。其可包括各種倍數體層面的植物，包括單倍體、二倍體、四倍體及多倍體。該植物可為單子葉植物或雙子葉植物。
在本文中將轉殖基因植物定義為以一些方式遺傳改造的植物，包括但不限於在其基因組內併入異源或同源老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS的植物。改變的遺傳物質可編碼蛋白質，包括調控或控制序列，或可為或包括反義序列或有意義序列，或編碼反義RNA或有意義RNA，其對植物的老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS DNA或mRNA序列或其一部分為反義或有意義。將「轉殖基因」或「轉殖基因序列」定義為已經併入轉殖基因植物內的外來基因或部分序列。
當在本文中使用「雜交」一詞通常用來意謂在熟習此項技術者依據探針序列及目標序列的性質將顯而易見的適當嚴格度條件下的核酸雜交作用。雜交及洗滌的條件為此項技術中已熟知，並且依據所要嚴格度，藉由改變保溫時間、溶液的溫度及/或離子強度對條件進行調整可容易地完成。參見，例如Sambrook,J.等人，分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York,1989。藉由所雜交之序列的長度，尤其探針序列的長度、核酸之相對G-C內含量及欲容許之錯配量，來指定條件的選擇。當希望在具有較低互補度之股之間發生部分雜交時，低嚴格度條件較佳。當希望完全或接近完全的互補時，高嚴格度條件較佳。在本文中稱為高嚴格度條件者為如下：雜交溶液含有6X S.S.C.、0.01 M EDTA、1X登哈特氏溶液(Denhardt's solution)及0.5% SDS。關於所選殖DNA之片段，在約68℃下進行雜交約3至4小時，至於總真核生物DNA，進行約12至約16小時。至於較低嚴格度，將雜交溫度降至約42℃，低於雙股的解鏈溫度(TM)。已知TM為G-C含量及雙股長度以及溶液之離子強度的函數。
當在本文中使用「實質序列一致性」或「實質同源性」一詞時，指示核酸序列或胺基酸序列顯示與另一核苷酸或胺基酸序列實質上結構或功能相等。在具有實質序列一致性或實質同源性的序列之間的任何結構或功能差異將最小；亦即其將不影響該序列在所要應用中發揮指定功能的能力。差異可歸因於例如，在不同物種間所使用之密碼子中的固有變化。若在兩個或兩個以上不同序列之間存在大量序列重疊或相似性，或若不同的序列顯示出類似的物理特徵，則將結構差異視為微量，即使序列的長度或結構有差異。該等特徵包括，例如在規定條件下雜交的能力，或在蛋白質的情況中為免疫交叉反應性、類似的酶活性等等。該等特徵中的每一者可由熟習此項技術者藉由業內已知 的方法容易地測定。
此外，若在兩個核苷酸序列之間，序列具有至少約70%、較佳80%，且最佳約90%的序列相似性，則其「實質上互補」。若在多肽之活性部分之間，兩個胺基酸序列具有至少70%相似性，則其實質上同源。
當在本文中使用片語「與DNA或RNA分子之相應部分雜交」時，係指與例如寡核苷酸、聚核苷酸或任何核苷酸序列(以有意義或反義之方向)雜交之分子識別並與在具有大致相同尺寸並具有足夠序列相似性之其他核苷酸中的序列雜交，以便在適當的條件下實現雜交。例如來自番茄創傷誘發之eIF-5A的3'密碼或非密碼區之100個核苷酸長的反義分子，將識別並與分別AT創傷誘發之eIF-5A基因或任何其他植物的創傷誘發之eIF-5A基因之3'密碼或非密碼區內之核苷酸序列的約100個核苷酸部分雜交，只要在兩個序列之間有約70%或更高的序列相似性。應瞭解「相應部分」的尺寸將容許在雜交中有一些錯配，使得「相應部分」可以比與其雜交的分子小或大，例如大或小20-30%，較佳大或小不超過約12-15%。
當在本文中使用核酸(或聚核苷酸)的「功能衍生物」一詞時，係指編碼老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS之基因或核苷酸序列的片段、變異體、同系物或類似物。功能衍生物保留老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS編碼DNA的至少一部分功能，其容許其符合本發明的效用。該功能可包括在高嚴格度條件下，與天然經分離老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS，或來自其他植物之實質上同源的DNA，或其mRNA轉錄物雜交的能力，且該老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS以反義方向抑制老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS的表現。
基因或DNA序列的「片段」係指分子的任何子集，例如較短的聚核苷酸或寡核苷酸。「變異體」係指實質上類似於完整基因或其片段的分子，諸如具有一或多個經取代核苷酸的核苷酸取代變異體，但其仍維持與特定基因雜交或編碼與天然DNA雜交之mRNA轉錄物的能力。「同系物」係指來自不同植物屬或種的片段或變異體序列。「類似物」係指非-天然的分子，實質上類似於完整分子、變異體或其片段或發揮與完整分子、變異體或其片段相關的功能。
「調節表現」意謂抑制或向上調節表現。「抑制表現」係指缺乏或可偵測地降低來自目標基因，諸如老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS之蛋白質及/或mRNA產物的含量。「向上調節」或「過度表現」係指可偵測地增加來自目標基因，諸如老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS之蛋白質及/或mRNA產物的含量。
本發明之經分離的聚核苷酸包括分離自天然來源、以重組方式產生或合成者。
本發明之經分離的肽包括分離自天然來源、以重組方式產生或合成者。本發明之經分離的蛋白質包括以融合蛋白質形式表現的老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS，較佳包括與麥芽糖結合蛋白質融合的eIF-5A或DHS。
本發明之老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS肽的「功能衍生物」，包括老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS的片段、變異體、類似物或化學衍生物，其保留至少一部分的活性或與對eIF-5A同功異型物或DHS特異性之抗體的免疫交叉反應性。eIF-5A或DHS肽的片段係指分子的任何子集。可藉由直接化學合成例如使用此項技術中已熟知的方法來製造變異體肽。eIF-5A或DHS肽的類似物係指非天然的蛋白質，其實質上類似於完整 的蛋白質或其片段。eIF-5A或DHS的化學衍生物含有正常並非肽或肽片段一部分的額外化學部分。可藉由使該肽之目標胺基酸殘基與能夠與所選擇之側鏈或末端殘基起反應的有機衍生劑反應，將稀釋引入肽或其片段內。
可藉由培養用本發明之核苷酸序列(以有意義方向)轉型的細胞，容許細胞合成蛋白質，並隨後視所用選殖方案而定自培養基或細胞萃取物以游離蛋白質或以融合蛋白質之形式分離該蛋白質，來產生本發明之eIF-5A或DHS肽。或者，可在無細胞系統中產生蛋白質。Ranu等人，Meth.Enzymol.,60：459-484,(1979)。
使用此項技術中已熟知的習知技術，進行質體DNA的製備、限制酵素消化、DNA的瓊脂糖凝膠電泳、蛋白質的聚丙烯醯胺凝膠電泳、PCR、RT-PCR、南方墨點法(Southern blots)、北方墨點法(Northern blots)、DNA連接及細菌轉型。參見，例如Sambrook,J.等人，分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,1989。核酸雜交的技術由Sambrook揭示。
在Sambrook，等人，分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)，以及Maniatis,T.等人，基因表現之控制中的分子機制(Molecular mechanisms in the Control of Gene expression)，編，Nierlich，等人，編，Acad.Press,N.Y.(1976)中，揭示建構本發明之重組核苷酸分子的程序，兩者全部以引用的方式併入本文中。
可藉由DNA轉型，使用任何此項技術中已知的植物轉型方法，來製備根據本發明製造的轉殖基因植物。植物轉型方法包括將植物、組織或細胞與根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)直接共培養或直接感染(Miki等人，Meth.in Plant Mol.Biol.and Biotechnology,(1993)，第 67-88頁)；基因直接轉移至原生質體內或原生質體攝入(Paszkowski等人，EMBO J.,12：2717(1984))；電穿孔(Fromm等人，Nature,319：719(1986))；粒子轟擊(Klein等人，BioTechnology,6：559-563(1988))；注射至幼苗及植物的分生組織內(De LaPena等人，Nature,325：274-276(1987))；注射至培養細胞及組織的原生質體內(Reich等人，BioTechnology,4：1001-1004(1986))。
通常自轉型過程獲得完整的植物。自原生質體、癒傷組織、組織部分或外植體等再生植物。獲自其中eIF-5A同功異型物或DHS之表現已改變的再生轉殖基因植物的植物部分，諸如葉片、花、果實、種子及其類似物，均納入在本文中使用之「植物」的定義中。將再生植物的後代、變異體及突變種亦納入「植物」的定義中。
eIF-5A總論
本發明係關於三種不同的eIF-5A同功異型物：老化誘發之eIF-5A；創傷誘發之eIF-5A；及生長eIF-5A。本發明提供分離自各種植物物種之eIf-5A的各種同功異型物，以及分離各種同功異型物eIF-5A的方法。本發明亦提供編碼該等本發明之各種eIf-5A同功異型物的聚核苷酸。本發明亦提供eIF-5A之同功異型物的反義聚核苷酸，以及含有該等聚核苷酸或反義聚核苷酸的表現載體。在一些實施例中，提供經由使用含有eIF-5A同功異型物之反義聚核苷酸的表現載體轉型植物，來抑制內源性eIF-5As表現的方法。在一些實施例中，提供藉由以有意義之方向提供含有eIF-5A同功異型物之聚核苷酸的表現載體，向上調節內源性eIF-5A同功異型物的方法。
不同的同功異型物在天然狀況下視植物之生命階段或植物的狀況而定受到向上或向下調節。例如，在正在老化的組織中，老化誘發之eIF-5A同功異型物受到向上調節。認為老化誘發之eIF-5A藉由使mRNA的特定子集(參與老化途徑者)自核穿梭至細胞質之間以便轉 譯，來參與植物或植物組織的進一步老化。藉由向下調節或抑制老化誘發之eIF-5A的表現，可在植物及/或植物組織中延遲老化。與非轉型或野外型的植物相比較，在轉型/轉殖基因植物中老化延遲表現為具有較大的生物質量、果實的存放期延長、花的存放期延長、種子尺寸增加及種子產量增加。
當植物及/或植物組織暴露在受傷事件，諸如寒冷、脫水或機械力下時，創傷誘發之eIF-5A同功異型物受到向上調節。藉由向下調節創傷誘發之eIF-5A的表現，與在非轉型或野外型植物中對病毒傷害的抗性相比較，對植物賦予了增加的對起因於病原體進入之病毒傷害的抗性。
當植物處於生長期時，生長eIF-5A同功異型物受到向上調節。藉由向上調節生長eIF-5A，所得轉殖基因植物具有增加的種子尺寸、增加的生物質量，以及增加的種子產量。
圖1顯示分離自擬南芥(「At」)之eIF-5A的三種同功異型物的比對。圖2顯示該三種同功異型物之密碼區的比對。圖3-5顯示三種同功異型物的基因組序列。
西方墨點(圖8)顯示在不同植物生命階段中，該三種同功異型物的表現。圖8顯示老化誘發之因子eIF-5A同功異型物之量隨著葉片年齡的增加而增加。其未見於未綻放的花芽、果莢或莖中，但可在已經浸潤的種子中見到。在已經浸潤的種子中，有子葉組織及正在生長的胚芽。因此，老化誘發之eIF-5A存在於已經浸潤的種子中，因為子葉組織隨著胚芽生長而逐漸老化。在已經浸潤的種子中見到生長eIF-5A，因為胚芽正積極地生長。在果莢、種子及莖中見到創傷誘發之eIF-5A，因為收獲該等組織時引起一些創傷。
雖然在不同的同功異型物之間，以及在不同植物物種的同功異型物之間有高度同源性(約85%)，但不同的同功異型物在3'UTR中彼此不 同。一個在同功異型物之間以及在物種之間高度保守區域為認為是羥腐胺離胺酸位點的區域。咸信羥腐胺離胺酸位點為以下胺基酸：5'-CKVVEVSTSKTGKHGHAKCHFV-3'(SEQ ID NO：32)。關於各種eIF-5A同功異型物及數個植物物種的比對，參見圖85。
老化誘發之eIF-5A
老化誘發之eIF-5A表現於老化組織中。本發明係關於擬南芥、番茄及康乃馨植物中老化誘發之eIF-5A的發現。在老化組織中老化誘發之eIF-5A受到向上調節，且其在植物及植物組織中參與誘發老化相關形態改變。在植物中抑制老化誘發之eIF-5A的表現，可用來在植物中改變老化及老化相關過程。可經由使用反義構築體，或經由使用有意義構築體而達成共抑制，進行向下調節。在轉殖基因植物中抑制老化誘發之eIF-5A的表現，結果產生各種形態改變，包括植物生物質量增加、果實軟化或腐敗延遲、切花或諸如萵苣葉之植物組織褐變延遲、種子產量增加及種子尺寸增加。
因此，本發明的一個實施例為自擬南芥中分離的老化誘發之eIF-5A。胺基酸序列提供於圖59中，並為SEQ ID NO：16。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖59中，並為SEQ ID NO：15。
本發明的另一實施例為自番茄中分離的老化誘發之eIF-5A。胺基酸序列提供於圖57及86中，並為SEQ ID NO：12。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖57及86中，並為SEQ ID NO：11。
本發明的另一實施例為自康乃馨中分離的老化誘發之eIF-5A。胺基酸序列提供於圖58中，並為SEQ ID NO：14。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖58中，並為SEQ ID NO：13。
本發明亦提供老化誘發之eIF-5A的經分離之聚核苷酸，其於上文列舉之SEQ ID NO具有90%的序列同源性，並在高嚴格度條件下與所列舉之SEQ ID NO的互補序列，以及編碼老化誘發之eIF-5A者雜交。
本發明亦提供老化誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸。反義聚核苷酸可具有任何長度，只要其能夠抑制表現即可。在一些實施例中，反義聚核苷酸包括全長密碼序列，而在其他特別較佳實施例中，反義聚核苷酸係針對3'UTR，因為eIF-5A的不同同功異型物在同功異型物3'UTR中具有更高度的改變。在一些實施例中，反義聚核苷酸係針對5'-非密碼序列。已知主要與5'-非密碼序列互補的反義聚核苷酸為編碼轉錄因子之基因之表現的有效抑制劑。Branch,M.A.,Molec.Cell Biol.,13：4284-4290(1993)。
當在本文及申請專利範圍中使用「老化誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸」一詞時，其不僅涵蓋與所列舉之SEQ ID NO之互補序列共享100%同源性的彼等反義聚核苷酸，亦涵蓋作為功能變異體的彼等反義聚核苷酸。功能變異體為天然或人造的彼等變異體，與老化誘發之eIF-5A的相應部分具有至少80%序列同源性，且在高嚴格度條件下與其雜交。此外，變異體必須具有本發明指定之功能，亦即當將其引入表現載體內，且其中將該載體併入至少一個植物細胞的基因組內時，能夠調節內源性老化誘發之eIF-5A的表現。熟習此項技術者能夠瞭解可在不會不利地影響反義聚核苷酸與轉錄物結合，並降低或抑制基因表現之能力的序列中，進行非實質的改變。因此，「反義聚核苷酸」一詞包括彼等實質上與轉錄物互補，且仍維持特異性地結合該轉錄物，並抑制或降低基因表現之能力的聚核苷酸。關於反義的普通討論，參見Alberts等人，細胞的分子生物學(Molecular Biology of the Cell)，第2版，Garland Publishing,Inc.New York,New York,1989(在特殊的第195-196頁，以引用的方式併入本文中)。
本發明的一個實施例提供包括(如上述本發明之)老化誘發之eIF-5A聚核苷酸或(如上述本發明之)老化誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸的表現載體。載體可為質體，或較佳可為病毒或此項技術中已知可 在植物細胞或細菌細胞中複製及表現其上所編碼之基因的其他載體。載體整合於染色體中，以使其能夠轉錄，產生所要老化誘發之eIF-5ARNA的反義聚核苷酸。可藉由此項技術中標準的重組DNA技術方法，建構該等質體或病毒載體。例如，載體可為含有在原核生物宿主中有功能的複製系統，及本發明之反義聚核苷酸的質體載體。或者，載體可為含有在農桿菌中有功能的複製系統，及本發明之反義聚核苷酸的質體。能夠在農桿菌中複製的質體為此項技術中已熟知。參見Miki等人，將外來DNA引入植物中的程序，植物分子生物學及生物技術中的方法(Procedures for Introducing Foreign DNA Into Plants,Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)，編B.R.Glick及J.E.Thompson.CRC Press(1993)，第67-83頁。
載體可進一步包括可操作地連接於聚核苷酸以容許該等聚核苷酸的表現的調控序列。調控序列可包括在被轉型之植物細胞中有功能的啟動基因。啟動基因可為可誘發的、組成性的或組織特異性的。該等啟動基因為熟習此項技術者所已知。
可與本發明之eIF-5A的各種同功異型物及DHS組合使用以產生基因之有意義或反義轉錄物的啟動基因調控元件通常包括任何植物啟動基因，而更特定言之為組成性啟動基因，諸如無花果樹瘤嵌紋病毒35S啟動基因、花椰菜花葉病毒啟動基因、CaMV35S啟動基因或MAS啟動基因，或組織特異性的或老化誘發之啟動基因，諸如康乃馨花瓣GST1啟動基因或擬南芥SAG12啟動基因(參見，例如J.C.Palaqui等人，Plant Physiol.,112：1447-1456(1996)；Morton等人，Molecular Breeding,1：123-132(1995)；Fobert等人，Plant Journal,6：567-577(1994)；以及Gan等人，Plant Physiol.,113：313(1997)，以引用的方式併入本文中)。較佳地，在本發明中使用的啟動基因為組成性啟動基因。當使用老化誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸時，較佳選用SAG12啟動基因。參見實例 23。
