KR20060016120A - 이아이에프-5에이의 이소폼： 노화-유도된이아이에프5에이； 손상-유도된 이아이에프-5에이； 생장이아이에프-5에이； 및 디에이취에스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 진핵성 개시 인자 5A("eIF-5A")의 특정 이소폼: 노화-유도 eIF-5A; 손상-유도 eIF-5A; 및 생장 eIF-5A뿐만 아니라 이들 인자를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이들 인자의 발현 조절 관련 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 디옥시하이푸신 신타제("DHS"), DHS를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드 및 DHS의 발현 조절 관련 방법에 관한 것이다.
Figure 112005074399539-PCT00032
식물, 노화, 발현, 억제, 안티센스, elF-5A, DHS, 폴리뉴클레오타이드, 갈변

Description

이아이에프-5에이의 이소폼： 노화-유도된 이아이에프5에이； 손상-유도된 이아이에프-5에이； 생장 이아이에프-5에이； 및 디에이취에스{Isoforms of eIF-5A： senescence-induced eIF5A； wounding-induced eIF-5A； growth eIF-5A； and DHS}
본 출원은 1999년 7월 6일 제출되고 현재 포기된 출원번호 09/348,675호의 부분연속출원인 2000년 6월 19일에 제출되고 현재 미국특허 제6,538,182호인 출원번호 제09/597,771호의 부분연속출원인 2000년 11월 29일에 제출된 출원번호 제09/725,019호의 부분연속출원이다.
본 발명은 진핵성 개시 인자 5A("eIF-5A")의 특정 이소폼 및 eIF-5A를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드 및 디옥시하이푸신 신타제("DHS") 및 DHS를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드 및 이소폼 eIF-5A 및 DHS의 발현을 조절 관련 방법에 관한 것이다.
노화는 식물의 수명에 있어서 생물적 발달의 말기 현상이다. 이는 죽음의 조짐이고, 전체 식물, 기관, 꽃과 열매, 조직 및 개체 세포를 포함한 생물적 조직화의 다양한 레벨에서 발생한다.
노화의 착수는 내부적 및 외부적 모두의 다른 인자에 의해 유도될 수 있다. 노화는 식물의 수명에 있어서 열매, 꽃 및 잎과 같이 복잡하고, 매우 조절된 발달 단계이다. 노화는 세포 막과 거대 분자의 통합된 파괴 및 식물의 다른 부분으로 대사물질의 수반된 이동을 초래한다.
정상적인 식물 발달 동안 발생하는 프로그램화된 노화 이외에도 세포와 조직의 사멸 및 뒤이은 대사물질의 재이동이 외부, 환경적 인자에 대한 통합된 반응으로서 발생한다. 괴사(necrosis) 또는 아폽토시스(apoptosis)로도 표현되는 노화의 조기 개시를 유도하는 외부 인자는 병원균 공격뿐만 아니라 온도, 가뭄, 부족한 빛 또는 영양 공급과 같은 환경적 스트레스를 포함한다. 식물 조직은 환경적 스트레스에 노출되고, 스트레스 에틸렌이라고 일반적으로 알려진 에틸렌을 생성한다(Buchana-Wollaston, V., 1997, J. Exp. Botany, 48:181-199; Wright, M., 1974, Plant, 120:63-69). 에틸렌은 일부 식물에서 노화를 유발하는 것으로 알려져 있다.
노화는 수동성 과정이 아니라 오히려 특별한 유전자의 통합된 발현을 포함한 능동적으로 조절된 과정이다. 노화동안 총 RNA 수주의 감소 및 많은 유전자의 발현이 스위치 오프된다(Bate et al., 1991, J. Exper. Botany, 42, 801-11; Hensel et al., 1993, The Plant Cell, 5, 553-64). 그러나 노화 과정이 핵 유전자의 디 노보(de novo) 전사에 따라 달라진다는 증가하는 증거가 있다. 예를 들어 노화는 mRNA의 개시자 및 단백질 합성 및 핵의 제거(enucleation)에 의해 봉쇄된다. 노화 잎과 푸른 입을 이용한 시험관내에서의 번역 실험의 분자적 연구는 노화 잎에서의 잎 단백질 생성물의 변화된 패턴을 나타낸다(Thomas et al., 1992, J. Plant Physiol., 139, 403-12). 차별적 스크리닝 및 마이너스의(subtractive) 하이브리디제이션 기술을 이용하여 노화-유도된 유전자를 나타내는 많은 cDNA 클론이 아라비돕시스, 옥수수, 오이, 아스파라거스, 토마토, 쌀 및 감자와 같은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 모두를 포함한 다른 식물 범위로부터 확인되었다. 노화 동안 특이적으로 발현되는 유전자의 확인은 진행되는 노화에 대한 디 노보 전사에 대한 필요성의 어려운 증거이다.
노화 동안 발생하는 이벤트는 매우 통합되어 괴사 및 사멸이 발생하기 전에 세포성 구성성분의 최대 이용을 가능하게 하는 것으로 보인다. 특이적인 시그널의 인식과 유전자 발현의 케스케이드(cascade)의 유도를 포함한 복잡한 상호관계가 이러한 과정을 조절하기 위해 발생한다. 노화 관련 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현은 일반적인 활성체 단백질을 통해 조절되고 이어서 호르몬 시그널에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 활성된다. 초기 시그널링 또는 과정의 수반된 공동-작용에 포함된 메카니즘에 대해 알려진 것이 거의 없다.
통합된 유전자 발현은 개시 인자를 포함하여 전사 및 번역에 포함된 인자를 필요로 한다. 번역 개시 인자 유전자는 식물을 포함한 다양한 생물체에서 분리되고 특성화되었다. 번역 개시 인자는 mRNA 집단이 세포핵으로부터 이동되는 속도, 리보솜과 관련된 속도를 조절할 수 있고, 어느 정도까지 특정 mRNA의 안정성에 영향을 미칠 수 있다(Zuk et al., EMBO J. 17:2914-2925(1998). 실제로 전체적인 벙녁 활성에 필요 없는 이러한 번역 개시 인자 중의 하나는 번역을 위해 세포핵으로부터 세포질로 mRNA 특정 서브세트를 왕복하는 것으로 여겨진다(Jao et al., Cell Biochem. 86:590-600(2002); Wang et al., J. Biol. Chem. 276:17541017549(2001); Rosorius et al., J. Cell Sci., 112:2369-2380(1999)). 이러한 번역 인자는 진핵성 개시 인자 5A(eIF-5A)로 알려져 있고 아미노산 하이푸신을 포함한 것으로 알려진 유일한 단백질이다(Park et al., J. Biol. Chem. 263:15264-15269(1988)).
진핵성 번역 개시 인자 5A(elF-5A)는 진핵 세포 단백질 합성의 개시에 포함된 약 17KDa 크기의 필수 단백질 인자이다. 이는 elF-5A에만 존재하는 것으로 알려진 독특한 변형된 아미노산인 하이푸신(hypusine)[N-(4-아미노-2-하이드록시부틸)리신]의 존재에 의해 특성화된다. 하이푸신은 폴리아민(polyamine), 스퍼미딘 (spermidine)으로부터의 부틸아미노 그룹의 elF-5A의 특이적 리신 잔기의 아미노 그룹의 사이드 체인으로의 전달 및 하이드록실레이션(hydroxylation)을 통해 후-번역적으로 형성된다. elF-5A의 활성화는 스퍼미딘의 부틸아민 잔기의 elF-5A의 리신으로의 전달을 포함하고, 하이푸신 및 활성화 elF-5A를 형성한다. 진핵세포에서 디옥시하이푸신 신타제(DHS)는 elF-5A 내의 하이푸신의 후-번역적 합성을 매개한다. 상응하는 DHS 유전자는 식물에서 확인되지 않았으나 식물 elF-5A은 하이푸신을 포함하는 것으로 알려져 있다. 하이푸신 매개는 메티오닐-프로마이신(methionyl-puromycin) 에세이를 이용한 시험관 내에서의 elF-5A 활성에 필수적인 것으로 나타났다.
하이푸신은 디옥시하이푸신 신타제(DHS; EC 1.1.1.249) 및 디옥시하이푸신 수산화효소(DHH; EC 1.14.99.29)의 작용에 의해 보존된 리신 잔기의 전환을 통해 후-번역적으로 eIF-5A 상에 형성된다. DHS는 토마토(유전자은행 접근번호 AF296077), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(AT-DHS; 유전자은행 접근번호 AF296078), 담배(Ober and Hartmann, 1999), 카네이션(유전자은행 접근번호 AF296079) 및 바나나(유전자접근번호 AF296080)을 포함한 여러 식물종으로부터 분리된 반면 DHH에 대한 유전자는 인식되지 않았다.
DHS는 스퍼미딘으로부터 유래된 부틸아민기의 첨가를 통해 eIF-5A의 보존된 리신 잔기를 디옥시하이푸신으로 전환시킨다. 이후 이러한 eIF-5A의 중간물 형태 는 DHH에 의해 수산화되어 하이푸신이 된다(Park et al., Biol. Signals 6:115-123(1997). eIF-5A의 디옥시하이푸신 및 하이푸신 형태 모두는 생체 내에서 mRNA에 결합할 수 있다(Liu et al., Biol. Signals 6:166-174(1997)). eIF-5A의 기능이 충분히 이해되지 않았더라도 이들이 세포 분열(Park et al., J. Biol. Chem. 263:15264-15269(1998); Tome et al., Biol. Signals 6:150-156(1997)) 및 노화(Wang et al., J. Biol. Chem. 276(20):17541-17549(2001))를 조절한다는 일부 증거가 있다. 참고문헌에 포함된 미국특허 제6,538,182호 및 미국출원 제09/725,019도 참조. 일부 생물체는 하나 이상의 eIF-5A 이소폼을 지닌 것으로 알려져 있고, 이는 각 이소폼이 세포 분열 및 노화와 같은 과정에 관련된 특정한 한벌의 mRNA에 대한 특정 셔틀이라는 전제에 적합하다.
Wang et al.은 증가된 수준의 DHS mRNA는 토마토의 열매 연화 및 자연적 및 스트레스-유도된 잎 노화와 상호관련됨을 증명하였다(Wang et al., J. Biol. Chem. 276(20):17541-17549(2001)). 더욱이 DHS 발현이 구성적 프로모터의 조절하에 DHS 안티센스 cDNA 단편을 도입함으로서 형질전환 토마토 식물 내에서 억제된 경우 이들 형질전환 식물로부터의 토마토 열매는 지연된 열매 연화 및 부패에 의해 증거가 된 극적으로 지연된 노화를 나타내었다. 참고문헌에 포함된 미국특허 제6,538,182호 및 2003년 11월 29일에 출원된 미국출원 제09/725,019도 참조. 또한 이는 구성적 프로모터의 조절 하에 전체 길이 또는 3'UTR cDNA의 안티센스에 의해 아라비돕시스 탈리아나("AT") 내의 DHS의 하향-조절을 통해 증명되었다. 아라비 돕시스 탈리아나 DHS("AT-DHS") 발현을 하향 조절하고 eIF-5A 활성화에 덜 유용하게 함으로서 노화는 약 2주까지 지연되었다(미국특허 제6,538,182호 참조). 노화가 지연되었을 뿐만 아니라 종자 산출량이 증가되었고, 스트레스 내성의 증가 및 생물량의 증가 형질전환 식물 내에서 관찰되었고, 각 표현형의 정도는 DHS의 하향-조절 정도에 의해 측정되었다. 서던 블럿에 의해 나타난 바와 같이(Wang et al., 2001)) 세포핵 밖으로의 노화 전사체의 왕복에 중요한 특정 eIF-5A 이소폼을 타겟하기 위해 토마토 및 아라비돕시스 탈리아나가 그들의 게놈 내에 단지 하나의 복제를 지니기 때문에 eIF-5A의 노화 특이적 이소폼은 노화-유도된 eIF-5A의 안티센스 컨스트럭트(3'UTR의)를 통해 또는 과발현된 유전자(즉, 센스 폴리뉴클레오타이드의 이용을 통한 과발현의 생성)의 하향-조절에 대한 식물의 자연적 능력을 이용함으로서 확인되고 특이적으로 하향-조절된다.
식물은 면역 체계가 없고 따라서 동시-억제라고 불리는 바이러스를 처리하는 유일한 방법을 지니고, 이는 바이러스성 RNA의 서열-특이적 분해를 유발한다. 트랜스유전자가 콜리플라워 모자이크 바이러스 이중 35S 프로모터와 같은 강한 구성적 프로모터의 조절 하에 있는 경우 이는 식물에 대한 바이러스 전사체로 여겨지고 노화 특이적 분해가 발생하나 트랜스유전자뿐만이 아니라 내생적 유전자도 마찬가지이다(Fagard and Vaucheret, Annual Review. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., June;51:167-194(2000)에서 조사됨). 내생적 유전자의 하향-조절에 대한 발현의 안티센스 억제보다 더욱 효과적이지 않은 경우 동시-억제가 효과적이라는 일부 증 거가 있다.
발명의 요약
본 발명은 진핵성 개시 인자 5A("eIF-5A")의 이소폼: 노화-유도된 eIF-5A; 손상-유도된 eIF-5A; 및 생장 eIF-5A뿐만 아니라 이들 인자를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 3가지 eIF-5A 이소폼의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한 본 발명은 3가지 eIF-5A 이소폼의 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 디옥시하이푸신 신타제("DHS") 및 DHS를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한 본 발명은 DHS의 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터를 제공한다. 또한 본 발명은 DHS 발현의 조절(증가/상향-조절 또는 억제) 관련 방법에 관한 것이다.
여기에 사용된 바와 같이 "식물"이라는 용어는 전체 식물, 식물 부분, 식물 세포 또는 식물 세포군을 나타낸다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물의 타입은 예를 들어 에틸렌-민감성 및 에틸렌-불감성 식물을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다 : 살구, 사과, 오렌지, 바나나, 자몽, 배, 토마토, 딸기, 아보카도 등과 같은 열매 맺는 식물 ; 당근, 완두콩, 상추, 양배추, 순무, 감자, 브로콜리, 아스파라거스 등과 같은 야채 ; 카네이션, 장미, 국화 등과 같은 꽃 ; 옥수수, 쌀, 대두, 자주개자리 등과 같은 농작식물 ; 및 일반적으로 본 발명의 DNA 분자를 흡수하고 발현할 수 있는 어떤 식물. 이는 반수체, 이배체, 사배체 및 다배체를 포함한 다양한 배수성 레벨의 식물을 포함한다. 식물은 단자엽식물 또는 쌍자엽식물이다.
형질전환 식물은 여기서 게놈 내로 이형성 또는 상동성 노화-유도된 DHS DNA 또는 변형된 DNA 또는 이형성 노화-유도된 DHS DNA 또는 상동성 노화-유도된 DHS DNA의 일부분을 통합시킨 식물을 포함하나 이에 한정적이지는 않은, 어떤 방법으로 유전적으로 변형된 식물로서 정의된다. 또한 본 발명의 형질전환 식물은 게놈 내로 이형성 또는 상동성 노화-유도된 elF-5A DNA 또는 변형된 DNA 또는 이형성 노화-유도된 elF-5A DNA 또는 상동성 노화-유도된 elF-5A DNA의 일부분을 통합시킨다. 본 발명의 형질전환 식물은 게놈 내로 이형성 또는 상동성 노화-유도된 DHS와 elF-5A DNA 또는 변형된 DNA 또는 이형성 노화-유도된 DHS와 elF-5A DNA 또는 상동성 노화-유도된 DHS DNA의 일부분 또는 이형성 및 상동성 DHS와 elF-5A 서열의 조합을 통합시킨다. 변화된 유전적 물질은 단백질을 인코드하고, 조절적 또는 제어 서열로 구성되거나 안티센스 서열이거나 포함하거나 식물의 내생적 노화-유도된 DHS 또는 elF-5A DNA 또는 mRNA 서열 또는 그의 일부분에 안티센스인 안티센스 RNA를 인코드한다. "트랜스유전자" 또는 "형질전환 서열"은 형질전환 식물 내로 통합된 외부 유전자 또는 일부 서열로 정의된다.
여기에 사용된 "하이브리디제이션"이라는 용어는 일반적으로 프로브 서열과 타겟 서열의 성질에 따라 당업자에게 용이하게 명백한 적당한 스트린젠시 조건에서의 핵산의 하이브리디제이션을 의미하는데 사용된다. 하이브리디제이션 및 세척의 조건은 당 분야에 잘 알려져 있고, 인큐베이션 시간, 온도 및/또는 용액의 이온 강도를 변화시킴으로서 원하는 스트린젠시(stringency)에 따라 다른 조건의 조정이 용이하게 성취된다. 예를 들어 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참조. 조건의 선택은 하이브리다이즈되는 서열의 길이, 특히 프로브 서열의 길이, 핵산의 상대 G-C 함유량 및 허용되는 미스매치(mismatch)의 양에 의해 규정된다. 더 낮은 정도의 상보성을 지닌 스트랜드 사이의 부분적인 하이브리디제이션이 요구될 때는 낮은 스트린젠시 조건이 바람직하다. 완벽한 또는 거의 완벽한 상보성이 요구될 때는 높은 스트린젠시 조건이 바람직하다. 일반적인 높은 스트린젠시 조건의 경우 하이브리디제이션 용액은 6X S.S.C, 0.01M EDTA, 1X Denhardt's 용액 및 0.5% SDS를 포함한다. 하이브리디제이션은 클론된 DNA의 단편의 경우 약 3∼4시간 동안, 진핵세포성 DNA의 경우 12∼16시간 동안 68℃에서 수행된다. 더 낮은 스트린젠시의 경우 하이브리디제이션의 온도는 이중나선의 녹는점(TM)인 42℃ 이하로 감소된다. TM은 용액의 이온 강도뿐만 아니라 G-C 함량 및 및 이중나선의 길이에 기능하는 것으로 알려져 있다.
여기에 사용된 바와 같이 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 상동성"이라는 용어는 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 의미하는데 사용된다. 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 상동성을 지닌 서열 사이의 구조적 또는 기능적 차이점은 디 미니미스(de minimis)가 될 것이다 ; 즉 서열의 능력이 원하는 적용에 나타난 바와 같은 기능을 하게 할 수 없을 것이다. 차이점은 예를 들어 다른 종 사이의 코돈 용법(usage)의 고유한 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이에 서열 중복 또는 유사성의 유의적인 양이 있거나 또는 다른 서열이 길이나 구조에 있어 다르더라도 유사한 물리적 특성을 나타내는 경우 구조적 차이점은 디 미니미스로 여겨진다. 이러한 특성은 예를 들어 한정된 조건하에서 하이브리다이즈하는 능력 또는 단백질의 경우에 있어서 면역적 교차반응성, 유사한 효소 활성 등을 포함한다. 이들 특성의 각각은 당 분야 알려진 방법에 의해 당업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
더욱이 2개의 뉴클레오타이드 서열이 그들 사이에 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 유사성을 지니는 경우 "실질적으로 상보적"이다. 2개의 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 활성 부분 사이에 적어도 약 50%, 바람직하게는 70% 이상의 유사성을 지니는 경우 실질적으로 상동성이다.
여기에 사용된 바와 같이 DNA 또는 RNA 분자의 "상응하는 부분에 하이브리다이즈하는"이라는 구문은 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 도는 어떤 뉴클레오타이드 서열을 하이브리다이즈하고(인센스 또는 안티센스 방향으로), 거의 동일한 크기의 또다른 핵산 분자의 서열을 인식하고 하이브리다이즈하고, 적당한 조건하에서 하이브리디제이션에 효과를 나타내는 것에 충분한 서열 유사성을 지닌 분자를 의미한다. 예를 들어 토마토 DHS의 3' 코딩 또는 비-코딩 구역으로부터의 100 뉴클레오타이드 길이 안티센스 분자는 2개의 서열 사이에 약 70% 이상의 서열 유사성이 있는 한 각각 카네이션 DHS 유전자 또는 다른 식물 DHS 유전자의 3' 코딩 또는 비-코딩 구역 내의 뉴클레오타이드 서열의 거의 100 뉴클레오타이드 부분을 인식하고 하이브리다이즈할 것이다. "상응하는 부분"의 크기는 하이브리디제이션에서의 일부 미스매치를 허용하여 "상응하는 부분"이 하이브리다이즈 하는 분자보다 더 크거나 더 작은, 예를 들어 20∼30% 더 크거나 또는 더 작은, 바람직하게는 약 12∼15% 더 크거나 더 작게 될 것이다.
여기서 핵산(또는 폴리- 또는 올리고뉴클레오타이드)의 "기능적 유도체"라는 용어는 노화-유도된 DHS 또는 노화-유도된 elF-5A를 인코딩하는 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열의 단편, 변이체, 상동체 또는 아날로그를 의미한다. 기능적 유도체는 본 발명에 따른 사용을 가능하게 하는 DNA를 인코딩하는 노화-유도된 DHS 또는 elF-5A의 기능의 적어도 일부분 이상을 보유한다. 이러한 기능은 식물 노화-유도된 DHS 또는 elF-5A mRNA의 전사 및/또는 번역을 억제하기 위해 낮은 스트린젠시 조건하에서 천연 토마토, 아라비돕시스 또는 카네이션 노화-유도된 DHS 또는 elF-5A 또는 노화-유도된 DHS 또는 elF-5A를 인코드하는 또다른 식물로부터의 실질적인 상동성 DNA 또는 그의 mRNA 전사체와 안티센스 방향으로 하이브리다이즈할 수 있는 능력을 포함한다.
유전자 또는 DNA 서열의 "단편"은 분자의 서브세트 즉, 더 짧은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. "변이체"는 하나 이상의 치환된 뉴클레오타이드를 지닌 뉴클레오타이드 치환 변이체와 같은 전체 유전자 또는 그의 단편을 나타내나 이는 특정한 유전자와 하이브리다이즈할 수 있고, 고유의 DNA와 하이브리다이즈하는 mRNA 전사체를 인코드할 수 있는 능력을 유지한다. "상동체"는 다른 식물속 또는 종으로부터의 단편 또는 변이체를 나타낸다. "아날로그"는 실질적으로 유사하거나 또는 전체 분자, 그의 변이체 또는 단편에 대해 기능하는 비-자연적 분자를 나타낸다.
"발현 조절"에 의해 발현이 억제되거나 상향-조절됨이 의미된다. "발현의 억제"는 노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A, 생장 eIF-5A 또는 DHS와 같은 타겟 유전자로부터의 단백질 및/또는 mRNA 부재 또는 검출 가능한 수준 감소를 나타낸다. "상향-조절" 또는 "과발현"은 노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A, 생장 eIF-5A 또는 DHS와 같은 타겟 유전자로부터의 단백질 및/또는 mRNA 수준의 검출 가능한 증가를 나타낸다.
본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 자연적 원료로부터 분리되거나 재조합적으로 생성되거나 합성된 것을 포함한다.
본 발명의 분리된 펩타이드는 자연적 원료로부터 분리되거나 재조합적으로 생성되거나 합성된 것을 포함한다. 본 발명의 분리된 단백질은 바람직하게는 말토즈 결합 단백질과 융합된 eIF-5A 또는 DHS를 포함한 융합 단백질로서 발현된 노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A, 생장 eIF-5A 또는 DHS를 포함한다.
본 발명의 노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A, 생장 eIF-5A 또는 DHS 펩타이드의 "기능적 유도체"는 eIF-5A 이소폼 또는 DHS에 대해 특이적인 항체와의 적어도 일부분 이상의 활성 또는 면역 교차 반응성을 보유한 노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A, 생장 eIF-5A 또는 DHS의 단편, 변이체, 아날로그 또는 화학적 유도체를 포함한다. eIF-5A 또는 DHS 펩타이드의 단편은 어떠한 분자 서브세트도 나타낸다. 변이체 펩타이드는 예를 들어 당분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 직접적인 화학 합성에 의해 제조된다. eIF-5A 또는 DHS 펩타이드의 아날로그는 전체 단백질 또는 그의 단편과 실질적으로 유사한 비-천연 단백질을 나타낸다. eIF-5A 또는 DHS의 화학적 유도체는 일반적으로 펩타이드 또는 펩타이드 단편의 일부가 아닌 추가적인 화학적 모이어티를 포함한다. 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도제와 펩타이드의 타겟된 아미노산 잔기를 반응시킴으로서 변형이 펩타이드 또는 그의 단편 내로 도입된다.
본 발명에 따른 eIF-5A 또는 DHS는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된(센스 방향으로) 세포를 배양하고, 세포가 단백질을 합성하게 한 후 사용된 클로닝 프로토콜에 따라 배양액 배지로부터 또는 세포 추출물로부터 본 단백질을 자유 단백질 또는 융합 단백질로서 분리함으로서 생성된다. 대안으로, 본 단백질은 무-세포 시스템 내에서 생성될 수 있다(Ranu et al., Meth. Eznymol., 60:459-484(1979)).
플라스미드 DNA의 제조, 제한 효소 분해, DNA의 아가로스 겔 전기영동, 단백질의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, PCR, RT-PCR, 서던 블럿, 노던 블럿, DNA 라이게이션 및 박테리아 형질전환이 당분야에 잘 알려진 통상의 방법을 이용하여 수행되었다. 예를 들어 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 참조. 핵산 하이브리디제이션 기술은 Sambrook에 의해 개시되었다.
본 발명에 따른 재조합 뉴클레오타이드 분자를 구축하기 위한 절차는 Sambrook et al.,에서 개시되었다: 참고문헌에 포함된 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989) 및 Maniatis, T. et al, Molecular mechanisms in the Control of Gene expression, eds., Nierlich et al., eds., Acad. Press, N.Y.(1976).
본 발명에 따라 제조된 형질전환 식물은 당분야에 알려진 어떠한 식물 형질전환 방법도 이용하여 DNA 형질전환에 의해 제조된다. 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 식물, 조직 또는 세포의 직접적인 동시-배양 또는 직접적인 감염(Miki et al., Meth. in Plant Mol. Biol. and Biotechnology, (1993), p.67-88); 프로토플라스트(protoplast) 내로의 직접적인 유전자 전이 또는 프로토플라스트 업테이크(uptake)(Paszkowski et al., 유도된 J., 12:2717 (1984)); 일렉트로포레이션(electroporation)(Fromn et al., Mature, 319:710 (1986)); 입자 포격(particle bombardment)(Klein et al., BioTechnology, 6:559-563 (1988)); 묘목 또는 식물의 분열조직 내로의 주입(De LePena et al., Nature, 325:274-276 (1987)); 배양된 세포 및 조직의 프로토플라스트 내로의 주입(Reich et al., BioTechnology, 4:1001-1004 (1986))을 포함한다.
일반적으로 완전한 식물은 형질전환 과정으로부터 수득된다. 식물은 프로토플라스트, 캘러스, 조직 부분 또는 외식편 등으로부터 재생된다. 잎, 꽃, 열매, 종자 등과 같이 노화-유도된 DHS의 발현이 변화된 재생된 식물로부터 수득된 식물부가 여기에 사용된 바와 같이 "식물"의 정의에 포함된다. 또한 재생된 식물의 자손, 변이체 및 돌연변이도 "식물"의 정의에 포함된다.
일반적 eIF-5A
본 발명은 3가지 다른 eIF-5A 이소폼: 노화-유도된 eIF-5A; 손상-유도된 eIF-5A; 및 생장 eIF-5A에 관한 것이다. 본 발명은 다양한 식물종으로부터 분리된 다양한 eIF-5A 이소폼 및 다양한 eIF-5A 이소폼을 분리하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 이들 본 발명의 다양한 eIF-5A 이소폼을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한 본 발명은 eIF-5A 이소폼의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터를 제공한다. 일부의 실시태양에서 식물을 형질전환하기 위해 eIF-5A 이소폼의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터의 이용을 통해 내생적 eIF-5A의 발현을 억제하는 방법이 제공된다. 일부 실시태양에서 센스 방향으로 eIF-5A 이소폼의 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터를 제공함으로서 내생적 eIF-5A 이소폼을 상향-조절하는 방법이 제공된다.
다른 이소폼은 식물의 수명 단계 또는 식물의 조건에 따라 다르게 자연적으로 상향 또는 하향-조절된다. 예를 들어 노화 조직에서 노화-유도된 eIF-5A 이소폼은 상향-조절된다. 노화-유도된 eIF-5A는 번역을 위해 세포핵으로부터 세포질로 mRNA의 특정 서브세트를(노하 경로에 관련된) 왕복시킴으로서 식물 또는 식물 조직의 추가적인 노화에 관여되는 것으로 여겨진다. 노화-유도된 eIF-5A의 발현을 하향 조절하거나 억제함으로서 노화가 식물 및/또는 식물 조직 내에서 지연될 수 있다. 지연된 노화는 비-형질전환된 또는 야생형 식물과 비교시 더 큰 생물량, 증가된 열매 저장 수명, 증가된 꽃 저장 수명, 증가된 종자 크기 및 증가된 종자 산출량을 지님으로서 형질전환 식물 내에서 명백해진다.
식물 및/또는 식물 조직이 냉기, 탈수 또는 기계적 힘과 같은 손상 이벤트에 노출되는 경우 손상-유도된 eIF-5A 이소폼이 상향-조절된다. 손상-유도된 eIF-5A의 발현을 하향 조절함으로서 비-형질전환된 또는 야생형 식물의 독성 손상에 대한 저항성과 비교시 병원균 이입으로 인한 독성 손상에 대한 증가된 저항성이 식물에 부여된다.
식물이 생장 단계에 있는 경우 생장 eIF-5A 이소폼이 상향-조절된다. 생장 eIF-5A를 상향-조절함으로서 수득된 형질전환 식물은 증가된 종자 크기, 증가되 생물량 및 증가된 종자 수확량을 지닌다.
도 1은 아라비돕시스 탈리아나("At")로부터 분리된 3가지 eIF-5A 이소폼의 정렬을 나타낸다. 도 2는 이들 3가지 이소폼의 코딩 구역의 정렬을 나타낸다. 도 305는 3가지 이소폼의 게놈 서열을 제공한다.
웨스턴 블럿(도 8 참조)은 다른 식물 수명 단계에서의 이들 3가지 이소폼 내의 발현을 나타낸다. 도 8은 노화-유도된 인자 eIF-5A 이소폼의 양이 잎 연령의 증가로서 증가됨을 나타낸다. 이는 개화되지 않은 꽃봉오리, 장각과 또는 줄기에서 나타나지 않고 흡수된 종자 내에 나타난다. 흡수된 종자내에 생장하는 배아뿐만 아니라 자엽 조직도 있다. 따라서 자엽 조직은 배아가 생장함에 따라 노화되기 때문에 노화-유도된 eIF-5A는 흡수된 종자 내에 존재한다. 손상-유도된 eIF-5A는 이들 조직의 수확이 일부 손상을 유도할 때 장각과, 종자 및 줄기에 나타난다.
다른 이소폼 사이 또는 다른 식물종 내의 다른 이소폼 사이의 높은 정도의 상동성(약 85%)이 존재하나 다른 이소폼은 3'UTR 내에서 서로 다르다. 종간뿐만아니라 이소폼 사이에서 높게 보존된 구역은 하이푸신 사이트로 여겨지는 지역이다. 하이푸신 사이트는 하기 아미노산으로 여겨진다:
5'-
Figure 112005074399539-PCT00001
-3'(서열번호: ). 다양한 eIF-5A 이소폼 및 여러 식물종의 정렬에 대해 도 85 참조.
노화-유도된 eIF-5A
노화-유도된 eIF-5A는 노하 조직 내에서 발현된다. 본 발명은 아라비돕시스 탈리아나, 토마토 및 카네이션 식물 내 노화-유도된 eIF-5A의 발견에 관한 것이다. 노화-유도된 eIF-5A는 노화 조직에서 상향-조절되고 식물 및 식물 조직 내 형태 변화에 관련된 노화의 유도에 관련된다. 식물 내에서 노화-유도 eIF-5A의 발현 억제는 식물 내에서 노화 및 노화-관련 과정을 변화시키는데 사용될 수 있다. 하향-조절은 동시-억제를 달성하기 위한 안티센스 컨스트럭트의 이용을 통해 또는 센스 컨스트럭트의 이용을 통해 발생한다. 노화-유도된 eIF-5A의 발현 억제는 증가된 식물 생물량, 지연된 열매 연화 또는 부패, 절단된 꽃 또는 상추 잎과 같은 식물 조직의 지연된 갈변, 증가된 종자 수확량 및 증가된 종자 크기를 포함한 형질전환 식물 내 다양한 형태 변화를 유발한다.
따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 아라비돕시스 탈리아나로부터 분리된 노화-유도된 eIF-5A이다. 아미노산 서열은 도 59에 제공되고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 59에 제공되고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 토마토로부터 분리된 노화-유도된 eIF-5A이다. 아미노산 서열은 도 57 및 86에 제공되고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 57 및 86에 제공되고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 카네이션으로부터 분리된 노화-유도된 eIF-5A이다. 아미노산 서열은 도 58에 제공되고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 58 및 86에 제공되고 서열번호: 이다.
또한 본 발명은 상기 열거된 서열번호와 90% 서열 상동성을 지니고 높은 스트린젠시 조건 하에서 열거된 서열번호의 상보체에 하이브리다이즈하고 노화-유도된 eIF-5A를 인코드하는 노화-유도된 eIF-5A의 분리된 폴리뉴클레오타이드 제공한다.
또한 본 발명은 노화-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 발현을 억제할 수 있는 길이이면 된다. 일부 실시태양에서 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전체 길이 코딩 서열을 포함하고 다른 특정하게 바람직한 실시태양에서 eIF-5A의 다른 이소폼이 3'UTR에서 이소폼 내의 다양한 정도의 변이를 지니기 때문에 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 3'UTR로 지시된다. 일부 실시태양에서 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 5'-비-코딩 서열로 지시된다. 5'-비-코딩 서열에 아마도 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전사 인자를 인코드하는 유전자 발현의 효과적인 억제제로 알려져 있다(Branch, M.A., Molec. Cell Biol., 13:4282-4290(1993)).
여기서 사용된 "노화-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 열거된 서열번호의 상보체의 100% 상보성을 공유하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함할 뿐만 아니라 기능적 변이체인 안티센스 폴리뉴클레오타이드도 포함한다. 기능적 변이체는 노화-유도된 eIF-5A의 상응하는 부분에 적어도 80% 이상의 서열 상동성을 지니고 높은 스트린젠시 조건 하에서 이에 하이브리다이즈하는 자연적 또는 인공적 변이체이다. 또한 변이체는 발현 벡터 내로 도입되고 이러한 벡터가 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합되는 경우 내생적 노화-유도된 eIF-5A의 발현을 조절할 수 있는 본 발명에 의해 의도된 기능을 지녀야 한다. 당업자는 전사체에 결합하고 유전자 발현을 감소시키거나 억제하기 위해 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 능력에 극적으로 영향을 미치지 않는 서열 내에 실질적이지 않는 변화가 생성될 수 있음을 인식할 수 있다. 따라서 "안티센스 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 전사체에 실질적으로 상보적이고 전사체에 특이적으로 결합하고 유전자 발현을 억제하거나 감소시키는 능력을 유지하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스의 일반적인 논의를 위해 Albert et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., Garland Publishing, Inc. New York, New York, 1989(특히 페이지 195-196, 참고문헌에 포함됨) 참조.
본 발명의 하나의 실시태양은 노화-유도된 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드(상기 기술된 본 발명의) 또는 노화-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드(상기 기술된 본 발명의)를 제공한다. 벡터는 플라스미드, 바람직하게는 바이러스성 또는 식물 세포 또는 박테리아 세포 내에서 인크드되는 유전자를 복제하고 발현하는 당분야에 알려진 다른 벡터이다. 벡터는 염색체적으로 통합되어 노화-유도된 eIF-5A RNA의 원하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 생성하도록 전사될 수 있다. 이러한 플라스미드 또는 바이러스성 벡터는 당분야에서 일반적인 재조합 DNA 기술에 의해 구축될 수 있다. 예를 들어 벡터는 원핵성 숙주 및 본 발명에 따른 안티센스 폴리뉴클레오타이드 내에서 기능적인 복제 시스템을 포함한 플라스미드 벡터이다. 대안으로 벡터는 아그로벡테리움 및 본 발명에 따른 안티센스 폴리뉴클레오타이드 내에서 기능적인 복제 시스템을 포함한 플라스미드이다. 아그로박테리움 내에서 복제할 수 플라스미드는 당분야에 잘 알려져 있다. Miki et al., Procedures for Introducing Foreign DNA Into Plants, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. B.R. Glick and J.E. Thompson. CRC Press (1993) pp.67-83 참조.
