TWI337185B - Isoforms of eif-5a: senescence-induced eif5a; wounding-induced eif-5a; growth eif-5a; and dhs - Google Patents

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Description

1337185 六、發明說明： 本申請案為2000年11月29曰申請之第〇9/725,〇19號的部 分接續申請案，該第09/725,019號為2000年6月19曰申請之 第09/597,771號，現為美國專利第6 538,182號的部分接續 申請案，該第09/597,771號為1999年7月6日申請而現在已 經放棄之第09/348,675號的部分接續申請案。本申請案主 張2003年6月20日申請之美國臨時申請案第6〇/479,968號及 第60/479,969號*以及20〇4年5月14日申請之美國臨時申請 案第60/570,833號及第60/570,835號的優先權，並且該等臨 時申請案以引用的方式併入本文中。 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於真核生物起始因子5A(「eIF_5A」）的獨特 同功異型物及編碼eIF-5A的聚核苷酸，以及脫氧羥腐胺離 胺酸合成酶（「DHS」）及編碼DHS的聚核苷酸，以及涉及 調節同功異型物eIF-5A及DHS表現的方法。 【先前技術】 老化為在植物壽命中生物發育的終期。其預示死亡，並 在生物組織化的各種層面出現，包括整個植物、器官、花 及果實、組織以及個別細胞。 死亡的開始可藉由不同的内部與外部因素誘發^老化為 植物或植物組織，諸如果實、花及葉片壽命中複雜且受高 度調控的發育階段。老化導致細胞獏及大分子的協調瓦 解’以及隨後代謝產物移動至植物的其他部分。 除了在正常植物發育期間發生的程式化老化之外，細胞 94139-990728.doc 1337185 及組織的死亡以及代謝產物的隨 後再移動作為對外部環境 因素之協調反應而發生。誘發老化之過早開始丨亦將:其P 為壞死或細胞凋亡）的外部因素包括環境逆境，諸如、σ 度、乾旱、不足光線或營養供應’以及病原體侵襲。暴露 在環境逆境下的植物組織亦產生乙烯，通常稱為逆^竟& # (Buchanan-Wollaston, V., 1997, J. Exp. Botany, 48:181 199; Wright, Μ” 1974，Plant, 120:63-69)。已知乙稀在一 些植物中引起老化。 老化並非被動的過程，反而為一受主動調控的過程其 涉及特定基因的協調表現。在老化期間，總RNA的含量降 低，並關閉許多基因的表現（Bate等人，1991，j Εχρα
Botany, 42, 801-1 1 ; Hensel等人，1993, The Plant Cell，5, 553-64)。然而，愈來愈多的證據證明老化過程依賴核基因 的重新轉錄。例如，藉由mRNA及蛋白質合成的抑制劑以 及去核阻斷老化。出於活體外轉譯實驗，使用來自老化葉 片及綠葉之mRNA進行分子研究，顯示在老化葉片中葉片 蛋白質產物的模式改變（Th〇mas等人，1992，j piant
Physiol·’ 13 9，403-12)。使用差示篩選及扣除雜交技術， 已自多種不同植物中鑑別出代表老化誘發基因的許多 cDNA純系，該等植物包括單子葉及雙子葉植物諸如擬 南芥（Arabidopsis)、玉黍蜀、黃瓜、蘆筍、番茄、稻榖及 馬鈴薯在老化期間特異性表現之基因的鑑別，是欲進行 之老化需要重新轉錄的堅定證據。 在老化期間發生的事件似乎高度協調，容許細胞組份在 94139-990728.doc •4. 1337185 壞死及死亡發生之前最大程度地使用。必須發生涉及特定 信號感知的複雜交互作用及基因表現級聯的誘導，來調斤 該過程》編碼老化相關蛋白質之基因的表現或許經由共同 的活化劑蛋白質調控，而該等活化劑蛋白質又受荷爾蒙传 號直接或間接活化。關於涉及該過程之初始信號傳導咬後 續協調的機制所知不多β 協調的基因表現需要涉及轉錄及轉譯的因子，包括起始 因子。已經在多種生物，包括植物中分離並表徵轉譯起始 因子基因。轉譯起始因子可控制mRNA群體自核中移出的 速率，其與核糖體締合的速率，並在一定程度上可影響特 定 mRNA 之穩定性。（Zuk 等人，eMB〇 j 17:2914_ 2925(1998)。實際上，咸信一種不為整體轉錄活性所需的 此類轉錄起始因子使mRNA的特定子集自核穿梭至細胞質 以供轉譯。Jao等人，J. Cell. Biochem. 86:590-600,（2〇〇2);
Wang 等人，】Bio1 Chem 276:17541-17549(2001) ; R0S0rius 等 人，J. Cell Sci.，112, 2369-2380(1999)。已知該轉譯因子為真 核生物起始因子5A(eIF-5A)，並為唯一已知含有胺基酸經 腐胺離胺酸的蛋白質。Park等人，J Biol Chem 263:15264-15269(1988) 〇 真核生物轉譯起始因子5A(eIF-5A)為尺寸約為17 KDa的 必要蛋白質因子，其參與真核生物細胞蛋白質合成的起 始其特徵在於存在羥腐胺離胺酸[N-(4-胺基-2-羥丁基）離 月女I ] 種獨特的經修飾胺基酸，已知僅存在於eiF-5 A 中。羥腐胺離胺酸係經由丁胺基自多元胺亞精胺轉移至 94139-990728.doc 1337185 elF 5 A中之特定離胺酸殘基的側鏈胺基並發生羥基化，在 轉譯後形《。eIF_5A的活化涉及亞精胺之丁胺基轉移至 eIF-5A的離胺酸’形成羥腐胺離胺酸，並活化eiF_5A。在 真核生物中，脫氧羥腐胺離胺酸合成酶（DHS)介導eIF-5A 中羥腐胺離胺酸之轉譯後合成。使用曱硫胺醯基-嘌呤黴 素k疋’顯示羥腐胺離胺酸修飾在活體外對於eIF 5 a活性 而言為必要的。
在轉譯後藉由脫氧羥腐胺離胺酸合成酶（DHS ; EC
1.1.1.249)及脫氧羥腐胺離胺酸羥基化酶（dhh ; EC
1.14.99.29)的作用’轉化保守性離胺酸殘基，在eIF_5a上 升> 成經腐胺離胺酸《已自數個植物物種中分離出dhs，包 括番益（GenBank寄存編號AF296077) '擬南芬（Arabidopsis thaliana)(AT-DHS ; GenBank 寄存編號 AF296078)、於草 (Ober 及 Hartmann, 1999)、康乃馨（GenBank 寄存編號 AF296079)及香蕉（GenBank 寄存編號 AF296080)，但 DHH 之基因尚未獲得公認。 DHS經由添加衍生自亞精胺之丁胺基，將eIF_5A之保守 性離胺酸殘基轉變為脫氧羥腐胺離胺酸。隨後藉由DHH將 eIF-5 A之該中間物形式羥基化成為羥腐胺離胺酸^ Park等 人，Biol. Signals 6，1 15-123(1997)。eIF-5A的脫氧羥腐胺 離胺酸及羥腐胺離胺酸兩種形式，均能夠在活體外結合 mRNA。Liu等人，Biol Signals 6，166-1 74( 1997)。雖然不 完全瞭解eIF-5 A的功能，但有一些證據表明其可調控細胞 分裂（Park等人，J Biol Chem 263:15264-15269 (1998); 94139-990728.doc -6- 1337185
Tome等人，Biol Signals 6:150-156,（1997))及老化。（Wang 等人，J. Biol. Chem. 276(20):17541-17549 (2001))。亦參 見美國專利第6,538,1 82號及美國專利申請案第〇9/725,019 號，全部以引用的方式併入本文中。似乎已知數種生物體 具有一種以上的eIF-5 A同功異型物符合每個同功異型物為 可在涉及諸如細胞分裂及老化之過程的特定mRN A組的穿 梭工具的前提。
Wang等人證實增加DHS mRN A的含量，與番％之果實軟 化及天然及逆境誘發之葉片老化有關。Wang等人，J.
Biol· Chem· 276(20):17541-1 7549(2001)。此外，當在轉殖 基因番茄植物中，藉由引入受組成性啟動基因調控之DHS 反義cDNA片段來抑制DHS的表現時’如藉由延遲果實軟 化及腐敗所證實，得自該等轉殖基因植物的番茄果實顯示 老化顯著延遲。參見2003年1 1月29日申請之美國專利第 6,538,182號及美國專利申請案第〇9/725,0 19號，全部以引 用的方式併入本文申。因為已知DHS活化elF-5A，該等資 料表明羥腐胺離胺酸修飾之eIF-5 A(活性eiF_5A)可經由選 擇性轉譯老化所需之mRNA種類來調控老化。此可經由在 擬南芥（「AT」）中，受組成性啟動基因控制的全長或 3'UTRcDNA的反義使DHS向下調節而進一步證實。藉由向 下調節擬南芥DHS(「ΑΤ-DHS」）表現，並使其較不可供 eIF-5A活化作用利用，使老化延遲約2週（參見美國專利第 6,538,182號）。在轉殖基因植物中不僅可觀察到老化延 遲，而且亦可觀察到種子產量增加，逆境耐受性增加及生 94139-990728.doc 1337185 物質量增加，其中每個表現型的程度由DHS向下調節的程 度決定。因為如藉由南方墨點法（s〇uthern bi〇t)(Wang等 人，2001)及BLAST分析所示，番茄及擬南芥在其基因組 中僅有一個DHS複本，所以為了靶向負責使老化轉錄物穿 梭出核外的特定eIF_5A同功異型物，必須鑑別出eiF_5A的 老化特異性同功異型物，並經由（3，UTR的）老化誘發之elF_ 5A的反義構築體，或藉由利用植物向下調節過度表現之基 因（亦即經由使用有義聚核苷酸的使用產生過度表現）的天 然能力’特異性地向下調節該同功異型物。 植物缺乏免疫系統，並因此具有應付病毒的獨特方法_ 稱為共抑制，該作用導致病毒RNA的序列特異性降解。當 轉殖基因受強有力之組成性啟動基因的控制時如花椰菜 花葉病毒雙35S啟動基因，其對植物表現為病毒轉錄物， 並發生序列特異性降解，但不僅針對轉殖基因，亦會針對 内源 1·生基因。（在 Fagard 及 Vaucheret，Annual Review. Plant Physiol. piant Mol. Biol” june; 51:167_194 (2〇〇〇)中回 顧）。有一些證據證明共抑制可能是有效的，即使並不比 反義抑制内源性基因之表現以便向下調節更有效。 【發明内容】 本發明提供真核生物起始因子5八（reIF_5A」）的同功異 型物：老化誘發之eIF_5A ;創傷誘發之eIF_5A ;及生長 eIF-5 A，以及編碼該三種因子的聚核苷酸。本發明提供該 三種eIF-5A同功異型物的反義聚核皆酸。本發明亦提供^ 括該三種eIF-从同功異型物之有意義及反義聚核苦酸的表 94I39-990728.doc 1337185 現載體。本發明亦關於涉及調節（增加/向上調節或抑制）該 專因子表現的方法。 本發明亦關於脫氧經腐胺離胺酸合成酶（「) 、乂 及編碼DHS之聚核苷酸。本發明亦提供dHs的反義聚核芽 酸。本發明亦提供包括DHS之有意義及反義聚核苦酸的表 現載體。本發明亦關於涉及調節（增加/向上調節或抑 制）DHS表現的方法。 【實施方式】 當在本文中使用「植物」一詞時，係指完整的植物、植 物部分、植物細胞或一群植物細胞。可在本發明之方法中 使用的植物類型，包括但不限於例如對乙烯敏感及對乙烯 不敏感的植物；有果實之植物’諸如杏、蘋果、柑橘、香 筹、、葡萄、梨、番祐、草每、酷梨等等；蔬菜植物，諸如 胡蘿萄、婉豆、萵苣、甘藍、蕪菁'馬鈴薯、花挪菜、產 筒等等；花，諸如康乃馨、玫瑰、菊花等等；農作植物， 諸如玉米、稻穀、大豆、紫花苜猜及其類似物，以及諸如 落葉樹、針葉樹、常綠樹等等的森林物種，及通常可接受 並表現本發明之DNA分子的任何植物。其可包括各種倍數 體層面的植物’包括單倍體、二倍體、四倍體及多倍體。 該植物可為單子葉植物或雙子葉植物。 在本文中將轉殖基因植物定義為以—些方式遺傳改造的 植物’包括但不限於在其基因組内併入異源或同源老化绣 發之eIF-5 A、創傷誘發之eIF_5 A、生長“Η A或則的植 物。改變的遺傳物質可編碼蛋白f，包括調控或控制序 94139-990728.doc 1337185 列，或可為或包括反義序列或有意義序列，或編碼反義 RNA或有思義RNA，其對植物的老化誘發之eIp_5 a、創傷 誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS DNA或mRNA序列或其 一部分為反義或有意義。將「轉殖基因」或「轉殖基因序 列」定義為已經併入轉殖基因植物内的外來基因或部分序 列。 當在本文中使用「雜交」一詞通常用來意謂在熟習此項 技術者依據探針序列及目標序列的性質將顯而易見的適當 嚴格度條件下的核酸雜交作用。雜交及洗滌的條件為此項 技術中已熟知’並且依據所要嚴格度，藉由改變保溫時 間、溶液的溫度及/或離子強度對條件進行調整可容易地 完成。參見，例如Sambrook，J·等人，分子選殖：實驗室 手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual)，第 2版，
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1 989。藉由所雜交之序列的長度，尤其探針序列的長度、 核酸之相對G-C内含量及欲容許之錯配量，來指定條件的 選擇。當希望在具有較低互補度之股之間發生部分雜交 時’低嚴格度條件較佳。當希望完全或接近完全的互補 時’高嚴格度條件較佳。在本文中稱為高嚴格度條件者為 如下·雜交溶液含有6X S.S.C.、0.01 M EDTA、IX登哈特 氏溶液（Denhardt’s solution)及0.5% SDS。關於所選殖£^八 之片段，在約68 C下進行雜交約3至4小時，至於總真核生 物DNA ’進行約12至約16小時。至於較低嚴格度，將雜交 溫度降至約42°C，低於雙股的解鏈溫度（τΜ)。已知丁^^為匕 94139-990728.doc -10· 1337185 畺及雙股長度以及溶液之離子強度的函數。 田在本文中使用「實質序列一致性」或「實質同源性」 一詞時，指示核酸序列或胺基酸序列顯示與另—核苷酸或 胺基酸序列實質上結構或魏相等。在具有實質序列一致 性或實質同源性的序列之間的㈣結構或功能差異將最 小，亦即其將不影響該序列在所要應用中發揮指定功能的 旎力。差異可歸因於例如，在不同物種間所使用之密碼子 中的固有變化。若在兩個或兩個以上不同序列之間存在大 量序列重疊或相似性，或若不同的序列顯示出類似的物理 特徵，則將結構差異視為微量，即使序列的長度或結構有 差異。該等特徵包括，例如在規定條件下雜交的能力或 在蛋白貝的隋況中為免疫交叉反應性、類似的酶活性等 等。该等特徵中的每一者可由熟習此項技術者藉由業内已 知的方法容易地測定。 此外’若在兩個核苷酸序列之間，序列具有至少約 70°/。、較佳80°/。，且最佳約9〇%的序列相似性，則其「實 吳上互補」。若在多肽之活性部分之間，兩個胺基酸序列 具有至少70¾相似性’則其實質上同源。 當在本文中使用片語「與DNA或RNA分子之相應部分雜 父」時’係指與例如寡核苷酸、聚核苷酸或任何核苷酸序 列（以有意義或反義之方向）雜交之分子識別並與在具有大 致相同尺寸並具有足夠序列相似性之其他核苷酸中的序列 雜父’以便在適當的條件下實現雜交。例如來自番茄創傷 誘發之eIF-5A的3'密碼或非密碼區之1〇〇個核苷酸長的反義 94139-990728.doc 1337185 分子，將識別並與分別AT創傷誘發之eIF_5A基因或任何其 他植物的創傷誘發之eIF-5A基因之3,密碼或非密碼區内之 核苷酸序列的約100個核苷酸部分雜交，只要在兩個序列 之間有約70%或更高的序列相似性。應瞭解「相應部分」 的尺寸將容許在雜交中有一些錯配，使得「相應部分」可 以比與其雜交的分子小或大，例如大或小20-30°Λ，較佳大 或小不超過約12-150/〇。 當在本文中使用核酸（或聚核苷酸）的「功能衍生物」一 詞時’係指編碼老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF_5A、 生長eIF-5A或DHS之基因或核苷酸序列的片段、變異體、 同系物或類似物。功能衍生物保留老化誘發之eIF 5A、創 傷誘發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS編碼DNA的至少一部 分功能’其容許其符合本發明的效用。該功能可包括在高 嚴格度條件下’與天然經分離老化誘發之eIF_5 a、創傷誘 發之eIF-5A、生長eIF-5A或DHS，或來自其他植物之實質 上同源的DNA，或其mRNA轉錄物雜交的能力，且該老化 誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF-5A、生長eiF_5A或DHS以 反義方向抑制老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eip_5A、生 長eIF-5A或DHS的表現。 基因或DNA序列的「片段」係指分子的任何子集，例如 較短的聚核苷酸或寡核苷酸。「變異體」係指實質上類似 於完整基因或其片段的分子’諸如具有一或多個經取代核 苷酸的核苷酸取代變異體，但其仍維持與特定基因雜交或 編碼與天然DNA雜交之mRNA轉錄物的能力。「同系物 94139-990728.doc -12- 1337185 係指來自不同植物屬或種的片段或變異體序列。「類似 物」係指非-天然的分子’實質上類似於完整分子、變異 體或其片段或發揮與完整分子、變異體或其片段相關的功 能。 「調節表現」意謂抑制或向上調節表現。「抑制表現」 係指缺乏或可偵測地降低來自目標基因，諸如老化誘發之 eIF-5A、創傷誘發之eiF_5A、生長eIF_5A或DHS之蛋白質 及/或mRNA產物的含量。「向上調節」或「過度表現」係 指可偵測地增加來自目標基因，諸如老化誘發之eIF_5 a、 創傷誘發之eIF-5A、生長elF-5A或DHS之蛋白質及/或 mRNA產物的含量。 本發明之經分離的聚核苷酸包括分離自天然來源、以重 組方式產生或合成者。 本發明之經分離的肽包括分離自天然來源、以重組方式 產生或合成者。本發明之經分離的蛋白質包括以融合蛋白 質形式表現的老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF_5A、生 長eIF-5A或DHS，較佳包括與麥芽糖結合蛋白質融合的 eIF-5A或 DHS。 本發明之老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF_5A、生長 eIF-5A或DHS肽的「功能衍生物」，包括老化誘發之eiF_ 5A、創傷誘發之eIF_5A、生長eIF_5A或DHS的片段、變異 體、類似物或化學衍生物，其保留至少一部分的活性或與 對eIF-5A同功異型物或DHS特異性之抗體的免疫交又反應 性。eIF-5A或DHS肽的片段係指分子的任何子集。可藉由 -13- 94l39-990728.doc
S 1337185 直接化學合成例如使用此項技術中已熟知的方法來製造變 異體肽。eIF-5 A或DHS肽的類似物係指非天然的蛋白質， 其貫質上類似於完整的蛋白質或其片段。eIF_5 A或DHS的 化學衍生物含有正常並非肽或肽片段一部分的額外化學部 分。可藉由使該肽之目標胺基酸殘基與能夠與所選擇之側 鏈或末端殘基起反應的有機衍生劑反應，將稀釋引入肽或 其片段内。 可藉由培養用本發明之核苷酸序列（以有意義方向）轉型 的細胞，容許細胞合成蛋白質，並隨後視所用選殖方案而 定自培養基或細胞萃取物以游離蛋白質或以融合蛋白質之 形式分離該蛋白質’來產生本發明之eIF_5A或DHS肽。或 者，可在無細胞系統中產生蛋白質。Ranu等人，Meth.
Enzymol·, 60:459-484, (1979) ° 使用此項技術中已熟知的習知技術，進行質體DNA的製 備、限制酵素消化、DNA的瓊脂糖凝膠電泳、蛋白質的聚 丙烯醯胺凝膠電泳、PCR、RT-PCR、南方墨點法（Southern blots)、北方墨點法（Northern blots)、DNA連接及細菌轉 型。參見’例如Sambrook，J.等人，分子選殖：實驗室手 冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual)，第 2版， Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor，NY, 1989。 核酸雜交的技術由Sambrook揭示。 在Sambrook，等人，分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual),第 2 版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，Ν·Υ·(1989)，以及 94139-990728.doc • 14· 1337185
Maniatis，T.等人’基因表現之控制中的分子機制 (Molecular mechanisms in the Control of Gene expression), 編，Nierlich，等人’編，Acad. Press, N_Y.(1976)中，揭 示建構本發明之重組核苷酸分子的程序，兩者全部以引用 的方式併入本文中。 可藉由DNA轉型，使用任何此項技術中已知的植物轉型 方法’來製備根據本發明製造的轉殖基因植物。植物轉型 方法包括將植物、組織或細胞與根瘤農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)直接共培養或直接感染（Miki 寺人 ’ Meth. in Plant Mol. Biol, and Biotechnology，（1993)， 第67-8 8頁）；基因直接轉移至原生質體内或原生質體攝入 (Paszkowski 等人 ’ EMBO J·, 12:2717(1984));電穿孔 (Fromm等人，Nature, 3 19:719(1986));粒子轟擊（Klein 等 人 ’ BioTechnology，6:559-563(1988));注射至幼苗及植物 的分生組織内（De LaPena等人，Nature，325:274-276(1987)); 注射至培養細胞及組織的原生質體内（Reich等人，
BioTechnology，4:1001-1004(1986))。 通常自轉型過程獲得完整的植物。自原生質體、癒傷組 織、組織部分或外植體等再生植物。獲自其中eiF_5A同功 異型物或DHS之表現已改變的再生轉殖基因植物的植物部 分，諸如葉片、花、果實、種子及其類似物，均納入在本 文中使用之「植物」的定義中。將再生植物的後代、變異 體及突變種亦納入「植物」的定義中。 eIF-5A總論 94139-990728.doc •15- 1337185 本發明係關於三種不同的eIF_5A同功異型物：老化誘發 之eIF-5A ;創傷誘發之eIF_5a ;及生長eiF-5A。本發明提
供分離自各種植物物種之eIf-5A的各種同功異型物，以及 分離各種同功異型物eIF_5A的方法。本發明亦提供編碼該 等本發明之各種eIf_5A同功異型物的聚核苷酸。本發明亦 提供eIF-5 A之同功異型物的反義聚核苷酸，以及含有該等 聚核苷酸或反義聚核苷酸的表現載體。在一些實施例中， 提供經由使用含有eIF_5A同功異型物之反義聚核苷酸的表 現載體轉型植物，來抑制内源性eIF_5As表現的方法。在 一些實施例中，提供藉由以有意義之方向提供含有eIF_5A 同功異型物之聚核苷酸的表現載體，向上調節内源性 5A同功異型物的方法。 不同的同功異型物在天然狀況下視植物之生命階段或植 物的狀況而定受到向上或向下調節。例如，在正在老化的 組織中，老化誘發之eIF_5A同功異型物受到向上調節。認 為老化誘發之eIF_5 A藉由使mRNA的特定子集（參與老化途 控者）自核穿梭至細胞質之間以便轉譯，來參與植物或植 物，.且織的進一步老化。藉由向下調節或抑制老化誘發之 eIF-5A的表現，可在植物及/或植物組織中延遲老化。與非 轉型或野外型的植物相比較，在轉型/轉殖基因植物中老 化延遲表現為具有較大的生物質量、果實的存放期延長、 化的存放期延長、種子尺寸增加及種子產量增加。 當植物及/或植物組織暴露在受傷事件，諸如寒冷、脫 水或機械力下時，創傷誘發之eIF_5 A同功異型物受到向上 94l39-990728.doc -16- 1337185 調節。藉由向下調節創傷誘發之eIF_5A的表現，與在非轉 型或野外型植物中對病毒傷害的抗性相比較，對植物賦予 了增加的對起因於病原體進人之病毒傷害的抗性。 當植物處於生長期時，生長eIF-5A同功異型物受到向上 調節。藉由向上調節生長抓5A，所得轉殖基因植物具有 增加的種子尺寸、增加的生物質量，以及增加的種子產 量。 圖1顯示分離自擬南芬（「At」）之eIF_5A的三種同功異型 物的比對。圖2顯示該三種同功異型物之密碼區的比對。 圖3-5顯示三種同功異型物的基因組序列。 西方墨點(圖8)顯示在不同植物生命階段中，該三種同 功異型物的表現。圖8顯示老化誘發之因子eiF_5A同功異 型物之量隨著葉片年齡的增加而增加。其未見於未綻放的 化牙、果莢或莖中，但可在已經浸潤的種子中見到。在已 經浸潤的種子中’有子葉組織及正在生長的胚芽。因此， 老化誘發之eIF-5 A存在於已經浸潤的種子中，因為子葉組 織著胚芽生長而逐漸老化。在已經浸潤的種子中見到生 長eIF-5A，因為胚芽正積極地生長。在果莢、種子及莖中 見到創傷誘發之eIF_5A，因為收獲該等組織時引起一些創 傷。 雖然在不同的同功異型物之間，以及在不同植物物種的 同功異型物之間有高度同源性（約85%)，但不同的同功異 1物在3 UTR中彼此不同。一個在同功異型物之間以及在 物種之間南度保守區域為認為是羥腐胺離胺酸位點的區 94139-990728.doc •17- Ί337185 域。咸信羥腐胺離胺酸位點為以下胺基酸：5,_ CKVVEVSTSKTGKHGHAKCHFV-3，(SEQ ID NO:」。關於 各種eIF-5A同功異型物及數個植物物種的比對，參見圖 85 〇
老化誘發之eIF-5A 老化誘發之eIF-5 A表現於老化組織中。本發明係關於擬 南芬、番茄及康乃馨植物中老化誘發之eIF-5A的發現。在 老化纽織中老化誘發之eIF_5 A受到向上調節，且其在植物 及植物組織中參與誘發老化相關形態改變。在植物中抑制 老化誘發之eIF-5 A的表現，可用來在植物中改變老化及老 化相關過程·>可經由使用反義構築體，或經由使用有意義 構築體而達成共抑制，進行向下調節。在轉殖基因植物中 抑制老化誘發之eIF-5A的表現，結果產生各種形態改變， 包括植物生物質量增加、果實軟化或腐敗延遲、切花或諸 如萵苣葉之植物組織褐變延遲、種子產量增加及種子尺寸 增加。 因此，本發明的一個實施例為自擬南芥中分離的老化誘 t之eIF-5A。胺基酸序列提供於圖59中，並為SEq 一。 編碼該胺基酸的聚㈣酸提供於圖59t，並為seqidn〇: —。 本發明的另-實施例為自中分離的老化誘發之他 5A。胺基酸序列提供於圖”及咐，並為seqidn〇:—。 編碼該胺基酸的聚㈣酸提供於圖57及86中，並為seq⑴ NO: _。 本叙月的卩冑鈿例為自康乃馨中分離的老化誘發之 94139-990728.doc 1337185 elF-5A。胺基酸序列提供於圖58中，並為seq 碼該胺基酸的聚核苷酸提供於圖58中，並為SEqidn〇: 本發明亦提供老化誘發之eIF_5A的經分離之聚核芽酸， 其於上文列舉之SEQ ID NO具有90%的序列同源性，並在 南嚴格度條件下與所列舉之SEq ID NO的互補序列，以及 編碼老化誘發之eIF-5A者雜交。 本發明亦提供老化誘發之6117_5人的反義聚核苷酸。反義 聚核苷酸可具有任何長度，只要其能夠抑制表現即可。在 些貫施例中，反義聚核苷酸包括全長密碼序列，而在其 他特別較佳實施例中，反義聚核苷酸係針對3，UTR，因為 eIF-5A的不同同功異型物在同功異型物3，UTR中具有更高 度的改變。在一些實施例中，反義聚核苷酸係針對5，非密 碼序列。已知主要與5，_非密碼序列互補的反義聚核苦酸為 編碼轉錄因子之基因之表現的有效抑制劑。Branch，m a.，
Molec. Cell Biol., 13:4284-4290(1993)。 當在本文及申請專利範圍中使用「老化誘發之eiF_5A的 反義聚核苷酸」一詞時，其不僅涵蓋與所列舉之seq ι〇 NO之互補序列共享⑽％同源性的彼等反義聚核㈣，亦 涵蓋作為功能變異體的彼等反義聚核苦酸。功能變異體為 天然或人造的彼等變異體，與老化誘發之eIF_5A的相應部 分具有至少80%序列同源性’且在高嚴格度條件下與:雜 交。此外’變異體必須具有本發明指定之功能，亦即當將 其引入表現載體内’且其中將該載體併入至少一個植物細 胞的基因組内時’能夠調節内源性老化誘發之抓从的表 94139-990728.doc -19- 1337185 現。熟習此項技術者能夠瞭解可在不會不利地影響反義聚 核芽酸與轉錄物結合’並降低或抑制基因表現之能力的序 列中，進行非實質的改變。因此，「反義聚料酸」一詞 包括彼等實質上與轉錄物互補，且仍維持特異性地結合唁 轉錄物’並抑制或降低基因表現之能力的聚核苦酸。關於 反義的普通討論，參見Albens等人，細胞的分子生物學 (Molecular Biology of the ㈣），第2版，p祕心叫，
Inc. ^〜丫0圮仏〜丫0纶，1989(在特殊的第195 196頁，以引 用的方式併入本文中）。 本發明的一個實施例提供包括（如上述本發明之）老化誘 發之eIF-5A聚核皆酸或（如上述本發明之）老化誘發之 5A的反義聚核苷酸的表現載體。載體可為質體，或較佳可 為病毒或此項技術中已知可在植物細胞或細菌細胞中複製 及表現其上所編碼之基因的其他載體。載體整合於染色體 中，以使其能夠轉錄，產生所要老化誘發之eIF_5A RNA的 反義聚核苷酸。可藉由此項技術中標準的重組DNA技術方 法，建構該等質體或病毒載體。例如，載體可為含有在原 核生物宿主中有功能的複製系統，及本發明之反義聚核苷 酸的質體載體。或者，載體可為含有在農桿菌中有功能的 複製系統，及本發明之反義聚核苷酸的質體。能夠在農桿 菌中複製的質體為此項技術中已熟知。參見Miki等人，將 外來DNA引入植物中的程序，植物分子生物學及生物技術 中的方法（Procedures for Introducing Foreign DNA Into Plants, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)，編B.R. 94139-990728.doc •20- 1337185
Glick及 J.E. Thompson· CRCPress(1993)，第 67-83 頁。 載體可進一步包括可操作地連接於聚核苷酸以容許該等 聚核苷酸的表現的調控序列。調控序列可包括在被轉型之 植物細胞中有功能的啟動基因。啟動基因可為可誘發的、 組成性的或組織特異性的。該等啟動基因為熟習此項技術 者所已知。 可與本發明之eIF-5A的各種同功異型物及〇118組合使用 以產生基因之有意義或反義轉錄物的啟動基因調控元件通 常包括任何植物啟動基因，而更特定言之為組成性啟動基 因，諸如無花果樹瘤嵌紋病毒358啟動基因、花椰菜花葉 病毒啟動基因、CaMV35S啟動基因或MAS啟動基因，或組 織特異性的或老化誘發之啟動基因，諸如康乃馨花瓣 GST1啟動基因或擬南芥SAGi2啟動基因（參見，例如】c Palaqui 等人，Plant Physi〇1， 112:14471456(1996);
Monon 等人，Molecular Breeding， 1:123-132(1995)； Fobert 等人，Plant journal，6:567_577(1994);以及等 人，Plant PhysioL，1 13:313(1997)，以引用的方式併入本 文中）。較佳地，在本發明中使用的啟動基因為組成性啟 動基因。當使用老化誘發之eIF_5A的反義聚核苦酸時，較 佳選用SAG12啟動基因。參見實例23。 可使用習知表現系統來測試來自適用於本發明之啟動基 因的表現量，例如藉由量測報導基因產物的含量，例如其 中已引入啟動基因/報導基因之轉殖基因植物的葉片、 花、果實或其他組織之萃取物中的蛋白質或灿财。一例 94139-990728.doc -21- 1337185 示性報導基因為GUS。 調控序列可視需要包括5,非轉譯料相或聚料酸化 信號或強化子。本發明可進一步涵蓋其他熟習此項技術者 已知的調控序列。 本發明亦提供利用包括老化誘發之eIF_5A的聚核苦酸的 本發明之載體或載體組合以有意義或反義方向轉型的轉殖 基因植物細胞，自該種細胞產生的轉殖基因幼苗或成熟轉 殖基因植物，或轉殖基因植物的植物部分，諸如花、果 實、葉片、種子等等。 本發明亦提供抑制内源性老化誘發之eIF_5A表現的方 法。該等方法包括將包括老化誘發之eIF_5A的反義聚核皆 酸的本發明之表現載體整合到植物的至少―個細胞的基因 組内。使老化誘發之eIF-5A的反義聚核普酸轉錄，並抑制 内源性老化誘發之eIF-5A的表現。 在抑制内源性老化誘發之eIF_5A表現的另一方法中，將 以有意義的方向含有本發明之老化誘發之咖八聚核苦酸 的表現載體整合到植物的至少—個細胞的基因組内。使老 化誘發之eIF-5A的聚核*酸轉錄，且外源性老化誘發之 eIF-5A的所得共表現引起向下調節或抑制内源性老化誘發 之eIF-5A的表現。
創傷誘發之eIF-5A 創㈣發之秦5A在受麻❹表現。本發明係關於在 擬南芥及番茄中創傷誘發之eIF_5A之發現。本發明已經發 現泫同功異型物在植物之創傷事件期間受到向上調節。向 94139-990728.doc •22- 1337185 上調節發生在轉錄層面。此外，在病毒感染後僅在蛋白質 層面發生向上調節，此隨後引起細胞死亡，導致在病原體 侵入的事件中，創傷誘發之eIF_5A驅使細胞死亡的推論。 圖9顯示在對照組植物、模倣處理之植物、Avr處理之植物 及Vir處理之植物中，老化誘發之eIF_5A保持恆定（其在植 物4週齡時偵測）。但在Vir處理之植物中，創傷誘發之Μ。 5A受到向上調節。 圖10顯示以止血鉗使植物葉片受傷之實驗的結果。在受 傷之後即刻、受傷之後丨小時及9小時量測擬南芥（「A。） 中老化誘發之eIF-5A、創傷誘發之eIF_5A及生長eIF_5A的 含量。北方墨點法顯示老化誘發之eIF_5A保持恆定，但創 傷誘發之eIF-5A的表現量明顯增加。在受傷事件中，生長 eIF-5A的表現量開始降低。 本發明已經證實當創傷誘發之抓5A受到向上調節並且 植物上發生受傷事件（諸如在移植軒苗時所發生）時，該創 傷導致生長eIF-5A受到極強抑制。參見圖14_17。所得植 物之生長強烈受阻。但#將種子浸泡在康黴素中並直接 播種於土壤中（不需移植並因此沒有移植傷害）時，該種子 發育成正常尺寸的植物。 ^在均已L併入有意義創傷誘發之構築體的各種測 /植物之間所見到的差異(圖丨5)係歸因於創傷誘發之那_ 5A的表現程度不同。孰羽 …' 各此項技術者將瞭解在引入基因 (有意義或反義）時，蔣怨丁 口 義”將仔到不同程度的基因向上調節或向 °即，、的程度將視在何處併入基因及併入多少個複 94I39-990728.doc •23· 1337185 本而定。藉由表現程度不同，可使各種表現型與基因表現 發生關連。一旦產生所要表現型，便可挑選該植物，並用 來產生所要後代。因此在圖15中，創傷誘發之eIF_5A受到 強烈向上調節的植物在創傷事件後幾乎不生長（植物標籤 10) ’但生長稍佳的植物（但不如野外型一般好植物標籤 4)則未受到強烈的向上調節。 本發明的一個實施例為自擬南芥分離的創傷誘發之eIF_ 5A。胺基酸序列提供於圖4丨中，並為seq ID no: _。編碼 έ亥胺基酸的聚核苷酸提供於圖41中，並為SEq ID N〇:—。 本發明的另一實施例為自番茄分離的創傷誘發之eIF_ 5A。胺基酸序列提供於圖ι〇3中，並為SEq a NO:—。編 碼遠胺基酸的聚核苷酸提供於圖i 〇3中並為SEq ID N〇:—。 本發明亦提供經分離的創傷誘發之eIF_5A之聚核苷酸， 其與上文列舉之SEQ ID NO具有90%的序列同源性，並在 尚嚴格度條件下與所列舉之SEQ ID N〇的互補序列及編碼 創傷誘發之e IF - 5 A者雜交。 本發明亦提供創傷誘發之eIF_5A的反義聚核苷酸。反義 聚核苷酸可具有任何長度，只要其能夠抑制表現即可。在 些貫施例中’反義聚核苷酸包括全長密碼序列，而在其 他特別較佳的貫施例中，反義聚核苷酸係針對3,UTR，因 為eIF-5A的不同同功異型物在3，UTR處具有高度的同功異 型物改贪。在—些實施例中，反義聚核苷酸係針對5非密 碼序列。已知主要與5，_非密碼序列互補的反義聚核苷酸為 編碼轉錄因子之基因的表現的有效抑制劑。Br_h，M.A， 94139-990728.doc -24· 1337185
Molec. Cell Biol.，13:4284-4290(】993)。 當在本文及申請專利範圍中使用「創傷誘發之犯_5八的 反義♦核苷Sa」硐時，不僅涵蓋與所列舉之SEQ ID NO 之互補序列共享1_同源性的彼等反義聚核芽酸，而且 以涵蓋為功能變異體的彼等反義聚核㈣。功㉟變異體為 如山所述者。變異體如本發明所指定起作用，亦即將其引 入表現載體内且其中將該種載體併入至少一個植物細胞的 基因組内時，能夠調節内源性創傷誘發之eIF_5A的表現。 本發明的一個實施例提供包括（如上所述本發明之）創傷 誘發之eIF-5 A聚核苷酸或（如上所述本發明之）創傷誘發之 eIF-5A的反義聚核苷酸的表現載體。載體係如上所述。 本發明亦提供用包括創傷誘發之eIF_5 A的聚核苷酸的本 Ίχ月之載體或載體組合以有意義或反義方向轉型的轉殖基 因植物細胞，自該種細胞產生的轉殖基因幼苗或成熟轉殖 基因植物，或轉殖基因植物的植物部分，諸如花、果實、 葉片、種子等等。 本發明亦提供抑制内源性創傷誘發之eIF_5A表現的方 法。該等方法包括將包括創傷誘發之eIF-5A的反義聚核苦 Ss_的本發明之表現載體整合到植物的至少一個細胞的基因 組内。使創傷誘發之eIF-5A的反義聚核苷酸轉錄，並抑制 内源性創傷誘發之eIF-5A的表現。 在抑制内源性創傷誘發之eIF-5 A表現的另一方法中，將 以有意義方向含有本發明之創傷誘發之eIF_5A聚核芽酸的 表現載體整合到植物的至少一個細胞的基因組内。使創傷 94l39-990728.doc -25· 1337185 誘發之eIF-5 A的聚核苷酸轉錄，並且外源性創傷誘發之 eIF-5A的所得共表現引起向下調節或抑制内源性創傷誘發 之eIF-5 A的表現。 藉由抑制内源性eIF-5 A的表現，所得轉殖基因植物對病 原體侵入所引起之毒力傷害的抗性增加。參見實例16以及 圖43及44 。
生長eIF-5A 本發明亦係關於生長eIF_5A。生長eiF_5A表現於正在生 長的組織中。當以有意義的方向，利用生長eiF_5 A之聚核 苷酸向上調節eIF-5A時，可注意到三種表現型的變化：種 子尺寸增加、生物質量增加，以及種子產量增加。 本發明的一個實施例為自擬南芥分離的生長elF_5A。胺 基酸序列提供於圖！中，並為SEQ ID N〇: _。編碼該胺基 酸的聚核苷酸提供於圖2中，並為SEQIDN〇: 一。 本發明的另一實施例為自番茄分離的生長eIF5A。胺基 鲛序列提i、於圖10 1中，並為SEQ ID N〇:—。編碼該胺基 酸的聚核苦酸提供於圖101中，並為SEQIDNO: —。 本發明的另一實施例為自康乃馨分離的生長eIF-5 A。胺 土酸序列提供於圖95中，並為SEQ ID NO: _。編碼該胺基 酸的聚核苷酸提供於圓95中，並為SEQIDN〇: —。 本發明亦提供經分離的生長eIF-5A之聚核苷酸，其與上 文列舉之SEQ ID N0具有9_序列同源性，並在高嚴格 度條件下與所列舉之SEQ m No的互補序列及編碼生長 eIF-5A者雜交。 94139-990728.doc -26· 1337185 本發明亦提供生長eIF-5As&反義聚核苷酸。反義聚核 苷酸可具有任何長度，只要其能夠抑制表現即可。在一些 實施例中，反義聚核苷酸包括全長密碼序列，而在其他特 別較佳的實施例中，反義聚核苷酸係針對3，UTR，因為 eIF-5A的不同同功異型物在3，utr處具有高度的同功異型 物改變。在一些實施例中’反義聚核苷酸係針對5，_非密碼 序列°已知主要與5非密碼序列互補的反義聚核苷酸為編 碼轉錄因子之基因的表現的有效抑制劑。Branch，m.A.，
Molec. Cell Biol.，13:4284-4290(1993)。 當在本文及申請專利範圍中使用「生長eiF-5 a的反義聚 核苦酸」一詞時，不僅涵蓋與所列舉之SEq ID no之互補 序列共享1 00°/。同源性的彼等反義聚核苷酸，而且亦涵蓋 為功能變異體的彼等反義聚核苷酸。功能變異體為如上所 述者。變異體如本發明所指定起作用，亦即將其引入表現 載體内且其中將該種載體併入至少一個植物細胞的基因組 内時，能夠調節内源性生長eIF_5 A的表現。 本發明的一個實施例提供包括（如上所述本發明之）生長 eIF-5A聚核苷酸或（如上所述本發明之）生長eIF_5A的反義 聚核苷酸的表現載體。載體係如上所述。 本發明亦提供用包括生長6^_5八的聚核苷酸的本發明之 載體或載體組合以有意義或反義方向轉型的轉殖基因植物 細胞，自該種細胞產生的轉殖基因幼苗或成熟轉殖基因植 物’或轉殖基因植物的植物部分，諸如花、果實、葉片、 種子等等。 94139-990728.doc -27· 1337185 本發明亦提供抑制内源性生長eIF_5A表現的方法。該等 方法包括將包括生長eIF-5A的反義聚核苷酸的本發明之表 現載體整合到植物的至少一個細胞的基因組内。使生長 elF 5 A的反義聚核苷酸轉錄，並抑制内源性生長a的 表現。 在抑制内源性生長eIF-5 A表現的另一方法中，將以有意 義的方向含有本發明之生長eIF_5 A聚核苷酸的表現載體整 合到植物的至少一個細胞的基因組内。使生長eIF_5A的聚 核苷酸轉錄，並且外源性生長eIF_5A的所得共表現引起向 下調節或抑制内源性生長eip_5 a的表現。 在本發明的另一實施例中，提供向上調節生長eIF 5A表 現的方法。將以有意義方向含有本發明之生長eiF 5A的聚 核苷酸的表現載體引入植物之至少一個細胞的基因組内。 使生長eIF-5A的聚核苷酸轉錄，並且外源性生長eIF_5A的 所得共表現引起細胞表現比非轉殖基因細胞多的生長eiF — 5A。 圖1 9顯示生長eiF_5 A爻到向上調節之植物，具有勝過對 照組植物之增加的生物f量。以有意義方向將生長犯_5八 插入擬南芥植物内，以向上調節生長抓从的表現。檢定 W固母株（1_16)，幻則定生長抓5八表現的—般含量。自 每個母株產生8個姊妹株（α·η)。測試每個母株中生長eIF_ 5场表現量，並在圖射顯示結果。在母株中注意到各種 程度的表現。例如植株2及1〇具有極高表現量，而植株" 及16具有極低或無表現。 94I39-990728.doc •28· 1337185 圖21及22顯示得自植株⑷的植物。該等植物比對照組 植物大。因為生長eIF-5A為細胞分裂同功異型物並且因 為其組成性表現，故存在細胞分裂增加。發生老化降低 因為該植物被鎖定在生長模式，而不能切換至老化路徑。 圖23及24為得自具有中等生長eIF_5A表現量的植株。其 似乎具有較大的葉片且老化延遲。 圖25及26係得自具有低程度之向上調節的植株。其具有 大葉片及大叢簇。 圖27及28為得自沒有向上調節（可能歸因於基因之共抑 制）的植株。因為該植物具有康黴素抗藥#，故該基因必 須存在，以便使該植物得以在培養基上生長。似乎老化誘 發之eIF-5 A亦被共抑制，並因此導致尺寸增加。 除了生物質量增加之外’在生長.5八受到向上調節的 植物中種子尺寸亦增加。量測所有植株的種子尺寸。在具 有最高eIF-5A表現量的植株中，種子尺寸可見增加超過3 倍。此係因為生長eIF_5A的向上調節而發生，增加細胞分 裂，並因此增加種子尺寸。 上文實例中之生長eIF-5A(來自擬南芬）係組成性表現， 亦即經由使用通用啟動基因，在植物的每個地方皆表現。 相反’藉由使用組織特異性啟動基因，可5丨導僅在特殊組 織中向上調節。例如，藉由使用種子特異性啟動基因，生 長仙'5八將僅在種子令向上調節，從而容許葉片正常生 長’但種子量卻增加。因此，使用特異性啟動基因，可在 所要植物刀中向上調節生長eIF_5A，以得到所要表現 94139-990728.doc -29· 1337185 型。 :由向上調節生長eIF_5 A ’ @時（或在相同植物中）出現 二種表現型結果-生物質量增加、種子產量增加或種子尺 寸增加，但並非所有的三種表現型皆出現。例如，若植物 顯不種子尺寸增加，則將出現較小的植物。在具有生長 eIF-5A之最高向上調節的植株中’產生最大的種子，但植 物較小，因為在整個植物中持續進行大規模的細胞分裂， 其代價為細胞擴大（需要較大的葉X )。以較低程度向上調 即生長AteIF-5A的表現，可見對葉片的影響（較大），但不 影響種子。因此’可使用！且織特異性純，並挑選所要表 現型。例如，可將生長eIF_5A置於木質部特異性啟動基因 下以達成所產生木質部之量增加。因此，可使用任何所 要啟動基因，以達成所要組織特異性向上調節。