可使用習知表現系統來測試來自適用於本發明之啟動基因的表現量，例如藉由量測報導基因產物的含量，例如其中已引入啟動基因/報導基因之轉殖基因植物的葉片、花、果實或其他組織之萃取物中的蛋白質或mRNA。一例示性報導基因為GUS。
調控序列可視需要包括5'非轉譯前導序列或聚腺苷酸化信號或強化子。本發明可進一步涵蓋其他熟習此項技術者已知的調控序列。
本發明亦提供利用包括老化誘發之eIF-5A的聚核苷酸的本發明之載體或載體組合以有意義或反義方向轉型的轉殖基因植物細胞，自該種細胞產生的轉殖基因幼苗或成熟轉殖基因植物，或轉殖基因植物的植物部分，諸如花、果實、葉片、種子等等。
本發明亦提供抑制內源性老化誘發之eIF-5A表現的方法。該等方法包括將包括老化誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸的本發明之表現載體整合到植物的至少一個細胞的基因組內。使老化誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸轉錄，並抑制內源性老化誘發之eIF-5A的表現。
在抑制內源性老化誘發之eIF-5A表現的另一方法中，將以有意義的方向含有本發明之老化誘發之eIF-5A聚核苷酸的表現載體整合到植物的至少一個細胞的基因組內。使老化誘發之eIF-5A的聚核苷酸轉錄，且外源性老化誘發之eIF-5A的所得共表現引起向下調節或抑制內源性老化誘發之eIF-5A的表現。
創傷誘發之eIF-5A
創傷誘發之eIF-5A在受創組織中表現。本發明係關於在擬南芥及番茄中創傷誘發之eIF-5A之發現。本發明已經發現該同功異型物在植物之創傷事件期間受到向上調節。向上調節發生在轉錄層面。此外，在病毒感染後僅在蛋白質層面發生向上調節，此隨後引起細胞死亡，導致在病原體侵入的事件中，創傷誘發之eIF-5A驅使細胞死亡的推 論。圖9顯示在對照組植物、模倣處理之植物、Avr處理之植物及Vir處理之植物中，老化誘發之eIF-5A保持恆定(其在植物4週齡時偵測)。但在Vir處理之植物中，創傷誘發之eIF-5A受到向上調節。
圖10顯示以止血鉗使植物葉片受傷之實驗的結果。在受傷之後即刻、受傷之後1小時及9小時量測擬南芥(「At」)中老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A及生長eIF-5A的含量。北方墨點法顯示老化誘發之eIF-5A保持恆定，但創傷誘發之eIF-5A的表現量明顯增加。在受傷事件中，生長eIF-5A的表現量開始降低。
本發明已經證實當創傷誘發之eIF-5A受到向上調節並且植物上發生受傷事件(諸如在移植籽苗時所發生)時，該創傷導致生長eIF-5A受到極強抑制。參見圖14-17。所得植物之生長強烈受阻。但當將種子浸泡在康黴素中，並直接播種於土壤中(不需移植並因此沒有移植傷害)時，該種子發育成正常尺寸的植物。
在均已經併入有意義創傷誘發之eIF-5A構築體的各種測試植物之間所見到的差異(圖15)係歸因於創傷誘發之eIF-5A的表現程度不同。熟習此項技術者將瞭解在引入基因(有意義或反義)時，將得到不同程度的基因向上調節或向下調節。差異的程度將視在何處併入基因及併入多少個複本而定。藉由表現程度不同，可使各種表現型與基因表現發生關連。一旦產生所要表現型，便可挑選該植物，並用來產生所要後代。因此在圖15中，創傷誘發之eIF-5A受到強烈向上調節的植物在創傷事件後幾乎不生長(植物標籤10)，但生長稍佳的植物(但不如野外型一般好)(植物標籤4)則未受到強烈的向上調節。
本發明的一個實施例為自擬南芥分離的創傷誘發之eIF-5A。胺基酸序列提供於圖41中，並為SEQ ID NO：55。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖41中，並為SEQ ID NO：54。
本發明的另一實施例為自番茄分離的創傷誘發之eIF-5A。胺基酸 序列提供於圖103中，並為SEQ ID NO：57。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖103中，並為SEQ ID NO：56。
本發明亦提供經分離的創傷誘發之eIF-5A之聚核苷酸，其與上文列舉之SEQ ID NO具有90%的序列同源性，並在高嚴格度條件下與所列舉之SEQ ID NO的互補序列及編碼創傷誘發之eIF-5A者雜交。
本發明亦提供創傷誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸。反義聚核苷酸可具有任何長度，只要其能夠抑制表現即可。在一些實施例中，反義聚核苷酸包括全長密碼序列，而在其他特別較佳的實施例中，反義聚核苷酸係針對3'UTR，因為eIF-5A的不同同功異型物在3'UTR處具有高度的同功異型物改變。在一些實施例中，反義聚核苷酸係針對5'-非密碼序列。已知主要與5'-非密碼序列互補的反義聚核苷酸為編碼轉錄因子之基因的表現的有效抑制劑。Branch,M.A.,Molec.Cell Biol.,13：4284-4290(1993)。
當在本文及申請專利範圍中使用「創傷誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸」一詞時，不僅涵蓋與所列舉之SEQ ID NO之互補序列共享100%同源性的彼等反義聚核苷酸，而且以涵蓋為功能變異體的彼等反義聚核苷酸。功能變異體為如山所述者。變異體如本發明所指定起作用，亦即將其引入表現載體內且其中將該種載體併入至少一個植物細胞的基因組內時，能夠調節內源性創傷誘發之eIF-5A的表現。
本發明的一個實施例提供包括(如上所述本發明之)創傷誘發之eIF-5A聚核苷酸或(如上所述本發明之)創傷誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸的表現載體。載體係如上所述。
本發明亦提供用包括創傷誘發之eIF-5A的聚核苷酸的本發明之載體或載體組合以有意義或反義方向轉型的轉殖基因植物細胞，自該種細胞產生的轉殖基因幼苗或成熟轉殖基因植物，或轉殖基因植物的植物部分，諸如花、果實、葉片、種子等等。
本發明亦提供抑制內源性創傷誘發之eIF-5A表現的方法。該等方法包括將包括創傷誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸的本發明之表現載體整合到植物的至少一個細胞的基因組內。使創傷誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸轉錄，並抑制內源性創傷誘發之eIF-5A的表現。
在抑制內源性創傷誘發之eIF-5A表現的另一方法中，將以有意義方向含有本發明之創傷誘發之eIF-5A聚核苷酸的表現載體整合到植物的至少一個細胞的基因組內。使創傷誘發之eIF-5A的聚核苷酸轉錄，並且外源性創傷誘發之eIF-5A的所得共表現引起向下調節或抑制內源性創傷誘發之eIF-5A的表現。
藉由抑制內源性eIF-5A的表現，所得轉殖基因植物對病原體侵入所引起之毒力傷害的抗性增加。參見實例16以及圖43及44。
生長eIF-5A
本發明亦係關於生長eIF-5A。生長eIF-5A表現於正在生長的組織中。當以有意義的方向，利用生長eIF-5A之聚核苷酸向上調節eIF-5A時，可注意到三種表現型的變化：種子尺寸增加、生物質量增加，以及種子產量增加。
本發明的一個實施例為自擬南芥分離的生長eIF-5A。胺基酸序列提供於圖1中，並分別為SEQ ID NO：58-60。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖2中，並分別為SEQ ID NO：61-63。
本發明的另一實施例為自番茄分離的生長eIF-5A。胺基酸序列提供於圖101中，並為SEQ ID NO：65。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖101中，並為SEQ ID NO：64。
本發明的另一實施例為自康乃馨分離的生長eIF-5A。胺基酸序列提供於圖95中，並為SEQ ID NO：67。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖95中，並為SEQ ID NO：66。
本發明亦提供經分離的生長eIF-5A之聚核苷酸，其與上文列舉之 SEQ ID NO具有90%的序列同源性，並在高嚴格度條件下與所列舉之SEQ ID NO的互補序列及編碼生長eIF-5A者雜交。
本發明亦提供生長eIF-5As的反義聚核苷酸。反義聚核苷酸可具有任何長度，只要其能夠抑制表現即可。在一些實施例中，反義聚核苷酸包括全長密碼序列，而在其他特別較佳的實施例中，反義聚核苷酸係針對3'UTR，因為eIF-5A的不同同功異型物在3'UTR處具有高度的同功異型物改變。在一些實施例中，反義聚核苷酸係針對5'-非密碼序列。已知主要與5'-非密碼序列互補的反義聚核苷酸為編碼轉錄因子之基因的表現的有效抑制劑。Branch,M.A.,Molec.Cell Biol.,13：4284-4290(1993)。
當在本文及申請專利範圍中使用「生長eIF-5A的反義聚核苷酸」一詞時，不僅涵蓋與所列舉之SEQ ID NO之互補序列共享100%同源性的彼等反義聚核苷酸，而且亦涵蓋為功能變異體的彼等反義聚核苷酸。功能變異體為如上所述者。變異體如本發明所指定起作用，亦即將其引入表現載體內且其中將該種載體併入至少一個植物細胞的基因組內時，能夠調節內源性生長eIF-5A的表現。
本發明的一個實施例提供包括(如上所述本發明之)生長eIF-5A聚核苷酸或(如上所述本發明之)生長eIF-5A的反義聚核苷酸的表現載體。載體係如上所述。
本發明亦提供用包括生長eIF-5A的聚核苷酸的本發明之載體或載體組合以有意義或反義方向轉型的轉殖基因植物細胞，自該種細胞產生的轉殖基因幼苗或成熟轉殖基因植物，或轉殖基因植物的植物部分，諸如花、果實、葉片、種子等等。
本發明亦提供抑制內源性生長eIF-5A表現的方法。該等方法包括將包括生長eIF-5A的反義聚核苷酸的本發明之表現載體整合到植物的至少一個細胞的基因組內。使生長eIF-5A的反義聚核苷酸轉錄，並抑 制內源性生長eIF-5A的表現。
在抑制內源性生長eIF-5A表現的另一方法中，將以有意義的方向含有本發明之生長eIF-5A聚核苷酸的表現載體整合到植物的至少一個細胞的基因組內。使生長eIF-5A的聚核苷酸轉錄，並且外源性生長eIF-5A的所得共表現引起向下調節或抑制內源性生長eIF-5A的表現。
在本發明的另一實施例中，提供向上調節生長eIF-5A表現的方法。將以有意義方向含有本發明之生長eIF-5A的聚核苷酸的表現載體引入植物之至少一個細胞的基因組內。使生長eIF-5A的聚核苷酸轉錄，並且外源性生長eIF-5A的所得共表現引起細胞表現比非轉殖基因細胞多的生長eIF-5A。
圖19顯示生長eIF-5A受到向上調節之植物，具有勝過對照組植物之增加的生物質量。以有意義方向將生長eIF-5A插入擬南芥植物內，以向上調節生長eIF-5A的表現。檢定16個母株(1-16)，以測定生長eIF-5A表現的一般含量。自每個母株產生8個姊妹株(A-H)。測試每個母株中生長eIF-5A的表現量，並在圖20中顯示結果。在母株中注意到各種程度的表現。例如植株2及10具有極高表現量，而植株11及16具有極低或無表現。
圖21及22顯示得自植株1及2的植物。該等植物比對照組植物大。因為生長eIF-5A為細胞分裂同功異型物，並且因為其組成性表現，故存在細胞分裂增加。發生老化降低，因為該植物被鎖定在生長模式，而不能切換至老化路徑。
圖23及24為得自具有中等生長eIF-5A表現量的植株。其似乎具有較大的葉片且老化延遲。
圖25及26係得自具有低程度之向上調節的植株。其具有大葉片及大叢簇。
圖27及28為得自沒有向上調節(可能歸因於基因之共抑制)的植 株。因為該植物具有康黴素抗藥性，故該基因必須存在，以便使該植物得以在培養基上生長。似乎老化誘發之eIF-5A亦被共抑制，並因此導致尺寸增加。
除了生物質量增加之外，在生長eIF-5A受到向上調節的植物中種子尺寸亦增加。量測所有植株的種子尺寸。在具有最高eIF-5A表現量的植株中，種子尺寸可見增加超過3倍。此係因為生長eIF-5A的向上調節而發生，增加細胞分裂，並因此增加種子尺寸。
上文實例中之生長eIF-5A(來自擬南芥)係組成性表現，亦即經由使用通用啟動基因，在植物的每個地方皆表現。相反，藉由使用組織特異性啟動基因，可引導僅在特殊組織中向上調節。例如，藉由使用種子特異性啟動基因，生長eIF-5A將僅在種子中向上調節，從而容許葉片正常生長，但種子量卻增加。因此，使用特異性啟動基因，可在所要植物部分中向上調節生長eIF-5A，以得到所要表現型。
藉由向上調節生長eIF-5A，同時(或在相同植物中)出現三種表現型結果-生物質量增加、種子產量增加或種子尺寸增加，但並非所有的三種表現型皆出現。例如，若植物顯示種子尺寸增加，則將出現較小的植物。在具有生長eIF-5A之最高向上調節的植株中，產生最大的種子，但植物較小，因為在整個植物中持續進行大規模的細胞分裂，其代價為細胞擴大(需要較大的葉片)。以較低程度向上調節生長AteIF-5A的表現，可見對葉片的影響(較大)，但不影響種子。因此，可使用組織特異性表現，並挑選所要表現型。例如，可將生長eIF-5A置於木質部特異性啟動基因下，以達成所產生木質部之量增加。因此，可使用任何所要啟動基因，以達成所要組織特異性向上調節。
DHS
DHS為eIF-5A之活化所必需，並且在正老化的組織中表現。因此，本發明提供自擬南芥、番茄、康乃馨、油菜、萵苣、紫花苜蓿、香蕉、 白楊及葉斑病菌(mycosphaerella)分離的DHS。
因此，本發明的一個實施例為自擬南芥分離的DHS。胺基酸序列提供於圖46B中，並為SEQ ID NO：6。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖46A中，並為SEQ ID NO：5。圖46C中之核苷酸序列顯示於SEQ ID NO：26，而圖46D中之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：92。
本發明的另一實施例為自番茄分離的DHS。胺基酸序列提供於圖45A及B中，並為SEQ ID NO：2。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖45A及B中，並為SEQ ID NO：1。
本發明的另一實施例為自康乃馨分離的DHS。胺基酸序列提供於圖54中，並為SEQ ID NO：10。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖54中，並為SEQ ID NO：9。
本發明的另一實施例為自油菜分離的DHS。胺基酸序列提供於圖97中，並為SEQ ID NO：71。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖97中，並為SEQ ID NO：70。
本發明的另一實施例為自萵苣分離的DHS。圖105提供一部分萵苣DHS聚核苷酸序列。
本發明的另一實施例為自紫花苜蓿分離的DHS。胺基酸序列提供於圖107A及B中，並為SEQ ID NO：73。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖107A及B中，並為SEQ ID NO：72。
本發明的另一實施例為自香蕉分離的DHS。胺基酸序列提供於圖108A及B中，並為SEQ ID NO：75。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖108A及B中，並為SEQ ID NO：74。
本發明的另一實施例為自白楊分離的DHS。胺基酸序列提供於圖109A及B中，並為SEQ ID NO：77。編碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖109A及B中，並為SEQ ID NO：76。
本發明的另一實施例為自葉斑病菌分離的DHS。圖110提供一部分 萵苣DHS聚核苷酸序列。
本發明亦提供經分離的DHS之聚核苷酸，其與上文列舉之SEQ ID NO具有90%的序列同源性，並在高嚴格度條件下與所列舉之SEQ ID NO的互補序列及編碼DHS者雜交。
本發明亦提供DHS的反義聚核苷酸。反義聚核苷酸可具有任何長度，只要其能夠抑制表現即可。在一些實施例中，反義聚核苷酸包括全長密碼序列、針對3'UTR，或針對5'-非密碼序列。已知主要與5'-非密碼序列互補的反義聚核苷酸為編碼轉錄因子之基因的表現的有效抑制劑。Branch,M.A.,Molec.Cell Biol.,13：4284-4290(1993)。
當在本文及申請專利範圍中使用「DHS的反義聚核苷酸」一詞時，不僅涵蓋與所列舉之SEQ ID NO之互補序列共享100%同源性的彼等反義聚核苷酸，亦涵蓋為功能變異體的彼等反義聚核苷酸。功能變異體為如上所述者。變異體如本發明所指定起作用，亦即將其引入表現載體內且其中將該種載體併入至少一個植物細胞的基因組內時，能夠調節內源性DHS的表現。
本發明的一個實施例提供包括(如上所述本發明之)DHS聚核苷酸或(如上所述本發明之)DHS之反義聚核苷酸的表現載體。載體係如上所述。
本發明亦提供用包括DHS之聚核苷酸的本發明之載體或載體組合以有意義或反義方向轉型的轉殖基因植物細胞，自該種細胞產生的轉殖基因幼苗或成熟轉殖基因植物，或轉殖基因植物的植物部分，諸如花、果實、葉片、種子等等。
本發明亦提供抑制內源性DHS表現的方法。該等方法包括將包括DHS的反義聚核苷酸的本發明之表現載體整合到植物的至少一個細胞的基因組內。使DHS的反義聚核苷酸轉錄，並抑制內源性DHS的表現。
在抑制內源性DHS表現的另一方法中，將含有本發明之DHS聚核 苷酸的表現載體以有意義方向整合到植物的至少一個細胞的基因組內。使DHS的聚核苷酸轉錄，並且外源性DHS的所得共表現引起向下調節或抑制內源性DHS的表現。
藉由抑制內源性DHS的表現，所得轉殖基因植物沒有或具有實質上較少活化eIF-5A的DHS蛋白質。如較早討論，eIF-5A必須活化方可使其在生物學上適用。因此，藉由反義聚核苷酸或藉由與有意義聚核苷酸的共抑制來抑制或降低DHS的表現，所得轉殖基因植物將沒有活性eIF-5A，或有降低活性的eIF-5A。該等轉殖基因植物將顯示出植物之生物質量增加、種子產量增加，及/或種子尺寸增加。具有DHS之反義聚核苷酸的轉殖基因植物顯示光合作用增加，且亦具有增加的澱粉含量。參見實例24及25。
藉由利用對DHS具特異性之抑制劑處理康乃馨花，可提供更多的證據支持DHS及eIF-5A在老化中扮演調控角色的論點。亞精胺及eIF-5A為DHS反應的受質(Park等人，1993；Park等人，1997)。數個具有類似於亞精胺之結構特徵的單胺、二胺及多胺在活體外抑制DHS活性(Jakus等人，1993)。已經普遍使用一些多胺，諸如亞精胺、腐胺及精胺，來延長康乃馨的花瓶壽命(Wang及Baker,1980)。經由以不同濃度的不同多胺來處理，Wang等人(未公開b)能夠延長康乃馨花的花瓶壽命2倍。使用暫時感染系統來向下調節DHS的其它研究正在進行。初步資料指出在利用表現反義DHS之暫時感染系統真空滲透的切割康乃馨中，在第8天的存活百分比幾乎為未經處理花的4倍高(Wang等人，未公開b)。