또한 벡터는 폴리뉴클레오타이드을 발현하게 하도록 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함한다. 조절 서열은 형질전환된 식물 세포 내에서 기능적인 프로모터를 포함한다. 프로모터는 유도성, 구성적 또는 조직 특이적이다. 이러한 프로모터는 당업자에 의해 잘 알려져 있다.
유전자의 센스 또는 안티센스 전사체를 생성하는 노화-유도된 DHS 유전자와의 결합에 유용한 프로모터 조절 요소는 일반적으로 어떤 식물 프로모터 및 더욱 특별하게는 피그 와트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터, CaMV35S 프로모터 또는 MAS 프로모터와 같은 구성적 프로모터 또는 카네이션 화판 GST1 프로모터 또는 아라비돕시스 SAG12 프로모터와 같은 조직-특이적 또는 노화-유도된 프로모터를 포함한다(예를 들어 J.C. Palaqui et al., Plant Physiol., 112:1447-1456 (1996); Morton et al., Molecular Breeding, 1:123-132 (1995); Forbert et al., Plant Journal, 6:567-577 (1994); Gan et al., Plant Physiol., 113:313 (1997) 참조). 바람직하게는 본 발명에 사용된 프로모터는 구성적 프로모터이다. 노화-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 경우 SAG12 프로모터가 바람직하다. 실시예 23 참조.
본 발명에 유용한 프로모터로부터의 발현 수준은 예를 들어 리포터 유전자 생성물 즉, 프로모터/리포터 유전자가 도입된 형질전환 식물의 잎, 꽃, 열매 또는 다른 조직의 추출물 내의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정함으로서 통상의 발현 시스템을 이용하여 시험될 수 있다.
선택적으로는, 조절 서열은 5'-비-번역 리더 서열 또는 폴리아데닐레이션 신호 또는 인핸서를 포함한다. 또한 본 발명은 당업자에 알려진 다른 조절 서열을 고려한다.
또한 본 발명은 벡터 또는 센스 또는 안티센스 방향의 노화-유도된 eIF-5A의 폴리뉴클레오타이드를 포함한 본 발명의 벡터의 결합으로 형질전환된 형질전환 식물, 형질전환 식물의 세포 또는 꽃, 열매, 잎, 종자 등과 같은 식물 부분으로부터 생성된 형질전환 묘목 또는 성숙 형질전환 식물을 제공한다.
또한 본 발명은 내생적 노화-유도된 eIF-5A의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 노화-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한 본 발명의 발현 벡터를 통합시키는 것을 포함한다. 노화-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 내생적 노화-유도된 eIF-5A의 발현을 억제한다.
내생적 노화-유도된 eIF-5A의 발현을 억제하는 또다른 방법에서 센스 방햐으로 본 발명의 노화-유도된 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터가 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합된다. 노화-유도된 eIF-5A의 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 수득된 외생적 노화-유도된 eIF-5A의 동시-발현은 내생적 노화-유도된 eIF-5A의 하향-조절 또는 억제를 유발한다.
손상-유도된 eIF-5A
손상-유도된 eIF-5A는 손상된 조직에서 발현된다. 본 발명은 아라비돕시스 탈리아나 및 토마토 내의 손상-유도된 eIF-5A의 발견에 관한 것이다. 본 발명자는 이러한 이소폼이 식물에 대한 손상 이벤트 동안 상향 조절됨을 발견하였다. 상향-조절은 전사 수준에서 발생한다. 또한 이는 독성 감염 후 단백질 수준에서 배타적으로 상향-조절된 후 세포 사멸을 유발하고 이는 손상-유도된 eIF-5A가 병원균에 의한 이입 이벤트 내에서 세포 사멸을 작동시키는 작용을 이끈다. 도 9는 노화-유도된 eIF-5A가 대조군 식물, 모의 처리된 식물, Avr 처리된 식물 및 Vir 처리된 식물 내에서 일정하게 유지됨을 나타낸다(식물이 4주령인 것으로 검출됨). 손상-유도된 eIF-5A는 Vir 처리된 식물에서 상향-조절된다.
도 10은 식물의 수준이 지혈기로 손상된 실험 결과를 나타낸다. 아라비돕시스 탈리아나("At") 내의 노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A 및 생장 eIF-5A의 수준은 손상 직후, 1시간후 및 9시간 후 측정되었다. 노던 블럿은 노화-유도된 eIF-5A가 일정하게 유지되나 손상-유도된 eIF-5A의 발현 수준의 현저한 증가가 있음을 나타낸다. 생장 eIF-5A의 발현 수준은 손상 이벤트시 감소하기 시작하였다.
본 발명자는 손상-유도된 eIF-5A가 상향-조절되고 손상 이벤트가 식물에 부과될 때(묘목이 이식될 때 발생하는 것과 같은) 이러한 손상은 생장 eIF-5A의 매우 강한 억제를 유발함을 증명하였다. 도 14-17 참조. 수득된 식물은 매우 왜소한 생장을 지닌다. 그러나 종자가 카나마이신 내에 침지되고 토양 내로 직접 심어지는 경우(이식이 필요없고 따라서 이식 손상이 없음) 종자는 정상 크기의 식물로 발달한다.
모두 통합된 센스 손상-유도된 eIF-5A 컨스트럭트를 지닌 다양한 시험 식물 사이에서 나타나는 차이는 손상-유도된 eIF-5A 발현의 다양한 정도에 기인한다. 당업자는 유전자가 도입될 때(센스 또는 안티센스) 유전자 다양한 정도의 상향-조절 또는 하향-조절을 지님을 인식할 것이다. 정도의 차이는 유전자가 어디에 통합되는지 및 얼마나 많은 복제가 통합되는지에 따라 달라진다. 발현 정도를 변화시킴으로서 다양한 표현형을 유전자 발현에 상호관련시킬 수 있다. 원하는 표현형이 생성되면 그 식물이 채취되어 원하는 자손을 생성하는데 이용될 수 있다. 따라서 도 15에서 손상-유도된 eIF-5A에 대해 강하게 상향-조절된 식물이 손상 이벤트 후 거의 생장하지 않았으나(식물 태그 10), 다소 잘 생장한 식물(그러나 야생형만틈 양질은 아닌)은 강하게 상향-조절되지 않았다.
본 발명의 하나의 실시태양은 아라비돕시스 탈리아나로부터의 분리된 손상-유도된 eIF-5A이다. 아미노산 서열은 도 41에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 41에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 토마토로부터의 분리된 손상-유도된 eIF-5A이다. 아미노산 서열은 도 103에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 103에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
또한 본 발명은 상기 열거된 서열번호와 90% 서열 상동성을 지니고, 높은 스트린젠시 조건 하에서 열거된 서열번호의 상보체에 하이브리다이즈하고 손상-유도된 eIF-5A를 인코드하는 손상-유도된 eIF-5A의 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한 본 발명은 손상-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 발현을 억제할 수 있는 길이면 된다. 일부 실시태양에서 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전체 길이 코딩 서열을 포함하고 다른 특정하게 바람직한 실시태양에서 eIF-5A의 다른 이소폼이 3'UTR에서 더 큰 정도의 이소폼 변이를 지니기 때문에 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 3'UTR로 지시된다. 일부 실시태양에서 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 5'-비-코딩 서열로 지시된다. 5'-비-코딩 서열에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전사 인자를 인코드하는 유전자 발현의 효과적인 억제제로 알려져 있다(Branch, M.A., Molec. Cell Biol., 13:4282-4290(1993)).
여기서 사용된 "노화-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 열거된 서열번호의 상보체의 100% 상보성을 공유하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함할 뿐만 아니라 기능적 변이체인 안티센스 폴리뉴클레오타이드도 포함한다. 변이체는 발현 벡터 내로 도입되고 이러한 벡터가 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합되는 경우 내생적 손상-유도된 eIF-5A의 발현을 조절할 수 있는 본 발명에 의해 의도된 바와 같이 기능한다.
본 발명의 하나의 실시태양은 손상-유도된 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드(상기 기술된 본 발명의) 또는 손상-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드(상기 기술된 본 발명의)를 포함한 발현 벡터를 제공한다. 벡터는 상기 기술된 바와 같다.
또한 본 발명은 센스 또는 안티센스 방향으로 손상-유도된 eIF-5A의 폴리펩타이드를 포함한 벡터 또는 벡터 결합으로 형질전환된 형질전환 식물 세포, 형질전환 묘목 또는 이러한 세포로부터 생성된 숙성 형질전환 식물 또는 꽃, 열매, 잎, 종자와 같은 형질전환 식물의 식물 일부를 제공한다.
또한 본 발명은 내생적 손상-유도 eIF-5A의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 식물의 적어도 하나 이상의 세포의 게놈 내로 손상-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한 본 발명의 발현 벡터를 통합시키는 것을 포함한다. 손상-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 내생적 손상-유도된 eIF-5A의 발현을 억제한다.
내생적 손상-유도된 eIF-5A의 발현을 억제하는 또다른 방법에 있어서, 센스 방향의 본 발명의 손상-유도된 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 식물의 적어도 하나 이상의 세포 게놈 내로 통합된다. 손상-유도된 eIF-5A의 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 수득된 내생적 손상-유도된 eIF-5A의 동시 발현은 내생적 손상-유도된 eIF-5A의 발현의 하향-조절 또는 억제를 유발한다.
내생적 eIF-5A의 발현을 억제함으로서 수득된 형질전환 식물은 병원균 이입에 의해 기인한 독성적 손상에 대한 증가된 저항성을 지닌다. 실시예 16 및 도 43 및 44 참조.
생장 eIF-5A
또한 본 발명은 생장 eIF-5A에 관한 것이다. 생장 eIF-5A는 생장 조직 내에서 발현된다. eIF-5A이 센스 방향으로 생장 eIF-5A의 폴리뉴클레오타이드로 상향-조절되면 3가지 표현형적 변화가 나타난다: 증가된 종자 크기, 증가된 생물량 및 증가된 종자 수확량.
본 발명의 하나의 실시태양은 아라비돕시스 탈리아나로부터의 분리된 생장 eIF-5A이다. 아미노산 서열은 도 1에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산의 폴리뉴클레오타이드는 도 2에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 토마토로부터의 분리된 생장 eIF-5A이다. 아미노산 서열은 도 101에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산의 폴리뉴클레오타이드는 도 101에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 카놀라로부터의 분리된 생장 eIF-5A이다. 아미노산 서열은 도 95에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산의 폴리뉴클레오타이드는 도 95에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
또한 본 발명은 상기 열거된 서열번호와 90% 서열 상동성을 지니고 높은 스트린젠시 조건 하에서 열거된 서열번호의 상보체에 하이브리다이즈하고 생장 eIF-5A를 인코드하는 생장 eIF-5A의 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한 본 발명은 생장 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 발현을 억제할 수 있는 길이면 된다. 일부 실시태양에서 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전체 길이 코딩 서열을 포함하고 다른 특정하게 바람직한 실시태양에서 eIF-5A의 다른 이소폼이 3'UTR에서 더 큰 정도의 이소폼 변이를 지니기 때문에 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 3'UTR로 지시된다. 일부 실시태양에서 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 5'-비-코딩 서열로 지시된다. 5'-비-코딩 서열에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전사 인자를 인코드하는 유전자 발현의 효과적인 억제제로 알려져 있다(Branch, M.A., Molec. Cell Biol., 13:4282-4290(1993)).
여기서 사용된 "생장 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 열거된 서열번호의 상보체의 100% 상보성을 공유하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함할 뿐만 아니라 기능적 변이체인 안티센스 폴리뉴클레오타이드도 포함한다. 기능적 변이체는 상기 기술된 것이다. 변이체는 발현 벡터 내로 도입되고 이러한 벡터가 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합되는 경우 내생적 생장 eIF-5A의 발현을 조절할 수 있는 본 발명에 의해 의도된 바와 같이 기능한다.
본 발명의 하나의 실시태양은 생장 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드(상기 기술된 본 발명의) 또는 생장 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드(상기 기술된 본 발명의)를 포함한 발현 벡터를 제공한다. 벡터는 상기 기술된 바와 같다.
또한 본 발명은 센스 또는 안티센스 방향으로 생장 eIF-5A의 폴리펩타이드를 포함한 벡터 또는 벡터 결합으로 형질전환된 형질전환 식물 세포, 형질전환 묘목 또는 이러한 세포로부터 생성된 숙성 형질전환 식물 또는 꽃, 열매, 잎, 종자와 같은 형질전환 식물의 식물 일부를 제공한다.
또한 본 발명은 내생적 생장 eIF-5A의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 식물의 적어도 하나 이상의 세포의 게놈 내로 생장 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한 본 발명의 발현 벡터를 통합시키는 것을 포함한다. 생장 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 내생적 생장 eIF-5A의 발현을 억제한다.
내생적 생장 eIF-5A의 발현을 억제하는 또다른 방법에 있어서, 센스 방향의 본 발명의 생장 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 식물의 적어도 하나 이상의 세포 게놈 내로 통합된다. 생장 eIF-5A의 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 수득된 내생적 생장 eIF-5A의 동시 발현은 내생적 생장 eIF-5A의 발현의 하향-조절 또는 억제를 유발한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서 생장 eIF-5A의 발현을 상향-조절하는 방법이 제공된다. 센스 방향으로 본 발명의 생장 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 식물의 적어도 하나 이상의 세포 게놈 내로 통합된다. 생장 eIF-5A의 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 수득된 외생적 생장 eIF-5A의 동시-발현은 세포가 비-형질전환 세포보다 더 많은 생장 eIF-5A를 발현하도록 한다.
도 19는 생장 eIF-5A에 대해 상향-조절된 식물이 대조군 식물보다 증가된 생물량을 지녔음을 나타낸다. 생장 eIF-5A의 발현을 상향-조절하기 위해 생장 eIF-5A이 센스 방향으로 아라비돕시스 탈리아나 내로 삽입되었다. 16개 모계(1-16)는 일반 수준의 생장 eIF-5A 발현을 측정하는데 분석되었다. 각각의 모계 8로부터 자매 라인이 생성되었다(A-H). 각 모계 내의 생장 eIF-5A의 발현 수준이 시험되었고 결과는 도 20에 나타나 있다. 다양한 정도의 발현이 전체 모계에 나타나 있다. 예를 들어 라인 2 및 10은 높은 수준의 발현을 지니는 반면 라인 11 및 16은 매우 낮은 발현을 지니거나 전혀 없다.
도 21 및 22는 라인 1 및 2로부터의 식물을 나타낸다. 이들 식물은 대조군 식물보다 더 크다. 생장 eIF-5A이 세포-분열 이소폼이고 구성적으로 발현되기 때문에 세포 분열이 증가된다. 식물이 생장 모드로 잠기고 노화 경로로 스위치될 수 없기 때문에 노화의 감소가 발생한다.
도 23 및 24는 중간 수준의 생장 eIF-5A 발현을 라인으로부터의 것이다. 이들은 더 큰 잎 및 지연된 노화를 나타낸다.
도 25 및 26은 낮은 수준의 상향-조절을 지닌 라인으로부터의 것이다. 이들은 큰 잎 및 큰 로제트를 지닌다.
도 27 및 28은 상향-조절이 없는 라인으로부터의 것이다(유전자의 동시-억제에 기인함). 식물이 카나마이신 저항적이기 때문에 식물이 배지 상에서 생장하도록 하기 위해 본 유전자가 존재해야 한다. 또한 노화-유도된 eIF-5A가 동시-억제되고 따라서 크기의 증가를 유발함이 나타난다.
증가된 생물량에 더하여 생장 eIF-5A 상향-조절된 식물 내에서 증가된 종자 크기를 보인다. 모든 라인의 종자 크기가 측정되었다. 가장 높은 수준의 생장 eIF-5A 발현을 지닌 라인에서 종자 크기 내의 3x 이상의 증가가 나타났다. 이는 생장 eIF-5A의 상향-조절이 세포 분열을 증가시켜 종자 크기를 증가시켰기 때문이다.
상기 예에서의 생장 eIF-5A(아라비돕시스 탈리아나로부터의)는 구성적으로 발현된 것으로 즉, 보편적인 프로모터의 이용을 통해 식물 내 어디에서나 발현된다. 반대로 조직 특이적 프로모터를 이용함으로서 특정 조직 내로 상향-조절이 지시되기도 한다. 예를 들어 종자 특이적 프로모터를 이용함으로서 생장 eIF-5A는 종자 내에서만 상향-조절되어 잎이 정상적으로 생장하도록 하나 종자의 양의 증가를 생성한다. 따라서 특정 프로모터를 이용하여 생장 eIF-5A가 원하는 식물 부분에서 상향-조절되어 원하는 표현형을 수득할 수 있다.
생장 eIF-5A를 상향-조절함으로서 3가지 표현형을 유발하나 - 증가된 생물량, 증가된 종자 수확량 또는 증가된 종자 크기- 3가지 표현형 모구가 동시에(또는 동일 식물 내에) 존재하지는 않는다. 예를 들어 식물이 종자 크기의 증가를 나타내는 경우 더 작은 식물이 존재할 것이다. 생장 eIF-5A의 가장 높은 상향-조절을 지닌 식물 라인에서 가장 큰 종자가 생성되었으나 세포 확대(더 큰 잎에 필요한)의 비용인 전체 식물에 걸쳐 진행된 대규모 세포 분열이 존재하기 때문에 식물은 더 작았다. 생장 eIF-5A 발현의 낮은 수준의 상향-조절에서 종자를 충격을 주지 않고 잎(더 큰) 상의 충격을 보인다. 따라서 조직 특이적 발현을 이용하고 원하는 표현형을 취한다. 예를 들어 생성되는 물관부 양의 증가를 달성하기 위해 생장 eIF-5A를 물관부 특이적 프로모터 아래에 생장 eIF-5A를 위치시킨다. 따라서 어떠한 원하는 프로모터도 원하는 조직-특이적 상향-조절을 달성하는데 이용된다.
DHS
DHS는 eIF-5A의 활성화에 필수적이고 노화 조직에서 발현된다. 따라서 본 발명은 아라비돕시스 탈리아나, 토마토, 카네이션, 카놀라, 상추, 자주개자리, 바나나, 미루나무 및 미코스파에렐라로부터의 분리된 DHS를 제공한다.
따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 아라비돕시스 탈리아나로부터의 분리된 DHS이다. 아미노산 서열은 도 46에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 46에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 토마토로부터의 분리된 DHS이다. 아미노산 서열은 도 45A 및 B에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 45A 및 B에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 카네이션으로부터의 분리된 DHS이다. 아미노산 서열은 도 54에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 54에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 카놀라로부터의 분리된 DHS이다. 아미노산 서열은 도 97에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 97에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 상추로부터의 분리된 DHS이다. 도 105는 상추 DHS 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부를 제공한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 자주개자리로부터의 분리된 DHS이다. 아미노산 서열은 도 107A 및 B에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 107A 및 B에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 바나나로부터의 분리된 DHS이다. 아미노산 서열은 도 108A 및 B에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 108A 및 B에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 미루나무로부터의 분리된 DHS이다. 아미노산 서열은 도 109A 및 B에 제공되어 있고 서열번호: 이다. 아미노산을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 도 109A 및 B에 제공되어 있고 서열번호: 이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 미코스파에렐라로부터의 분리된 DHS이다. 도 110은 상추 DHS 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부를 제공한다.
또한 본 발명은 DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 발현을 억제할 수 있는 길이면 된다. 일부 실시태양에서 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 3'UTR로 지시되거나 5'-비-코딩 서열로 지시된 전체 길이 코딩 서열을 포함한다. 5'-비-코딩 서열에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전사 인자를 인코드하는 유전자 발현의 효과적인 억제제로 알려져 있다(Branch, M.A., Molec. Cell Biol., 13:4282-4290(1993)).
여기서 사용된 "DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 열거된 서열번호의 상보체의 100% 상보성을 공유하는 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함할 뿐만 아니라 기능적 변이체인 안티센스 폴리뉴클레오타이드도 포함한다. 기능적 변이체는 상기 기술된 것이다. 변이체는 발현 벡터 내로 도입되고 이러한 벡터가 적어도 하나 이상의 식물 세포의 게놈 내로 통합되는 경우 내생적 DHS의 발현을 조절할 수 있는 본 발명에 의해 의도된 바와 같이 기능한다.
본 발명의 하나의 실시태양은 DHS 폴리뉴클레오타이드(상기 기술된 본 발명의) 또는 DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드(상기 기술된 본 발명의)를 포함한 발현 벡터를 제공한다. 벡터는 상기 기술된 바와 같다.
또한 본 발명은 센스 또는 안티센스 방향으로 DHS의 폴리펩타이드를 포함한 벡터 또는 벡터 결합으로 형질전환된 형질전환 식물 세포, 형질전환 묘목 또는 이러한 세포로부터 생성된 숙성 형질전환 식물 또는 꽃, 열매, 잎, 종자와 같은 형질전환 식물의 식물 일부를 제공한다.
또한 본 발명은 내생적 DHS의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 식물의 적어도 하나 이상의 세포의 게놈 내로 DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한 본 발명의 발현 벡터를 통합시키는 것을 포함한다. DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 내생적 DHS의 발현을 억제한다.
내생적 DHS의 발현을 억제하는 또다른 방법에 있어서, 센스 방향의 본 발명의 DHS 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 식물의 적어도 하나 이상의 세포 게놈 내로 통합된다. DHS의 폴리뉴클레오타이드는 전사되고 수득된 내생적 DHS의 동시 발현은 내생적 DHS의 발현의 하향-조절 또는 억제를 유발한다.
내생적 DHS의 발현을 억제함으로서 수득된 형질전환 식물은 eIF-5A를 활성화시키는 DHS를 전혀 지니지 않거나 실질적으로 거의 지니지 않는다. 앞서 논의된 바와 같이 eIF-5A는 활성화되어 생물학적으로 유용하게 되어야 한다. 따라서 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 의해 또는 센스 폴리펩타이드로의 동시-억제에 의해 DHS 발현을 억제하거나 감소시킴으로서 수득된 형질전환 식물은 활성 eIF-5A를 지니지 않거나 활성 eIF-5A를 감소시킬 것이다. 이들 형질전환 식물은 식물의 생물량의 증가, 증가된 종자 수확량 및/또는 증가된 종자 크기를 나타낼 것이다. DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 지닌 형질전환 식물은 광합성의 증가를 나타내고 또한 증가된 전분 함량을 지닌다. 실시예 24 및 25 참조.
DHS 및 eIF-5A가 노화에 조절적인 역할을 한다는 논쟁을 지지하는 추가적인 증거는 DHS에 특이적인 억제제로 카네이션 꽃을 처리함으로서 제공되었다. 스퍼미딘 및 eIF-5A는 DHS 반응의 기질이다(Park et al., 1993; Park et al., 1997). 스퍼미딘과 유사한 구조적 특징을 지닌 일부 모노, 디- 및 폴리아민이 시험관 내에서 DHS 활성을 억제한다(Jakus et al., 1993). 스퍼미딘, 푸트레신(putrescine) 및 스퍼민과 같은 일부 폴리아민이 카네이션 꽃병 수명을 연장시키는데 일반적으로 사용되었다(Wang and Baker, 1980). 다른 농도의 다른 폴리아민으로의 처리를 통해 Wang et al(발표되지 않음)은 2배까지 카네이션 꽃의 꽃병 수명을 연장시킬 수 있었다. DHS를 하향-조절하기 위해 일시적인 감염 시스템을 이용한 연구는 진행중이다. 예비 데이터는 생존율 백분율이 비처리된 꽃보다 안티센스 DHS를 발현하는 일시적 감염 시스템으로 진공 침윤된 카네이션 절단 내에서 8일에 거의 4배 이상 높음을 나타낸다(Wang et al, 발표되지 않음).
스트레스에 의한 생장 손실 이외의 농업 내의 또다른 주요 손실은 수확-후 스트레스-유도된 노화이다(McCabe et al., 2001). 이는 절단된 상추와 같이 부분적으로 처리된 식물에 특히 맞다. 절단 상추의 증후는 페놀 생성의 결과인 갈변이다(Matile et al, 1999). 상추 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 또는 안티센스 전체 길이 DHS로의 상추의 시도는 형질전환 상추가 대조군 상추보다 절단 후 갈변에 유의적으로 더 저항적임을 증명하였다. 이는 수확에 의한 스트레스 유도된 노화가 별도의 회로이나(Page et al., 2001) 갈변 및 다른 노화의 번역적 조절 업스트림은 DHS 및 eIF-5A에 의해 적어도 부분적으로 조절됨을 나타낸다. 노화 조절의 다운스트림은 실행 유전자이다. 이들은 노화의 이펙터이고 노화 증후군을 야기하는 대사적 변화를 유발한다. 이는 eIF-5A 및 DHS가 하향-조절될 때 노화의 의해 유발된 전체 범위의 증후군을 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
또한 본 발명은 eIF-5A의 이소폼(노화-유도된 eIF-5A);(손상-유도된 eIF-5A) 및 (생장 eIF-5A)을 인식하는 항체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 다른 식물 및 진균 내에서 노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A, 생장 eIF-5A 또는 DHS를 확인하는 방법을 제공한다. 여기에 기술된 방법 및 제공된 서열을 이용함으로서 프로브는 원하는 이소폼 또는 DHS를 분리/확인하도록 고안된다. eIF-5A의 이소폼(노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A, 생장 eIF-5A)이 코딩 구역 내에서 종종 매우 상동적이기 때문에(도 2 참조) 원하는 이소폼의 확인을 확신하고 증폭을 변화시키기 위해 바람직하게는 프로브 또는 프라이머는 5'UTR의 시작점 및 3'UTR의 말단으로부터 고안된다(도 3, 4 및 5 참조). 손상-유도된 eIF-5A의 증폭을 위한 바람직한 프라이머 또는 손상-유도된 eIF-5A의 확인을 위한 바람직한 프라이머의 세트는 하기와 같다. 다운스트림 프라이머는 5'
Figure 112005074399539-PCT00002
3'(서열번호: )이다. 프라이머의 업스트림은 5'
Figure 112005074399539-PCT00003
3'(서열번호: )이다.
식물 또는 식물 부분으로부터 손상-유도된 eIF-5A를 분리하기 전에 식물이 손상-유도된 eIF-5A를 발현하기 시작하도록 손상 이벤트를 도입하는 것이 최선이다. 어떠한 손상 이벤트도 수용 가능하고 예시적인 손상 이벤트는 중앙 엽맥에서 잎을 압착시키는 것을 포함한다. 유사하게는 노화-유도된 eIF-5A를 분리하기 전에 식물 조직이 노화를 유도하도록 하는 것이 최선이다.
일반적으로 여기에 기술된 바와 같이 동일한 것이 실례에 의해 제공된 하기 실시예에 대한 참조를 통해 쉽게 이해될 것이고, 이는 본 발명에 한정적이지 않다.
도 1은 eIF-5A 분리된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 노화-유도된 eIF-5A(라인 1)(미국특허 제6,538,182호 및 미국출원 제09/725,019호); 손상-유도된 eIF-5A(라인 1); 및 생장 eIF-5A(라인 3)의 3가지 이소폼의 정렬을 나타낸 것이다.
도 2는 3가지 아라비돕시스 탈리아나 이소폼의 코딩 구역의 정렬을 나타낸 것이다. 라인 1은 노화-유도된 eIF-5A이다. 라인 2는 손상-유도된 eIF-5A이다. 라인 3은 생장 eIF-5A이다.
도 3은 아라비돕시스 탈리아나의 노화-유도된 eIF-5A의 게놈 서열을 제공한다.
도 4는 아라비돕시스 탈리아나의 손상-유도된 eIF-5A의 게놈 서열을 제공한다.
도 5는 아라비돕시스 탈리아나의 생장 eIF-5A의 게놈 서열을 제공한다.
도 6은 이원 벡터 pKYLX71-35S2의 지도이다.
도 7은 이원 벡터 pGEM-T EASY Vector의 지도이다.
도 8은 콜롬비아 생태형의 아라비돕시스 탈리아나 야생형의 다른 조직 내의 eIF-5A의 3가지 이소폼의 웨스턴 블럿을 나타낸 것이다.
도 9는 콜롬비아 생태형의 아라비돕시스 탈리아나 야생형의 감염된 잎의 72시간 후 노화-유도된 eIF-5A 및 손상-유도된 eIF-5A에 대한 웨스턴 블럿이다.
도 10은 콜롬비아 생태형의 아라비돕시스 탈리아나 야생형의 손상된 잎의 72시간 후 eIF-5A의 3가지 이소폼의 노던 블럿이다.
도 11은 각각 라인 1, 2 및 3 내의 노화-유도된 AteIF-5A, 손상-유도된 AteIF-5A 및 생장 AteIF-5A의 게놈 DNA로부터의 PCR 생성물을 나타낸 것이다.
도 12는 pGEM 내의 노화-유도된 AteIF-5A, 손상-유도된 AteIF-5A 및 생장 AteIF-5A로의 아가로스 겔을 나타낸 것이다.
도 13은 pKYLX71 내의 손상-유도된 AteIF-5A, 생장 AteIF-5A, 게놈 서열로의 아가로스 겔을 나타낸 것이다.
도 14는 센스 손상-유도된 AteIF-5A를 지닌 컨스트럭트로 형질전환된 식물에 대한 T1 식물의 사진이다.
도 15는 4주령의 센스 손상-유도된 AteIF-5A로 형질전환된 T1 식물의 사진이다.
도 16은 5.5주령의 센스 손상-유도된 AteIF-5A로 형질전환된 T1 식물의 사진이다.
도 17은 씨뿌리기 10일 후의 센스 손상-유도된 AteIF-5A로 형질전환된 T2 식물의 사진이다.
도 18은 씨뿌리기 10일 후의 센스 생장 AteIF-5A로 형질전환된 T1 식물의 사진이다.
도 19는 4주령의 센스 생장 AteIF-5A로 형질전환된 T1 식물의 사진이다.
도 20은 센스 생장 AteIF-5A 라인으로 형질전환된 T2 식물의 웨스턴 블럿이다.
도 21은 4주령(상단), 5주령(좌측 하단) 및 6주령(우측 하단)의 센스 생장 AteIF-5A(라인 1A-1D)로 형질전환된 T2 식물이다.
도 22는 4주령(상단), 5주령(좌측 하단) 및 6주령(우측 하단)의 센스 생장 AteIF-5A(라인 2A-1D)로 형질전환된 T2 식물이다.
도 23은 4주령(상단), 5주령(좌측 하단) 및 6주령(우측 하단)의 센스 생장 AteIF-5A(라인 4A-D)로 형질전환된 T2 식물이다.
도 24는 4주령(상단), 5주령(좌측 하단) 및 6주령(우측 하단)의 센스 생장 AteIF-5A(라인 15A-D)로 형질전환된 T2 식물이다.
도 25는 4주령(상단), 5주령(좌측 하단) 및 6주령(우측 하단)의 센스 생장 AteIF-5A(라인 8A-D)로 형질전환된 T2 식물이다.
도 26은 4주령(상단), 5주령(좌측 하단) 및 6주령(우측 하단)의 센스 생장 AteIF-5A(라인 9E-H)로 형질전환된 T2 식물이다.
도 27은 4주령(상단), 5주령(좌측 하단) 및 6주령(우측 하단)의 센스 생장 AteIF-5A(라인 11A-D)로 형질전환된 T2 식물이다.
도 28은 4주령(상단), 5주령(좌측 하단) 및 6주령(우측 하단)의 센스 생장 AteIF-5A(라인 16A-D)로 형질전환된 T2 식물이다.
도 29는 다양한 식물 라인(야생형 대조군 및 센스 생장 AteIF-5A로 형질전환된 식물 라인을 포함한)으로부터의 아라비돕시스 탈리아나 종자의 사진이다.
도 30은 센스 생장 AteIF-5A로 형질전환된 각 식물 서브라인의 평균 종자 크기의 막대 그래프이다.
도 31은 센스 생장 AteIF-5A로 형질전환된 각 식물 서브라인에 대한 개체 종자 중량의 막대 그래프이다.
도 32는 개체 종자 중량과 개체 종자 부피 사이의 비례적 관계를 나타낸 그래프이다.
도 33은 센스 생장 AteIF-5A로 형질전환된 각 식물 서브라인에 대한 식물 당 종자 산출량을 나타낸 막대 그래프이다.
도 34는 센스 생장 AteIF-5A 식물에 나타난 표현형의 요약이다.
도 35는 형질전환 아라비돕시스 식물(안티센스 전체 길이 노화-유도된 eIF-5A로 형질전환된)과 야생형 식물의 비교를 나타낸 것이다. 형질전환 식물은 지연된 노화를 나타낸다.
도 36∼38은 식물(안티센스 생장 eIF-5A로 형질전환된)의 사진을 나타낸다.
도 39는 안티센스 아라비돕시스 탈리아나 3'DHS를 생성하기 위한 벡터를 구축하는데 사용된 프라이머를 나타낸 것이다.
도 40은 벡터 컨스트럭트를 나타낸 것이다.
도 41은 아라비돕시스로부터 분리된 손상 인자 eIF-5A에 대한 서열 및 안티센스 컨스트럭트의 위치를 나타낸 것이다.
도 42는 벡터 컨스트럭트를 나타낸 것이다.
도 43은 슈도모나스(pseudomanas)로 접종된 잎 디스크의 식물 카운트를 나타낸 것이다.
도 44는 야생형에 대한 안티센스 형질전환 식물 내 CFU의 그래프를 나타낸 것이다.
도 45는 토마토 잎 DHS cDNA 서열의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 1) 및 토마토 잎 cDNA 라이브러리로부터 수득된 유도된 아미노산 서열(서열번호: 2)을 나타낸 것이다.
도 46은 밑줄친 게놈 서열을 지닌 토마토 DHS 서열을 아라비돕시스 유전자 은행(서열번호: 5) 내의 확인되지 않은 게놈 서열에 정렬시킴으로서 수득된 아라비돕시스 DHS 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다. 아미노산 서열 사이의 갭은 추정되는 인트론이다. 도 46B는 유도된 아라비돕시스 DHS 아미노산 서열(서열번호: 6)을 나타낸 것이다. 도 46C는 PCR에 의해 수득된 600 염기쌍의 아라비돕시스 DHS cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다. 도 46D는 아라비돕시스 DHS cDNA 단편의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 47은 유도된 전체 길이 토마토 잎 DHS 아미노산 서열(서열번호: 2) 및 인간, 효모, 진균 및 알케오박테리아(Archaeobacteria)의 DHS 단백질의 서열을 지닌 유도된 아라비돕시스 노화-유도된 DHS 아미노산 서열의 정렬이다. 3 또는 4의 서열 사이의 동일한 아미노산이 박스쳐져 있다.
도 48은 토마토 DHS cDNA의 제한 지도이다.
도 49는 토마토 잎으로부터 분리되고, 32P-dCTP-표지된 전체 길이 토마토 DHS cDNA로 프로브된 게놈 DNA의 서던 블럿이다.
도 50은 발달의 다른 단계에서의 토마토 꽃으로부터 분리된 RNA의 노던 블럿이다. 상부 패널은 총 RNA의 에티듐 브로마이드 염색된 겔이다. 각각의 레인은 10㎍의 RNA를 함유한다. 하부 패널은 32P-dCTP-표지된 전체 길이 토마토 DHS cDNA로 프로브된 노던 블럿의 방사능 사진이다.
도 51은 32P-dCTP-표지된 전체 길이 토마토 DHS cDNA로 프로브된 다양한 숙성 단계에서의 토마토 열매로부터 분리된 RNA의 노던 블럿이다. 각각의 레인은 10㎍의 RNA를 함유하였다.
도 52는 6시간 동안 2M 솔비톨로 처리함으로서 가뭄-스트레스 받은 토마토 잎으로부터 분리된 RNA의 노던 블럿이다. 각각의 레인은 10㎍의 RNA를 함유한다. 블럿은 32P-dCTP-표지된 전체 길이 토마토 DHS cDNA로 프로브되었다.
도 53은 냉기 온도에 노출된 토마토 잎으로부터 분리된 RNA의 노던 블럿이다. 도 53A는 총 RNA의 에티듐 브로마이드 염색된 겔이다. 각각의 레인은 10㎍의 RNA를 함유한다. 도 53B는 32P-dCTP-표지된 전체 길이 토마토 DHS cDNA로 프로브된 노던 블럿의 방사능 사진이다. 도 53C는 잎 확산체의 전도율로서 측정된 상응하는 누출 데이터를 나타낸다.
도 54는 폴리A 꼬리 및 5' 말단 비-코딩 구역을 포함하지 않은 카네이션 DHS 전체길이(1384 염기쌍) cDNA 클론 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 9)이다. 유도된 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열 아래에 나타나 있다(373 아미노산)(서열번호: 10).