DHS DHS為eIF-5A之活化所必需，並且在正老化的組織中表 現。因此，本發明提供自擬南芥、番茄、康乃馨、油菜、 萵苣务匕為盘、香蒸、白揚及葉斑病菌（mycosphaerella) 分灕的DHS。 因此，本發明的一個實施例為自擬南芥分離的DHS。胺 基酸序列提供於圖46中，並為SEQ ID N〇: 一。編碼該胺基 酸的聚核苷酸提供於圖46中，並為seq ID NO:。 本發明的另一實施例為自番茄分離的DHS。胺基酸序列 提供於圖45A及B中’並為SEQ ID NO: _。編碼該胺基酸的 聚核苷酸提供於圖45A及B中，並為SEqidn〇:。 94139-990728.doc •30- 1337185 本發明的另一實施例為自康乃馨分離的DHS。胺基酸序 列提供於圖54中，並為SEQ ID NO: _。編碼該胺基酸的聚 核苷酸提供於圖54申，並為SEQ ID NO: _。 本發明的另一實施例為自油菜分離的DHS。胺基酸序列 提供於圖97中，並為SEQ ID NO:—。編碼該胺基酸的聚核 苷酸提供於圖97中，並為SEQIDNO:_。 本發明的另一實施例為自萵苣分離的DHS。圖1 05提供 一部分萵苣DHS聚核苷酸序列。 本發明的另一實施例為自紫花苜蓿分離的DHS。胺基酸 序列提供於圖107A及B中，並為SEQ ID NO: _。編碼該胺 基酸的聚核苷酸提供於圖107A及B中，並為SEQ ID NO: ο 本發明的另一實施例為自香蕉分離的DHS。胺基酸序列 提供於圖108A及B中，並為SEQ ID NO: _。編碼該胺基酸 的聚核苷酸提供於圖108A及B中，並為SEQIDNO:_。 本發明的另一實施例為自白楊分離的DHS。胺基酸序列 提供於圖109 A及B中，並為SEQ ID NO: _。編碼該胺基酸 的聚核苷酸提供於圖109A及B中，並為SEQIDNO: —。 本發明的另一實施例為自葉斑病菌分離的DHS。圖11 0 提供一部分萵苣DHS聚核苷酸序列。 本發明亦提供經分離的DHS之聚核苷酸，其與上文列舉 之SEQ ID NO具有90%的序列同源性，並在高嚴格度條件 下與所列舉之SEQ ID NO的互補序列及編碼DHS者雜交。 本發明亦提供DHS的反義聚核苷酸。反義聚核苷酸可具 94139-990728.doc -31 - 山 7185 有任何長度，只要其能夠抑制表現即可。在一些實施例 中反義來核苦酸包括全長密碼序列、針對別丁r，或針 對5’-非密碼序列。已知主要與5,·非密碼序列互補的反義聚 核苦酸為編碼轉錄因子之基因的表現的有效抑制劑。 Branch, M.A., Molec. Cell Biol., 13:4284-4290(1993) 〇 當在本文及申請專利範圍中使用「DHS的反義聚核苦 酸」一詞時，不僅涵蓋與所列舉之SEQ m n〇之互補序列 共于100 /〇同源性的彼等反義聚核苷酸，亦涵蓋為功能變 異體的彼等反義聚核苷酸。功能變異體為如上所述者。變 異體如本發明所指定起作用，亦即將其引入表現載體内且 其中將該種載體併入至少一個植物細胞的基因組内時，能 夠調節内源性DHS的表現。 本發明的一個貫施例提供包括（如上所述本發明之）dh$ 聚核苦酸或（如上所述本發明之）DHS之反義聚核苷酸的表 現載體。載體係如上所述。 本發明亦提供用包括DHS之聚核皆酸的本發明之載體或 載體組合以有意義或反義方向轉型的轉殖基因植物細胞， 自該種細胞產生的轉殖基因幼苗或成熟轉殖基因植物，或 轉殖基因植物的植物部分，諸如花、果實、葉片、種子等 等。 本發明亦提供抑制内源性DHS表現的方法。該等方法包 括將包括DHS的反義聚核苷酸的本發明之表現載體整合到 植物的至少一個細胞的基因組内。使DHS的反義聚核普酸 轉錄，並抑制内源性DHS的表現。 94139-990728.doc •32- 0^ 1337185 在抑制内源性E) H S表現的另· 一方法中’將含有本發明之 D H S t核皆酸的表現載體以有意義方向整合到植物的至少 一個細胞的基因組内。使DHS的聚核苷酸轉錄，並且外源 性DHS的所得共表現引起向下調節或抑制内源性dhs的表 現。 藉由抑制内源性DHS的表現，所得轉殖基因植物沒有或 具有實質上較少活化eIF-5A的DHS蛋白質。如較早討論， eIF-5A必須活化方可使其在生物學上適用。因此，藉由反 義聚核苷酸或藉由與有意義聚核苷酸的共抑制來抑制或降 低DHS的表現，所得轉殖基因植物將沒有活性eIi?_5 a，或 有降低活性的elF-5A。該等轉殖基因植物將顯示出植物之 生物質量增加、種子產量增加，及/或種子尺寸增加。具 有DHS之反義聚核苷酸的轉殖基因植物顯示光合作用增 加1且亦具有增加的澱粉含量。參見實例24及25 , 藉由利用對DHS具特異性之抑制劑處理康乃馨花，可提 供更多的證據支持DHS及eIF-5A在老化中扮演調控角色的 論點。亞精胺及eIF-5A為DHS反應的受質（Park等人， 1993 ; Park等人，1997)。數個具有類似於亞精胺之結構特 徵的單胺、二胺及多胺在活體外抑制DHS活性（Jakus等 人’ 1993)。已經普遍使用一些多胺，諸如亞精胺、腐胺 及精胺，來延長康乃馨的花瓶壽命（Wang及Baker, 1980)。 經由以不同濃度的不同多胺來處理，Wang等人（未公開b) 月b夠延長康乃馨花的花版壽命2倍。使用暫時感染系統來 向下調節DHS的其它研究正在進行。初步資料指出在利用 94139-990728.doc -33- 1337185 表現反義DHS之暫時感染系統真空滲透的切割康乃馨中， 在第8天的存活百分比幾乎為未經處理花的4倍高（Wang等 人’未公開b)。 除歸因於逆境的生長損失以外的另一主要農業損失為收 穫後逆境誘發之老化（McCabe等人，2001)。此對於部分處 理的植物，諸如切割的萬苣尤其如此。切隔萬苣的一個症 狀為褐變，此為酚產生的結果（MatUe等人，1999)。利用 萵苣eIF-5A(LeIF-5A)之反義聚核苷酸或反義全長DHS的萵 苣田野试驗證貫轉殖基因萵苣在切割之後對褐變之抗性明 顯比對照組萵苣強。似乎雖然歸因於收穫所致之逆境誘發 老化具有不同的通路（Page等人，2〇〇1)，但褐變及其他可 旎的老化症狀上游之轉譯控制至少部分受£)1^8及£117_5八調 控。s周控老化的下游為執行基因。其為老化的效應物並引 起代謝改變，該改變促成老化症狀。顯然在eIF_5 A及DHS 受到向下調節時能夠阻止整個範圍的由老化引起的症狀。 本發明亦係關於識別三種eIF_5 a同功異型物（老化誘發 因子eIF-5A ;創傷因子eIF_5A及生長因子eIF_5A)的抗體。 本發明亦提供在其他植物及真菌中，鑑別老化誘發之 eIF_5A、創傷誘發之eIF-5A、生長elF-5A及DHS的方法。 藉由使用在本文中描述的方法及所提供之序列，設計用來 分離/鑑別所要同功異型物或DHS的探針。因為eIF_5A的同 功異型物（老化誘發之eIF_5A、創傷誘發之elF 5A及生長 eIF-5A)在岔碼區通常高度同源（參見圖2)，因此為確保鑑 別且甚至改變所要同功異型物的擴大，較佳自5WTR的起 94139-990728.doc -34» 1337185 點及3’’UTR的終點來設計探針或引子。（參見圖3、4及5)。 組李父佳的用來擴大創傷誘發之eIF_5 a的引子或用來鑑別 創傷誘發之eIF-5 A的探針如下。下游引子為5，GAG CTC AAG AAT AAC ATC TCA TAA GAAAC3'(SEQ ID NO: 一）， 上游引子為 5'CTC GAG TGC TCA CTT CTC TCT CTT AGG3'(SEQ ID NO: _)。 在自植物或植物部分中分離創傷誘發之eIF_5 a之前，最 佳引入創傷事件以容許植物開始表現創傷誘發之eiF-5 A。 任何創傷事件均可接受，而一種此類例示性創傷事件包括 在中央葉脈處壓扁葉片。類似地，在分離老化誘發之eIF· 5 A之前’最佳給植物組織逆境以便誘發老化。 現已一般性描述本發明’其將經由參考下列實例更容易 瞭解’該等實例係以說明的方式提供且並不意欲限制本發 明。 實例 實例1 信使RNA(mRNA)分離 自處於各種發育階段的番茄花及番茄果實，及自葉片 (未經處理或在寒冷或山梨糖醇處理之後）分離總RNA。在 液氮中簡單地磨碎組織（5克）。將磨碎的粉末與3 〇毫升胍鹽 緩衝液（4 Μ異硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate)、2.5 mM NaOAc(pH 8.5)、0.8%毓基乙醇）混合。經由四層棉布 (cheesecloth)過濾該混合物’並在4°C下以10,000 Xg離心 3 0分鐘。隨後對上清液進行26,〇〇〇 Xg的氣化铯密度梯度 94139-990728.doc •35- 1337185 離心20小時。以75%乙醇沖洗集結RNA，再懸浮於600微 升經DEPC處理的水中，並在-70°C下利用0.75毫升95%乙 醇及30微升3 M NaO Ac使RNA沈澱。在1.2%變性甲醛瓊脂 糖凝膠上分級分離1 〇微克RNA，並轉移至耐綸膜上。使用 隨機引子化之32P-dCTP標記之全長DHS cDNA(SEQ ID NO: 1)，在42°C下探測該膜隔夜。隨後在室溫下以含有0.1 % SDS的IX SSC洗滌該膜一次15分鐘，並在65°C下以含有 0.1% SDS的0.2X SSC洗滌該膜三次每次15分鐘。在-70°C 下以該膜使X-光軟片曝光隔夜。 使用獲自Promega的聚A+束mRNA分離系統，自總RNA 分離聚A+ mRNA。使用聚A+ mRNA作為模板，以供使用獲 自 Stratagene(La Jolla，Calif.)的 ZAP Express® cDNA合成系 統進行cDNA合成。 番茄葉片cDNA庫的篩選 將使用分離自已經暴露在2 Μ山梨糖醇下6小時之Match F1雜交番茄葉片的mRNA來製備的cDNA庫稀釋至約5x106 PFU/毫升。使用32P標記之600個鹼基對的RT-PCR片段來篩 選該cDNA庫。切下三個陽性的cDNA純系，並使用製造商 說明書中的方法，再度環化成pBK-CMV®(Stratagene)嗟 粒。將全長cDNA插入pBK-CMV載體中。 質體DNA分離、DNA定序 使用Sambrook等人（前述）描述的鹼性溶解方法分離質體 DNA。使用二脫氧定序法，定序全長陽性cDNA純系。 Sanger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，74:5463-5467。 94139-990728.doc ·36· 1337185 使用BLAST搜哥（GenBank, Bethesda，MD)棄編並分析開放 閱讀框架’並使用BCM Search Launcher :多重序列比對 模式誘發之多重比對法（參見F. Corpet，Nuc. Acids Res.， 16:10881-10890，（1997))，達成五個最具同源性蛋白質與 編碼基因之衍生胺基酸序列的比對。藉由Multi Finder鑑別 出衍生胺基酸序列中所存在的功能基元。 番茄RNA的北方墨點雜交 在1%變性曱醛瓊脂糖凝膠上，對分離自各種階段的番 茄花（花芽及花朵1以及盛開或脫水的老化花瓣）、番茄葉 片’以及各種成熟階段的番蘇果實（破色期，亦即具有少 於1 0%紅色的綠色果實’粉紅’亦即整個果實為橘色或粉 紅色，及紅色的，無論為軟或硬）之1〇微克總RNA進行分 離，並固定在耐綸膜上。使用利用隨機引子套組 (Boehringer Mannheim)以 32P-dCTP 標記的全長番茄 cDNA 來探測濾紙（7xl〇7 cpm)。在室溫下以USSC、0.1% SDS洗 滌濾紙一次，並在65°C下以0.2xSSC、0.1% SDS洗條三 次。將濾紙乾燥，並在-7(TC下以該濾紙使X-光軟片曝光 隔夜。結果顯示於圖50-52 t。 擬南芬RNA的北方墨點雜交 如上所述自五週齡（泳道〇、六週齡（泳道2)及七週齡（泳 道3)之擬南芥植物的葉月中分離總rnA，在1 %變性甲搭環 脂糖凝膠上進行分離，並固定在耐綸膜上。使用利用隨機 引子套組（Boehringer Mannheim)以32P-dCTP標記的全長擬 南芥老化誘發之DHS cDNA來探測濾紙（7xl07 cpm)。在室 94139-990728.doc
S -37- 1337185 溫下以lxSSC、0.1。/。SDS洗滌濾紙一次，並在65t：下以 0.2xSSC、0.1% SDS洗務三次。將濾紙乾燥，並在下 以該渡紙使X-光軟片曝光隔夜。結果顯示於圖55中。 康乃馨RNA的北方墨點雜交 如上所述自處於花發育之各種階段，亦即緊閉拍爸之花 (泳道1)、開始綻放（泳道2)、完全綻放之花（泳道3)、具有 未捲起花瓣之花（泳道4)的康乃馨植物之花瓣分離總RNA , 在1%變性甲醛瓊脂糖凝膠上進行分離，並固定在耐綸膜 上。使用利用隨機引子套組（Boehringer Mannheim)以32P-dCTP標記的全長康乃馨老化誘發之DHS cDNA來探測濾紙 (7xl〇7 cpm)。在室溫下以lxSSC、0‘1% SDS洗滌濾紙一 次’並在65t下以0.2xSSC、0.1% SDS洗滌三次。將濾紙 乾燥，並在-70 C下以該濾紙使X-光軟片曝光隔夜。結果 顯示於圖5 6中。 實例2 山梨糖醇誘發番茄老化誘發之DHS基因 在密封腔室中以2 Μ山梨糖醇處理番茄葉片6小時。如下 自經山梨糖醇處理的葉片中萃取rna。 在液氮中磨碎葉片（5克）。將磨碎的粉末與3〇毫升胍鹽 緩衝液（4M異硫氰酸胍、2.5 mM Na〇Ac(pH 8 5)、〇8%巯 基乙醇）混合。經由四層棉布過濾該混合物，並在4乞下以 10,000 Xg離心30分鐘。隨後對上清液進行26，_ Xg的氣 化铯密度梯度離心20小時。以75%乙醇洗務集結RNA，再 懸浮於600微升經DEPC處理的水中，並在_7〇。〇下利用〇·75 94139-990728.doc -38. 1337185 毫升95%乙醇及30微升3 M NaOAc使RNA沈澱。在i 2%變 性曱路瓊脂糖凝膠上分級分離丨〇微克RNA，並轉移至耐論 膜上。使用隨機引子化之32p_dCTP標記之全長dhs cDNA(SEQ ID NO: 1) ’在42°C下探測該膜隔夜。隨後在室 溫下以含有0.1% SDS的IX SSC洗滌該膜一次15分鐘，並 在65〇C下以含有0.1% SDS的0.2X SSC洗滌該臈三次每次15 分鐘。在-70°C下以該膜使x_光軟片曝光隔夜。 結果顯示於圖52中。如可見，藉由山梨糖醇在葉片中誘 發出DHS的轉錄。 實例3 在正老化的花中誘發番茄DHS基因 收穫番茄植物之緊閉花苞及綻放、老化之花朵，並按照 實例2分離RNA。在1.2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分級分離 10微克RNA，並轉移至耐綸膜上。使用隨機引子化之32p_ dCTP 標記之全長 DHS cDNA(SEQ ID NO: 1)，在 42t 下探 測該膜隔夜。隨後在室溫下以含有〇SDS的IX SSC洗 務該膜一次15分鐘，並接著在65°c下以含有〇 1% SDS的 0.2X SSC洗滌該膜三次每次15分鐘。在_7〇。〇下以該膜使χ_ 光軟片曝光隔夜。 結果顯示於圖50中。如可見，在正老化之花朵中誘發出 DHS的轉錄。 實例4 在成熟果實中誘發番茄DHS基因 按照實例2 ’自破色期果實、粉紅色及成熟果實分離 94139-99072S.doc -39- 1337185 RNA。在1.2%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分級分離1〇微克 RNA ’並轉移至耐綸膜上。使用隨機引子化之32p_dCTp標 s己之全長 DHS cDNA(SEQ ID NO: 1)(圖 45)，在 42°C 下探測
該膜隔夜。隨後在室溫下以含有〇 1% SDS的lx SSC洗滌 δ亥膜一次15分鐘，並接著在65。〇下以含有〇丨％ sds的0.2X ssc洗滌該膜三次每次15分鐘。在_7〇t下以該膜使χ光軟 片曝光隔夜。 結果顯示於圖5 1中。如可見，在緊接在導致廯敗之老化 開始之前的成熟、紅色果實中’ DHS的轉錄最強。 實例5 藉由寒冷誘發番茄老化誘發之DHS基因 在生長至中，將盆中的番茄植物（7_8週齡）暴露在6。匸下2 天、3天或6天。設定光週期為8小時暗及16小時亮。藉由 將植物移回到溫室，使植物再升溫。在自生長室中移除之 後即刻收穫未再升溫的植物。如下自葉片中萃取rn Α。 在液氮中磨碎葉片（5克）。將磨碎的粉末與3〇毫升胍鹽 緩衝液（4 Μ異硫氰酸胍、2_5 mM NaOAc(pH 8.5)、0.8〇/〇 巯 基乙醇）混合。經由四層棉布過濾該混合物，並在4艺下以 1〇’〇〇()§離心3()分鐘。隨後對上清液進行26，GG()g的氣化絶 密度梯度離心20小時。以75%乙醇洗蘇集結RNA，再懸浮 於600微升經DEPC處理的水中，並在_7〇〇c下利用〇75毫升 95%乙醇及30微升3 M Na〇Ac^RNA沈澱。在12〇乂變性曱 醛瓊脂糖凝膠上分級分離1〇微克RNA，並轉移至耐綸膜 上。使用隨機引子化之32P-dCTp標記之全長 94139-990728.doc -40· 1337185 cDNA(SEQ ID NO: 1)，在42°C下探測該膜隔夜。隨後在室 溫下以含有0.1% SDS的IX SSC洗滌該膜一次15分鐘，並 在65°C下以含有0.1% SDS的0.2X SSC洗滌該膜三次每次15 分鐘。在-70°C下以該膜使X-光軟片曝光隔夜。 結果顯示於圖53中。如可見，藉由暴露在寒冷的溫度下 且接著再升溫，在葉片中誘發出DHS的轉錄，並如膜洩漏 所量測，轉錄增強與寒冷傷害有關。 實例6 使用基於未鑑別擬南芥基因組序列之引子產生擬南芥 PCR產物 使用一對自擬南芥基因組序列設計的寡核苷酸引子，藉 由PCR，自擬南芥cDNA模板產生部分長度的老化誘發之 DHA 序列 。5'引子為具有序 列 5'-GGTGGTGTTGAGGAAGATC 的 19體（SEQ ID NO: 7); 3'引 子為具有序列 GGTGCACGCCCTGATGAAGC-3'的 20體（SEQ ID NO: 8)。如下使用擴大高保真度PCR系統（Boehringer Mannheim)及擬南芬老化葉片cDNA庫作為模板進行聚合酶 鏈反應。 反應組份： cDNA 1 微升（5xl07 pfu) dNTP(各 10mM) 1 微升
MgC12(5 mM) + 10x緩衝液 5微升 引子1及2(各100 μΜ) 2微升 擴大高保真度DNA聚合酶 1.75單位 94139-990728.doc -41 · 1337185 反應體積 50微升 反應參數： 94°C維持3分鐘 94°C/1分鐘，58°C/1分鐘，72°C/2分鐘，進行45次循環 72°C維持15分鐘。 實例7 分離基因組DNA及南方分析 藉由在液氮中將1 0公克番茄葉片組織磨成細粉，自番祐 葉片萃取基因組DNA。將預熱至6(TC之37.5毫升含有25毫 升均質化緩衝液[100 mM Tris-HCI(pH 8.0)，1〇〇 mM EDTA ’ 250 mM NaCl，1% 十二烷基肌胺酸鈉（sark〇syG， 1% 2-疏基乙醇，i〇微克/毫升rnA酶及12.5毫升苯酚]的混 合物添加至磨碎的組織中。搖動該混合物〖5分鐘。再將 1 2.5毫升氣仿/異戊醇（24:1)添加至該混合物中，並再搖動 15分鐘。離心該混合物，並以25毫升苯酚/氣仿/異戊醇 (25:24:1)及氣仿/異戊醇（24:1)再度萃取液相。藉由在室溫 下用1 5毫升異丙醇沈澱’回收核酸。將沈澱物再懸浮於1 毫升水中。 如下對基因組DNA進行限制酵素消化：以4〇〇微升之總 反應體積，使10微克基因組DNA、40微升10X反應緩衝液 及100單位限制酵素（XbaI、Ec〇RI、EcoRV或HinDIII)反應 5至6小時。隨後對該混合物進行苯酚萃取及乙醇沈澱。對 經消化的DNA在0.8°/。瓊脂糖凝膠上在15伏特下進行瓊脂糖 凝膠電泳約1 5小時。將凝膠浸入變性緩衝液[87 66公克 94139-990728.doc -42· (§) 1337185
NaCl及20公克NaOH/公升]中30分鐘，同時溫和攪動，以 蒸餾水沖洗，並浸入中和緩衝液[87.66公克NaCl及60.55公 克tris-HCl(pH7.5)/公升]中30分鐘，同時溫和攪動。藉由 毛細管沾染，將DNA轉移至Hybond-H+耐綸膜上。 在42°C下，使用lxlO6 cpm/毫升的32P-dCTP標記之全長 DHS cDNA或DHS cDNA純系的3’-非密碼區，進行雜交隔 夜。在含有50%曱醯胺、6X SSC、5X登哈特氏溶液、 0.1%SDS及100毫克/毫升變性鮭精DNA的緩衝液中，進行 預雜交及雜交。使該膜預雜交2至4小時；進行雜交隔夜。 在雜交完成之後，在室溫下以2X SSC及0.1% SDS沖洗 該膜，並隨後以2X SSC及0.1% SDS洗滌15分鐘，並以 0.2X SSC及0.1%SDS洗滌15分鐘。隨後在-80°C下以該膜使 X-光軟片曝光隔夜。結果顯示於圊49中。 實例8 自擬南芥分離老化誘發之eIF-5A基因 使用擬南芥的老化葉片cDNA庫作為模板，藉由PCR獲 得在擬南芥葉片中表現的老化誘發之eIF-5A基因的全長 cDNA純系。一開始使用與載體T7引子 <AATACGACTCACTATAG>(SEQ ID NO: 18)配對的簡併上游引 <AAARRYCGMCCYTGCAAGGT>(SEQ ID NO: 17) » a ^ 載體 T3 弓丨子 <ATTAACCCTCACTAAAG>(SEQ ID NO: 20)配 對的簡併下游引子 <TCYTTNCCYTCMKCTAAHCC>(SEQ ID NO: 19)，製備對應於基因之5*及3'末端的PCR產物。將 該PCR產物次選殖至pBluescript内以供定序。隨後使用與 -43- 94139-990728.doc
C 1337185 3，-特異性引子 <AGAAGAAGTATAAAAACCATC>(SEQ ID NO: 22)配對的 5'-特異性引子 <CTGTTACCAAAAAATCTGTACC> (SEQ ID NO: 21)，獲得全長cDNA，並將其次選殖至 pBluescript内以供定序。 實例9 自番茄果實分離老化誘發之eIF-5 A基因 使用番茄果實cDNA庫作為模板，藉由PCR獲得在番茄 果實中表現的老化誘發之eIF-5A基因的全長cDNA純系。 一開始，使用與載體T7引子（SEQ ID NO: 18)配對的簡併 上游引子（SEQ ID NO: 17)，以及與載體T3引子（SEQ ID NO: 20)配對的簡併下游引子（SEQ ID NO: 19)，製備對應 於基因之5’及1末端的PCR產物。將該PCR產物次選殖至 pBluescript内以供定序。隨後使用與載體T7引子（SEQ ID NO·· 18) 配對的 51-特異性引子 <AAAGAATCCTAGAGAGAGAAAGG> (SEQ ID NO: 23)，獲得全長的cDNA，並將其次選殖至 pBluescript内以供定序。 實例10 自康乃馨分離老化誘發之eIF-5A基因 使用康乃馨老化花朵之cDNA庫作為模板，藉由PCR獲 得在康乃馨花中表現的老化誘發之eIF-5A基因的全長 cDNA純系。一開始，使用與載體T7引子（SEQ ID NO: 18) 配對的簡併上游引子（SEQ ID NO: 17)，以及與載體T3引 子（SEQ ID NO: 20)配對的簡併下游引子（SEQ ID NO:
19) ，製備對應於基因之5'及3'末端的PCR產物。將該PCR 94139-990728.doc -44· 1337185 產物次選殖至pBluescript内以供定序。隨後使用與3'-特異 性引子 <ACCAAAACCTGTGTTATAACTCC>(SEQ ID NO: 25)配對的 5，-特異性引子 <TTTTACATCAATCGAAAA>(SEQ ID NO: 24)，獲得全長的cDNA，並將其次選殖.至 pBluescript内以供定序。 實例11 自擬南芥分離老化誘發之DHS基因 藉由篩選擬南芬老化葉片的cDNA庫，獲得在擬南芬葉 片中表現的老化誘發之DHS基因的全長cDNA純系。用來 篩選的探針序列（SEQ ID NO: 26)顯示於圖82中。使用老化 葉片之cDNA庫作為模板及自GenBank中未鑑別基因組序列 (八8017060)設計之引子，藉由？011獲得探針。 實例12 自康乃馨分離老化誘發之DHS基因 藉由篩選康乃馨老化花瓣的cDNA庫，獲得在康乃馨花 瓣中表現的老化誘發之DHS基因的全長cDNA純系。用來 篩選的探針序列（SEQ ID NO: 27)顯示於圖83中。使用老化 花瓣的cDNA庫作為模板，以及簡併引子（上游：5’TTG ARG AAG ATY CAT MAA RTG CCT 3')(SEQ ID NO: 28)； 下游：5'CCA TCA AAY TCY TGK GCR GTG TT3')(SEQ ID NO: 29))，藉由PCR獲得探針。將該PCR產物次選殖至 pBluescript内以供定序。 實例13 以反義方向，利用擬南芥DHS之全長或Y區轉型擬南芥 •45- 94139-990728.doc 1337185 以含有全長的老化誘發之擬南芥DHS cDNA序列或DHS 基因之3,末端（SEQ ID NO: 30)(圖80)的二元載體PKYLX71 轉型農桿菌，兩者皆以反義組態表現並處於雙35S啟動基 因的調控下。藉由真空滲透，以經轉型之農桿菌轉型擬南 芬植物’並以胺苄青黴素選擇來自所得Tq植物的轉型種 子。 圖65-68為經轉型之擬南芥植物的照片，顯示以反義方 向在經轉型之植物中表現DHS基因或其3'末端產生增加的 生物質量’例如較大的葉片及增加的植物尺寸。圖69說明 轉殖基因擬南芥植物具有增加的種子產量。 實例14 以反義方向，利用番茄DHS之全長或3,區轉型番茄植物 以含有全長的老化誘發之番茄DHS cDNA序列或DHS基 因之3’末端（SEQ ID NO: 31)(圖81)的二元載體pKYLX71轉 型農桿菌’兩者皆以反義組態表現並處於雙358啟動基因 的》周控下。利用該等農桿菌形成番茄葉片的外植體，並產 生經轉型的癒傷組織及幼苗，再藉由標準組織培養方法選 擇。在溫室條件下，使經轉型的幼苗生長成產生成熟果實 的T1植物。 圖70-79為顯示在經轉型之植物中老化誘發之番茄DHs 基因的表現減少產生增加之生物質量的照片，例如較大的 葉片尺寸及較大的植物，如在經轉型之擬南芥植物中所 見，以及番茄果實的軟化及腐敗延遲。 實例15 94139-990728.doc •46· 1337185 以反義方向，利用番茄DHS之3,區轉型番茄植物 以含有DHS基因之3'末端（圖81)的二元載體pKYLX71轉 型農桿菌’其係以反義組態表現並處於雙3 5 s啟動基因的 調控下。利用該等農桿菌形成番茄葉片的外植體，並產生 經轉型的癒傷組織及幼苗’再藉由標準組織培養方法選 擇。在溫室條件下，使經轉型的幼苗生長成產生成熟果實 的T1植物。 來自該等具有減少DHS表現之轉殖基因植物的果實完全 沒有頂腐病，在該條件下約33%來自對照組植物的果實發 展出該疾病。頂腐病為生理學的疾病，可歸因於營養逆 k ’引起果實基（花）端的老化及腐爛。圖84A及84B為顯示 展現頂腐病之對照組果實及無頂腐病之轉殖基因果實的照 片。 結果指出減少DHS的表現可防止起因於生理學疾病之組 織及細胞死亡的發生。 實例16 在野外型哥倫比亞（Columbia)植物材料中，表現擬南芥 轉澤起始因子5A(AteIF-5A)同功異型物 在 6吋花盆中在Promix Βχ 土壤（premier Brands，Brampt〇n, ◦N，Canada)中培養擬南芥哥倫比亞生態型（ec〇type)的種 子。將新近播種的花盆放在4t下2天，並隨後轉移至在 22 C下操作並具有16小時亮/8小時暗之週期的生長室中。 藉由冷白螢光燈泡提供每秒每平方公尺i 5 〇微莫耳照射的 照明。在2週至7週齡時，以一週間隔收集完整的叢簇，在 94139-990728.doc -47- 1337185 第5週收集莖生葉’在第6週收集莖、果莢、花苞及花，亦 收集已浸湖的種子（在水中24小時），在液I中急驟冷束， 並儲存在-80°C下。 以丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae)感染擬南芥 在含有64個生長孔的平台上，將擬南芥哥倫比亞生態型 的種子撒播在 Promix BX土壞（Premier Brands，Brampt〇n， 〇N，Canada)上。將已經播種的平台在4<t下維持2天，並 轉移至具有9小時亮/15小時暗之光週期的生長室。在4週 齡時處理所有植物，不過在生理學上歸因於縮短光週期， 發育似乎變得較慢。 以獲自 Robin Cameron 博士（University of T〇r〇nt。
Toronto’ Canada)的無毒力（avr)及有毒力（Wr)菌株丁香假單 胞菌番庙變種㈣而__ ρν 切⑽）％ 3000，感染4週齡植物的叢生葉。使用無針頭的1毫升注射 筒，接種每個植物叢生葉的遠軸面。使用四種處 〈 '一木 處理植物：不接種 '以1〇 mM MgCh模倣接種、以avr丁香 假單胞菌菌株（每毫升1〇 mM MgCh含1〇6 Cfu)接種成^ vir丁香假單胞菌菌株（每毫升10 mM MgC丨合 6 2 s 10 Cfu)接 種。進行兩次細菌計數，一次在接種之後即刻 _ 4疋仃，而第 二次在3天之後進行，以確保有足量的細菌滲 心’以便在 avr處理中誘發全身性的後天抗性。在預定的 呼間點收穫 接種的葉片，以便進行後續的分析。 使用反義T-DNA插入任一基因，發展出具有、、成j
$我少的DHS 或創傷誘發之eIF-5A表現的植物。該等植株已细#丄 、π對丁香假 94139-990728.doc • 48· 1337185 單胞菌番茄變種DC 300顯示出明顯的抗性，其中轉殖基因 株相對於野外型植物顯示細菌負荷降低多達。參見圖 43及44。使用作物植物的資料亦指出病原體抗性增強。 利用止血鉗使擬南芥植物受傷 根據Stotz等人（2000)，藉由以止血甜沿著中央葉脈壓扁 (約10%的葉片表面），使在正常光照條件下生長的4週齡植 物受傷。在0分鐘、i小時及9小時時收穫組織，並即刻在 液氮中冷凍，且儲存在_8〇°c下，以便進行進一步的分 析。 RNA分離及北方墨點法 根據Davis等人（1986)，自擬南芥叢生葉分離 總RNA，以 便進行北方墨點分析。在1 %瓊脂糖凝膠上分級分離 RNA，並轉移至财綸膜上。（Dav“等人，1986)。在42°C下 使經固定的RNA與老化誘發之AteIF-5A、創傷誘發之
AteIF-5A或生長AteIF-5A的經放射性標記之3'UTR部分雜 火使用 k 機引子套組（Boehringer Mannheim)，以[α-32Ρ]. dCTP標記3’UTR。在42。(：下以含有0.1% SDS的2Χ SSC洗 游:雜交膜兩次1 5分鐘’並在42°C下以含有0.1 % SDS的1X SSC洗滌兩次30分鐘。藉由自動放射照相術在_8〇°c下曝光 隔夜之後觀測雜交。 抗體產生及純化 擬南芥（At)的真核轉譯起始因子5A(eIF-5A)同功異型物 在胺基酸層面高度同源，尤其在蛋白質的N端區及中心區 (圖1)。為了獲得同功異型物特異性的抗體，設計針對在 94139-990728.doc •49- 1337185
AteIF-5 A之同功異型物中似乎為彼此獨特之區域的肽。在 每個肽的N端處添添加一額外的半胱胺酸殘基以便與KLH 共軛。所使用之序列為：對於老化誘發之AteIF-5A為 CNDDTLLQQIKS ， 對於創傷誘發之AteIF-5A為 CTDDGLTAQMRL ，且對於生長 AteIF-5A 為 CTDEALLTQLKN。當將該等序歹提交至蛋白質BLAST(短 的近乎精確序列；受限於擬南芥；預期數20000 ;字長2 ; 矩陣PAM90 ;間隙懲罰9 1)時，在資料庫中找到的大量序 列僅與AteIF-5A匹配，而不與其他匹配。該等肽在西安大 略大學肽合成實驗室（University of Western Ontario Peptide Synthesis facility)合成。根據 Drenckhahn 等人 (1993)，以及Collawn 及 Patterson(1999)，使用間-順丁烯二 醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯，將載體蛋白質匙 孔螺血氰蛋白（Sigma)共軛至肽的N端半胱胺酸。按兩週之 間隔，以已經連接的肽注射兔子四次。在最後一次注射之 後兩週，藉由將兔子放血來收集血液，並使所收集的血液 凝固，以便收集抗血清。 蛋白質分級分離及西方墨點法 在微量離心管中利用小杵，或利用大的臼與杵，在缓衝 液（50 mM EPPS(pH 7.4)，0.25 Μ 山梨糖醇，10 mM EDTA，2 mM EGTA，1 mM DTT，10 mM胺基-正癸酸， 植物組織的蛋白酶抑制劑混合物（Sigma))中，將上文列舉 的組織均質化（約0_5公克/毫升）。在微量離心機上，以最 大速度簡單地離心勻漿，並拋棄離心塊。根據Ghosh等人 94139-990728.doc -50- 1337185 (198 8)將總蛋白質定量。在微型蛋白質二元板單元 (BioRad，Mississauga, Ontario)上進行 SDS-PAGE，並以考 馬斯亮藍 R250(Coomassie brilliant blue R250)(Fairbanks 等 人，1971)對凝膠（12%聚丙烯醯胺）染色，或使用半乾轉移 法（半乾轉移單元，Bio-Rad，Hercules，CA)將凝膠轉移至 聚偏二氟乙烯（PVDF)膜上。在1毫克/毫升聚乙烯醇中，阻 斷墨點30秒（Miranda等人，1993)，並在含有0· 1。/。（體積/體 積）吐溫20(Tween 20)及5%(重量/體積）奶粉的磷酸鹽緩衝 生理鹽水（PBS)中阻斷1小時。以含有0.1%(體積/體積）吐溫 20及1%(重量/體積）奶粉的PBS，將初級抗體（得自在第二 次注射之後的採血）稀釋至1:50。使用與鹼性磷酸酶偶合的 針對兔子抗體在山羊中製備的二級抗體（Biosh〇p，
Burlington，Ontario)及磷酸酶受質 NBT 及 BCIP(BioRad,
Mississauga, ON)，使抗原呈現。 實例17 產生過度表現三種eIF-5 A同功異型物之轉型擬南芥植物 引子設計 擬南芥（At)的真核轉譯起始因子5 A(eiF-5 A)同功異型物 在密碼區中高度同源（圖2)。為避免擴大正確基因時出現問 題’自分別在圖3、4及5中所示的接近5'UTR之起點及 3’UTR之終點，設計老化誘發之AteIF_5A、創傷誘發之 eIF-5A及生長eiF-5A的弓丨子。以在GenBank資料庫中的 EST資訊及其他序列資訊為基礎，估計5，utr及3，utr。在 引子的末端添加適當的限制性位點，以有意義的方向連接 94139-990728.doc •51 - 1337185 於pKYLX71二元載體中（圖6)。關於老化誘發之AteIF-5A，上 游引子為 5'AAGCTT GATCGTGGTCAACTTCCTCTGTTACC3·， 而下游引子為 5'GAGCT CAGAAGAAGTATAAAAACCATC3'。 至於創傷誘發之AteIF-5A，上游引子為5'CTC GAGTGC TCACTTCTCTCTCTTAGG3'，而下游弓丨子為 5'GAGCTCA AGAATAACATCTCATAAGAAAC3'。生長 AteIF-5A 的上游引 子為 5'CTC GAGCTAAACTCCATTCGCTGACTTCGC3,，而下游 引子為5'GAGC TCTAGTAAATATAAGAGTGTCTTGC3'。添 加至引子内的限制性位點，關於老化誘發之AteIF-5 A為 Hindlll及SacI，關於創傷誘發之AteIF-5A為Xhol及SacI， 而關於生長AteIF-5A則為Xhol及SacI，如在上文列舉之引 子中加下標線所指示。
自擬南齐分離基因組DNA 自3-週齡的叢生葉分離基因組DNA。在萃取緩衝液（200 mM Tris pH 7.5 » 250 mM NaCl > 25 mM EDTA > 0.5% SDS)中將組織均質化，並渦旋所得勻漿15秒。藉由在微量 離心機中以最大速度離心1分鐘，移除殘餘碎片。收集上 清液，並按1:1之比例與異丙醇混合’渦旋並在室溫下留 置2分鐘。藉由在微量離心機中，以最大速度離心5分鐘收 集離心塊，以70%乙醇洗滌，並真空乾燥2分鐘。將乾燥 離心塊再懸浮於水中’並以1:1體積之氣仿處理’再渦 旋。在微量離心機中以最大速度離心2分鐘之後，收集上 層，並以20微升鹽（3 Μ乙酸鈉）處理’在-20°C下以2體積之 乙醇使其沈澱3〇分鐘。隨後在微量離心機中’以最大速度 94139-990728.doc • 52- 1337185 離心經純化的基因組DNA持續30分鐘，乾燥並再懸浮於水 中，以便進行PCR。
自基因組DNA進行PCR 利用上述的引子進行PCR。PCR反應混合物相應地含有 lx Tsg或Taq聚合酶反應緩衝液、1單位TSg或丁叫聚合酶、 0.2 mM dNTP、2 mM MgCl2及特異性引子各1 5微微莫耳濃 度。5亥反應始於在95C下開始加熱10分鐘，及由95 之變 性溫度1分鐘、55°C之黏接溫度2分鐘及72。(：之延伸溫度2 分鐘組成的第一個循環。接著29次循環進行至結束程式， 其中黏接溫度每次循環降低0 · 5 °C，而最終循環的黏接溫 度為40°C。72°C的最後延伸維持1〇分鐘。藉由1%瓊脂糖 凝膠電泳分離PCR產物’切割並根據說明書藉由用於〇να 萃取的Millipore Ultrafree-DA自瓊脂糖自旋管柱（MiUip〇re Corporation，Bedford, ΜΑ)回收。 連接至pGEM®-T Easy中 根據由Promega提供的說明書，將經純化的PcR產物連 接到pGEM®-T Easy載體中（圖7)。簡言之，在Pr〇mega pGEM®-T Easy 載體系統（Promega Corporation，Madison WI)中&供的快速連接緩衝液（3〇 mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10 mM DTT ’ 1 mM ATP及 5% 聚乙二醇（分子量 8000，ACS級）pH7.8)中，以3:1之比率將PCR產物與pGEM T-Easy載體，3韋斯單位（Weiss Unit)T4 DNA連接酶混合。 在15 C下保溫该連接反應隔夜，並轉型至勝任大腸桿菌 DH5-a細胞懸浮液（使用RbCl/CaCl使其勝任；Kushner， 94139-990728.doc -53- 1337185 1978)中。首先在冰上保溫轉型混合物30分鐘，在42°C下 …、休克90移，並谷許添加1毫升γτ培養液後在3?它下恢 復1〗時使經轉型的細胞集結，再懸浮於少量體積的 2χΥΤ培養液中，並塗舖在含有5〇微克/毫升胺苄青黴素的 瓊脂盤上，以便進行選擇。只有轉型體能夠在含有胺苄青 黴素的培養盤上生長，因為PGEM®-T Easy載體為細胞提 供了胺苄青黴素抗性。針對連接至pGEM®-T Easy載體中 的PCR產物插入物，對轉型體進行選擇及篩選。 經由限制酵素消化’針對pGEM®-T Easy載體中的pcr 產物插入物進行篩選 在37°C下，使生長在選擇培養基上的菌落，在含有5〇微 克/毫升胺苄青黴素的5毫升2χ γτ培養液中生長隔夜。使 用Wizard Prep DNA純化套組（promega),純化得自所選菌 落的重組質體。在37°C下以EcoRI消化質體dNA 1小時， 並在1°/。瓊脂糖凝膠上觀測，以證實AteIF_5As插入物尺寸 的存在。隨後藉由核心分子生物學實驗室（沃特盧大學 (University of Waterloo), Waterloo, ON)，將陽性的質體定 序’證貫該序列適合在植物中過度表現。 連接至PKYLX71中 以Xhol及SacI雙重消化pGEM:創傷誘發之AteIF_5 A及 pGEM:生長AteIF-5A的構築體，並次選殖至亦已經利用 Xhol及SacI消化的二元載體pKYLX71中。該等酶消化作用 確保創傷誘發之AteIF-5A及生長AteIF-5A將以有意義方向 插入二元載體pKYLX71中並處於花椰菜花葉病毒雙35S啟 94139-990728.doc -54. 1337185
動基因的控制下。連接反應使用1微克二元載體及3微克創 傷誘發之AteIF-5A或生長AteIF-5A。在連接緩衝液（30 mM
Tris-HCl，10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP及 5%聚 乙一醇（分子量8000，ACS級）pH 7.8)與3韋斯單位T4 DN A 連接酶（Fermentas)中進行連接。在irC下保溫該連接反應 隔夜’並轉型至勝任大腸桿菌DH5-a細胞懸浮液（使用 RbCl/CaCl使其勝任；Kushner，1978)中。首先在冰上保溫 轉型混合物30分鐘；在42°C下熱休克90秒，並容許在添加 1宅升2x YT培養液後在37 C下恢復1小時。使經轉型的細 胞集結’再懸浮於少量體積的2χΥΤ培養液中，並塗鋪在 含有50微克/¾升四環素的瓊脂盤上，以便進行選擇。只 有轉型體能夠在含有四環素的培養盤上生長，因為二元載 體PKYLX71為細菌細胞提供了四環素抗性。藉由pcR以及 利用Xhol及SacI的二元消化，針對創傷誘發之八以11?_5八或 生長AteIF-5A插入物來對轉型體進行選擇及篩選。在pcR 擴大（與上文說明基因组DNA所進行的相同）及消化之後， 使用1 %瓊脂糖電泳分離產物，以證實正痛尺寸之插入 物。 農桿菌電穿孔及選擇 使構築體pKYLX7 1:創傷誘發之AteIF-5 A及pKYLX7 1:生 長AteIF-5A電穿孔至勝任農桿菌GV3〇1〇中。製備勝任農 桿菌細胞，將單一菌落接種在含有5〇微克/毫升利福平 (rifampicin)及50微克/毫升健他黴素（gentamycin)的5毫升 2xYT培養液中。在28°C下，在學執道震盪器 94139-990728.doc •55· 1337185 (Fisher Scientific)上以280 rpm生長隔夜，並以各種稀釋度 (1:500、1:1〇〇〇、1:2000)用來接種30毫升亦含50微克/毫升 利福平及50微升/毫升健他黴素的2χΥΤ培養物。使新近接 種的培養物生長至0〇6〇()在0.5與0.8之間為止，隨後冷卻並 在SS-34轉子（Sorvall)中以2000 g離心15分鐘。將離心塊再 懸浮於50毫升冰冷的水中，並以2〇〇〇 g離心1 5分鐘。重複 該洗滌程序總共四次，以便自培養物中移除鹽及死亡細 胞。將最後的離心塊再懸浮於40毫升冰冷的1〇%(體積/體 積）甘油中，並以2000 g離心15分鐘，並重複一次。隨後將 離心塊再懸浮於100微升冰冷的10%甘油中，並充分混 合。將細胞分成1 00微升的等份試樣，並儲存在冰上。 為將DNA構築體電穿孔至勝任農桿菌細胞中，分別將 100微升的等份試樣與500毫微克DNA構築體充分混合。隨 後將細菌：載體混合物轉移至預先冷卻的電穿孔杯中，並 置於調至下列設定的Gene Pulser(Biorad)中：2.5仟伏、25 微法拉第及200歐姆。在電穿孔之後，添加1毫升2χγΤ培 養液’並將整個懸浮液轉移至培養管。在28t ' 28〇 rpm 下培養電穿孔的培養物3小時，以容許其恢復，且隨後添 加2毫升2xYT培養液，以及50微克/毫升利福平及5〇微克/ 毫升健他黴素。在培養基中生長2天之後，將電穿孔之細 胞塗鋪在四環素、徤他黴素及利福平（均以5〇微克/毫升） 上’且菌落在之後再生長2天。藉由PCR以及利用SacI& Xhol進行雙重消化，針對pKYLX71:創傷誘發之AteIF_5A 或PKYLX71:生長AteIF_5A篩選所得菌落，並藉由在1%瓊 94139-990728.doc -56· 1337185 脂糖凝膠上分離來觀測。 植物轉型 使用含有pKYLX71:創傷誘發之AteIF-5A或pKYLX71:生 長AteIF-5A的根瘤農桿菌GV3010之陽性菌落，轉型野外 型擬南芥哥倫比亞生態型。在製備用於植物轉型的細菌紫 液時’將對PKYLX71:創傷誘發之AteIF-5A或PKYLX71:生 長AteIF-5 A構染體而言為陽性的單一菌落，接種在含有5〇 微克/毫升四環素、50微克/毫升利福平及50微克/毫升健他 徽素的5爱升2xYT培養液中。使其在28°C下，Forma科學 轨道震盪器（Fisher Scientific)中在280 rpm下生長2天，並 用來接種亦含有50微克/毫升利福平及50微克/毫升健他黴 素的35毫升（總共）2χΥΤ。使該35毫升培養物在28°c、28〇 rpm下生長隔夜’並用來接種含有5〇微克/毫升利福平及5〇 微克/毫升健他黴素的535毫升（總共）2xYT。再度使該培養 物在28°C、280 rpm下生長隔夜，至約2.〇之〇d600。 將培養物轉移至兩個250毫升的試管中，隨後在斗它下， 在GSA轉子（SorvaU)中以1945 g離心15分鐘。將離心塊再 懸洋於500毫升滲透培養基（11公克MS鹽、25公克蔗糖、 〇-25公克MES(PH 5.7)’含有K0H、100毫微克/毫升苄胺基 嘌呤及 50 微升 Vac_In_Stuff(snwet L77 ; LeMe Seeds))中， 並置於在真空乾燥器中、具有四個大橡膠塞子的大塑膠盤 中。連續使用5個各含有8株在適當發育階段之植物的花 盆，以便進行滲透。首先分別在垃圾桶上倒轉每個花盆， 以移除任何鬆散的土壤’隨後放在㈠乃倒轉著）處於玻璃乾 94139-990728.doc -57- 1337185 燥器中的塑膠容器内’使得四個大橡膠塞子充當倒轉花盆 的台架，如此容許結實浸在農桿菌浆液内，但叢鎮則否。 隨後使植物在倒轉狀態下經歷真空（400毫米汞柱）ι〇分鐘。 隨後容許真空渗透的植物恢復，且照常在植物材料章節中 說明的生長室條件下生長。在數週之後，此時果芙乾燥且 種子成熟，將自每個花盆收集的種子彙集在—起。 選擇植物轉型體及分離分析 為鑑別主要的轉㈣，在轉子（Ba⑽tead/Therm〇i㈣ 上，在1%(體積/體積）次氣酸鈉及〇 1%(體積/體積）吐溫8〇 的溶液中將得自真空渗透植物的種子表面滅菌2G分鐘，以 無菌水沖洗四次，並再懸浮於無菌0.8%瓊脂中。隨後將再 懸汗·的種子種植在補充有1%(重量/體積）蔗糖、0 5公克/公 升2-[N-嗎琳基]乙烧績酸（MES)、〇7%(重量/體卵田菌壤 脂及4〇至5〇微克/毫升康黴素的無菌半強度Murashige及 Sk〇〇g(MS)培養基（2.2公克/公升）上（M⑽Shige及Shoog， 1962)。只有轉型體能夠在含有康黴素的培養盤上生長， 因為-7L載體為轉型籽苗提供了康黴素抗性基因（圖6)。不 含二元載體的籽苗因為沒有康徽素抗性基因而變成黃色並 亡使用野外型籽苗作為對照组，並種植在培養基令未 添加康黴素的MS培養基上，亦將得自含有空沐似7〇載 體之同源接合子植株的種子播種在含有康徽素的培養盤上 作為對照組。空载體對照組可用來證實康黴素對籽苗生長 的影響’以及二元載體隨機整合至擬南芥基因組中的影 響。將少量野外型種子種植在每個含有⑽培養基及4〇至 94139-990728.doc -58· 1337185 50微克/毫升康黴素之培養盤的小區域上。此係為了確保 培養基足以選擇轉型體，並測試康黴素的強度而進行。 將播種的植物在4°C下保持3天，以便同步發芽。在3天 之後’將植物轉移至生長室，在此處使其在丨6小時亮/8小 時暗的週期下’在2〇±2°C下再生長7天。光照維持在每秒 每平方公尺1 50微莫耳照射下，並由冷白螢光燈泡提供。 測定以PKYLX71:創傷誘發之AteIF-5A及pKYLX71:生長 AteIF-5A載體轉型擬南芥植物的效率。 在自播種開始總共1 〇天之後，分別將有意義創傷誘發之 AteIF-5A及有意義生長AteiF-5A的14個轉型體或16個轉型 體移植到在含有32個單元之平台中的Pr〇mix BX土壤。隨 後將該等移植的T1代植物轉移至在22。〇、16小時亮/8小時 暗週期下操作的另一生長室中。由冷白螢光燈泡提供每秒 每平方公尺1 50微莫耳照射的光照。使丁丨代植物生長至成 熟，並產生T2代種子。收穫該等種子並儲存在_2〇〇c下直 至進行進一步篩選為止。將T1代稱為！、2、3等等。有意 義生長AteIF-5A植物所有的16個植株均存活，並產生種 子，但14個有意義創傷誘發之AteIF_5A植物的轉型體中只 有9個存活’並產生種子。 以與T1代轉型體相同的方式，進行T2代轉型體的選擇。 有意義生長AteIF-5A植物的植株12在選擇培養基上未產生 轉型體，且不納入任何進一步的操作令。有意義生長 5 A植物的植株1至丨6(減去植株丨2)分別繼續獲得8個 亞株。將其稱為A至Η，使得例如在T1植株丨中，將T2代植 94139-990728.doc -59- 1337185
物稱為1A、IB、ic笼笙 士立篆A 尊。有思義創傷誘發之Ate】F_5A植 物的植株1、2、3、4、5、7、9及11分別繼續獲得8個亞株 (A-Η)。植株丨2 T1植物僅產生約3〇個仞種子，且在丁2代中 僅繼續獲得1個亞株。仍隸有意義創傷誘發之Α㈣5α 的Τ2植物生長’並進行表徵。有意義生長AteIF_5AwT4 物已經成熟並產生種子，收穫並储存在-2〇t下，直至進 一步分析為止。 以與T2相同的方式進行有意義生長八^11?-5八之丁3代轉型 體的選擇。以表現型分析及有意義生長A之過度表 現的程度為基礎，選出8個植株。將表現量細分成四類： 高表現量' 中等表現量、低表現量及無表現（歸因於共抑 制）。每種表現量選出2個植株’並移植得自每個植株的12 個植物。該四種表現量相對應的植株為：1A、2D、4D、 15A、8D、9H、liC及16C。仍然使有意義生長八化1{；_5八植 物的T3代生長，並進行表徵。 實例18 有思義創傷誘發之AteIF-5 A及有意義生長AteIF-5 A的表 現型分析：照片記錄 在分離期間，以照片記錄有意義創傷誘發之AtelF-5 A及 有意義生長AteIF-5A植株的形態學表現型，以及相應對照 組野外型植物（擬南芬哥倫比亞生態型）及利用空二元載體 pKYLX7 1轉型之植物的表現型。 種子量測 量測自有意義生長AteIF-5A之T2植物中收集的T3種子的 94139-990728.doc •60· 1337185 總種子產量（重量及體積兩者）、種子尺寸（長度及寬度）， 並計算所產生之種子的個別重量及體積。在Sartorius分析 數位化量表上量測按重量計的總種子產量，並藉由將每個 植物所產生之總種子注入並包裝在按每1 〇0微升劃上刻度 的玻璃1毫升注射筒内，來測定體積。為藉由長度、寬度 及所計算的體積來測定種子尺寸，將種子置於有測微計之 玻片上，並在Olympus BX5 1顯微鏡下檢視。利用附接至 Compaq Evo D500(Compaq Company Corporation ； Intel®
Pentium 4 CPU 1.7 GHz，262 MG RAM，在 Windows 2000 上執行）的 Spot Insight彩色攝影機（Diagnostic Instruments