除歸因於逆境的生長損失以外的另一主要農業損失為收穫後逆境誘發之老化(McCabe等人，2001)。此對於部分處理的植物，諸如切割的萵苣尤其如此。切隔萵苣的一個症狀為褐變，此為酚產生的結果(Matile等人，1999)。利用萵苣eIF-5A(LeIF-5A)之反義聚核苷酸或反義 全長DHS的萵苣田野試驗證實轉殖基因萵苣在切割之後對褐變之抗性明顯比對照組萵苣強。似乎雖然歸因於收穫所致之逆境誘發老化具有不同的通路(Page等人，2001)，但褐變及其他可能的老化症狀上游之轉譯控制至少部分受DHS及eIF-5A調控。調控老化的下游為執行基因。其為老化的效應物並引起代謝改變，該改變促成老化症狀。顯然在eIF-5A及DHS受到向下調節時能夠阻止整個範圍的由老化引起的症狀。
本發明亦係關於識別三種eIF-5A同功異型物(老化誘發因子eIF-5A；創傷因子eIF-5A及生長因子eIF-5A)的抗體。
本發明亦提供在其他植物及真菌中，鑑別老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A及DHS的方法。藉由使用在本文中描述的方法及所提供之序列，設計用來分離/鑑別所要同功異型物或DHS的探針。因為eIF-5A的同功異型物(老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A及生長eIF-5A)在密碼區通常高度同源(參見圖2)，因此為確保鑑別且甚至改變所要同功異型物的擴大，較佳自5'UTR的起點及3"UTR的終點來設計探針或引子。(參見圖3、4及5)。一組較佳的用來擴大創傷誘發之eIF-5A的引子或用來鑑別創傷誘發之eIF-5A的探針如下。下游引子為5'GAG CTC AAG AAT AAC ATC TCA TAA GAAAC3'(SEQ ID NO：33)，上游引子為5'CTC GAG TGC TCA CTT CTC TCT CTT AGG3'(SEQ ID NO：34)。
在自植物或植物部分中分離創傷誘發之eIF-5A之前，最佳引入創傷事件以容許植物開始表現創傷誘發之eIF-5A。任何創傷事件均可接受，而一種此類例示性創傷事件包括在中央葉脈處壓扁葉片。類似地，在分離老化誘發之eIF-5A之前，最佳給植物組織逆境以便誘發老化。
現已一般性描述本發明，其將經由參考下列實例更容易瞭解，該等實例係以說明的方式提供且並不意欲限制本發明。
實例 實例1
信使RNA(mRNA)分離
自處於各種發育階段的番茄花及番茄果實，及自葉片(未經處理或在寒冷或山梨糖醇處理之後)分離總RNA。在液氮中簡單地磨碎組織(5克)。將磨碎的粉末與30毫升胍鹽緩衝液(4 M異硫氰酸胍(guanidinium isothiocyanate)、2.5 mM NaOAc(pH 8.5)、0.8%巰基乙醇)混合。經由四層棉布(cheesecloth)過濾該混合物，並在4℃下以10,000 Xg離心30分鐘。隨後對上清液進行26,000 Xg的氯化銫密度梯度離心20小時。以75%乙醇沖洗集結RNA，再懸浮於600微升經DEPC處理的水中，並在-70℃下利用0.75毫升95%乙醇及30微升3 M NaOAc使RNA沈澱。在1.2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分級分離10微克RNA，並轉移至耐綸膜上。使用隨機引子化之32P-dCTP標記之全長DHS cDNA(SEQ ID NO：1)，在42℃下探測該膜隔夜。隨後在室溫下以含有0.1% SDS的1X SSC洗滌該膜一次15分鐘，並在65℃下以含有0.1% SDS的0.2X SSC洗滌該膜三次每次15分鐘。在-70℃下以該膜使x-光軟片曝光隔夜。
使用獲自Promega的聚A+束mRNA分離系統，自總RNA分離聚A+ mRNA。使用聚A+ mRNA作為模板，以供使用獲自Stratagene(La Jolla,Calif.)的ZAP Express® cDNA合成系統進行cDNA合成。
番茄葉片cDNA庫的篩選
將使用分離自已經暴露在2 M山梨糖醇下6小時之Match F1雜交番茄葉片的mRNA來製備的cDNA庫稀釋至約5x106 PFU/毫升。使用32P標記之600個鹼基對的RT-PCR片段來篩選該cDNA庫。切下三個陽性的cDNA純系，並使用製造商說明書中的方法，再度環化成pBK-CMV®(Stratagene)噬粒。將全長cDNA插入pBK-CMV載體中。
質體DNA分離、DNA定序
使用Sambrook等人(前述)描述的鹼性溶解方法分離質體DNA。使用二脫氧定序法，定序全長陽性cDNA純系。Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74：5463-5467。使用BLAST搜尋(GenBank,Bethesda,MD)彙編並分析開放閱讀框架，並使用BCM Search Launcher：多重序列比對模式誘發之多重比對法(參見F.Corpet,Nuc.Acids Res.,16：10881-10890,(1997))，達成五個最具同源性蛋白質與編碼基因之衍生胺基酸序列的比對。藉由MultiFinder鑑別出衍生胺基酸序列中所存在的功能基元。
番茄RNA的北方墨點雜交
在1%變性甲醛瓊脂糖凝膠上，對分離自各種階段的番茄花(花芽及花朵，以及盛開或脫水的老化花瓣)、番茄葉片，以及各種成熟階段的番茄果實(破色期，亦即具有少於10%紅色的綠色果實，粉紅，亦即整個果實為橘色或粉紅色，及紅色的，無論為軟或硬)之10微克總RNA進行分離，並固定在耐綸膜上。使用利用隨機引子套組(Boehringer Mannheim)以32P-dCTP標記的全長番茄cDNA來探測濾紙(7x107 cpm)。在室溫下以1xSSC、0.1% SDS洗滌濾紙一次，並在65℃下以0.2xSSC、0.1% SDS洗滌三次。將濾紙乾燥，並在-70℃下以該濾紙使X-光軟片曝光隔夜。結果顯示於圖50-52中。
擬南芥RNA的北方墨點雜交
如上所述自五週齡(泳道1)、六週齡(泳道2)及七週齡(泳道3)之擬南芥植物的葉片中分離總RNA，在1%變性甲醛瓊脂糖凝膠上進行分離，並固定在耐綸膜上。使用利用隨機引子套組(Boehringer Mannheim)以32P-dCTP標記的全長擬南芥老化誘發之DHS cDNA來探測濾紙(7x107 cpm)。在室溫下以1xSSC、0.1% SDS洗滌濾紙一次，並在65℃下以0.2xSSC、0.1% SDS洗滌三次。將濾紙乾燥，並在-70℃下以該濾紙使X-光軟片曝光隔夜。結果顯示於圖55中。
康乃馨RNA的北方墨點雜交
如上所述自處於花發育之各種階段，亦即緊閉花苞之花(泳道1)、開始綻放(泳道2)、完全綻放之花(泳道3)、具有未捲起花瓣之花(泳道4)的康乃馨植物之花瓣分離總RNA，在1%變性甲醛瓊脂糖凝膠上進行分離，並固定在耐綸膜上。使用利用隨機引子套組(Boehringer Mannheim)以32P-dCTP標記的全長康乃馨老化誘發之DHS cDNA來探測濾紙(7x107 cpm)。在室溫下以1xSSC、0.1% SDS洗滌濾紙一次，並在65℃下以0.2xSSC、0.1% SDS洗滌三次。將濾紙乾燥，並在-70℃下以該濾紙使X-光軟片曝光隔夜。結果顯示於圖56中。
實例2
山梨糖醇誘發番茄老化誘發之DHS基因
在密封腔室中以2 M山梨糖醇處理番茄葉片6小時。如下自經山梨糖醇處理的葉片中萃取RNA。
在液氮中磨碎葉片(5克)。將磨碎的粉末與30毫升胍鹽緩衝液(4M異硫氰酸胍、2.5 mM NaOAc(pH 8.5)、0.8%巰基乙醇)混合。經由四層棉布過濾該混合物，並在4℃下以10,000 Xg離心30分鐘。隨後對上清液進行26,000 Xg的氯化銫密度梯度離心20小時。以75%乙醇洗滌集結RNA，再懸浮於600微升經DEPC處理的水中，並在-70℃下利用0.75毫升95%乙醇及30微升3 M NaOAc使RNA沈澱。在1.2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分級分離10微克RNA，並轉移至耐綸膜上。使用隨機引子化之32P-dCTP標記之全長DHS cDNA(SEQ ID NO：1)，在42℃下探測該膜隔夜。隨後在室溫下以含有0.1% SDS的1X SSC洗滌該膜一次15分鐘，並在65℃下以含有0.1% SDS的0.2X SSC洗滌該膜三次每次15分鐘。在-70℃下以該膜使x-光軟片曝光隔夜。
結果顯示於圖52中。如可見，藉由山梨糖醇在葉片中誘發出DHS的轉錄。
實例3
在正老化的花中誘發番茄DHS基因
收穫番茄植物之緊閉花苞及綻放、老化之花朵，並按照實例2分離RNA。在1.2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分級分離10微克RNA，並轉移至耐綸膜上。使用隨機引子化之32P-dCTP標記之全長DHS cDNA(SEQ ID NO：1)，在42℃下探測該膜隔夜。隨後在室溫下以含有0.1% SDS的1X SSC洗滌該膜一次15分鐘，並接著在65℃下以含有0.1% SDS的0.2X SSC洗滌該膜三次每次15分鐘。在-70℃下以該膜使x-光軟片曝光隔夜。
結果顯示於圖50中。如可見，在正老化之花朵中誘發出DHS的轉錄。
實例4
在成熟果實中誘發番茄DHS基因
按照實例2，自破色期果實、粉紅色及成熟果實分離RNA。在1.2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分級分離10微克RNA，並轉移至耐綸膜上。使用隨機引子化之32P-dCTP標記之全長DHS cDNA(SEQ ID NO：1)(圖45)，在42℃下探測該膜隔夜。隨後在室溫下以含有0.1% SDS的1X SSC洗滌該膜一次15分鐘，並接著在65℃下以含有0.1% SDS的0.2X SSC洗滌該膜三次每次15分鐘。在-70℃下以該膜使x-光軟片曝光隔夜。
結果顯示於圖51中。如可見，在緊接在導致腐敗之老化開始之前的成熟、紅色果實中，DHS的轉錄最強。
實例5
藉由寒冷誘發番茄老化誘發之DHS基因
在生長室中，將盆中的番茄植物(7-8週齡)暴露在6℃下2天、3天或6天。設定光週期為8小時暗及16小時亮。藉由將植物移回到溫室，使植物再升溫。在自生長室中移除之後即刻收穫未再升溫的植物。如下自葉片中萃取RNA。
在液氮中磨碎葉片(5克)。將磨碎的粉末與30毫升胍鹽緩衝液(4 M異硫氰酸胍、2.5 mM NaOAc(pH 8.5)、0.8%巰基乙醇)混合。經由四層棉布過濾該混合物，並在4℃下以10,000 g離心30分鐘。隨後對上清液進行26,000 g的氯化銫密度梯度離心20小時。以75%乙醇洗滌集結RNA，再懸浮於600微升經DEPC處理的水中，並在-70℃下利用0.75毫升95%乙醇及30微升3 M NaOAc使RNA沈澱。在1.2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分級分離10微克RNA，並轉移至耐綸膜上。使用隨機引子化之32P-dCTP標記之全長DHS cDNA(SEQ ID NO：1)，在42℃下探測該膜隔夜。隨後在室溫下以含有0.1% SDS的1X SSC洗滌該膜一次15分鐘，並在65℃下以含有0.1% SDS的0.2X SSC洗滌該膜三次每次15分鐘。在-70℃下以該膜使x-光軟片曝光隔夜。
結果顯示於圖53中。如可見，藉由暴露在寒冷的溫度下且接著再升溫，在葉片中誘發出DHS的轉錄，並如膜洩漏所量測，轉錄增強與寒冷傷害有關。
實例6
使用基於未鑑別擬南芥基因組序列之引子產生擬南芥PCR產物
使用一對自擬南芥基因組序列設計的寡核苷酸引子，藉由PCR，自擬南芥cDNA模板產生部分長度的老化誘發之DHA序列。5'引子為具有序列5'-GGTGGTGTTGAGGAAGATC的19體(SEQ ID NO：7)；3'引子為具有序列GGTGCACGCCCTGATGAAGC-3'的20體(SEQ ID NO：8)。如下使用擴大高保真度PCR系統(Boehringer Mannheim)及擬南芥老化葉片cDNA庫作為模板進行聚合酶鏈反應。
反應組份：
cDNA 1微升(5x107 pfu)
dNTP(各10 mM) 1微升
MgCl2(5 mM)+10x緩衝液 5微升
引子1及2(各100 μM) 2微升
擴大高保真度DNA聚合酶 1.75單位
反應體積 50微升
反應參數：
94℃維持3分鐘
94℃/1分鐘，58℃/1分鐘，72℃/2分鐘，進行45次循環
72℃維持15分鐘。
實例7
分離基因組DNA及南方分析
藉由在液氮中將10公克番茄葉片組織磨成細粉，自番茄葉片萃取基因組DNA。將預熱至60℃之37.5毫升含有25毫升均質化緩衝液[100 mM Tris-HCl(pH 8.0)，100 mM EDTA，250 mM NaCl，1%十二烷基肌胺酸鈉(sarkosyl)，1% 2-巰基乙醇，10微克/毫升RNA酶及12.5毫升苯酚]的混合物添加至磨碎的組織中。搖動該混合物15分鐘。再將12.5毫升氯仿/異戊醇(24：1)添加至該混合物中，並再搖動15分鐘。離心該混合物，並以25毫升苯酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)及氯仿/異戊醇(24：1)再度萃取液相。藉由在室溫下用15毫升異丙醇沈澱，回收核酸。將沈澱物再懸浮於1毫升水中。
如下對基因組DNA進行限制酵素消化：以400微升之總反應體積，使10微克基因組DNA、40微升10X反應緩衝液及100單位限制酵素(XbaI、EcoRI、EcoRV或HinDIII)反應5至6小時。隨後對該混合物進行苯酚萃取及乙醇沈澱。對經消化的DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上在15伏特下進行瓊脂糖凝膠電泳約15小時。將凝膠浸入變性緩衝液[87.66公克NaCl及20公克NaOH/公升]中30分鐘，同時溫和攪動，以蒸餾水沖洗，並浸入中和緩衝液[87.66公克NaCl及60.55公克tris-HCl(pH7.5)/公升]中30分鐘，同時溫和攪動。藉由毛細管沾染，將DNA轉移至Hybond-H+ 耐綸膜上。
在42℃下，使用1x106 cpm/毫升的32P-dCTP標記之全長DHS cDNA或DHS cDNA純系的3'-非密碼區，進行雜交隔夜。在含有50%甲醯胺、6X SSC、5X登哈特氏溶液、0.1%SDS及100毫克/毫升變性鮭精DNA的緩衝液中，進行預雜交及雜交。使該膜預雜交2至4小時；進行雜交隔夜。
在雜交完成之後，在室溫下以2X SSC及0.1% SDS沖洗該膜，並隨後以2X SSC及0.1% SDS洗滌15分鐘，並以0.2X SSC及0.1%SDS洗滌15分鐘。隨後在-80℃下以該膜使x-光軟片曝光隔夜。結果顯示於圖49中。
實例8
自擬南芥分離老化誘發之eIF-5A基因
使用擬南芥的老化葉片cDNA庫作為模板，藉由PCR獲得在擬南芥葉片中表現的老化誘發之eIF-5A基因的全長cDNA純系。一開始使用與載體T7引子<AATACGACTCACTATAG>(SEQ ID NO：18)配對的簡併上游引子<AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(SEQ ID NO：17)，以及與載體T3引子<ATTAACCCTCACTAAAG>(SEQ ID NO：20)配對的簡併下游引子<TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(SEQ ID NO：19)，製備對應於基因之5'及3'末端的PCR產物。將該PCR產物次選殖至pBluescript內以供定序。隨後使用與3'-特異性引子<AGAAGAAGTATAAAAACCATC>(SEQ ID NO：22)配對的5'-特異性引子<CTGTTACCAAAAAATCTGTACC>(SEQ ID NO：21)，獲得全長cDNA，並將其次選殖至pBluescript內以供定序。
實例9
自番茄果實分離老化誘發之eIF-5A基因
使用番茄果實cDNA庫作為模板，藉由PCR獲得在番茄果實中表現的老化誘發之eIF-5A基因的全長cDNA純系。一開始，使用與載體T7 引子(SEQ ID NO：18)配對的簡併上游引子(SEQ ID NO：17)，以及與載體T3引子(SEQ ID NO：20)配對的簡併下游引子(SEQ ID NO：19)，製備對應於基因之5'及3'末端的PCR產物。將該PCR產物次選殖至pBluescript內以供定序。隨後使用與載體T7引子(SEQ ID NO：18)配對的5'-特異性引子<AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG>(SEQ ID NO：23)，獲得全長的cDNA，並將其次選殖至pBluescript內以供定序。
實例10
自康乃馨分離老化誘發之eIF-5A基因
使用康乃馨老化花朵之cDNA庫作為模板，藉由PCR獲得在康乃馨花中表現的老化誘發之eIF-5A基因的全長cDNA純系。一開始，使用與載體T7引子(SEQ ID NO：18)配對的簡併上游引子(SEQ ID NO：17)，以及與載體T3引子(SEQ ID NO：20)配對的簡併下游引子(SEQ ID NO：19)，製備對應於基因之5'及3'末端的PCR產物。將該PCR產物次選殖至pBluescript內以供定序。隨後使用與3'-特異性引子<ACCAAAACCTGTGTTATAACTCC>(SEQ ID NO：25)配對的5'-特異性引子<TTTTACATCAATCGAAAA>(SEQ ID NO：24)，獲得全長的cDNA，並將其次選殖至pBluescript內以供定序。
實例11
自擬南芥分離老化誘發之DHS基因
藉由篩選擬南芥老化葉片的cDNA庫，獲得在擬南芥葉片中表現的老化誘發之DHS基因的全長cDNA純系。用來篩選的探針序列(SEQ ID NO：26)顯示於圖82中。使用老化葉片之cDNA庫作為模板及自GenBank中未鑑別基因組序列(AB017060)設計之引子，藉由PCR獲得探針。
實例12
自康乃馨分離老化誘發之DHS基因
藉由篩選康乃馨老化花瓣的cDNA庫，獲得在康乃馨花瓣中表現的老化誘發之DHS基因的全長cDNA純系。用來篩選的探針序列(SEQ ID NO：27)顯示於圖83中。使用老化花瓣的cDNA庫作為模板，以及簡併引子(上游：5'TTG ARG AAG ATY CAT MAA RTG CCT 3')(SEQ ID NO：28)；下游：5'CCA TCA AAY TCY TGK GCR GTG TT3')(SEQ ID NO：29))，藉由PCR獲得探針。將該PCR產物次選殖至pBluescript內以供定序。
實例13
以反義方向，利用擬南芥DHS之全長或3'區轉型擬南芥
以含有全長的老化誘發之擬南芥DHS cDNA序列或DHS基因之3'末端(SEQ ID NO：30)(圖80)的二元載體pKYLX71轉型農桿菌，兩者皆以反義組態表現並處於雙35S啟動基因的調控下。藉由真空滲透，以經轉型之農桿菌轉型擬南芥植物，並以胺芐青黴素選擇來自所得T0植物的轉型種子。