도 55는 32P-dCTP-표지된 전체 길이 아라비돕시스 DHS cDNA로 프로브된 노화 아라비돕시스 잎으로부터의 총 RNA의 노던 블럿이다. 방사능 사진이 위이고, 에티듐 염색된 겔이 아래이다.
도 56은 다양한 단계의 카네이션 꽃의 화판으로부터 분리된 총 RNA의 노던 블럿이다. 블럿은 32P-dCTP-표지된 전체-길이 카네이션 DHS cDNA로 프로브되었다. 방사능 사진이 위이고, 에티듐 염색된 겔이 아래이다.
도 57은 토마토 열매 노화-유도된 elF-5A 유전자의 뉴클레오타이드(상)(서열번호: 11) 및 유도된 아미노산 서열(하)(서열번호: 12)이다.
도 58은 카네이션 노화-유도된 elF-5A 유전자의 뉴클레오타이드(상)(서열번호: 13) 및 유도된 아미노산 서열(하)(서열번호: 14)이다.
도 59는 아라비돕시스 노화-유도된 elF-5A 유전자의 뉴클레오타이드(상)(서열번호: 15) 및 유도된 아미노산 서열(하)(서열번호: 16)이다.
도 60은 다양한 발단 단계에서의 아라비돕시스 식물의 잎으로부터 분리된 총 RNA의 노던 블럿이다. 블럿은 32P-dCTP-표지된 전체-길이 아라비돕시스 DHS cDNA 및 전체-길이 노화-유도된 elF-5A로 프로브되었다. 방사능 사진이 위이고, 에티듐 염색된 겔이 아래이다.
도 61은 브레이커(breaker)(BK), 레드-펌(red-firm, RF) 및 레드-소프트(RS) 발달 단계에서의 토마토 열매로부터 분리된 총 RNA의 노던 블럿이다. 블럿은 32P- dCTP-표지된 전체-길이 DHS cDNA 및 전체-길이 노화-유도된 elF-5A로 프로브되었다. DHS 및 elF-5A는 열매 숙성과 일치하게 레드-소프트 열매에 병행하여 상향-조절된다. 방사능 사진이 위이고, 에티듐 염색된 겔이 아래이다.
도 62는 가뭄 스트레스를 유도하기 위해 솔비톨로 처리된 토마토 잎으로부터 분리된 총 RNA의 노던 블럿이다. C는 대조군이고; S는 솔비톨 처리된 것이다. 블럿은 32P-dCTP-표지된 전체-길이 DHS cDNA 및 전체-길이 노화-유도된 elF-5A로 프로브되었다. elF-5A와 DHS 모두 가뭄 스트레스에 대해 상향-조절된다. 방사능 사진이 위이고, 에티듐 염색된 겔이 아래이다.
도 63은 토마토 식물의 꽃봉오리 및 개화된 노화 꽃으로부터 분리된 총 RNA의 노던 블럿이다. 블럿은 32P-dCTP-표지된 전체-길이 DHS cDNA 및 전체-길이 노화-유도된 elF-5A로 프로브되었다. elF-5A와 DHS 모두 개화/노화 꽃에서 상향-조절되었다. 방사능 사진이 위이고, 에티듐 염색된 겔이 아래이다.
도 64는 냉기(chill)-손상된 토마토 잎으로부터 분리된 총 RNA의 노던 블럿이다. 블럿은 32P-dCTP-표지된 전체-길이 DHS cDNA 및 전체-길이 노화-유도된 elF-5A로 프로브되었다. elF-5A와 DHS 모두 다시 따뜻해지는 동안 냉기 손상의 발달로 상향-조절되었다. 방사능 사진이 위이고, 에티듐 염색된 겔이 아랫니다.
도 65는 3.1주령 아라비돕시스 야생형(좌측) 및 형질전환 식물에서 증가된 잎 크기를 나타내는 안티센스 방향으로 DHS 유전자의 3'-말단(서열은 도 80에 나타남)을 발현하는 형질전환 식물의 사진이다.
도 66은 4.6주령 아라비돕시스 야생형(좌측) 및 형질전환 식물에서 증가된 잎 크기를 나타내는 안티센스 방향으로 DHS 유전자의 3'-말단(서열은 도 80에 나타남)을 발현하는 형질전환 식물의 사진이다.
도 67은 5.6주령 아라비돕시스 야생형(좌측) 및 형질전환 식물에서 증가된 잎 크기를 나타내는 안티센스 방향으로 DHS 유전자의 3'-말단(서열은 도 80에 나타남)을 발현하는 형질전환 식물의 사진이다.
도 68은 6.1주령 아라비돕시스 야생형(좌측) 및 형질전환 식물에서 증가된 잎 크기를 나타내는 안티센스 방향으로 DHS 유전자의 3'-말단(서열은 도 80에 나타남)을 발현하는 형질전환 식물의 사진이다.
도 69는 안티센스 방향으로 노화-유도된 DHS 유전자를 발현하는 3개의 T1 형질전환 아라비돕시스 식물 라인으로부터 수확된 종자의 증가를 나타내는 그래프이 다. 종자 수확량은 종자의 부피로 표현된다. n = 30에 대한 SE는 야생형 식물에 대하 나타난다.
도 70은 형질전환 식물에서 증가된 잎 크기와 증가된 식물체 크기를 나타내는 안티센스 방향으로 DHS 유전자의 3'-말단(서열은 도 80에 나타남)을 발현하는 형질전환 토마토 식물(좌측) 및 야생형 식물(우측)의 사진이다. 사진은 묘목을 토양으로 옮긴지 18일 후에 찍혔다.
도 71은 형질전환 식물에서 증가된 잎 크기와 증가된 식물체 크기를 나타내는 안티센스 방향으로 DHS 유전자의 3'-말단(서열은 도 80에 나타남)을 발현하는 형질전환 토마토 식물(좌측) 및 야생형 식물(우측)의 사진이다. 사진은 묘목을 토양으로 옮긴지 32일 후에 찍혔다.
도 72∼79는 야생형(상위 패널) 및 안티센스 방향으로 전체-길이 DHS 유전자를 발현하는 형질전환 식물(하위 패널)로부터의 토마토 열매의 사진이다. 열매는 발달의 브레이커 단계에서 수확되어 그로쓰 챔버(growth chamber)에서 숙성되었다. 수확후 날짜가 각 패널의 상부 좌측 모서리에 나타나 있다.
도 80은 식물을 형질전환시키기 위해 안티센스 방향으로 사용된 아라비돕시스 노화-유도된 DHS 유전자의 3'-말단의 뉴클레오타이드(상)(서열번호: 30) 및 유 도된 아미노산(하) 서열이다.
도 81은 식물을 형질전환시키기 위해 안티센스 방향으로 사용된 토마토 DHS 유전자의 3'-말단의 뉴클레오타이드(상)(서열번호: 31) 및 유도된 아미노산(하) 서열이다.
도 82는 전체-길이 아라비돕시스 유전자를 분리하기 위해 사용된 600 염기쌍의 아라비돕시스 DHS 프로브의 뉴클레오타이드(상)(서열번호: 26) 및 유도된 아미노산(하) 서열이다.
도 83은 전체-길이 카네이션 유전자를 분리하기 위해 사용된 483 염기쌍의 카네이션 DHS 프로브의 뉴클레오타이드(상)(서열번호: 27) 및 유도된 아미노산(하) 서열이다.
도 84(A) 및 (B)는 안티센스 방향으로 DHS 유전자의 3'-말단을 발현하는 형질전환 토마토 식물로부터의 토마토 열매(좌측) 및 야생형 식물로부터의 토마토 열매(우측)의 사진이다. 야생형 열매는 블러섬 말단 부패를 나타내는 반면 형질전환 열매는 그렇지 않다.
도 85는 일부 식물종으로부터의 다야한 eIF-5A 이소폼의 정렬을 나타낸 것이 다. 이는 또한 하이푸신 보존 구역의 정렬을 제공한다.
도 86은 토마토 노화-유도된 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 제공한다.
도 87은 아라비돕시스 노화-유도된 eIF-5A 및 pKYLX71-센스 노화-유도된 eIF-5A의 구축을 제공한다.
도 88은 토마토 노화-유도된 eIF-5A 및 pKYLX71-센스 노화-유도된 eIF-5A의 구축을 제공한다.
도 89는 아라비돕시스 탈리아나 대조군과 센스 폴리 뉴클레오타이드 노화-유도 eIF-5A를 포함한 형질전환 식물의 비교 사진을 제공한다.
도 90 및 91은 센스 폴리뉴클레오타이드 노화-유도 eIF-5A(도 90 - 아라비돕시스 및 도 91 - 토마토)를 포함한 형질전환 식물이 형질전환 식물 내 증가된 물관부에 의해 나타난 증가된 물관생성을 지님을 나타낸 것이다.
도 92는 아라비돕시스 탈리아나 대조군과 센스 폴리뉴클레오타이드 노화-유도 eIF-5A를 포함한 아라비돕시스 탈리아나 형질전환 식물의 비교 사진을 제공한 다. 토마토 센스 폴리뉴클레오타이드 노화-유도 eIF-5A가 아라비돕시스 탈리아나에 사용되었다. 형질전환 식물은 대조군 식물보다 두꺼운 화서 줄기를 지닌다.
도 93 및 94는 센스 폴리뉴클레오타이드 노화-유도 eIF-5A를 포함한 형질전환 식물 내 증가된 물관생성을 나타내는 막대 그래프이다. 도 94는 토마토 센스 폴리뉴클레오타이드 노화-유도된 eIF-5A에 관한 것이다.
도 95는 카놀라 생장 eIF-5A 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
도 96은 카놀라 생장 eIF-5A 및 pKYLX71-센스 생장 eIF-5A의 구축을 제공한다.
도 97은 카놀라 DHS 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
도 98은 카놀라 DHS 및 pKYLX71-센스 DHS의 구축을 제공한다.
도 99는 막대 그래프 형태 내에서 DHS 발현의 억제가 카놀라 내 종자 수확량을 증가시킴을 나타낸다.
도 100은 막대 그래프 형태 내에서 좌측으로부터 아라비돕시스, 카놀라, 토마토의 생장 eIF-5A 이소폼의 상향 조절 및 토마토 DHS의 상향 조절을 나탄내다.
도 101은 토마토 생장 eIF-5A 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
도 102는 생장 eIF-5A 및 pKYLX71-센스 토마토 생장 eIF-5A의 구축을 제공한다.
도 103은 손상-유도된 eIF-5A 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
도 104A 및 B는 토마토 손상-유도된 eIF-5A 및 pKYLX71-센스 토마토 손상-유도된 eIF-5A의 구축을 제공한다.
도 105는 상추 DHS 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부를 제공한다.
도 106은 pTA7001-3'UTR 안티센스 상추 DHS의 컨스트럭트를 제공한다.
도 107A 및 B는 자주개자리 DHS 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 제 공한다.
도 108A 및 B는 바나나 DHS 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
도 109A 및 B는 미루나무 DHS 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
도 110은 미코스파에렐라 피지엔시스(Mycosphaerella fijiensis) DHS 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
(실시예 1)
메신저 RNA(mRNA) 분리
총 RNA는 다양한 발단 단계의 토마토 꽃 및 토마토 열매 및 잎으로부터 분리되었다(비처리, 냉기화후 또는 솔비톨 처리). 간단히 조직(5g)이 액체 질소 내에서 갈아졌다. 갈린 분말은 30ml의 구아니디늄 완충액(4M 구아니디늄 이소티오시아테이트(guanidinium isothiocyanate), 2.5mM NaOAc pH 8.5, 8.0%의 β-멀캅토에탄 올(mercaptoethanol)으로 혼합되었다. 혼합물은 4겹의 치즈클로스(cheesecloth)로 여과되었고 4℃에서 30분간 10,000 ×g로 원심분리되었다. 이후 상청액은 20시간 동안 26,000 ×g에서 염화세슘 밀도 기울기 원심분리되었다. 펠렛화된 RNA는 75% 에탄올로 세척되었고, 600㎕의 DEPC-처리된 물에 재현탁되었고, RNA는 -70℃에서 0.75ml의 95% 에탄올과 30㎕의 3M NaOAc로 침전되었다. 10㎍의 RNA는 1.2%의 변성 포름알데하이드 아가로스 겔 상에서 분획화되었고, 나일론 멤브레인으로 옮겨졌다. 무작위로 프라임된 32P-dCTP-표지된 전체 길이 DHS cDNA(서열번호: 1)가 42℃에서 오버나이트로 멤브레인을 프로브하는데 사용되었다. 멤브레인은 상온에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 1x SSC 내에서 1회 세척되었고, 65℃에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 0.2x SSC 내에서 3회 세척되었다. 멤브레인은 오버나이트로 -70℃에서 X-선 필름에 노출되었다.
폴리A+ mRNA는 Promega사의 폴리A+ 트랙(tract) mRNA 분리 시스템을 이용하여 총 RNA로부터 분리되었다. 폴리A+ mRN는 Stratagene(La Jolla, Calif)사의 ZAP Express cDNA 합성 시스템을 이용하여 cDNA 합성을 위한 주형으로서 이용되었다.
토마토 잎 cDNA 라이브러리 스크리닝
2M의 솔비톨에 6시간 동안 노출된 Match F1 하이브리드 토마토 잎으로부터 분리된 mRNA를 이용하여 제조된 cDNA 라이브러리가 약 5 ×106 PFU/ml로 희석되었다. cDNA 라이브러리는 32P-표지된 600 bp RT-PCR 단편을 이용하여 선별되었다. 3개의 양성 cDNA 클론이 절제되었고, 제조사의 지침 내에 있는 방법을 이용하여 pBK-CMV(Stratagene) 파지미드(phagemid) 내로 재순환되었다. 전체 길이 cDNA가 pBK-CMV 벡터 내로 삽입되었다.
플라스미드 DNA 분리, DNA 서열화
Sambrook et al.,(Supra)에 의해 기술된 알칼리성 분해 방법이 플라스미드 DNA를 분리하는데 이용되었다. 전체 길이 양성 cDNA 클론은 디디옥시(dideoxy) 서열화 방법을 이용하여 서열화되었다(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467). 오픈 리딩 프레임이 편집되었고, BLAST 검색(GenBank, Bethesda, MD)을 이용하여 분석되었고, 인코드된 유전자의 유도된 아미노산 서열과의 5개의 가장 상동적인 단백질의 정렬은 BCM Search Launcher를 이용하여 이루어졌다: Multiple Sequence Alignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method(F. Corpet, Nuc. Acids Res., 16:10881-10890 (1987) 참조). 유도된 아미노산 서열 내에 존재하는 기능적인 모티프는 MultiFinder에 의해 확인되었다
토마토 RNA의 노던 블럿 하이브리디제이션
다양한 단계의 토마토 꽃(봉오리 및 꽃 및 넓게 개화된 노화 화판 또는 건조), 토마토 잎 및 다양한 숙성 단계의 토마토 열매(브레이커 즉, 10% 이하의 붉은 색을 지닌 푸른색 열매, 핑크색 즉, 전체 열매가 오렌지색이거나 핑크색인 및 부드럽거나 단단한 붉은색)로부터 분리된 총 RNA의 10㎍이 1%의 변성된 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리되었고, 나일론 멤브레인 상에 고정되었다. 무작위 프라이머 키트(Boehringer Mannuheim)를 이용하여 32P-dCTP로 표지된 전체 길이 토마토 cDNA가 필터를 프로브하는데 이용되었다(7 ×107 cpm). 필터는 상온에서 1x SSC, 0.1% SDS로 1회 세척되었고, 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS로 3회 세척되었다. 필터는 건조되었고, -70℃에서 오버나이트로 X-선 필름에 노출되었다. 결과는 도 50∼52에 나타나 있다.
아라비돕시스 RNA의 노던 블럿 하이브리디제이션
5주령(레인 1), 6주령(레인 2) 및 7주령(레인 3)의 아라비돕시스 식물의 잎으로부터 분리된 총 RNA가 상기와 같이 분리되었고, 1%의 변성된 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리되었고, 나일론 멤브레인 상에 고정되었다. 무작위 프라이머 키트(Boehringer Mannuheim)을 이용하여 32P-dCTP로 표지된 전체-길이 아라비돕 시스 노화-유도된 DHS cDNA가 필터를 프로브하는데 이용되었다(7 ×107 cpm). 필터는 상온에서 1x SSC, 0.1% SDS로 1회 세척되었고, 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS로 3회 세척되었다. 필터는 건조되었고, -70℃에서 오버나이트로 X-선 필름에 노출되었다. 결과는 도 55에 나타나 있다.
카네이션 RNA의 노던 블럿 하이브리디제이션
다양한 발달 단계 즉, 단단한-봉오리 꽃(레인 1), 개화를 시작한 꽃(레인 2), 충분히 개화한 꽃(레인 3), 인롤링 화판을 지닌 꽃(레인 4)의 카네이션 식물의 화판으로부터 분리된 총 RNA가 상기와 같이 분리되었고, 1%의 변성된 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리되었고, 나일론 멤브레인 상에 고정되었다. 무작위 프라이머 키트(Boehringer Mannuheim)을 이용하여 32P-dCTP로 표지된 전체 길이 카네이션 노화-유도된 DHS cDNA가 필터를 프로브하는데 이용되었다(7 ×107 cpm). 필터는 상온에서 1x SSC, 0.1% SDS로 1회 세척되었고, 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS로 3회 세척되었다. 필터는 건조되었고, -70℃에서 오버나이트로 X-레이 필름에 노출되었다. 결과는 도 56에 나타나 있다.
(실시예 2)
토마토 노화-유도된 DHS 유전자의 솔비톨 유도
토마토 잎은 6시간 동안 밀폐된 챔버 안에서 2M 솔비톨로 처리되었다. RNA는 하기와 같이 솔비톨 처리된 잎으로부터 추출되었다.
잎(5g)은 액체 질소 내에서 갈아졌다. 갈린 분말은 30ml의 구아니디늄 완충액(4M 구아니디늄 이소티오시아테이트, 2.5mM NaOAc pH 8.5, 8.0%의 β-멀캅토에탄올로 혼합되었다. 혼합물은 4겹의 치즈클로스로 여과되었고 4℃에서 30분간 10,000 ×g로 원심분리되었다. 이후 상청액은 20시간 동안 26,000 ×g에서 염화세슘 밀도 기울기 원심분리되었다. 펠렛화된 RNA는 75% 에탄올로 세척되었고, 600㎕의 DEPC-처리된 물에 재현탁되었고, RNA는 -70℃에서 0.75ml의 95% 에탄올과 30㎕의 3M NaOAc로 침전되었다. 10㎍의 RNA는 1.2%의 변성 포름알데하이드 아가로스 겔 상에서 분획화되었고, 나일로 멤브레인으로 옮겨졌다. 무작위로 프라임된 32P-dCTP-표지된 전체 길이 DHS cDNA(서열번호: 1)가 42℃에서 오버나이트로 멤브레인을 프로브하는데 사용되었다. 멤브레인은 상온에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 1x SSC 내에서 1회 세척되었고, 65℃에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 0.2x SSC 내에서 3회 세척되었다. 멤브레인은 오버나이트로 -70℃에서 X-선 필름에 노출되었다.
결과는 도 52에 나타나 있다. 나타난 바와 같이 DHS의 전사는 솔비톨에 의 해 잎에서 유도된다.
(실시예 3)
노화 꽃에서의 토마토 DHS 유전자의 유도
토마토 식물의 단단한 꽃봉오리 및 개화, 노화 꽃이 수확되었고, RNA가 실시예 2에서와 같이 분리되었다. 10㎍의 RNA가 1.2%의 변성 포름알데하이드 아가로스 겔 상에서 분획화되었고, 나일로 멤브레인으로 옮겨졌다. 무작위로 프라임된 32P-dCTP-표지된 전체 길이 DHS cDNA(서열번호: 1)가 42℃에서 오버나이트로 멤브레인을 프로브하는데 사용되었다. 멤브레인은 상온에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 1x SSC 내에서 1회 세척되었고, 65℃에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 0.2x SSC 내에서 3회 세척되었다. 멤브레인은 오버나이트로 -70℃에서 X-선 필름에 노출되었다.
결과는 도 50에 나타나 있다. 나타난 바와 같이 DHS의 전사는 노화 꽃에서 유도된다.
(실시예 4)
숙성 열매에서의 토마토 DHS 유전자의 유도
브레이커, 핑크 및 숙성 여래로부터의 RNA가 실시예 2에서와 같이 분리되었다. 10㎍의 RNA가 1.2%의 변성 포름알데하이드 아가로스 겔 상에서 분획화되었고, 나일로 멤브레인으로 옮겨졌다. 무작위로 프라임된 32P-dCTP-표지된 전체 길이 DHS cDNA(서열번호: 1)(도 45)가 42℃에서 오버나이트로 멤브레인을 프로브하는데 사용되었다. 멤브레인은 상온에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 1x SSC 내에서 1회 세척되었고, 65℃에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 0.2x SSC 내에서 3회 세척되었다. 멤브레인은 오버나이트로 -70℃에서 X-선 필름에 노출되었다.
결과는 도 51에 나타나 있다. 나타난 바와 같이 DHS의 전사는 부패를 이끄는 노화의 착수 바로 전 숙성, 붉은 열매에서 가장 강하다.
(실시예 5)
냉기에 의한 토마토 노화-유도된 DHS 유전자의 유도
화분 내의 토마토 식물(7∼8주령)이 6℃, 그로쓰 챔버에서 2일, 3일 또는 6일간 노출되었다. 광 사이클은 8시간 동안 암조건 16시간 동안 광조건으로 맞춰졌다. 식물은 비닐하우스로 다시 옮김으로서 다시 따뜻해졌다. 다시 따뜻해지지 않은 식물은 그로쓰 챔버로부터 제거된 후 바로 수확되었다. RNA는 하기와 같 이 잎으로부터 추출되었다.
잎(5g)은 액체 질소 내에서 갈아졌다. 갈린 분말은 30ml의 구아니디늄 완충액(4M 구아니디늄 이소티오시아테이트, 2.5mM NaOAc pH 8.5, 8.0%의 β-멀캅토에탄올로 혼합되었다. 혼합물은 4겹의 치즈클로스로 여과되었고 4℃에서 30분간 10,000 ×g로 원심분리되었다. 이후 상청액은 20시간 동안 26,000 ×g에서 염화세슘 밀도 기울기 원심분리되었다. 펠렛화된 RNA는 75% 에탄올로 세척되었고, 600㎕의 DEPC-처리된 물에 재현탁되었고, RNA는 -70℃에서 0.75ml의 95% 에탄올과 30㎕의 3M NaOAc로 침전되었다. 10㎍의 RNA는 1.2%의 변성 포름알데하이드 아가로스 겔 상에서 분획화되었고, 나일론 멤브레인으로 옮겨졌다. 무작위로 프라임된 32P-dCTP-표지된 전체 길이 DHS cDNA(서열번호: 1)가 42℃에서 오버나이트로 멤브레인을 프로브하는데 사용되었다. 멤브레인은 상온에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 1x SSC 내에서 1회 세척되었고, 65℃에서 15분간 0.1%의 SDS를 함유한 0.2x SSC 내에서 3회 세척되었다. 멤브레인은 오버나이트로 -70℃에서 X-선 필름에 노출되었다.
결과는 도 53에 나타나 있다. 나타난 바와 같이 DHS의 전사는 냉기 온도에노출하고 뒤이어 다시 따뜻하게 함으로서 잎에서 유도되고, 증가된 전사는 멤브레인의 누출로서 측정된 냉기 손상과 관련된다.
(실시예 6)
확인되지 않은 아라비돕시스 게놈 서열에 기초한 프라이머를 이용한 아라비돕시스 PCR 생성물의 생성
아라비돕시스 cDNA 주형으로부터의 일부 길이의 노화-유도된 DHS 서열이 아라비돕시스 게놈 서열로부터 고안된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의해 생성되었다. 5' 프라이머는 서열 5'-GGTGGTGTTGAGGAAGATC(서열번호: 7)를 지닌 19-머(mer)이고 ; 3' 프라이머는 서열 3'-GGTGCACGCCCTGATGAAGC(서열번호: 8)를 지닌 20-머이다. Expand High Fidelity PCR System(Boehringer Mannheim)과 주형으로서 아라비돕시스 노화 잎 cDNA 라이브러리를 이용한 중합효소 연쇄 반응이 하기와 같이 수행되었다.
반응 구성성분 :
게놈 DNA 1㎕(5 ×107 pfu)
dNTP (각각 10mM) 1㎕
MgCl2 (5mM) + 10x 완충액 5㎕
프라이머 1 및 2 (각각 100㎕) 2㎕
Expand High Fidelity DNA 중합효소 1.75㎕
반응 부피 50㎕
반응 파라미터 :
3분간 94℃
45 사이클 동안 94℃/1분, 58℃/1분, 72℃/2분
15분간 72℃
(실시예 7)
게놈 DNA의 분리 및 서던 분석
게놈 DNA는 액제 질소 내에서 토마토 잎 조직을 미세한 분말로 갊으로서 토마토 잎으로부터 추출되었다. 60℃에서 예열된 25ml의 균질화 완충액[100mM 트리스-HCl, pH 8.0, 100mm EDTA, 250mM NaCl, 1% 살코실(sarkosyl), 1% 2-멀캅토에탄올, 10㎍/ml RNase 및 12.5ml 페놀]을 함유한 37.5ml의 혼합물이 갈린 조직 내로 첨가되었다. 혼합물은 15분간 진탕되었다. 부가적인 12.5ml의 클로로포름/이소아밀알코올(24 : 1)이 혼합물에 첨가되어 다시 15분간 진탕되었다. 혼합물은 원심분리되고, 수성 상(phase)은 25ml의 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25 : 24 : 1)과 클로로포름/이소아밀알코올(24 : 1)로 재추출되었다. 핵산은 상온에서 15ml의 이소프로판올 침전시킴으로서 회수되었다. 침전물은 1ml의 물에 재현탁되었다.
게놈 DNA는 하기와 같이 제한효소 분해되었다. 10㎍의 게놈 DNA, 40㎕의 10X 반응 완충액 및 100 U 제한효소(Xbal, EcoRI, EcoRV 또는 HinDⅢ)가 400㎕의 총 부피로 5∼6시간 동안 반응되었다. 이후 혼합물은 페놀-추출되고, 에탄올-추출되었다. 분해된 DNA는 약 15시간 동안 15 추대로 0.8%의 아가로스 겔 상에서 아가로스 겔 전기영동되었다. 겔은 천천히 교반하면서 30분간 변성 완충액[87.66g NaCl 및 20g NaOH/리터] 내에 침수되었고, 증류수로 세척되었고, 천천히 교반하면서 30분간 중화 완충액[87.66g NaCl 및 60.55g 트리스-HCl, pH 7.5/리터]내에 침수되었다. DNA는 모세관 블럿팅에 의해 Hybond-N+ 나일론 멤브렌인으로 옮겨졌다.
하이브리디제이션은 1 ×106 cpm/ml의 32P-dCTP-표지된 전체 길이 DHS cDNA 또는 DHS cDNA의 3'-비-코딩 구역을 이용하여 42℃에서 오버나이트로 수행되었다. 프리하이브리디제이션(prehybridization)과 하이브리디제이션은 50%의 포름아마이드, 6X SSC, 5X Denhardt's 용액, 0.1%의 SDS 및 100mg/ml의 변성된 연어 정자 DNA를 함유한 완충액 내에서 수행되었다. 멤브레인은 2∼4시간 동안 프리하이브리다이즈되었고, 하이브리디제이션은 밤새 수행되었다.
하이브리디제이션이 완성된 후 멤브레인은 상온에서 2X SSC 및 0.1% SDS로 세척된 후 15분간 2X SSC 및 0.1% SDS로, 15분간 0.2X SSC 및 0.1% SDS로 세척되었다. 멤브레인은 -80℃에서 밤새 X-선 필름에 노출되었다. 결과는 도 49에 나타나 있다.
(실시예 8)
아라비돕시스로부터의 노화-유도된 elF-5A 유전자의 분리
아라비돕시스 잎에서 발현된 노화-유도된 elF-5A 유전자의 전체-길이 cDNA 클론은 주형으로서 아라비돕시스 노화 잎 cDNA 라이브러리를 이용한 PCR에 의해 수득되었다. 먼저 유전자의 5'- 및 3'- 말단에 상응하는 PCR 생성물은 벡터 T7 프라이머 <AATACGACTCACTATAG>(서열번호: 18)와 쌍을 이룬 퇴화한 업스트림 프라이머 <AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(서열번호: 17) 및 벡터 T3 프라이머 <ATTAACCCTCACTAAAG>(서열번호: 20)와 쌍을 이룬 퇴화한 다운스트림 프라이머 <TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(서열번호: 19)를 이용하여 제조되었다. PCR 생성물은 서열화를 위해 pBluescript 내로 서브클론되었다. 이후 전체-길이 cDNA는 3'-특이적 프라이머 <AGAAGAAGTATAAAAACCATC>(서열번호: 22)와 쌍을 이룬 5'-특이적 프라이머 <CTGTTACCAAAAAATCTGTACC>(서열번호: 21)를 이용하여 수득되었고, 서열화를 위해 pBluescript 내로 서브클론되었다.
(실시예 9)
토마토 열매로부터의 노화-유도된 elF-5A 유전자의 분리
토마토 열매에서 발현된 노화-유도된 elF-5A 유전자의 전체-길이 cDNA 클론이 주형으로서 토마토 열매 cDNA 라이브러리르 이용한 PCR에 의해 수득되었다. 먼저 유전자의 5'- 및 3'- 말단에 상응하는 PCR 생성물은 벡터 T7 프라이머 <AATACGACTCACTATAG>(서열번호: 18)와 쌍을 이룬 퇴화한 업스트림 프라이머 <AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(서열번호: 17) 및 벡터 T3 프라이머 <ATTAACCCTCACTAAAG>(서열번호: 20)와 쌍을 이룬 퇴화한 다운스트림 프라이머 <TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(서열번호: 19)를 이용하여 제조되었다. PCR 생성물은 서열화를 위해 pBluescript 내로 서브클론되었다. 이후 전체-길이 cDNA는 벡터 T7 프라이머 <AATACGACTCACTATAG>(서열번호: 18)와 쌍을 이룬 5'-특이적 프라이머 <AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG>(서열번호: 23)를 이용하여 수득되었고, 서열화를 위해 pBluescript 내로 서브클론되었다.
(실시예 10)
카네이션으로부터의 노화-유도된 elF-5A 유전자의 분리
카네이션 꽃에서 발현된 노화-유도된 elF-5A 유전자의 전체-길이 cDNA 클론은 주형으로서 카네이션 노화 꽃 cDNA 라이브러리를 이용한 PCR에 의해 수득되었다. 먼저 유전자의 5'- 및 3'- 말단에 상응하는 PCR 생성물은 벡터 T7 프라이머( 서열번호: 18)와 쌍을 이룬 퇴화한 업스트림 프라이머(서열번호: 17) 및 벡터 T3 프라이머(서열번호: 20)와 쌍을 이룬 퇴화한 다운스트림 프라이머(서열번호: 19)를 이용하여 제조되었다. PCR 생성물은 서열화를 위해 pBluescript 내로 서브클론되었다. 이후 전체-길이 cDNA는 3'-특이적 프라이머 <ACCAAAACCTGTGTTATAACTCC>(서열번호: 25)와 쌍을 이룬 5'-특이적 프라이머 <TTTTACATCAATCGAAAA>(서열번호: 24)를 이용하여 수득되었고, 시퀀싱을 위해 pBluescript 내로 서브클론되었다.
(실시예 11)
아라비돕시스로부터의 노화-유도된 DHS 유전자의 분리
아라비돕시스 잎에서 발현된 노화-유도된 DHS 유전자의 전체-길이 cDNA 클론은 아라비돕시스 노화 잎 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로서 수득되었다. 스크리닝을 위해 사용된 프로브의 서열(서열번호: 26)은 도 82에 나타나 있다. 프로브는 주형으로서 노화 잎 cDNA 라이브러리 및 유전자은행의 확인되지 않은 게놈 서열(AB017060)로부터 고안된 프라이머를 이용한 PCR에 의해 수득되었다. PCR 생성물은 시퀀싱을 위해 pBluescript 내로 서브클론되었다.
(실시예 12)
카네이션으로부터의 노화-유도된 DHS 유전자의 분리
카네이션 화판에서 발현된 노화-유도된 DHS 유전자의 전체-길이 cDNA 클론은 카네이션 노화 화판 cDNA 라이브러리를 선별함으로서 수득되었다. 선별을 위해 사용된 프로브의 서열(서열번호: 27)은 도 83에 나타나 있다. 프로브는 주형으로서 노화 화판 cDNA 라이브러리 및 퇴화한 프라이머(업스트림: 5' TTG ARG AAG ATY CAT MAA RTG CCT 3'(서열번호: 28); 다운스트림: 5' CCA TCA AAY T CY TGK GCR GTG TT 3'(서열번호: 29))를 이용한 PCR에 의해 수득되었다. PCR 생성물은 시퀀싱을 위해 pBluescript 내로 서브클론되었다.
(실시예 13)
안티센스 방향의 아라비돕시스 DHS의 전체-길이 또는 3' 구역으로의 아라비돕시스의 형질전환
아그로박테라아가 이중 35S 프로모터의 조절하에서 안티센스 형상으로 발현되는 전체-길이 노화-유도된 아라비돕시스 DHS cDNA 서열 또는 DHS 유전자의 3' 말단(서열번호: 30)(도 80)을 포함한 이원(binary) 벡터, pKYLX71로 형질전환되었다. 아라비돕시스 식물은 진공 침윤에 의해 형질전환된 아그로박테리아로 형질전환되었고 결과적인 T0 식물로부터의 형질전환 종자가 암피실린에 대해 선택되었다.
도 65∼도 68은 형질전환된 식물 내에서 안티센스 방향의 그의 DHS 유전자 또는 3' 말단의 발현이 증가된 생물량 즉, 더 큰 잎과 증가된 식물 크기를 초래함을 나타내는 형질전환된 아라비돕시스 식물의 사진이다. 도 69는 형질전환 아라비돕시스 식물이 종자 수확량을 증가시켰음을 나타낸다.
(실시예 14)
안티센스 방향의 토마토 DHS의 전체-길이 또는 3' 구역으로의 토마토 식물의 형질전환
아그로박테라아가 이중 35S 프로모터의 조절하에서 안티센스 형상으로 발현되는 전체-길이 노화-유도된 토마토 DHS cDNA 서열 또는 DHS 유전자의 3' 말단(서열번호: 31)(도 81)을 포함한 이원(binary) 벡터, pKYLX71로 형질전환되었다. 토마토 잎 외식편은 이들 아그로박테리아로 형질전환되었고, 형질전환된 캘러스 및 묘목이 생성되었고, 표준 조직 배양 방법에 의해 선택되었다. 형질전환된 묘목은 온실 조건하에서 열매-생산 T1 식물을 숙성시키도록 생장되었다.
도 70∼79는 형질전환된 아라비돕시스 식물에서 나타난 바와 같이 형질전환된 식물 내에서 노화-유도된 토마토 DHS 유전자의 감소된 발현이 토마토 열매의 지연된 연화 및 부패뿐만 아니라 증가된 생물량 즉, 더 큰 잎과 증가된 식물 크기를 초래함을 나타내는 사진이다.
(실시예 15)
안티센스 방향의 토마토 DHS의 3' 구역으로의 토마토 식물의 형질전환
아그로박테라아가 이중 35S 프로모터의 조절하에서 안티센스 형상으로 발현되는 DHS 유전자의 3' 말단(도 81)을 포함한 이원(binary) 벡터, pKYLX71로 형질전환되었다. 토마토 잎 외식편은 이들 아그로박테리아로 형성되었고, 형질환된 캘러스 및 묘목이 생성되었고, 표준 조직 배양 방법에 의해 선택되었다. 형질전환된 묘목은 온실 조건하에서 열매 생산 T1 식물을 숙성시키도록 생장되었다.
감소된 DHS 발현을 지닌 이들 형질전환 식물로부터의 열매는 대조군 식물의 약 33%의 열매가 발명되는 조건하에서 블러섬 말단 부패를 전혀 나타내지 않았다. 블러섬 말단 부패는 열매의 기부(블러섬) 말단이 노화하거나 부패하는 것을 유발하는 영양분 스트레스에 의한 생리적 질병이다. 도 84(A) 및 84(B)는 블러섬 말단 부패를 나타내는 대조군 열매 및 블러섬 말단 부패를 나타내지 않는 형질전환 열매를 나타내는 사진이다.