Inc.) ’拍下在測微計上之種子的照片。使用適用於
Windows的Image-Pro Express 4.0版。每種亞株量測10個種 子，在景> 像中使用測微計進行尺寸校正。將量測值輸入 Microsoft Excel内’並進行諸如標準誤差及體積之類的計 算。 實例19 有意義創傷誘發之AteIF-5A及有意義生長AteIF_5 A的生 化分析-蛋白質分級分離及西方墨點法 自有意義生長AteIF-5A T2植物的每個亞株收集第一個 里生葉，並如上所述萃取蛋白質。藉由丨2% sds_page* 級分離得自植WA、2Ay6A的總蛋白質，並轉移至 PVDF膜以1.5G之稀釋度，利用生長心犯仏探測墨 點。自付自野外型及空二元載體對照組植物之第一個莖生 葉萃取對照組總蛋白質。 94139-990728.doc -61 · 1337185 實例20 在野外型哥倫比亞中表現擬南芥轉譯起始因子 5A(AteIF-5A)同功異型物 收集處於不同發育階段的數個組織，並使用自該等組織 中萃取的蛋白質進行西方墨點法。圖8中的西方墨點證實 老化誘發之AteIF-5 A並未出現在2週齡的叢生葉中，但在3 週齡的叢生葉中被向上調節，並且豐度增加，i至5週為 止並且丘度下降，但在7週時仍存在。在pEG處理的植 物或對照組中，並未偵測到老化AteIF_5A,但出現在花的 冰道（包括老化的花）及在經過浸潤的種子泳道中，反映子 葉組織的老化。當利用創傷誘發之aAteIF_5A抗體探測墨 點時，在果莢、浸潤的種子及莖的泳道中出現模糊的譜 可。在果莢及莖之泳道中見到的譜帶可歸因於收集組織時 發生的傷害。因為難以收集果莢及莖，其不能即刻急驟冷 凍，從而使得創傷誘發之AteIF_5A同功異型物在一定程度 上向上調節。在利用生長aATeIF-5A探測墨點時唯一出現 的譜帶為已經浸潤之種子，與該同功異型物涉及細胞分裂 的觀念一致。 在數個時間點收集未處理、用MgCl2模傲接種 '以avr 丁 香假單胞菌或用vir丁香假單胞菌處理的植物，以便在病原 體進入期間分析AteIF-5As的表現。avr菌株可被植物識 別’並誘發過敏反應，其在感染區導致細胞死亡或壞死， 因此不容許病原體引起疾病。此外，局部化反應最後變成 全身性反應，以便保護植物免於進一步進入。已知此為全 94139-990728.doc -62- 1337185 身性後天抗性（SAR)，其涉及_ '，且柄為發病反應（PR)基因 之基因的表現。另一方面，virmiit收τα 囷株將不會被植物識別，且 將不引起過敏反應，並將導致痂 , 疾病。擬南芥的染病狀態包 括在感染數天之後，葉片變黃及細胞死亡。在處理後的72 小時之後，收集對照組植物、模倣處理之植物、_處理 之植物及仏處理之植物，進行利用三種αΑ_·5Α抗體的 西方墨點法在此時’可分別在_處理及vir處理之 植物令見到SAR及疾病兩者。當利用老化誘發之aAteIF_ 5 A抗體探測時，在所有槐品中4 丁你，徠口口中硯察到相對同樣的譜帶。因 為所有的植物均為4週齡，所以此並不意外，因為在圖8中 在第3週才開始見到老化同功異型物。隨後在利用創傷誘 發之一5A抗體探測墨點時，可在未經處理、模倣處 理及讀處理之植物中谓測到模糊的譜帶，而在士處理之 ㈣中於該處偵測到強譜帶。創傷同功異型物的此向上調 節可歸因於由疾病引起的細胞死亡（亦為一種類型的細胞 創傷）。利用生長aAteIF_5A探測墨點未顯示任何譜帶，並
因此未納入圖中。因為在該等處理期間老化誘發之MW 5A的表現並未改變證明其對天然老化的特異性。創傷誘發 之AteIF-5A表現增加亦證明其對起因於創傷之死亡的特異 性。為進-步研究該可能性，利用擬南芥的受傷葉片來進 行實驗。
創傷實驗顯示與發病實驗類似的結果（圖1G)。使用北方 墨點法顯示在老化誘發之編F_5 A、創傷誘發之α·5A 5A中發生轉錄變化。探針對每種八“抒巧八具 94139-990728.doc •63- 1337185 特異性’並由各自的3，UTR組成。觀察到類似於發病實 驗，老化誘發之偏F_5A表現並無㈣，因為其林週於 的植物，且僅以9小時之間隔取得樣品。此再度與老化誘 發之AteIF-5A為天然老化特有之同功異型物的事實相符 合。然而’創傷誘發之AteIF_5^表現在9小時之後確實 增加。或許有-定程度的轉譯控制發生，因為轉錄物似乎 完全為組成性（圖10) ’但在沒有誘發時，蛋白質似乎未顯 示為高度表現（圖9)。在所有的樣&中，《乎不㈣測到生 長AteIF-5A的轉錄物，並顯示在創傷之後表現降低。 實例21 產生過度表現三種eIF-5 A同功異型物之轉型擬南芥植物 藉由PCR自基因組DNA分離AteIF-5 A(圖11)。將產物連 接到pGEM中（圖12) ’並證實該序列在植物中過度表現的 適用性。利用Xhol及SacI將創傷誘發之AteIF-5A及生長 AteIF-5A自pGEM中雙重消化出來，並以有意義方向連接 至PKYLX71中花椰菜花葉病毒35S2啟動基因之後方。藉由 消化及PCR證實陽性連接（圖13)。隨後將pKYLX71 :老化 誘發之AteIF-5A及pKYLX71:生長AteIF-5A電穿孔至根瘤 農桿菌GV3 0 1 0内，以便經由真空滲透對擬南芥野外型哥 倫比亞生態型進行轉型。在植物轉型之後收集種子，並在 含有康黴素的MS培養盤上選擇轉型體。 過度表現創傷誘發之AteIF-5A(有意義創傷誘發之AtelF-5A)的擬南芥植物 將T1代植物播種在含有50微克/毫升康黴素的MS培養盤 94l39-990728.doc • 64- 1337185 並儲存在4C下3天，pi|後放在生長室中7天（圖14)。將 14個轉型體移植至土壤。在該14個了 1代植物中之共同表現 型為生長遲緩。植株卜4、6、8、1G、u、12、13及㈣ 生長嚴重遲緩，而6、8、1()、13及14則未產生任何種子。 植株2及3中等遲.緩’而植株5、7及9的生長類似野外型植 物（圖1 5及圖丨6)。在有意義創傷誘發之AteiF_5 a植物之η 代中觀察到一些其他表現型，包括黃葉、冑色子葉、捲縮 葉片’以及花的形狀不同。有趣的是，注意到並未觀察到 遲緩生長的外觀，直至將植物移植到土壤中為止。其可能 的解釋將是在移植期間稍微傷害到根部（不可避免的移植 結果）’且不能恢復。事實上’將種子浸泡在康黴素溶液 中，並直接播種到土壤中的預備實驗並沒有觀察到生長遲 緩的植物（而先前70%的植物有某種程度的遲緩），因為沒 有移植將不會引起根部的傷害。 植株1、2、3、4、5、7、8、u&12產生丁2種子並繼續 實驗（圖17)。每個Τ2植株具有亞株Α_Η，除了 12之外，其 僅生長一個轉型體’並現在進行分析。 過度表現生長AteIF-5A(有意義生長AteIF_5A)的擬南芥 植物 使有思義生長AteIF-5A的T1代種子生長在選擇培養基 上，並長出16個轉型體（圖18)。在其一生中對轉型體拍 照。表現型自類似於野外型（植株i、2、5、6、7、8、 10、11、12、13、14、15及16)變化至中等遲緩及變黃（植 株2、4及9 ;圖19)。所有的植株繼續生長至丁2，且每個植 94139-990728.doc -65- 1337185 株均具有8個標記為A-Η的亞株。植株丨2在T2中未產生任 何轉型體，並被視為野外型。Τ2代植物具有比τ丨代植物更 誇張的表現型。將詳細討論繼續生長為丁3的植株。 根據生長AteIF-5 Α轉殖基因的表現量，成組表徵有意義 生長AteIF-5A T2代植株的特徵。對自得自每個植株之莖生 葉中萃取的蛋白質進行西方墨點法（圖2〇)。因為大多數的 亞株A-Η在植株内顯示類似的表現型，故僅對每個植株的 亞株A進行西方墨點，取得生長AteIF5A2表現量的一般 概況。在凝膠上使用得自野外型植物及含有空二元載體之 植物之災生葉的蛋白質作為對照組。可將在該等亞株中觀 察到的表現量分類為高（植株i、2、3、1〇、13)，中（植株 4、5、6、15) ’ 低（植株 7、8、9、14)或無（植株 ^、16、 野外型及二元對照組）。亦利用針對老化誘發之AteiF_5 A 及創傷誘發之AteIF-5A的抗體探測墨點。該等西方墨點法 指出在有意義生長八4吓-5八植株中表現增加係歸因於生長 AteIF-5A，且通常不向上調節其他的AteIF 5A同功異型 物’因為沒有偵測到顯著含量的任一同功異型物。此亦證 實同功異型物特異性之抗體的特異性可接受。 以表現型及生長AteIF-5 A的表現量為基礎，選擇繼續生 長為T3代的有意義生長AteIF_5A植株（參見表i關於在每個 植株令之表現型的概述）。自每個表現量的分類中選出兩 個植株。將繼續生長的植株為丨八、2D、4D、15八、8d、 9H、11C及 16C。 根據在圓20中的西方墨點，植株i具有高生長歸_5a 94I39-990728.doc -66 - 表現量。該等植物具有大、深綠色的叢鎮，葉片與野外型 植物相比較非常圓（圖21)。植株1的㈣亦具有輪生的表現 型’其中葉片全部以相同的方向捲曲。該等有意義生長 AteIF-5A植物比野外型稍晚—些結實。植株㉔顯示高生 長AteIF-5A表現量，但與植才朱i之差異為該等植物小而且 變以圖22)。植株2植物#比野外型及二元對照組植物更晚 結實，並產生較小的結實(大約一半尺寸)及較少的果笑。 在中等表現量的植株中，植株4在葉片/叢襄尺寸及在結 實尺寸上顯然類似野外型’雖然似乎是在野外型及二元對 照組植物之前幾天結實。具有生長姉_5八之中等表現量 的第二個植株為植株15。該等植物類似於植株4，非常類 似野外型，但叢簇佔據的區域比對照組大（圖。及以）。叢 鎮的葉片在尖端似乎亦比對照組圓。然而，結實顯然並沒 有任何不同的表現型。 將繼續生長為T3的低表現有意義生長八__5八植株係來 自植株8及9。與對照組植物相比較，植株8具有極大的葉 片及大的叢族（圖25)。葉片顯然亦比對照組植物寬且圓。 結只的時間、結實尺寸及數目，似乎與對照組__致。有意 義生長AteIF-5A植株9具有類似在植株8中的葉片尺寸，但 通比其黃且小（圖26)。如同在植株2(—個高度表現的植株） 中°玄等植物顯不出生長遲緩、結實較短，但不同於植株 2,植株9在與對照組植物大致相同的時間結實。 根據西方墨點法，有意義生長AteIF-5 Α植物的兩個植株 11及16(圖20) ’沒有向上調節生長AteIF_5A的表現。此可 94139-990728.doc •67- 1337185 歸因於轉殖基因與内源基因之共㈣卜雖然該等植物似乎 類似對照組（圖27及圖28)，但因為數個理由相信已經將轉 殖基因併入植株11及16的基因組内。首先，肖由在含有康 黴素之MS培養盤上的選擇性’證實其具有康黴素抗性。 其次，植株16的叢簇尺寸、葉片尺寸及結實尺寸（圖28)比 對照組至少大50%。但最強的證據為其所產生之丁3種子的 尺寸及組成。 量測得自所有Τ2有意義生長AteIF_5 Α植物之植株的丁3種 子。拍下每個植株的照片（在圖29中強調最大及最小），並 在電腦上在照片中利用測微計進行量測，用以進行校正。 至於每個植株及每個對照組，量測視野中最大的1〇個種 子，用來進行計算。發現高表現植株2所具有的種子，比 野外型及二元對照組大三倍。同時證實為最低表現的植株 (植株11及16)具有一些最小的種子，僅為野外型或二元對 照組種子尺寸的約88%。以立方毫微米表示每個植株的平 均種子尺寸（圖30)，並使用橢圓型體積之等式來計算，因 為得自擬南芥的種子近似橢圓形。對照組種子的量測尺寸 落在Boyes等人（2001)測定的公告基準線内。自個別種子的 量測尺寸及總種子產量（重量及體積兩者），計算平均個別 種子重量並作圖（圖31)。顯然大部分顯示與對照组種子之 尺寸不同的植株’在個別種子重量上亦有相同的傾向。事 實上當將種子重量對種子尺寸（體積）作圖時，關係多半具 線性，且R2=0.7412。有5個植株為界外值，其具有增加的 密度（其中3個）或降低的密度（其中2個）。具有増加密度的 94139-990728.doc -68· 1337185 植株之一為8D，並繼續生長至T3代。得自所有T2代植物 的總種子產量非常不同，有些許傾向。然而，值得注意的 個植株為中等表現的有意義生長AteIF-5A植株4D，其產 生最多種子（重量及體積兩者）。事實上，4D產生的為對照 組植物的2.5倍多，並將繼續生長至T3。 知:照先前的描述，將T3種子塗鋪在選擇培養基上。將植 株 1A、2D、4D、15A、8D、9H、11C 及 16C移植到土壌 中。有意義生長AteIF-5 A植株1的數個其他亞株不發芽， 以及具有所有亞株中最大種子的植株2H亦不發芽。得自植 株11(共同抑制植株之一）的種子，不如在該年齡中普遍發 現的一般健康。該等種子亦為量測到最小者之一。該等植 株似乎仍正在分離，因為仍有無康黴素抗性的植物，且得 自所有植株的種子均不發芽。此或許為轉殖基因而非技術 的副作用，因為以相同方式處理的對照組種子均發芽。 實例22
表徵擬南芬老化誘發之eIF-5A 獲得全長擬南芥老化誘發之eIF_5A的方法 使用以數個植物eIF-5A基因為基礎的簡併引子與載體引 子T3及T7組合，以便自擬南芥(：1)^^八庫對eIF_5A基因進行 PCR擴大。特定而言 利用T3引子（在庫載體中位於在F5 a 基因的上游）及一個下游（逆向）簡併引子兩者，自pcR反應 利用Τ7引子（在庫載體中
94139-990728.doc 獲得eIF-5A基因的5·區域。同樣， 1 -69- 1337185 分析中，獲得全長eIF-5A基因。 每個PCR反應有2-3種主要產物。將該等片段選殖到 pBluescript質體内並定序。以針對基因銀行（gene bank)的 作圖分析為基礎，鑑別出eIF-5A陽性PCR片段。對擬南芬 而言，只有一個上游及下游陽性eIF-5A PCR片段。 根據5'及3'PCR片段定序的結果，消化擬南芥eIF-5A基因 的特異性5·及3'末端引子。自PCR反應，使用其特異性的5, 及3'末端引子，以及相應cDNA庫作為模板，獲得全長擬南 芥eIF-5 A基因。藉由定序進一步證實全長基因。最後，選 殖一個擬南芥eIF-5 A同功異型物基因，將其稱為老化誘發 之 eIF-5A。 T3及T7引子： T3 ： 5'-ATT AAC CCT CAC TAA AG-3' T7 ： 5'-AAT ACG ACT CAC TAT AG-3' 擬南芥eIF-5A的簡併引子： 前進（上游）引子：5'-AAARRYCGMCCYTGCAAGGT-3, 逆向（下游）引子：5'-TCY TTN CCY TCM KCT AAH CC-3’ 將擬南芥反義全長老化誘發之eIF-5A次選殖至pKYLX71 載體（含有SAG 12啟動基因）内 擬南芥老化誘發之eIF-5A的特異性（同源）引子，反義全 長構築體：前進全長老化誘發之eIF-5A引子（30體）：5·-CCGAGCTCCTGTTACCAAAAAATCTGTACC-3'(注意：加 下標線的部分為SacI認知序列，用來將PCR片段的5'末端 連接到pBluescript之多重選殖位置（MCS)中的SacI位點）。 94139-990728.doc -70- 1337185 逆向全長老化誘發之eIF-5A引子（36體）：5'-ACCTCGAGCGGCCGCAGAAGAAGTATAAAAACCATC-3' (注意：加下標線的部分為Notl認知序列，用來連接到 pBluescript之 MCS 中）。 pBluescript載體之MCS内的SacI及Notl位點之方向可使 該基因得以以其反義方向次選殖（亦即Notl位點在SacI位點 的上游）。 實例23
使用SAG 12啟動基因來表現反義老化誘發之擬南芥全長 eIF-5A 實驗證據顯示在老化開始的期間，一組「老化相關基 因」或SAG的轉錄增加（Lohman等人，1994 ; Weaver等 人，1998)。事實上，老化似乎始於新mRNA的合成，及或 許其他mRNA的向下調節，指示蛋白質的選擇性合成為老 化所必需（Nooden，1988)。葉片老化程式伴隨著基因表現 的改變，首先由Watanabe及Imaseki(1982)證實，其使用活 體外轉譯，接著進行凝膠電泳，偵測到發生在可轉譯之 mRNA群組中的改變。該初步工作及活體外轉譯蛋白質的 後續分析，揭示在老化進行期間大多數mRNA的豐度明顯 降低，而其他可轉譯mRNA則增加（Watanabe及Imaseki， 1982 ; Davies 及 Grierson, 1989 ; Becker 及 Apel, 1993 ; Buchanan-Wollaston, 1 994 ; Smart 等人，1 995)。對自老化 葉片組織之mRNA製備的cDNA庫進行差示篩選，亦證實在 老化期間許多基因的表現被向下調節，而其他基因的表現 -71 - 94139-990728.doc e 1337185 則被向上調節。已經自多種植物物種中鑑別出SAG，包括 擬南芥（Hensel等人，1993 ; Taylor等人，1993 ; Lohman等 人，1994 ; Oh 等人，1996)、蘆荀（King 等人，1995)、大 麥（Becker 及 Apel, 1993)、甘藍型油菜（Brassica napus)(Buchanan-Wollaston, 1 994)、玉蜀黍（Smart 等人， 1995)、蘿蔔（Azumi 及 Watanabe，1991)及番茄（Davies 及 Grierson, 1989 ; Drake等人，1996)。老化在形態學上鑑別 為特徵性圖案葉片變黃，其始於自葉片的邊緣且最後達到 葉脈（Weaver等人，1998)。在擬南芥叢生葉中可見的老化 出現在發芽之後約21天，此時SAG 12顯著向上調節（Noh an Amasino, 1999) » SAG 12為對天然老化具有最密切特異 性的基因，並因此被稱為老化標記。在年輕葉片中沒有可 僧測的表現’在較老的葉片令’在其有約2〇0/〇變黃之後绣 發SAG 12 ’但不會被不引起葉片變黃的處理所誘發 (Weaver等人，1998)。可藉由SAG 12之基因產物顯示與半 胱胺酸蛋白酶之相似性，並可能在老化期間參與蛋白質周 轉的事實，來解釋其對天然老化的高度特異性（L〇hman等 人，1994 ; Weaver等人，1998)。 轉殖基因植物的描述 產生轉殖基因擬南芥植物，其在SAG 12(葉片老化特異 性）啟動基因的控制下，表現全長反義老化誘發之eiF_5A 轉殖基因，該SAG 12啟動基因約在發芽之後21天在天然葉 片的老化開始時活化（Noh及Amasin〇, 1994)，但在逆境誘 發之老化的事件中則$。在此時，轉殖基因植物表現受抑 94139·990鳥 c -72- 1337185 制全長老化誘發之eIF-5A表現所特有的表現型。自3至8週 齡的轉殖基因擬南芥反義全長老化誘發之eIF-5 A植物收穫 叢生葉。 在SAG 12啟動基因的控制下，產生同源接合子轉殖基因 反義老化誘發之eIF_5 A擬南芥植物的方法 將SAG 12-反義-全長老化誘發之eIF-5A構築體插入 pKYLX71中 首先，利用EcoRI及Hindlll切割質體pKYLX71，以移除 其雙35S啟動基因，並利用Klenow酶填滿所得的黏性末 端，產生鈍端。隨後連接沒有啟動基因的pKYLX7 1，再度 環化成質體。 其次，自基因組DNA藉由PCR使用含有Sail及Xbal的引 子擴大擬南芥SAG 1 2啟動基因，如下所述。隨後使用限制 酵素Sail及Xbal，接著利用T4 DNA連接酶連接，將該啟動 基因序列插入pBluescript的多重選殖位置（MCS)。 前進 SAG 12 引子為 5’-GGCCGTCGACGATATCTCTTTTTA TAT TCAAAC-3'(加下標線的部分為Sail識別位點，用來將 PCR片段的5·末端連接到pBluescript之多重選殖位置（MCS) 中的Sail位點）。逆向SAG 12引子為5'-CGTCTAGACATTG TTTTAGGAAAGTTAAATGA-3’（加下標線的部分為Xbal識 別位點，用來將PCR片段的5'末端連接到pBluescript之多 重選殖位置（MCS)中的SacI位點）。 第三，為產生pBluescript-SAG 12:反義-全長-老化誘發 之eIF-5A構築體，藉由PCR使用具有SacI及Notl限制性位 94139-990728.doc -73· 1337185 點的引子自擬南芥cDNA庫擴大全長老化誘發之eIF-5A， 如下所概述’並次選殖至在先前段落中描述的pBluescript-SAG 12中。注意SacI 及 Notl位點在 pBluescript-SAG 12 載體 内的方向可使基因以其反義方向次選殖（亦即Notl位點在 SacI位點之上游）。 前進全長老化誘發之eIF-5A引子為5’-CCGAGCTCC TGTTACCAAAAAATCTGTACC-3·(注意：加下標線的部分 為SacI認知序列，用來將PCR片段的5·末端連接到 pBluescript-SAG 12載體之多重選殖位置（MCS)中的SacI位 點）。逆向全長老化誘發之eIF-5A引子為5'-ACCTCGA GCGGCCGCAGAAGAAGTATAAAAACCATC-3,（注意：加 下標線的部分為Notl認知序列，用來連接到pBluescript-SAG 12載體的多重選殖位置（MCS))。 最後，藉由以SacI及Xhol消化pKYLX71，亦利用Sail及 SacI自pBluescript中切下SAG 12:全長老化誘發之eIF-5A卡 匣，在二元載體PKYLX71中產生所要構築體。
Xhol及Sail黏性末端部分互補。因此，利用T4 DNA連接 酶能夠將該兩組經湞化的突出物（亦即SacI與SacI ’以及 Xhol與Sail)連接在一起，產生最後的構築體（在PKYLX71 申的SAG 12:反義·老化誘發之eIF-5A)。 轉型及T1種子收穫 使pKYLX71-SAG 12 :反義-eIF-5A構築體在大腸桿菌 DHa細胞中增殖，並電穿孔至勝任農桿菌菌株内。隨後使 用細菌滲透4.5週齡野外型擬南芥植物，並將所得的滲透 •74· 94139-990728.doc !337185 植物命名為「丁ϋ」植物，隨後使其生長至其生命週期結 束。收穫種子，收集並命名為儿種子。將Τι種子塗鋪在ι〇 個培養盤上，並篩選康黴素抗性（1/2 Ms鹽及5〇微克康黴 素/毫升），以野外型作為對照組；只有含有pKYLX7nsag 12-反義-6汗，5八構築體的彼等種子存活，並在康黴素（K5〇) 培養基上生長，自培養盤中選出24個乃籽苗，並置於土壤 中。將自Τ】轉殖基因植物收穫的種子標記為丁2種子。每個 籽田產生一個植株（#1 =含有i個植物的“固植株，含有i 個植物的1個植株，等等）。 表現型的讳選及鑑別 一旦鑑別出康黴素抗性T,種子，便連續培養τ2、丁3及丁4 代。藉由在Κ50培養基上篩選，可區別彼等繼承遺傳構築 體及對§亥構築體為同源接合子的植物。當在花盆中生長 時，在一個植物植株中觀察到生長遲緩的表現型表現^ 然而，當同一組種子在相同的條件下再度生長時，未觀察 到表現型。
自2_Tl植物中’以高種子產量為基礎選以個植株（植 株Τ2」4、Τ2，18、丁2.19及丁2.23)，並塗铺在κ5〇培養基 上，以野外型種子作為對照組Μ旱自每個植株的約75%的 種子在Κ50培養基上存活，並落在小、中及大的尺寸分類 中。將得自每個植株的小、中及大籽苗自培養盤移出，並 種植在土壤中。在溫室條件下，小籽苗不如其中及大相對 物般快速恢復。在第6週，小植物才開始顯示出結實的徵 兆，而其他植物已經結實並開花.總計6個轉殖基因的L •75- 94139-990728.doc
S «37185 植物（得自總共3個植株x 8個植物=96個轉殖基因植物）證實 在結實方面顯著延遲’並視為「延遲結實的」植物。該等 植物的種子產量亦顯著比其他轉殖基因者低。 自96個丁2植物中，選擇3個植株來產生Τ3植物（T3 i9s8 及⑴4丄7’其為延遲結實；以及T3 23 S3，其不為延遲 結實）。當種植在K5G培養盤上時，該等植株顯示同源接合 子存活。將13個籽苗移植到花盆中（每個花盆ι〇個軒苗）。 自-亥組植物中，在T3.i4.L7植物植株中觀察到顯著的矮化 表現型。收集T4種子，並在植株中觀察到較低的種子產 量。在植株丁3.19.S8中觀察到密集生長(密集果莢生長，較 多分支）的表現型，而在植株T3.23S3中觀察到類似野外型 的表現型。比較得自3個轉殖基因植株的種子尺寸，但未 測疋到在統计學上顯著的差異。亦分析葉綠素含量，但未 測定到在統計學上與野外型對照組之間顯著的差異。 在K50上篩選植株T3.19.S8、T3 14丄7及my的丁 4種 子，獲得下一代植物，並顯示與死亡的野外型種子相比 較，繼承基因構築體（在培養盤上均一的綠色生長）的證 據。然而，當種植在個別的平台上時，並未表現出矮化表 現型，表明已經喪失了 eIF_F5A反義轉殖基因。最後’在 K50培養盤上筛選自所有丁5植物收集到的種子，並顯示康 黴素抗性的證據。目前進行中的研究，證實已經喪失反義 基因’而該等Τ4植物不接合。 母植株Τ2_14、Τ2.19及Τ2.23中選出8個後代植株 並 在Κ5 0培養基上篩選 以野外型種子作為對照組。以低種 94139-990728.doc ③ •76· 1337185 子產量為基礎選出3個植株：τ T3 ςι 乂 i4.L8、T3.14.S8 及 •23义。選出其他5個植株為：丁3」 τ〇 ίο ci 了3-1 8.S2、 U.19.S1、T319 85及丁3 23 。 播嫉在K50培養基上篩選所 植株，顯示同源接合子存活， , T3 Μ - 3.14丄8、T3.14.S8 及 上3.23.S6顯示出異型接人π …η 子存活1自存活之植株 總 及T3.14.S8的籽苗為白色，並具有綠色的脈管％ Λ，而得自存活之T3.23‘S6的籽苗整個為深綠色㈣ f軒苗進行移植。總計將28個得自每個植株的籽苗移㈣ 單兀内，並在溫室條件下生長。 在第3週，所有的植株都開始結實，除了植株ΤΗ。 及T3.23.S1，以及數個植株丁3 i8 s7 ' 丁3mu 丁3.19.81、丁3.19.85、丁3,23.81及73 23 86内的植物以外。 在T3.14.L8及T3.14.S8植株争觀察到不規則的叢生葉形態 (第二對葉片表現型延長卜在第5週，亦在植株τ3·ΐ8^ mS6中觀察到增加數目之叢生葉的額外不規則葉片形 態，以及邊緣捲曲的叢生葉形態。在植株τ3 ^ 、 Τ3.19.S1及T3.19.S5中觀察到比野外型小的叢簇。在第7 週，在植株 T3.18.S7、T3.18.S2、T3 19S1 ' T3 19 ^、 T3.23.S1及T3.23.S6中觀察到細長的莖及無莖延長的表現 型。在第5及6週分別收集每個植物第一及第二個莖生葉， 用來研究老化eIF-5A的蛋白質表現。 實例24 氧輸入的測定 收穫葉片，並量測面積，隨後將其秤重。使用丨毫升冰 94139-990728.doc •77- 1337185 冷脫氣研磨緩衝液，利用臼及样，將葉片磨成細粉。隨後 將勻漿移至微量離心管中，並即刻放在冰上。關於番茄葉 片而要使所分離的勻漿經由一片Miracloth過遽。 將得自所有樣品的5 0微升勻漿添加至含有5毫升研磨緩 衝液及25微升DCPIP(2,6_二氣苯酚靛酚）的1〇毫升試管中。 喊底搖動樣品，隨後將一組樣品放在由—對燈提供的照明 下1 5分鐘，並將第二組樣品放在暗處丨5分鐘。在丨5分鐘保 溫之後，向兩組樣品中添加5〇微升DCMU(3-(3,4-二氣笨 基）-1，1 -二曱基脲）’以便停止反應，隨後在微量離心機中 以1 4,000 g離心2分鐘。在590毫微米處讀取所收集之上清 液的吸光度’使用研磨緩衝液作為空白。 该檢定之莫耳消光係數為1 6χ 1 〇3，亦即每公升1莫耳的 浪度變化改變該溶液之吸光度達1 6χ 1 〇3微莫耳DCPIP降低/ 小時/毫升=(吸光度之差異）χ[(1/16χ103(莫耳/公升）]χ[反應 體積（毫升）/103(毫升/公升）]χ[1〇6(微莫耳/莫耳）]x[6〇(分鐘/ 小時）/(反應時間（分鐘）]x[l/樣品體積（毫升）]。 每降低2莫耳的DCPIP，將產生1莫耳〇2。參考：Allen j· F.及Holmes N.G.，1986在光合作用中的電子傳遞及氧化還 原滴疋.月匕里轉導（Electron Transport and Redox Titrations in Photosynthesis: Energy Transduction) M.F. Hipkins 及 N,R. Baker.編，IRL Press，Oxford 第 107-108 頁。 實例25 澱粉的定量測定 使用改編自Lustinec等人，在植物組織中使用玻璃纖維 -78· 94139-990728.doc 1337185 紙定量測定澱粉' 直鏈澱粉及支鏈澱粉（Quantitative determination of starch, amylose, and amylopectin in plant tissues using glass fiber paper) > Anal. Biochem. 132:265-27 1( 1983)的方法，測定番茄莖中的澱粉含量。在三體積的 水中 使用〇mnimixer(每5秒12 reps)，接著使用Poly tr on 均質機（30秒），將番茄莖組織均質化。在分析之前，將勻 聚分成1 0毫升的等份試樣儲存在_2〇。〇下。為了分析，將 10毫升勻聚解凍，並與等體積的濃高氣酸（HC104，70%重 里/重重）混合，在室溫下保溫2〇分鐘，使澱粉溶解。同 時’將數個馬鈴薯殿粉的溶液與番茄莖樣品（在〇丨_丨〇毫 克/毫升的範圍中）並排處理，產生標準曲線。攪拌勻漿（或 馬鈴薯澱粉標準溶液），並使用附接吸氣器的真空燒瓶， 經由Whatman GF/A玻璃微纖維紙（直徑9 〇公分）過濾。將i 毫升濾液與3毫升碘溶液a(8 mM 12，17 mM ΚΙ，5 14 mM NaCl)此& ’並在4 ◦下保溫3〇分鐘，形成澱粉峨沈澱 物使用附接吸氣器的真空燒jf瓦，在Whatman GF/A玻璃 微纖維紙（直徑9.0公分）上收集沈澱物，隨後以下列溶液洗 滌濾液：以ίο毫升碘溶液B(83 mM l2，18〇 mM KI，8%高 氣[HCl〇4]酸）洗滌一次；以5毫升乙醇卞3(：1溶液（67%乙 醇、342 mM NaC1)洗滌一次；以3毫升乙醇·&〇Η溶液 (67%乙醇、250 mM NaOH)洗滌兩次。一旦蒸發乙醇，便 自吸氣益中移出微纖維紙，並插入有螺絲帽的玻璃管中。 向試管中添加硫[Ηβ〇4]酸（9毫升〇_75 M溶液），並在沸水 浴中保溫該t式管30分鐘。將三個】毫彳等份試樣的溶離物 94139-990728.doc •79· 1337185 吸移至玻璃試管中，並與丨毫升5%笨酚混合，接著很快與 5毫升濃Η4〇4混合。渦旋試管，並在室溫下保溫3〇分鐘， 容許顏色顯現。同時，藉由將1毫升〇 75 M 1^8〇4與1毫升 5°/〇笨酚混合，並很快地添加5毫升濃ΗΑ〇4，製備分光光 度量測的空白；亦在室溫下保溫空白3〇分鐘。在48〇毫微 米處使用空白校準分光光度計，量測並記錄所有樣品及馬 鈴薯澱粉標準物的O.D.。使用馬鈐薯澱粉溶液製備標準曲 線’並用來插入在每個樣品中的殺粉量。 實例26 分別藉由擬南芥有意義老化誘發之eIF_5A(At_eIF)及番 茄有意義老化誘發之eIF_5 A基因轉型擬南芥（哥倫比亞生 態型）。在轉殖基因植物的整個生命週期中，該等基因組 成性表現。該等植物的花梗顯示木質部發育明顯增加。來 見圖89-94。 將轉殖基因及對照組植物的種子播種在丨/2 Ms培養基瓊 脂盤上，並保持在22。(：、80。/。相對溼度及16小時亮/天的生 長至中9天。隨後將籽苗移至有市售土壤的32孔平台中， 並維持在與上述相同的條件下48天。選擇主要的花梗進行 顯微觀察。自在叢簇以上2毫米内的莖基部，以手切下橫 戴面切片。以根皮酸苯三酚一酯-HC丨法將切片染色。發現 在該年齡的莖木質部已經達到其最大發育。在轉殖基因及 對照組植物之間，比較木質部的尺寸（斷面的面積）^此 外’亦在轉殖基因及對照組植物兩者中量測韌皮部及木趙 部〇 94139-990728.doc 1337185 如下量測組織面積。利用Zeiss顯微鏡將橫切面拍照，並 使用Photoshop®將顯微照片數位化。將該等影像印在紙 上’並切掉不同的組織’隨後藉由面積量測計來量測其面 積。為計算每個組織的實際面積，使用下式：實際面積= (在紙上個別組織的面積）/(放大倍數）2。 因此顯然，老化誘發之eIF-5 A亦參與與木質部生成有關 的程式化細胞死亡。在擬南芥中，老化誘發之八411?_5八的 組成性反義抑制降低了花梗的厚度及木質部細胞層的數 目。相反，其中組成性過度表現擬南芥或番茄老化誘發之 eIF-5 A的植物之花梗，平均粗達相應野外型植物的1 7_ 倍，且每個花梗橫切面的總木質部面積高達2倍。過度表 現之轉殖基因植物亦具有大大增加的叢生葉生物質量且 比野外型植物生長得快，其可能反映營養攝入增強。當在 擬南芥植物中過度表現得自番莊的老化誘發之_5Α同功 異型物時，觀察到相同的表現型。該等結果總體表明老化 誘發之eIF-5A同功異型物不僅調節葉及花的老化’亦涉及 木質部生成。 實例27 抑制脫氧㈣胺離胺酸合成酶延遲預包裝之切割萬望在 周圍氛圍中的褐變 *市。預包裝的沙拉通常儲存在經過控制的氛圍條件下， ，此將氧含量大大地降低至其氛圍濃度之下，以便延長產 ，的存放期。肖包裝沙拉最常見的腐敗症狀為萵苣的切面 褐變n經過控制之分文包裝使得褐變延遲，但亦可能 94139-990728.doc
•8N 1337185 導致無臭無味。在本研究巾，顯示脫氧經腐胺離胺酸合成 酶PHS)的向下調節有潛力成為延遲萵苣之切面褐變的另 一種策略。鹏催化真核轉譯起始因子5α_5α)的活 化。亥因子充虽選疋mRNA群組之核細胞質穿梭蛋白質。 DHS似乎在切割萵苣褐變之過程中起作用，因為抑制願 的表現（藉由反義技術）導致在大氣條件下褐變開始明顯延 遲。特定而言，嶋野外制t植物的切隔區段顯示在切 割6天之後褐變，而平均僅有27%來自5個分離植株的轉殖 基因植物之切割區段在相同的期間内轉變為褐色，其中一 些個別植物顯示〇。/。褐變。參見圖51及53。 實例28 在油菜中抑制脫氧羥腐胺離胺酸合成酶表現，增加種子 產量 脫氧羥腐胺離胺酸合成酶（DHS)介導將無活性的真核轉 譯起始因子-5 A(eIF-5 A)轉變為能夠促進轉譯的活化形式的 兩個酶反應的第一個。自由老化葉片製備之cDNA表現庫 分離編碼油菜（威達甘藍型油菜（Brassica napus cv Westar))DHS的全長cDNA純系。在轉殖基因油菜植物中， 藉由在組成性花椰菜花葉病毒（CaMV-3 5S)啟動基因的調節 下表現油菜DHS cDNA的反義3，-UTR，抑制DHS。表現該 反義轉殖基因的植物具有降低的葉片DHS蛋白質含量，並 顯示天然葉片老化延遲。DHS表現的抑制亦增加叢生葉尺 寸1.5至2倍，並提高種子產量高達9〇%。DHS抑制在油菜 中的該等多效影響，與先前對擬南芥所獲得的結果一致 94I39-990728.doc -82- 1337185 (Wang 等人，2003，Plant Mol. Biol. 52:1223-1235)，並表 明該蛋白質在植物發育及老化中起重要作用。 實例29 藉由技與脫氧起腐胺離胺酸合成酶的抑制劑，並藉由脫 氧羥腐胺離胺酸合成酶的反義抑制，延長康乃馨花的花瓶 舞命 自康乃馨植物分離編碼脫氧羥腐胺離胺酸合成酶（DHs) 的王長cDNA純系（AF296079)。DHS介導將無活性的真核 轉譯起始因子_5 A(eIF_5 A)轉變為能夠促進轉譯的活化形式 的兩個酶反應的第一個。北方分析揭示DHS表現與康乃馨 花瓣的老化有關。以DHS反應的抑制劑，包括二胺基丁烷 (腐胺）、一胺基丙烷、二胺基己烷、二胺基辛烷及亞精胺 处理切下的康乃馨花’延長了花的花瓶壽命高達8 3 %。為 了更可靠地評估DHS在康乃馨花老化中的作用，藉由在轉 殖基因植物巾，在組成性花才耶菜花葉病毒啟動基因的調節 下，經由農桿菌轉型引入康乃馨DHS cDNA的反義3，_ UTR ’抑制該蛋白質的表現。分析具有減少DHS表現之轉 殖基因花的三個植株，發現相對於野外型花具有更長的 花瓶壽命。實際上，-個植株顯示花瓶壽命增加大於 100%。該等發現表明聰在花朵老化中起重要作用。 實例30 在擬南”’可藉由以GA3處理’解救藉由抑制脫氧經 腐胺離胺酸合成酶所引起的結實表現型延遲 脫氧經腐胺離胺酸合成酶（麵）為真核轉譯起始因子 94139-990728.doc •83- 1337185 5A(eIF-5A)之轉譯後活化作用所需的廣泛存在的酶，且似 乎對正常植物生長及發育不可或缺。藉由在轉殖基因植物 中，在老化特異性的SAG 12啟動基因的調節下，表現全長 反義擬南芥DHS cDNA，在擬南芬中抑制DHS。表現轉殖 基因的植物具有降低的葉片DHS蛋白質含量，並顯示結實 延遲，並顯著地延遲葉片老化的開始（2至5週）。結實亦較 短，雖然其並未導致生物質量或種子產量降低。以^八3處 理轉殖基因植物逆轉了結實表現型延遲。藉由在GCI(其為 可藉由投與地塞米松（dexamethasone)(DEX)活化的糖皮質 激素誘發性啟動基因）的調節下反義抑制DHS獲得類似的 表現型。再者，投與GA3解救該表現型；亦即經GA3處理 之轉殖基因植物正常地結實，結實具有正常的尺寸，且沒 有葉片老化開始的延遲。該等結果總體表明DHS在擬南芥 中經由二種eIF-5A同功異型物中一或多種的活化來影響 GA代謝。 【圖式簡單說明】 圖1顯不eIF-5A的三種同功異型物：經分離之擬南芥老 化誘發之eIF-5A(第1行）（之前在美國專利第6,538,1 82號及 i在申請中的第09/725,019號中描述）；創傷誘發之eIF_ 5八（第2行）；以及生長611?_5八（行3第）的比對。以虛線（一·) 強調相同的胺基酸，並以實線（一）指出用於肽設計的區 域。每個肽含有11個來自eIF_5A序列的胺基酸，以及在1^ 端的額外半胱胺酸殘基’以便與KLH進行共輛。 圖2顯示該三種擬南芥同功異型物之密碼區的比對。第夏 1337185 行為老化誘發的eIF-5 A。第2行為創傷誘發的elF-5 A。第3 行為生長eIF-5 A。以盒子指出在所有三種同功異型物中相 同的驗基對。序列僅包括子甲硫胺酸（ATG)到終止密碼子 的密碼區。1 =老化誘發之eIF_5A ; 2 =創傷誘發之eIF_5A ; 及3 =生長e[F-5A。 圖3提供擬南芥之老化誘發elF_5A的基因組序列。以虛 底線（----)指示用來設計引子的區域。5,末端引子亦含有 Hindlll限制性位點，且3,末端引子含有SacI限制性位點， 以便在連接至二元載體中時確保蛋白質方位。盒子區域指 示用作北方墨點之探針的3,末端。 圖4提供擬南芥之創傷誘發eIF_5A的基因組序列。以虛 底線（----)指示用來設計引子的區域。5ι末端引子亦含有 Xhol限制性位點，且3'末端引子含有gacI限制性位點以 便在連接至二元載體中時確保蛋白質方位。盒子區域指示 用作北方墨點之探針的3，末端„ 圖5提供擬南芥之生長eIF_5A的基因組序列。以虛底線 …）指不用來設計引子的區域。5，末端引子亦含有xh〇I限 亲J性位點，且3末端引子含有Sac〖限制性位點，以便在連 接到一元載體中時確保蛋白質方位。盒子區域指示用作北 方墨點之探針的3·末端。 圖6為二元載體PKYLX71-35S2的舆圖。二元載體 PKYLX71-3 5 S2含有在大腸桿菌中用來進行轉型體選擇的 四％素抗性，以及在含有康黴素的MS培養盤上，進行種 子轉型體選擇的康黴素抗性^ 94I39-990728.doc -85- 1337185 圖7為二元載體pGEM®-T Easy載體的輿圖。在多重選殖 位置中間的T突出物，提供PCR產物的插入位點。Ampr基 因適用於基於在胺苄青黴素存在下生長來篩選轉型體。 圖8顯示在哥倫比亞生態型之擬南芬野外型的不同組織 中，eIF-5A之所有三種同功異型物的西方墨點。泳道說明 於下：標記2'3、4、5、6、7的泳道為在2、3、4、5' ό、7週齡時收集的總叢生葉，^為來自以5% pEG處理之 植物的葉片，u為來自洗水之peg對照組植物的葉片，B為 緊閉未綻放的花苞，F1為範圍自緊閉花苞到老化花朵之所 有年齡的花，Si為在6週時收集的果莢，Se為浸潤】天的種 子’且St為在6週時收集的莖。 圖9為在哥倫比亞生態型之擬南芬野外型的小時之
後，被感染葉片的老化誘發之eIF_5A及創傷誘發之eIF_5A 的西方墨點，泳道1 :對照組植物（未處理），泳道2 :模倣 處理，泳道3 : Avr處理，泳道4 : Vir處理。老化誘發之
AteIF-5A的表現量保持恆定’因為該等植物均為共4週 齡。創傷誘發之AteIF-5A的表現在病毒處理的植物中增 加。生長A4IF-5A的表現不可偵測，並因此未納入本圖 中。 圖ίο為在哥倫比亞生態型之擬南芬野外型的72小時之 後’在文傷葉片中eIF-5A之三種同功異型物的北方墨點。 孝J用止血鉗使葉片觉傷，並在〇小時、處理後即刻、受傷 後1小時’及在受傷後9小時收集。創傷誘發之版1{7_5八轉 錄物的表S，是唯-在受傷後9小時增加的。生長α__ 94I39-990728.doc • 86 · ⑧ 1337185 5 A的表現儘管低，但在受傷事件中開始減少。 圖11描繪分別在泳道1、2及3中，得自老化誘發之AtelF- 5A、創傷誘發之AteIF-5A及生長AteIF-5A的基因組DNA的 PCR產物。切下並純化單一上方譜帶，以便連接到pGEM 中〇 圖12顯示分別在泳道1、2及3令具有pGEM中之老化誘發 之AteIF-5 A、創傷誘發之AteIF-5 A及生長AteIF-5A基因組 序列的瓊脂糖凝膠。pGEM :老化誘發之AteIF_5A、 pGEM:創傷誘發之AteIF_5A及pgem:生長AteIF-5A均以