圖65-68為經轉型之擬南芥植物的照片，顯示以反義方向在經轉型之植物中表現DHS基因或其3'末端產生增加的生物質量，例如較大的葉片及增加的植物尺寸。圖69說明轉殖基因擬南芥植物具有增加的種子產量。
實例14
以反義方向，利用番茄DHS之全長或3'區轉型番茄植物
以含有全長的老化誘發之番茄DHS cDNA序列或DHS基因之3'末端(SEQ ID NO：31)(圖81)的二元載體pKYLX71轉型農桿菌，兩者皆以反義組態表現並處於雙35S啟動基因的調控下。利用該等農桿菌形成番茄葉片的外植體，並產生經轉型的癒傷組織及幼苗，再藉由標準組織培養方法選擇。在溫室條件下，使經轉型的幼苗生長成產生成熟果實的T1植物。
圖70-79為顯示在經轉型之植物中老化誘發之番茄DHS基因的表現減少產生增加之生物質量的照片，例如較大的葉片尺寸及較大的植物，如在經轉型之擬南芥植物中所見，以及番茄果實的軟化及腐敗延遲。
實例15
以反義方向，利用番茄DHS之3'區轉型番茄植物
以含有DHS基因之3'末端(圖81)的二元載體pKYLX71轉型農桿菌，其係以反義組態表現並處於雙35S啟動基因的調控下。利用該等農桿菌形成番茄葉片的外植體，並產生經轉型的癒傷組織及幼苗，再藉由標準組織培養方法選擇。在溫室條件下，使經轉型的幼苗生長成產生成熟果實的T1植物。
來自該等具有減少DHS表現之轉殖基因植物的果實完全沒有頂腐病，在該條件下約33%來自對照組植物的果實發展出該疾病。頂腐病為生理學的疾病，可歸因於營養逆境，引起果實基(花)端的老化及腐爛。圖84A及84B為顯示展現頂腐病之對照組果實及無頂腐病之轉殖基因果實的照片。
結果指出減少DHS的表現可防止起因於生理學疾病之組織及細胞死亡的發生。
實例16
在野外型哥倫比亞(Columbia)植物材料中，表現擬南芥轉譯起始因子5A(AteIF-5A)同功異型物
在6吋花盆中在Promix BX土壤(Premier Brands,Brampton,ON,Canada)中培養擬南芥哥倫比亞生態型(ecotype)的種子。將新近播種的花盆放在4℃下2天，並隨後轉移至在22℃下操作並具有16小時亮/8小時暗之週期的生長室中。藉由冷白螢光燈泡提供每秒每平方公尺150微莫耳照射的照明。在2週至7週齡時，以一週間隔收集完整的叢簇， 在第5週收集莖生葉，在第6週收集莖、果莢、花苞及花，亦收集已浸潤的種子(在水中24小時)，在液氮中急驟冷凍，並儲存在-80℃下。
以丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)感染擬南芥
在含有64個生長孔的平台上，將擬南芥哥倫比亞生態型的種子撒播在Promix BX土壤(Premier Brands,Brampton,ON,Canada)上。將已經播種的平台在4℃下維持2天，並轉移至具有9小時亮/15小時暗之光週期的生長室。在4週齡時處理所有植物，不過在生理學上歸因於縮短光週期，發育似乎變得較慢。
以獲自Robin Cameron博士(University of Toronto,Toronto,Canada)的無毒力(avr)及有毒力(vir)菌株丁香假單胞菌番茄變種(Pseudomonas syringae pv.Tomato)DC 3000，感染4週齡植物的叢生葉。使用無針頭的1毫升注射筒，接種每個植物叢生葉的遠軸面。使用四種處理之一來處理植物：不接種、以10 mM MgCl2模倣接種、以avr丁香假單胞菌菌株(每毫升10 mM MgCl2含106 cfu)接種，或以vir丁香假單胞菌菌株(每毫升10 mM MgCl2含106 cfu)接種。進行兩次細菌計數，一次在接種之後即刻進行，而第二次在3天之後進行，以確保有足量的細菌滲透，以便在avr處理中誘發全身性的後天抗性。在預定的時間點收穫接種的葉片，以便進行後續的分析。
使用反義T-DNA插入任一基因，發展出具有減少的DHS或創傷誘發之eIF-5A表現的植物。該等植株已經對丁香假單胞菌番茄變種DC 300顯示出明顯的抗性，其中轉殖基因株相對於野外型植物顯示細菌負荷降低多達99%。參見圖43及44。使用作物植物的資料亦指出病原體抗性增強。
利用止血鉗使擬南芥植物受傷
根據Stotz等人(2000)，藉由以止血鉗沿著中央葉脈壓扁(約10%的葉片表面)，使在正常光照條件下生長的4週齡植物受傷。在0分鐘、1 小時及9小時時收穫組織，並即刻在液氮中冷凍，且儲存在-80℃下，以便進行進一步的分析。
RNA分離及北方墨點法
根據Davis等人(1986)，自擬南芥叢生葉分離總RNA，以便進行北方墨點分析。在1%瓊脂糖凝膠上分級分離RNA，並轉移至耐綸膜上。(Davis等人，1986)。在42℃下使經固定的RNA與老化誘發之AteIF-5A、創傷誘發之AteIF-5A或生長AteIF-5A的經放射性標記之3'UTR部分雜交。使用隨機引子套組(Boehringer Mannheim)，以[α-32P]-dCTP標記3'UTR。在42℃下以含有0.1% SDS的2X SSC洗滌雜交膜兩次15分鐘，並在42℃下以含有0.1% SDS的1X SSC洗滌兩次30分鐘。藉由自動放射照相術在-80℃下曝光隔夜之後觀測雜交。
抗體產生及純化
擬南芥(At)的真核轉譯起始因子5A(eIF-5A)同功異型物在胺基酸層面高度同源，尤其在蛋白質的N端區及中心區(圖1)。為了獲得同功異型物特異性的抗體，設計針對在AteIF-5A之同功異型物中似乎為彼此獨特之區域的肽。在每個肽的N端處添添加一額外的半胱胺酸殘基以便與KLH共軛。所使用之序列為：對於老化誘發之AteIF-5A為CNDDTLLQQIKS(SEQ ID NO：35)，對於創傷誘發之AteIF-5A為CTDDGLTAQMRL(SEQ ID NO：36)，且對於生長AteIF-5A為CTDEALLTQLKN(SEQ ID NO：37)。當將該等序列提交至蛋白質BLAST(短的近乎精確序列；受限於擬南芥；預期數20000；字長2；矩陣PAM90；間隙懲罰91)時，在資料庫中找到的大量序列僅與AteIF-5A匹配，而不與其他匹配。該等肽在西安大略大學肽合成實驗室(University of Western Ontario Peptide Synthesis facility)合成。根據Drenckhahn等人(1993)，以及Collawn及Patterson(1999)，使用間-順丁烯二醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯，將載體蛋白質匙孔螺血氰 蛋白(Sigma)共軛至肽的N端半胱胺酸。按兩週之間隔，以已經連接的肽注射兔子四次。在最後一次注射之後兩週，藉由將兔子放血來收集血液，並使所收集的血液凝固，以便收集抗血清。
蛋白質分級分離及西方墨點法
在微量離心管中利用小杵，或利用大的臼與杵，在緩衝液(50 mM EPPS(pH 7.4)，0.25 M山梨糖醇，10 mM EDTA，2 mM EGTA，1 mM DTT，10 mM胺基-正癸酸，植物組織的蛋白酶抑制劑混合物(Sigma))中，將上文列舉的組織均質化(約0.5公克/毫升)。在微量離心機上，以最大速度簡單地離心勻漿，並拋棄離心塊。根據Ghosh等人(1988)將總蛋白質定量。在微型蛋白質二元板單元(BioRad,Mississauga,Ontario)上進行SDS-PAGE，並以考馬斯亮藍R250(Coomassie brilliant blue R250)(Fairbanks等人，1971)對凝膠(12%聚丙烯醯胺)染色，或使用半乾轉移法(半乾轉移單元，Bio-Rad,Hercules,CA)將凝膠轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在1毫克/毫升聚乙烯醇中，阻斷墨點30秒(Miranda等人，1993)，並在含有0.1%(體積/體積)吐溫20(Tween 20)及5%(重量/體積)奶粉的磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中阻斷1小時。以含有0.1%(體積/體積)吐溫20及1%(重量/體積)奶粉的PBS，將初級抗體(得自在第二次注射之後的採血)稀釋至1：50。使用與鹼性磷酸酶偶合的針對兔子抗體在山羊中製備的二級抗體(Bioshop,Burlington,Ontario)及磷酸酶受質NBT及BCIP(BioRad,Mississauga,ON)，使抗原呈現。
實例17
產生過度表現三種eIF-5A同功異型物之轉型擬南芥植物
引子設計
擬南芥(At)的真核轉譯起始因子5A(eIF-5A)同功異型物在密碼區中高度同源(圖2)。為避免擴大正確基因時出現問題，自分別在圖3、4及5中所示的接近5'UTR之起點及3'UTR之終點，設計老化誘發之 AteIF-5A、創傷誘發之eIF-5A及生長eIF-5A的引子。以在GenBank資料庫中的EST資訊及其他序列資訊為基礎，估計5'UTR及3'UTR。在引子的末端添加適當的限制性位點，以有意義的方向連接於pKYLX71二元載體中(圖6)。關於老化誘發之AteIF-5A，上游引子為5'AAGCTT GATCGTGGTCAACTTCCTCTGTTACC3'(SEQ ID NO：38)，而下游引子為5'GAGCT CAGAAGAAGTATAAAAACCATC3'(SEQ ID NO：39)。至於創傷誘發之AteIF-5A，上游引子為5'CTC GAGTGC TCACTTCTCTCTCTTAGG3'(SEQ ID NO：40)，而下游引子為5'GAGCTCA AGAATAACATCTCATAAGAAAC3'(SEQ ID NO：41)。生長AteIF-5A的上游引子為5'CTC GAGCTAAACTCCATTCGCTGACTT CGC3'(SEQ ID NO：42)，而下游引子為5'GAGC TCTAGTAAATATAAGAGTGTCTTGC3'(SEQ ID NO：43)。添加至引子內的限制性位點，關於老化誘發之AteIF-5A為HindIII及SacI，關於創傷誘發之AteIF-5A為XhoI及SacI，而關於生長AteIF-5A則為XhoI及SacI，如在上文列舉之引子中加下標線所指示。
自擬南芥分離基因組DNA
自3-週齡的叢生葉分離基因組DNA。在萃取緩衝液(200 mM Tris pH 7.5，250 mM NaCl，25 mM EDTA，0.5% SDS)中將組織均質化，並渦旋所得勻漿15秒。藉由在微量離心機中以最大速度離心1分鐘，移除殘餘碎片。收集上清液，並按1：1之比例與異丙醇混合，渦旋並在室溫下留置2分鐘。藉由在微量離心機中，以最大速度離心5分鐘收集離心塊，以70%乙醇洗滌，並真空乾燥2分鐘。將乾燥離心塊再懸浮於水中，並以1：1體積之氯仿處理，再渦旋。在微量離心機中以最大速度離心2分鐘之後，收集上層，並以20微升鹽(3 M乙酸鈉)處理，在-20℃下以2體積之乙醇使其沈澱30分鐘。隨後在微量離心機中，以最大速度離心經純化的基因組DNA持續30分鐘，乾燥並再懸浮於水中，以便進行 PCR。
自基因組DNA進行PCR
利用上述的引子進行PCR。PCR反應混合物相應地含有1x Tsg或Taq聚合酶反應緩衝液、1單位Tsg或Taq聚合酶、0.2 mM dNTP、2 mM MgCl2及特異性引子各15微微莫耳濃度。該反應始於在95℃下開始加熱10分鐘，及由95℃之變性溫度1分鐘、55℃之黏接溫度2分鐘及72℃之延伸溫度2分鐘組成的第一個循環。接著29次循環進行至結束程式，其中黏接溫度每次循環降低0.5℃，而最終循環的黏接溫度為40℃。72℃的最後延伸維持10分鐘。藉由1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，切割並根據說明書藉由用於DNA萃取的Millipore Ultrafree-DA自瓊脂糖自旋管柱(Millipore Corporation,Bedford,MA)回收。
連接至pGEM®-T Easy中
根據由Promega提供的說明書，將經純化的PCR產物連接到pGEM®-T Easy載體中(圖7)。簡言之，在Promega pGEM®-T Easy載體系統(Promega Corporation,Madison WI)中提供的快速連接緩衝液(30 mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP及5%聚乙二醇(分子量8000，ACS級)pH7.8)中，以3：1之比率將PCR產物與pGEM T-Easy載體，3韋斯單位(Weiss Unit)T4 DNA連接酶混合。在15℃下保溫該連接反應隔夜，並轉型至勝任大腸桿菌DH5-α細胞懸浮液(使用RbCl/CaCl使其勝任；Kushner,1978)中。首先在冰上保溫轉型混合物30分鐘，在42℃下熱休克90秒，並容許添加1毫升2x YT培養液後在37℃下恢復1小時。使經轉型的細胞集結，再懸浮於少量體積的2xYT培養液中，並塗舖在含有50微克/毫升胺苄青黴素的瓊脂盤上，以便進行選擇。只有轉型體能夠在含有胺苄青黴素的培養盤上生長，因為pGEM®-T Easy載體為細胞提供了胺苄青黴素抗性。針對連接至pGEM®-T Easy載體中的PCR產物插入物，對轉型體進行選擇及篩選。
經由限制酵素消化，針對pGEM®-T Easy載體中的PCR產物插入物進行篩選
在37℃下，使生長在選擇培養基上的菌落，在含有50微克/毫升胺苄青黴素的5毫升2x YT培養液中生長隔夜。使用Wizard Prep DNA純化套組(Promega)，純化得自所選菌落的重組質體。在37℃下以EcoRI消化質體DNA 1小時，並在1%瓊脂糖凝膠上觀測，以證實AteIF-5As插入物尺寸的存在。隨後藉由核心分子生物學實驗室(沃特盧大學(University of Waterloo),Waterloo,ON)，將陽性的質體定序，證實該序列適合在植物中過度表現。
連接至pKYLX71中
以XhoI及SacI雙重消化pGEM：創傷誘發之AteIF-5A及pGEM：生長AteIF-5A的構築體，並次選殖至亦已經利用XhoI及SacI消化的二元載體pKYLX71中。該等酶消化作用確保創傷誘發之AteIF-5A及生長AteIF-5A將以有意義方向插入二元載體pKYLX71中並處於花椰菜花葉病毒雙35S啟動基因的控制下。連接反應使用1微克二元載體及3微克創傷誘發之AteIF-5A或生長AteIF-5A。在連接緩衝液(30 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP及5%聚乙二醇(分子量8000，ACS級)pH 7.8)與3韋斯單位T4 DNA連接酶(Fermentas)中進行連接。在15℃下保溫該連接反應隔夜，並轉型至勝任大腸桿菌DH5-α細胞懸浮液(使用RbCl/CaCl使其勝任；Kushner,1978)中。首先在冰上保溫轉型混合物30分鐘；在42℃下熱休克90秒，並容許在添加1毫升2x YT培養液後在37℃下恢復1小時。使經轉型的細胞集結，再懸浮於少量體積的2xYT培養液中，並塗鋪在含有50微克/毫升四環素的瓊脂盤上，以便進行選擇。只有轉型體能夠在含有四環素的培養盤上生長，因為二元載體pKYLX71為細菌細胞提供了四環素抗性。藉由PCR以及利用XhoI及SacI的二元消化，針對創傷誘發之AteIF-5A或生長AteIF-5A插入物來對 轉型體進行選擇及篩選。在PCR擴大(與上文說明基因組DNA所進行的相同)及消化之後，使用1%瓊脂糖電泳分離產物，以證實正確尺寸之插入物。
農桿菌電穿孔及選擇
使構築體pKYLX71：創傷誘發之AteIF-5A及pKYLX71：生長AteIF-5A電穿孔至勝任農桿菌GV3010中。製備勝任農桿菌細胞，將單一菌落接種在含有50微克/毫升利福平(rifampicin)及50微克/毫升健他黴素(gentamycin)的5毫升2xYT培養液中。在28℃下，在Forma科學軌道震盪器(Fisher Scientific)上以280 rpm生長隔夜，並以各種稀釋度(1：500、1：1000、1：2000)用來接種30毫升亦含50微克/毫升利福平及50微升/毫升健他黴素的2xYT培養物。使新近接種的培養物生長至OD600在0.5與0.8之間為止，隨後冷卻並在SS-34轉子(Sorvall)中以2000 g離心15分鐘。將離心塊再懸浮於50毫升冰冷的水中，並以2000 g離心15分鐘。重複該洗滌程序總共四次，以便自培養物中移除鹽及死亡細胞。將最後的離心塊再懸浮於40毫升冰冷的10%(體積/體積)甘油中，並以2000 g離心15分鐘，並重複一次。隨後將離心塊再懸浮於100微升冰冷的10%甘油中，並充分混合。將細胞分成100微升的等份試樣，並儲存在冰上。
為將DNA構築體電穿孔至勝任農桿菌細胞中，分別將100微升的等份試樣與500毫微克DNA構築體充分混合。隨後將細菌：載體混合物轉移至預先冷卻的電穿孔杯中，並置於調至下列設定的Gene Pulser(Biorad)中：2.5仟伏、25微法拉第及200歐姆。在電穿孔之後，添加1毫升2xYT培養液，並將整個懸浮液轉移至培養管。在28℃、280 rpm下培養電穿孔的培養物3小時，以容許其恢復，且隨後添加2毫升2xYT培養液，以及50微克/毫升利福平及50微克/毫升健他黴素。在培養基中生長2天之後，將電穿孔之細胞塗鋪在四環素、健他黴素及利福 平(均以50微克/毫升)上，且菌落在之後再生長2天。藉由PCR以及利用SacI及XhoI進行雙重消化，針對pKYLX71：創傷誘發之AteIF-5A或pKYLX71：生長AteIF-5A篩選所得菌落，並藉由在1%瓊脂糖凝膠上分離來觀測。
植物轉型
使用含有pKYLX71：創傷誘發之AteIF-5A或pKYLX71：生長AteIF-5A的根瘤農桿菌GV3010之陽性菌落，轉型野外型擬南芥哥倫比亞生態型。在製備用於植物轉型的細菌漿液時，將對pKYLX71：創傷誘發之AteIF-5A或pKYLX71：生長AteIF-5A構築體而言為陽性的單一菌落，接種在含有50微克/毫升四環素、50微克/毫升利福平及50微克/毫升健他黴素的5毫升2xYT培養液中。使其在28℃下，Forma科學軌道震盪器(Fisher Scientific)中在280 rpm下生長2天，並用來接種亦含有50微克/毫升利福平及50微克/毫升健他黴素的35毫升(總共)2xYT。使該35毫升培養物在28℃、280 rpm下生長隔夜，並用來接種含有50微克/毫升利福平及50微克/毫升健他黴素的535毫升(總共)2xYT。再度使該培養物在28℃、280 rpm下生長隔夜，至約2.0之OD600。
將培養物轉移至兩個250毫升的試管中，隨後在4℃下，在GSA轉子(Sorvall)中以1945 g離心15分鐘。將離心塊再懸浮於500毫升滲透培養基(1.1公克MS鹽、25公克蔗糖、0.25公克MES(pH 5.7)，含有KOH、100毫微克/毫升苄胺基嘌呤及50微升Vac-In-Stuff(Silwet L-77；Lehle Seeds))中，並置於在真空乾燥器中、具有四個大橡膠塞子的大塑膠盤中。連續使用5個各含有8株在適當發育階段之植物的花盆，以便進行滲透。首先分別在垃圾桶上倒轉每個花盆，以移除任何鬆散的土壤，隨後放在(仍倒轉著)處於玻璃乾燥器中的塑膠容器內，使得四個大橡膠塞子充當倒轉花盆的台架，如此容許結實浸在農桿菌漿液內，但叢簇則否。隨後使植物在倒轉狀態下經歷真空(400毫米汞柱)10分鐘。隨 後容許真空滲透的植物恢復，且照常在植物材料章節中說明的生長室條件下生長。在數週之後，此時果莢乾燥且種子成熟，將自每個花盆收集的種子彙集在一起。