결과는 DHS 발현의 감소가 생리적 질병에 기인한 조직 및 세포의 사멸 착수를 방지함을 나타낸다.
(실시예 16)
야생형 콜롬비아 - 식물 재료 - 내의 아라비돕시스 탈리아나 번역 개시 인자 5A(AteIF-5A) 이소폼의 발현
생태형 콜롬비아(Columbia)인 아라비돕시스 탈리아나의 종자가 6-인치 화분내의 Promix BX 토양(Premier Brands, Brampton, ON, Canada)에서 생장되었다. 신선하기 씨뿌려진 화분은 4℃에서 2일간 유지된 후 16-h 광/8-h 암 사이클로 22℃에서 작동하는 그로쓰 챔버로 옮겨졌다. 150 μmol radiation m-2.s-2에서의 조명이 냉-백 형광 전구에 의해 제공되었다. 전체 로제트가 2주령에서 7주령 사이에 1주일 간격으로 수집되었고 줄기에서 나는 잎은 5주에 수집되었고, 줄기, 장각과, 싹 및 꽃은 6주에 수집되었고 흡수된 종자(물에 24시간)도 수집되어 액체 질소로 순간 동결되어 -80℃에 보관되었다.
슈도모나스 시린게( Pseudomanas syringae )로의 아라비돕시스 탈리아나 식물의 감염
아라비돕시스 탈리아나 생태형 콜롬비아 종자가 64 생장 세포를 포함한 평면에서 Promix BX 토양에 뿌려졌다. 씨뿌려진 평면은 4℃에서 2일간 유지되었고 9- h 광/15-h 암의 광주기를 지닌 그로쓰 챔버로 옮겨졌다. 감소된 광주기에 생리적으로 기인하여 발달이 더 느려진 것으로 보이나 모든 식물은 4주령에 처리되었다.
4-주령 식물의 로제트 잎은 Dr. Robin Cameron(토론토대학, 토론토, 캐나다)로부터 획득된 무독성(avr) 및 독성(vir) 균주 Pseudomans syringae pv. Tomato DC 3000으로 감염되었다. 각 식물의 로제트 잎의 배축 표면은 바늘이 없는 1 ml 주사기를 이용하여 접종되었다. 식물은 4가지 처리 중의 하나를 이용하여 처리도었다: 무접종, 10 mM MgCl2로의 모의-접종, avr P. syringae 균주로의 접종(106 cfu/ml 10 mM MgCl2) 또는 vir P. syringae 균주로의 접종(106 cfu/ml 10 mM MgCl2). 충분한 양의 박테리아가 침윤되어 avr 처리에서 전신으로 획득된 저항성을 유도하도록 침투되었는지 확인하기 위해 2개의 박테리아 카운트가 이루어졌고 하나는 접종 직후이고 두 번째는 3일 후이다. 접종된 잎은 이후의 분석을 위해 예비측정된 시점에 채취되었다.
감소된 DHS 또는 손상-유도된 eIF-5A 발현을 지닌 식물은 유전자에 대한 안티센스 T-DNA 삽입을 이용하여 발달되었다. 이들 식물 라인은 야생형 식물에 비해 박테리아 부하의 99%까지의 감소를 나타내는 형질전환 라인을 지닌 Pseudomans syringae pv. Tomato DC 3000에 대한 두드러진 저항성을 나타내었다. 도 43 및 44 참조. 농작물 식물을 이용한 데이터도 증가된 병원균 저항성을 나타내었다.
지혈기로의 아라비돕시스 탈리아나 식물의 손상
일반적인 조명 조건 하에서 생장된 4-주령 식물이 Stotz et al(2000)에 따라 중앙 엽맥을 따라(잎 표면의 약 10%) 지혈기로 압축시킴으로서 손상되었다. 조직은 0분, 1시간 및 9시간에 채취되었고 액체 질소에서 즉시 동결되었고 추가 분석을 위해 -80℃에서 보관되었다.
RNA 분리 및 노던 불럿팅
노던 블럿 분석을 위한 총 RNA가 Davis et al.(1986)에 따라 아라비돕시스 탈리아나 로제트로부터 분리되었다. RNA는 1% 아가로스 겔 상에 분획되었고 나일론 멤브레인으로 옮겨졌다(Davis et al.,1986). 고정된 RNA는 노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A 또는 생장 eIF-5A의 방사성동위원소표지된 3'UTR 부분으로 42℃에서 밤새 하이브리다이즈되었다. 3'UTR은 무작위 프라이머 세트(Boehringer Manheim)를 사용하여 [α-32P]-dCTP로 표지되었다. 하이브리다이즈된 멤브레인은 42℃에서 15분간 0.1% SDS를 함유한 2X SSC로 2회 세척되었고 42℃에서 30분간 0.1% SDS를 함유한 1X SSC로 2회 세척되었다. 하이브리디제이션은 -80℃에서 밤 새 노출 후 방사능 사진에 의해 시각화되었다.
항체 생성 및 정제
아라비돕시스 탈리아나(At)의 진핵성 번역 개시 인자 5A(eIF-5A)는 아미노산 수준 특히 단백질의 N-말단 구역 및 중심 구역에서 매우 상동적이다(도 1). 특정 이소폼이 될 항체를 수득하기 위해 펩타이드는 서로 특정한 것으로 나타난 AteIF-5A의 이소폼 내의 구역에 대해 고안된다. 추가적인 시스테인 잔기가 KLH와의 컨쥬게이션을 위해 N-말단에서 각 펩타이드에 첨가된다. 사용된 서열은: 노화-유도된 AteIF-5A의 경우
Figure 112005074399539-PCT00004
이고, 손상-유도된 AteIF-5A의 경우
Figure 112005074399539-PCT00005
이고, 생장 AteIF-5A의 경우
Figure 112005074399539-PCT00006
이다. 이들 서열이 단백질 BLAST(짧은 거의 정확한 서열; 아라비돕시스 탈리아나에 국한; 예측 개수 20000; 문자 크기 2; Matrix PAM90; Gap cost 91)에 제출시 데이터베이스 내에서 발견된 유의적인 서열은 다른 것이 아닌 AteIF-5A에만 매치되었다. 펩타이드는 University of Western Ontario Peptide Synthesis 시설에서 합성되었다. 캐리어 단백질, Keyhole Limpet Hemocyanin(Sigma)이 Drenckhaln et al.(1993) 및 Collawn 및 Patterson(1999)에 따라 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 이용하여 펩타이드의 N-말단 시스테인에 컨쥬게이트되었다. 토끼는 결합된 펩타이드로 2-주 간격으로 4회 주사되었다. 최종 주사 2주 후 혈액이 토 끼의 방혈에 의해 수집되었고 항혈청을 모으기 위해 수집된 혈액을 응혈시켰다.
단백질 분획화 및 웨스턴 블럿팅
상기 조직 리스트는 작은 막자를 지닌 에펜도르프 튜브 또는 큰 모르타르 및 막자 내의 완충액(50 mM EPPS, pH 7.4, 0.25 M 솔비톨, 10 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 mM 아미노-n-카프론산, Protease Inhibitor Cocktail for Plant tissues(Sigma)) 내에서 균질화되었다(∼0.5 g/ml). 균질체는 최대 속도로 마이크로원심분리기에서 간단히 원심분리되었고 펠렛이 제거되었다. 총 단백질은 Ghosh et al.(1988)에 따라 정량화되었다. SDS-PAGE가 Mini protein Dual Slab cells(BioRad, Mississauga, Ontario) 상에서 수행되었고 겔(12% 폴리아크릴아미드)은 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색되거나(Fairbanks et al., 1971) 반-건조 이동 방법(semi-dry transfer cell, Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 멤브레인으로 옮겨졌다. 블럿은 1 mg/ml 폴리비닐알코올 내에서 30초간(Miranda et al., 1993) 및 0.1%(v/v) Tween 20 및 5%(w/v) 분말화된 우유를 함유한 인산-완충 식염수 내에서 1시간 동안 블록되었다. 1차 항체(두 번째 주사후 방혈로부터의)는 0.1%(v/v) Tween 20 및 1%(w/v) 분말화된 우유를 함유한 PBS 내에서 1:50으로 희석되었다. 항원은 알칼리성 포스파타제(Bioshop, Burlington, Ontario) 및 포스파타제 기질, NBT 및 BCIP(BioRad, Mississauga, ON)에 결합된 토끼 항체에 대한 염소 내에서 제조된 2차 항체를 이용하여 시각화되었다.
(실시예 17)
3가지 eIF-5A 이소폼을 과발현하는 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나의 생성
프라이머 디자인
아라비돕시스 탈리아나(At)의 진핵성 번역 개시 인지 5A(eIF-5A) 이소폼은 코딩 구역에서 크게 상동적이다(도 2). 정확한 유전자의 증폭 문제를 방지하기 위해 노화-유도된 eIF-5A, 손상-유도된 eIF-5A 또는 생장 eIF-5A에 대한 프라이머는 각각 도 3, 4 및 5에 나타난 바와 같이 5'UTR의 시작점 및 3'UTR 말단으로부터 고안되었다. 5'UTR 및 3'UTR은 EST 정보 및 유전자은행 데이터베이스 내의 다른 서열 정보에 기반하여 추정되었다. 적당한 제한 사이트가 pKYLX71 이원 벡터 내에서 센스 방향으로 라이게이션을 위한 프라이머의 말단에 첨가되었다(도 1). 노화-유도된 AteIF-5A의 경우 업스트림 프라이머는 5'
Figure 112005074399539-PCT00007
3'이고, 다운스트림 프라이머는 5'
Figure 112005074399539-PCT00008
3'이다. 손상-유도된 AteIF-5A의 업스트림 프라이머는 5'
Figure 112005074399539-PCT00009
3'이고, 다운스트림 프라이머는 5'
Figure 112005074399539-PCT00010
3'이다. 생장 AteIF-5A에 대한 업스트림 프라이머는 5'
Figure 112005074399539-PCT00011
3'이고, 다운스트림 프라이머는 5'
Figure 112005074399539-PCT00012
3'이다. 프라이머에 첨가된 제한 사이트는 상기 목록된 프라이머 내에 밑줄침으로서 나타난 바와 가팅 노화-손상된 AteIF-5A의 경우 HindⅢ 및 SacI이고, 손상-유도된 AteIF-5의 경우 XhoI 및 SacI이고, 생장 AteIF-5A의 경우 XhoI 및 SacI이다.
아라비돕시스 탈리아나로부터의 게놈 DNA의 분리
게놈 DNA는 3-주령 로제트 잎으로부터 분리되었다. 조직은 추출 완충액(200 mM Tris pH 7.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 내에서 균질화되었고 수득된 균질체는 15초간 볼텍스되었다. 잔여 파편은 1분간 최대 속도로 마이크로원심분리기로의 원심분리에 의해 제거되었다. 상청액이 수집되었고 이소프로판올과 1:1 비율로 혼합되었고, 볼텍스되었고 2분간 상온에 정치되었다. 펠렛은 5분간 최대 속도로 마이크로원심분리기로의 원심분리에 의해 수집되었고, 70% 에탄올로 세척되었고 2분간 진공 건조되었다. 건조된 펠렛은 물에 재현탁되었고 클로로포름의 1:1 부피로 처리되었고 볼텍스되었다. 2분간 마이크로원심분리기로의 원심분리 후 상층이 수집되었고 침전을 위해 -20℃에서 30분간 20 ㎕(3 M 아세트산나트륨) 및 2 부피의 에탄올로 처리되었다. 이후 정제된 게놈 DNA는 마이크로원심분리기 내에서 30분간 최대 속도로 원심분리되었고, 건조되었고 PCR을 위해 물에 재현탁되었다.
게놈 DNA로부터의 PCR
PCR은 상기 기술된 프라이머로 수행되었다. PCR 반응 혼합물은 1x Tsg 또는 Taq 중합효소 반응 완충액, 1U의 Tsg 또는 Taq 중합효소, 0.2 mM dNTP, 2 mM MgCl2 및 15 pmol의 각 특정 프라이머를 포함하였다. 반응은 95℃에서 10분간 hot start로 시작되었고 첫 번째 사이클은 95℃의 변성 온도 1분, 55℃의 어닐링 온도 2분 및 72℃의 확장 온도 2분으로 구성되었다. 이후 다음의 29 사이클이 어닐링 온도가 사이클 당 0.5℃까지 감소되는 터치다운 프로그램을 진행시켰고, 최종 사이클은 40℃의 어닐링 온도를 지녔다. 72℃의 최종 확장은 10분간 유지되었다. PCR 생성물은 지침에 따라 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리되었고 Millipore Ultrafree-DA for DNA Extraction from Agarose spin columns(Millipore Corporation, Bedford, MA)에 의해 수행되고 회수되었다.
pGEM-T Easy 내로의 라이게이션
정제된 PCR 생성물은 Promega에 의해 제공된 지침에 따라 pGEM-T Easy Vector 내로 라이게이트되었다(도 7). 간단히, PCR 생성물은 Promega pGEM-T Easy Vector System(Promega Corporation, Madison WI)에서 제공된 Rapid Ligation Buffer(30 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP 및 5% 폴리에틸렌글리콜 (MW8000, ACS Grade) pH 7.8) 내의 pGEM-T Easy Vector, 3 Weiss Units T4 DNA 리가제와 3:1의 비율로 혼합되었다. 라이게이션 반응은 15℃에서 밤새 인큐베이트되었고 적합한 E. coli DH5-α 세포 현탁액(RbCl/CaCl을 이용하여 적합하게 제조; Kushner, 1978) 내로 옮겨졌다. 형질전환 혼합물은 먼저 30분간 얼음 위에서 인큐베이트되었고, 42℃에서 90초간 열충격이 가해졌고, 1 ml 2xYT 브로쓰의 첨가 후 1시간 동안 37℃에서 회복되었다. 형질전환된 세포는 펠렛되었고, 적은 부피의 2xYT 브로쓰 내에서 재현탁되었고 선택을 위해 50 ㎍/ml 암피실린을 함유한 한천 플레이트 상에 놓였다. pGEM-T Easy Vector가 세포에 암피실린 저항성을 제공하기 때문에 형질전환체만 암피실린 함유 플레이트 상에서 생장할 수 있다. 형질전환체는 pGEM-T Easy Vector 내로 라이게이트된 PCR 생성물 삽입에 대해 선택되고 선별되었다.
제한효소 분해를 통한 pGEM-T Easy Vector 내의 PCR 생성물 삽입의 선별
선택 배지 상에서 생장된 콜로니는 37℃에서 밤새 50 ㎍/ml 암피실린을 함유한 5 ml 2xYT 브로쓰 내에서 생장되었다. 선택된 콜로니로부터의 재조합 플라스미드는 Wizard Prep DNA Purification Kit(Promega)를 이용하여 정제되었다. 플라스미드 DNA는 37℃에서 1시간 동안 EcoRI로 분해되었고 AteIF-5A 삽입 크기가 존재한다는 증명을 위해 1% 아가로스 겔 상에서 시각화되었다. 이후 양성 플라스미드는 본 서열이 인 플란타(in planta)에서 과발현에 적당하다는 확인을 위해 Core Molecular Biology Facility(University of Waterloo, Waterloo, ON)에 의해 시퀀스되었다.
pKYLX71 내로의 라이게이션
pGEM:손상-유도된 AteIF-5A 및 pGEM:생장 AteIF-5A의 컨스트럭트가 XhoI 및 SacI로 이중 분해되었고 XhoI 및 SacI로 역시 분해된 이원 벡터 pKYLX71 내로 서브-클론되었다. 이들 효소 분해는 손상-유도된 AteIF-5A 및 생장 AteIF-5A이 콜리플라워 모자이크 바이러스 이중 35S 프로모터의 조절 하에서 이원 벡터 pKYLX71 내로 센스 방향으로 삽입됨을 확인시켰다. 라이게이션 반응은 1 ㎍의 이원 벡터 및 3 ㎍의 손상-유도된 AteIF-5A 또는 생장 AteIF-5A를 이용하였다. 라이게이션은 3 Weiss units of T4 DNA Ligase(Fermentas)로 라이게이션 완충액(30 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP 및 5% 폴리에틸렌글리콜(MW8000, ACS Grade) pH 7.8) 내에서 발생되었다. 라이게이션 반응은 15℃에서 밤새 인큐베이트되었고 적합한 E. coli DH5-α 세포 현탁액(RbCl/CaCl을 이용하여 적합하게 제조; Kushner, 1978) 내로 옮겨졌다. 형질전환 혼합물은 먼저 30분간 얼음 위에서 인큐베이트되었고, 42℃에서 90초간 열충격이 가해졌고, 1 ml 2xYT 브로쓰의 첨가 후 1시간 동안 37℃에서 회복되었다. 형질전환된 세포는 펠렛되었고, 적은 부피의 2xYT 브로쓰 내에서 재현탁되었고 선택을 위해 50 ㎍/ml 테트라사이클린을 함유한 한천 플레이트 상에 놓였다. pGEM-T Easy Vector가 세포에 테트라사이클린 저항성을 제공 하기 때문에 형질전환체만 테트라사이클린 함유 플레이트 상에서 생장할 수 있다. 형질전환체는 PCR 및 XhoI 및 SacI로의 이중 분해에 의해 손상-유도된 AteIF-5A 또는 생장 AteIF-5A에 대해 선택되고 선별되었다. PCR 증폭(상기 설명된 게놈 DNA에서 수행된 것과 동일) 및 분해 후 생성물은 정확한 크기의 삽입의 확인을 위해 1% 아가로스 전기영동을 이용하여 분리되었다.
아그로박테리움 일렉트로포레이션(electroporation) 및 선택
pKYLX71:손상-유도된 AteIF-5A 및 pKYLX71:생장 AteIF-5A 컨스트럭트가 적합한 Agrobacterium tumefaciens GV3010 내로 일렉트로포레이트되었다. 적합한 아그로박테리움 세포 단일 콜로니의 제조는 50 ㎍/ml의 리팜피신(rifampicin) 및 50 ㎍/ml 겐타마이신(gentamycin)을 함유한 2xYT 브로쓰 5ml 내에 접종되었다. 이는 280 rpm으로 Forma Scientific Orbital Shaker(Fisher Scientific) 내에서 28℃에서 밤새 생장되었고 다양한 희석(1:500, 1:1000, 1:2000)으로 50 ㎍/ml의 리팜피신 및 50 ㎍/ml의 겐타마이신을 지닌 30 ml의 2xYT 배양액을 접종시키는데 사용되었다. 새롭게 접종된 배양액은 냉각 전까지 OD600이 0.5와 0.8 사이에 있을 때까지 생장되었고 15분간 2000 g에서 SS-34 rotor(Sorvall) 내에서 원심분리되었다. 펠렛은 50 ml의 얼음-냉각수에 재현탁되었고 15분간 2000 g에서 원심분리되었다. 이러한 세척 절차는 배양액으로부터 염 및 사멸된 세포를 제거하기 위해 총 4회 반 복되었다. 최종 펠렛은 40 ml 얼음 냉각된 10%(v/v) 글리세롤 내에 재현탁되었고 15분간 2000 g로 원심분리되었고 1회 반복되었다. 이후 펠렛은 100 ㎕ 얼음-냉각된 10% 글리세롤 내에 재현탁되었고 잘 혼합되었다. 세포는 100 ㎕의 알리쿼트로 분할되었고 얼음 위에 보관되었다.
적합한 아그로박테리움 세포 내로의 DNA 컨스트럭트의 일렉트로포레이션을 위해 100 ㎕ 알리쿼트가 500 ng의 DNA 컨스트럭트와 잘 혼합되었다. 이후 박테리아:벡터 혼합물은 미리-냉각된 일렉트로포레이션 큐벳으로 옮겨졌고 하기 셋팅에 조정된 Gene Pulser(Biorad)에 위치되었다: 2.5 kV, 25 μF 및 200Ω. 일렉트로포레이션 후 1 ml의 2xYT 브로쓰가 첨가되었고 전체 현탁액은 배양액 튜브로 옮겨졌다. 일렉트로포레이트된 배양액은 회복되게 하기 위해 3시간 동안 28℃에서 280 rpm으로 인큐베이트된 후 50 ㎍/ml의 리팜피신 및 50 ㎍/ml 겐타마이신뿐만 아니라 2ml 2xYT 브로쓰가 첨가되었다. 배양액 내에서의 생장 2일 후 일렉트로포레이트된 세포는 테트라사이클린, 겐타마이신 및 리팜피신(모두 50 ㎍/ml) 상에서 플레이트되었고 첨가 2일 후 콜로니가 생장되었다. 수득된 콜로니는 PCR 및 SacI 및 XhoI로의 이중 분해에 의해 pKYLX71:손상-유도된 AteIF-5A 또는 pKYLX71:생장 AteIF-5A에 대해 선별되었고, 1% 아가로스 겔 상에서의 분리에 의해 시각화되었다.
식물 형질전환
pKYLX71:손상-유도된 AteIF-5A 또는 pKYLX71:생장 AteIF-5A을 포함한 Agrobacterium tumefaciens GV3010의 양성 콜로니가 야생형 아라비돕시스 탈리아나 생태형 콜롬비아의 형질전환을 위해 사용되었다. 식물 형질전환을 위해 사용된 박테리아 슬러리의 제조시 pKYLX71:손상-유도된 AteIF-5A 또는 pKYLX71:생장 AteIF-5A 컨스트럭트에 대해 양성인 단일 콜로니가 50 ㎍/ml의 테트라사이클린, 50 ㎍/ml의 리팜피신 및 50 ㎍/ml의 겐타마이신을 함유한 5 ml의 2xYT 브로쓰 내에서 접종되었다. 이는 280 rpm으로 Forma Scientific Orbital Shaker(Fisher Scientific) 내에서 28℃에서 2일간 생장되었고 50 ㎍/ml의 리팜피신 및 50 ㎍/ml의 겐타마이신을 지닌 35 ml의 2xYT를 접종시키는데 사용되었다. 35 ml 배양액은 28℃에서 280 rpm으로 밤새 생장되었고 50 ㎍/ml의 리팜피신 및 50 ㎍/ml의 겐타마이신을 지닌 535 ml(총)의 2xYT를 접종시키는데 사용되었다. 다시 배양액은 약 2의 OD600가 되도록 28℃에서 280 rpm으로 밤새 생장되었다.
배양액은 GSA rotor(Sorvall) 내의 4℃에서 1945 g으로 15분간 원심분리 전에 2개의 250 ml의 튜브로 옮겨졌다. 펠렛은 500 ml의 침투 배지(1.1 g MS 염, 25 g 슈크로즈, 0.25 g MES, pH 5.7 with KOH, 100 ng/ml 벤질아미노퓨린 및 50 ㎕ Vac-In-Stuff(Silwet L-77; Lehle Seeds)) 내에 재현탁되었고 4개의 큰 고무 마개를 지닌 진공 건조기 내의 큰 플라스틱 접시에 놓였다. 각각의 맞는 발단 단계의 8개 식물체를 포함한 5개 화분이 침투를 위해 연속적으로 사용되었다. 각각의 화 분은 느슨한 토양을 제거하기 위해 먼저 쓰레기통 위에서 전도된 후 유리 건조기 내의 플라스틱 컨테이너 내로 옮겨져서(여전히 전도됨) 4개의 큰 고무 마개가 전도된 화분에 대한 스탠드로서 작용하게 하여 추대가 로제트가 아닌 아그로박테리움 슬러리 내로 떨어지도록 하였따. 이후 식물은 10분간 전도된 상태로 진공처리되었다(400 mmHg). 이후 진공 침투된 식물은 회수되었고 식물 재료 섹션 내에서 설명된 그로쓰 챔버 조건에서와 같이 통상적으로 생장되었다. 몇주 후 장각과가 건조되고 종자가 숙성되면 각 화분이 함께 풀되어 종자가 수집되었다.
식물 형질전환체의 선택 및 분리(segregation) 분석
초기 형질전환체를 확인하기 위해 진공-침투된 식물로부터의 종자가 로테이터(Barnstead/Thermolyne) 상에서 20분간 1%(v/v) 차아염소산나트륨 및 0.1%(v/v) Tween 80 수용액 내에서 표면 멸균되었고 멸균수로 4회 세척되었고 멸균된 0.8% 한천 내에 재현탁되었다. 이후 재현탁된 종자는 1%(w/v) 슈크로즈, 0.5 g/L 2-[N-몰폴리노]에탄술폰산(MES), 0.7%(w/v) 박테리올로지칼 한천 및 40∼50 ㎍/ml 카나마이신로 보충된 멸균된 반-강도 Murashige and Skoog(MS) 배지(2.2 g/L) 상에 이식되었다(Murashige and Skoog, 1962). 이원 벡터가 형질전환체 묘목에 카나마이신 저항성 유전자를 제공하기 때문에 형질전환체만이 카나마이신-함유 플레이트 상에서 생장할 수 있다(도 6). 이원 벡터를 품지 않는 묘목은 카나마이신 저항성 유전자가 없기 때문에 황화되고 사멸하게 된다. 야생형 묘목은 대조군으로 사용 되었고 배지에 첨가되는 카나마이신이 없는 MS 배지 상에 이식되었고, 또한 빈 pKYLX71 벡터를 포함한 상동접합성 라인으로부터의 종자가 카나마이신 함유 플레이트 상에서 대조군으로서 씨뿌려졌다. 빈 벡터 대조군은 아라비돕시스 탈리아나의 게놈 내로의 이원 벡터의 무작위 통합의 효과뿐만 아니라 카나마이신 효과가 묘목 생장에 영햐을 미침을 증명하는데 유용하다. 적은 양의 야생형 종자는 MS 배지 및 40∼50 ㎍/ml 카나마이신을 포함한 각 플레이트의 작은 지역 상에 플레이트되었다. 이는 배지가 형질전환체에 충분히 선택적인지를 확인하고 카나마이신의 강도를 시험하기 위해 수행되었다.
씨뿌려진 플레이트는 발아를 동시 발생시키기 위해 3일 간 4℃에서 유지되었다. 3일 후 플레이트는 20±2℃에서 16-h 광/8-h 암 사이클 조건 하에서 추가 7일간 생장되는 그로쓰 챔버로 옮겨졌다. 조명은 150 μmol radiation m-2.s-1에서 유지되었고 냉-백 형광 전구에 의해 제공되었다. pKYLX71:손상-유도된 AteIF-5A 및 pKYLX71:생장 AteIF-5A 벡터로의 아라비돕시스 탈리아나 식물의 형질전환 효율이 측정되었다.
씨뿌리기 총 10일 후 센스 손상-유도된 AteIF-5A 및 센스 생장 AteIF-5A 각각에 대한 14개 형질전환체 또는 16개 형질전환체가 32 세포를 포함한 플랫 내에서 Promix BX 토양(Premier Brands, Brampton, ON, Canada)로 이식되었다. 이후 이 들 이식된 T1 세대 식물은 16-h 광/8-암 사이클로 22℃에서 작동하는 또다른 그로쓰 챔버 내로 옮겨졌다. 150 μmol radiation m-2.s-1에서의 조명이 냉-백 형광 전구에 의해 제공되었다. T1 세대 식물은 생장하여 성숙되었고 T2 세대 종자를 생성하였다. 이들은 수확되었고 추가 선별이 수행될 때까지 -20℃에서 보관되었다. T1 세대는 1, 2, 3으로 명명되었다. 센스 생장 AteIF-5A 식물의 모든 16개 라인은 생존하였고 종자를 생성하였으나 센스 손상-유도된 AteIF-5A 식물의 14개 형질전환체 중 단지 9개만이 생존하였고 종자를 생성하였다.
T2 세대 형질전환체의 선택은 T1 세대 형질전환체와 동일한 방법으로 수행되었다. 센스 생장 AteIF-5A 식물의 12개 라인은 선택 가능한 배지 상에서 어떠한 형질전환체도 생성하지 않았고 어떠한 추가 작업에 포함되지 않았다. 센스 생장 AteIF-5A 식물의 1 내지 16개 라인(마이너스 라인 12) 각각은 운반되는 8개 서브라인을 지녔다. 이들은 A 내지 H로 명명되어 예를 들어 T1 라인 1 내에서 T2 세대 식물은 1A, 1B, 1C 등으로 명명되었다. 센스 손상-유도된 AteIF-5A 식물 라인 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 및 11 각각은 운반되는 8개 서브라인(A-H)를 지녔다. 라인 12 T1 식물은 약 30개 T2 종자만을 생성하였고 T2 세대 내의 단지 1개 서브라인만이 운반될 것이다. 센스 손상-유도된 AteIF-5A 식물의 T2 식물은 여전히 생장하고 있고 특성화되고 있다. 센스 생장 AteIF-5A 식물에 대한 T2 식물은 숙성하였고 종자를 생성하여 수확되었고 추가 분석까지 -20℃에서 보관되었다.
센스 생장 AteIF-5A의 T3 세대 형질전환체의 선택은 T2와 동일한 방식으로 수행되었다. 8개 라인이 센스 생장 AteIF-5A의 과발현 정도뿐만 아니라 표현형 분석에 기반하여 선택되었다. 발현 수준은 4개 카테고리로 분류되었다: 높은-수준 발현, 중간-수준 발현, 낮은-수준 발현 및 무발현(동시-억제에 기인함). 2개 라인이 각각의 발현 수준에 대해 선택되었고 각 라인으로부터의 12개 식물이 이식되었다. 이들 4개 발현 수준에 대해 상응하는 라인은: 1A, 2D, 4D, 15A, 8D, 9H, 11C 및 16C이다. 센스 생장 AteIF-5A 식물에 대한 T3 세대는 여전히 생장하고 있고 특성화되고 있다.
(실시예 18)
센스 손상-유도된 AteIF-5A 및 센스 생장 AteIF-5A의 표현형 분석: 사진 기록
센스 손상-유도된 AteIF-5A 및 센스 생장 AteIF-5A 라인의 형태적 표현형은 상응하는 대조군 야생형 식물(아라비돕시스 탈리아나 생태형 콜롬비아) 및 빈 이원 벡터 pKYLX71로 형질전환 식물의 표현형과 같이 분리동안 사진으로 기록되었다.
종자 측정
센스 생장 AteIF-5A의 T2 식물로부터 수집된 T3 종자는 총 종자 수확량(중량 및 부피), 종자 크기(길이 및 폭) 대해 측정되었고, 생성된 종자의 개체 중량 및 부피를 계산하였다. 중량에 의한 총 종자 수확량은 봉공근 분석 디지털화 저울 상에서 측정되었고 부피는 각 식물에 의해 산출된 총 종자를 100 ㎕ 마다 누진된 유리 1 ml 주사기 내로 쏟아 붓고 채워 넣음으로서 측정되었다. 길이, 폭에 의해 종자 크기를 측정하고 부피를 계산하기 위해 종자는 마이크로미터를 포함한 슬라이드 상에 놓였고 Olympus BX51 현미경 상에서 관찰되었다. 마이크로미터 상의 종자 사진이 Compaq Evo D500(Compaq Company Corporation; Intel Pentium 4 CPU 1.7GHz, 262 MG RAM, running Windows 2000)에 부착된 Spot Insight Color Camera(Diagnostic Instruments Inc.)로 촬영되었다. Image-Pro Express Version 4.0 for Windows를 이용하여 크기 교정을 위한 이미지 내 마이크로미터를 이용하여 각 서브라인 내의 10개 종자의 측정이 이루어졌다. 측정은 Microsoft Excel로 입수되어 표준 오차 및 부피와 같은 계산이 수행되었다.
(실시예 19)
센스 손상-유도된 AteIF-5A 및 센스 생장 AteIF-5A의 생화학적 분석 - 단백질 분획화 및 웨슨턱 블럿팅
센스 생장 AteIF-5A T2 식물의 각 서브라인으로부터의 첫 번째 줄기에 나는 잎이 수집되었고 단백질이 상기 기술된 바와 같이 추출되었다. 라인 1A, 2A로부 터 16A까지의 총 단백질이 12% SDS-PAGE에 의해 분획화되었고 PVDF 멤브레인으로 옮겨졌다. 블럿은 1:50 희석으로 생장 αAteIF-5A로 프로브되었다. 대조군 총 단백질은 야생형으로부터의 첫 번째 줄기에 난 잎 및 빈 이원 벡터 대조군 식물로부터 추출되었다.
(실시예 20)
야생형 콜롬비아 내의 아라비돕시스 탈리아나 번역 개시 인자 5A(AteIF-5A) 이소폼의 발현
일부 조직이 다른 발달 단계에서 수집되었고 이들 조직으로부터 추출된 단백질은 웨스턴 블럿팅에 사용되었다. 도 8 내의 웨스턴 블럿은 노화-유도된 eIF-5A이 2 주령 로제트 잎 내에 존재하지 않으나 3 주령 로제트 잎 내에서 상향조절되고 5주까지 풍부하게 증가되고 감소되나 7주에도 여전히 존재함을 증명한다. 노화 AteIF-5A는 PEG 처리된 식물 또는 대조군에서 검출되지 않았으나 꽃 레인(노화 꽃 포함) 및 자엽 조직의 노화를 반영하는 흡수된 종자 레인 내에 존재하였다. 블럿이 손상-유도된 αAteIF-5A 항체로 프로브되면 희미한 밴드가 장각과, 흡수된 종자 및 줄기 레인에서 나타났다. 장각과 및 줄기 레인 내에서 나타난 밴드는 조직의 수집으로 발생된 손상에 기인한다. 장각과 및 줄기를 수집하기 어렵기 때문에 AteIF-5A의 손상-유도된 이소폼의 일부 상향-조절을 가능하게 하는 직시 순간 동결되지 않았다. 블럿이 생장 αAteIF-5A로 프로브될 때 나타난 밴드만이 흡수된 종 자이고 이것이 세포 분열에 관련된 이소폼이라는 견해를 유지시킨다.
비처리되거나 MgCl2로의 avr P. syringae 또는 vir P. syringae로의 모의 접종으로 처리된 식물은 병원균 침입 동안 AteIF-5A의 발현을 분석하기 위해 여러 시점에서 수집되었다. avr 균주는 식물에 의해 인식 가능하고 감염 구역 내의 세포사멸 및 괴사를 유도하는 고감도 반응을 유도하고, 따라서 질병을 유발하는 병원균을 불허한다. 더욱이 위치화된 반응은 추가 침입으로부터 식물을 보호하기 위해 전신성 반응이 된다. 이는 발병 반응(PR) 유전자로 알려진 한 벌의 유전자 발현을 포함한 전신성 획득 저항성(SAR)로 알려져 있다. 반대로 vir 균주는 식물에 의해 인식되지 않을 것이고 고감도 반응을 유도하지 않을 것이고 질병을 유발하지 않을 것이다. 아라비돕시스 탈리아나의 병에 걸린 상태는 감염 며칠 후 황화 잎 및 세포 사멸을 포함한다. 처리 72시간 후 대조군 식물, 모의 처리된 식물, avr 처리된 식물 및 vir 처리된 식물이 3개의 αAteIF-5A 항체로의 웨스턴 블럿팅을 위해 수집되었다(도 9). 이 시점에서 SAR 및 질병 모두는 avr 처리된 및 vir 처리된 식물 각각에서 관찰할 수 있었다. 노화-유도된 αAteIF-5A 항체로 프로브된 경우 모든 표본에서 매우 동일한 밴드가 관찰되었다. 모든 식물이 4주령이고 때문에 이는 놀라운 것도 아니고, 도 8에서 노화 이소폼은 3주에 나타나기 시작하였다. 블럿이 손상-유도된 αAteIF-5A 항체로 프로브돈 경우 희미한 밴드가 비처리된, 모의 처리된 및 avr 처리된 식물에서 검출 가능하였고 vir 처리된 식물 내에서 검출되는 강한 밴드가 존재하였다. 이러한 손상 이소폼의 상향 조절은 질병에 의해 유발된 세포 사멸에 기인한다(또한 세포적 손상의 형태). 생장 αAteIF-5A로 프로브된 블럿은 어떠한 밴드도 나타내지 않았고 따라서 도면에 포함되지 않았다. 노화-유도된 AteIF-5A가 이들 처리 동안 발현 내 변화를 나타내지 않았기 때문에 자연적 노화에 대한 특이성을 증명한다. 손상-유도된 AteIF-5A 발현 내의 증가는 손상에 기인한 사멸에 대한 그의 특이성을 증명한다. 이러한 가능성을 더욱 조사하기 위해 아라비돕시스 탈리아나의 손상 잎으로 실험이 수행되었다.