EcoRI消化，以便鑑別出含有適當尺寸插入物的陽性轉型 體菌落。隨後將該等純系送去定序，證實序列在植物中過 度表現的適合性。 圖13顯示具有PKYLX71中之創傷誘發之AteIF、5A、生長 AtelF-SA基因組序列的瓊脂糖凝膠。經由利用適當酶進行 二元消化（D)，以及利用適當引子進行pCR(p)，針對創傷 誘發之AUIF-5A插入物或生長AteIF_5A插入物，筛選能夠 在含有四環素之培養盤上生長的菌落。 圖14為利用具有有意義創傷誘發^teiF_5A的構築體轉 型之植物的T1培養盤的照片。在該培養盤上，^色圈起 兩個轉型體，並對應於植株13及14。以白色圈起野外型對 圖15為四週齡之利用有意義創傷誘發的編㈠八轉 T1植物的照片。以p標籤指示轉殖基因植株以…桿 -野外型植物’並以Y標籤指示二元載體對照組植物 94139-990728.doc -87. 1337185 株6、8、10、13及14未產生種子。 圖16為5·5週齡之利用有意義創傷誘發的AteIF-5A轉型之 T1植物的照片。在本圖中只包括極小的植株。植株1、4及 12均產生種子，剩下的最後死亡，未產生種子。 圖17為在播種後10天利用有意義創傷誘發之八4汗_5八轉 型之T2植物的照片。藉由康徽素抗性（深色植物）與缺乏康 黴素抗性之非轉型體（淺色植物）的混合，指出所有T2植株 均仍然為異型接合子。以白色圓圈指示野外型對照組植 物。植株12未被納入本圖中，因為其僅有丨個轉型體生 長’且尚待移植。 圖18為在播種後10天利用有意義生長AteIF-5A轉型之T1 植物的照片。對本培養盤，以黑色圓圈指示三個轉型體， 並對應於植株6、7及8。以白色圓圈指示野外型對照組植 物。 圖19為四週齡之利用有意義生長AteIF-5A轉型之T1植物 的照片。以B標籤指示轉型體植株，並以w標籤或缺少標 籤才a示野外型對照組。在圖的下方包括空的二元對照組（γ 標籤）’顯示其看起來與野外型沒有差異。 圖20為利用有意義生長AteIF_5A株轉型之丁2植物的西方 墨點。使用每個母植株的代表物，以測定在每個植株中的 一般表現量。 圖21為在四週齡（上方）、五週齡（下左）及六週齡（下右）， 利用有意義生長八^11?_5八（1八_11)株）轉型的丁2植物。以8標 籤（灰色圓圈）指示轉型體植株，並以W標籤（白色橢圓）指 94139-990728.doc 1337185 示野外型對照組。以γ標籤（黑色圓圈）指示空的二元對照 組。植株1Α(以黑色盒子指示）將繼續生長為Τ3。 圖22為在四週齡（上方）、五週齡（下左）及六週齡（下右）， 利用有意義生長AteIF-5A(2A-lD株）轉型的Τ2植物。以Β標 籤（灰色圓圈）指示轉型體植株，並以w標籤（白色橢圓）指 示野外型對照組。以γ標籤（黑色圓圈）指示空的二元對照 組。植株2D(以黑色盒子指示）將繼續生長為T3。 圖23為在四週齡（上方）、五週齡（下左）及六週齡（下右）， 利用有意義生長AteIF_5A(4A_D株）轉型的丁2植物。以以票 籤（灰色圓圈）指示轉型體植株，並以w標籤（白色橢圓）指 示野外型對照組。以γ標籤(黑色圓圈)指示空的二元對照 組。植株4D(以黑色盒子指示）將繼續生長為T3。 圖24為在四週齡（上方）、五週齡（下左）及六週齡（下右）， 利用有意義生長AteIF-5A(15A-D株）轉型的Τ2植物。以Β標 籤（灰色圓圈）指示轉型體植株，並以w標籤（白色橢圓）指 示野外型對照組。以γ標籤(黑色圓圈)指示空的二元對照 組。植株1 5 A(以黑色盒子指示）將繼續生長為Τ3。 圖25為在四週齡（上方）、五週齡（下左）及六週齡（下右）， 利用有意義生長AteIF_5 A(8A_D株）轉型的T2植物。藉由藍 色枯籤私不轉型體植株，並藉由白色標籤指示野外型對照 組。藉由黃色標籤指示空的二元對照組。植株8D(以黑色 盒子指示）將繼續生長為T3。 圖26為在四週齡（上方）、五週齡（下左）及六週齡（下右）， 利用有思、義生長AteIF_5A(9E_H株）轉型的丁2植物。以B標 94139-990728.doc -89- 1337185 籤（灰色圓圈）指示轉型體植株，並以w標蕺（白色擴圓）指 示野外型對照組。以γ標籤（黑色圓圈）指示空的二元對照 組。植株9H(以黑色盒子指示）將繼續生長為T3。 圖27為在四週齡（上方）、五週齡（下左）及六週齡（下右广 利用有意義生長AteIF-5A(llA-D株）轉型的Τ2植物。以8標 籤（灰色圓圈）指示轉型體植株，並以w標籤（白色橢圓）指 示野外型對照組。以γ標籤（黑色圓圈）指示空的二元對照 組。植株11 C(以黑色盒子指示）將繼續生長為T3。 圖28為在四週齡（上方）、五週齡（下左）及六週齡（下右）， 利用有意義生長AteIF-5A(16A-D株）轉型的T2植物。以B標 籤（灰色圓圈）指示轉型體植株，並以w標籤（白色橢圓）指 示野外型對照組。以γ標籤（黑色圓圈）指示空的二元對照 組。植株1 6C(以黑色盒子指示示）將繼續生長為T3。 圖2 9為來自各種植株（包括野外型對照組及已經有意義 生長AteIF-5 A轉型的植株）的擬南芬種子的照片。野外型 (wt)、二元對照組（二元）及來自T3有意義生長八41?_5八種 子的植株11C、16C、2D、2Η。植株11C及16C僅為平均野 外型種子尺寸的88及87%，而植株2D及2Η分別比野外型大 273 及 299%。 圖30為每個已經用有意義生長AteIF-5A轉型之植物亞株 的平均種子尺寸（立方毫微米）的柱狀圖。每個植株具有在 圖中未分開標記之亞株A-Η。二元對照組及野外型對照組 對應於最後兩個柱條。按n = 1 0計算以誤差柱表示的標準誤 差。 94139-990728.doc -90- Θ31為母個已用有意義生長AteiF_5A轉型之植物亞株的 個別種子重量（毫免）的柱狀圖。二元對照組及野外型對照 組對應於最後兩個柱條。 圖32為顯示在個別種子重量對個別種子體積之間的比例 關係的圖。 圖33為顯示每個已用有意義生長AteIF_5 a轉型之植物亞 株’每個植物之種子產量（毫克）的柱狀圖。每個植株具有 亞株A-Η。二元對照組及野外型對照組對應於最後兩個柱 條。 圖34為在有意義生長AteIF_5A植物中展現之表現型的概 述如藉由西方墨點法所測定的表現量為基礎’將表現型 分類。顯示高表現量的植株以深藍色框起，顯示中等表現 ϊ的植株以（框起，顯示低表現量的植株以 框起，且顯示可能由於共抑制而無表現的植株以 白色框起。 圖35顯示U週齡擬南芬SAG12_反義全長老化誘發之eIF_ 5 A植物（在左）對野外型植物（在右）的表現型：轉殖基因植 物為矮小的，具有增加數目的小叢生葉，並顯示出延遲的 老化。 圖36-38顯示植物（利用反義生長eIF_5A轉型）的照片。 圖39顯示用來建構產生反義擬南芥3'DHS之載體的引 子。 圖40顯不載體構築體，其中插入物為反義擬南芥DHS的 3，-UTR。 94139-990728.doc -91· 1337185 圖41顯示分離自擬南芥之創傷因子eIF-5A的序列，以及 反義構築體的位置。利用XhoI/SacI#片段自pGEM-T切 離，並次選殖至PKYLX71中。 圖42顯示載體構築體（pKYLX71-反義-3’-UTR-擬南芥創 傷誘發之eIF-5A)。 圖43顯示接種假單胞菌之葉片圓盤的培養盤計數。以丁 香假單胞菌感染反義DHS擬南芥。表1:以有毒力或無毒 力之丁香假單胞菌接種之擬南芥葉片培養盤的標準培養盤 計數。 圖44顯示在反義轉殖基因植物對野外型中之CFU的圖表 (丁香假單胞菌感染）。 圖45描繪番茄葉片DHS cDNA序列（SEQ ID NO: 1)之核 苷酸序列，以及獲自番茄葉片cDNA庫的衍生胺基酸序列 (SEQ ID NO: 2)。 圖46描繪藉由將番茄DHS序列與在擬南芥基因銀行中尚 未鑑別出之基因組序列比對獲得的擬南芥DHS基因的核苷 酸序列（SEQ ID NO: 5)。預測在胺基酸序列之間的間隙為 内含子。圖46B描繪衍生的擬南芥DHS胺基酸序列（SEQ ID NO: 6)。圖46C描繪藉由PCR獲得的擬南芥DHS cDNA之 600個鹼基對的核苷酸序列。圖46D描繪擬南芥DHS cDNA 片段之衍生的胺基酸序列。 圖47為衍生之全長番茄葉片DHS胺基酸序列（SEQ ID NO: 2)與帶有人類、酵母菌、脈孢菌（Neurospora)(真菌） 及甲烧球菌（Methanococcus)(古原細菌（Archaeobacteria)i 94139-990728.doc •92· 1337185 之DHS蛋白質序歹ij的衍生之全長擬南芥老化誘發之DHS胺 基酸序列的比對。在三或四個序列中相同的胺基酸被圍 住。 圖48為番茄DHScDNA的限制圖。 圖49為分離自番茄葉片並利用經32P-dCTP-標記之全長 番茄DHS cDNA探測之基因組DNA的南方墨點。 圖50為分離自不同發育階段之番茄花的RNA的北方墨 點。上方的圖為總RN A的溴化乙錠染色凝膠。每條泳道含 有10微克RNA。下方的圖為以經32P-dCTP-標記之全長番 茄DHS cDNA探測之北方墨點的自動放射照片。 圖5 1為自各種成熟階段之番茄果實分離之RN A的北方墨 點，其係利用經32P-dCTP-標記之全長番茄DHS cDNA探 測。每條泳道含有1 0微克RN A。 圖52為分離自藉由以2 Μ山梨糖醇處理6小時進行乾旱逆 境脅迫的番茄葉片之RNA的北方墨點。每條泳道含有10微 克RNA。以經32P-dCTP-標記之全長番茄DHS cDNA探測墨 點。 圖53為分離自已暴露在寒冷的溫度下的番茄葉片之RNA 的北方墨點。圖53A為總RNA的溴化乙錠染色的凝膠。每 條泳道含有10微克RNA。圖53B為以經32P-dCTP-標記之全 長番茄DHS cDNA探測之北方墨點的自動放射照片。圖 53C顯示根據葉片滲出液之傳導性所量測的相應洩漏資 料。 圖54為康乃馨DHS全長（1384個鹼基對）cDNA純系核苷酸 94139-990728.doc -93- 1337185 序列（SEQ ID NO: 9)，不包括聚A尾及5,末端非密碼區。在 核苦酸序列下方顯示衍生的胺基酸序列（373個胺基 酸）(SEQ ID NO: 10)。 圖55為得自正老化之擬南芬葉片的總rnA的北方墨點， 以經32P-dCTP-標記之全長擬南芥DHS cDNA探測。上方為 自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。 圖5 6為分離自各種階段之康乃馨花花瓣的總rn a的北方 墨點。利用經32P-dCTP-標記之全長康乃馨DHS cDNA探測 墨點。上方為自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。 圖57為番祐果實老化誘發之eIF-5A基因的核皆酸（上 方）（SEQ ID NO: 1)及衍生的胺基酸（下方）（SEQ ID NO: 12) 序列。 圖58為康乃馨老化誘發之eiF_5A基因的核皆酸（上 方）（SEQ ID NO: 13)及衍生的胺基酸（下方）（SEQ ID NO: 14)序列。 圖59為擬南芥老化誘發之elF-5 A基因的核苦酸（上 方）（SEQ ID NO: 15)及衍生的胺基酸（下方）（SEQ ID NO: 16)序列。 圖60為分離自處於各種發育階段之擬南芥植物之葉片的 總RNA的北方墨點。利用經32P-dCTP-標記之全長擬南芬 DHS cDNA及全長的老化誘發之eIF-5A探測墨點。上方為 自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。（野外型AT DHS 及老化誘發之eIF-5A的北方分析。） 圖61為分離自處於發育之破色期果實（BK)、紅-硬 94139-990728.doc • 94· 1337185 及紅-軟（RS)階段的番茄果實之總RNA的北方墨點。利用 經32P-dCTP-標記之全長DHS cDNA及全長老化誘發之eIF_ 5 A探測墨點。在紅-軟果實中，DHS及eIF-5 A與果實成熟 同時平行地獲得向上調節。上方為自動放射照片，下方為 乙錠染色的凝膠。 圖62為分離自以山梨糖醇處理以便誘發乾旱逆境的番祐 葉片之總RNA的北方墨點。C為對照組；s為以山梨糖醇處 理。利用經32P-dCTP-標記之全長DHS cDNA及全長老化誘 發之eIF-5A〖采測墨點。eIF-5A及DHS兩者回應於乾旱逆境 而向上調節。上方為自動放射照片，下方為乙錠染色的凝 膠。 圖6 3為分離自番茄植物之花芽及正老化之綻放花的總 RNA的北方墨點。利用經32p_dCTp標記之全長老化誘發 之DHS cDNA及全長老化誘發之eIF_5A探測墨點。在旋放/ 老化的花中，eIF-5A及DHS兩者受到向上調節。上方為 自動放射照片，下方為乙錠染色的凝膠。 4 刀離自欠寒冷傷害之番茄葉片的總RNA的北方墨 點。利用經32Ρ《ΤΡ-標記之全長MS cDNA及全長老化誘 發之沿心探測墨點。在再升溫期間，隨著寒冷傷害之發 展eIF-5A及DHS兩者受到向上調節。上方為自動放射照 片，下方為乙錠染色的凝膠。 DH=5為3.1週齡之擬南芥野外型(左)及以反義方向表現 土因之3,末端的轉殖基因植物(在圖80中所示之序列） 的照片，顯千户±由丄 yi ) 』不在轉殖基因植物中葉片尺寸增加。 94I39-990728.doc •95- 丄0：) 二為齡之擬南芬野外型(左)及以反義方向表現 的心顯纟端的轉殖基因植物(在圖80中所示之序列) 的…、片：顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加。 DH圖sT為56週齡之擬南芥野外型(左)及以反義方向表現 土因之3末端的轉殖基因植物（在圖80中所示之序列） 的照片’顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加。 圖6 8為6. i週齡之擬南芥野外型(左)及以反義方向表現 則基因之3,末端的轉殖基因植物（在圖80中所示之序列） 的照片’顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加。 圖69為顯示在三種以反義方向表現刪基目的T,轉殖基 因擬南芥植株中種子產量增加的圖。以種子的體積表示種 子產里。至於野外型植物，顯示n=3 〇的SE。 圖70為以反義方向表現DHS基因之3，末端（在圖8〇中所示 之序列）的轉殖基因番茄植物（左）及野外型植物（右）的照 片’顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加且植物尺寸增 加。照片係在將植株移至土壤之後丨8天拍攝。 圖71為以反義方向表現dhs基因之3,末端（在圖36中所示 之序列）的轉殖基因番茄植物（左）及野外型植物（右）的照 片’顯示在轉殖基因植物中葉片尺寸增加且植物尺寸增 加。照片係在將植株移至土壤之後32天拍攝。 圖72到79為野外型（上方圖）及以反義方向表現全長DHS 基因之轉殖基因植物（下方圖）的番茄果實的照片。在發育 之破色期果實階段收穫果實，並在生長室中使其成熟。在 每個圖的左上角指出在收穫之後的天數。 94139-990728.doc -96· 1337185 圖80為擬南芬老化誘發之DHS基因的3,末端的核苷酸（上 方）（SEQ ID NO: 3〇)及衍生之胺基酸（下方）序列該序列 以反義的方向用來轉型植物。 圖81為番茄DHS基因之3,末端的核苷酸（上方）（SEq m NO: 31)及衍生之胺基酸（下方）序列，該序列以反義的方向 用來轉型植物。 圖82為600個鹼基對之擬南芥DHS探針的核苷酸（上 方）（SEQ ID NO: 26)及衍生之胺基酸（下方）序列，用來分 離全長的擬南芥基因。 圖83為483個鹼基對之康乃馨DHS探針的核苷酸（上 方）（SEQ ID NO: 27)及衍生之胺基酸（下方）序列，用來分 離全長的康乃馨基因。 圖84(a)及（b)為以反義方向表現DHS基因之3,末端（在圖 81中所示之序列）的轉殖基因番茄植物之番茄果實（右），以 及野外型植物之番茄果實（左）的照片。野外型果實顯示出 頂腐病，轉殖基因的果實則否。 圖85顯示來自數個植物物種之eIF_5A的各種同功異型物 的比對。亦提供羥腐胺離胺酸保守區的比對。 圖86提供番茄老化誘發之eIF_5A聚核苷酸及胺基酸序 列。 圖87提供擬南芥老化誘發之eIF_5A& pKYLX71-有意義 老化誘發之eIF-5A的建構。（建構雙353啟動基因：有意義 老化 eIF-5 A。） 圖88提供番茄老化誘發之eIF_5A及pKYLX71-有意義老 94139-990728.doc •97· 1337185 化誘發之eIF-5A的建構。 圖89提供比較擬南芥對照組及包括有意義聚核苷酸老化 誘發之eIF-5A之轉殖基因植物的照片。轉殖基因植物具有 較粗的花梗，勝過對照組植物。（比較對照組與At_eiF5Ai_ 轉殖基因植物（5週齡）。（A):花梗；（B):整個植物。） 圖90及91顯示包括有意義聚核苷酸老化誘發之eiF 5A的 轉殖基因植物（圖90-擬南芥及圖91_番茄），如藉由在轉殖 基因植物中木質部增加所指示，具有增加的木質部生成 (xylogenesis)。（（A)對照組僅具有啟動基因35S。（B)轉殖 基因具有啟動基因35S::At-eIF5Al。以根皮酸苯三酚一酯_ Hcl將木質部帶染成灰色，條柱=1 00微米。1 圖92提供比較擬南芥對照組及包括有意義聚核苷酸老化 誘發之eIF-5 A之擬南芥轉殖基因植物的照片。在擬南芥中 使用番蘇有意義聚核苷酸老化誘發之eIF_5 a。轉殖基因植 物具有較粗的花梗，勝過對照組植物。（(A)花梗；（B)整個 植物。） 圖93及94為在包括有意義聚核苷酸老化誘發ieIF_5Aw 轉殖基因植物中，顯示木質部生成增加的柱狀圖。圖叫係 關於番力α有意義聚核芽酸老化誘發之eIF-5A。 圖95提供油菜生長eIF-5A胺基酸及聚核苷酸序列。 圖96提供油菜生長eIF_5A及pKYLX71_有意義生長elF_ 5 A的建構。 圖97提供油菜DHS胺基酸及聚核苷酸序列。 圖98提供油菜DHS及pKYLX71_有意義DHS的建構。 94139-990728.doc •98· 1337185 圖99以柱狀圖形式顯示在油菜中抑制DHS表現（τ, _τ4重 量）增加種子產量（12月28日-3月18日）。 圖100以柱狀圖形式顯示eIF-5 Α之生長同功異型物的向 上調節’自左到右為擬南芬、油菜、番茄，以及番莊 的向上調節（12月28日-3月18日）。 圖101提供售茄生長eIF-5A胺基酸及聚核苷酸序列。 圖102提供番茄生長eIF-5A，以及pKYLX71-有意義番祐 生長eIF-5A的建構。 圖103提供番茄創傷誘發之eIF-5 A胺基酸及聚核皆酸序 列。（TeIF-5A3(創傷）） 圖1 04A及B提供番祐創傷誘發之eij7_5 a，以及pKLYX7 1 _ 有意義番茄創傷誘發之eIF-5A的建構。 圖105提供部分的萵苣DHS聚核苷酸序列。 圖106提供pTA7〇01-3'UTR反義萵苣DHS的構築體，其中 插入物為反義萵苣DHS的3'-UTR。 圖107A及B提供紫花苜蓿DHS胺基酸及聚核苷酸序列。 圖108A及B提供香蕉DHS胺基酸及聚核苷酸序列。 圖109A及B提供白楊DHS胺基酸及聚核苷酸序列。 圖110提供部分的香蕉葉斑病菌（mycosphaerella fijiensis)DHS胺基酸及聚核苷酸序列。（真菌DHS(香蕉葉 斑病菌不完整。） 參考文獻
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<110>美商新諾斯柯科技公司 THOMPSON, JOHN E. WANG, TZANN-WEI <120〉eIF-5A之異構形：老化誘發之eIF-5A ;創傷誘發之eIF-5A ;生長eIF-5A ;及DHS <130> 10799/132 <140> TW 93117962 <141> 2004-06-08 <150> 09/725,019 <151> 2000-11-29 <150〉 09/597,771 <151> 2000-06-19 <150〉 09/348,675 <151> 1999-07-06 <150> 60/479,968 <151> 2003-06-20 <150〉 60/479,969 <151> 2003-06-20 <150> 60/570,833 <151> 2004-05-14 <150> 60/570,835 <151> 2004-05-14 <160> 165 <170> Patentln 版本 3.2
<210> 1 <211> 1584 <212> DNA <213> 番茄（Lycopersicon esculentum) <220> <221> CDS <222〉（54)..(11%) <400〉 1 cgcagaaact cgcggcggca gtcttgttcc gtacataatc ttggtctgca ata atg 56
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Tyr Lys Asn Arg lie Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser 230 235 240 ctt ggt gac atg eta tac ttc cat tet ttc aaa aag ggt gat cca gat 824
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Met Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Ser lie Met Asp Ser Val Arg Ser Val 15 10 15
Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Glu Gly Ser Cys Thr Lys He Glu 20 25 30
Gly Tyr Asp Phe Asn Lys Gly Val Asn Tyr Ala Glu Leu lie Lys Ser 35 40 45
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Thr Gly Lys His Gly His 1 5
<210> 5 <211> 2272 <212> DNA <213> 擬南芬(Arabidopsis thaliana) <220> <221> CDS <222〉 （68)..(265) <220>
<221> CDS <222〉 （348)..(536) <220> <221> CDS <222> (624)..(842) <220>
<221> CDS <222〉 （979)..(1065) <220〉
<221> CDS <222> (1154)..(1258) <220>
<221> CDS <222> (1575)..(1862) <400> 5 gaactcccaa aaccctctac tactacactt tcagatccaa ggaaatcaat tttgtcattc 60 gagcaac atg gag gat gat cgt gtt ttc tct teg gtt cac tea aca gtt 109
Met Glu Asp Asp Arg Val Phe Ser Ser Val His Ser Thr Val 1 5 10 ttc aaa gaa tcc gaa tea ttg gaa gga aag tgt gat aaa ate gaa gga 157
Phe Lys Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys lie Glu Gly 15 20 25 30 tac gat ttc aat caa gga gta gat tac cca aag ett atg ega tec atg 205
Tyr Asp Phe Asn Gin Gly Val Asp Tyr Pro Lys Leu Met Arg Ser Met 35 40 45 etc acc acc gga ttt caa gee teg aat etc ggc gaa get att gat gtc 253
Leu Thr Thr Gly Phe Gin Ala Ser Asn Leu Gly Glu Ala lie Asp Val 50 55 60 • Ί ·
94l39.doc 1337185 gtc aat caa atg gttcgtttct cgaattcatc aaaaataaaa attccttctt 305
Val Asn Gin Met 65 tttgttttcc tttgttttgg gtgaattagt aatgacaaag ag ttt gaa ttt gta 359
Phe Glu Phe Val 70 ttg aag eta gat tgg aga ctg get gat gaa act aca gta get gaa gac 407
Leu Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu Thr Thr Val Ala Glu Asp 75 80 85 tgt agt gaa gag gag aag aat cca teg ttt aga gag tet gtc aag tgt 455
Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asa Pro Ser Phe Arg Glu Ser Val Lys Cys 90 95 100 aaa ate ttt eta ggt ttc act tea aat ett gtt tea tet ggt gtt aga 503
Lys lie Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val Arg
105 110 115 gat act att cgt tat ett gtt cag cat cat atg gtttgtgatt tttgctttat 556
Asp Thr lie Arg Tyr Leu Val Gin His His Met 120 125 caccctgctt ttttatagat gttaaaattt tegagettta gttttgattt caatggtttt 616 tctgcag gtt gat gtt ata gtc aeg aca act ggt ggt gtt gag gaa gat 665
Val Asp Val lie Val Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp 130 135 140 etc ata aaa tgc ett gca cct aca ttt aaa ggt gat ttc tet eta cct 713
Leu lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro 145 150 155 gga get tat tta agg tea aag gga ttg aac ega att ggg aat ttg ctg 761
Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu 160 165 170 175 gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag gat tgg ate att ccc ate 809
Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie lie Pro lie 180 185 190 ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa gag gtattgcttt atctttcctt 862
Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gin Lys Glu Glu 195 200 tttatatgat ttgagatgat tctgtttgtg cgtcactagt ggagatagat tttgattcct 922 ctcttgcatc attgaetteg ttggtgaatc cttctttctc tggtttttcc ttgtag aat 981
Asn gtg ttg tgg act cct tet aaa ctg tta gca egg ctg gga aaa gaa ate 1029
Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys Glu lie 205 210 215 94l39.doc aac aat gag agt tea tac ett tat tgg gca tac aag gtatccaaaa 1075
Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys 220 225 230 ttttaacctt tttagttttt taatcatcct gtgaggaact cggggattta aattttccgc 1135 ttcttgtggt gtttgtag atg aat att cca gta ttc tgc cca ggg tta aca 1186 Met Asn lie Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr 235 240 gat ggc tet ett ggg gat atg ctg tat ttt cac tet ttt cgt acc tet 1234
Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser 245 250 255 ggc etc ate ate gat gta gta caa ggtaettett ttactcaata agtcagtgtg 1288 Gly Leu lie lie Asp Val Val Gin 260 265 ataaatattc ctgctacatc tagtgcagga atattgtaac tagtagtgea ttgtagcttt 1348 tccaattcag caacggactt tactgtaagt tgatatctaa aggttcaaac gggagetagg 1408 agaatageat aggggcattc tgatttaggt ttggggcact gggttaagag ttagagaata 1468 ataatettgt tagttgttta tcaaactctt tgatggttag tctcttggta atttgaattt 1528 tatcacagtg tttatggtct ttgaaccagt taatgtttta tgaaca gat ate aga 1583
Asp lie Arg get atg aac ggc gaa get gtc cat gca aat cct aaa aag aca ggg atg 1631
Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys Lys Thr Gly Met 270 275 280 285 ata ate ett gga ggg ggc ttg cca aag cac cac ata tgt aat gee aat 1679 lie lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His lie Cys Asn Ala Asn 290 295 300 atg atg ege aat ggt gca gat tac get gta ttt ata aac acc ggg caa 1727
Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie Asn Thr Gly Gin 305 310 315 gaa ttt gat ggg age gac teg ggt gca ege cct gat gaa gee gtg tet 1775
Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser 320 325 330 tgg ggt aaa att agg ggt tet get aaa acc gtt aag gtc tgc ttt tta 1823
Trp Gly Lys lie Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu 335 340 345 att tet tea cat cct aat tta tat etc act cag tgg ttt tgagtacata 1872 lie Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr Leu Thr Gin Trp Phe 350 355 360 tttaatattg gatcattctt gcaggtatac tgtgatgcta ccatagcctt cccattgttg 1932 94139.doc gttgcagaaa catttgccac aaagagagac caaacctgtg agtctaagac ttaagaactg 1992 actggtcgtt ttggccatgg attcttaaag atcgttgctt tttgatttta cactggagtg 2052 accatataac actccacatt gatgtggctg tgacgcgaat tgtcttcttg cgaattgtac 2112 tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc agattgtgtt ttcgtttaaa acacaagagt 2172 cttgtagtca ataatccttt gccttataaa attattcagt tccaacaaca cattgtgatt 2232 ctgtgacaag tctcccgttg cctatgttca cttctctgcg 2272
<210> 6 <211> 362 <212> PRT <213> 擬南芥"(Arabidopsis thaliana) <400> 6
Met Glu Asp Asp Arg Val Phe Ser Ser Val His Ser Thr Val Phe Lys 15 10 15
Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys lie Glu Gly Tyr Asp 20 25 30
Phe Asn Gin Gly Val Asp Tyr Pro Lys Leu Met Arg Ser Met Leu Thr 35 40 45
Thr Gly Phe Gin Ala Ser Asn Leu Gly Glu Ala lie Asp Val Val Asn 50 55 60
Gin Met Phe Glu Phe Val Leu Lys Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu 65 70 75 80
Thr Thr Val Ala Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asn Pro Ser Phe 85 90 95
Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys lie Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu 100 105 110
Val Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr lie Arg Tyr Leu Val Gin His His 115 120 125
Met Val Asp Val lie Val Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu 130 135 140 lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly 145 150 155 160
Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu Val 165 170 175
Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie lie Pro lie Phe 180 185 190 -10- 94139.doc 1337185
Asp GIu Met Leu Lys Glu Gin Lys Glu Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro 195 200 205
Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys Glu lie Asn Asn Glu Ser Ser 210 215 220
Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn lie Pro Val Phe Cys Pro Gly 225 230 235 240
Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg 245 250 255
Thr Ser Gly Leu lie lie Asp Val Val Gin Asp lie Arg Ala Met Asn 260 265 270
Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys Lys Thr Gly Met lie lie Leu 275 280 285
Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His lie Cys Asn Ala Asn Met Met Arg 290 295 300
Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie Asn Thr Gly Gin Glu Phe Asp 305 310 315 320
Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys 325 330 335 lie Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu lie Ser Ser 340 345 350
His Pro Asn Leu Tyr Leu Thr Gin Trp Phe 355 360 <210> 7 <211〉 19 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 7 ggtggtgttg aggaagatc <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 -11 - 94139.doc 20 <400> 8
ggtgcacgcc ctgatgaagc <210> 9 <211> 1660 <212> DNA <213> 康乃馨（Dianthus caryophyllus) <220〉
<221> CDS <222> (256)..(1374) <400> 9 gtcattacaa tgcataggat cattgcacat gctaccttcc tcattgcact tgagcttgcc 60 atacttttgt ttttgacgtt tgataataat actatgaaaa tattatgttt tttcttttgt 120 gtgttggtgt ttttgaagtt gtttttgata agcagaaccc agttgtttta cacttttacc 180 attgaactac tgcaattcta aaactttgtt tacattttaa ttccatcaaa gattgagttc 240 agcataggaa aaagg atg gag gat get aat cat gat agt gtg gca tet geg 291 Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser Ala 1 5 10 cac tet gca gca ttc aaa aag teg gag aat tta gag ggg aaa age gtt 339
His Ser Ala Ala Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser Val 15 20 25 aag att gag ggt tat gat ttt aat caa ggt gta aac tat tee aaa etc 387
Lys He Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gin Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu 30 35 40 ttg caa tet ttc get tet aat ggg ttt caa gee teg aat ett gga gat 435
Leu Gin Ser Phe Ala Ser Asn Gly Phe Gin Ala Ser Asn Leu Gly Asp 45 50 55 60 gee att gaa gta gtt aat cat atg eta gat tgg agt ctg gca gat gag 483
Ala lie Glu Val Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp Glu 65 70 75 gca cct gtg gac gat tgt age gag gaa gag agg gat cct aaa ttc aga 531
Ala Pro Val Asp Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe Arg 80 85 90 gaa tet gtg aag tgc aaa gtg ttc ttg ggc ttt act tea aat ett att 579
Glu Ser Val Lys Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu lie 95 100 105 tee tet ggt gtt cgt gac aca att egg tat etc gtg caa cat cat atg 627
Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr He Arg Tyr Leu Val Gin His His Met 110 115 120 gtt gac gtg ata gta aeg aca acc gga ggt ata gaa gaa gat eta ata 675 -12- 94139.doc 7231337185
Val Asp Val lie Val Thr Thr Thr Gly Gly lie Glu Glu Asp Leu He 125 130 135 140 aaa gga aga tcc ate aag tgc ett gca ccc act ttc aaa ggc gat ttt Lys Gly Arg Ser lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe 145 150 155 gcc tta cca gga get caa tta ege tec aaa ggg ttg aat ega att ggt Ala Leu Pro Gly Ala Gin Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly 160 165 170 aat ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg ate Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie 175 180 185 att cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tea gag aaa ate lie Pro lie Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gin lie Ser Glu Lys lie 190 195 200 tta tgg aca cca teg aag ttg att ggt ega tta gga aga gaa ata aac Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu lie Gly Arg Leu Gly Arg Glu lie Asn 205 210 215 220 gat gag agt tea tac ett tac tgg gcc ttc aag aac aat att cca gta Asp Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn lie Pro Val 225 230 235 ttt tgc cca ggt tta aca gac ggc tea etc gga gac atg eta tat ttt Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe 240 245 250 cat tet ttt ege aat ccg ggt tta ate gtc gat gtt gtg caa gat ata His Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu lie Val Asp Val Val Gin Asp lie 255 260 265 aga gca gta aat ggc gag get gtg cac gca geg cct agg aaa aca ggc Arg Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly 270 275 280 atg att ata etc ggt gga ggg ttg cct aag cac cac ate tgc aac gca Met lie lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His lie Cys Asn Ala 285 290 295 300 aac atg atg aga aat ggc gcc gat tat get gtt ttc ate aac act gcc Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie Asn Thr Ala 305 310 315 gaa gag ttt gac ggc agt gai let ggt get ege ccc gat gag get att Glu Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala lie 320 325 330 tea tgg ggc aaa att age gga tet get aag act gtg aag gtg cat tgt Ser Trp Gly Lys lie Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys 335 340 345 771 819 867 915 963 1011 1059 1107 1155 1203 1251 94139.doc •13· 1299 1337185 gat gcc acg ata get ttc cct eta eta gtc get gag aca ttt gca gca 1347
Asp Ala Thr lie Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala 350 355 360 aaa aga gaa aaa gag agg aag age tgt taaaactttt ttgattgttg 1394
Lys Arg Glu Lys Glu Arg Lys Ser Cys 365 370 aaaaatctgt gttatacaag tctcgaaatg cattttagta attgaettga tcttatcatt 1454 tcaatgtgtt atctttgaaa atgttggtaa tgaaacatct cacctcttct atacaacatt 1514 gttgatccat tgtactccgt atcttgtaat tttggaaaaa aaaaaccgtc tattgttacg 1574 agagagtaca tttttgaggt aaaaatatag gatttttgtg cgatgcaaat gctggttatt 1634 cccttgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1660 <210> 10 <211> 373 <212>蛋白質 <213> 康乃馨（Dianthus caryophyllus) <400> 10
Met Glu Asp Ala Asn His Asp Ser Val Ala Ser Ala His Ser Ala Ala 15 10 15
Phe Lys Lys Ser Glu Asn Leu Glu Gly Lys Ser Val Lys lie Glu Gly 20 25 30
Tyr Asp Phe Asn Gin Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Gin Ser Phe 35 40 45
Ala Ser Asn Gly Phe Gin Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala lie Glu Val 50 55 60
Val Asn His Met Leu Asp Trp Ser Leu Ala Asp Glu Ala Pro Val Asp 65 70 75 80
Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asp Pro Lys Phe Arg Glu Ser Val Lys 85 90 95
Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu lie Ser Ser Gly Val 100 105 110
Arg Asp Thr lie Arg Tyr Leu Val Gin His His Met Val Asp Val lie 115 120 125
Val Thr Thr Thr Gly Gly lie Glu Glu Asp Leu lie Lys Gly Arg Ser 130 135 140 lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala Leu Pro Gly 145 150 155 160 •14- 94139.doc
Ala Gin Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu Val 165 170 175
Pro Asa Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie lie Pro lie Leu 180 185 190
Asp Lys Met Leu Glu Glu Gin lie Ser Glu Lys lie Leu Trp Thr Pro 195 200 205
Ser Lys Leu lie Gly Arg Leu Gly Arg Glu lie Asn Asp Glu Ser Ser 210 215 220
Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn lie Pro Val Phe Cys Pro Gly 225 230 235 240
Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg 245 250 255
Asn Pro Gly Leu He Val Asp Val Val Gin Asp He Arg Ala Val Asn 260 265 270
Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met lie lie Leu 275 280 285
Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His lie Cys Asn Ala Asn Met Met Arg 290 295 300
Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie Asn Thr Ala Glu Glu Phe Asp 305 310 315 320
Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala lie Ser Trp Gly Lys 325 330 335 lie Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr lie 340 345 350
Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Arg Glu Lys 355 360 365
Glu Arg Lys Ser Cys 370