選擇植物轉型體及分離分析
為鑑別主要的轉型體，在轉子(Barnstead/Thermolyne)上，在1%(體積/體積)次氯酸鈉及0.1%(體積/體積)吐溫80的溶液中將得自真空滲透植物的種子表面滅菌20分鐘，以無菌水沖洗四次，並再懸浮於無菌0.8%瓊脂中。隨後將再懸浮的種子種植在補充有1%(重量/體積)蔗糖、0.5公克/公升2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸(MES)、0.7%(重量/體積)細菌瓊脂及40至50微克/毫升康黴素的無菌半強度Murashige及Skoog(MS)培養基(2.2公克/公升)上(Murashige及Shoog,1962)。只有轉型體能夠在含有康黴素的培養盤上生長，因為二元載體為轉型籽苗提供了康黴素抗性基因(圖6)。不含二元載體的籽苗因為沒有康黴素抗性基因而變成黃色並死亡。使用野外型籽苗作為對照組，並種植在培養基中未添加康黴素的MS培養基上，亦將得自含有空pKYLX70載體之同源接合子植株的種子播種在含有康黴素的培養盤上作為對照組。空載體對照組可用來證實康黴素對籽苗生長的影響，以及二元載體隨機整合至擬南芥基因組中的影響。將少量野外型種子種植在每個含有MS培養基及40至50微克/毫升康黴素之培養盤的小區域上。此係為了確保培養基足以選擇轉型體，並測試康黴素的強度而進行。
將播種的植物在4℃下保持3天，以便同步發芽。在3天之後，將植物轉移至生長室，在此處使其在16小時亮/8小時暗的週期下，在20±2℃下再生長7天。光照維持在每秒每平方公尺150微莫耳照射下，並由冷白螢光燈泡提供。測定以pKYLX71：創傷誘發之AteIF-5A及pKYLX71：生長AteIF-5A載體轉型擬南芥植物的效率。
在自播種開始總共10天之後，分別將有意義創傷誘發之AteIF-5A 及有意義生長AteIF-5A的14個轉型體或16個轉型體移植到在含有32個單元之平台中的Promix BX土壤。隨後將該等移植的T1代植物轉移至在22℃、16小時亮/8小時暗週期下操作的另一生長室中。由冷白螢光燈泡提供每秒每平方公尺150微莫耳照射的光照。使T1代植物生長至成熟，並產生T2代種子。收穫該等種子並儲存在-20℃下直至進行進一步篩選為止。將T1代稱為1、2、3等等。有意義生長AteIF-5A植物所有的16個植株均存活，並產生種子，但14個有意義創傷誘發之AteIF-5A植物的轉型體中只有9個存活，並產生種子。
以與T1代轉型體相同的方式，進行T2代轉型體的選擇。有意義生長AteIF-5A植物的植株12在選擇培養基上未產生轉型體，且不納入任何進一步的操作中。有意義生長AteIF-5A植物的植株1至16(減去植株12)分別繼續獲得8個亞株。將其稱為A至H，使得例如在T1植株1中，將T2代植物稱為1A、1B、1C等等。有意義創傷誘發之AteIF-5A植物的植株1、2、3、4、5、7、9及11分別繼續獲得8個亞株(A-H)。植株12T1植物僅產生約30個T2種子，且在T2代中僅繼續獲得1個亞株。仍然使有意義創傷誘發之AteIF-5A的T2植物生長，並進行表徵。有意義生長AteIF-5A的T2植物已經成熟並產生種子，收穫並儲存在-20℃下，直至進一步分析為止。
以與T2相同的方式進行有意義生長AteIF-5A之T3代轉型體的選擇。以表現型分析及有意義生長AteIF-5A之過度表現的程度為基礎，選出8個植株。將表現量細分成四類：高表現量、中等表現量、低表現量及無表現(歸因於共抑制)。每種表現量選出2個植株，並移植得自每個植株的12個植物。該四種表現量相對應的植株為：1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C及16C。仍然使有意義生長AteIF-5A植物的T3代生長，並進行表徵。
實例18
有意義創傷誘發之AteIF-5A及有意義生長AteIF-5A的表現型分析：照片記錄
在分離期間，以照片記錄有意義創傷誘發之AteIF-5A及有意義生長AteIF-5A植株的形態學表現型，以及相應對照組野外型植物(擬南芥哥倫比亞生態型)及利用空二元載體pKYLX71轉型之植物的表現型。
種子量測
量測自有意義生長AteIF-5A之T2植物中收集的T3種子的總種子產量(重量及體積兩者)、種子尺寸(長度及寬度)，並計算所產生之種子的個別重量及體積。在Sartorius分析數位化量表上量測按重量計的總種子產量，並藉由將每個植物所產生之總種子注入並包裝在按每100微升劃上刻度的玻璃1毫升注射筒內，來測定體積。為藉由長度、寬度及所計算的體積來測定種子尺寸，將種子置於有測微計之玻片上，並在Olympus BX51顯微鏡下檢視。利用附接至Compaq Evo D500(Compaq Company Corporation；Intel® Pentium 4 CPU 1.7 GHz,262 MG RAM，在Windows 2000上執行)的Spot Insight彩色攝影機(Diagnostic Instruments Inc.)，拍下在測微計上之種子的照片。使用適用於Windows 的Image-Pro Express 4.0版。每種亞株量測10個種子，在影像中使用測微計進行尺寸校正。將量測值輸入Microsoft Excel內，並進行諸如標準誤差及體積之類的計算。
實例19
有意義創傷誘發之AteIF-5A及有意義生長AteIF-5A的生化分析-蛋白質分級分離及西方墨點法
自有意義生長AteIF-5A T2植物的每個亞株收集第一個莖生葉，並如上所述萃取蛋白質。藉由12% SDS-PAGE分級分離得自植株1A、2A至16A的總蛋白質，並轉移至PVDF膜。以1：50之稀釋度，利用生長αAteIF-5A探測墨點。自得自野外型及空二元載體對照組植物之第一個 莖生葉萃取對照組總蛋白質。
實例20
在野外型哥倫比亞中表現擬南芥轉譯起始因子5A(AteIF-5A)同功異型物
收集處於不同發育階段的數個組織，並使用自該等組織中萃取的蛋白質進行西方墨點法。圖8中的西方墨點證實老化誘發之AteIF-5A並未出現在2週齡的叢生葉中，但在3週齡的叢生葉中被向上調節，並且豐度增加，直至5週為止，並且豐度下降，但在7週時仍存在。在PEG處理的植物或對照組中，並未偵測到老化AteIF-5A，但出現在花的泳道(包括老化的花)及在經過浸潤的種子泳道中，反映子葉組織的老化。當利用創傷誘發之αAteIF-5A抗體探測墨點時，在果莢、浸潤的種子及莖的泳道中出現模糊的譜帶。在果莢及莖之泳道中見到的譜帶可歸因於收集組織時發生的傷害。因為難以收集果莢及莖，其不能即刻急驟冷凍，從而使得創傷誘發之AteIF-5A同功異型物在一定程度上向上調節。在利用生長αATeIF-5A探測墨點時唯一出現的譜帶為已經浸潤之種子，與該同功異型物涉及細胞分裂的觀念一致。
在數個時間點收集未處理、用MgCl2模倣接種、以avr丁香假單胞菌或用vir丁香假單胞菌處理的植物，以便在病原體進入期間分析AteIF-5As的表現。avr菌株可被植物識別，並誘發過敏反應，其在感染區導致細胞死亡或壞死，因此不容許病原體引起疾病。此外，局部化反應最後變成全身性反應，以便保護植物免於進一步進入。已知此為全身性後天抗性(SAR)，其涉及一組稱為發病反應(PR)基因之基因的表現。另一方面，vir菌株將不會被植物識別，且將不引起過敏反應，並將導致疾病。擬南芥的染病狀態包括在感染數天之後，葉片變黃及細胞死亡。在處理後的72小時之後，收集對照組植物、模倣處理之植物、avr處理之植物及vir處理之植物，進行利用三種αAteIF-5A抗體的西方 墨點法(圖9)。在此時，可分別在avr處理及vir處理之植物中見到SAR及疾病兩者。當利用老化誘發之αAteIF-5A抗體探測時，在所有樣品中觀察到相對同樣的譜帶。因為所有的植物均為4週齡，所以此並不意外，因為在圖8中在第3週才開始見到老化同功異型物。隨後在利用創傷誘發之αAteIF-5A抗體探測墨點時，可在未經處理、模倣處理及avr處理之植物中偵測到模糊的譜帶，而在vir處理之植物中於該處偵測到強譜帶。創傷同功異型物的此向上調節可歸因於由疾病引起的細胞死亡(亦為一種類型的細胞創傷)。利用生長αAteIF-5A探測墨點未顯示任何譜帶，並因此未納入圖中。因為在該等處理期間老化誘發之AteIF-5A的表現並未改變證明其對天然老化的特異性。創傷誘發之AteIF-5A表現增加亦證明其對起因於創傷之死亡的特異性。為進一步研究該可能性，利用擬南芥的受傷葉片來進行實驗。
創傷實驗顯示與發病實驗類似的結果(圖10)。使用北方墨點法顯示在老化誘發之AteIF-5A、創傷誘發之AteIF-5A及生長AteIF-5A中發生轉錄變化。探針對每種AteIF-5A具特異性，並由各自的3'UTR組成。觀察到類似於發病實驗，老化誘發之AteIF-5A表現並無改變，因為其為4-週齡的植物，且僅以9小時之間隔取得樣品。此再度與老化誘發之AteIF-5A為天然老化特有之同功異型物的事實相符合。然而，創傷誘發之AteIF-5A的表現在9小時之後確實增加。或許有一定程度的轉譯控制發生，因為轉錄物似乎完全為組成性(圖10)，但在沒有誘發時，蛋白質似乎未顯示為高度表現(圖9)。在所有的樣品中，幾乎不能偵測到生長AteIF-5A的轉錄物，並顯示在創傷之後表現降低。
實例21
產生過度表現三種eIF-5A同功異型物之轉型擬南芥植物
藉由PCR自基因組DNA分離AteIF-5A(圖11)。將產物連接到pGEM中(圖12)，並證實該序列在植物中過度表現的適用性。利用XhoI及SacI 將創傷誘發之AteIF-5A及生長AteIF-5A自pGEM中雙重消化出來，並以有意義方向連接至pKYLX71中花椰菜花葉病毒35S2啟動基因之後方。藉由消化及PCR證實陽性連接(圖13)。隨後將pKYLX71：老化誘發之AteIF-5A及pKYLX71：生長AteIF-5A電穿孔至根瘤農桿菌GV3010內，以便經由真空滲透對擬南芥野外型哥倫比亞生態型進行轉型。在植物轉型之後收集種子，並在含有康黴素的MS培養盤上選擇轉型體。
過度表現創傷誘發之AteIF-5A(有意義創傷誘發之AteIF-5A)的擬南芥植物
將T1代植物播種在含有50微克/毫升康黴素的MS培養盤上，並儲存在4℃下3天，隨後放在生長室中7天(圖14)。將14個轉型體移植至土壤。在該14個T1代植物中之共同表現型為生長遲緩。植株1、4、6、8、10、11、12、13及14的生長嚴重遲緩，而6、8、10、13及14則未產生任何種子。植株2及3中等遲緩，而植株5、7及9的生長類似野外型植物(圖15及圖16)。在有意義創傷誘發之AteIF-5A植物之T1代中觀察到一些其他表現型，包括黃葉、紫色子葉、捲縮葉片，以及花的形狀不同。有趣的是，注意到並未觀察到遲緩生長的外觀，直至將植物移植到土壤中為止。其可能的解釋將是在移植期間稍微傷害到根部(不可避免的移植結果)，且不能恢復。事實上，將種子浸泡在康黴素溶液中，並直接播種到土壤中的預備實驗並沒有觀察到生長遲緩的植物(而先前70%的植物有某種程度的遲緩)，因為沒有移植將不會引起根部的傷害。
植株1、2、3、4、5、7、8、11及12產生T2種子並繼續實驗(圖17)。每個T2植株具有亞株A-H，除了12之外，其僅生長一個轉型體，並現在進行分析。
過度表現生長AteIF-5A(有意義生長AteIF-5A)的擬南芥植物
使有意義生長AteIF-5A的T1代種子生長在選擇培養基上，並長出 16個轉型體(圖18)。在其一生中對轉型體拍照。表現型自類似於野外型(植株1、2、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15及16)變化至中等遲緩及變黃(植株2、4及9；圖19)。所有的植株繼續生長至T2，且每個植株均具有8個標記為A-H的亞株。植株12在T2中未產生任何轉型體，並被視為野外型。T2代植物具有比T1代植物更誇張的表現型。將詳細討論繼續生長為T3的植株。
根據生長AteIF-5A轉殖基因的表現量，成組表徵有意義生長AteIF-5A T2代植株的特徵。對自得自每個植株之莖生葉中萃取的蛋白質進行西方墨點法(圖20)。因為大多數的亞株A-H在植株內顯示類似的表現型，故僅對每個植株的亞株A進行西方墨點，取得生長AteIF-5A之表現量的一般概況。在凝膠上使用得自野外型植物及含有空二元載體之植物之莖生葉的蛋白質作為對照組。可將在該等亞株中觀察到的表現量分類為高(植株1、2、3、10、13)，中(植株4、5、6、15)，低(植株7、8、9、14)或無(植株11、16、野外型及二元對照組)。亦利用針對老化誘發之AteIF-5A及創傷誘發之AteIF-5A的抗體探測墨點。該等西方墨點法指出在有意義生長AteIF-5A植株中表現增加係歸因於生長AteIF-5A，且通常不向上調節其他的AteIF-5A同功異型物，因為沒有偵測到顯著含量的任一同功異型物。此亦證實同功異型物特異性之抗體的特異性可接受。
以表現型及生長AteIF-5A的表現量為基礎，選擇繼續生長為T3代的有意義生長AteIF-5A植株(參見表1關於在每個植株中之表現型的概述)。自每個表現量的分類中選出兩個植株。將繼續生長的植株為1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C及16C。
根據在圖20中的西方墨點，植株1具有高生長AteIF-5A表現量。該等植物具有大、深綠色的叢簇，葉片與野外型植物相比較非常圓(圖21)。植株1的叢簇亦具有輪生的表現型，其中葉片全部以相同的方向 捲曲。該等有意義生長AteIF-5A植物比野外型稍晚一些結實。植株2亦顯示高生長AteIF-5A表現量，但與植株1之差異為該等植物小而且變黃(圖22)。植株2植物亦比野外型及二元對照組植物更晚結實，並產生較小的結實(大約一半尺寸)及較少的果莢。
在中等表現量的植株中，植株4在葉片/叢簇尺寸及在結實尺寸上顯然類似野外型，雖然似乎是在野外型及二元對照組植物之前幾天結實。具有生長AteIF-5A之中等表現量的第二個植株為植株15。該等植物類似於植株4，非常類似野外型，但叢簇佔據的區域比對照組大(圖23及24)。叢簇的葉片在尖端似乎亦比對照組圓。然而，結實顯然並沒有任何不同的表現型。
將繼續生長為T3的低表現有意義生長AteIF-5A植株係來自植株8及9。與對照組植物相比較，植株8具有極大的葉片及大的叢簇(圖25)。葉片顯然亦比對照組植物寬且圓。結實的時間、結實尺寸及數目，似乎與對照組一致。有意義生長AteIF-5A植株9具有類似在植株8中的葉片尺寸，但遠比其黃且小(圖26)。如同在植株2(一個高度表現的植株)中，該等植物顯示出生長遲緩、結實較短，但不同於植株2，植株9在與對照組植物大致相同的時間結實。
根據西方墨點法，有意義生長AteIF-5A植物的兩個植株11及16(圖20)，沒有向上調節生長AteIF-5A的表現。此可歸因於轉殖基因與內源基因之共抑制。雖然該等植物似乎類似對照組(圖27及圖28)，但因為數個理由相信已經將轉殖基因併入植株11及16的基因組內。首先，藉由在含有康黴素之MS培養盤上的選擇性，證實其具有康黴素抗性。其次，植株16的叢簇尺寸、葉片尺寸及結實尺寸(圖28)比對照組至少大50%。但最強的證據為其所產生之T3種子的尺寸及組成。
量測得自所有T2有意義生長AteIF-5A植物之植株的T3種子。拍下每個植株的照片(在圖29中強調最大及最小)，並在電腦上在照片中利 用測微計進行量測，用以進行校正。至於每個植株及每個對照組，量測視野中最大的10個種子，用來進行計算。發現高表現植株2所具有的種子，比野外型及二元對照組大三倍。同時證實為最低表現的植株(植株11及16)具有一些最小的種子，僅為野外型或二元對照組種子尺寸的約88%。以立方毫微米表示每個植株的平均種子尺寸(圖30)，並使用橢圓型體積之等式來計算，因為得自擬南芥的種子近似橢圓形。對照組種子的量測尺寸落在Boyes等人(2001)測定的公告基準線內。自個別種子的量測尺寸及總種子產量(重量及體積兩者)，計算平均個別種子重量並作圖(圖31)。顯然大部分顯示與對照組種子之尺寸不同的植株，在個別種子重量上亦有相同的傾向。事實上當將種子重量對種子尺寸(體積)作圖時，關係多半具線性，且R2=0.7412。有5個植株為界外值，其具有增加的密度(其中3個)或降低的密度(其中2個)。具有增加密度的植株之一為8D，並繼續生長至T3代。得自所有T2代植物的總種子產量非常不同，有些許傾向。然而，值得注意的一個植株為中等表現的有意義生長AteIF-5A植株4D，其產生最多種子(重量及體積兩者)。事實上，4D產生的為對照組植物的2.5倍多，並將繼續生長至T3。
按照先前的描述，將T3種子塗鋪在選擇培養基上。將植株1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C及16C移植到土壤中。有意義生長AteIF-5A植株1的數個其他亞株不發芽，以及具有所有亞株中最大種子的植株2H亦不發芽。得自植株11(共同抑制植株之一)的種子，不如在該年齡中普遍發現的一般健康。該等種子亦為量測到最小者之一。該等植株似乎仍正在分離，因為仍有無康黴素抗性的植物，且得自所有植株的種子均不發芽。此或許為轉殖基因而非技術的副作用，因為以相同方式處理的對照組種子均發芽。
實例22
表徵擬南芥老化誘發之eIF-5A
獲得全長擬南芥老化誘發之eIF-5A的方法
使用以數個植物eIF-5A基因為基礎的簡併引子與載體引子T3及T7組合，以便自擬南芥cDNA庫對eIF-5A基因進行PCR擴大。特定而言，利用T3引子(在庫載體中位於在F5A基因的上游)及一個下游(逆向)簡併引子兩者，自PCR反應獲得eIF-5A基因的5'區域。同樣，利用T7引子(在庫載體中位於eIF-5A基因的下游)及一個上游(前向)簡併引子兩者，自PCR反應獲得基因的3'區域。自基因之5'區及3'區的比對分析中，獲得全長eIF-5A基因。
每個PCR反應有2-3種主要產物。將該等片段選殖到pBluescript質體內並定序。以針對基因銀行(gene bank)的作圖分析為基礎，鑑別出eIF-5A陽性PCR片段。對擬南芥而言，只有一個上游及下游陽性eIF-5APCR片段。
根據5'及3'PCR片段定序的結果，消化擬南芥eIF-5A基因的特異性5'及3'末端引子。自PCR反應，使用其特異性的5'及3'末端引子，以及相應cDNA庫作為模板，獲得全長擬南芥eIF-5A基因。藉由定序進一步證實全長基因。最後，選殖一個擬南芥eIF-5A同功異型物基因，將其稱為老化誘發之eIF-5A。
T3及T7引子：
T3：5'-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3'(SEQ ID NO：20)
T7：5'-AAT ACG ACT CAC TAT AG-3'(SEQ ID NO：18)
擬南芥eIF-5A的簡併引子：
前進(上游)引子：5'-AAA RRY CGM CCY TGC AAG GT-3'(SEQ ID NO：17)
逆向(下游)引子：5'-TCY TTN CCY TCM KCT AAH CC-3'(SEQ ID NO：19)