손상 실험은 발명 실험과 동일한 결과를 나타내었다(도 10). 노던 블럿이 노화-유도된 AteIF-5A, 손상-유도된 AteIF-5A 및 생장 AteIF-5A의 전사적 변화를 나타내는데 사용되었다. 프로브는 각각의 AteIF-5A에 특이적이고 각각 3'UTR로 구성되었다. 이들은 4-주령 식물이고 표본은 9시간 간격으로만 채취되었기 때문에 발병 실험과 같이 노화-유도 AteIF-5A 발현은 어떠한 변화도 나타내지 않음이 관찰되었다. 이는 다시 노화-유도된 AteIF-5A이 자연적 노화 특이적 이소폼이라는 사실과 일치한다. 그러나 손상-유도된 AteIF-5A의 발현은 9시간 후 증가되지 않았다. 전사체가 완전히 구성적인 것으로 나타날 때(도 10) 발생되는 번역 조절이 있으나 유도되지 않은 경우(도 9) 단백질은 크게 발현되는 것으로 나타나지 않았다. 생장 AteIF-5A의 전사체는 모든 표본에서 거의 검출되지 않았고 손상 후 발현 내 감소를 나타낸다.
(실시예 21)
3가지 eIF-5A 이소폼을 과발현하는 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 식물의 생성
AteIF-5A는 PCR에 의해 게놈 DNA로부터 분리되었다(도 11). 생성물은 pGEM 내에 라이게이트되었고 서열은 인 플란타에서 과-발현에 대한 적합성에 대해 검증되었다. 손상-유도된 AteIF-5A 및 생장 AteIF-5A는 XhoI 및 SacI로 pGEM으로부터 이중 분해되었고 pKYLX71 내에서 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S2 프로모터 뒤에 센스 방향으로 라이게이트되었다. 양성 라이게이션은 분해 및 PCR에 의해 확인되었다(도 13). 이후 pKYLX71:노화-유도된 AteIF-5A 및 pKYLX71:생장 AteIF-5A은 형질전환을 위해 생태형 콜롬비아의 아라비돕시스 탈리아나 야생형의 진공 침투를 통해 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3010 내로 일렉트로포레이트되었다. 식물 형질전환후 종자가 수집되었고 카나마이신 함유 MS 플레이트 사에서 형질전환가 선택되었다.
손상-유도된 AteIF-5A(센스 손상-유도된 AteIF-5A)를 과발현하는 아라리돕시스 탈리아나 식물
T1 세대 식물은 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유한 MS 플레이트 상에서 씨뿌려졌 고 4℃에서 3일간 보관되었고 7일간 그로쓰 챔버에서 보관되었다(도 14). 토양으로 이식된 14개 형질전환가 있었다. 이들 14개 T1 세대 식물의 일반적 표현형은 왜소한 생장이었다. 라인 1, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13 및 14는 생장면에서 매우 왜소하였고 6, 8, 10, 13 및 14는 종자를 생성하지 않았다. 라인 2 및 3은 다소 왜소한 반면 라인 5, 7, 9는 야생형 식물과 유사하게 생장하였다(도 15 및 16). 센스 손상-유도된 AteIF-5A 식물의 T1 세대 내에서 관찰된 일부 또다른 표현형은 황화 잎, 보라색 자엽, 말아 올려진 잎 및 꽃 형태의 차이를 포함하였다. 왜소한 생장의 양상은 식물이 토양으로 이식되기 전까지는 관찰되지 않았다는 점을 주지하는 것이 흥미롭다. 이의 가능한 설명은 이식 동안 뿌리가 다소 손상되고(피할 수 없이 이식의 결과로) 회복될 수 없었다는 것이다. 사실상 이식이 없다면 뿌리 손상이 야기되지 않기 때문에 카나마이신 용액 내에 침지되고 토양에 직접 씨뿌려진 예비 실험에서 왜소한 식물은 발견되지 않았다(반면 식물의 약 70%가 어느 정도 왜소증을 나타냄).
라인 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 11 및 12는 T2 종자를 생성하였고 견뎌내었다(도 17). 각 T2 라인은 하나의 형질전환체만을 생장시키고 현재 분석 중인 12를 제외하고는 서브라인 A-H를 지닌다.
생장 AteIF-5A(센스 생장 AteIF-5A)을 과발현하는 아라비돕시스 탈리아나 식물
센스 생장 AteIF-5A의 T1 세대 종자가 선택 배지 상에서 생장되었고 16개 형질전환체가 생장되었다(도 18). 형질전환체는 그의 수명에 대해 사진촬영되었다. 표현형은 야생형과 동일한 것부터(라인 1, 2, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16) 다소 왜소하고 황화된 것(라인 2, 4 및 9; 도 19)까지 다양하였다. 모든 라인은 T2로 되었고 각 라인은 A-H로 표지된 8개의 서브라인을 지녔다. 라인 12는 T2의 형질전환체를 생성하지 않았고 야생형으로 간주되었다. T2 세대 식물은 T1 세대 식물보다 더욱 더 과장된 표현형을 지녔다. T3까지 진행된 라인은 더욱 상세히 논의될 것이다.
센스 생장 AteIF-5A T2 세대 라인은 생장 AteIF-5A 트랜스유전자의 발현 수준에 따른 그룹으로 특성화되었다. 웨스턴 블럿이 각 라인으로부터의 줄기에서 난 잎으로부터 추출된 단백질에 대해 수행되었다(도 20). 대부분의 서브라인 A-H가 라인 내의 유사한 표현형을 증명하였기 때문에 웨스턴 블럿은 생장 AteIF-5A의 발현 수준의 일반적은 개요를 획득하기 위해 각 라인의 서브라인 A에 대해서만 수행되었다. 야생형 식물 및 빈 이원 벡터를 포함한 식물의 줄기에서 난 잎으로부터의 단백질이 겔 상에서 대조군으로 사용되었다. 이들 서브라인에서 관찰된 발현 수준은 고(라인 1, 2, 3, 10, 13), 중(라인 4, 5, 6, 15) 저(라인 7, 8, 9, 14) 또는 무(라인 11, 16, 야생형 및 이원 대조군)으로 분류될 수 있다. 또한 블럿은 노화-유도된 AteIF-5A 및 손상-유도된 AteIF-5A에 대한 항체로 프로브되었다. 이 들 웨스턴은 다른 이소폼 양의 유의적인 양이 검출되지 않았기 때문에 센스 생장 AteIF-5A 라인 내에서의 발현 증가가 다른 AteIF-5A 이소폼의 일반적인 상향 조절이 아닌 생장 AteIF-5A에 기인함을 나타내었다. 또한 이는 이소폼 특이적 항체의 특이성이 수용 가능함을 증명하였다.
T3까지 관철된 센스 생장 AteIF-5A 라인은 생장 AteIF-5A의 발현 수준뿐만 아니라 표현형에 기반하여 선택되었다(각 라인의 표현형 요약에 대한 표 1 참조). 발현 수준의 각 카테고리로부터의 2개 라인이 선택되었다. 관철될 라인은 1A, 2D, 4D, 15A, 8D, 9H, 11C 및 16C이다.
도 20에서 웨스턴 블럿에 따른 라인 1은 생장 AteIF-5A 발현의 높은 수준을 지닌다. 이들 식물은 야생형 식물과 비교시 완전히 원형인 잎을 지닌 크고 암록색의 로제트를 지녔다(도 21). 또한 라인 1으로부터의 로제트는 잎이 모두 동일한 방향으로 감긴 윤생 표현형을 지녔다. 이들 센스 생장 AteIF-5A 식물은 야생형보다 다소 후에 추대되었다. 또한 라인 2는 높은 수준의 생장 AteIF-5A 발현을 증명하였으나 이들 식물이 작고 황화되었다는 점에서 라인 1과 달랐다(도 22). 또한 라인 2 식물은 야생형 및 이원 대조군 식물보다 더 늦게 추대되었고 또한 더 작은 추대(약 반 크기) 및 더 적은 장각과를 생성하였다. 중간 수준의 발현 라인 중에서 라인 4는 야생형 및 이원 대조군 식물보다 바로 며칠 전에 추대됨을 나타내었으나 잎/로제트 크리 및 추대 크기면에서 야생형과 동일함을 나타내었다. 생 장 AteIF-5A의 중간 수준 발현을 지닌 두 번째 라인은 라인 15이다. 라인 4와 같이 이들 식물은 야생형과 매우 유사하나 로제트가 확보한 지역이 대조군보다 더 컸다(도 23 및 24). 또한 로제트의 잎은 대조군보다 말단에서 더 둥글게 나타났다. 그러나 추대는 뚜렷한 표현형을 지닌 것으로 나타내지 않았다.
T3까지 진행될 낮은 발현 센스 생장 AteIF-5A 라인은 라인 8 및 9까지이다. 라인 8은 대조군 식물과 비교시 매우 큰 잎 및 큰 로제트를 지녔다(도 25). 또한 잎은 대조군 식물보다 더 넓고 둥글게 보였다. 추대 시간, 추대 크기 및 수는 대조군과 일치하는 것으로 보였다. 센스 생장 AteIF-5A 라인 9는 라인 8와 유사한 잎 형태를 지녔으나 더욱 더 노란색이고 작았다(도 26). 라인 2에서와 같이(높은 발현 라인 중의 하나) 이들 식물은 왜소한 생장, 짧은 추대를 나타내었으나 라인 2와 달리 대조군 식물과 동일하게 추대되었다.
웨스턴 블럿에 따른 센스 생장 AteIF-5A 식물의 2개 라인 11 및 16(도 20)은 생장 AteIF-5A의 상향 조절된 발현을 지니지 않는다. 이는 내생적 유전자뿐만 아니라 트랜스유전자의 동시 억제에 기인한다. 이들 식물이 대조군과 유사하게 보이지 않으나(도 27 및 도 28) 트랜스유전자가 여러 이유로 라인 11 및 16의 게놈 내로 통합된 것으로 여겨진다. 첫 번째로 이들은 카나마이신 함유 MS 플레이트 상에서의 선택성에 의해 증명된 카나마이신 저항성을 지닌다. 두 번째로 라인 16의 로제트 크기, 잎 크기 및 추대 크기(도 28)는 대조군보다 적어도 50% 이상 크 다. 그러나 가장 강력한 증거는 그들이 생성한 T 3 종자의 크기 및 조성이다.
T3 종자는 센스 생장 AteIF-5A 식물의 모든 라인으로부터 측정되었다. 사진이 각 라인에서 촬영되었고(도 29에서 가장 큰 것과 가장 작은 것이 하이라이트되어 있음), 측정은 교정을 위해 사용된 사진에서 마이크로미터로 인 실리코(in silico)로 이루어졌다. 각 라인 및 대조군에 있어서 가장 큰 종자의 10개가 측정되었고 교정에 사용되었다. 높은 발현 라인 2는 야생형 및 이원 대조군보다 3배 큰 종자를 지님이 발견되었다. 반면에 가장 낮은 발현을 증명한 라인(라인 11 및 16)은 야생형 및 이원 대조군 종자 크기의 약 88% 정도로 가장 작은 종자를 지녔다. 각 라인의 평균 종자 크기는 nm3으로 표현되었고 거의 타원체인 아라비돕시스 탈리아나로부터의 종자로서 타원체 부피에 대한 방정식을 이용하여 계산되었다. 대조군 종자의 측정 크기는 Boyes et al(2001)에 의해 측정된 발표된 가이드라인과 맞았다. 개체 종자의 측정 크기 및 총 종자 수확량(중량 및 부피 모두)로부터 평균 개체 종자 중량이 계산되었고 플롯되었다(도 31). 대조군 종자와 다른 크기를 증명한 대부분의 라인이 개제 종자 중량에서도 동일한 경향을 지님이 나타났다. 실제로 종자 중량이 종자 크기(부피)에 대해 플롯될 때 상관관계는 R2=0.7412로 거의 직선이었다. 증가된 밀도(이들 중 3개) 또는 감소된 밀도(이들 중 2개)을 지닌 이상값인 5개 라인이 존재하였다. 증가된 밀도를 지닌 이들 라인의 하나는 8D이고 T3 세대까지 진행될 것이다. 모든 T2 세대 식물로부터의 총 종자 수확량은 몇가지 경향을 지닌 매우 가변적이다. 그러나 하나의 주목할 만한 라인은 중간 발현 센스 생장 AteIF-5A 라인 4D이고, 이는 가장 많은 종자(중량 및 부피 모두)를 생성하였다. 실제로 4D는 대조군 식물보다 2.5배 이상을 생성하였고 T3으로 진행될 것이다.
T3 종자는 앞서 기술된 바와 같이 선택 배지 상에 플레이트되었다. 라인 1A, 2D, 4D, 15A, 8D, 8H, 11C 및 16C가 토양으로 이식되었다. 센스 생장 AteIF-5A의 일부 다른 서브라인은 발아되지 않았을 뿐만 아니라 모든 서브라인 중에서 가장 큰 종자를 지닌 라인 2H도 발아되지 않았다. 라인 11로부터의 식물(동시 억제 라인 중의 하나)은 이렇나 시기에 일반적으로 발견되는 바와 같이 건강하지 않았다. 또한 이들 종자는 가장 작게 측정된 것 중의 하나였다. 이들 라인은 여전히 비-카나마이신 저항성 식물일 뿐만 아니라 종자가 모든 라인으로부터 발아하지 않기 때문에 여전히 분리하고 있는 것으로 보인다. 동일한 방식으로 처리된 대조군 종자 모두 발아되었기 때문에 이는 기술이 아닌 트랜스유전자의 부작용이다.
(실시예 22)
아라비돕시스 노화-유도된 eIF-5A의 특성화
전체 길이 아라비돕시스 노화-유도된 eIF-5A를 수득하기 위한 방법론
아라비돕시스 cDNA 라이브러리로부터의 eIF-5A 유전자를 PCR하기 위해 벡터 프라이머 T3 & T7와 결합하는, 일부 식물 eIF-5A 유전자에 기반한 퇴화 프라이머가 사용되었다. 특히 eIF-5A 유전자의 5' 구역이 T3 프라이머(라이브러리 벡터 내 F5A 유전자의 업스트림에 위치)와 다운스트림(역-방향) 퇴화 프라이머의 중의 하나를 이용한 PCR 반응으로부터 수득되었다. 이와 유사하게 유전자의 3' 구역은 T7 프라이머(라이브러리 벡터 내 eIF-5A 유전자의 다운스트림에 위치)와 업스트림(전방-방향) 퇴화 프라이머 중의 하나를 이용한 PCR 반응으로부터 수득되었다. 전체-길이 eIF-5A 유전자는 유전자의 5' 구역 및 3' 구역의 정렬 분석으로부터 유래되었다.
각 PCR 반응에 대한 2∼3개 주요 생성물이 존재한다. 이들 단편은 pBluescript 플라스미드 내로 클론되었고 시퀀스되었다. 유전자 맵핑 분석 eIF-5A 양성 PCR 단편이 확인되었다. 아라비돕시스에 대해 단 하나의 업스트림 및 다운스트림 양성 eIF-5A PCR 단편이 존재한다.
아라비돕시스 eIF-5A에 대한 특정 5'- 및 3'-말단 프라이머가 5' 및 3' PCR 단편 시퀀싱 결과에 따라 고안되었다. 전체-길이 아라비돕시스 eIF-5A 유전자는 그들의 특정 5'- 및 3'-말단 프라이머 및 주형으로서 상응하는 cDNA 라이브러리를 이용한 PCR 반응으로부터 수득되었다. 전체-길이 유전자는 시퀀싱에 의해 추가 확인되었다. 결국 노화-유도된 eIF-5A로 명명된 하나의 아라비돕시스 eIF-5A 이소폼 유전자를 클론하였다.
T3 및 T7 프라이머:
Figure 112005074399539-PCT00013
아라비돕시스 eIF-5A에 대한 퇴화 프라이머:
전방(업스트림) 프라이머:
Figure 112005074399539-PCT00014
역방(다운스트림) 프라이머:
Figure 112005074399539-PCT00015
pKYLX71 벡터(SAG12 프로모터를 포함한) 내로의 아라비돕시스 안티센스 전체-길이 노화-유도된 eIF-5A의 서브클로닝
아라비돕시스 노화-유도된 eIF-5A에 특이적인(상동적) 프라이머, 안티센스 전체-길이 컨스트럭트: 전방 전체-길이 노화-유도된 eIF-5A 프라이머(30-머):
Figure 112005074399539-PCT00016
(주지: 밑줄친 부분은 pBluescript의 멀티플 클로닝 사이트(MCS) 내의 SacI 사이트 내로 PCR 단편의 5'-말단을 라이게이트하는데 사용된 SacI 인식 서열). 역방 전체-길이 노화-유도된 eIF-5A 프라이머(36-머): 5'-
Figure 112005074399539-PCT00017
(주지: 밑줄친 부분은 pBluescript의 MCS 내로의 라이게이션에 사용된 NotI 인식 서열).
pBluescript 벡터의 MCS 내 SacI및 NotI의 방향은 유전자가 이의 안티센스 방향으로 서브클론되게 하는 방향이다(즉, NotI 사이트는 SacI 사이트의 업스트림임).
(실시예 23)
SAG 12 프로모터가 안티센스 노화-유도된 아라비돕시스 전체-길이 eIF-5A를 발현하는데 사용됨
실험 증거는 "노화-관련 유전자" 또는 SAG 세트의 전사가 노화의 착수 동안 증가됨을 나타낸다(Lohman et al., 1994; Weaver et al., 1998). 실제로, 노화는 새로운 mRNA의 합성 및 아마도 다른 mRNA의 하향-조절과 함께 시작하는 것으로 보이고, 이는 단백질의 선택적 합성은 노화에 필수적임을 나타낸다(Nooden, 1988). 잎 노화 문제가 유전자 발현 내의 변화에 의해 달성된다는 것은 번역 가능한 mRNA 집단 내에서 발생하는 변화를 검출하기 위해 시험관 내 번역 후 겔 전기영동을 이용한 Watanabe and Imaseki(1982)에 의해 먼저 증명되었다. 이러한 초기 연구 및 시험관 내에서 번역된 단백질의 이후의 분석은 대부분의 많은 mRNA가 노화의 진행 동안 유의적으로 감소하고 다른 번역 가능한 mRNA는 증가함을 나타내었다(Watanabe and Imaseki, 1982; Davies and Grierson, 1989; Becker and Apel, 1993; Buchanan-Wollaston, 1994; Smart et al., 1995). 또한 노화 잎 조직의 mRNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리의 차별적 선별은 노화 동안 많은 유전자 발현이 하향-조절된 반면 다른 유전자의 발현이 상향-조절됨이 증명하였다. SAG는 아라비돕시스(Hensel et al., 1993; Taylor et al., 1993; Lohman et al., 1994; Oh et al, 1996), 아스파라거스(King et al., 1995), 보리(Becker and Apel, 1993), 브라시카 나푸스(Brassica napus)(Buchanana-Wollaston, 1994), 옥수수(Smart et al., 1995), 무(Azumi and Watanabe, 1991) 및 토마토(Davies and Grierson, 1989; Drake et al., 1996)을 포함한 다양한 식물종으로부터 확인되었다.
노화는 잎의 말단에서 시작하여 마지막으로 엽맥까지 도달하는 특성적으로 패턴화된 잎 황화로서 형태학적으로 확인될 수 있다(Weaver et al., 1998). 아라비돕시스 탈리아나 로제트 잎에서 관찰 가능한 노화는 발아 약 21일 후 그때에 SAG 12의 극적인 상향 조절로 나타난다. 어린 잎에서 검출 가능한 발현이 없는 경우 SAG 12는 ∼20% 황화된 후 노후한 잎에서 유도되나 황화 잎을 유도하지 않는 처리에 의해 유도될 수 없다(Weaver et al., 1998). 자연적 노화에 대한 높은 정도의 특이성은 SAG 12의 유전자 생성물이 시스테인 프로테아제와의 유사성을 나타낸다는 사실에 의해 설명될 수 있고 이는 노화 동안 단백질 전도에 관련된다(Lohman et al., 1994; Weaver et al., 1998).
형질전환 식물의 설명
형질전환 아라비돕시스 식물은 발아 약 21일 후 스트레스-유도된 노화의 이벤트가 아닌 자연적 잎 노화의 착수시 활성화되는(Noh and Amasino, 1994) SAG 12(잎 노화-특이적) 프로모터의 조절 하에서 전체-길이 안티센스 노화-유도된 eIF-5A 트랜스유전자를 발현하여 생성되었다. 이 시점에서 형질전환 식물은 억제된 전체-길이 노화-유도된 eIF-5A 발현의 표현형 특성을 발현한다. 로제트 잎은 3∼8주령 형질전환 아라비돕시스 안티센스 전체-길이 노화-유도된 eIF-5A 식물로부터 수확되었다.
SAG 12 프로모터의 조절 하의 상동적 형질전환 안티센스 노화-유도된 eIF-5A 아라비돕시스 탈리아나 식물의 생성을 위한 방법론
pKYLX71 내로 SAG 12-안티센스-전체-길이 노화-유도된 eIF-5A 컨스트럭트의 삽입
먼저, 이중 35S 프로모터를 제거하기 위해 플라스미드 pKYLX71이 EcoRI 및 HindⅢ로 절단되었고, 수득된 점착성 말단은 Klenow 효소로 채워져서 무딘(blunt) 말단을 생성하였다. 이후 프로모터가 없는 pKYLX71는 라이게이트되어 플라스미드를 재순환시켰다.
두 번째로 아라비돕시스 SAG 12 프로모터는 하기 기술된 바와 같이 SalI 및 XbaI를 포함한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 게놈 DNA로부터 증폭되었다. 이후 이러한 프로모터 서열은 제한 효소 SalI 및 XbaI를 이용하여 pBluescript의 멀티플 클로닝 사이트(MCS) 내로 삽입된 후 T4 DNA 리가제로 라이게이션되었다.
전방 SAG 12 프라이머는
Figure 112005074399539-PCT00018
(밑줄친 부분은 pBluescript의 멀티플 클로닝 사이트(MCS) 내의 SalI 내로 PCR 단편의 5'-말단을 라이게이트하는데 사용된 SalI 인식 사이트). 역방 SAG 12 프랄이머는
Figure 112005074399539-PCT00019
(밑줄친 부분은 pBluescript의 멀티플 클로닝 사이트(MCS) 내의 SacI 내로 PCR 단편의 5'-말단을 라이게이트하는데 사용된 XbaI 인식 사이트).
세 번째로 pBlueScript-SAG 12:안티센스-전체 길이-노화-유도된 eIF-5A 컨스트럭트를 생성하기 위해 전체 길이 노화-유도된 eIF-5A가 하기에 개요된 바와 같이 SacI 및 NotI 제한 사이트를 지닌 프라이머를 이용하여 아라비돕시스 cDNA 라이브러리로부터 PCR에 의해 증폭되었고 앞선 단락에 기술된 pBluscript-SAG 12 내로 서브클론되었다. MCS 내의 SacI 및 NotI의 방향은 유전자가 그의 안티센스 방향으로 서브클론되는 방향임(즉, NotI 사이트가 SacI 사이트의 업스트림)이 주지되어야 한다.
전방 전체-길이 노화-유도된 eIF-5A 프라이머는
Figure 112005074399539-PCT00020
(주지: 밑줄친 부분은 pBluescript-SAG 12 벡터의 멀티플 클로닝 사이트(MCS) 내의 SacI 내로 PCR 단편의 5'-말단을 라이게이트하는데 사용된 SacI 인식 사이트). 역방 전체-길이 노화-유도된 eIF-5A 프라이머는
Figure 112005074399539-PCT00021
(주지: 밑줄친 부분은 pBluescript-SAG 12 벡터의 멀티플 클로닝 사이트(MCS) 내로의 라이게이션에 사용된 NotI 인식 사이트).
마지막으로 원하는 컨스트럭트가 SacI 및 XhoI로 pKYLX71을 분해하고 SalI 및 SacI를 지닌 pBluescript로부터 SAG 12: 전체-길이 노화-유도된 eIF-5A 카세트를 절단함으로서 이원 벡터 pKYLX71을 생성하였다.
XhoI 및 SalI 점착성 말단은 부분적으로 상보적이다. 따라서 분해된 돌출의 이들 2 세트(특히, SacI를 지닌 SacI 및 SalI를 지닌 XhoI)는 T4 DNA 리가제와 함께 라이게이트되어 최종 컨스트럭트를 생성할 수 있었다(pKYLX71 내의 SAG 12:안티센스 노화-유도된 eIF-5A).
형질전환 및 T1 종자 수확
pKYLX71-SAG 12:안티센스-eIF-5A 컨스트럭트는 E. coli DHα 세포 내에서 정제되었고, 분리되었고 적합한 아그로박테리움 균주 내로 일렉트로포레이트되었다. 이후 박테리아는 4.5 주령 야생형 아라비돕시스 식물을 침투하였고 수득된 침투된 식물은 "T0" 식물로 명명되었으며, 이후 이는 그이 수명까지 생장되었다. 종자가 수확되었고 수집되었고 T1 종자로 명명되었다. T1 종자의 10개 플레이트가 대조군으로서 야생형과 함께 카나마이신 저항성에 대해 선별되었고(1/2 MS 염 및 50 ㎍ 카나마이신/ml); pKYLX71-SAG 12-안티센스-eIF-5A 컨스트럭트를 포함한 종자만이 카나마이신(K50) 배지 상에서 생존하고 생장하였다. 24개 T1 묘목이 이들 플레이트로부터 선택되어 토양으로 옮겨졌다. T1 형질전환 식물로부터 수확된 종자는 T2 종자로 표지되었다. 각 묘목은 하나의 식물 라인을 산출하였다(#1= 1 식물을 포함한 1 라인, #2= 1 식물을 포함한 1 라인 등).
표현형의 선별 및 확인
카나마이신 저항성 T1 종자가 확인되면 T2, T3 및 T4 식물의 성공적인 세대가 생장되었다. K50 배지 상에서 종자를 선별함으로서 유전적 컨스트럭트를 유전받고 컨스트럭트에 상동접합성인 식물을 구별하는 것이 가능하였다. 왜소한 생장의 표현형적 발현은 토양에서 생장시 하나의 T3 식물 라인에서 관찰되었다. 그러나 동일한 세트의 종자가 동일한 조건에서 재-생장되었고 표현형은 관찰되지 않았다.
24개 T1 식물로부터 4개 라인이 높은 종자 수확량에 기초하여 선택되었고(라인 T2.14, T2.18, T2.19 및 T2.23) 대조군으로서 야생형 종자와 함께 K50 배지 상에 플레이트되었다. 각 라인으로부터의 약 75% 종자가 K50 배지 상에서 생존하였고 소, 중, 대의 크기 카테고리에 포함되었다. 각 라인으로부터 소, 중, 대 묘목이 플레이트로부터 제거되었고 토양에 심어졌다. 온실 조건 하에서 소 묘목은 중 및 대 대응물만큼 빨리 회복되지 않았다. 6주에 소 식물은 추대의 사인을 나타내지 시작한 반면 다른 식물은 추대되고 개화되었다. 전체적으로 6개 형질전환 T2 식물(총 3 라인 X 8 식물 = 96 형질전환 식물)이 추대 내에서의 극적인 지연을 증명하였고 "늦은 추대" 식물로 간주되었다. 이들 식물의 종자 수확량은 다른 형질전환체보다 극적으로 낮았다.
96개 T2 식물로부터 3개 라인이 T3 식물을 생성하는데 선택되었다(늦은 추대인 T3.19.S8 및 T3.14.L7; 및 늦은 추대가 아닌 T3.23.S3). K50 배지 상에 놓였을 때 이들 라인은 상동접합성 생존을 나타내었다. 13개 묘목이 토양으로 이식되었다(화분 당 10개 묘목). 이들 식물 세트로부터 극적인 왜소증 표현형이 T3.14.L7 식물 라인에서 관찰되었다. T4 종자가 수집되었고 낮은 종자 수확량이 본 라인엔서 관찰되었다. 조밀한 생장(조밀한 장각과 생장, 많은 가지) 표현형이 T3.19.S8에서 관찰된 반면 야생형과 유사한 표현형은 T3.23.S3에서 관찰되었다. 3개 형질전환 라인으로부터의 종자 크기가 비교되었으나 통계적으로 유의적인 차이는 측정되지 않았다. 또한 엽록소 수준이 분석되었으나 야생형 대조군과 통계적으로 유의적인 차이가 측정되지 않았다.
다음 세대 식물을 수득하기 위해 라인 T3.19.S8, T3.14.L7 및 T3.23.S3의 T4 종자가 선별되었고 사멸된 야생형-종자와 비교시 유전된 유전자 컨스트럭트의 증거를 나타내었다. 그러나 개별적인 평면 내에 심어졌을 때 왜소증 표현형은 표현되지 않았고 이는 eIF-5A 안티센스 트랜스유전자가 유실되었음을 나타내었다. 마지막으로 모든 T5 식물로부터 수집된 종자는 K50 플레이트 상에서 선별되었고 카나마이신 저항성의 증거를 나타내었다. 안티센스 트랜스유전자가 유실되었는지를 확인하기 위해 연구가 진행중이고, 이들 T4 식물은 쌍을 이루지 않는다.
8개 딸 라인이 모계 T2.14, T2.19 및 T2.23으로부터 선택되었고 대조군으로서 야생형 종자와 함께 K50 배지 상에서 선별되었다. 낮은 종자 수확량에 기반하여 3개 라인이 선택되었다: T3.14.L8, T3.14.S8 및 T3.23.S1. 선택된 다른 5개 라인은: T3.18.S7, T3.18.S2, T3.19.S1, T3.19.S5 및 T3.23.S6이다. K50 배지 상 에서 선별된 모든 라인은 상동접합성 생존을 나타낸 반면 T3.14.L8, T3.14.S8 및 T3.23.S6은 이형접합성 생존을 나타내었다. 생존한 라인 T3.14.L8 및 T3.14.S8로부터의 묘목은 녹색 도관 조직을 지닌 백색인 반면 생존한 T3.23.S6로부터의 묘목은 전체적으로 암록색이었다. 이들 묘목은 이식을 위해 선택되었다. 전체적으로 각 라인으로부터의 28개 묘목이 세포 내로 이식되었고 온실 조건으로 생장되었다.
T3.14.L8 및 T3.23.S1 및 T3.18.S7, T3.18.S2, T3.19.S1, T3.19.S5, T3.23.S1 및 T3.23.S6 내의 일부 식물을 제외하고 3주에 모든 라인이 추대하기 시작하였다. 불규칙적인 로제트 잎 형태(두 번째 쌍 잎 표현형의 신장)가 T3.14.L8 및 T3.14.S8 라인에서 관찰되었다. 5주에 증가된 수의 로제트 잎의 추가적인 불규칙적 잎 형태 및 오그라든-말단 로제트 잎 표현형도 T3.18.S7 및 T3.23.S6에서 관찰되었다. 야생형보다 작은 로제트가 라인 T3.23.S1, T3.19.S1 및 T3.19.S5에서 관찰되었다. 7주에 가늘고 긴 줄기 및 줄기 신장이 없는 표현형이 라인 T3.18.S7, T3.18.S2, T3.19.S1, T3.119.S5, T3.23.S1 및 T3.23.S6에서 관찰되었다. 각 식물의 첫 번째 및 두 번째 줄기에서 난 잎이 노화 eIF-5A 단백질 발현의 조사를 위해 각각 5주 및 6주에 수집되었다.
(실시예 24)
산소 방출의 측정
잎이 수확되었고 무게 측정 전에 면적이 측정되었다. 잎은 막자사발과 막자로 1 ml의 차가운 가스 제거된 분쇄 완충액을 이용하여 미세 분말로 분쇄되었다. 이후 균질체는 에펜도르프 튜브로 옮겨졌고 얼음에 즉시 놓였다. 토마토 잎의 경우 분리된 균질체는 Miraclothm 조각을 통해 여과될 필요가 있었다.
모든 표본으로부터의 50 ㎕의 균질체가 5 ml의 분쇄 완충액 및 25 ㎕ DCPIP(2,6-디클로로페놀 인도페놀)을 포함한 10 ml 시험관에 첨가되었다. 표본은 잘 진탕되었고 이후 표본 세트 하나는 램프 쌍에 의한 조명 하에 15분간 놓였고 두 번째 표본 세트는 15분간 암조건에 놓였다. 반응을 정지시키기 위해 15분 인큐베이션 후 50 ㎕의 DCMU(3-(3,4-디클로로페닐)-1,1 디메틸우레아)가 두 표본 세트에 첨가된 후 14,000 g로 2분간 마이크로원심분리기에 의해 원심분리되었다. 수집된 상청액의 흡광도는 블랭크로서 분쇄 완충액을 이용하여 590 nm에서 판독되었다.
이러한 분석의 몰 흡광 계수는 16 x 103이고, 즉, 리터 당 1 몰 농도의 변화가 DCPIP 감소된/h/ml의 16 x 103 μmol = (흡광도 차이) x [1/16 x 103(mole/l)] x [반응 부피(ml)/ 103(ml/l)] x [106(μmole/mole)] x [60(분/시)/반응시간(분)] x [1/표본 부피(ml)]에 의해 용액의 흡광도를 변화시킨다.
감소된 DCPIP의 모든 2 몰에 대해 1 몰의 O2가 생성된다. 참조: Allen J.F. and Holmes N.G., 1986 Electron Transport and Redox Titrations in Photosynthesis: Energy Transduction. Edited by M.F. Hipkins & N.R. Baker., IRL Press, Oxford pp 107-108.
(실시예 25)
전분의 정량적 측정
토마토 줄기 내의 전분 함량이 Lustinec et al. Quantitative determination of starch, amylose, and amylopectin in plant tissues using glass fiber pepper. Anal. Biochem. 132:265-271(1983).로부터 채택된 방법을 이용하여 측정되었다. 토마토 줄기 조직은 Omnimixer(각각 5초의 12 반복)를 이용 하여 3 부피의 물에 균질화된 후 Polystron 균질기(30초)로 균질화되었다. 균질체는 분석전에 -20℃에서 10 ml 알리쿼트로 보관되었다. 분석을 위해 10 ml 균질체가 해동되었고 동일 부피의 농축된 과염소산(HClO4, 70% w/w)으로 혼합되었고 20분간 상온에서 인큐베이트되어 전분을 용해하였다. 동시에 감자 전분의 일부 용액(0.1∼1.0 mg/ml 범위)은 표준 곡선을 생성하기 위해 토마토 줄기 표본과 나란히 처리되었다. 균질체(또는 감자 전분 표분 용액)가 교반되었고 흡입기에 부착된 진공 플라스크를 이용하여 Whatman GF/A 유리 마이크로필터 종이(9.0 cm 지름)를 통해 여과되었다. 여과물 1 ml가 3 ml의 요오드 용액 A(8 mM I2, 17 mM KI, 514 mM NaCl)과 혼합되었고 4℃에서 30분간 인큐베이트되어 전분-요오드 침전물을 형성하였다. 침전물은 흡입기에 부착된 진공 플라스크를 이용하여 Whatman GF/A 유리 마이크로필터 종이(9.0 cm 지름) 상에 수집된 후 하기 용액으로 여과물을 세척하였다: 10 ml 요오드 용액 B(83 mM I2, 180 mM KI, 8% 과염소산[HClO4])로 1회; 5 ml 에탄올-NaCl 용액(67% 에탄올, 342 mM NaCl)로 1회; 3 ml 에탄올-NaOH 용액(67% 에탄올, 250 mM NaOH)으로 2회. 에탄올이 증발되면 마이크로필터 종이가 흡입기로부터 제거되었고 나사-마개 유리 튜브로 삽입되었다. 황산[H2SO4](9 ml의 0.75 M 용액)이 튜브에 첨가되었고 튜브는 30분간 끓는 물에서 인큐베이트되었다. 용출액 1 ml-알리쿼트 3개가 유리 시험관 내로 피펫팅되었고 1 ml의 5% 페놀과 혼합되었고 5 ml의 농축 H2SO4과 빨리 혼합되었다. 튜브는 볼텍스되었고 30분간 상온에서 인큐베이트되어 발색되었다. 동시에 분광광도계 측정을 위한 블랭크가 1 m의 0.75 M H2SO4를 1 ml의 5% 페놀과 혼합시키고 5 ml의 농축 H2SO4을 빨리 첨가시킴으로서 제조되었고; 블랭크도 상온에서 30분간 인큐베이트되었다. 분광광도계는 블랭크를 이용하여 480 nm에서 보정되었고, 모든 표본 및 감자 전분 표준의 O.D가 측정되고 기록되었다. 표준 곡선은 감자 전분 용액을 이용하여 준비되었고 각 표본 내 전분 양을 삽입(interpolate)시키는데 이용되었다.