<210> 11 <211> 780 <212> DNA <213> #*5(Lycopersicon esculentum) <220> <221> CDS <222〉 （43)..(522) <400〉 11 aaagaatcct agagagagaa agggaatcct agagagagaa gc atg teg gac gaa -15- 94139.doc
Met Ser Asp Glu gaa cac cat ttt gag tea aag gca gat get ggt gee tea aaa act ttc 102
Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser Lys Thr Phe 5 10 15 20 cca cag caa get gga acc ate cgt aag aat ggt tac ate gtt ate aaa 150
Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Asn Gly Tyr lie Val lie Lys 25 30 35 g£C cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtc tee act tea aaa act gga aaa 198
Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys 40 45 50 cac gga cat get aaa tgt cac ttt gtg gca att gac att ttc aat gga 246
His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie Phe Asn Gly 55 60 65 aag aaa ctg gaa gat ate gtt ccg tee tee cac aat tgt gat gtg cca 294
Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp Val Pro 70 75 80 cat gtt aac cgt acc gac tat cag ctg att gat ate tet gaa gat ggt 342
His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Ser Glu Asp Gly 85 90 95 100 ttt gtc tea ett ett act gaa agt gga aac acc aag gat gac etc agg 390
Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys Asp Asp Leu Arg 105 110 115 ett ccc acc gat gaa aat ctg ctg aag cag gtt aaa gat ggg ttc cag 438
Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gin Val Lys Asp Gly Phe Gin 120 125 130 gaa gga aag gat ett gtg gtg tet gtt atg tet geg atg ggc gaa gag 486
Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly Glu Glu 135 140 145 cag att aac gee gtt aag gat gtt ggt acc aag aat tagttatgtc 532
Gin lie Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn 150 155 160 atggeageat aatcactgcc aaagctttaa gacattatca tatcctaatg tggtactttg 592 atatcactag attataaact gtgttatttg cactgttcaa aacaaaagaa agaaaactgc 652 tgttatggct agagaaagta ttggctttga gcttttgaca gcacagttga actatgtgaa 712 aattetaett tttttttttt gggtaaaata ctgctcgttt aatgttttgc aaaaaaaaaa 772 aaaaaaaa 780 <210> 12 16· 94139.doc <211> 160 <212>蛋白質 <213> 番茄（Lycopersicon esculentum) <400> 12
Met Ser Asp Glu GIu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala 15 10 15
Ser Lys Thr Phe Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Asn Gly Tyr 20 25 30 lie Val lie Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser 35 40 45
Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp 50 55 60 lie Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80
Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie 85 90 95
Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Ser Gly Asn Thr Lys 100 105 110
Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Lys Gin Val Lys 115 120 125
Asp Gly Phe Gin Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala 130 135 140
Met Gly Glu Glu Gin lie Asn Ala Val Lys Asp Val Gly Thr Lys Asn 145 150 155 160 <210> 13 <211> 812 <212> DNA <213> 康乃馨（Dianthus caryophyl lus) <220〉 <221> CDS <222〉 （67)..(546) <400> 13 ctcttttaca tcaatcgaaa aaaaattagg gttcttattt tagagtgaga ggcgaaaaat 60 cgaacg atg teg gac gac gat cac cat ttc gag tea teg gcc gac gcc 108
Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala 1 5 10 gga gca tcc aag act tac cct caa caa get ggt aca ate ege aag age 156
Gly Ala Ser Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Ser -17- 94139.doc 1337185 15 20 25 30 ggt cac ate gtc ate aaa aat ege cct tgc aag gtg gtt gag gtt tet 204
Gly His lie Val lie Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser 35 40 45 acc tee aag act ggc aag cac ggt cat gee aaa tgt cac ttt gtt gee 252
Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala 50 55 60 att gac att ttc aac ggc aag aag ctg gaa gat att gtc ccc tea tee 300 lie Asp lie Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser 65 70 75 cac aat tgt gat gtt cca cat gtc aac cgt gtc gac tac cag ctg ctt 348
His Asn Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gin Leu Leu 80 85 90 gat ate act gaa gat ggc ttt gtt agt ctg ctg act gac agt ggt gac 396
Asp lie Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp 95 100 105 110 acc aag gat gat ctg aag ett cct get gat gag gee ett gtg aag cag 444
Thr Lys Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gin 115 120 125 atg aag gag gga ttt gag geg ggg aaa gac ttg att ctg tea gtc atg 492
Met Lys Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu lie Leu Ser Val Met 130 135 140 tgt gca atg gga gaa gag cag ate tgc gee gtc aag gac gtt agt ggt 540
Cys Ala Met Gly Glu Glu Gin lie Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly 145 150 155 ggc aag tagaagettt tgatgaatcc aatactacgc ggtgcagttg aagcaatagt 596 Gly Lys 160 aatetegaga acattctgaa ccttatatgt tgaattgatg gtgcttagtt tgttttggaa 656 atctctttgc aattaagttg taccaaatca atggatgtaa tgtcttgaat ttgttttatt 716 tttgttttga tgtttgctgt gattgeatta tgcattgtta tgagttatga cctgttataa 776 cacaaggttt tggtaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 812 <210> 14 <211> 160 <212>蛋白質 <213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus) <400> 14
Met Ser Asp Asp Asp His His Phe Glu Ser Ser Ala Asp Ala Gly Ala 15 10 15 -18-
94139.doc 1337185
Ser Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Ser Gly His 20 25 30 lie Val lie Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val GIu Val Ser Thr Ser 35 40 45
Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp 50 55 60 lie Phe Asn Gly Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80
Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gin Leu Leu Asp lie 85 90 95
Thr Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Asp Thr Lys 100 105 110
Asp Asp Leu Lys Leu Pro Ala Asp Glu Ala Leu Val Lys Gin Met Lys 115 120 125
Glu Gly Phe Glu Ala Gly Lys Asp Leu lie Leu Ser Val Met Cys Ala 130 135 140
Met Gly Glu Glu Gin lie Cys Ala Val Lys Asp Val Ser Gly Gly Lys 145 150 155 160
<210> 15 <211> 702 <212> DNA <213> 擬南芬（Arabidopsis thaliana) <220> <221> CDS <222〉 （56)..(529) <400> 15 ctgttaccaa aaaatctgta ccgcaaaatc ctcgtcgaag ctcgctgctg caacc atg
Met tcc gac gag gag cat cac ttt gag tcc agt gac gcc gga gcg tcc aaa
Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser Lys 5 10 15 acc tac cct caa caa get gga acc ate cgt aag aat ggt tac ate gtc
Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Asn Gly Tyr lie Val 20 25 30 ate aaa aat cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtt tea acc teg aag act lie Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 94139.doc -19- 58 106 154 202 ggc aag cat ggt cat get aaa tgt cat 111 gta get att gat ate ttc 250
Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie Phe 50 55 60 65 acc age aag aaa etc gaa gat att gtt cct tet tee cac aat tgt gat 298
Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp 70 75 80 gtt cct cat gtc aac cgt act gat tat cag ctg att gac att tet gaa 346
Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Ser Glu 85 90 95 gat gga tat gtc agt ttg ttg act gat aac ggt agt acc aag gat gac 394
Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp Asp 100 105 110 ett aag etc cct aat gat gac act ctg etc caa cag ate aag agt ggg 442
Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gin Gin He Lys Ser Gly 115 120 125 ttt gat gat gga aaa gat eta gtg gtg agt gta atg tea get atg gga 490
Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly 130 135 140 145 gag gaa cag ate aat get ett aag gac ate ggt ccc aag tgagactaac 539 Glu Glu Gin lie Asn Ala Leu Lys Asp lie Gly Pro Lys 150 155 aaagcctccc ctttgttatg agattettet tcttctgtag gcttccatta ctcgtcggag 599 attatettgt ttttgggtta ctcctatttt ggatatttaa acttttgtta ataatgccat 659 cttcttcaac cttttccttc tagatggttt ttataettet tet 702
<210> 16 <211> 158 <212> PRT <213> 擬南齐(Arabidopsis thaliana) <400> 16
Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 15 10 15
Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Asn Gly Tyr lie 20 25 30
Val lie Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45
Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie 50 55 60
Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys -20· 94139.doc 1337185 65 70 75 80
Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Ser 85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp 100 105 110
Asp Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gin Gin lie Lys Ser 115 120 125
Gly Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140
Gly Glu Glu Gin lie Asn Ala Leu Lys Asp He Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400〉 17 aaarrycgmc cytgcaaggt 20 <210〉 18 <211> 17 <212> DNA <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：引子 <400> 18 aatacgactc actatag 17 <210〉 19 <211> 20 <212> DNA <213〉人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：引子 <220> <221> modified_base <222> (6) <223> a, tt c or g •21 · 94139.doc 1337185 <400> 19 tcyttnccyt cmkctaahcc 20 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213〉人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 20 17 attaaccctc actaaag <2i0> 21 <211> 22 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 21 ctgttaccaa aaaatctgta cc 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 22 agsagaagta taaaaaccat c 21 <210〉 23 <211> 23 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 23 aaagaatcct agagagagaa agg <210〉 24 <211> 18 22- 94139.doc 23 1337185 <212> <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 24 ttttacatca atcgaaaa 18 <210> 25 <211> 23 <232> DNA <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：引子 <400> 25 accaaaacct gtgttataac tcc 23
<210> 26 <211> 581 <212> DNA <213> 擬南芬(Arabidopsis thaliana) <220> <221> CDS <222> (1)..(579) <400> 26 ggt ggt gtt gag gaa gat etc ata aaa tgc ett gca eel aca 111 aaa 48
Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys 15 10 15 ggt gat ttc tet eta cct gga get tat tta agg tea aag gga ttg aac 96
Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn 20 25 30 ega att ggg aat ttg ctg gtt cct aat gat aac tac tgc aag ttt gag 144
Arg lie Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu 35 40 45 gat tgg ate att ccc ate ttt gac gag atg ttg aag gaa cag aaa gaa 192
Asp Trp lie lie Pro lie Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gin Lys Glu 50 55 60 gag aat gtg ttg tgg act cct let aaa ctg tta gca egg ctg gga aaa 240
Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu Gly Lys 65 70 75 80 gaa ate aac aat gag agt tea tac ett tat tgg gca tac aag atg aat 288
Glu lie Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn 85 90 95 -23· 94139.doc 336 1337185 alt cca gta ttc tgc cca ggg tta aca gat ggc tct ctt agg gat atg lie Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met 100 105 110 ctg tat ttt cac tct ttt cgt acc tct ggc etc ate ate gat gta gta Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu lie lie Asp Val Val 115 120 125 caa gat ate aga get atg aac ggc gaa get gtc cat gca aat cct aaa Gin Asp lie Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys 130 135 140 aag aca ggg atg ata ate ctt gga ggg ggc ttg cca aag cac cac ata Lys Thr Gly Met lie lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His lie 145 150 155 160 tgt aat gcc aat atg atg ege aat ggt gca gat tac get gta ttt ata Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie 165 170 175 aac acc ggg caa gaa ttt gat ggg age gac teg ggt gca ege cct gat Asn Thr Gly Gin Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp 180 185 190 384 432 480 528 576 gaa gc Glu 581 <210> 27 <211> 523 <212> DNA <213> 康乃馨（Dianthus caryophyllus) <220> <221> CDS <222> (1),.(522) <400> 27 mga aga tcc ate aag tgc ctt gca ccc act ttc aaa ggc gat ttt gcc Arg Arg Ser lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala 15 10 15 tta cca gga get caa tta ege tec aaa ggg ttg aat ega att ggt aat Leu Pro Gly Ala Gin Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn 20 25 30 ctg ttg gtt ccg aat gat aac tac tgt aaa ttt gag gat tgg ate att Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie lie 35 40 45 cca att tta gat aag atg ttg gaa gag caa att tea gag aaa ate tta Pro lie Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gla lie Ser Glu Lys lie Leu 50 55 60 48 96 144 94139.doc •24· 192 1337185 tgg aca cca teg aag ttg att ggt ega tta gga aga gaa ata aac gat 240
Trp Thr Pro Ser Lys Leu lie Gly Arg Leu Gly Arg Glu lie Asn Asp 65 70 75 80 gag agt tea tac ett tac tgg gee ttc aag aac aat att cca gta ttt 288
Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn lie Pro Val Phe 85 90 95 tgc cca ggt tta aca gac ggc tea etc gga gac atg eta tat ttt cat 336
Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His 100 105 110 tet ttt ege aat ccg ggt tta ate ate gat gtt gtg caa gat ata aga 384
Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu lie lie Asp Val Val Gin Asp lie Arg 115 120 125 gca gta aat ggc gag get gtg cac gca geg cct agg aaa aca ggc atg 432
Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met 130 135 140 att ata etc ggt gga ggg ttg cct aag cac cac ate tgc aac gca aac 480
He lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His He Cys Asn Ala Asn 145 150 155 160 atg atg aga aat ggc gee gat tat get gtt ttc ate aac acc g 523
Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie Asn Thr 165 170 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 28 ttgargaaga tycatmaart gcct 24 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：引子 <400〉 29 ccatcaaayt cytgkgcrgt gtt 23 -25- 94139.doc
<210> 30 <211> 484 <212> DNA <213> 康乃馨（Dianthus caryophyllus) <220>
<221> CDS <222> (2)..(112) <400> 30 t gca cgc cct gat gaa get gtg tet tgg ggt aaa att agg ggt tet get 49 Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie Arg Gly Ser Ala 15 10 15 aaa acc gtt aag gtc tgc ttt tta att tet tea cat cct aat tta tat 97
Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu lie Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr 20 25 30 etc act cag tgg ttt tgagtacata tttaatattg gatcattctt gcaggtatac 152 Leu Thr Gin Trp Phe 35 tgtgatgcta ccatagcctt cccattgttg gttgcagaaa catttgccac aaagagagac 212 caaacctgtg agtetaagae ttaagaactg actggtcgtt ttggccatgg attettaaag 272 ategttgett tttgatttta cactggagtg accatataac actccacatt gatgtggctg 332 tgacgcgaat tgtettettg cgaattgtac tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc 392 agattgtgtt ttcgtttaaa acacaagagt ettgtagtea ataatccttt geettataaa 452 attattcagt tccaacaaaa aaaaaaaaaa aa 484
<210> 31 <211〉 559 <212> DNA <213> 番茄（Lycopersicon esculentum) <220> <221> CDS <222〉 （1).,(156) <220> <221> modi fied_base <222〉 （542) <223> a, t, c or g <400> 31 ggt get cgt cct gat gaa get gta tea tgg gga aag ata cgt ggt ggt 48
Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie Arg Gly Gly 15 10 15 -26- 94139.doc gcc aag act gtg aag gtg cat tgt gat gca acc att gca ttt ccc ata 96
Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr lie Ala Phe Pro lie 20 25 30 tta gta get gag aca ttt gca get aag agt aag gaa ttc tee cag ata 144
Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gin lie 35 40 45 agg tgc caa gtt tgaacattga ggaagctgtc cttccgacca cacatatgaa 196
Arg Cys Gin Val 50 ttgetagett ttgaagccaa ettgetagtg tgcagcacca tttattctgc aaaactgact 256 agagageagg gtatattcct ctaccccgag ttagacgaca tcctgtatgg ttcaaattaa 316 ttatttttct ccccttcaca ccatgttatt tagttetett cctcttcgaa agtgaagagc 376 ttagatgttc ataggttttg aattatgttg gaggttggtg ataactgact agtcctctta 436 ccatatagat aatgtatcct tgtactatga gattttgggt gtgtttgata ccaaggaaaa 496 atgtttattt ggaaaacaat tggattttta atttaaaaaa aattgnttaa aaaaaaaaaa 556 aaa 559 <210> 32 <211> 22 <2I2>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：保留的肽片段 <400> 32
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <2L0> 33 <211> 29 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 ·27· 94139.doc 1337185 <400> 33 gagctcaaga ataacatctc ataagaaac 29 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 34 ctcgagtgct cacttctctc tcttagg 27 <210> 35 <211> 12 <212〉人蛋白質 <213〉人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽 <400> 35
Cys Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gin Gin lie Lys Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212>蛋白質 <2I3>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的肽 <400> 36
Cys Thr Asp Asp Gly Leu Thr Ala Gin Met Arg Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <m> <223>人造序列的說明：合成的肽 <400> 37
Cys Thr Asp Glu Ala Leu Leu Thr Gin Leu Lys Asn -28- 94139.doc 1337185 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213〉人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：引子 <400> 38 aagcttgatc gtggtcaact tcctctgtta cc <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400〉 39 gagctcagaa gaagtataaa aaccatc <210> 40 <211〉 27 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 40 ctcgagtgct cacttctctc tcttagg <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213〉人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：引子 <400〉 41 gagctcaaga ataacatctc ataagaaac <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213>人造的序列 94139.doc 1337185 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 42 ctcgagctaa actccattcg ctgacttcgc 30 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 43 gagctctagt aaatataaga gtgtcttgc 29
<210> 44 <211> 353 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223>未知生物之說明：真菌序列 <400> 44
Met Ala Asp Asn Gin lie Pro Ser Ser Val Ala Asp Ala Val Leu Val 15 10 15
Lys Ser lie Glu Met Pro Glu Gly Ser Gin Lys Val Glu Glu Leu Asp 20 25 30
Phe Asn Lys Phe Lys Gly Arg Pro lie Thr Val Asp Asp Leu Leu Gin 35 40 45
Gly Met Lys His Met Gly Phe Gin Ala Ser Ser Met Cys Glu Ala Val 50 55 60
Arg lie lie Asn Glu Met Arg Ala Tyr Arg Asp Pro Thr Thr Ser Glu 65 70 75 80
Lys Thr Thr He Phe Leu Gly Tyr Thr Ser Asn Leu lie Ser Ser Gly 85 90 95
Leu Arg Gly Thr Leu Arg Tyr Leu Val Gin His Lys His Val Ser Ala 100 105 110 lie Val Thr Thr Ala Gly Gly He Glu Glu Asp Phe lie Lys Cys Leu 115 120 125
Gly Asp Thr Tyr Met Ser Ser Phe Ser Ala Val Gly Ala Asp Leu Arg •30- 94139.doc 1337185 130 135 140
Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Val Val Pro Asn Ser Asn 145 150 155 160
Tyr Cys Ala Phe Glu Asp Trp Val Val Pro lie Leu Asp Lys Met Leu 165 170 175
Glu Glu Gin Glu Ala Ser Arg Gly Thr Glu Asn Glu lie Asn Trp Thr 180 1S5 190
Pro Ser Lys Val lie His Arg Leu Gly Lys Glu lie Asn Asp Glu Arg 195 200 205
Ser Val Tyr Tyr Trp Ala Trp Lys Asn Asp lie Pro Val Phe Cys Pro 210 215 220
Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Thr Phe 225 230 235 240
Lys Ala Ser Pro Glu Gin Leu Arg lie Asp lie Val Glu Asp lie Arg 245 250 255
Lys lie Asn Thr lie Ala Val Arg Ala Lys Arg Ala Gly Met lie lie 260 265 270
Leu Gly Gly Gly lie Val Lys His His lie Ala Asn Ala Cys Leu Met 275 280 285
Arg Asn Gly Ala Glu Ser Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe 290 295 300
Asp Gly Ser Asp Ala Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly 305 310 315 320
Lys lie Lys Val Gly Ala Asp Ala Val Lys Val Tyr Met Glu Ala Thr 325 330 335
Ala Ala Phe Pro Phe lie Val Ala Asn Thr Phe Ala Lys Glu Asp Gly 340 345 350
Leu <210> 45 <211> 387 <212> PRT <213〉未知生物 <220> <223>未知生物的說明：酵母菌序列 <400> 45 •31 · 94139.doc
Met Ser Asp lie Asn Glu Lys Leu Pro Glu Leu Leu Gin Asp Ala Val 15 10 15
Leu Lys Ala Ser Val Pro lie Pro Asp Asp Phe Val Lys Val Gin Gly 20 25 30 lie Asp Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Asa Met Arg Ala Thr Asp Leu 35 40 45 lie Glu Ala Met Lys Thr Met Gly Phe Gin Ala Ser Ser Val Gly Thr 50 55 60
Ala Cys Glu lie lie Asp Ser Met Arg Ser Trp Arg Gly Lys His He 65 70 75 80
Asp Glu Leu Asp Asp His Glu Lys Lys Gly Cys Phe Asp Glu Glu Gly 85 90 95
Tyr Gin Lys Thr Thr lie Phe Met Gly Tyr Thr Ser Asn Leu lie Ser 100 105 110
Ser Gly Val Arg Glu Thr Leu Arg Tyr Leu Val Gin His Lys Met Val 115 120 125
Asp Ala Val Val Thr Ser Ala Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu lie Lys 130 135 140
Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Leu Gly Glu Phe Ala Leu Lys Gly Lys Ser 145 150 155 160
Leu Arg Asp Gin Gly Met Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn 165 170 175
Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Glu Trp lie Val Pro lie Leu Asp Lys 180 185 190
Met Leu Glu Glu Gin Asp Glu Tyr Val Lys Lys His Gly Ala Asp Cys 195 200 205
Leu Glu Ala Asn Gin Asp Val Asp Ser Pro lie Trp Thr Pro Ser Lys 210 215 220
Met lie Asp Arg Phe Gly Lys Glu lie Asn Asp Glu Ser Ser Val Leu 225 230 235 240
Tyr Trp Ala His Lys Asn Lys lie Pro lie Phe Cys Pro Ser Leu Thr 245 250 255
Asp Gly Ser lie Gly Asp Met Leu Phe Phe His Thr Phe Lys Ala Ser 260 265 270
Pro Lys Gin Leu Arg Val Asp lie Val Gly Asp lie Arg Lys lie Asn 275 280 285
Ser Met Ser Met Ala Ala Tyr Arg Ala Gly Met lie lie Leu Gly Gly -32- 94139.doc 1337185 290 295 300
Gly Leu lie Lys His His lie Ala Asn Ala Cys Leu Met Arg Asn Gly 305 310 315 320
Ala Asp Tyr Ala Val Tyr lie Asn Thr Gly Gin Glu Tyr Asp Gly Ser 325 330 335
Asp Ala Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie Lys 340 345 350
Ala Glu Ala Lys Ser Val Lys Leu Phe Ala Asp Val Thr Thr Val Leu 355 360 365