將擬南芥反義全長老化誘發之eIF-5A次選殖至pKYLX71載體(含 有SAG12啟動基因)內擬南芥老化誘發之eIF-5A的特異性(同源)引子，反義全長構築體：前進全長老化誘發之eIF-5A引子(30體)：5'-CCGAGCTCCTGTTACCAAAAAATCTGTACC-3'(SEQ ID NO：48)(注意：加下標線的部分為SacI認知序列，用來將PCR片段的5'末端連接到pBluescript之多重選殖位置(MCS)中的SacI位點)。逆向全長老化誘發之eIF-5A引子(36體)：5'-ACCTCGAGCGGCCGCAGAAGAAGTATA AAAACCATC-3'(SEQ ID NO：49)(注意：加下標線的部分為NotI認知序列，用來連接到pBluescript之MCS中)。
pBluescript載體之MCS內的SacI及NotI位點之方向可使該基因得以以其反義方向次選殖(亦即NotI位點在SacI位點的上游)。
實例23
使用SAG 12啟動基因來表現反義老化誘發之擬南芥全長eIF-5A
實驗證據顯示在老化開始的期間，一組「老化相關基因」或SAG的轉錄增加(Lohman等人，1994；Weaver等人，1998)。事實上，老化似乎始於新mRNA的合成，及或許其他mRNA的向下調節，指示蛋白質的選擇性合成為老化所必需(Nooden,1988)。葉片老化程式伴隨著基因表現的改變，首先由Watanabe及Imaseki(1982)證實，其使用活體外轉譯，接著進行凝膠電泳，偵測到發生在可轉譯之mRNA群組中的改變。該初步工作及活體外轉譯蛋白質的後續分析，揭示在老化進行期間大多數mRNA的豐度明顯降低，而其他可轉譯mRNA則增加(Watanabe及Imaseki,1982；Davies及Grierson,1989；Becker及Apel,1993；Buchanan-Wollaston,1994；Smart等人，1995)。對自老化葉片組織之mRNA製備的cDNA庫進行差示篩選，亦證實在老化期間許多基因的表現被向下調節，而其他基因的表現則被向上調節。已經自多種植物物種中鑑別出SAG，包括擬南芥(Hensel等人，1993；Taylor等人，1993；Lohman等人，1994；Oh等人，1996)、蘆筍(King等人，1995)、大麥(Becker 及Apel,1993)、甘藍型油菜(Brassica napus)(Buchanan-Wollaston,1994)、玉蜀黍(Smart等人，1995)、蘿蔔(Azumi及Watanabe,1991)及番茄(Davies及Grierson,1989；Drake等人，1996)。老化在形態學上鑑別為特徵性圖案葉片變黃，其始於自葉片的邊緣且最後達到葉脈(Weaver等人，1998)。在擬南芥叢生葉中可見的老化出現在發芽之後約21天，此時SAG 12顯著向上調節(Noh an Amasino,1999)。SAG 12為對天然老化具有最密切特異性的基因，並因此被稱為老化標記。在年輕葉片中沒有可偵測的表現，在較老的葉片中，在其有約20%變黃之後誘發SAG 12，但不會被不引起葉片變黃的處理所誘發(Weaver等人，1998)。可藉由SAG 12之基因產物顯示與半胱胺酸蛋白酶之相似性，並可能在老化期間參與蛋白質周轉的事實，來解釋其對天然老化的高度特異性(Lohman等人，1994；Weaver等人，1998)。
轉殖基因植物的描述
產生轉殖基因擬南芥植物，其在SAG 12(葉片老化特異性)啟動基因的控制下，表現全長反義老化誘發之eIF-5A轉殖基因，該SAG 12啟動基因約在發芽之後21天在天然葉片的老化開始時活化(Noh及Amasino,1994)，但在逆境誘發之老化的事件中則否。在此時，轉殖基因植物表現受抑制全長老化誘發之eIF-5A表現所特有的表現型。自3至8週齡的轉殖基因擬南芥反義全長老化誘發之eIF-5A植物收穫叢生葉。
在SAG 12啟動基因的控制下，產生同源接合子轉殖基因反義老化誘發之eIF-5A擬南芥植物的方法
將SAG 12-反義-全長老化誘發之eIF-5A構築體插入pKYLX71中
首先，利用EcoRI及HindIII切割質體pKYLX71，以移除其雙35S啟動基因，並利用Klenow酶填滿所得的黏性末端，產生鈍端。隨後連接沒有啟動基因的pKYLX71，再度環化成質體。
其次，自基因組DNA藉由PCR使用含有SalI及XbaI的引子擴大擬南芥SAG 12啟動基因，如下所述。隨後使用限制酵素SalI及XbaI，接著利用T4 DNA連接酶連接，將該啟動基因序列插入pBluescript的多重選殖位置(MCS)。
前進SAG 12引子為5'-GGCCGTCGACGATATCTCTTTTTATAT TCAAAC-3'(SEQ ID NO：50)(加下標線的部分為SalI識別位點，用來將PCR片段的5'末端連接到pBluescript之多重選殖位置(MCS)中的SalI位點)。逆向SAG 12引子為5'-CGTCTAGACATTG TTTTAGGAAAGTTAAATGA-3'(SEQ ID NO：51)(加下標線的部分為XbaI識別位點，用來將PCR片段的5'末端連接到pBluescript之多重選殖位置(MCS)中的SacI位點)。
第三，為產生pBluescript-SAG 12：反義-全長-老化誘發之eIF-5A構築體，藉由PCR使用具有SacI及NotI限制性位點的引子自擬南芥cDNA庫擴大全長老化誘發之eIF-5A，如下所概述，並次選殖至在先前段落中描述的pBluescript-SAG 12中。注意SacI及NotI位點在pBluescript-SAG 12載體內的方向可使基因以其反義方向次選殖(亦即NotI位點在SacI位點之上游)。
前進全長老化誘發之eIF-5A引子為5'-CCGAGCTCC TGTTACCAAAAAATCTGTACC-3'(SEQ ID NO：48)(注意：加下標線的部分為SacI認知序列，用來將PCR片段的5'末端連接到pBluescript-SAG 12載體之多重選殖位置(MCS)中的SacI位點)。逆向全長老化誘發之eIF-5A引子為5'-ACCTCGAGCGGCCGCAGAAGAAGTATAAAAA CCATC-3'(SEQ ID NO：49)(注意：加下標線的部分為NotI認知序列，用來連接到pBluescript-SAG 12載體的多重選殖位置(MCS))。
最後，藉由以SacI及XhoI消化pKYLX71，亦利用SalI及SacI自pBluescript中切下SAG 12：全長老化誘發之eIF-5A卡匣，在二元載體 pKYLX71中產生所要構築體。
XhoI及SalI黏性末端部分互補。因此，利用T4 DNA連接酶能夠將該兩組經消化的突出物(亦即SacI與SacI，以及XhoI與SalI)連接在一起，產生最後的構築體(在pKYLX71中的SAG 12：反義-老化誘發之eIF-5A)。
轉型及T1種子收穫
使pKYLX71-SAG 12：反義-eIF-5A構築體在大腸桿菌DHα細胞中增殖，並電穿孔至勝任農桿菌菌株內。隨後使用細菌滲透4.5週齡野外型擬南芥植物，並將所得的滲透植物命名為「T0」植物，隨後使其生長至其生命週期結束。收穫種子，收集並命名為T1種子。將T1種子塗鋪在10個培養盤上，並篩選康黴素抗性(1/2 MS鹽及50微克康黴素/毫升)，以野外型作為對照組；只有含有pKYLX71-SAG 12-反義-eIF-5A構築體的彼等種子存活，並在康黴素(K50)培養基上生長。自培養盤中選出24個T1籽苗，並置於土壤中。將自T1轉殖基因植物收穫的種子標記為T2種子。每個籽苗產生一個植株(#1=含有1個植物的1個植株，#2=含有1個植物的1個植株，等等)。
表現型的篩選及鑑別
一旦鑑別出康黴素抗性T1種子，便連續培養T2、T3及T4代。藉由在K50培養基上篩選，可區別彼等繼承遺傳構築體及對該構築體為同源接合子的植物。當在花盆中生長時，在一個T3植物植株中觀察到生長遲緩的表現型表現。然而，當同一組種子在相同的條件下再度生長時，未觀察到表現型。
自24個T1植物中，以高種子產量為基礎選出4個植株(植株T2.14、T2.18、T2.19及T2.23)，並塗鋪在K50培養基上，以野外型種子作為對照組。得自每個植株的約75%的種子在K50培養基上存活，並落在小、中及大的尺寸分類中。將得自每個植株的小、中及大籽苗自培養盤移 出，並種植在土壤中。在溫室條件下，小籽苗不如其中及大相對物般快速恢復。在第6週，小植物才開始顯示出結實的徵兆，而其他植物已經結實並開花。總計6個轉殖基因的T2植物(得自總共3個植株x 8個植物=96個轉殖基因植物)證實在結實方面顯著延遲，並視為「延遲結實的」植物。該等植物的種子產量亦顯著比其他轉殖基因者低。
自96個T2植物中，選擇3個植株來產生T3植物(T3.19.S8及T3.14.L7，其為延遲結實；以及T3.23.S3，其不為延遲結實)。當種植在K50培養盤上時，該等植株顯示同源接合子存活。將13個籽苗移植到花盆中(每個花盆10個籽苗)。自該組植物中，在T3.14.L7植物植株中觀察到顯著的矮化表現型。收集T4種子，並在植株中觀察到較低的種子產量。在植株T3.19.S8中觀察到密集生長(密集果莢生長，較多分支)的表現型，而在植株T3.23.S3中觀察到類似野外型的表現型。比較得自3個轉殖基因植株的種子尺寸，但未測定到在統計學上顯著的差異。亦分析葉綠素含量，但未測定到在統計學上與野外型對照組之間顯著的差異。
在K50上篩選植株T3.19.S8、T3.14.L7及T3.23.S3的T4種子，獲得下一代植物，並顯示與死亡的野外型種子相比較，繼承基因構築體(在培養盤上均一的綠色生長)的證據。然而，當種植在個別的平台上時，並未表現出矮化表現型，表明已經喪失了eIF-F5A反義轉殖基因。最後，在K50培養盤上篩選自所有T5植物收集到的種子，並顯示康黴素抗性的證據。目前進行中的研究，證實已經喪失反義基因，而該等T4植物不接合。
自母植株T2.14、T2.19及T2.23中選出8個後代植株，並在K50培養基上篩選，以野外型種子作為對照組。以低種子產量為基礎選出3個植株：T3.14.L8、T3.14.S8及T3.23.S1。選出其他5個植株為：T3.18.S7、T3.18.S2、T3.19.S1、T3.19.S5及T3.23.S6。在K50培養基上篩選所有植 株，顯示同源接合子存活，而T3.14.L8、T3.14.S8及T3.23.S6顯示出異型接合子存活。得自存活之植株T3.14.L8及T3.14.S8的籽苗為白色，並具有綠色的脈管組織，而得自存活之T3.23.S6的籽苗整個為深綠色。選擇該等籽苗進行移植。總計將28個得自每個植株的籽苗移植到單元內，並在溫室條件下生長。
在第3週，所有的植株都開始結實，除了植株T3.14.L8及T3.23.S1，以及數個植株T3.18.S7、T3.18.S2、T3.19.S1、T3.19.S5、T3.23.S1及T3.23.S6內的植物以外。在T3.14.L8及T3.14.S8植株中觀察到不規則的叢生葉形態(第二對葉片表現型延長)。在第5週，亦在植株T3.18.S7及T3.23.S6中觀察到增加數目之叢生葉的額外不規則葉片形態，以及邊緣捲曲的叢生葉形態。在植株T3.23.S1、T3.19.S1及T3.19.S5中觀察到比野外型小的叢簇。在第7週，在植株T3.18.S7、T3.18.S2、T3.19.S1、T3.19.S5、T3.23.S1及T3.23.S6中觀察到細長的莖及無莖延長的表現型。在第5及6週分別收集每個植物第一及第二個莖生葉，用來研究老化eIF-5A的蛋白質表現。
實例24
氧輸入的測定
收穫葉片，並量測面積，隨後將其秤重。使用1毫升冰冷脫氣研磨緩衝液，利用臼及杵，將葉片磨成細粉。隨後將勻漿移至微量離心管中，並即刻放在冰上。關於番茄葉片，需要使所分離的勻漿經由一片Miracloth過濾。
將得自所有樣品的50微升勻漿添加至含有5毫升研磨緩衝液及25微升DCPIP(2,6-二氯苯酚靛酚)的10毫升試管中。激底搖動樣品，隨後將一組樣品放在由一對燈提供的照明下15分鐘，並將第二組樣品放在暗處15分鐘。在15分鐘保溫之後，向兩組樣品中添加50微升DCMU(3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲)，以便停止反應，隨後在微量 離心機中以14,000 g離心2分鐘。在590毫微米處讀取所收集之上清液的吸光度，使用研磨緩衝液作為空白。
該檢定之莫耳消光係數為16x103，亦即每公升1莫耳的濃度變化改變該溶液之吸光度達16x103微莫耳DCPIP降低/小時/毫升=(吸光度之差異)x[(1/16x103(莫耳/公升)]x[反應體積(毫升)/103(毫升/公升)]x[106(微莫耳/莫耳)]x[60(分鐘/小時)/(反應時間(分鐘)]x[1/樣品體積(毫升)]。
每降低2莫耳的DCPIP，將產生1莫耳O2。參考：Allen J.F.及Holmes N.G.,1986在光合作用中的電子傳遞及氧化還原滴定：能量轉導(E1ectron Transport and Redox Titrations in Photosynthesis：Energy Transduction)M.F.Hipkins及N.R.Baker.編，IRL Press,Oxford第107-108頁。
實例25
澱粉的定量測定
使用改編自Lustinec等人，在植物組織中使用玻璃纖維紙定量測定澱粉、直鏈澱粉及支鏈澱粉(Quantitative determination of starch,amylose,and amylopectin in plant tissues using glass fiber paper)，Anal.Biochem.132：265-271(1983)的方法，測定番茄莖中的澱粉含量。在三體積的水中，使用Omnimixer(每5秒12 reps)，接著使用Polytron均質機(30秒)，將番茄莖組織均質化。在分析之前，將勻漿分成10毫升的等份試樣儲存在-20℃下。為了分析，將10毫升勻漿解凍，並與等體積的濃高氯酸(HClO4，70%重量/重量)混合，在室溫下保溫20分鐘，使澱粉溶解。同時，將數個馬鈴薯澱粉的溶液與番茄莖樣品(在0.1-1.0毫克/毫升的範圍中)並排處理，產生標準曲線。攪拌勻漿(或馬鈴薯澱粉標準溶液)，並使用附接吸氣器的真空燒瓶，經由Whatman GF/A玻璃微纖維紙(直徑9.0公分)過濾。將1毫升濾液與3毫升碘溶液A(8 mM I2，17 mM KI，514 mM NaCl)混合，並在4℃下保溫30分鐘，形成澱粉-碘沈澱物。使用附接吸氣器的真空燒瓶，在Whatman GF/A玻璃微纖維紙(直徑9.0公分)上收集沈澱物，隨後以下列溶液洗滌濾液：以10毫升碘溶液B(83 mM I2，180 mM KI，8%高氯[HClO4]酸)洗滌一次；以5毫升乙醇-NaCl溶液(67%乙醇、342 mM NaCl)洗滌一次；以3毫升乙醇-NaOH溶液(67%乙醇、250 mM NaOH)洗滌兩次。一旦蒸發乙醇，便自吸氣器中移出微纖維紙，並插入有螺絲帽的玻璃管中。向試管中添加硫[H2SO4]酸(9毫升0.75 M溶液)，並在沸水浴中保溫該試管30分鐘。將三個1毫升等份試樣的溶離物吸移至玻璃試管中，並與1毫升5%苯酚混合，接著很快與5毫升濃H2SO4混合。渦旋試管，並在室溫下保溫30分鐘，容許顏色顯現。同時，藉由將1毫升0.75 M H2SO4與1毫升5%苯酚混合，並很快地添加5毫升濃H2SO4，製備分光光度量測的空白；亦在室溫下保溫空白30分鐘。在480毫微米處使用空白校準分光光度計，量測並記錄所有樣品及馬鈴薯澱粉標準物的O.D.。使用馬鈴薯澱粉溶液製備標準曲線，並用來插入在每個樣品中的澱粉量。
實例26
分別藉由擬南芥有意義老化誘發之eIF-5A(At-eIF)及番茄有意義老化誘發之eIF-5A基因轉型擬南芥(哥倫比亞生態型)。在轉殖基因植物的整個生命週期中，該等基因組成性表現。該等植物的花梗顯示木質部發育明顯增加。參見圖89-94。
將轉殖基因及對照組植物的種子播種在1/2 MS培養基瓊脂盤上，並保持在22℃、80%相對溼度及16小時亮/天的生長室中9天。隨後將籽苗移至有市售土壤的32孔平台中，並維持在與上述相同的條件下48天。選擇主要的花梗進行顯微觀察。自在叢簇以上2毫米內的莖基部，以手切下橫截面切片。以根皮酸苯三酚一酯-HCl法將切片染色。發現在該年齡的莖木質部已經達到其最大發育。在轉殖基因及對照組植物 之間，比較木質部的尺寸(斷面的面積)。此外，亦在轉殖基因及對照組植物兩者中量測韌皮部及木髓部。
如下量測組織面積。利用Zeiss顯微鏡將橫切面拍照，並使用Photoshop®將顯微照片數位化。將該等影像印在紙上，並切掉不同的組織，隨後藉由面積量測計來量測其面積。為計算每個組織的實際面積，使用下式：實際面積=(在紙上個別組織的面積)/(放大倍數)2。
因此顯然，老化誘發之eIF-5A亦參與與木質部生成有關的程式化細胞死亡。在擬南芥中，老化誘發之AteIF-5A的組成性反義抑制降低了花梗的厚度及木質部細胞層的數目。相反，其中組成性過度表現擬南芥或番茄老化誘發之eIF-5A的植物之花梗，平均粗達相應野外型植物的1.7-倍，且每個花梗橫切面的總木質部面積高達2倍。過度表現之轉殖基因植物亦具有大大增加的叢生葉生物質量，且比野外型植物生長得快，其可能反映營養攝入增強。當在擬南芥植物中過度表現得自番茄的老化誘發之eIF-5A同功異型物時，觀察到相同的表現型。該等結果總體表明老化誘發之eIF-5A同功異型物不僅調節葉及花的老化，亦涉及木質部生成。
實例27
抑制脫氧羥腐胺離胺酸合成酶延遲預包裝之切割萵苣在周圍氛圍中的褐變
市售預包裝的沙拉通常儲存在經過控制的氛圍條件下，藉此將氧含量大大地降低至其氛圍濃度之下，以便延長產品的存放期。預包裝沙拉最常見的腐敗症狀為萵苣的切面褐變。雖然經過控制之分文包裝使得褐變延遲，但亦可能導致無臭無味。在本研究中，顯示脫氧羥腐胺離胺酸合成酶(DHS)的向下調節有潛力成為延遲萵苣之切面褐變的另一種策略。DHS催化真核轉譯起始因子5A(eIF5A)的活化，該因子充當選定mRNA群組之核細胞質穿梭蛋白質。DHS似乎在切割萵苣褐變 之過程中起作用，因為抑制DHS的表現(藉由反義技術)導致在大氣條件下褐變開始明顯延遲。特定而言，80%野外型萵苣植物的切隔區段顯示在切割6天之後褐變，而平均僅有27%來自5個分離植株的轉殖基因植物之切割區段在相同的期間內轉變為褐色，其中一些個別植物顯示0%褐變。參見圖51及53。
實例28
在油菜中抑制脫氧羥腐胺離胺酸合成酶表現，增加種子產量
脫氧羥腐胺離胺酸合成酶(DHS)介導將無活性的真核轉譯起始因子-5A(eIF-5A)轉變為能夠促進轉譯的活化形式的兩個酶反應的第一個。自由老化葉片製備之cDNA表現庫分離編碼油菜(威達甘藍型油菜(Brassica napus cv Westar))DHS的全長cDNA純系。在轉殖基因油菜植物中，藉由在組成性花椰菜花葉病毒(CaMV-35S)啟動基因的調節下表現油菜DHS cDNA的反義3'-UTR，抑制DHS。表現該反義轉殖基因的植物具有降低的葉片DHS蛋白質含量，並顯示天然葉片老化延遲。DHS表現的抑制亦增加叢生葉尺寸1.5至2倍，並提高種子產量高達90%。DHS抑制在油菜中的該等多效影響，與先前對擬南芥所獲得的結果一致(Wang等人，2003,Plant Mol.Biol.52：1223-1235)，並表明該蛋白質在植物發育及老化中起重要作用。
實例29