(실시예 26)
아라비돕시스 탈리아나(콜롬비아 생태형)는 아라비돕시스 탈리아나 센스 노화-유도된 eIF-5A(At-eIF-5A) 및 토마토 센스 노화-유도된 eIF-5A 유전자에 의해 독립적으로 형질전환되었다. 이들 유전자는 형질전환 식물의 생활환에서 구성적으로 발현되었다. 이들 식물의 화서 줄기는 물관부 발달의 유의적인 증가를 나타내었다. 도 89∼94 참조.
형질전환 및 대조군 식물의 종자는 1/2 MS 배지 한천 플레이트 상에 씨뿌려졌고 9일간 22℃, 80% rh 및 16 h 광/일로 그로쓰 챔버에서 유지되었다. 이후 묘목이 통상의 토양을 지닌 32-웰 플랫으로 옮겨졌고 48일간 상기와 동일한 조건으로 유지되었다. 주요 화서 줄기가 현미경 관찰을 위해 선택되었다. 횡단면은 로제트로부터 2 mm 위의 줄기 기부로부터 손으로 절단되었다. 섹션은 플로로글루시놀(phloroglucinol)-HCl 방법으로 염색되었다. 이러한 연령에서 줄기 물관부가 최대 발달을 달성하였음이 발견하였다. 물관부 크기면에서의 형질전환과 대조군 식물 사이의 비교가 이루어졌다. 더욱이 형질전환 및 대조군 식물 모두에서 체관부 및 속에 대한 측정이 수행되었다.
조직 면적에 대한 측정은 하기와 같았다. 횡단면은 Zeiss 현미경으로 사진촬영되었고 현미경 사진은 Photoshop을 이용하여 디지털화되었다. 이들 이미지는 종이로 인쇄되었고 다른 조직이 절단되었고 그의 면적이 면적-측정기에 의해 측정되었다. 각 조직의 실제 면적을 계산하기 위해 하기 식이 이용되었다: 실제 면적 = (종이 상의 개체 조직의 면적)/(배율)2
따라서 노화-유도된 eIF-5A도 물관생성과 관련된 프로그램된 세포 사멸에 관련됨을 나타낸다. 아라비돕시스 내의 노화-유도된 AteIF-5A 구성적 안티센스 억제는 물관부 세포층의 수뿐만 아니라 화서 줄기의 두께를 감소시켰다. 반대로 아라비돕시스 또는 토마토 노화-유도된 eIF-5A가 구성적으로 과발현된 식물의 화서 줄기는 상응하는 야생형 식물보다 평균 1.7-배 더 두꺼웠고 화서 줄기 횡단면 당 총 물관부 면적은 2배 이상이었다. 과발현 형질전환 식물은 매우 증가된 로제트 잎 생물량을 지녔고 야생형 식물보다 더 빨리 생장되었고, 이는 증가된 영양분 흡수를 반영한다. 동일한 표현형은 토마토로부터의 노화-유도된 eIF-5A 이소폼이 아라비돕시스 식물 내에서 과발현될 때 관찰되었다. 이들 결과는 노화-유도된 eIF-5A 이소폼이 잎 및 꽃 노화를 조절할 뿐만 아니라 물관생성에도 관련됨을 종합적으로 나타낸다.
(실시예 27)
디옥시하이푸신 신타제의 억제는 대기 내에서 미리-포장된 절단 상추의 갈변을 지연시킴
통상적으로-사용되는 미리-포장된 샐러드는 일반적으로 제품의 저장수명을 연장시키기 위해 산소 수준이 그의 대기 농도 이하로 크게 감소된 조절된 대기 조건 하에서 보관된다. 미리-포장된 샐러드의 가장 일반적인 부패 징후는 상추 절단 표면의 갈변이다. 조절된 대기 포장이 갈변의 지연을 달성하더라도 악취 및 불쾌취를 초래할 수 있다. 본 연구에서 디옥시하이푸신 신타제(DHS)의 하향-조절은 상추의 절단 표면 상의 갈변을 지연시키기 위한 대안적 전략으로서의 잠재성을 지님을 나타내었다. DHS는 진핵성 번역 개시 인자 5A(eIF-5A)의 활성화를 촉매하고, 이는 mRNA의 집단을 선택하기 위한 핵세포질성 셔틀 단백질로서 작용한다. DHS는 대기 조건 하에서 갈변의 착수의 유의적인 지연을 유발한 DHS 발현(안티센스 기술에 의한)의 억제만큼 크게 상추 절단의 갈변에 중요한 역학을 하는 것으로 보인다. 특히, 80% 이상의 야생형 상추 식물의 절단 세그먼트는 절단 6일 후 갈변을 나타낸 반면 0% 갈변을 나타내는 일부 개체 식물과 함께 5개 분리 라인으로부터의 형질전환 식물의 절단 세그먼트의 평균 27%만이 동일한 기간 동안 갈변되었다.
(실시예 28)
카놀라 내의 디옥시하이푸신 신타제 발현의 억제는 종자 수확량을 증가시킴
디옥시하이푸신 신타제(DHS)는 불활성 진핵성 번역 개시 인자-5A(eIF-5A)를 번역을 촉진시킬 수 있는 활성 형태로 전환시키는 2개 효소 반응의 첫 번째를 매개 한다. 카놀라(Brassica napus cv Westar)를 인코드하는 DHS 전체-길이 cDNA 클론이 노화 잎으로부터 제조된 cDNA 발현 라이브러리로부터 분리되었다. DHS는 구성적 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV-35S) 프로모터의 조절 하에서 카놀라 DHS cDNA의 안티센스 3'-UTR를 발현함으로서 형질전환 카놀라 식물 내에서 억제되었다. 이러한 안티센스 트랜스유전자를 발현하는 식물은 잎 DHS 단백질 수준을 감소시켰고 지연된 자연적 잎 노화를 나타내었다. 또한 DHS 발현의 억제는 1.5∼2배까지 로제트 잎 크기를 증가시켰고, 90%까지 종자 수확량을 증가시켰다. 카놀라 내의 이들 DHS 억제의 다면발현성 효과는 아라비돕시스에서 앞서 수득된 결과와 일치하고(Wang et al., 2003, Plant Mol. Biol. 52:1223-1235), 이러한 단백질이 단백질 발달 및 노화에 중심 역할을 함을 나타낸다.
(실시예 29)
디옥시하이푸신 신타제 억제제의 투여 및 디옥시하이푸신 신타제의 안티센스에 의한 카네이션 꽃의 화병 수명의 연장
디옥시하이푸신 신타제(DHS)를 인코드하는 전체-길이 cDNA 클론(AF296079)은 카네이션 화판으로부터 분리되었다. DHS는 불활성 진핵성 번역 개시 인자-5A(eIF-5A)를 번역을 촉진시킬 수 있는 활성 형태로 전환시키는 2개 효소 반응의 첫 번째를 매개한다. 노던 분석은 DHS 발현은 카네이션 꽃 화판의 노화와 상호관련됨을 나타내었다. 절단 카네이션 꽃의 디아미노푸탄(푸트레신), 디아미노프로 판, 디아미노헥산, 디아미노옥탄 및 스퍼미딘을 포함한 DHS 반응의 억제제로의 처리는 83%까지 꽃의 화병 수명을 연장시켰다. 카네이션 꽃 노화에서 DHS의 역할을 더욱 한정적으로 평가하기 위해 단백질 발현은 아그로박테리움 형질전환을 통해 구성적 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터의 조절 하에서 카네이션 DHS cDNA의 안티센스 3'-UTR을 도입시킴으로서 형질전환 식물 내에서 억제되었다. 감소된 DHS 발현을 지닌 형질전환 꽃의 3개 라인이 분석되었고 야생형-꽃에 비해 더 긴 화병-수명을 지니는 것으로 나타났다. 실제로 라인 중의 하나는 >100%의 화병 수명의 증가를 나타내었다. 이들 발견은 DHS가 꽃 노화에 중심 역할을 함을 나타낸다.
(실시예 30)
아라비돕시스 내 디옥시하이푸신 신타제의 억제에 의해 유도된 지연된 추대 표현형은 GA3의 처리에 의해 감소될 수 있음
디옥시하이푸신 신타제(DHS)는 진핵성 번역 개시 인자 5A(eIF-5A)의 후-번역 활성화에 필수적인 편재하는 효소이고 정상 식물 생장 및 발달에 필수적인 것으로 나타난다. DHS는 노화-유도된 SAG 12 프로모터의 조절 하에서 형질전환 식물 내에서 전체-길이 안티센스 아라비돕시스 DHS cDNA를 발현함으로서 아라비돕시스 내에서 억제되었다. 트랜스유전자를 발현하는 식물은 잎 DHS 단백질 수준을 감소시켰고, 지연된 추대 및 잎 노화 착수의 선고된 지연(2∼5주)을 나타내었다. 또한 생물량 또는 종자 수확량 내의 감소를 유발하지 않더라도 추대는 더욱 짧았다. GA3로의 형질전환 식물의 처리는 지연된 추대 표현형을 나타내었다. 유사한 표현형은 덱사메타손(dexamethasone, DEX)을 투여함으로서 달성될 수 있는 글루카코티코이드(glucacorticoid)-유도성 프로모터(GCI)의 조절 하에서 DHS의 안티센스 억제에 의해 수득되었다. 다시, GA3의 투여는 이러한 표현형을 감소시켰다; 즉, GA3-처리된 형질전환 식물은 정상적으로 추대되었고, 추대는 정상 크기의 것이었고 잎 노화의 착수의 지연이 없었다. 이들 결과는 아라비돕시스 내 3가지 eIF-5A 이소폼의 하나 이상의 활성화를 통해 DHS가 GA 대사에 영향을 미침을 종합적으로 나타낸다.
참고문헌
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SEQUENCE LISTING <110> SENESCO TECHNOLOGIES, INC. THOMPSON, JOHN E. WANG, TZANN-WEI <120> ISOFORMS OF EIF-5A: SENESCENCE-INDUCED EIF5A; WOUNDING-INDUCED EIF-5A; GROWTH EIF-5A; AND DHS <130> 10799/130 <140> PCT/US04/19840 <141> 2004-06-08 <150> 09/725,019 <151> 2000-11-29 <150> 09/597,771 <151> 2000-06-19 <150> 09/348,675 <151> 1999-07-06 <150> 60/479,968 <151> 2003-06-20 <150> 60/479,969 <151> 2003-06-20 <150> 60/570,833 <151> 2004-05-14 <150> 60/570,835 <151> 2004-05-14 <160> 165 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 1584 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> CDS <222> (54)..(1196) <400> 1 cgcagaaact cgcggcggca gtcttgttcc gtacataatc ttggtctgca ata atg 56 Met 1 gga gaa gct ctg aag tac agt atc atg gac tca gta aga tcg gta gtt 104 Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Ile Met Asp Ser Val Arg Ser Val Val 5 10 15 ttc aaa gaa tcc gaa aat cta gaa ggt tct tgc act aaa atc gag ggc 152 Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys Ile Glu Gly 20 25 30 tac gac ttc aat aaa ggc gtt aac tat gct gag ctg atc aag tcc atg 200 Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr 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20 25 aag att gag ggt tat gat ttt aat caa ggt gta aac tat tcc aaa ctc 387 Lys Ile Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu 30 35 40 ttg caa tct ttc gct tct aat ggg ttt caa gcc tcg aat ctt gga gat 435 Leu Gln Ser Phe Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp 45 50 55 60 gcc att gaa gta gtt aat cat atg cta gat tgg agt ctg gca gat gag 483 Ala Ile Glu Val Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp Glu 65 70 75 gca cct gtg gac gat tgt agc gag gaa gag agg gat cct aaa ttc aga 531 Ala Pro Val Asp Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe Arg 80 85 90 gaa tct gtg aag tgc aaa gtg ttc ttg ggc ttt act tca aat ctt att 579 Glu Ser Val Lys Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Ile 95 100 105 tcc tct ggt gtt cgt gac aca att cgg tat ctc gtg caa cat cat atg 627 Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met 110 115 120 gtt gac gtg ata gta acg aca acc gga ggt ata gaa gaa gat cta ata 675 Val Asp Val Ile Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile 125 130 135 140 aaa gga aga tcc atc aag tgc ctt gca ccc act ttc aaa ggc gat ttt 723 Lys Gly Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe 145 150 155 gcc tta cca gga gct caa tta cgc tcc aaa ggg ttg aat cga att ggt 771 Ala Leu Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly 160 165 170 aat ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg atc 819 Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile 175 180 185 att cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tca gag aaa atc 867 Ile Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile 190 195 200 tta tgg aca cca tcg aag ttg att ggt cga tta gga aga gaa ata aac 915 Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn 205 210 215 220 gat gag agt tca tac ctt tac tgg gcc ttc aag aac aat att cca gta 963 Asp Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val 225 230 235 ttt tgc cca ggt tta aca gac ggc tca ctc gga gac atg cta tat ttt 1011 Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe 240 245 250 cat tct ttt cgc aat ccg ggt tta atc gtc gat gtt gtg caa gat ata 1059 His Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Val Asp Val Val Gln Asp Ile 255 260 265 aga gca gta aat ggc gag gct gtg cac gca gcg cct agg aaa aca ggc 1107 Arg Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly 270 275 280 atg att ata ctc ggt gga ggg ttg cct aag cac cac atc tgc aac gca 1155 Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala 285 290 295 300 aac atg atg aga aat ggc gcc gat tat gct gtt ttc atc aac act gcc 1203 Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala 305 310 315 gaa gag ttt gac ggc agt gat tct ggt gct cgc ccc gat gag gct att 1251 Glu Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Ile 320 325 330 tca tgg ggc aaa att agc gga tct gct aag act gtg aag gtg cat tgt 1299 Ser Trp Gly Lys Ile Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys 335 340 345 gat gcc acg ata gct ttc cct cta cta gtc gct gag aca ttt gca gca 1347 Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala 350 355 360 aaa aga gaa aaa gag agg aag agc tgt taaaactttt ttgattgttg 1394 Lys Arg Glu Lys Glu Arg Lys Ser Cys 365 370 aaaaatctgt gttatacaag tctcgaaatg cattttagta attgacttga tcttatcatt 1454 tcaatgtgtt atctttgaaa atgttggtaa tgaaacatct cacctcttct atacaacatt 1514 gttgatccat tgtactccgt atcttgtaat tttggaaaaa aaaaaccgtc tattgttacg 1574 agagagtaca tttttgaggt aaaaatatag gatttttgtg cgatgcaaat gctggttatt 1634 cccttgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1660 <210> 10 <211> 373 <212> PRT <213> Dianthus caryophyllus <400> 10 Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser Ala His Ser Ala Ala 1 5 10 15 Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser Val Lys Ile Glu Gly 20 25 30 Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Gln Ser Phe 35 40 45 Ala Ser Asn Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Glu Val 50 55 60 Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp Glu Ala Pro Val Asp 65 70 75 80 Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe Arg Glu Ser Val Lys 85 90 95 Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe 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Ile Asn Thr Ala Glu Glu Phe Asp 305 310 315 320 Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Ile Ser Trp Gly Lys 325 330 335 Ile Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile 340 345 350 Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Arg Glu Lys 355 360 365 Glu Arg Lys Ser Cys 370 <210> 11 <211> 780 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> CDS <222> (43)..(522) <400> 11 aaagaatcct agagagagaa agggaatcct agagagagaa gc atg tcg gac gaa 54 Met Ser Asp Glu 1 gaa cac cat ttt gag tca aag gca gat gct ggt gcc tca aaa act ttc 102 Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser Lys Thr Phe 5 10 15 20 cca cag caa gct gga acc atc cgt aag aat ggt tac atc gtt atc aaa 150 Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile Val Ile Lys 25 30 35 ggc cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtc tcc act tca aaa act gga aaa 198 Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys 40 45 50 cac gga cat gct aaa tgt cac ttt gtg gca att gac att ttc aat gga 246 His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe Asn Gly 55 60 65 aag aaa ctg gaa gat atc gtt ccg tcc tcc cac aat tgt gat gtg cca 294 Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp Val Pro 70 75 80 cat gtt aac cgt acc gac tat cag ctg att gat atc tct gaa gat ggt 342 His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu Asp Gly 85 90 95 100 ttt gtc tca ctt ctt act gaa agt gga aac acc aag gat gac ctc agg 390 Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys Asp Asp Leu Arg 105 110 115 ctt ccc acc gat gaa aat ctg ctg aag cag gtt aaa gat ggg ttc cag 438 Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gln Val Lys Asp Gly Phe Gln 120 125 130 gaa gga aag gat ctt gtg gtg tct gtt atg tct gcg atg ggc gaa gag 486 Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly Glu Glu 135 140 145 cag att aac gcc gtt aag gat gtt ggt acc aag aat tagttatgtc 532 Gln Ile Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn 150 155 160 atggcagcat aatcactgcc aaagctttaa gacattatca tatcctaatg tggtactttg 592 atatcactag attataaact gtgttatttg 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Leu Leu 80 85 90 gat atc act gaa gat ggc ttt gtt agt ctg ctg act gac agt ggt gac 396 Asp Ile Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp 95 100 105 110 acc aag gat gat ctg aag ctt cct gct gat gag gcc ctt gtg aag cag 444 Thr Lys Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gln 115 120 125 atg aag gag gga ttt gag gcg ggg aaa gac ttg att ctg tca gtc atg 492 Met Lys Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu Ile Leu Ser Val Met 130 135 140 tgt gca atg gga gaa gag cag atc tgc gcc gtc aag gac gtt agt ggt 540 Cys Ala Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly 145 150 155 ggc aag tagaagcttt tgatgaatcc aatactacgc ggtgcagttg aagcaatagt 596 Gly Lys 160 aatctcgaga acattctgaa ccttatatgt tgaattgatg gtgcttagtt tgttttggaa 656 atctctttgc aattaagttg taccaaatca atggatgtaa tgtcttgaat ttgttttatt 716 tttgttttga tgtttgctgt gattgcatta tgcattgtta tgagttatga cctgttataa 776 cacaaggttt tggtaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 812 <210> 14 <211> 160 <212> PRT <213> Dianthus caryophyllus <400> 14 Met 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Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser Lys 5 10 15 acc tac cct caa caa gct gga acc atc cgt aag aat ggt tac atc gtc 154 Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile Val 20 25 30 atc aaa aat cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtt tca acc tcg aag act 202 Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 ggc aag cat ggt cat gct aaa tgt cat ttt gta gct att gat atc ttc 250 Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe 50 55 60 65 acc agc aag aaa ctc gaa gat att gtt cct tct tcc cac aat tgt gat 298 Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp 70 75 80 gtt cct cat gtc aac cgt act gat tat cag ctg att gac att tct gaa 346 Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu 85 90 95 gat gga tat gtc agt ttg ttg act gat aac ggt agt acc aag gat gac 394 Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp Asp 100 105 110 ctt aag ctc cct aat gat gac act ctg ctc caa cag atc aag agt ggg 442 Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser Gly 115 120 125 ttt gat gat gga aaa gat cta gtg gtg agt gta atg tca gct atg gga 490 Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly 130 135 140 145 gag gaa cag atc aat gct ctt aag gac atc ggt ccc aag tgagactaac 539 Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys 150 155 aaagcctccc ctttgttatg agattcttct tcttctgtag gcttccatta ctcgtcggag 599 attatcttgt ttttgggtta ctcctatttt ggatatttaa acttttgtta ataatgccat 659 cttcttcaac cttttccttc tagatggttt ttatacttct tct 702 <210> 16 <211> 158 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 16 Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile 20 25 30 Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser 85 90 95 Glu Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp 100 105 110 Asp Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser 115 120 125 Gly Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 17 aaarrycgmc cytgcaaggt 20 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 18 aatacgactc actatag 17 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <220> <221> modified_base <222> (6) <223> a, t, c or g <400> 19 tcyttnccyt cmkctaahcc 20 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 20 attaaccctc actaaag 17 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn 20 25 30 cga att ggg aat ttg ctg gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag 144 Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu 35 40 45 gat tgg atc att ccc atc ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa 192 Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu 50 55 60 gag aat gtg ttg tgg act cct tct aaa ctg tta gca cgg ctg gga aaa 240 Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys 65 70 75 80 gaa atc aac aat gag agt tca tac ctt tat tgg gca tac aag atg aat 288 Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn 85 90 95 att cca gta ttc tgc cca ggg tta aca gat ggc tct ctt agg gat atg 336 Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met 100 105 110 ctg tat ttt cac tct ttt cgt acc tct ggc ctc atc atc gat gta gta 384 Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val 115 120 125 caa gat atc aga gct atg aac ggc gaa gct gtc cat gca aat cct aaa 432 Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys 130 135 140 aag aca ggg atg ata atc ctt gga ggg ggc ttg cca aag cac cac ata 480 Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile 145 150 155 160 tgt aat gcc aat atg atg cgc aat ggt gca gat tac gct gta ttt ata 528 Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile 165 170 175 aac acc ggg caa gaa ttt gat ggg agc gac tcg ggt gca cgc cct gat 576 Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp 180 185 190 gaa gc 581 Glu <210> 27 <211> 523 <212> DNA <213> Dianthus caryophyllus <220> <221> CDS <222> (1)..(522) <400> 27 mga aga tcc atc aag tgc ctt gca ccc act ttc aaa ggc gat ttt gcc 48 Arg Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala 1 5 10 15 tta cca gga gct caa tta cgc tcc aaa ggg ttg aat cga att ggt aat 96 Leu Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn 20 25 30 ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg atc att 144 Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile 35 40 45 cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tca gag aaa atc tta 192 Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile Leu 50 55 60 tgg aca cca tcg aag ttg att ggt cga tta gga aga gaa ata aac gat 240 Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn Asp 65 70 75 80 gag agt tca tac ctt tac tgg gcc ttc aag aac aat att cca gta ttt 288 Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val Phe 85 90 95 tgc cca ggt tta aca gac ggc tca ctc gga gac atg cta tat ttt cat 336 Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His 100 105 110 tct ttt cgc aat ccg ggt tta atc atc gat gtt gtg caa gat ata aga 384 Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg 115 120 125 gca gta aat ggc gag gct gtg cac gca gcg cct agg aaa aca ggc atg 432 Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met 130 135 140 att ata ctc ggt gga ggg ttg cct aag cac cac atc tgc aac gca aac 480 Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn 145 150 155 160 atg atg aga aat ggc gcc gat tat gct gtt ttc atc aac acc g 523 Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr 165 170 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 28 ttgargaaga tycatmaart gcct 24 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 29 ccatcaaayt cytgkgcrgt gtt 23 <210> 30 <211> 484 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (2)..(112) <400> 30 t gca cgc cct gat gaa gct gtg tct tgg ggt aaa att agg ggt tct gct 49 Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala 1 5 10 15 aaa acc gtt aag gtc tgc ttt tta att tct tca cat cct aat tta tat 97 Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr 20 25 30 ctc act cag tgg ttt tgagtacata tttaatattg gatcattctt gcaggtatac 152 Leu Thr Gln Trp Phe 35 tgtgatgcta ccatagcctt cccattgttg gttgcagaaa catttgccac aaagagagac 212 caaacctgtg agtctaagac ttaagaactg actggtcgtt ttggccatgg attcttaaag 272 atcgttgctt tttgatttta cactggagtg accatataac actccacatt gatgtggctg 332 tgacgcgaat tgtcttcttg cgaattgtac tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc 392 agattgtgtt ttcgtttaaa acacaagagt cttgtagtca ataatccttt gccttataaa 452 attattcagt tccaacaaaa aaaaaaaaaa aa 484 <210> 31 <211> 559 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> CDS <222> (1)..(156) <220> <221> modified_base <222> (542) <223> a, t, c or g <400> 31 ggt gct cgt cct gat gaa gct gta tca tgg gga aag ata cgt ggt ggt 48 Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly 1 5 10 15 gcc aag act gtg aag gtg cat tgt gat gca acc att gca ttt ccc ata 96 Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile 20 25 30 tta gta gct gag aca ttt gca gct aag agt aag gaa ttc tcc cag ata 144 Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile 35 40 45 agg tgc caa gtt tgaacattga ggaagctgtc cttccgacca cacatatgaa 196 Arg Cys Gln Val 50 ttgctagctt ttgaagccaa cttgctagtg tgcagcacca tttattctgc aaaactgact 256 agagagcagg gtatattcct ctaccccgag ttagacgaca tcctgtatgg ttcaaattaa 316 ttatttttct ccccttcaca ccatgttatt tagttctctt cctcttcgaa agtgaagagc 376 ttagatgttc ataggttttg aattatgttg gaggttggtg ataactgact agtcctctta 436 ccatatagat aatgtatcct tgtactatga gattttgggt gtgtttgata ccaaggaaaa 496 atgtttattt ggaaaacaat tggattttta atttaaaaaa aattgnttaa aaaaaaaaaa 556 aaa 559 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Conserved peptide fragment <400> 32 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 33 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 33 gagctcaaga ataacatctc ataagaaac 29 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 34 ctcgagtgct cacttctctc tcttagg 27 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Cys Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Cys Thr Asp Asp Gly Leu Thr Ala Gln Met Arg Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Cys Thr Asp Glu Ala Leu Leu Thr Gln Leu Lys Asn 1 5 10 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 38 aagcttgatc gtggtcaact tcctctgtta cc 32 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 39 gagctcagaa gaagtataaa aaccatc 27 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 40 ctcgagtgct cacttctctc tcttagg 27 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 41 gagctcaaga ataacatctc ataagaaac 29 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 42 ctcgagctaa actccattcg ctgacttcgc 30 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 43 gagctctagt aaatataaga gtgtcttgc 29 <210> 44 <211> 353 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Fungi sequence <400> 44 Met Ala Asp Asn Gln Ile Pro Ser Ser Val Ala Asp Ala Val Leu Val 1 5 10 15 Lys Ser Ile Glu Met Pro Glu Gly Ser Gln Lys Val Glu Glu Leu Asp 20 25 30 Phe Asn Lys Phe Lys Gly Arg Pro Ile Thr Val Asp Asp Leu Leu Gln 35 40 45 Gly Met Lys His Met Gly Phe Gln Ala Ser Ser Met Cys Glu Ala Val 50 55 60 Arg Ile Ile Asn Glu Met Arg Ala Tyr Arg Asp Pro Thr Thr Ser Glu 65 70 75 80 Lys Thr Thr Ile Phe Leu Gly Tyr Thr Ser Asn Leu Ile Ser Ser Gly 85 90 95 Leu Arg Gly Thr Leu Arg Tyr Leu Val Gln His Lys His Val Ser Ala 100 105 110 Ile Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Phe Ile Lys Cys Leu 115 120 125 Gly Asp Thr Tyr Met Ser Ser Phe Ser Ala Val Gly Ala Asp Leu Arg 130 135 140 Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Val Val Pro Asn Ser Asn 145 150 155 160 Tyr Cys Ala Phe Glu Asp Trp Val Val Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu 165 170 175 Glu Glu Gln Glu Ala Ser Arg Gly Thr Glu Asn Glu Ile Asn Trp Thr 180 185 190 Pro Ser Lys Val Ile His Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Arg 195 200 205 Ser Val Tyr Tyr Trp Ala Trp Lys Asn Asp Ile Pro Val Phe Cys Pro 210 215 220 Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Thr Phe 225 230 235 240 Lys Ala Ser Pro Glu Gln Leu Arg Ile Asp Ile Val Glu Asp Ile Arg 245 250 255 Lys Ile Asn Thr Ile Ala Val Arg Ala Lys Arg Ala Gly Met Ile Ile 260 265 270 Leu Gly Gly Gly Ile Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Cys Leu Met 275 280 285 Arg Asn Gly Ala Glu Ser Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe 290 295 300 Asp Gly Ser Asp Ala Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly 305 310 315 320 Lys Ile Lys Val Gly Ala Asp Ala Val Lys Val Tyr Met Glu Ala Thr 325 330 335 Ala Ala Phe Pro Phe Ile Val Ala Asn Thr Phe Ala Lys Glu Asp Gly 340 345 350 Leu <210> 45 <211> 387 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Yeast sequence <400> 45 Met Ser Asp Ile Asn Glu Lys Leu Pro Glu Leu Leu Gln Asp Ala Val 1 5 10 15 Leu Lys Ala Ser Val Pro Ile Pro Asp Asp Phe Val Lys Val Gln Gly 20 25 30 Ile Asp Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Asn Met Arg Ala Thr Asp Leu 35 40 45 Ile Glu Ala Met Lys Thr Met Gly Phe Gln Ala Ser Ser Val Gly Thr 50 55 60 Ala Cys Glu Ile Ile Asp Ser Met Arg Ser Trp Arg Gly Lys His Ile 65 70 75 80 Asp Glu Leu Asp Asp His Glu Lys Lys Gly Cys Phe Asp Glu Glu Gly 85 90 95 Tyr Gln Lys Thr Thr Ile Phe Met Gly Tyr Thr Ser Asn Leu Ile Ser 100 105 110 Ser Gly Val Arg Glu Thr Leu Arg Tyr Leu Val Gln His Lys Met Val 115 120 125 Asp Ala Val Val Thr Ser Ala Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys 130 135 140 Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Leu Gly Glu Phe Ala Leu Lys Gly Lys Ser 145 150 155 160 Leu Arg Asp Gln Gly Met Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn 165 170 175 Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Glu Trp Ile Val Pro Ile Leu Asp Lys 180 185 190 Met Leu Glu Glu Gln Asp Glu Tyr Val Lys Lys His Gly Ala Asp Cys 195 200 205 Leu Glu Ala Asn Gln Asp Val Asp Ser Pro Ile Trp Thr Pro Ser Lys 210 215 220 Met Ile Asp Arg Phe Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Ser Ser Val Leu 225 230 235 240 Tyr Trp Ala His Lys Asn Lys Ile Pro Ile Phe Cys Pro Ser Leu Thr 245 250 255 Asp Gly Ser Ile Gly Asp Met Leu Phe Phe His Thr Phe Lys Ala Ser 260 265 270 Pro Lys Gln Leu Arg Val Asp Ile Val Gly Asp Ile Arg Lys Ile Asn 275 280 285 Ser Met Ser Met Ala Ala Tyr Arg Ala Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly 290 295 300 Gly Leu Ile Lys His His Ile Ala Asn Ala Cys Leu Met Arg Asn Gly 305 310 315 320 Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Gly Gln Glu Tyr Asp Gly Ser 325 330 335 Asp Ala Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Lys 340 345 350 Ala Glu Ala Lys Ser Val Lys Leu Phe Ala Asp Val Thr Thr Val Leu 355 360 365 Pro Leu Ile Val Ala Ala Thr Phe Ala Ser Gly Lys Pro Ile Lys Lys 370 375 380 Val Lys Asn 385 <210> 46 <211> 370 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Archaebacterial sequence <400> 46 Met Arg Asp Ile Lys Asp Asn Pro Ile Arg Arg Gly Ile Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ser Glu Ala Met His Pro Gly Tyr Thr Asn Arg Ala Lys Pro Tyr Gly 20 25 30 Cys Lys Arg Asp Pro Lys Asp Ile Val Leu Lys Glu Ser Glu Asp Ile 35 40 45 Glu Gly Ile Ala Ile Glu Gly Pro Trp Leu Glu Asp Asp Ile Ser Leu 50 55 60 Glu Glu Ile Ile Lys Lys Tyr Tyr Leu Lys Ile Gly Phe Gln Ala Ser 65 70 75 80 His Ile Gly Lys Ala Ile Lys Ile Trp Lys His Ile Glu Glu Lys Arg 85 90 95 Lys Lys Gly Asp Glu Ile Thr Val Phe Phe Gly Tyr Thr Ser Asn Ile 100 105 110 Val Ser Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ile Ala Tyr Leu Val Lys His Lys 115 120 125 Lys Ile Asp Ile Ile Val Thr Thr Ala Gly Gly Val Glu Glu Asp Phe 130 135 140 Ile Lys Cys Leu Lys Pro Phe Ile Leu Gly Asp Trp Glu Val Asp Gly 145 150 155 160 Lys Met Leu Arg Glu Lys Gly Ile Asn Arg Ile Gly Asn Ile Phe Val 165 170 175 Pro Asn Asp Arg Tyr Ile Ala Phe Glu Glu Tyr Met Met Glu Phe Phe 180 185 190 Glu Glu Ile Leu Asn Leu Gln Arg Glu Thr Gly Lys Ile Ile Thr Ala 195 200 205 Ser Glu Phe Cys Tyr Lys Leu Gly Glu Phe Met Asp Lys Lys Leu Lys 210 215 220 Ser Lys Glu Lys Glu Lys Ser Ile Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asn 225 230 235 240 Ile Pro Ile Phe Cys Pro Ala Ile Thr Asp Gly Ser Ile Gly Asp Met 245 250 255 Leu Tyr Phe Phe Lys Lys Tyr Asn Lys Asp Glu Glu Leu Lys Ile Asp 260 265 270 Val Ala Asn Asp Ile Val Lys Leu Asn Asp Ile Ala Ile Asn Ser Lys 275 280 285 Glu Thr Ala Cys Ile Val Leu Gly Gly Ser Leu Pro Lys His Ser Ile 290 295 300 Ile Asn Ala Asn Leu Phe Arg Glu Gly Thr Asp Tyr Ala Ile Tyr Val 305 310 315 320 Thr Thr Ala Leu Pro Trp Asp Gly Ser Leu Ser Gly Ala Pro Pro Glu 325 330 335 Glu Gly Val Ser Trp Gly Lys Ile Gly Ala Lys Ala Asp Tyr Val Glu 340 345 350 Ile Trp Gly Asp Ala Thr Ile Ile Phe Pro Leu Leu Val Tyr Cys Val 355 360 365 Met Lys 370 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <220> <221> modified_base <222> (3) <223> a, t, c or g <220> <221> modified_base <222> (15) <223> a, t, c or g <400> 47 gcngarttyg ayggntccga yca 23 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 48 ccgagctcct gttaccaaaa aatctgtacc 30 <210> 49 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 49 acctcgagcg gccgcagaag aagtataaaa accatc 36 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 50 cgtcgacgat atctcttttt atattcaaac 30 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 51 cgtctagaca ttgttttagg aaagttaaat ga 32 <210> 52 <211> 1235 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 52 accctagatc gctttcttca gtgttctata aaaactaaac tccattcgct gacttcgcaa 60 agaagaacac tttctctctg aaatctcaaa ttcatctctt ctcttccgat ttcgctgaat 120 catgtcagac gacgagcatc acttcgaatc cagcgacgcc ggagcttcta agacttatcc 180 tcaacaagcc ggtaacattc gtaaaggtgg tcacatcgtc atcaagggac gtccctgcaa 240 ggttttgtct ctgatttgat tattattgat tttagaggaa tcatcttcat ggattgtatt 300 aaagcagtgt tccgttacct gatcgttgtg aatttttgag gtttagtgat tctggattgt 360 gatctggtgt ttagtgttga gaaaaacctc tgtttttgaa gtttatggat ttatagggtt 420 tttaaatcta taatagggtt taattcaatt ggtgatatgt ggggtttatg atataggtgg 480 ttgaggtatc gacttcgaag actgggaagc atggtcacgc caagtgtcac tttgttgcca 540 ttgatatctt tacttctaag aagcttgaag atatcgttcc ttcttcccac aattgtgatg 600 tgagtcttgt gaatggatta gaaacgttat acaaagtcta taatttttga ctcacaacac 660 aaaactgttt cctttttatt ggcacaggtt ccacatgtga atcgtgttga ttatcagttg 720 attgatatct ctgaagatgg ctttgtatgt catcttcttt ttcactagtt cagctttgtg 780 ttttgtcttt gcccatatgg ttgaattaga gggttttgtt ctttgattac atttacaggt 840 tagtcttctt actgataatg gtagcactaa ggatgatctg aagctgccaa cagatgaagc 900 tttactcaca cagctcaaga atggatttga ggagggtaag gatattgttg tgtctgtcat 960 gtctgcaatg ggagaggagc agatgtgtgc tctcaaggaa gttggtccca agtaataata 1020 ataagtaagc attctctctt ttacagaggc tatgtattat caagtttgac agagtcaaat 1080 gttataagaa caaagtttgg tccttttttt tggtcttctt agtataattt aagcccacat 1140 gtgtttccca tgcaagacac tcttatattt actagtatat cttactattg gttttggttg 1200 tggagaagtt actgttgaca gttccaaacc tctac 1235 <210> 53 <211> 161 <212> PRT <213> Mycosphaerella fijiensis <400> 53 Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Phe Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys 1 5 10 15 Arg Phe Glu Asp Trp Val Met Pro Ile Leu Asp Thr Met Leu Glu Glu 20 25 30 Gln Glu Ala Cys Lys Gly Ser Gly Glu Ala Ile His Trp Thr Pro Ser 35 40 45 Lys Ile Ile Asn Arg Leu Gly Lys Glu Val Asn Asp Glu Ser Ser Val 50 55 60 Tyr Tyr Trp Ala Trp Lys Asn Asp Ile Pro Val Phe Cys Pro Ala Leu 65 70 75 80 Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Thr Phe Lys Ser 85 90 95 Ser Pro Gln Gln Leu Arg Val Asp Ile Val Glu Asp Ile Arg Lys Ile 100 105 110 Asn Thr Leu Ala Val Arg Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly 115 120 125 Gly Gly Ile Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 130 135 140 Gly Ala Glu Ser Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Glu Phe Asp Gly Ser 145 150 155 160 Asp <210> 54 <211> 861 <212> DNA <213> Arabidopsis sp. <400> 54 tttttccctt ctcccaatct catcttctcc gaaaaccttt cttctctcaa atttctgtga 60 aaacatgtct gacgacgagc accactttga ggccagcgaa tccggagctt ccaagaccta 120 tcctcaatca gccggtaaca tccgtaaagg tggtcacatc gtcatcaaaa accgtccctg 180 caaggttgtt gaggtttcga cttccaaaac tggcaagcac ggtcacgcca aatgtcactt 240 tgttgctatt gatatcttca ctgctaagaa gcttgaagat attgttccat cttcccacaa 300 ttgtgatgtt ccacatgtga accgtgttga ttaccagttg attgatatca ctgaggatgg 360 cttcgtgagc cttctcactg acagtggtgg caccaaggat gatctcaagc ttcccaccga 420 tgatggtctc accgcccaga tgaggcttgg attcgatgag ggaaaggata ttgtggtgtc 480 tgtcatgtct tccatgggag aggagcagat ctgtgccgtc aaggaagttg gtggtggcaa 540 gtaaacaagt atcattcgat atattattac cagtttgaca acggacgtca atgttataag 600 aaccaaaaga tgtttttctt tttcctaatt tagacccttt gtgtgtgttt cttgttgcaa 660 gacaaccata tctattggtt ttggattgtt ggaaaagttt gtgttgaaac attcaaagtt 720 tcttatgaga tgttattctt aaaaccactt tttgtttgtt cactggatat gtttgttcat 780 gaagcttgtt ttaagcaact ctttacatga tattcattgc tatttgcacg attcaagagt 840 gaaatataca ttttatttaa c 861 <210> 55 <211> 159 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 55 Met Ser Asp Asp Glu His His Phe Glu Ala Ser Glu Ser Gly Ala Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Pro Gln Ser Ala Gly Asn Ile Arg Lys Gly Gly His Ile 20 25 30 Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 Phe Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Thr 85 90 95 Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp 100 105 110 Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Asp Gly Leu Thr Ala Gln Met Arg Leu 115 120 125 Gly Phe Asp Glu Gly Lys Asp Ile Val Val Ser Val Met Ser Ser Met 130 135 140 Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys 145 150 155 <210> 56 <211> 698 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> CDS <222> (52)..