Pro Leu lie Val Ala Ala Thr Phe Ala Ser Gly Lys Pro lie Lys Lys 370 375 380
Val Lys Asn 385 <210> 46 <211> 370 <212>蛋白質 未知生物 <220> <223>未知生物的說明：古原細 <400> 46
Met Arg Asp lie Lys Asp Asn Pro lie Arg Arg Gly lie Ala Glu Gin 15 10 15
Ser Glu Ala Met His Pro Gly Tyr Thr Asn Arg Ala Lys Pro Tyr Gly 20 25 30
Cys Lys Arg Asp Pro Lys Asp lie Val Leu Lys Glu Ser Glu Asp lie 35 40 45
Glu Gly lie Ala lie Glu Gly Pro Trp Leu Glu Asp Asp lie Ser Leu 50 55 60
Glu Glu lie lie Lys Lys Tyr Tyr Leu Lys lie Gly Phe Gin Ala Ser 65 70 75 80
His lie Gly Lys Ala lie Lys He Trp Lys His lie Glu Glu Lys Arg 85 90 95
Lys Lys Gly Asp Glu lie Thr Val Phe Phe Gly Tyr Thr Ser Asn lie 100 105 110
Val Ser Ser Gly Leu Arg Glu lie lie Ala Tyr Leu Val Lys His Lys 115 120 125 •33- 94139.doc 1337185
Lys lie Asp lie lie Val Thr Thr Ala Gly Gly Val Glu Glu Asp Phe 130 135 140 lie Lys Cys Leu Lys Pro Phe lie Leu Gly Asp Trp Glu Val Asp Gly 145 150 155 160
Lys Met Leu Arg Glu Lys Gly lie Asn Arg lie Gly Asn lie Phe Val 165 170 175
Pro Asn Asp Arg Tyr lie Ala Phe Glu Glu Tyr Met Met Glu Phe Phe 180 185 190
Glu Glu lie Leu Asn Leu Gin Arg Giu Thr Gly Lys lie lie Thr Ala 195 200 205
Ser Glu Phe Cys Tyr Lys Leu Gly Glu Phe Met Asp Lys Lys Leu Lys 210 215 220
Ser Lys Glu Lys Glu Lys Ser lie Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asn 225 230 235 240 lie Pro lie Phe Cys Pro Ala lie Thr Asp Gly Ser lie Gly Asp Met 245 250 255
Leu Tyr Phe Phe Lys Lys Tyr Asn Lys Asp Glu Glu Leu Lys lie Asp 260 265 270
Val Ala Asn Asp lie Val Lys Leu Asn Asp lie Ala lie Asn Ser Lys 275 280 285
Glu Thr Ala Cys lie Val Leu Gly Gly Ser Leu Pro Lys His Ser lie 290 295 300 lie Asn Ala Asn Leu Phe Arg Glu Gly Thr Asp Tyr Ala lie Tyr Val 305 310 315 320
Thr Thr Ala Leu Pro Trp Asp Gly Ser Leu Ser Gly Ala Pro Pro Glu 325 330 335
Glu Gly Val Ser Trp Gly Lys lie Gly Ala Lys Ala Asp Tyr Val Glu 340 345 350 lie Trp Gly Asp Ala Thr lie lie Phe Pro Leu Leu Val Tyr Cys Val 355 360 365
Met Lys 370 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213〉人造的序列 •34-
94139.doc 1337185 <220> <223>人造序列的說明：引子 <220> <221> modified_base <222〉 （3) <223〉a, t，c or g <220> <221> modified_base <222> (15) <223> a, t， c or g <400> 47 gcngarttyg ayggntccga yea <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213〉人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 48 ccgagctcct gttaccaaaa aatctgtacc <210〉 49 <211> 36 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 49 acctcgagcg gccgcagaag aagtataaaa accatc <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：引子 <400〉 50 egtegaegat atctcttttt atattcaaac 94139.doc <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 51 cgtctagaca ttgttttagg aaagttaaat ga 32
<210> 52 <211> 1235 <212> DNA <213> 擬南齐(Arabidopsis thaliana) <400> 52 accctagatc gctttcttca gtgttctata aaaactaaac tccattcgct gacttcgcaa 60 agaagaacac tttctctctg aaatctcaaa ttcatctctt ctcttccgat ttcgctgaat 120 catgtcagac gacgagcatc acttcgaatc cagcgacgcc ggagcttcta agacttatcc 180 tcaacaagcc ggtaacattc gtaaaggtgg tcacatcgtc atcaagggac gtccctgcaa 240 ggttttgtct ctgatttgat tattattgat tttagaggaa tcatcttcat ggattgtatt 300 aaagcagtgt tccgttacct gatcgttgtg aatttttgag gtttagtgat tctggattgt 360 gatctggtgt ttagtgttga gaaaaacctc tgtttttgaa gtttatggat ttatagggtt 420 tttaaatcta taatagg£tt taattcaatt ggtgatatgt ggggtttatg atataggtgg 480 ttgaggtatc gacttcgaag actgggaagc atggtcacgc caagtgtcac tttgttgcca 540 ttgatatctt tacttctaag aagcttgaag atatcgttcc ttcttcccac aattgtgatg 600 tgagtcttgt gaatggatta gaaacgttat acaaagtcta taatttttga ctcacaacac 660 aaaactgttt cctttttatt ggcacaggtt ccacatgtga atcgtgttga ttatcagttg 720 attgatatct ctgaagatgg ctttgiatgt catcttcttt ttcactagtt cagctttgtg 780 ttttgtcttt gcccatatgg ttgaattaga gggttttgtt ctttgattac atttacaggt 840 tagtcttctt actgataatg gtagcactaa ggatgatctg aagctgccaa cagatgaagc 900 tttactcaca cagctcaaga atggatttga ggagggtaag gatattgttg tgtctgtcat 960 gtctgcaatg ggagaggagc agatgtgtgc tctcaaggaa gttggtccca agtaataata 1020 ataagtaagc attctctctt ttacagaggc tatgtattat caagtttgac agagtcaaat 1080 gttataagaa caaagtttgg tccttttttt tggtcttctt agtataattt aagcccacat 1140 gtgtttccca tgcaagacac tcttatattt actagtatat cttactattg gttttggttg 1200 tggagaagtt actgttgaca gttccaaacc tctac 1235 <210〉 53 <211> 161 <212>蛋白質 <213> 香蕉葉斑病菌（Mycosphaerella fijiensis) <400> 53
Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Phe Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys 15 10 15
Arg Phe Glu Asp Trp Val Met Pro He Leu Asp Thr Met Leu Glu Glu 20 25 30
Gin Glu Ala Cys Lys Gly Ser Gly Glu Ala lie His Trp Thr Pro Ser 35 40 45 •36· 94139.doc
Lys lie lie Asn Arg Leu Gly Lys Glu Val Asn Asp Glu Ser Ser Val 50 55 60
Tyr Tyr Trp Ala Trp Lys Asn Asp lie Pro Val Phe Cys Pro Ala Leu 65 70 75 80
Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Thr Phe Lys Ser 85 90 95
Ser Pro Gin Gin Leu Arg Val Asp lie Val Glu Asp lie Arg Lys lie 100 105 110
Asn Thr Leu Ala Val Arg Ala Lys Arg Thr Gly Met lie lie Leu Gly 115 120 125
Gly Gly lie Val Lys His His He Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 130 135 140
Gly Ala Glu Ser Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Glu Phe Asp Gly Ser 145 150 155 160
Asp
<210> 54 <211〉 861 <212> DNA <213> 擬南芥(Arabidopsis sp·) <400> 54 tttttccctt ctcccaatct catcttctcc gaaaaccttt cttctctcaa atttctgtga aaacatgtct gacgacgagc accactttga ggccagcgaa tccggagctt ccaagaccta tcctcaatca gccggtaaca tccgtaaagg tggtcacatc gtcatcaaaa accgtccctg caaggttgtt gaggtttcga cttccaaaac tggcaagcac ggtcacgcca aatgtcactt tgttgctatt gatatcttea ctgctaagaa gettgaagat attgttccat cttcccacaa ttgtgatgtt ccacatgtga accgtgttga ttaccagttg attgatatca ctgaggatgg ettegtgage cttctcactg acagtggtgg caccaaggat gatctcaagc ttcccaccga tgatggtctc accgcccaga tgaggcttgg attegatgag ggaaaggata ttgtggtgtc tgtcatgtct tccatgggag aggageagat ctgtgccgtc aaggaagttg gtggtggcaa gtaaacaagt atcattcgat atattattac cagtttgaca aeggaegtea atgttataag aaccaaaaga tgtttttctt tttcctaatt tagacccttt gtgtgtgttt cttgttgcaa gacaaccata tctattggtt ttggattgtt ggaaaagttt gtgttgaaac attcaaagtt tettatgaga tgttattctt aaaaccactt tttgtttgtt cactggatat gtttgttcat gaagcttgtt ttaagcaact ctttacatga tattcattgc tatttgcacg attcaagagt gaaatataca ttttatttaa c <210> 55 <211> 159 <212>蛋白質 37- 94139.doc 1337185 <213> 擬南芬(Arabidopsis thaliana) <400> 55
Met Ser Asp Asp Glu His His Phe Glu Ala Ser Glu Ser Gly Ala Ser 15 10 15
Lys Thr Tyr Pro Gin Ser Ala Gly Asn lie Arg Lys Gly Gly His lie 20 25 30
Val lie Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45
Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie 50 55 60
Phe Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80
Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Thr 85 90 95
Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp 100 105 110
Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Asp Gly Leu Thr Ala Gin Met Arg Leu 115 120 125
Gly Phe Asp Glu Gly Lys Asp lie Val Val Ser Val Met Ser Ser Met 130 135 140
Gly Glu Glu Gin lie Cys Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys 145 150 155
<210> 56 <211> 698 <212> DNA <213> 番茄（Lycopersicon esculentum) <220> <221> CDS <222> (52)..(528) <400> 56 cttcctgaat ttttctcctt ctccttctcc gttcaatcga atttttcagc c atg tct
Met Ser gac gag gag cat caa ttt gag tct aag get gat gcc gga gca tea aaa
Asp Glu Glu His Gin Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser Lys 5 10 15 act tac cct caa caa get ggt act att cgt aag aac ggt tat ate gtc
Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Asn Gly Tyr lie Val 20 25 30 94139.doc -38- 57 105 153 ate aaa ggc cgt cca tgc aag gtt gtg gaa gtc tet aca tee aaa act lie Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 50 ggc aag cac ggt cac gee aaa tgt cat tie gtt get att gac ate ttc
Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie Phe 55 60 65 act ggg aag aag ett gag gat att gtc ccc tet tea cac aat tgt gat
Thr Gly Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys Asp 70 75 80 gtg ccc cat gtt aat cgt aca gat tat cag ett att gac ate tet gaa
Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Ser Glu 85 90 95 gat gga ttt gtg agt ctg ett act gac aat ggt aac acc aag gat gac
Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Asn Thr Lys Asp Asp 100 105 110 etc agg ett eel act gat gaa aat ctg ett tea ctg ate aag gac ggg
Leu Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Ser Leu lie Lys Asp Gly 115 120 125 130 ttt gee gag ggt aag gac etc gtt gtg tet gtt atg tea get atg ggt
Phe Ala Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met Gly 135 140 145 gag gaa cag att aat get ttg aag gat att ggc ccc aag tgatctcttg
Glu Glu Gin lie Asn Ala Leu Lys Asp lie Gly Pro Lys 150 155 attggatgga ttgcttgacg cgatggttct ttacgacctt gagtgagata gatatttata gtcatggaaa aaaattgtga tcttatggaa tattegtate atgatttatg gaccattgtg agttagattt ttatttatgt tgttttaaat tgtggtattc <210> 57 <211> 159 <212>蛋白質 <213> 番茄（Lycopersicon esculentum) <400〉 57
Met Ser Asp Glu Glu His Gin Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala 15 10 15
Ser Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Asn Gly Tyr 20 25 30 lie Val lie Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser 35 40 45 -39- 94139.doc
Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp 50 55 60 lie Phe Thr Gly Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80
Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie 85 90 95
Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Asn Thr Lys 100 105 110
Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Glu Asn Leu Leu Ser Leu lie Lys 115 120 125
Asp Gly Phe Ala Glu Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala 130 135 140
Met Gly Glu Glu Gin lie Asn Ala Leu Lys Asp lie Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 58 <211> 158 <212>蛋白質 <213〉擬南芬(Arabidopsis thaliana) <400> 58
Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 15 10 15
Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Asn Gly Tyr lie 20 25 30
Val He Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45
Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie 50 55 60
Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80
Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Ser 85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp 100 105 110
Asp Leu Lys Leu Pro Asn Asp Asp Thr Leu Leu Gin Gin He Lys Ser 115 120 125
Gly Phe Asp Asp Gly Lys Asp Leu Val Val Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 •40· 94139.doc
Gly Glu Glu Gin lie Asn Ala Leu Lys Asp lie Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 59 <211> 159 <212>蛋白質 <213〉擬南芬(Arabidopsis thaliana) <400〉 59
Met Ser Asp Asp Glu His His Phe Glu Ala Ser Glu Ser Gly Ala Ser 1 5 10 15
Lys Thr Tyr Pro Gin Ser Ala Gly Asn lie Arg Lys Gly Gly His lie 20 25 30
Val lie Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45
Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie 50 55 60
Phe Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80
Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Thr 85 90 95
Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp 100 105 110
Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Asp Gly Leu Thr Ala Gin Met Arg Leu 115 120 125
Gly Phe Asp Glu Gly Lys Asp lie Val Val Ser Val Met Ser Ser Met 130 135 140
Gly Glu Glu Gin lie Cys Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys 145 150 155 <210> 60 <211> 158 <212>蛋白質 <213> 擬南芬(Arabidopsis thaliana) <400> 60
Met Ser Asp Asp Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 15 10 15
Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Asn lie Arg Lys Gly Gly His lie 20 25 30
Val lie Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys -41- 94139.doc 35 40 45
Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala He Asp lie 50 55 60
Phe Thr Ser Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80
Asp Val Pro His Val Asn Arg Val Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Ser 85 90 95
Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Asn Gly Ser Thr Lys Asp 100 105 110
Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Glu Ala Leu Leu Thr Gin Leu Lys Asn 115 120 125
Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp lie Val Val Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140
Gly Glu Glu Gin Met Cys Ala Leu Lys Glu Val Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 61 <211〉 477 <212> DNA <213> 擬南芥*(Arabidopsis thaliana) <400> 61 atgtccgacg aggagcatca ctttgagtcc agtgacgccg gagcgtccaa aacctaccct caacaagctg gaaccatccg taagaatggt tacatcgtca tcaaaaatcg tccctgcaag gttgttgagg tttcaacctc gaagactggc aagcatggtc atgctaaatg tcattttgta gctattgata tcttcaccag caagaaactc gaagatattg ttccttcttc ccacaattgt gatgttcctc atgtcaaccg tactgattat cagctgattg acatttctga agatggatat gtcagtttgt tgactgataa cggtagtacc aaggatgacc ttaagctccc taatgatgac actctgctcc aacagatcaa gagtgggttt gatgatggaa aagatctagt ggtgagtgtg atgtcagcta tgggagagga acagatcaat gctcttaagg acatcggtcc caagtga
<210> 62 <211> 480 <212> DNA <213> 擬南茶(Arabidopsis thaliana) <400> 62 atgtctgacg acgagcacca ctttgaggcc agcgaatccg gagcttccaa gacctatcct caatcagccg gtaacatccg taaaggtggt cacatcgtca tcaaaaaccg tccctgcaag gttgttgagg tttcgacttc caaaactggc aagcacggtc acgccaaatg tcactttgtt gctattgata tcttcactgc taagaagctt gaagatattg ttccatcttc ccacaattgt gatgttccac atgtgaaccg tgttgattac cagttgattg atatcactga ggatggcttc gtgagccttc tcactgacag tggtggcacc aaggatgatc tcaagcttcc caccgatgat ggtctcaccg cccagatgag gcttggattc gatgagggaa aggatattgt ggtgtctgtc atgtcttcca tgggagagga gcagatctgt gccgtcaagg aagttggtgg tggcaagtaa -42· 94139.doc
<210> 63 <211> 477 <212> DNA <213> 擬南芬(Arabidopsis thaliana) <4〇〇> 63 atgtcagacg acgagcatca cttcgaatcc agcgacgccg gagcttctaa gacttatcct 60 caacaagccg gtaacattcg taaaggtggt cacatcgtca tcaagggacg tccctgcaag 120 gtggttgagg tatcgacttc gaagactggg aagcatggtc acgccaagtg tcactttgtt 180 gccattgata tctttacttc caagaagctt gaagatatcg ttccttcttc ccacaattgt 240 gatgttccac atgtgaatcg tgttgattat cagttgattg atatctctga agatggcttt 300 gttagtcttc ttactgataa tggtagcact aaggatgatc tgaagctgcc aacagatgaa 360 gctttactca cacagctcaa gaatggattt gaggagggta aggatattgt tgtgtctgtc 420 atgtctgcaa tgggagagga gcagatgtgt gctctcaagg aagttggtcc caagtaa 477
<210> 64 <211> 700 <212> DNA <213> 番茄（Lycopersicon esculentum) <220> <221> CDS <222> (56)..(532) <400> 64 aaatttctcc ttctccttaa tcctctccac cggcgaaccg gcgaagatca aaacg atg 58
Met 1 teg gac gaa gag cac cac ttc gaa tcc aag gcc gat gcc gga get tea 106
Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser 5 10 15 aag aeg tat cct caa caa get ggt act att cgt aaa ggt ggt cac ate 154
Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Gly Gly His lie 20 25 30 gtc ata aaa aat cgt cct tgc aag gtg gtt gaa gtt tea act tec aag 202
Val lie Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 aca ggc aag cac ggt cat get aaa tgt cac ttc gtg gca att gac att 250
Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie 50 55 60 65 ttc act gga aag aaa ett gag gat att gtt ccc tet tet cac aat tgt 298
Phe Thr Gly Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys 70 75 80 gat gtt cct cat gtg aat agg act gat tat caa ett att gat ate tet 346
Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Ser 85 90 95 -43· 94139.doc 394 gag gat ggc ttt gtg agt ctg ttg act gaa aat ggt aac acc aag gat GIu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Asn Gly Asn Thr Lys Asp 100 105 110 gac ttg aga etc cca act gat gat act ett ctg get cag gtc aaa gat 442
Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Asp Thr Leu Leu Ala Gin Val Lys Asp 115 120 125 ggt ttt get gag ggg aaa gac ctg gtt da tea gtg atg tet gee atg 490
Gly Phe Ala Glu Gly Lys Asp Leu Val Leu Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 145 gga gag gag cag att tgt ggt ate aag gac att ggc cct aag 532
Gly Glu Glu Gin lie Cys Gly lie Lys Asp lie Gly Pro Lys 150 155 tagetgeaga tggtattggt gtatgtttac agagtttcta taaaagatgt attaagaacc 592 aaaacttctt taetttetet tgcagttgct ctatataact gccatttaac tattattata 652 tgtgttgtga ttagattett gtctcactac agtatttcct ttactctg 700 <210> 65 <211> 159 <212>蛋白質 <213> #i〇(Lycopersicon esculentum) <400> 65
Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala 15 10 15
Ser Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Gly Gly His 20 25 30 lie Val lie Lys Asn Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser 35 40 45
Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp 50 55 60 lie Phe Thr Gly Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80
Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie 85 90 95
Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Asn Gly Asn Thr Lys 100 105 110
Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Asp Thr Leu Leu Ala Gin Val Lys 115 120 125
Asp Gly Phe Ala Glu Gly Lys Asp Leu Val Leu Ser Val Met Ser Ala 130 135 140 • 44· 94139.doc 1337185
Met Gly Glu Glu Gin lie Cys Gly lie Lys Asp lie Gly Pro Lys 145 150 155 <210> 66 <2L1> 658 <212> DNA <213> 甘藍型油菜（Brassica napus) <220> <221> CDS <222> (1)..(477) <400> 66 atg tct gac gag gag cac cac ttc gag tcc age gac gcc gga get tcc Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 15 10 15 aaa acc tac cct cag cag get ggt aac ate ege aag ggt ggt cac ate Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Asn lie Arg Lys Gly Gly His lie 20 25 30 gtc ate aag ggc cgt ccc tgc aag gtt gtt gag gtt teg act teg aag Val lie Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 act ggg aag cac ggt cac gca aag tgt cac ttt gtt get ate gac ate Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie 50 55 60 ttc act get aag aag etc gag gat att gtt ccc tct tcc cac aat tgt Phe Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80 gat gtt ccc cat gtg aac cgt att gac tac cag ttg att gat ate tct Asp Val Pro His Val Asn Arg lie Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Ser 85 90 95 gag aat ggc ttt gtt age ett ttg acc gac agt ggt ggc acc aag gac Glu Asn Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp 100 105 110 gac etc aag ett ccc acc gat gat aat etc age get ctg atg aag agt Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Asp Asn Leu Ser Ala Leu Met Lys Ser 115 120 125 gga ttc gag gag gga aag gat gtg gtg gtg tct gtc atg tct tcc atg Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp Val Val Val Ser Val Met Ser Ser Met 130 135 140 gga gag gag cag ate tgt gcc gtc aag gaa gtt ggt ggt ggc aag Gly Glu Glu Gin lie Cys Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys 145 150 155 48 96 144 192 240 288 336 384 432 94l39.doc •45· 477 taaaacccat tctctgagag aggataatct tattaccagt ggtcaatgtt ataagaacaa 537 gaacttgttt tttttccttt ttctaattta gatcatttgt gttgtgtttc tttgttgcaa 597 gacaaccatt atctattatt ggttttggat tgtttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 657 a 658 <210> 67 <211> 159 <212>蛋白質 <213> 甘藍型油菜（Brassica napus) <400> 67
Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Ser Asp Ala Gly Ala Ser 15 10 15
Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Asn He Arg Lys Gly Gly His He 20 25 30
Val lie Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45
Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie 50 55 60
Phe Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys 65 70 75 80
Asp Val Pro His Val Asn Arg He Asp Tyr Gin Leu He Asp lie Ser 85 90 95
Glu Asn Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Asp Ser Gly Gly Thr Lys Asp 100 105 110
Asp Leu Lys Leu Pro Thr Asp Asp Asn Leu Ser Ala Leu Met Lys Ser 115 120 125
Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp Val Val Val Ser Val Met Ser Ser Met 130 135 140
Gly Glu Glu Gin lie Cys Ala Val Lys Glu Val Gly Gly Gly Lys 145 150 155
<210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> 香蕉葉斑病菌（Mycosphaerella fijiensis) <400> 68
Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu -46- 94139.doc 5 <210〉 69 <211> 8 <212>蛋白質 <213> 香蕉葉斑病菌（Mycosphaerella fijiensis) <400> 69
Ala Glu Phe Asp Gly Ser Asp Gin 1 5