藉由投與脫氧羥腐胺離胺酸合成酶的抑制劑，並藉由脫氧羥腐胺離胺酸合成酶的反義抑制，延長康乃馨花的花瓶壽命
自康乃馨植物分離編碼脫氧羥腐胺離胺酸合成酶(DHS)的全長cDNA純系(AF296079)。DHS介導將無活性的真核轉譯起始因子-5A(eIF-5A)轉變為能夠促進轉譯的活化形式的兩個酶反應的第一個。北方分析揭示DHS表現與康乃馨花瓣的老化有關。以DHS反應的抑制劑，包括二胺基丁烷(腐胺)、二胺基丙烷、二胺基己烷、二胺基 辛烷及亞精胺處理切下的康乃馨花，延長了花的花瓶壽命高達83%。為了更可靠地評估DHS在康乃馨花老化中的作用，藉由在轉殖基因植物中，在組成性花椰菜花葉病毒啟動基因的調節下，經由農桿菌轉型引入康乃馨DHS cDNA的反義3'-UTR，抑制該蛋白質的表現。分析具有減少DHS表現之轉殖基因花的三個植株，發現相對於野外型花，具有更長的花瓶壽命。實際上，一個植株顯示花瓶壽命增加大於100%。該等發現表明DHS在花朵老化中起重要作用。
實例30
在擬南芥中，可藉由以GA3處理，解救藉由抑制脫氧羥腐胺離胺酸合成酶所引起的結實表現型延遲
脫氧羥腐胺離胺酸合成酶(DHS)為真核轉譯起始因子5A(eIF-5A)之轉譯後活化作用所需的廣泛存在的酶，且似乎對正常植物生長及發育不可或缺。藉由在轉殖基因植物中，在老化特異性的SAG12啟動基因的調節下，表現全長反義擬南芥DHS cDNA，在擬南芥中抑制DHS。表現轉殖基因的植物具有降低的葉片DHS蛋白質含量，並顯示結實延遲，並顯著地延遲葉片老化的開始(2至5週)。結實亦較短，雖然其並未導致生物質量或種子產量降低。以GA3處理轉殖基因植物逆轉了結實表現型延遲。藉由在GCI(其為可藉由投與地塞米松(dexamethasone)(DEX)活化的糖皮質激素誘發性啟動基因)的調節下反義抑制DHS獲得類似的表現型。再者，投與GA3解救該表現型；亦即經GA3處理之轉殖基因植物正常地結實，結實具有正常的尺寸，且沒有葉片老化開始的延遲。該等結果總體表明DHS在擬南芥中經由三種eIF-5A同功異型物中一或多種的活化來影響GA代謝。
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<160> 165
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<210> 1
<211> 1584
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<220>
<221> CDS
<222> (54)..(1196)
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 2
<210> 3
<211> 369
<212> PRT
<213> 人類
<400> 3
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：保留的肽片段
<400> 4
<210> 5
<211> 2272
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221> CDS
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<220>
<221> CDS
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<220>
<221> CDS
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<220>
<221> CDS
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<221> CDS
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<220>
<221> CDS
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<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
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<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 7
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 8
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<212> DNA
<213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus)
<220>
<221> CDS
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<212> PRT
<213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus)
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<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<220>
<221> CDS
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<212> PRT
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 12
<210> 13
<211> 812
<212> DNA
<213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus)
<220>
<221> CDS
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<210> 14
<211> 160
<212> PRT
<213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus)
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<210> 15
<211> 702
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221> CDS
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<210> 16
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<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 16
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 17
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<220>
<221> modified_base
<222> (6)
<223> a,t,c or g
<400> 19
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 23
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 25
<210> 26
<211> 581
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221> CDS
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<400> 26
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<211> 523
<212> DNA
<213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(522)
<400> 27
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 28
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 29
<210> 30
<211> 484
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221> CDS
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<212> DNA
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<220>
<221> CDS
<222> (1)..(156)
<220>
<221> modified_base
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<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：保留的肽片段
<400> 32
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 33
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 34
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成肽
<400> 35
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成肽
<400> 36
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成肽
<400> 37
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 38
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 39
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 40
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 41
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 42
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 43
<210> 44
<211> 353
<212> PRT
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：真菌序列
<400> 44
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<211> 387
<212> PRT
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：酵母菌序列
<400> 45
<210> 46
<211> 370
<212> PRT
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：古原細菌(Archaebacterial)序列
<400> 46
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<220>
<221> modified_base
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<223> a,t,c or g
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> a,t,c or g
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<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 48
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 49
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 50
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 51
<210> 52
<211> 1235
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 52
<210> 53
<211> 161
<212> PRT
<213> 香蕉葉斑細菌(Mycosphaerella fijiensis)
<400> 53
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<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis sp.)
<400> 54
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<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
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<212> DNA
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<220>
<221> CDS
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<400> 58
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<211> 159
<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 59
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<211> 158
<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 60
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<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 61
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<211> 480
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 62
<210> 63
<211> 477
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 63
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<211> 700
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<220>
<221> CDS
<222> (56)..(532)
<400> 64
<210> 65
<211> 159
<212> PRT
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 65
<210> 66
<211> 658
<212> DNA
<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(477)
<400> 66
<210> 67
<211> 159
<212> PRT
<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)
<400> 67
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 香蕉葉斑細菌(Mycosphaerella fijiensis)
<400> 68
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 香蕉葉斑細菌(Mycosphaerella fijiensis)
<400> 69
<210> 70
<211> 1335
<212> DNA
<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)
<220>
<221> CDS
<222> (57)..(1160)
<400> 70
<210> 71
<211> 368
<212> PRT
<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)
<400> 71
<210> 72
<211> 1862
<212> DNA
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)
<220>
<221> CDS
<222> (293)..(1396)
<400> 72
<210> 73
<211> 368
<212> PRT
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)
<400> 73
<210> 74
<211> 1363
<212> DNA
<213> 香蕉(Musa acuminata)
<220>
<221> CDS
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<400> 74
<210> 75
<211> 376
<212> PRT
<213> 香蕉(Musa acuminata)
<400> 75
<210> 76
<211> 1451
<212> DNA
<213> 楊木(Populus deltoides)
<220>
<221> CDS
<222> (8)..(1126)
<400> 76
<210> 77
<211> 373
<212> PRT
<213> 楊木(Populus deltoides)
<400> 77
<210> 78
<211> 1488
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 78
<210> 79
<211> 1566