(528) <400> 56 cttcctgaat ttttctcctt ctccttctcc gttcaatcga atttttcagc c atg tct 57 Met Ser 1 gac gag gag cat caa ttt gag tct aag gct gat gcc gga gca tca aaa 105 Asp Glu Glu His Gln Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser Lys 5 10 15 act tac cct caa caa gct ggt act att cgt aag aac ggt tat atc gtc 153 Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile Val 20 25 30 atc aaa ggc cgt cca tgc aag gtt gtg gaa gtc tct aca tcc aaa act 201 Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 50 ggc aag cac ggt cac gcc aaa tgt cat ttc gtt gct att gac atc ttc 249 Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile Phe 55 60 65 act ggg aag aag ctt gag gat att gtc ccc tct tca cac aat tgt gat 297 Thr Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp 70 75 80 gtg ccc cat gtt aat cgt aca gat tat cag ctt att gac atc tct gaa 345 Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser Glu 85 90 95 gat gga ttt gtg agt ctg ctt act gac aat ggt aac acc aag gat gac 393 Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Asn Thr Lys Asp Asp 100 105 110 ctc agg ctt cct act gat gaa aat ctg ctt tca ctg atc aag gac ggg 441 Leu Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Ser Leu Ile Lys Asp Gly 115 120 125 130 ttt gcc gag ggt aag gac ctc gtt gtg tct gtt atg tca gct atg ggt 489 Phe Ala Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly 135 140 145 gag gaa cag att aat gct ttg aag gat att ggc ccc aag tgatctcttg 538 Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys 150 155 attggatgga ttgcttgacg cgatggttct ttacgacctt gagtgagata gatatttata 598 gtcatggaaa aaaattgtga tcttatggaa tattcgtatc atgatttatg gaccattgtg 658 agttagattt ttatttatgt tgttttaaat tgtggtattc 698 <210> 57 <211> 159 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum <400> 57 Met Ser Asp Glu Glu His Gln Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr 20 25 30 Ile Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser 35 40 45 Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp 50 55 60 Ile Phe Thr Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80 Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Asn Thr Lys 100 105 110 Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Ser Leu Ile Lys 115 120 125 Asp Gly Phe Ala Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala 130 135 140 Met Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 58 <211> 158 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 58 Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile 20 25 30 Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser 85 90 95 Glu Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp 100 105 110 Asp Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gln Gln Ile Lys Ser 115 120 125 Gly Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 Gly Glu Glu Gln Ile Asn Ala Leu Lys Asp Ile Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 59 <211> 159 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 59 Met Ser Asp Asp Glu His His Phe Glu Ala Ser Glu Ser Gly Ala Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Pro Gln Ser Ala Gly Asn Ile Arg Lys Gly Gly His Ile 20 25 30 Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 Phe Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Thr 85 90 95 Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp 100 105 110 Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Asp Gly Leu Thr Ala Gln Met Arg Leu 115 120 125 Gly Phe Asp Glu Gly Lys Asp Ile Val Val Ser Val Met Ser Ser Met 130 135 140 Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys 145 150 155 <210> 60 <211> 158 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 60 Met Ser Asp Asp Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Asn Ile Arg Lys Gly Gly His Ile 20 25 30 Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser 85 90 95 Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp 100 105 110 Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Glu Ala Leu Leu Thr Gln Leu Lys Asn 115 120 125 Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp Ile Val Val Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 Gly Glu Glu Gln Met Cys Ala Leu Lys Glu Val Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 61 <211> 477 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 61 atgtccgacg aggagcatca ctttgagtcc agtgacgccg gagcgtccaa aacctaccct 60 caacaagctg gaaccatccg taagaatggt tacatcgtca tcaaaaatcg tccctgcaag 120 gttgttgagg tttcaacctc gaagactggc aagcatggtc atgctaaatg tcattttgta 180 gctattgata tcttcaccag caagaaactc gaagatattg ttccttcttc ccacaattgt 240 gatgttcctc atgtcaaccg tactgattat cagctgattg acatttctga agatggatat 300 gtcagtttgt tgactgataa cggtagtacc aaggatgacc ttaagctccc taatgatgac 360 actctgctcc aacagatcaa gagtgggttt gatgatggaa aagatctagt ggtgagtgtg 420 atgtcagcta tgggagagga acagatcaat gctcttaagg acatcggtcc caagtga 477 <210> 62 <211> 480 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 62 atgtctgacg acgagcacca ctttgaggcc agcgaatccg gagcttccaa gacctatcct 60 caatcagccg gtaacatccg taaaggtggt cacatcgtca tcaaaaaccg tccctgcaag 120 gttgttgagg tttcgacttc caaaactggc aagcacggtc acgccaaatg tcactttgtt 180 gctattgata tcttcactgc taagaagctt gaagatattg ttccatcttc ccacaattgt 240 gatgttccac atgtgaaccg tgttgattac cagttgattg atatcactga ggatggcttc 300 gtgagccttc tcactgacag tggtggcacc aaggatgatc tcaagcttcc caccgatgat 360 ggtctcaccg cccagatgag gcttggattc gatgagggaa aggatattgt ggtgtctgtc 420 atgtcttcca tgggagagga gcagatctgt gccgtcaagg aagttggtgg tggcaagtaa 480 <210> 63 <211> 477 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 63 atgtcagacg acgagcatca cttcgaatcc agcgacgccg gagcttctaa gacttatcct 60 caacaagccg gtaacattcg taaaggtggt cacatcgtca tcaagggacg tccctgcaag 120 gtggttgagg tatcgacttc gaagactggg aagcatggtc acgccaagtg tcactttgtt 180 gccattgata tctttacttc taagaagctt gaagatatcg ttccttcttc ccacaattgt 240 gatgttccac atgtgaatcg tgttgattat cagttgattg atatctctga agatggcttt 300 gttagtcttc ttactgataa tggtagcact aaggatgatc tgaagctgcc aacagatgaa 360 gctttactca cacagctcaa gaatggattt gaggagggta aggatattgt tgtgtctgtc 420 atgtctgcaa tgggagagga gcagatgtgt gctctcaagg aagttggtcc caagtaa 477 <210> 64 <211> 700 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> CDS <222> (56)..(532) <400> 64 aaatttctcc ttctccttaa tcctctccac cggcgaaccg gcgaagatca aaacg atg 58 Met 1 tcg gac gaa gag cac cac ttc gaa tcc aag gcc gat gcc gga gct tca 106 Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser 5 10 15 aag acg tat cct caa caa gct ggt act att cgt aaa ggt ggt cac atc 154 Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Gly Gly His Ile 20 25 30 gtc ata aaa aat cgt cct tgc aag gtg gtt gaa gtt tca act tcc aag 202 Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 aca ggc aag cac ggt cat gct aaa tgt cac ttc gtg gca att gac att 250 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 65 ttc act gga aag aaa ctt gag gat att gtt ccc tct tct cac aat tgt 298 Phe Thr Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 70 75 80 gat gtt cct cat gtg aat agg act gat tat caa ctt att gat atc tct 346 Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser 85 90 95 gag gat ggc ttt gtg agt ctg ttg act gaa aat ggt aac acc aag gat 394 Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Asn Gly Asn Thr Lys Asp 100 105 110 gac ttg aga ctc cca act gat gat act ctt ctg gct cag gtc aaa gat 442 Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Asp Thr Leu Leu Ala Gln Val Lys Asp 115 120 125 ggt ttt gct gag ggg aaa gac ctg gtt cta tca gtg atg tct gcc atg 490 Gly Phe Ala Glu Gly Lys Asp Leu Val Leu Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 145 gga gag gag cag att tgt ggt atc aag gac att ggc cct aag 532 Gly Glu Glu Gln Ile Cys Gly Ile Lys Asp Ile Gly Pro Lys 150 155 tagctgcaga tggtattggt gtatgtttac agagtttcta taaaagatgt attaagaacc 592 aaaacttctt tactttctct tgcagttgct ctatataact gccatttaac tattattata 652 tgtgttgtga ttagattctt gtctcactac agtatttcct ttactctg 700 <210> 65 <211> 159 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum <400> 65 Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Gly Gly His 20 25 30 Ile Val Ile Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser 35 40 45 Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp 50 55 60 Ile Phe Thr Gly Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80 Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Asn Gly Asn Thr Lys 100 105 110 Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Asp Thr Leu Leu Ala Gln Val Lys 115 120 125 Asp Gly Phe Ala Glu Gly Lys Asp Leu Val Leu Ser Val Met Ser Ala 130 135 140 Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Gly Ile Lys Asp Ile Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 66 <211> 658 <212> DNA <213> Brassica napus <220> <221> CDS <222> (1)..(477) <400> 66 atg tct gac gag gag cac cac ttc gag tcc agc gac gcc gga gct tcc 48 Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 aaa acc tac cct cag cag gct ggt aac atc cgc aag ggt ggt cac atc 96 Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Asn Ile Arg Lys Gly Gly His Ile 20 25 30 gtc atc aag ggc cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtt tcg act tcg aag 144 Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 act ggg aag cac ggt cac gca aag tgt cac ttt gtt gct atc gac atc 192 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 ttc act gct aag aag ctc gag gat att gtt ccc tct tcc cac aat tgt 240 Phe Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 gat gtt ccc cat gtg aac cgt att gac tac cag ttg att gat atc tct 288 Asp Val Pro His Val Asn Arg Ile Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser 85 90 95 gag aat ggc ttt gtt agc ctt ttg acc gac agt ggt ggc acc aag gac 336 Glu Asn Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp 100 105 110 gac ctc aag ctt ccc acc gat gat aat ctc agc gct ctg atg aag agt 384 Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Asp Asn Leu Ser Ala Leu Met Lys Ser 115 120 125 gga ttc gag gag gga aag gat gtg gtg gtg tct gtc atg tct tcc atg 432 Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp Val Val Val Ser Val Met Ser Ser Met 130 135 140 gga gag gag cag atc tgt gcc gtc aag gaa gtt ggt ggt ggc aag 477 Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys 145 150 155 taaaacccat tctctgagag aggataatct tattaccagt ggtcaatgtt ataagaacaa 537 gaacttgttt tttttccttt ttctaattta gatcatttgt gttgtgtttc tttgttgcaa 597 gacaaccatt atctattatt ggttttggat tgtttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 657 a 658 <210> 67 <211> 159 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 67 Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Asn Ile Arg Lys Gly Gly His Ile 20 25 30 Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 Phe Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 Asp Val Pro His Val Asn Arg Ile Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser 85 90 95 Glu Asn Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp 100 105 110 Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Asp Asn Leu Ser Ala Leu Met Lys Ser 115 120 125 Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp Val Val Val Ser Val Met Ser Ser Met 130 135 140 Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys 145 150 155 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Mycosphaerella fijiensis <400> 68 Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu 1 5 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Mycosphaerella fijiensis <400> 69 Ala Glu Phe Asp Gly Ser Asp Gln 1 5 <210> 70 <211> 1335 <212> DNA <213> Brassica napus <220> <221> CDS <222> (57)..(1160) <400> 70 cttgctagaa ccctaaaact ccctcccaaa actctccaca tcttccgaga aagaag atg 59 Met 1 gag gag gat cgt gtt ctc tcg tct gtc cac tca acg gtc ttc aag gaa 107 Glu Glu Asp Arg Val Leu Ser Ser Val His Ser Thr Val Phe Lys Glu 5 10 15 tcc gaa tcg ttg gaa gga aag tgc gac aaa atc gaa gga tac gat ttc 155 Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys Ile Glu Gly Tyr Asp Phe 20 25 30 aac caa gga gta aac tac ccg aag ctc ctc cga tcc atg ctc aca acc 203 Asn Gln Gly Val Asn Tyr Pro Lys Leu Leu Arg Ser Met Leu Thr Thr 35 40 45 ggc ttc caa gcc tca aac ctc ggc gac gta att gat gtc gtt aat caa 251 Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Val Ile Asp Val Val Asn Gln 50 55 60 65 atg cta gag tgg aga ctc tct gat gaa act ata gca cct gaa gac tgt 299 Met Leu Glu Trp Arg Leu Ser Asp Glu Thr Ile Ala Pro Glu Asp Cys 70 75 80 agt gaa gag gag aag gat cca gcg tat aga gag tcc gtg aag tgt aaa 347 Ser Glu Glu Glu Lys Asp Pro Ala Tyr Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys 85 90 95 atc ttt cta ggc ttc act tcg aat ctt gtt tcc tct ggt gtt aga gag 395 Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val Arg Glu 100 105 110 act att cga tac ctt gtt cag cat cat atg gtt gat gtt ata gtt act 443 Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met Val Asp Val Ile Val Thr 115 120 125 aca act ggt ggc gta gag gaa gat ctc atc aaa tgc ctt gct cct act 491 Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr 130 135 140 145 ttc aaa ggt gat ttc tct cta ccg ggt gcg tat ctt cgg tca aag gga 539 Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly 150 155 160 ttg aac cgg atc ggg aac ttg ctt gtt cct aat gat aac tac tgc aag 587 Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys 165 170 175 ttt gag gat tgg atc att ccc atc ttt gac cag atg ttg aag gaa cag 635 Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Gln Met Leu Lys Glu Gln 180 185 190 aaa gaa gag agt gtg ttg tgg acg cct tct aaa ttg tta gcg cgg ctg 683 Lys Glu Glu Ser Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu 195 200 205 ggg aaa gaa ata aat aat gag agt tca tat ctt tat tgg gca tac aag 731 Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys 210 215 220 225 atg aat att cca gtg ttc tgc cgg ggg tta acc gat ggc tct ctc ggt 779 Met Asn Ile Pro Val Phe Cys Arg Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly 230 235 240 gat atg ttg tat ttt cac tca ttt cgt acc tct ggc ctt gtc atc gat 827 Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Val Ile Asp 245 250 255 gtt gtg caa gat att aga gct atg aac ggt gaa gca gtc cat gcg act 875 Val Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Thr 260 265 270 cca aga aag aca ggg atg ata atc ctt gga ggg ggc ttg ccg aag cac 923 Pro Arg Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His 275 280 285 cac ata tgt aat gcc aac atg atg cgt aac ggt gcg gat tac gct gtg 971 His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val 290 295 300 305 ttt atc aac acc ggg caa gag ttt gat gga agt gac tcg ggt gca cgc 1019 Phe Ile Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg 310 315 320 cct gat gaa gca gtg tct tgg ggt aaa ata agg gga tct gct aaa act 1067 Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala Lys Thr 325 330 335 gtc aag gtg tac tgt gat gct acc ata gcc ttc cct ttg ttg gtt gct 1115 Val Lys Val Tyr Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala 340 345 350 gaa aca ttt gcc tcc aag aga gaa caa agc tgt gag cac aag acc 1160 Glu Thr Phe Ala Ser Lys Arg Glu Gln Ser Cys Glu His Lys Thr 355 360 365 taagcccaag aaagcttacg tctcttttat cggtttgttc ttccatcttg ttgttgtacc 1220 ctttgtcctg ctttacataa cattcatctc taaaacaata ctacctcctt ttgacaaaaa 1280 ataaaaaaaa ttggaaaaat ggtttcacaa gaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1335 <210> 71 <211> 368 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 71 Met Glu Glu Asp Arg Val Leu Ser Ser Val His Ser Thr Val Phe Lys 1 5 10 15 Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys Ile Glu Gly Tyr Asp 20 25 30 Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Pro Lys Leu Leu Arg Ser Met Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Val Ile Asp Val Val Asn 50 55 60 Gln Met Leu Glu Trp Arg Leu Ser Asp Glu Thr Ile Ala Pro Glu Asp 65 70 75 80 Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asp Pro Ala Tyr Arg Glu Ser Val Lys Cys 85 90 95 Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val Arg 100 105 110 Glu Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met Val Asp Val Ile Val 115 120 125 Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro 130 135 140 Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys 145 150 155 160 Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys 165 170 175 Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Gln Met Leu Lys Glu 180 185 190 Gln Lys Glu Glu Ser Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg 195 200 205 Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr 210 215 220 Lys Met Asn Ile Pro Val Phe Cys Arg Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu 225 230 235 240 Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Val Ile 245 250 255 Asp Val Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala 260 265 270 Thr Pro Arg Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys 275 280 285 His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala 290 295 300 Val Phe Ile Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala 305 310 315 320 Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala Lys 325 330 335 Thr Val Lys Val Tyr Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Leu Leu Val 340 345 350 Ala Glu Thr Phe Ala Ser Lys Arg Glu Gln Ser Cys Glu His Lys Thr 355 360 365 <210> 72 <211> 1862 <212> DNA <213> Medicago sativa <220> <221> CDS <222> (293)..(1396) <400> 72 gaaaccttct tcttctggag caaagtcgcc attccctacc tccttcttca ttcttattct 60 ctataacaaa cggtccgacc ggatccaagt tgcaccggtt cgaaccgctt tagttactac 120 taacggttcg aaccgttatt tttcaacccg tgacaaacgt ggaaggcttc gttgtttctt 180 cttcttcttc ttaattacca tgcgtttttg tttttctttt gagtcattga agtcttgttt 240 tttgtcgtgt ttctgtcttg agaccgtgaa agagaaaaca aagagtacga ga atg agt 298 Met Ser 1 gaa aca aag caa gaa gat gat aca att atg tcc tca gtt cac tcc act 346 Glu Thr Lys Gln Glu Asp Asp Thr Ile Met Ser Ser Val His Ser Thr 5 10 15 gtc ttc aaa gaa tcc gaa aat ctc gca gga aag tgt gtc caa atc gag 394 Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Ala Gly Lys Cys Val Gln Ile Glu 20 25 30 ggt tat gat ttc aac cgc ggc gtc gat tat caa cag ctt ctc aaa tca 442 Gly Tyr Asp Phe Asn Arg Gly Val Asp Tyr Gln Gln Leu Leu Lys Ser 35 40 45 50 atg ctc aca act ggt ttt caa gct tcc aac ttt ggt gat gcc gtt aaa 490 Met Leu Thr Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Phe Gly Asp Ala Val Lys 55 60 65 gtc gtt aat caa atg cta gat tgg agg ttg gtt gat gaa cca att gat 538 Val Val Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Val Asp Glu Pro Ile Asp 70 75 80 gag gat tgt gat gaa gat aag aag gat ttg gag tat agg aaa tct gtt 586 Glu Asp Cys Asp Glu Asp Lys Lys Asp Leu Glu Tyr Arg Lys Ser Val 85 90 95 aca tgc aaa gtg ttt ttg ggt ttc act tct aat ctt atc tct tct ggt 634 Thr Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Ile Ser Ser Gly 100 105 110 gtt aga gat gtt gtt cgt tac ctt tgt cag cat cac atg gtt cat gta 682 Val Arg Asp Val Val Arg Tyr Leu Cys Gln His His Met Val His Val 115 120 125 130 gtt gtt aca act aca ggt ggt att gaa gaa gat ctt ata aag tgc ctt 730 Val Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu 135 140 145 gca cca aca tat aaa gga gag ttc tct ttg ccc gga gct tat ctt cgc 778 Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Glu Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg 150 155 160 tca aaa gga ttg aat cga atc ggt aat tta ttg gtc cct aat gaa aat 826 Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Glu Asn 165 170 175 tat tgc aaa ttt gag gac tgg att att cct att ttt gat caa atg ttg 874 Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Gln Met Leu 180 185 190 aag gag caa aag gaa gag aaa gtg ctg tgg aca ccg tct aag tta ata 922 Lys Glu Gln Lys Glu Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile 195 200 205 210 gct cga ttg gga aaa gag atc aac aat gaa aac tcc tac ctt tac tgg 970 Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Asn Ser Tyr Leu Tyr Trp 215 220 225 gca tat aag aac aat att cca gtt tat tgt cca gga tta acc gat ggc 1018 Ala Tyr Lys Asn Asn Ile Pro Val Tyr Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly 230 235 240 tca ctg ggt gac atg ctg tac ttc cat tcc ttc cac aac cct ggt ctg 1066 Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe His Asn Pro Gly Leu 245 250 255 att gtg gac ata gtg caa gat ata agg gcc atg aat ggt gaa gct gta 1114 Ile Val Asp Ile Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val 260 265 270 cat gca aat cct agc aag acg ggc atg att att tta gga ggc ggc ctt 1162 His Ala Asn Pro Ser Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu 275 280 285 290 cca aaa cat cac att tgc aat gcc aat atg atg cgc aat ggt gca gac 1210 Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp 295 300 305 tat gcg gtt ttt att aat act gca caa gaa ttt gat gga agt gat tct 1258 Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser 310 315 320 gga gct cgt cca gat gag gct gtt tca tgg ggg aaa ata cga gga tct 1306 Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser 325 330 335 gct aaa act gtt aag gta cat tgt gat gca acg ata gca ttc cct ctg 1354 Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Leu 340 345 350 ctg gtt gct gaa aca ttt gcc tca aga acg tca ccc ctt aat 1396 Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ser Arg Thr Ser Pro Leu Asn 355 360 365 tgataaaggt ccaccgtcaa aagtaaaagg tgtggctggg aagtgtttta ccgcagctcc 1456 acttgtgagt gccaaatgtt ttggtatgta acttataaga ccaaggtcgg ctgtatgtca 1516 tacttgagtt gaggtcaaag ttcatttgca atgcagtgtg tttgaggatc ttgatggacc 1576 agtttgccat tgacttttaa tttgactgtc ttgttattcg caaggtccac ataacaagca 1636 tttttaccat ttagaaacaa tttattagtc ctgaaggaat tgagagtcat gaattcagat 1696 gtaaattatg caatgctaac tatatttttt tggaactgtg gtttctctta gatttgaggt 1756 gttgaaaact gtaatatcta gagcaaataa gactagaaaa gtttatcaac tattactgat 1816 cagttatagt atcttcaata ttttccagaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1862 <210> 73 <211> 368 <212> PRT <213> Medicago sativa <400> 73 Met Ser Glu Thr Lys Gln Glu Asp Asp Thr Ile Met Ser Ser Val His 1 5 10 15 Ser Thr Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Ala Gly Lys Cys Val Gln 20 25 30 Ile Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Arg Gly Val Asp Tyr Gln Gln Leu Leu 35 40 45 Lys Ser Met Leu Thr Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Phe Gly Asp Ala 50 55 60 Val Lys Val Val Asn Gln Met Leu Asp Trp Arg Leu Val Asp Glu Pro 65 70 75 80 Ile Asp Glu Asp Cys Asp Glu Asp Lys Lys Asp Leu Glu Tyr Arg Lys 85 90 95 Ser Val Thr Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Ile Ser 100 105 110 Ser Gly Val Arg Asp Val Val Arg Tyr Leu Cys Gln His His Met Val 115 120 125 His Val Val Val Thr Thr Thr Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys 130 135 140 Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Glu Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn 165 170 175 Glu Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Gln 180 185 190 Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys 195 200 205 Leu Ile Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Asn Ser Tyr Leu 210 215 220 Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asn Ile Pro Val Tyr Cys Pro Gly Leu Thr 225 230 235 240 Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe His Asn Pro 245 250 255 Gly Leu Ile Val Asp Ile Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu 260 265 270 Ala Val His Ala Asn Pro Ser Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly 275 280 285 Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly 290 295 300 Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser 305 310 315 320 Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg 325 330 335 Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe 340 345 350 Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ser Arg Thr Ser Pro Leu Asn 355 360 365 <210> 74 <211> 1363 <212> DNA <213> Musa acuminata <220> <221> CDS <222> (93)..(1220) <400> 74 ggcacgagcg cgcggcgccc gcaacgaata ttgcagagag taagaaggat cctcgccttt 60 gtcaccaaac ccttggtttc cagcgaggcg ac atg gaa ggc ggc gcc gcg gga 113 Met Glu Gly Gly Ala Ala Gly 1 5 ggg cag cga gac cgg gaa acc ctg gac gcg gtg cgg tcg gtg gtg ttt 161 Gly Gln Arg Asp Arg Glu Thr Leu Asp Ala Val Arg Ser Val Val Phe 10 15 20 aag cct tcc gta tcc ttg gag gag aag cgg ttc ccg agg gtc cag ggg 209 Lys Pro Ser Val Ser Leu Glu Glu Lys Arg Phe Pro Arg Val Gln Gly 25 30 35 tac gac ttc aac cgg ggt tgt gac ctc atc ggc ctc ctc gat tcc atc 257 Tyr Asp Phe Asn Arg Gly Cys Asp Leu Ile Gly Leu Leu Asp Ser Ile 40 45 50 55 tcc tct acc ggg ttc caa gct tcc aac ctc ggc gac gcc atc gat gtc 305 Ser Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala Ile Asp Val 60 65 70 atc aat cag atg att gac tgg agg ctc tcc cat gat gcg ccc acg gaa 353 Ile Asn Gln Met Ile Asp Trp Arg Leu Ser His Asp Ala Pro Thr Glu 75 80 85 gat tgc agc gag gaa gag cgc aat ctg gct tac agg caa tcg gtc acg 401 Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asn Leu Ala Tyr Arg Gln Ser Val Thr 90 95 100 tgc aag atc ttt ctg ggc ttc act tcg aac ctt gta tct tct ggc atc 449 Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Ile 105 110 115 agg gag ata att cgg ttt ctt gtg cag cac cga atg gtt gaa gtt tta 497 Arg Glu Ile Ile Arg Phe Leu Val Gln His Arg Met Val Glu Val Leu 120 125 130 135 gtc aca act gct ggc ggc att gaa gaa gat tta atc aaa tgc ctt gct 545 Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala 140 145 150 cca aca tat aag ggt gac ttt tct ttg cct gga tcg tat ctg cgt tca 593 Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ser Tyr Leu Arg Ser 155 160 165 aaa gga ttg aat cgg ata gga aac ctt ctt gtc cct aat gac aat tac 641 Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr 170 175 180 tgc aaa ttc gag gac tgg atc atg cca att ctg gac cag atg tta ctt 689 Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Met Pro Ile Leu Asp Gln Met Leu Leu 185 190 195 gaa cag act aca gag aat gta gtt tgg aca cca tct aaa gtg att gcg 737 Glu Gln Thr Thr Glu Asn Val Val Trp Thr Pro Ser Lys Val Ile Ala 200 205 210 215 cgc ctt gga aaa gaa ata aat gat gaa agt tca tac ctg tac tgg gca 785 Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala 220 225 230 tac aag aac aat gtt tct gtc tat tgc ccg gca ttg act gat gga tca 833 Tyr Lys Asn Asn Val Ser Val Tyr Cys Pro Ala Leu Thr Asp Gly Ser 235 240 245 ttg ggg gat atg ttg tac tgc cat tca gtg cgg aat cct ggt tta ctt 881 Leu Gly Asp Met Leu Tyr Cys His Ser Val Arg Asn Pro Gly Leu Leu 250 255 260 att gat att gtg caa gac ata cga gca atg aat gga gaa gct gta cat 929 Ile Asp Ile Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His 265 270 275 gtg ggt ctg aga aag act ggg gtc ata att ctt ggt ggg ggc ctc cca 977 Val Gly Leu Arg Lys Thr Gly Val Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro 280 285 290 295 aag cac cat ata tgt aat gcc aac atg ttt cgg aat ggt gca gat tat 1025 Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Phe Arg Asn Gly Ala Asp Tyr 300 305 310 gct gtt tat gtc aac act gca cag gaa ttt gat gga agt gat tct gga 1073 Ala Val Tyr Val Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly 315 320 325 gca gag cct gat gag gcg att tca tgg gga aag ata aaa ggt tct gcg 1121 Ala Glu Pro Asp Glu Ala Ile Ser Trp Gly Lys Ile Lys Gly Ser Ala 330 335 340 aag act att aaa gtt cat tgt gat gca act att gct ttt cct cta ttg 1169 Lys Thr Ile Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Leu Leu 345 350 355 gta gct gca aca ttt gca aga aag ttt cag gaa aga aac aac aaa tta 1217 Val Ala Ala Thr Phe Ala Arg Lys Phe Gln Glu Arg Asn Asn Lys Leu 360 365 370 375 gcc tgatgggggt gcaaaaggtg atcatcttat ttggattcaa ataccttaat 1270 Ala gtaatctgct aacatctgca gatgctgtat tcttgcaaac caaaaattta atattagata 1330 accgagagcc tacagagggt cctttcaaaa aaa 1363 <210> 75 <211> 376 <212> PRT <213> Musa acuminata <400> 75 Met Glu Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gln Arg Asp Arg Glu Thr Leu Asp 1 5 10 15 Ala Val Arg Ser Val Val Phe Lys Pro Ser Val Ser Leu Glu Glu Lys 20 25 30 Arg Phe Pro Arg Val Gln Gly Tyr Asp Phe Asn Arg Gly Cys Asp Leu 35 40 45 Ile Gly Leu Leu Asp Ser Ile Ser Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn 50 55 60 Leu Gly Asp Ala Ile Asp Val Ile Asn Gln Met Ile Asp Trp Arg Leu 65 70 75 80 Ser His Asp Ala Pro Thr Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asn Leu 85 90 95 Ala Tyr Arg Gln Ser Val Thr Cys Lys Ile Phe Leu Gly Phe Thr Ser 100 105 110 Asn Leu Val Ser Ser Gly Ile Arg Glu Ile Ile Arg Phe Leu Val Gln 115 120 125 His Arg Met Val Glu Val Leu Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu 130 135 140 Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu 145 150 155 160 Pro Gly Ser Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu 165 170 175 Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Met Pro 180 185 190 Ile Leu Asp Gln Met Leu Leu Glu Gln Thr Thr Glu Asn Val Val Trp 195 200 205 Thr Pro Ser Lys Val Ile Ala Arg Leu Gly Lys Glu Ile Asn Asp Glu 210 215 220 Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asn Val Ser Val Tyr Cys 225 230 235 240 Pro Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Cys His Ser 245 250 255 Val Arg Asn Pro Gly Leu Leu Ile Asp Ile Val Gln Asp Ile Arg Ala 260 265 270 Met Asn Gly Glu Ala Val His Val Gly Leu Arg Lys Thr Gly Val Ile 275 280 285 Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met 290 295 300 Phe Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Val Asn Thr Ala Gln Glu 305 310 315 320 Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Glu Pro Asp Glu Ala Ile Ser Trp 325 330 335 Gly Lys Ile Lys Gly Ser Ala Lys Thr Ile Lys Val His Cys Asp Ala 340 345 350 Thr Ile Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Ala Thr Phe Ala Arg Lys Phe 355 360 365 Gln Glu Arg Asn Asn Lys Leu Ala 370 375 <210> 76 <211> 1451 <212> DNA <213> Populus deltoides <220> <221> CDS <222> (8)..