<210> 70 <211> 1335 <212> DNA <213>甘藍型油菜（Brassica napus) <220〉 <221> CDS <222〉 （57)..(1160) <400> 70 59 cttgctagaa ccctaaaact ccctcccaaa actctccaca tcttccgaga aagaag atg gag gag gat cgt gtt etc teg tct gtc cac tea aeg gtc ttc aag gaa Glu Glu Asp Arg Val Leu Ser Ser Val His Ser Thr Val Phe Lys Glu 5 10 15 tcc gaa teg ttg gaa gga aag tgc gac aaa ate gaa gga tac gat ttc Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys He Glu Gly Tyr Asp Phe 20 25 30 aac caa gga gta aac tac ccg aag etc etc ega tec atg etc aca acc Asn Gin Gly Val Asn Tyr Pro Lys Leu Leu Arg Ser Met Leu Thr Thr 35 40 45 ggc ttc caa gee tea aac etc ggc gac gta att gat gtc gtt aat caa Gly Phe Gin Ala Ser Asn Leu Gly Asp Val lie Asp Val Val Asn Gin 50 55 60 65 atg eta gag tgg aga etc tct gat gaa act ata gca cot gaa gac tgt Met Leu Glu Trp Arg Leu Ser Asp Glu Thr lie Ala Pro Glu Asp Cys 70 75 80 agt gaa gag gag aag gat cca geg tat aga gag tec gtg aag tgt aaa Ser Glu Glu Glu Lys Asp Pro Ala Tyr Arg Glu Ser Val Lys Cys Lys 85 90 95 ate ttt eta ggc ttc act teg aat ett gtt tec tct ggt gtt aga gag lie Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val Arg Glu 100 105 110 107 155 203 251 299 347 •47· 94139.doc 395 4431337185 act att cga tac ctt gtt cag cat cat atg gtt gat gtt ata gtt act Thr lie Arg Tyr Leu Val Gin His His Met Val Asp Val lie Val Thr 115 120 125 aca act ggt ggc gta gag gaa gat etc ate aaa tgc ctt get cct act Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr 130 135 140 145 ttc aaa ggt gat ttc tet eta ccg ggt geg tat ctt egg tea aag gga Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly 150 155 160 ttg aac egg ate ggg aac ttg ctt gtt cct aat gat aac tac tgc aag Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys 165 170 175 ttt gag gat tgg ate att ccc ate ttt gac cag atg ttg aag gaa cag Phe Glu Asp Trp lie lie Pro lie Phe Asp Gin Met Leu Lys Glu Gin 180 185 190 aaa gaa gag agt gtg ttg tgg aeg cct tet aaa ttg tta geg egg ctg Lys Glu Glu Ser Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg Leu 195 200 205 ggg aaa gaa ata aat aat gag agt tea tat ctt tat tgg gca tac aag Gly Lys Glu lie Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys 210 215 220 225 atg aat att cca gtg ttc tgc egg ggg tta acc gat ggc tet etc ggt Met Asn lie Pro Val Phe Cys Arg Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly 230 235 240 gat atg ttg tat ttt cac tea ttt cgt acc tet ggc ctt gic ate gat Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Val lie Asp 245 250 255 gtt gtg caa gat att aga get atg aac ggt gaa gca gtc cat geg act Val Val Gin Asp lie Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Thr 260 265 270 cca aga aag aca ggg atg ata ate ctt gga ggg ggc ttg ccg aag cac Pro Arg Lys Thr Gly Met He lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His 275 280 285 cac ata tgt aat gec aac atg atg cgt aac ggt geg gat tac get gtg His lie Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val 290 295 300 305 ttt ate aac acc ggg caa gag ttt gat gga agt gac teg ggt gca ege Phe lie Asn Thr Gly Gin Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg 310 315 320 cct gat gaa gca gtg tet tgg g£t aaa ata agg gga tet get aaa act Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie Arg Gly Ser Ala Lys Thr 325 330 335 491 539 587 635 683 731 779 827 875 923 971 1019 94139.doc -48- 1067 gtc aag gtg tac tgt gat get acc ata gee ttc cct ttg ttg gtt get 1115
Val Lys Val Tyr Cys Asp Ala Thr lie Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala 340 345 350 gaa aca ttt gee tee aag aga gaa caa age tgt gag cac aag acc 1160
Glu Thr Phe Ala Ser Lys Arg Glu Gin Ser Cys Glu His Lys Thr 355 360 365 taagcccaag aaagcttacg tctcttttat cggtttgttc ttccatcttg ttgttgtacc 1220 ct ttgtcctg ctttacataa cattcatctc taaaacaata ctacctcct t ttgacaaaaa 1280 ataaaaaaaa ttggaaaaat ggtttcacaa gaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1335 <210> 71 <211> 368 <212〉蛋白質 <213〉甘藍型油菜（Brassica napus) <400> 71
Met Glu Glu Asp Arg Val Leu Ser Ser Val His Ser Thr Val Phe Lys 1 - 5 10 15
Glu Ser Glu Ser Leu Glu Gly Lys Cys Asp Lys lie Glu Gly Tyr Asp 20 25 30
Phe Asn Gin Gly Val Asn Tyr Pro Lys Leu Leu Arg Ser Met Leu Thr 35 40 45
Thr Gly Phe Gin Ala Ser Asn Leu Gly Asp Val lie Asp Val Val Asn 50 55 60
Gin Met Leu Glu Trp Arg Leu Ser Asp Glu Thr lie Ala Pro Glu Asp 65 70 75 80
Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asp Pro Ala Tyr Arg Glu Ser Val Lys Cys 85 90 95
Lys lie Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu Val Ser Ser Gly Val Arg 100 105 110
Glu Thr lie Arg Tyr Leu Val Gin His His Met Val Asp Val He Val 115 120 125
Thr Thr Thr Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu lie Lys Cys Leu Ala Pro 130 135 140
Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys 145 150 155 160
Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys 165 170 175 -49- 94139.doc
Lys Phe Glu Asp Trp lie lie Pro lie Phe Asp Gin Met Leu Lys Glu 180 185 190
Gin Lys Glu Glu Ser Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu Leu Ala Arg 195 200 205
Leu Gly Lys Glu lie Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr 210 215 220
Lys Met Asn lie Pro Val Phe Cys Arg Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu 225 230 235 240
Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu Val lie 245 250 255
Asp Val Val Gin Asp lie Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala 260 265 270
Thr Pro Arg Lys Thr Gly Met lie lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys 275 280 285
His His lie Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala 290 295 300
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Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie Arg Gly Ser Ala Lys 325 330 335
Thr Val Lys Val Tyr Cys Asp Ala Thr lie Ala Phe Pro Leu Leu Val 340 345 350
Ala Glu Thr Phe Ala Ser Lys Arg Glu Gin Ser Cys Glu His Lys Thr 355 360 365
<210> 72 <211> 1862 <212> DNA <213〉紫花苜蓿（Medicago sativa) <220>
<221> CDS <222> (293)..(1396) <400> 72 gaaaccttct tcttctggag caaagtcgcc attccctacc tccttcttca ttcttattct ctataacaaa cggtccgacc ggatccaagt tgcaccggtt cgaaccgctt tagttactac taacggttcg aaccgttatt 11tcaacccg tgacaaacgt ggaaggcttc gttgtttctt cttcttcttc ttaattacca tgcgtttttg tttttctttt gagtcattga agtcttgttt -50- 94139.doc 298 tttgtcgtgt ttctgtcttg agaccgtgaa agagaaaaca aagagtacga ga atg agt Met Ser gaa aca aag caa gaa gat gat aca att atg tcc tea gtt cac tcc act Glu Thr Lys Gin Glu Asp Asp Thr lie Met Ser Ser Val His Ser Thr 5 10 15 gtc ttc aaa gaa tcc gaa aat etc gca gga aag tgt gtc caa ate gag Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Ala Gly Lys Cys Val Gin lie Glu 20 25 30 ggt tat gat ttc aac ege ggc gtc gat tat caa cag ett etc aaa tea Gly Tyr Asp Phe Asn Arg Gly Val Asp Tyr Gin Gin Leu Leu Lys Ser 35 40 45 50 atg etc aca act ggt ttt caa get tcc aac ttt ggt gat gee gtt aaa Met Leu Thr Thr Gly Phe Gin Ala Ser Asn Phe Gly Asp Ala Val Lys 55 60 65 gtc gtt aat caa atg eta gat tgg agg ttg gtt gat gaa cca att gat Val Val Asn Gin Met Leu Asp Trp Arg Leu Val Asp Glu Pro lie Asp 70 75 80 gag gat tgt gat gaa gat aag aag gat ttg gag tat agg aaa tet gtt Glu Asp Cys Asp Glu Asp Lys Lys Asp Leu Glu Tyr Arg Lys Ser Val 85 90 95 aca tgc aaa gtg ttt ttg ggt ttc act tet aat ett ate tet tet ggt Thr Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu lie Ser Ser Gly 100 105 110 gtt aga gat gtt gtt cgt tac ett tgt cag cat cac atg gtt cat gta Val Arg Asp Val Val Arg Tyr Leu Cys Gin His His Met Val His Val 115 120 125 130 gtt gtt aca act aca ggt ggt att gaa gaa gat ett ata aag tgc ett Val Val Thr Thr Thr Gly Gly lie Glu Glu Asp Leu lie Lys Cys Leu 135 140 145 gca cca aca tat aaa gga gag ttc tet ttg ccc gga get tat ett ege Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Glu Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg 150 155 160 tea aaa gga ttg aat ega ate ggt aat tta ttg gtc cct aat gaa aat Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Glu Asn 165 170 175 tat tgc aaa ttt gag gac tgg att att cct att ttt gat caa atg ttg Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie lie Pro lie Phe Asp Gin Met Leu 180 185 190 aag gag caa aag gaa gag aaa gt£ ctg tgg aca ccg tet aag tta ata Lys Glu Gin Lys Glu Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Leu lie 346 394 442 490 538 586 634 682 730 778 826 874 94139.doc -51 · 922 1337185 195 200 205 210 get ega ttg gga aaa gag ate aac aat gaa aac tee tac ett tac tgg 970
Ala Arg Leu Gly Lys Glu lie Asn Asn Glu Asn Ser Tyr Leu Tyr Trp 215 220 225 gca tat aag aac aat att cca gtt tat tgt cca gga tta acc gat ggc 1018
Ala Tyr Lys Asn Asn lie Pro Val Tyr Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly 230 235 240 tea ctg ggt gac atg ctg tac ttc cat tee ttc cac aac cct ggt ctg 1066
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Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr lie Ala Phe Pro Leu 340 345 350 ctg gtt get gaa aca ttt gee tea aga aeg tea ccc ett aat 1396
Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ser Arg Thr Ser Pro Leu Asn 355 360 365 tgataaaggt ccaccgtcaa aagtaaaagg tgtggctggg aagtgtttta ccgcagctcc 1456 acttgtgagt gccaaatgtt ttggtatgta aettataaga ccaaggtcgg ctgtatgtca 1516 taettgagtt gaggtcaaag ttcatttgca atgcagtgtg tttgaggatc ttgatggacc 1576 agtttgccat tgacttttaa tttgactgtc ttgttattcg caaggtccac ataacaagca 1636 tttttaccat ttagaaacaa tttattagtc ctgaaggaat tgagagteat gaattcagat 1696 gtaaattatg caatgctaac tatatttttt tggaactgtg gtttctctta gatttgaggt 1756 gttgaaaact gtaatateta gagcaaataa gactagaaaa gtttatcaac tattactgat 1816 -52·
94139.doc 1337185 cagttatagt atcttcaata ttttccagaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1862 <210> 73 <211〉 368 <212>蛋白質 <213> 紫花苜蓿（Medicago sativa) <400> 73
Met Ser Glu Thr Lys Gin Glu Asp Asp Thr lie Met Ser Ser Val His 15 10 15
Ser Thr Val Phe Lys Glu Ser Glu Asn Leu Ala Gly Lys Cys Val Gin 20 25 30
He Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Arg Gly Val Asp Tyr Gin Gin Leu Leu 35 40 45
Lys Ser Met Leu Thr Thr Gly Phe Gin Ala Ser Asn Phe Gly Asp Ala 50 55 60
Val Lys Val Val Asn Gin Met Leu Asp Trp Arg Leu Val Asp Glu Pro 65 70 75 80 lie Asp Glu Asp Cys Asp Glu Asp Lys Lys Asp Leu Glu Tyr Arg Lys 85 90 95
Ser Val Thr Cys Lys Val Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu lie Ser 100 105 110
Ser Gly Val Arg Asp Val Val Arg Tyr Leu Cys Gin His His Met Val 115 120 125
His Val Val Val Thr Thr Thr Gly Gly lie Glu Glu Asp Leu lie Lys 130 135 140
Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Glu Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr L45 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn 165 170 175
Glu Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie He Pro lie Phe Asp Gin 180 185 190
Met Leu Lys Glu Gin Lys Glu Glu Lys Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys 195 200 205
Leu lie Ala Arg Leu Gly Lys Glu lie Asn Asn Glu Asn Ser Tyr Leu 210 215 220
Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asn lie Pro Val Tyr Cys Pro Gly Leu Thr 225 230 235 240 -53-
94139.doc
Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe His Asn Pro 245 250 255
Gly Leu lie Val Asp lie Val Gin Asp lie Arg Ala Met Asn Gly Glu 260 265 270
Ala Val His Ala Asn Pro Ser Lys Thr Gly Met lie lie Leu Gly Gly 275 280 285
Gly Leu Pro Lys His His lie Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly 290 295 300
Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp Gly Ser 305 310 315 320
Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie Arg 325 330 335
Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr lie Ala Phe 340 345 350
Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ser Arg Thr Ser Pro Leu Asn 355 360 365
<210> 74 <211> 1363 <212> DNA <213〉香蕉（Musa acuminate) <220> <221〉 CDS <222〉 （93)..(1220) <400〉 74 ggcacgagcg cgcggcgccc gcaacgaata ttgcagagag taagaaggat cctcgccttt 60 gtcaccaaac ccttggtttc cagcgaggcg ac atg gaa ggc ggc gcc gcg gga 113
Met Glu Gly Gly Ala Ala Gly 1 5 ggg cag cga gac egg gaa acc ctg gac gcg gtg egg teg gtg gtg ttt 161
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94139.doc 977 1337185 gtg ggt ctg aga aag act ggg gtc ata att ctt ggt ggg ggc etc cca
Val Gly Leu Arg Lys Thr Gly Val lie lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro 280 285 290 295 aag cac cat ata tgt aat g〇c aac atg ttt egg aat ggt gca gat tat
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Ala Glu Pro Asp Glu Ala lie Ser Trp Gly Lys lie Lys Gly Ser Ala 330 335 340 aag act att aaa gtt cat tgt gat gca act att get ttt cct eta ttg
Lys Thr lie Lys Val His Cys Asp Ala Thr lie Ala Phe Pro Leu Leu 345 350 355 gta get gca aca ttt gca aga aag ttt cag gaa aga aac aac aaa tta
Val Ala Ala Thr Phe Ala Arg Lys Phe Gin Glu Arg Asn Asn Lys Leu 360 365 370 375 gcc tgatgggggt gcaaaaggtg atcatcttat ttggattcaa ataccttaat Ala gtaatctgct aacatctgca gatgctgtat tcttgcaaac caaaaattta atattagata accgagagcc tacagagggt cctttcaaaa aaa <210〉 75 <211> 376 <212>蛋白質 <213> 香蕉（Musa acuminate) <400> 75
Met Glu Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gin Arg Asp Arg Glu Thr Leu Asp 15 10 15
Ala Val Arg Ser Val Val Phe Lys Pro Ser Val Ser Leu Glu Glu Lys 20 25 30
Arg Phe Pro Arg Val Gin Gly Tyr Asp Phe Asn Arg Gly Cys Asp Leu 35 40 45 lie Gly Leu Leu Asp Ser He Ser Ser Thr Gly Phe Gin Ala Ser Asn 50 55 60
Leu Gly Asp Ala lie Asp Val lie Asn Gin Met lie Asp Trp Arg Leu 65 70 75 80
Ser His Asp Ala Pro Thr Glu Asp Cys Ser Glu Glu Glu Arg Asn Leu 85 90 95 94139.doc • 56- 1025 1073 1121 1169 1217 1270 1330 1363
Ala Tyr Arg Gin Ser Val Thr Cys Lys lie Phe Leu Gly Phe Thr Ser 100 105 110
Asn Leu Val Ser Ser Gly lie Arg Glu lie lie Arg Phe Leu Val Gin 115 120 125
His Arg Met Val Glu Val Leu Val Thr Thr Ala Gly Gly lie Glu Glu 130 135 140
Asp Leu lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu 145 150 155 160
Pro Gly Ser Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu 165 170 175
Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp He Met Pro 180 185 190 lie Leu Asp Gin Met Leu Leu Glu Gin Thr Thr Glu Asn Val Val Trp 195 200 205
Thr Pro Ser Lys Val lie Ala Arg Leu Gly Lys Glu lie Asn Asp Glu 210 215 220
Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asn Val Ser Val Tyr Cys 225 230 235 240
Pro Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Cys His Ser 245 250 255
Val Arg Asn Pro Gly Leu Leu lie Asp lie Val Gin Asp lie Arg Ala 260 265 270
Met Asn Gly Glu Ala Val His Val Gly Leu Arg Lys Thr Gly Val lie 275 280 285 lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His lie Cys Asn Ala Asn Met 290 295 300
Phe Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Val Asn Thr Ala Gin Glu 305 310 315 320
Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Glu Pro Asp Glu Ala lie Ser Trp 325 330 335
Gly Lys lie Lys Gly Ser Ala Lys Thr lie Lys Val His Cys Asp Ala 340 345 350
Thr lie Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Ala Thr Phe Ala Arg Lys Phe 355 360 365
Gin Glu Arg Asn Asn Lys Leu Ala 370 375 57· 94l39.doc 1337185
<210〉 76 <211> 1451 <212> DNA <213〉楊木(Populus deltoids) <220> <221> CDS <222> (8)..(1126) <400> 76 gggattt atg aca ggc aaa aaa caa tgg gag gaa gat ttg eta tea tea 49
Met Thr Gly Lys Lys Gin Trp Glu Glu Asp Leu Leu Ser Ser 1 5 10 gta egg acc aca gtg ttt aaa gaa tea gaa get ett gat ggg aaa tgc 97
Val Arg Thr Thr Val Phe Lys Glu Ser Glu Ala Leu Asp Gly Lys Cys 15 20 25 30 att aaa att gaa ggt tat gat ttt aat caa gga gtg aac tac tet aag 145 lie Lys lie Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gin Gly Val Asa Tyr Ser Lys 35 40 45 ett etc aaa tee atg gtc tet acc ggg ttt caa get tee aac ett gga 193
Leu Leu Lys Ser Met Val Ser Thr Gly Phe Gin Ala Ser Asn Leu Gly 50 55 60 gat gee att caa gtt gtt aat aac atg eta gac tgg agg ett get gat 241
Asp Ala lie Gin Val Val Asn Asn Met Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp 65 70 75 gaa gag ata aca gaa gat tgt agt gat gag gag agg gag ttg gee tat 289
Glu Glu lie Thr Glu Asp Cys Ser Asp Glu Glu Arg Glu Leu Ala Tyr 80 85 90 aga gag tet gtg aga tgc aaa ctg ttc ttg ggt ttt aca tea aat ett 337
Arg Glu Ser Val Arg Cys Lys Leu Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asn Leu 95 100 105 110 gtt tet tea ggt gtc aga gat aca att ega tat ett gtt cag cat cat 385
Val Ser Ser Gly Val Arg Asp Thr lie Arg Tyr Leu Val Gin His His 115 120 125 atg gtt gat gta gtg gtt aca aeg gca ggt ggc ata gaa gaa gat ett 433
Met Val Asp Val Val Val Thr Thr Ala Gly Gly lie Glu Glu Asp Leu 130 135 140 ata aaa tgc ctg gca cca aca tac aaa ggt gac ttt tet eta ccc ggg 481 lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly 145 150 155 get caa tta ega tea aaa ggg ttg aat ega att ggt aac ttg ttg gta 529
Ala Gin Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu Val 160 165 170 58·
94139.doc 1337185 cct aat gac aac tac tgc aaa ttt gag gat tgg ate att cca ate ttt 577
Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie lie Pro lie Phe 175 180 185 190 gac caa atg ttg aag gaa caa att gaa gag aat ate acc tgg aca cct 625
Asp Gin Met Leu Lys Glu Gin lie Glu Glu Asn lie Thr Trp Thr Pro 195 200 205 tet aaa tta ata get ege atg ggg aaa gaa ata aat aat gag agt tea 673
Ser Lys Leu lie Ala Arg Met Gly Lys Glu lie Asn Asn Glu Ser Ser 210 215 220 tac ett tat tgg gca tat aag aac gac att cca gta ttc tgt cca ggc 721
Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asp lie Pro Val Phe Cys Pro Gly 225 230 235 tta aca gat ggt tet eta ggg gac atg eta tac ttt cat tee ttc cac 769
Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe His 240 245 250 aac cct ggt eta att gtt gee ata gtc caa gat att aga gee atg aat 817
Asn Pro Gly Leu lie Val Ala lie Val Gin Asp lie Arg Ala Met Asn 255 260 265 270 ggt gaa get gtc cac gca agt cct aga aaa act ggt ate ate att ett 865
Gly Glu Ala Val His Ala Ser Pro Arg Lys Thr Gly lie lie lie Leu 275 280 285 gga ggt ggg ett cct aag cat cat ata tgc aat gee aat atg atg cgt 913
Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His lie Cys Asn Ala Asn Met Met Arg 290 295 300 aac ggt gca gat tat get gta ttc ate aat aca gca caa gaa ttt gat 961
Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp 305 310 315 ggg agt gat tet gga get cat cct gat gag get gta teg tgg ggg aaa 1009
Gly Ser Asp Ser Gly Ala His Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys 320 325 330 ata ega ggt tet get aaa act gtt aag gtc cac tgt gat gca act att 1057 lie Arg Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr lie 335 340 345 350 get ttt cct etc eta gtt get gaa aca ttt gee cct agg agg aac aga 1105
Ala Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Pro Arg Arg Asn Arg 355 360 365 ttc tgc age agt act caa age tagggctgtg tgcagttctt ggccagaaaa 1156 Phe Cys Ser Ser Thr Gin Ser 370 ttgattcatt tttatttgta ttatgactga acgatccgca ggatgggtag tgggctccat 1216 -59-
94139.doc tgatgccata aacttctttt tttttcccct cagaattaag ggatccgcca gaacacactg 1276 ctctcagccc caaaccattg ttgcctctac tgggagtagc ataaccaatt gaattgcgct 1336 cctccaagca gcgcctctta gttgcgttat ttattgtaag tagcgcaacc aactaaatta 1396 tgctagttcc cacatttatt gactgctatt ttcaaaagaa aaaaaaaaaa aaaaa 1451 <210> 77 <211> 373 <212>蛋白質 <213> 楊木(Populus deltoids) <400> 77
Met Thr Gly Lys Lys Gin Trp Glu Glu Asp Leu Leu Ser Ser Val Arg 15 10 15
Thr Thr Val Phe Lys Glu Ser Glu Ala Leu Asp Gly Lys Cys lie Lys 20 25 30 lie Glu Gly Tyr Asp Phe Asn Gin Gly Val Asn Tyr Ser Lys Leu Leu 35 40 45
Lys Ser Met Val Ser Thr Gly Phe Gin Ala Ser Asn Leu Gly Asp Ala 50 55 60 lie Gin Val Val Asn Asn Met Leu Asp Trp Arg Leu Ala Asp Glu Glu 65 70 75 80 lie Thr Glu Asp Cys Ser Asp Glu Glu Arg Glu Leu Ala Tyr Arg Glu 85 90 95
Ser Val Arg Cys Lys Leu Phe Leu Gly Phe Thr Ser Asa Leu Val Ser 100 105 110
Ser Gly Val Arg Asp Thr lie Arg Tyr Leu Val Gin His His Met Val 115 120 125
Asp Val Val Val Thr Thr Ala Gly Gly lie Glu Glu Asp Leu lie Lys 130 135 140
Cys Leu Ala Pro Thr Tyr Lys Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Gin 145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn 165 170 175
Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie lie Pro lie Phe Asp Gin 180 185 190
Met Leu Lys Glu Gin lie Glu Glu Asn lie Thr Trp Thr Pro Ser Lys 195 200 205
Leu lie Ala Arg Met Gly Lys Glu lie Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu -60· 94l39.doc 210 215 220
Tyr Trp Ala Tyr Lys Asn Asp lie Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr 225 230 235 240
Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Ser Phe His Asn Pro 245 250 255
Gly Leu lie Val Ala lie Val Gin Asp lie Arg Ala Met Asn Gly Glu 260 265 270
Ala Val His Ala Ser Pro Arg Lys Thr Gly lie lie lie Leu Gly Gly 275 280 285
Gly Leu Pro Lys His His lie Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly 290 295 300
Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp Gly Ser 305 310 315 320
Asp Ser Gly Ala His Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie Arg 325 330 335
Gly Ser Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr lie Ala Phe 340 345 350
Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Pro Arg Arg Asn Arg Phe Cys 355 360 365
Ser Ser Thr Gin Ser 370