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 79
<210> 80
<211> 319
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 80
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 81
<210> 82
<211> 38
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 82
<210> 83
<211> 521
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 83
<210> 84
<211> 497
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 84
<210> 85
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 85
<210> 86
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 86
<210> 87
<211> 906
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 87
<210> 88
<211> 205
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 88
<210> 89
<211> 662
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 89
<210> 90
<211> 37
<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 90
<210> 91
<211> 52
<212> PRT
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 91
<210> 92
<211> 193
<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 92
<210> 93
<211> 174
<212> PRT
<213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus)
<400> 93
<210> 94
<211> 22
<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 94
<210> 95
<211> 22
<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 95
<210> 96
<211> 22
<212> PRT
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 96
<210> 97
<211> 22
<212> PRT
<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)
<400> 97
<210> 98
<211> 22
<212> PRT
<213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus)
<400> 98
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<211> 22
<212> PRT
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 99
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<211> 22
<212> PRT
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 100
<210> 101
<211> 22
<212> PRT
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 101
<210> 102
<211> 22
<212> PRT
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)
<400> 102
<210> 103
<211> 22
<212> PRT
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)
<400> 103
<210> 104
<211> 22
<212> PRT
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)
<400> 104
<210> 105
<211> 22
<212> PRT
<213> 萵苣(Lactuca sativa)
<400> 105
<210> 106
<211> 22
<212> PRT
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：樹序列肽
<400> 106
<210> 107
<211> 22
<212> PRT
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：樹序列肽
<400> 107
<210> 108
<211> 22
<212> PRT
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：樹序列肽
<400> 108
<210> 109
<211> 22
<212> PRT
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：樹序列肽
<400> 109
<210> 110
<211> 66
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 110
<210> 111
<211> 66
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 111
<210> 112
<211> 66
<212> DNA
<213> 擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 112
<210> 113
<211> 66
<212> DNA
<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)
<400> 113
<210> 114
<211> 66
<212> DNA
<213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus)
<400> 114
<210> 115
<211> 66
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 115
<210> 116
<211> 66
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 116
<210> 117
<211> 66
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 117
<210> 118
<211> 66
<212> DNA
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)
<400> 118
<210> 119
<211> 66
<212> DNA
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)
<400> 119
<210> 120
<211> 66
<212> DNA
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)
<400> 120
<210> 121
<211> 66
<212> DNA
<213> 萵苣(Lactuca sativa)
<400> 121
<210> 122
<211> 66
<212> DNA
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：樹寡核苷酸序列
<400> 122
<210> 123
<211> 66
<212> DNA
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：樹寡核苷酸序列
<400> 123
<210> 124
<211> 66
<212> DNA
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：樹寡核苷酸序列
<400> 124
<210> 125
<211> 66
<212> DNA
<213> 未知生物
<220>
<223> 未知生物的說明：樹寡核苷酸序列
<400> 125
<210> 126
<211> 745
<212> DNA
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<220>
<221> CDS
<222> (55)..(534)
<400> 126
<210> 127
<211> 160
<212> PRT
<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)
<400> 127
<210> 128
<211> 25
<212> PRT
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 128
<210> 129
<211> 26
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 129
<210> 130
<211> 906
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 130
<210> 131
<211> 495
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 131
<210> 132
<211> 662
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 132
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 133
<210> 134
<211> 28
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 134
<210> 135
<211> 906
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 135
<210> 136
<211> 499
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 136
<210> 137
<211> 662
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 137
<210> 138
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 138
<210> 139
<211> 906
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 139
<210> 140
<211> 661
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 140
<210> 141
<211> 662
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 141
<210> 142
<211> 325
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 142
<210> 143
<211> 906
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 143
<210> 144
<211> 325
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 144
<210> 145
<211> 662
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 145
<210> 146
<211> 28
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 146
<210> 147
<211> 28
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 147
<210> 148
<211> 906
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 148
<210> 149
<211> 497
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 149
<210> 150
<211> 662
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 150
<210> 151
<211> 27
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 151
<210> 152
<211> 29
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 152
<210> 153
<211> 906
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 153
<210> 154
<211> 486
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 154
<210> 155
<211> 662
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：合成構築體
<400> 155
<210> 156
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 156
<210> 157
<211> 38
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<400> 157
<210> 158
<211> 413
<212> DNA
<213> 萵苣(Lactuca sativa)
<400> 158
<210> 159
<211> 388
<212> DNA
<213> 萵苣(Lactuca sativa)
<400> 159
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<220>
<221> modified_base
<222> (3)
<223> a,t,c or g
<220>
<221> modified_base
<222> (12)
<223> a,t,c or g
<220>
<221> modified_base
<222> (18)
<223> a,t,c or g
<400> 160
<210> 161
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造的序列
<220>
<223> 人造序列的說明：引子
<220>
<221> modified_base
<222> (9)
<223> a,t,c or g
<220>
<221> modified_base
<222> (21)
<223> a,t,c or g
<400> 161
<210> 162
<211> 108
<212> DNA
<213> 香蕉葉斑細菌(Mycosphaerella fijiensis)
<400> 162
<210> 163
<211> 487
<212> DNA
<213> 香蕉葉斑細菌(Mycosphaerella fijiensis)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(486)
<400> 163
<210> 164
<211> 162
<212> PRT
<213> 香蕉葉斑細菌(Mycosphaerella fijiensis)
<400> 164
<210> 165
<211> 214
<212> DNA
<213> 香蕉葉斑細菌(Mycosphaerella fijiensis)
<400> 165

Claims (12)

  1. 一種經分離的脫氧羥腐胺離胺酸合成酶(deoxyhypusine synthase；DHS)多肽，其與SEQ ID NO：77具有至少95%序列一致性。
  2. 如請求項1之經分離的多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO：77或由SEQ ID NO：77所組成。
  3. 如請求項1之經分離的多肽，其中該DHS係來自白楊(cottonwood)。
  4. 一種經分離的聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至3中任一項之經分離的多肽的核苷酸序列。
  5. 如請求項4之聚核苷酸，其中該聚核苷酸序列包含SEQ ID NO：76或由SEQ ID NO：76所組成。
  6. 一種載體，其包括如請求項4或5之聚核苷酸，及操作地連接於該聚核苷酸以提供該聚核苷酸於植物中轉錄的調控序列。
  7. 一種反義聚核苷酸，其雜交至如請求項4或5之聚核苷酸。
  8. 一種載體，其包括如請求項7之聚核苷酸，及操作地連接於該聚核苷酸以提供該聚核苷酸於植物中轉錄的調控序列。
  9. 一種抑制植物中內源性DHS表現之方法，包括將如請求項8之載體併入至少一個植物細胞之基因體，其中該聚核苷酸之該轉錄抑制植物中內源性DHS之表現。
  10. 如請求項9之方法，其中該抑制產生相對於野生型植物對環境壓力具有增加耐受性之植物。
  11. 如請求項9之方法，其中該抑制產生相對於野生型植物具有增加種子產量及/或增加種子大小之植物。
  12. 如請求項9至11中任一項之方法，其中該植物為白楊。
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