(1126) <400> 76 gggattt atg aca ggc aaa aaa caa tgg gag gaa gat ttg cta tca tca 49 Met Thr Gly Lys Lys Gln Trp Glu Glu Asp Leu Leu Ser Ser 1 5 10 gta cgg acc aca gtg ttt aaa gaa tca gaa gct ctt gat ggg aaa tgc 97 Val Arg Thr Thr Val Phe Lys Glu Ser Glu Ala Leu Asp Gly Lys Cys 15 20 25 30 att aaa att gaa ggt tat gat ttt aat caa gga gtg aac tac tct aag 145 Ile Lys Ile Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys 35 40 45 ctt ctc aaa tcc atg gtc tct acc ggg ttt caa gct tcc aac ctt gga 193 Leu Leu Lys Ser Met Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly 50 55 60 gat gcc att caa gtt gtt aat aac atg cta gac tgg agg ctt gct gat 241 Asp Ala Ile Gln Val Val Asn Asn Met Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp 65 70 75 gaa gag ata aca gaa gat tgt agt gat gag gag agg gag ttg gcc tat 289 Glu Glu Ile Thr Glu Asp Cys Ser Asp Glu Glu Arg Glu Leu Ala Tyr 80 85 90 aga gag tct gtg aga tgc aaa ctg ttc ttg ggt ttt aca tca aat ctt 337 Arg Glu Ser Val Arg Cys Lys Leu Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu 95 100 105 110 gtt tct tca ggt gtc aga gat aca att cga tat ctt gtt cag cat cat 385 Val Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His 115 120 125 atg gtt gat gta gtg gtt aca acg gca ggt ggc ata gaa gaa gat ctt 433 Met Val Asp Val Val Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu 130 135 140 ata aaa tgc ctg gca cca aca tac aaa ggt gac ttt tct cta ccc ggg 481 Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly 145 150 155 gct caa tta cga tca aaa ggg ttg aat cga att ggt aac ttg ttg gta 529 Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val 160 165 170 cct aat gac aac tac tgc aaa ttt gag gat tgg atc att cca atc ttt 577 Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe 175 180 185 190 gac caa atg ttg aag gaa caa att gaa gag aat atc acc tgg aca cct 625 Asp Gln Met Leu Lys Glu Gln Ile Glu Glu Asn Ile Thr Trp Thr Pro 195 200 205 tct aaa tta ata gct cgc atg ggg aaa gaa ata aat aat gag agt tca 673 Ser Lys Leu Ile Ala Arg Met Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser 210 215 220 tac ctt tat tgg gca tat aag aac gac att cca gta ttc tgt cca ggc 721 Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asp Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly 225 230 235 tta aca gat ggt tct cta ggg gac atg cta tac ttt cat tcc ttc cac 769 Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe His 240 245 250 aac cct ggt cta att gtt gcc ata gtc caa gat att aga gcc atg aat 817 Asn Pro Gly Leu Ile Val Ala Ile Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn 255 260 265 270 ggt gaa gct gtc cac gca agt cct aga aaa act ggt atc atc att ctt 865 Gly Glu Ala Val His Ala Ser Pro Arg Lys Thr Gly Ile Ile Ile Leu 275 280 285 gga ggt ggg ctt cct aag cat cat ata tgc aat gcc aat atg atg cgt 913 Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg 290 295 300 aac ggt gca gat tat gct gta ttc atc aat aca gca caa gaa ttt gat 961 Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp 305 310 315 ggg agt gat tct gga gct cat cct gat gag gct gta tcg tgg ggg aaa 1009 Gly Ser Asp Ser Gly Ala His Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys 320 325 330 ata cga ggt tct gct aaa act gtt aag gtc cac tgt gat gca act att 1057 Ile Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile 335 340 345 350 gct ttt cct ctc cta gtt gct gaa aca ttt gcc cct agg agg aac aga 1105 Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Pro Arg Arg Asn Arg 355 360 365 ttc tgc agc agt act caa agc tagggctgtg tgcagttctt ggccagaaaa 1156 Phe Cys Ser Ser Thr Gln Ser 370 ttgattcatt tttatttgta ttatgactga acgatccgca ggatgggtag tgggctccat 1216 tgatgccata aacttctttt tttttcccct cagaattaag ggatccgcca gaacacactg 1276 ctctcagccc caaaccattg ttgcctctac tgggagtagc ataaccaatt gaattgcgct 1336 cctccaagca gcgcctctta gttgcgttat ttattgtaag tagcgcaacc aactaaatta 1396 tgctagttcc cacatttatt gactgctatt ttcaaaagaa aaaaaaaaaa aaaaa 1451 <210> 77 <211> 373 <212> PRT <213> Populus deltoides <400> 77 Met Thr Gly Lys Lys Gln Trp Glu Glu Asp Leu Leu Ser Ser Val Arg 1 5 10 15 Thr Thr Val Phe Lys Glu Ser Glu Ala Leu Asp Gly Lys Cys Ile Lys 20 25 30 Ile Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gln Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu Leu 35 40 45 Lys Ser Met Val Ser Thr Gly Phe Gln Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala 50 55 60 Ile Gln Val Val Asn Asn Met Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu Glu 65 70 75 80 Ile Thr Glu Asp Cys Ser Asp Glu Glu Arg Glu Leu Ala Tyr Arg Glu 85 90 95 Ser Val Arg Cys Lys Leu Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser 100 105 110 Ser Gly Val Arg Asp Thr Ile Arg Tyr Leu Val Gln His His Met Val 115 120 125 Asp Val Val Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Glu Glu Asp Leu Ile Lys 130 135 140 Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Gln 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn 165 170 175 Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Gln 180 185 190 Met Leu Lys Glu Gln Ile Glu Glu Asn Ile Thr Trp Thr Pro Ser Lys 195 200 205 Leu Ile Ala Arg Met Gly Lys Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu 210 215 220 Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asp Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr 225 230 235 240 Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe His Asn Pro 245 250 255 Gly Leu Ile Val Ala Ile Val Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu 260 265 270 Ala Val His Ala Ser Pro Arg Lys Thr Gly Ile Ile Ile Leu Gly Gly 275 280 285 Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly 290 295 300 Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly Ser 305 310 315 320 Asp Ser Gly Ala His Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg 325 330 335 Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe 340 345 350 Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Pro Arg Arg Asn Arg Phe Cys 355 360 365 Ser Ser Thr Gln Ser 370 <210> 78 <211> 1488 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 78 acaataaggc tttaaagccc ataaaaccct taaatatatc aaagcccaaa agaaacgcct 60 tttgcgcttt cccgatcgtg gtcaacttcc tctgttacca aaaaatctgt accgcaaaat 120 cctcgtcgaa gctcgctgct gcaaccatgt ccgacgagga gcatcacttt gagtccagtg 180 acgccggagc gtccaaaacc taccctcaac aagctggaac catccgtaag aatggttaca 240 tcgtcatcaa aaatcgtccc tgcaaggttt cgttctcaaa catttctcca ctctcttcct 300 ctgatcttat tagatctgtt cattacttag attcctcaga ttcttttttt tgtcacctcc 360 acgatgttcg actgatattt gttcttgtca tcattgttaa attcacattt tattgcactt 420 ttgttttagc gaaattatta aattggtcat cttcagtttt gttcgattag ataagtttta 480 ggattttttc ttacacaagt tactggatca gctgctaaat gtcattttgt gtcgcaggtt 540 gttgaggttt caacctcgaa gactggcaag catggtcatg ctaaatgtca ttttgtagct 600 attgatatct tcaccagcaa gaaactcgaa gatattgttc cttcttccca caattgtgat 660 gtatgtgaaa aaagctcctt tgatcacttt catttcttgt ttgtttcttt caagtcccat 720 ttgagatttt gtttttgttg aattgggttt caggttcctc atgtcaaccg tactgattat 780 cagctgattg acatttctga agatggatat gtatgtgttc ttaaatagca cttgttcctt 840 tatatggttt agttacttgt tctgttttgt aatcattttg caggtcagtt tgttgactga 900 taacggtagt accaaggatg accttaagct ccctaatgat gacactctgc tccaacaggt 960 taagttttgc atgttcatca cattaaatgt tgctagttaa ttaaaatcaa ctctatgtcg 1020 atttctgaaa atggaagaaa aagtgcagag taatgagtga cctgattgtg ttaatgaaac 1080 agatcaagag tgggtttgat gatggaaaag atctagtggt gagtgtgatg tcagctatgg 1140 gagaggaaca gatcaatgct cttaaggaca tcggtcccaa gtgagactaa caaagcctcc 1200 cctttgttat gagattcttc ttcttcttct gtaggcttcc attactcatc ggagattatc 1260 ttgtttttgg gtgactccta ttttggatat ttaaactttt gttaataatg ccatcttctt 1320 caaccttttc cttctagatg gtttttatac ttcttctaat tgattgattc tttatggttg 1380 tccaagtgtc aaagtgttcc acccatatga ttctaacctt ttgatgagcg aagtctttac 1440 tcgtgcgtta tgtagagacg tagaagcaat accacaaaag agtataat 1488 <210> 79 <211> 1566 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 79 aggataataa tacagtaacc ctagaaaggt ttcctccacc ttcctcttcc cctcctatat 60 aaaaaaaatc gacatcgctt ttgctcactt ctctctctta ggtttttttt cccttctccc 120 aatctcatct tctccgaaaa cctttcttct ctcaaatttc tgtgaaaaca tgtctgacga 180 cgagcaccac tttgaggcca gcgaatccgg agcttccaag acctatcctc aatcagccgg 240 taacatccgt aaaggtggtc acatcgtcat caaaaaccgt ccctgcaagg tctgatttct 300 atttcatcat caaacatcgt tctcgatctc tttttcctga ttctagatct cgtctctgta 360 tagtagctcc ttgattttgt ttttatcctc ggatttgacc tggttctgtt tagtttgaat 420 ttttcttata gatcgctact tagatgaata tgatgaatct tatcctgtta ttttgatggt 480 ggtacctctc tagattcgtg gaattttggg aaatgaaaat gaaaaatgga tagaaatcaa 540 gcaatatcag acgacgcctt ttgtgatttt gaatctaagt agtctattga ttgatttgat 600 ttaaacgttt atggagaaca tagatttgat tttgatattt tggttttgat taggttgttg 660 aggtttcgac ttccaaaact ggcaagcacg gtcacgccaa atgtcacttt gttgctattg 720 atatcttcac tgctaagaag cttgaagata ttgttccatc ttcccacaat tgtgatgtaa 780 gttactacac aaactatgta gattcatttt cacagtattt gatatgattg tgtgatctga 840 ctcaaatatt gttcctttct ctttttttct caggttccac atgtgaaccg tgttgattac 900 cagttgattg atatcactga ggatggcttc gtatgttttt ctttatactc actttcctca 960 tcactccagc tttatttatc tattcttgcc ataacttttg tacttgttta cattataggt 1020 gagccttctc actgacagtg gtggcaccaa ggatgatctc aagcttccca ccgatgatgg 1080 tctcaccgcc caggttattt tcttgtcttt tcatactcgc acacaaatga cttgactttg 1140 tattcatctc tcgaattgtg atattgaaaa cagttgttgt gttttgttaa tgcagatgag 1200 gcttggattc gatgagggaa aggatattgt ggtgtctgtc atgtcttcca tgggagagga 1260 gcagatctgt gccgtcaagg aagttggtgg tggcaagtaa acaagtatca ttcgatatat 1320 tattaccagt ttgacaacgg acgtcaatgt tataagaacc aaaagatgtt tttctttttc 1380 ctaatttaga ccctttgtgt gtgtttcttg ttgcaagaca accatatcta ttggttttgg 1440 attgttggaa aagtttgtgt tgaaacattc aaagtttctt atgagatgtt attcttaaaa 1500 ccactttttg tttgttcact ggatatgttt gttcatgaag cttgttttaa gcaactcttt 1560 acatga 1566 <210> 80 <211> 319 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Promoter sequence <400> 80 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 60 gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 120 ttcatttgga gaggacacgc tgaaatcacc agtctctctc tcaagcttgg atcctcgagt 180 actagttcag ggagctcgaa ttgatcctct agagctttcg ttcgtatcat cggtttcgac 240 aacgttcgtc aagttcaatg catcagtttc attgcgcaca caccagaatc ctactgagtt 300 tgagtattat ggcattggg 319 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 81 gggagggact agtgtgcacg cc 22 <210> 82 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 82 gcgaagcggc catggctcga gttttttttt tttttttt 38 <210> 83 <211> 521 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 83 gggagggact agtgtgcacg ccctgatgaa gctgtgtctt ggggtaaaat taggggttct 60 gctaaaaccg ttaaggtata ctgtgatgct accatagcct tcccattgtt ggttgcagaa 120 acatttgcca caaagagaga ccaaacctgt gagtctaaga cttaagaact gactggttcg 180 tacctctggc ctcatcatcg atgtagtaca agatatcaga gctatgaacg gcgaagctgt 240 ccatgcaaat cctaaaaaga caggcgtttt ggccatggat tcttaaagat cgttgctttt 300 tgattttaca ctggagtgac catataacac tccacattga tgtggctgtg acgcgaattg 360 tcttcttgcg aattgtactt tagtttctct caacctaaaa tgatttgcag attgtgtttt 420 cgtttaaaac acaagagtct tgtagtcaat aatcctttgc cttataaaat tattcagttc 480 caacaaaaaa aaaaaaaaaa ctcgagccat ggccgcttcg c 521 <210> 84 <211> 497 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 84 ctagtgtgca cgccctgatg aagctgtgtc ttggggtaaa attaggggtt ctgctaaaac 60 cgttaaggta tactgtgatg ctaccatagc cttcccattg ttggttgcag aaacatttgc 120 cacaaagaga gaccaaacct gtgagtctaa gacttaagaa ctgactggtt cgtacctctg 180 gcctcatcat cgatgtagta caagatatca gagctatgaa cggcgaagct gtccatgcaa 240 atcctaaaaa gacaggcgtt ttggccatgg attcttaaag atcgttgctt tttgatttta 300 cactggagtg accatataac actccacatt gatgtggctg tgacgcgaat tgtcttcttg 360 cgaattgtac tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc agattgtgtt ttcgtttaaa 420 acacaagagt cttgtagtca ataatccttt gccttataaa attattcagt tccaacaaaa 480 aaaaaaaaaa aactcga 497 <210> 85 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 85 ctcgagaaga ataacatctc ataagaaac 29 <210> 86 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 86 gagctcggca agtaaacaag tatcattcg 29 <210> 87 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 87 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta 480 cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggatc 906 <210> 88 <211> 205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 88 aagaataaca tctcataaga aactttgaat gtttcaacac aaacttttcc aacaatccaa 60 aaccaataga tatggttgtc ttgcaacaag aaacacacac aaagggtcta aattaggaaa 120 aagaaaaaca tcttttggtt cttataacat tgacgtccgt tgtcaaactg gtaataatat 180 atcgaatgat acttgtttac ttgcc 205 <210> 89 <211> 662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 89 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat 300 ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 tcactaggca acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 at 662 <210> 90 <211> 37 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 90 Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Ser Ala 1 5 10 15 Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu Ile Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr 20 25 30 Leu Thr Gln Trp Phe 35 <210> 91 <211> 52 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum <400> 91 Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr Ile Ala Phe Pro Ile 20 25 30 Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gln Ile 35 40 45 Arg Cys Gln Val 50 <210> 92 <211> 193 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 92 Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys 1 5 10 15 Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn 20 25 30 Arg Ile Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu 35 40 45 Asp Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gln Lys Glu 50 55 60 Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys 65 70 75 80 Glu Ile Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn 85 90 95 Ile Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met 100 105 110 Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Ile Ile Asp Val Val 115 120 125 Gln Asp Ile Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys 130 135 140 Lys Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile 145 150 155 160 Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile 165 170 175 Asn Thr Gly Gln Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp 180 185 190 Glu <210> 93 <211> 174 <212> PRT <213> Dianthus caryophyllus <400> 93 Arg Arg Ser Ile Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Gln Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn 20 25 30 Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp Ile Ile 35 40 45 Pro Ile Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gln Ile Ser Glu Lys Ile Leu 50 55 60 Trp Thr Pro Ser Lys Leu Ile Gly Arg Leu Gly Arg Glu Ile Asn Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn Ile Pro Val Phe 85 90 95 Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His 100 105 110 Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu Ile Ile Asp Val Val Gln Asp Ile Arg 115 120 125 Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met 130 135 140 Ile Ile Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His Ile Cys Asn Ala Asn 145 150 155 160 Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe Ile Asn Thr 165 170 <210> 94 <211> 22 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 94 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 95 <211> 22 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 95 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 96 <211> 22 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 96 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 97 <211> 22 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 97 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 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<210> 104 <211> 22 <212> PRT <213> Medicago sativa <400> 104 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 105 <211> 22 <212> PRT <213> Lactuca sativa <400> 105 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 106 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Tree sequence peptide <400> 106 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 107 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Tree sequence peptide <400> 107 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 108 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Tree sequence peptide <400> 108 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 109 <211> 22 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Tree sequence peptide <400> 109 Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15 Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 110 <211> 66 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 110 tgcaaggttg ttgaggtttc aacctcgaag actggcaagc atggtcatgc taaatgtcat 60 tttgta 66 <210> 111 <211> 66 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 111 tgcaaggttg ttgaggtttc gacttccaaa actggcaagc acggtcacgc caaatgtcac 60 tttgtt 66 <210> 112 <211> 66 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 112 tgcaaggtgg ttgaggtatc gacttcgaag actgggaagc atggtcacgc caagtgtcac 60 tttgtt 66 <210> 113 <211> 66 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 113 tgcaaggttg ttgaggtttc gacttcgaag actgggaagc acggtcacgc aaagtgtcac 60 tttgtt 66 <210> 114 <211> 66 <212> DNA <213> Dianthus caryophyllus <400> 114 tgcaaggtgg ttgaggtttc tacctccaag actggcaagc acggtcatgc caaatgtcac 60 tttgta 66 <210> 115 <211> 66 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 115 tgcaaggtgg ttgaagtttc aacctccaag acaggcaagc acggtcatgc taaatgtcac 60 ttcgtg 66 <210> 116 <211> 66 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 116 tgcaaggttg tggaagtctc tacatccaaa actggcaagc acggtcacgc caaatgtcat 60 ttcgtt 66 <210> 117 <211> 66 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 117 tgcaaggttg ttgaggtctc cacttccaaa actggcaagc atggacatgc aaaatgtcac 60 tttgtg 66 <210> 118 <211> 66 <212> DNA <213> Medicago sativa <400> 118 tgcaaggtgg ttgaagtttc gacttcgaag accgggaagc atggacatgc caagtgtcat 60 tttgtt 66 <210> 119 <211> 66 <212> DNA <213> Medicago sativa <400> 119 tgcaaggttg ttgaggtttc tacttcaaaa acaggaaaac atggacatgc aaagtgtcac 60 tttgtt 66 <210> 120 <211> 66 <212> DNA <213> Medicago sativa <400> 120 tgcaaggtag ttgaagtttc aacttctaaa actggaaagc atggacatgc aaagtgtcac 60 tttgtt 66 <210> 121 <211> 66 <212> DNA <213> Lactuca sativa <400> 121 tgcaaggttg ttgaagtttc tacctccaag actgggaagc atgggcatgc taagtgtcac 60 tttgtc 66 <210> 122 <211> 66 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Tree oligonucleotide sequence <400> 122 tgcaaggtcg tggaggtttc aacctctaaa actggcaagc atggccatgc taaatgtcac 60 tttgtt 66 <210> 123 <211> 66 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Tree oligonucleotide sequence <400> 123 tgcaaggttg ttgaggtttc cacctcaaag acaggcaagc acggacatgc taagtgccac 60 tttgtg 66 <210> 124 <211> 66 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Tree oligonucleotide sequence <400> 124 tgcaaggttg tggaggtttc tacctctaaa actggcaagc acggccatgc caaatgtcac 60 tttgtt 66 <210> 125 <211> 66 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Tree oligonucleotide sequence <400> 125 tgcaaggttg ttgaggtttc aacctcaaag acaggcaagc atggacatgc taagtgccac 60 tttgtg 66 <210> 126 <211> 745 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <220> <221> CDS <222> (55)..(534) <400> 126 ttctccacag caaacacaga gaagttcata gcagaagaag agagagattt agct atg 57 Met 1 tct gat gaa gaa cac cat ttt gag tcc aaa gct gat gct ggt gcc tca 105 Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser 5 10 15 aaa act tac cct caa caa gct ggt act att cgc aag aat ggt tat ata 153 Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr Ile 20 25 30 gtt atc aaa ggc aga cct tgc aag gtt gtt gag gtc tcc act tcc aaa 201 Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 act ggc aag cat gga cat gca aaa tgt cac ttt gtg gca atc gac att 249 Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp Ile 50 55 60 65 ttc aat gca aaa aag ctt gaa gat att gtt cct tca tcc cac aat tgt 297 Phe Asn Ala Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn Cys 70 75 80 gat gtg cca cat gtc aat cgt act gac tat cag ctg att gac ata tct 345 Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile Ser 85 90 95 gaa gat ggt ttt gtg tct ctt ctt act gaa aat gga aac acc aaa gac 393 Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Asn Gly Asn Thr Lys Asp 100 105 110 gac ctc aga ctt ccc acc gat gac acc ctg ttg aac cag gtt aaa ggt 441 Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Asp Thr Leu Leu Asn Gln Val Lys Gly 115 120 125 gga ttt gag gaa gga aag gat ctc gtt ctg tct gtg atg tct gca atg 489 Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp Leu Val Leu Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 145 ggt gaa gag cag atc tgt gct gtg aag gac att ggt acc aag acc 534 Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Ile Gly Thr Lys Thr 150 155 160 tagttgtgtg cattctgcag cataaataat tgctttttag cgaagacgtt ttatatcttg 594 ttatcgtggt acctttgcaa tctgttttat cgtgaaaaca ccttatatct attggcatgg 654 cttgaatagt tgaaactcta atagtttctg tttggcataa ggcaatgaac tggatttgat 714 agcagaagta atctacatgt cacttttttt t 745 <210> 127 <211> 160 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum <400> 127 Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala 1 5 10 15 Ser Lys Thr Tyr Pro Gln Gln Ala Gly Thr Ile Arg Lys Asn Gly Tyr 20 25 30 Ile Val Ile Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser 35 40 45 Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala Ile Asp 50 55 60 Ile Phe Asn Ala Lys Lys Leu Glu Asp Ile Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80 Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gln Leu Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Asn Gly Asn Thr Lys 100 105 110 Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Asp Thr Leu Leu Asn Gln Val Lys 115 120 125 Gly Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp Leu Val Leu Ser Val Met Ser Ala 130 135 140 Met Gly Glu Glu Gln Ile Cys Ala Val Lys Asp Ile Gly Thr Lys Thr 145 150 155 160 <210> 128 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 128 Gly Ala Ala Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Cys Cys 20 25 <210> 129 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 129 ggggagctct tgttagtctc acttgg 26 <210> 130 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 130 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcaccaca cgcttgtcta 480 cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggatc 906 <210> 131 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 131 gctgcaacca tgtccgacga ggagcatcac tttgagtcca gtgacgccgg agcgtccaaa 60 acctaccctc aacaagctgg aaccatccgt aagaatggtt acatcgtcat caaaaatcgt 120 ccctgcaagg ttgttgaggt ttcaacctcg aagactggca agcatggtca tgctaaatgt 180 cattttgtag ctattgatat cttcaccagc aagaaactcg aagatattgt tccttcttcc 240 cacaattgtg atgttcctca tgtcaaccgt actgattatc agctgattga catttctgaa 300 gatggatatg tcagtttgtt gactgataac ggtagtacca aggatgacct taagctccct 360 aatgatgaca ctctgctcca acagatcaag agtgggtttg atgatggaaa agatctagtg 420 gtgagtgtaa tgtcagctat gggagaggaa cagatcaatg ctcttaagga catcggtccc 480 aagtgagact aacaa 495 <210> 132 <211> 662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 132 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat 300 ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 tcactaggca acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 at 662 <210> 133 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 133 gcgctcgagc tatgtctgat gaagaacacc 30 <210> 134 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 134 tttgagctcc agaatgcaca caactagg 28 <210> 135 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 135 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta 480 cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggatc 906 <210> 136 <211> 499 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 136 ctatgtctga tgaagaacac cattttgagt ccaaagctga tgctggtgcc tcaaaaactt 60 accctcaaca agctggtact attcgcaaga atggttatat agttatcaaa ggcagacctt 120 gcaaggttgt tgaggtctcc acttccaaaa ctggcaagca tggacatgca aaatgtcact 180 ttgtggcaat cgacattttc aatgcaaaaa agcttgaaga tattgttcct tcatcccaca 240 attgtgatgt gccacatgtc aatcgtactg actatcagct gattgacata tctgaagatg 300 gttttgtgtc tcttcttact gaaaatggaa acaccaaaga cgacctcaga cttcccaccg 360 atgacaccct gttgaaccag gttaaaggtg gatttgagga aggaaaggat ctcgttctgt 420 ctgtgatgtc tgcaatgggt gaagagcaga tctgtgctgt gaaggacatt ggtaccaaga 480 cctagttgtg tgcattctg 499 <210> 137 <211> 662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 137 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat 300 ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 tcactaggca acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 at 662 <210> 138 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 138 gcatgtcgac atgtctgacg aggagcacc 29 <210> 139 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 139 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta 480 cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggatc 906 <210> 140 <211> 661 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 140 tcgacatgtc tgacgaggag caccacttcg agtccagcga cgccggagct tccaaaacct 60 accctcagca ggctggtaac atccgcaagg gtggtcacat cgtcatcaag ggccgtccct 120 gcaaggttgt tgaggtttcg acttcgaaga ctgggaagca cggtcacgca aagtgtcact 180 ttgttgctat tgacatcttc actgctaaga agctcgagga tattgttccc tcttcccaca 240 attgtgatgt tccccatgtg aaccgtattg actaccagtt gattgatatc tctgagaatg 300 gctttgttag ccttttgacc gacagtggtg gcaccaagga cgacctcaag cttcccaccg 360 atgataatct cagcgctctg atgaagagtg gattcgagga gggaaaggat gtggtggtgt 420 ctgtcatgtc ttccatggga gaggagcaga tctgtgccgt caaggaagtt ggtggtggca 480 agtaaaaccc attctctgag agaggataat cttattacca gtggtcaatg ttataagaac 540 aagaacttgt tttttttcct ttttctaatt tagatcattt gtgttgtgtt tctttgttgc 600 aagacaacca ttatctatta ttggttttgg attgtttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 a 661 <210> 141 <211> 662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 141 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat 300 ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 tcactaggca acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 at 662 <210> 142 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 142 ggtgcacgcc ctgatgaagc agtgtcttgg ggtaaaataa ggggatctgc taaaactgtc 60 aaggtgtact gtgatgctac catagccttc cctttgttgg ttgctgaaac atttgcctcc 120 aagagagaac aaagctgtga gcacaagacc taagcccaag aaagcttacg tctcttttat 180 cggtttgttc ttccatcttg ttgttgtacc ctttgtcctg ctttacataa cattcatctc 240 taaaacaata ctacctcctt ttgacaaaaa ataaaaaaaa ttggaaaaat ggtttcacaa 300 gaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 325 <210> 143 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 143 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta 480 cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggatc 906 <210> 144 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 144 tttttttttt tttttttttt tattcttgtg aaaccatttt tccaattttt tttatttttt 60 gtcaaaagga ggtagtattg ttttagagat gaatgttatg taaagcagga caaagggtac 120 aacaacaaga tggaagaaca aaccgataaa agagacgtaa gctttcttgg gcttaggtct 180 tgtgctcaca gctttgttct ctcttggagg caaatgtttc agcaaccaac aaagggaagg 240 ctatggtagc atcacagtac accttgacag ttttagcaga tccccttatt ttaccccaag 300 acactgcttc atcagggcgt gcacc 325 <210> 145 <211> 662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 145 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 ttttcgctat cgaactgtgc aaatggaaat ggatggagaa gagttaatga atgatatggt 240 ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct cttatttgtt gtgtgttgaa 300 tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt aaaaatgtgt caaatcgtgg 360 cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg tagttgtacc attatgctta 420 ttcactaggc aacaaatata ttttcagacc tagaaaagct gaaatgttac tgaatacaag 480 tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 at 662 <210> 146 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 146 aagctcgaga tgtcggacga agagcacc 28 <210> 147 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 147 gtagagctcc accaatacca tctgcagc 28 <210> 148 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 148 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta 480 cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggatc 906 <210> 149 <211> 497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 149 atgtcggacg aagagcacca cttcgaatcc aaggccgatg ccggagcttc aaagacgtat 60 cctcaacaag ctggtactat tcgtaaaggt ggtcacatcg tcataaaaaa tcgtccttgc 120 aaggtggttg aagtttcaac ttccaagaca ggcaagcacg gtcatgctaa atgtcactcg 180 tggcaattga cattttcact ggaaagaaac ttgaggatat tgttccctct tctcacaatt 240 gtgatgttcc tcatgtgaat aggactgatt atcaacttat tgatatctct gaggatggct 300 ttgtgagtct gttgactgaa aatggtaaca ccaaggatga cttgagactc ccaactgatg 360 atactcttct ggctcaggtc aaagatggtt ttgctgaggg gaaagacctg gttctatcag 420 tgatgtctgc catgggagag gagcagattt gtggtatcaa ggacattggc cctaagtagc 480 tgcagatggt attggtg 497 <210> 150 <211> 662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 150 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat 300 ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 tcactaggca acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 at 662 <210> 151 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 151 cgactcgagc agccatgtct gacgagg 27 <210> 152 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 152 atcgagctca tcacttgggg ccaatatcc 29 <210> 153 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 153 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta 480 cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggatc 906 <210> 154 <211> 486 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 154 cagccatgtc tgacgaggag catcaatttg agtctaaggc tgatgccgga gcatcaaaaa 60 cttaccctca acaagctggt actattcgta agaacggtta tatcgtcatc aaaggccgtc 120 catgcaaggt tgtggaagtc tctacatcca aaactggcaa gcacggtcac gccaaatgtc 180 atttcgttgc tattgacatc ttcactggga agaagcttga ggatattgtc ccctcttcac 240 acaattgtga tgtgccccat gttaatcgta cagattatca gcttattgac atctctgaag 300 atggatttgt gagtctgctt actgacaatg gtaacaccaa ggatgacctc aggcttccta 360 ctgatgaaaa tctgctttca ctgatcaagg acgggtttgc cgagggtaag gacctcgttg 420 tgtctgttat gtcagctatg ggtgaggaac agattaatgc tttgaaggat attggcccca 480 agtgat 486 <210> 155 <211> 662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 155 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat 300 ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 tcactaggca acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 at 662 <210> 156 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 156 cactgctcac tagtttgatg gc 22 <210> 157 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 157 gcgaagcggc catggctcga gttttttttt tttttttt 38 <210> 158 <211> 413 <212> DNA <213> Lactuca sativa <400> 158 cactgctcac tagtttgatg gcagtgattc tggtgctcga cctgatgaag ctgtctcctg 60 ggggaaaata cgtggttctg ctaaatctgt caaggtgcac tgtgatgcaa ctatcgcgtt 120 ccctttactt gttgcagaaa catttgctgc aaagagagag ggggagatga aaaatgttga 180 gtcaaccaaa gctttggttt aaaaaggtgg aacagtgtag gacagggact catttttgat 240 attttgtttg ctaaaaaatg gtctttggaa gaatattgat gcacacaaac aaggagacaa 300 tgttactgat cttggagagt gtaatgtaaa atgtctaaat aatttcaaag cttctcacaa 360 caaatcaaac tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aactcgagcc atggccgctt cgc 413 <210> 159 <211> 388 <212> DNA <213> Lactuca sativa <400> 159 ctagtttgat ggcagtgatt ctggtgctcg acctgatgaa gctgtctcct gggggaaaat 60 acgtggttct gctaaatctg tcaaggtgca ctgtgatgca actatcgcgt tccctttact 120 tgttgcagaa acatttgctg caaagagaga gggggagatg aaaaatgttg agtcaaccaa 180 agctttggtt taaaaaggtg gaacagtgta ggacagggac tcatttttga tattttgttt 240 gctaaaaaat ggtctttgga agaatattga tgcacacaaa caaggagaca atgttactga 300 tcttggagag tgtacatgta aaatgtctaa ataatttcaa agcttctcac aacaaatcaa 360 acttaaaaaa aaaaaaaaaa aaactcga 388 <210> 160 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <220> <221> modified_base <222> (3) <223> a, t, c or g <220> <221> modified_base <222> (12) <223> a, t, c or g <220> <221> modified_base <222> (18) <223> a, t, c or g <400> 160 ggnttraayc gnathggnaa ytt 23 <210> 161 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <220> <221> modified_base <222> (9) <223> a, t, c or g <220> <221> modified_base <222> (21) <223> a, t, c or g <400> 161 tgrtcgganc crtcraaytc ngc 23 <210> 162 <211> 108 <212> DNA <213> Mycosphaerella fijiensis <400> 162 cgccaagcta tttaggtgac actatagaat actcaagcta tgcatccaac gcgttgggag 60 ctctcccata tggtcgacct gcaggcggcc gcgaattcac tagtgatt 108 <210> 163 <211> 487 <212> DNA <213> Mycosphaerella fijiensis <220> <221> CDS <222> (1)..(486) <400> 163 ggg tta aat cgt att gga aac ttc tta gtg cca aac gac aat tac tgc 48 Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Phe Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys 1 5 10 15 cgc ttt gaa gac tgg gtg atg cca atc ctc gac aca atg ctc gaa gaa 96 Arg Phe Glu Asp Trp Val Met Pro Ile Leu Asp Thr Met Leu Glu Glu 20 25 30 cag gaa gca tgc aag ggt tcg ggc gaa gca atc cac tgg act ccc agc 144 Gln Glu Ala Cys Lys Gly Ser Gly Glu Ala Ile His Trp Thr Pro Ser 35 40 45 aaa atc atc aac cgg ctt ggc aag gag gtc aac gac gaa tcg tcc gtg 192 Lys Ile Ile Asn Arg Leu Gly Lys Glu Val Asn Asp Glu Ser Ser Val 50 55 60 tac tac tgg gca tgg aag aac gac att cca gtg ttc tgt ccg gcg ctt 240 Tyr Tyr Trp Ala Trp Lys Asn Asp Ile Pro Val Phe Cys Pro Ala Leu 65 70 75 80 act gat ggc agt ctc gga gac atg ctg tac ttc cac acg ttc aaa tcc 288 Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Thr Phe Lys Ser 85 90 95 tca ccg cag cag ctt cga gtc gac att gtg gaa gac atc cga aag atc 336 Ser Pro Gln Gln Leu Arg Val Asp Ile Val Glu Asp Ile Arg Lys Ile 100 105 110 aac acc ctc gcc gtc cga gcc aag cgc act ggc atg atc att ctc gga 384 Asn Thr Leu Ala Val Arg Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly 115 120 125 ggc ggc att gtc aag cac cac atc gca aat gcc aac ctg atg cgc aat 432 Gly Gly Ile Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 130 135 140 ggc gcg gaa agc gca gtg tac atc aat acc gcg ccg aat tcg acg gat 480 Gly Ala Glu Ser Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Pro Asn Ser Thr Asp 145 150 155 160 ccg acc a 487 Pro Thr <210> 164 <211> 162 <212> PRT <213> Mycosphaerella fijiensis <400> 164 Gly Leu Asn Arg Ile Gly Asn Phe Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys 1 5 10 15 Arg Phe Glu Asp Trp Val Met Pro Ile Leu Asp Thr Met Leu Glu Glu 20 25 30 Gln Glu Ala Cys Lys Gly Ser Gly Glu Ala Ile His Trp Thr Pro Ser 35 40 45 Lys Ile Ile Asn Arg Leu Gly Lys Glu Val Asn Asp Glu Ser Ser Val 50 55 60 Tyr Tyr Trp Ala Trp Lys Asn Asp Ile Pro Val Phe Cys Pro Ala Leu 65 70 75 80 Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Thr Phe Lys Ser 85 90 95 Ser Pro Gln Gln Leu Arg Val Asp Ile Val Glu Asp Ile Arg Lys Ile 100 105 110 Asn Thr Leu Ala Val Arg Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly 115 120 125 Gly Gly Ile Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 130 135 140 Gly Ala Glu Ser Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Pro Asn Ser Thr Asp 145 150 155 160 Pro Thr <210> 165 <211> 214 <212> DNA <213> Mycosphaerella fijiensis <400> 165 aatcgaattc ccgcggccgc catggcggcc gggagcatgc gacgtcgggc ccaattcgcc 60 ctatagtgag tcgtattaca attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 120 cctggcggta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 180 agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc aaca 214

Claims (25)

  1. 분리된 아라비돕시스(Arabidopsis) 손상-유도된 eIF-5A
  2. 분리된 토마토 손상-유도된 eIF-5A
  3. 아라비돕시스 손상-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드
  4. 토마토 손상-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드
  5. 제 3항의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 전사를 제공하기 위해 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함한 식물의 형질전환을 위한 발현 벡터
  6. 제 4항의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이 드의 전사를 제공하기 위해 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함한 식물의 형질전환을 위한 발현 벡터
  7. 손상-유도된 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 전사를 제공하기 위해 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함하여 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 전사가 식물 내에서 내생적 손상-유도된 eIF-5A의 발현을 억제하게 하는 벡터를 식물의 적어도 하나 이상의 세포의 게놈 내로 통합시키는 것으로 포함한 식물 내 내생적 손상-유도된 eIF-5A 발현의 억제 방법
  8. 제 7항에 있어서, 상기 발현 억제는 야생형 식물과 비교시 병원균 이입에서 기인한 독성 손상에 대한 증가된 저항성을 부여함을 특징으로 하는 방법
  9. 분리된 아라비돕시스 생장 eIF-5A
  10. 분리된 토마토 생장 eIF-5A
  11. 분리된 카놀라 생장 eIF-5A
  12. 센스 방향의 생장 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사를 제공하기 위해 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함한 식물의 형질전환을 위한 발현 벡터
  13. 생장 eIF-5A의 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사를 제공하기 위해 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함하여 상기 폴리뉴클레오타이드의 전사가 식물 내에서 생장 eIF-5A의 발현을 증가시키게 하는 벡터를 식물의 적어도 하나 이상의 세포의 게놈 내로 통합시키는 것으로 포함한 식물 내 생장 eIF-5A 발현의 증가 방법
  14. 분리된 카놀라 DHS
  15. 분리된 자주개자리 DHS
  16. 분리된 바나나 DHS
  17. 분리된 미루나무 DHS
  18. 카놀라 DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드
  19. 자주개자리 DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드
  20. 바나나 DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드
  21. 제 18항의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 전사를 제공하기 위해 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함한 식물의 형질전환을 위한 발현 벡터
  22. 제 19항의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 전사를 제공하기 위해 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함한 식물의 형질전환을 위한 발현 벡터
  23. 제 20항의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 전사를 제공하기 위해 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함한 식물의 형질전환을 위한 발현 벡터
  24. DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 전사를 제공하기 위해 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함하여 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드의 전사가 식물 내에서 내생적 DHS의 발현을 억제하게 하는 벡터를 식물의 적어도 하나 이상의 세포의 게놈 내로 통합시키는 것으로 포함한 식물 내 내생적 DHS 발현의 억제 방법
  25. a) 상추 DHS의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 및
    b) DHS의 억제된 발현을 지닌 형질전환 상추를 생성하기 위해 상기 안티센스 폴리뉴클레오타이드가 발현되고 상기 발현이 내생적 DHS 발현을 억제하도록 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 실시가능하게 결합된 조절 서열을 포함한 벡터를 상추 식물의 적어도 하나 이상의 세포의 게놈 내로 통합시키는 것을 포함하고,
    상기 내생성 DHS 발현의 억제가 야생형 상추에서의 갈변과 비교시 갈변의 지연을 나타내는 형질전환 상추 식물을 유발함을 특징으로 하는,
    DHS 발현의 억제에 의한 상추 내 갈변의 지연 방법
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