<210> 78 <211> 1488 <212> DNA <213> 擬南齐(Arabidopsis thaliana) <400> 78 acaataaggc tttaaagccc ataaaaccct taaatatatc aaagcccaaa agaaacgcct 【ttgcgcttt cccgatcgtg gtcaacttcc tctgttacca aaaaatctgt accgcaaaat cctcgtcgaa gctcgctgct gcaaccatgt ccgacgagga gcatcacttt gagtccagtg acgccggagc gtccaaaacc taccctcaac aagctggaac catccgtaag aatggttaca tcgtcatcaa aaatcgtccc tgcaaggttt cgttctcaaa catttctcca ctctcttcct ctgatcttat tagatctgtt cattacttag attcctcaga ttcttttttt tgtcacctcc acgatgttcg actgatattt gttcttgtca tcattgttaa attcacattt tattgcactt ttgttttagc gaaattatta aattggtcat cttcagtttt gttcgattag ataagtttta ggattttttc ttacacaagt tactggatca gctgctaaat gtcattttgt gtcgcaggtt gttgaggttt caacctcgaa gactggcaag catggtcatg ctaaatgtca ttttgtagct attgatatct tcaccagcaa gaaactcgaa gatattgttc cttcttccca caattgtgat gtatgtgaaa aaagctcctt tgatcacttt catttcttgt ttgtttcttt caagtcccat ttgagatttt gtttttgttg aattgggttt caggttcctc atgtcaaccg tactgattat cagctgattg acatttctga agatggatat gtatgtgttc ttaaatagca cttgttcctt tatatggttt agttacttgt tctgttttgt aatcattttg caggtcagtt tgttgactga -61- 94139.doc taacggtagt taagttttgc atttctgaaa agatcaagag gagaggaaca cctttgttat ttgtttttgg caaccttttc tccaagtgtc tcgtgcgtta accaaggatg atgttcatca atggaagaaa tgggtttgat gatcaatgct gagattcttc gtgactccta cttctagatg aaagtgttcc tgtagagacg accttaagct cattaaatgt aagtgcagag gatggaaaag cttaaggaca ttcttcttct ttttggatat gtttttatac acccatatga tagaagcaat ccctaatgat gacactctgc tccaacaggt 960 tgctagttaa ttaaaatcaa ctctatgtcg 1020 taatgagtga cctgattgtg ttaatgaaac 1080 atctagtggt gagtgtgatg tcagctatgg 1140 tcggtcccaa gtgagactaa caaagcctcc 1200 gtaggcttcc attactcatc ggagattatc 1260 ttaaactttt gttaataatg ccatcttctt 1320 ttcttctaat tgattgattc tttatggttg 1380 ttctaacctt ttgatgagcg aagtctttac 1440 accacaaaag agtataat 1488
<210> 79 <211> 1566 <212> DNA <213> 擬南芥"（Arabidopsis thaliana) <400> 79 aggataataa aaaaaaaatc aatctcatct cgagcaccac taacatccgt atttcatcat tagtagctcc ttttcttata ggtacctctc gcaatatcag ttaaacgttt aggtttcgac atatcttcac gt tactacac ctcaaatat t cagttgattg tcactccagc gagccttctc tctcaccgcc tattcatctc gcttggattc gcagatctgt tat taccagt ctaatttaga attgttggaa ccactttttg acatga tacagtaacc gacatcgctt tctccgaaaa tttgaggcca aaaggtggtc caaacatcgt ttgattttgt gatcgctact tagattcgtg acgacgcctt atggagaaca t tccaaaact tgctaagaag aaactatgta gttcctttct atatcactga tttatttatc actgacagtg caggttattt tcgaattgtg gatgagggaa gccgtcaagg ttgacaacgg ccctttgtgt aagtttgtgt tttgttcact ctagaaaggt ttgctcactt cctttcttct gcgaatccgg acatcgtcat tctcgatctc ttttatcctc tagatgaata gaattttggg ttgtgatttt tagatttgat ggcaagcacg cttgaagata gattcatttt ctttttttct ggatggcttc tattcttgcc gtggcaccaa tcttgtcttt atattgaaaa aggatattgt aagttggtgg acgtcaatgt gtgtttcttg tgaaacattc ggatatgttt ttcctccacc ttcctcttcc cctcctatat 60 ctctctctta ggtttttttt cccttctccc 120 ctcaaatttc tgtgaaaaca tgtctgacga 180 agcttccaag acctatcctc aatcagccgg 240 caaaaaccgt ccctgcaagg tctgatttct 300 tttttcctga ttctagatct cgtctctgta 360 ggatttgacc tggttctgtt tagtttgaat 420 tgatgaatct tatcctgtta ttttgatggt 480 aaatgaaaat gaaaaatgga tagaaatcaa 540 gaatctaagt agtctattga ttgatttgat 600 tttgatattt tggttttgat taggttgttg 660 gtcacgccaa atgtcacttt gttgctattg 720 ttgttccatc ttcccacaat tgtgatgtaa 780 cacagtattt gatatgattg tgtgatctga 840 caggttccac atgtgaaccg tgttgattac 900 gtatgttttt ctttatactc actttcctca 960 ataacttttg tacttgttta cattataggt 1020 ggatgatctc aagcttccca ccgatgatgg 1080 tcatactcgc acacaaatga cttgactttg 1140 cagttgttgt gttttgttaa tgcagatgag 1200 ggtgtctgtc atgtcttcca tgggagagga 1260 tggcaagtaa acaagtatca ttcgatatat 1320 tataagaacc aaaagatgtt tttctttttc 1380 ttgcaagaca accatatcta ttggttttgg 1440 aaagtttctt atgagatgtt attcttaaaa 1500 gttcatgaag cttgttttaa gcaactcttt 1560 1566 <210> 80 <211> 319 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：啟動基因序列 -62- 94139.doc <400> 80 aagacgttcc gggatgacgc ttcatttgga actagttcag aacgttcgtc tgagtattat aaccacgtct acaatcccac gaggacacgc ggagctcgaa aagttcaatg ggcattggg tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 60 tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 120 tgaaatcacc agtctctctc tcaagcttgg atcctcgagt 180 ttgatcctct agagctttcg ttcgtatcat cggtttcgac 240 catcagtttc attgcgcaca caccagaatc ctactgagtt 300 319 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 81 gggagggact agtgtgcacg cc 22 <210〉 82 <211> 38 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 82 gcgaagcggc catggctcga gttttttttt tttttttt 38
<210> 83 <211> 521 <212> DNA <213> 擬南芬（Arabidopsis thaliana) <400> 83 gggagggact agtgtgcacg ccctgatgaa gctaaaaccg ttaaggtata ctgtgatgct acatttgcca caaagagaga ccaaacctgt tacctctggc ctcatcatcg atgtagtaca ccatgcaaat cctaaaaaga caggcgtttt tgattttaca ctggagtgac catataacac tcttcttgcg aattgtactt tagtttctct cgtttaaaac acaagagtct tgtagtcaat caacaaaaaa aaaaaaaaaa ctcgagccat gctgtgtctt ggggtaaaat taggggttct 60 accatagcct tcccattgtt ggttgcagaa 120 gagtctaaga cttaagaact gactggttcg 180 agatatcaga gctatgaacg gcgaagctgt 240 ggccatggat tcttaaagat cgttgctttt 300 tccacattga tgtggctgtg acgcgaattg 360 caacctaaaa tgatttgcag attgtgt111 420 aatcctttgc cttataaaat tattcagttc 480 ggccgcttcg c 521
<210> 84 <211> 497 <212> DNA <213> 擬南芬（Arabidopsis thaliana) 63· 94139.doc <400> 84 ctagtgtgca cgttaaggta cacaaagaga gcctcatcat atcctaaaaa cactggagtg cgaattgtac acacaagagt aaaaaaaaaa cgccctgatg aagctgtgtc ttggggtaaa attaggggtt ctgctaaaac 60 tactgtgatg ctaccatagc cttcccattg ttggtt£cag aaacatttgc 120 gaccaaacct gtgagtctaa gacttaagaa ctgactggtt cgtacctctg 180 cgatgtagta caagatatca gagctatgaa cggcgaagct gtccatgcaa 240 gacaggcgtt ttggccatgg attcttaaag atcgttgctt tttgatttta 300 accatataac actccacatt gatgtggctg tgacgcgaat tgtcttcttg 360 tttagtttct ctcaacctaa aatgatttgc agattgtgtt ttcgtttaaa 420 cttgtagtca ataatccttt gccttataaa attattcagt tccaacaaaa 480 aactcga 497 <210> 85 <211> 29 <212> Wk <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 85 ctcgagaaga ataacatctc ataagaaac 29 <210> 86 <211> 29 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400〉 86 29 gagctcggca agtaaacaag tatcattcg <210> 87 <211> 906 <212> DNA <213〉人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 construct <400〉 87 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgicaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta 480 -64- 94139.doc cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggatc 906 <210> 88 <211> 205 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223〉人造序列的說明：合成的構築想 <400> 88 aagaataaca tctcataaga aactttgaat gtttcaacac aaacttttcc aacaatccaa 60 aaccaataga tatggttgtc ttgcaacaag aaacacacac aaagggtcta aattaggaaa 120 aagaaaaaca tcttttggtt cttataacat tgacgtccgt tgtcaaactg gtaataatat 180 atcgaatgat acttgtttac ttgcc 205 <210> 89 <211> 662 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的搆築體 gtcaagttca 60 tatggcattg 120 ttttattcgg 180 tgatatggtc 240 tgtgttgaat 300 aaatcgtggc 360 ttatgcttat 420 tgaatacaag 480 ccagaatcct 540 tagttgagta 600 gcatcaatcg 660 <400> 89 gaattgatcc atgcatcagt ggaaaactgt ttttcgctat cttttgttca ttgaaattat ctctaatgac tcactaggca tatgtcctct tgtcagat tc tgaaaatatt at tctagagctt ttcattgcgc ttttcttgta cgaactgtga ttctcaaatt aagagatatg cgaagttaat acaaatatat tgtgttttag taatcattgc ttttaatgca tcgttcgtat acacaccaga ccatttgttg aatggaaatg aatattattt caaacatttt atgaggagta 11 tcagacct acatttatga tttataatta ttttatgact catcggtttc atcctactga tgcttgtaat gatggagaag gttttttctc gttttgagta aaacacttgt agaaaagctg actttccttt tagttatact tgccaattga gacaacgttc gttcgagtat ttactgtgtt agt taatgaa ttatt tgttg aaaatgtgtc agt tgtacca caaatgttac atgtaatttt catggatttg ttgacaacat <210> 90 <21l> 37 <212>蛋白質 <213> 擬南芥（Arabidopsis thaliana) 65· 94139.doc 1337185 <400> 90
Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie Arg Gly Ser Ala 15 10 15
Lys Thr Val Lys Val Cys Phe Leu lie Ser Ser His Pro Asn Leu Tyr 20 25 30
Leu Thr Gin Trp Phe 35 <210> 91 <211> 52 <212>蛋白質 <213> -§i〇(Lycopersicon esculentum) <400> 91
Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie Arg Gly Gly 15 10 15
Ala Lys Thr Val Lys Val His Cys Asp Ala Thr lie Ala Phe Pro lie 20 25 30
Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Ala Lys Ser Lys Glu Phe Ser Gin lie 35 40 45
Arg Cys Gin Val 50 <210〉 92 <211> 193 <212>蛋白質 <213> 擬南齐（Arabidopsis thaliana) <400> 92
Gly Gly Val Glu Glu Asp Leu lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys 15 10 15
Gly Asp Phe Ser Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn 20 25 30
Arg lie Gly Asn Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu 35 40 45
Asp Trp lie lie Pro He Phe Asp Glu Met Leu Lys Glu Gin Lys Glu 50 55 60
Glu Asn Val Leu Trp Thr Pro Ser Lys Lea Leu Ala Arg Leu Gly Lys 65 70 75 80
Glu lie Asn Asn Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Tyr Lys Met Asn 85 90 95 •66-
94139.doc lie Pro Val Phe Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Arg Asp Met 100 105 110
Leu Tyr Phe His Ser Phe Arg Thr Ser Gly Leu lie lie Asp Val Val 115 120 125
Gin Asp lie Arg Ala Met Asn Gly Glu Ala Val His Ala Asn Pro Lys 130 135 140
Lys Thr Gly Met lie lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His lie 145 150 155 160
Cys Asn Ala Asn Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie 165 170 175
Asn Thr Gly Gin Glu Phe Asp Gly Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp 180 185 190
Glu <210> 93 <211> 174 <212>蛋白質 <213> 康乃馨（Dianthus caryophyllus) <400> 93
Arg Arg Ser lie Lys Cys Leu Ala Pro Thr Phe Lys Gly Asp Phe Ala 15 10 15
Leu Pro Gly Ala Gin Leu Arg Ser Lys Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn 20 25 30
Leu Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys Lys Phe Glu Asp Trp lie lie 35 40 45
Pro lie Leu Asp Lys Met Leu Glu Glu Gin lie Ser Glu Lys lie Leu 50 55 60
Trp Thr Pro Ser Lys Leu He Gly Arg Leu Gly Arg Glu lie Asn Asp 65 70 75 80
Glu Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Ala Phe Lys Asn Asn lie Pro Val Phe S5 90 95
Cys Pro Gly Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His 100 105 110
Ser Phe Arg Asn Pro Gly Leu lie lie Asp Val Val Gin Asp lie Arg 115 120 125
Ala Val Asn Gly Glu Ala Val His Ala Ala Pro Arg Lys Thr Gly Met -67- 94l39.doc 1337185 130 135 140 lie lie Leu Gly Gly Gly Leu Pro Lys His His lie Cys Asn Ala Asn 145 150 155 160
Met Met Arg Asn Gly Ala Asp Tyr Ala Val Phe lie Asn Thr 165 170 <210> 94 <211> 22 <212>蛋白質 <213> 擬南芬（Arabidopsis thaliana) <400> 94
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 95 <211> 22 <212>蛋白質 <213〉擬南芥(Arabidopsis thaliana) <400> 95
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 96 <211> 22 <212〉蛋白質 <2Π> 擬南芬(Arabidopsis thaliana) <400> 96
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 97 <211> 22 <212>蛋白質 <213> 甘藍型油菜（Brassica napus) -68· 94139.doc 1337185 <400> 97
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 98 <211> 22 <212>蛋白質 <213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus) <400〉 98
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 99 <211> 22 <212>蛋白質 <213> #*〇(Lycopersicon esculentum) <400〉 99
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210〉 100 <211> 22 <212>蛋白質 <213> #iS(Lycopersicon esculentum) <400> 100
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 101 <211> 22 <212〉蛋白質 <213> 番拓（Lycopersicon esculentum) <400> 101
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15 • 69- 94139.doc 1337185
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 102 <211> 22 <212>蛋白質 <213〉紫花苜蓿（Medicago sativa) <400〉 102
Cys Lys Val Val GIu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 103 <211> 22 <212>蛋白質 <213〉紫花苜蓿（Medicago sativa) <400〉 103
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 104 <211> 22 <212>蛋白質 <213〉紫花苜蓿（Medicago sativa) <400> 104
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 105 <211> 22 <212>蛋白質 <213〉萵苣(Lactuca sativa) <400> 105
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 94139.doc -70- 1337185 <210> 106 <211> 22 <212〉蛋白質 <213〉未知生物 <220〉 <223>未知生物的說明：樹序列肽 <400> 106
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 107 <211> 22 <212>蛋白質 <213>未知生物 <220> <223>未知生物的說明：樹序列肽 <400> 107
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 108 <211> 22 <212〉蛋白質 <213>未知生物 <220> <223>未知生物的說明：樹序列肽 <400> 108
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 15 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20 <210> 109 <211> 22 94139.doc - 71 - 1337185 <212>蛋白質 <213〉未知生物 <220> <223>未知生物的說明：樹序列肽 <400> 109
Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His 1 5 10 15
Ala Lys Cys His Phe Val 20
<210〉 110 <211> 66 <212> DNA <213> 擬南芥（Arabidopsis thaliana) <400> 110
tgcaaggttg ttgaggtttc aacctcgaag actggcaagc atggtcatgc taaatgtcat 60 tttgta 66 <210> 111 <211> 66 <212> DNA <213〉擬南芬（Arabidopsis thaliana) <400> 111 tgcaaggttg ttgaggtttc gacttccaaa actggcaagc acggtcacgc caaatgtcac 60 tttgtt 66 <210> 112 <211> 66 <212> 脆 <213〉擬南茶(Arabidopsis thaliana) <400> 112 tgcaaggtgg ttgaggtatc gacttcgaag actgggaagc atggtcacgc caagtgtcac 60 tttgtt 66
<210> 113 <211> 66 <212> DNA <213> 甘藍型油菜（Brassica napus) <400> 113 tgcaaggttg ttgaggtttc gacttcgaag actgggaagc acggtcacgc aaagtgtcac 60 tttgtt 66 -72- 94139.doc 1337185
<210> 114 <211> 66 <212> DNA <213> 康乃馨(Dianthus caryophyllus) <400> 114 tgcaaggtgg ttgaggtttc tacctccaag actggcaagc acggtcatgc caaatgtcac 60 tttgta 66
<210> 115 <211> 66 <212> DNA <213> #iS(Lycopersicon esculentum)) <400> 115 tgcaaggtgg ttgaagtttc aacctccaag acaggcaagc acggtcatgc taaatgtcac 60 ttcgtg 66
<210> 116 <211> 66 <212> DNA <213> 番茄（Lycopersicon esculentum) <400> 116 tgcaaggttg tggaagtctc tacatccaaa actggcaagc acggtcacgc caaatgtcat 60 ttcgtt 66
<210> 117 <211> 66 <212> DNA <213> #i〇(Lycopersicon esculentum) <400> 117 tgcaaggttg ttgaggtctc cacttccaaa actggcaagc atggacatgc aaaatgicac 60 tttgtg 66
<210> 118 <211> 66 <212> DNA <213> 紫花苜蓿（Medicago sativa) <400> 118 tgcaaggtgg ttgaagtttc gacttcgaag accgggaagc atggacatgc caagtgtcat 60 tttgtt 66
<210〉 119 <211> 66 <212> DNA <213> 紫花苜蓿（Medicago sativa) -73- 94139.doc 1337185 <400> 119
tgcaaggttg ttgaggtttc tacttcaaaa acaggaaaac atggacatgc aaagtgtcac 60 tttgtt 66 <210> 120 <211> 66 <212> DNA <213〉紫花苜辖（Medicago sativa) <400> 120 tgcaaggtag ttgaagtttc aacttctaaa actggaaagc atggacatgc aaagtgtcac 60 tttgtt 66
<210> 121 <211> 66 <212> DNA <213〉萵苣(Lactuca sativa) <400> 121 tgcaaggttg ttgaagttic tacctccaag actgggaagc atgggcatgc taagtgtcac 60 tttgtc 66 <210> 122 <211> 66 <212> DNA <2Π>未知生物 <220> <223〉未知生物的說明：榭寡核:y：酸序列 <400> 122 igcaaggtcg tggaggtttc aacctctaaa actggcaagc atggccatgc taaatgtcac 60 tttgtt 66 <210> 123 <211> 66 <212> DNA <2丨3>未知生物 <220> <223>未知生物的說明：樹募核甘酸序列 <400> 123 tgcaaggttg ttgaggtttc cacctcaaag acaggcaagc acggacatgc taagtgccac 60 tttgtg 66 <210> 124 <211> 66 74· 94139.doc 1337185 <212> DNA <213>未知生物的說明 <220〉 <223〉未知生物的說明：樹募核苷酸序列 <400> 124 tgcaaggttg tggaggtttc tacctctaaa actggcaagc acggccatgc caaatgtcac tttgtt 60 66 <210> 125 <211> 66 <212> DNA <213>未知生物 <220> <223〉未知生物的說明：樹寡核苷酸序列 <400> 125 tgcaaggttg ttgaggtttc aacctcaaag acaggcaagc atggacatgc taagtgccac tttgtg 60 66 <210> 126 <211> 745 <212> DNA <213> 番茄（Lycopersicon esculentum) <220〉 <221> CDS <222> (55)..(534) <400〉 126 ttctccacag caaacacaga gaagttcata gcagaagaag agagagattt agct atg Met 1 tct gat gaa gaa cac cat 111 gag tcc aaa get gat get ggt gcc tea Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala Ser 5 10 15 aaa act tac cct caa caa get ggt act att ege aag aat ggt tat ata Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Asn Gly Tyr lie 20 25 30 gtt ate aaa ggc aga cct tgc aag gtt gtt gag gtc tec act tec aaa Val lie Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Lys 35 40 45 act ggc aag cat gga cat gca aaa tgt cac ttt gtg gca ate gac att Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp lie 50 55 60 65 57 105 153 201 94139.doc •75· 249 297 ttc aat gca aaa aag ctt gaa gat att gtt cct tea tee cac aat tgt
Phe Asn Ala Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn Cys 70 75 80 gat gtg cca cat gtc aat cgt act gac tat cag ctg att gac ata tet 345
Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie Ser 85 90 95 gaa gat ggt ttt gtg tet ctt ctt act gaa aat gga aac acc aaa gac 393
Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Asn Gly Asn Thr Lys Asp 100 105 110 gac etc aga ctt ccc acc gat gac acc ctg ttg aac cag gtt aaa ggt 441
Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Asp Thr Leu Leu Asn Gin Val Lys Gly 115 120 125 gga ttt gag gaa gga aag gat etc gtt ctg tet gtg atg tet gca atg 489
Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp Leu Val Leu Ser Val Met Ser Ala Met 130 135 140 145 ggt gaa gag cag ate tgt get gtg aag gac att ggt acc aag acc 534
Gly Glu Glu Gin lie Cys Ala Val Lys Asp lie Gly Thr Lys Thr 150 155 160 tagttgtgtg cattctgcag cataaataat tgctttttag egaagaegtt ttatatcttg 594 ttatcgtggt acctttgcaa tctgttttat cgtgaaaaca ccttatatct attggcatgg 654 ettgaatagt tgaaactcta atagtttctg tttggcataa ggcaatgaac tggatttgat 714 ageagaagta atctacatgt cacttttttt t 745 <210> 127 <211> 160 <212>蛋白質 <213> #iS(Lycopersicon esculentum) <400> 127
Met Ser Asp Glu Glu His His Phe Glu Ser Lys Ala Asp Ala Gly Ala 15 10 15
Ser Lys Thr Tyr Pro Gin Gin Ala Gly Thr lie Arg Lys Asn Gly Tyr 20 25 30 lie Val lie Lys Gly Arg Pro Cys Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser 35 40 45
Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Cys His Phe Val Ala lie Asp 50 55 60 lie Phe Asn Ala Lys Lys Leu Glu Asp lie Val Pro Ser Ser His Asn 65 70 75 80 • 76· 94l39.doc 1337185
Cys Asp Val Pro His Val Asn Arg Thr Asp Tyr Gin Leu lie Asp lie 85 90 95
Ser Glu Asp Gly Phe Val Ser Leu Leu Thr Glu Asn Gly Asn Thr Lys 100 105 110
Asp Asp Leu Arg Leu Pro Thr Asp Asp Thr Leu Leu Asn Gin Val Lys 115 120 125
Gly Gly Phe Glu Glu Gly Lys Asp Leu Val Leu Ser Val Met Ser Ala 130 135 140
Met Gly Glu Glu Gin lie Cys Ala Val Lys Asp lie Gly Thr Lys Thr 145 150 155 160 <210〉 128 <211> 25 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：引子 <400> 128
Gly Ala Ala Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala 15 10 15
Ala Cys Cys Ala Thr Gly Thr Cys Cys 20 25 <210> 129 <211> 26 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 129 ggggagctct tgttagtctc acttgg <210> 130 <211> 906 <212> DNA <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 130 -77· 94l39.doc cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg atlccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcaccaca cgcttgtcta cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg c〇£acagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct tggatc <210> 131 <211> 495 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 131 gctgcaacca tgtccgacga ggagcatcac tttgagtcca gtgacgccgg agcgtccaaa acctaccctc aacaagctgg aaccatccgt aagaatggtt acatcgtcat caaaaatcgt ccctgcaagg ttgttgaggt ttcaacctcg aagactggca agcatggtca tgctaaatgt cattttgtag ctattgatat cttcaccagc aagaaactcg aagatattgt tccttcttcc cacaattgtg atgttcctca tgtcaaccgt actgattatc agctgattga catttctgaa gatggatatg tcagtttgtt gactgataac ggtagtacca aggatgacct taagctccct aatgatgaca ctctgctcca acagatcaag agtgggtttg atgatggaaa agatctagtg gtgagtgtaa tgtcagctat gggagaggaa cagatcaatg ctcttaagga catcggtccc aagtgagact aacaa <210> 132 <211> 662 <212> DNA <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：合成的搆築體 <400> 132 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc -78- 94l39.doc ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat tcactaggca acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg at <210> 133 <211> 30 <212> DNA <213〉人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 133 gcgctcgagc tatgtctgat gaagaacacc <210> 134 <211> 28 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 134 tttgagctcc agaatgcaca caactagg
<210> 135 <211> 906 <212> DNA <213> 番茄（Artificial Sequence) <220> <223〉人造序列的說明：合成的構築體 <400> 135 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtd cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat -79· 94139.doc 1337185 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggaic 906 <210> 136 <211〉 499 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 136 ctatgtctga tgaagaacac cattttgagt ccaaagctga tgctggtgcc tcaaaaactt 60 accctcaaca agctggtact attcgcaaga atggttatat agttatcaaa ggcagacctt 120 gcaaggttgt tgaggtctcc acttccaaaa ctggcaagca tggacatgca aaatgtcact 180
ttgtggcaat cgacattttc aatgcaaaaa agcttgaaga tattgttcct tcatcccaca 240 attgtgatgt gccacatgtc aatcgtactg actatcagct gattgacata tctgaagatg 300 gttttgtgtc tcttcttact gaaaatggaa acaccaaaga cgacctcaga cttcccaccg 360 atgacaccct gttgaaccag gttaaaggtg gatttgagga aggaaaggat ctcgttctgt 420 ctgtgatgtc tgcaatgggt gaagagcaga tctgtgctgt gaaggacatt ggtaccaaga 480 cctagttgtg tgcattctg 499 <210〉 137 <211> 662 <212> DNA <2I3>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 137 gaattgatcc atgcatcagt ggaaaactgt ttttcgctat cttttgttca ttgaaattat ctctaatgac tcactaggca tatgtcctct tgtcagattc tgaaaatatt at
tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgtt£aat 300 aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 662 <210> 138 <211> 29 <212> DNA <213>人造的序列 -80- 94139.doc <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 138 gcatgtcgac atgtctgacg aggagcacc <210> 139 <211> 906 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 139 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactggc gaacagttea tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gageategtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca egettgteta cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tetetaaget tggatc <210> 140 <211> 661 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的搆築體 <400> 140 tcgacatgtc tgaegaggag caccacttcg agtccagcga cgccggagct tccaaaacct accctcagca ggctggtaac atccgcaagg gtggtcacat cgtcatcaag ggccgtccct gcaaggttgt tgaggtttcg aettegaaga ctgggaagca cggtcacgca aagtgtcact ttgttgctat tgacatcttc actgctaaga agetegagga tattgttccc tcttcccaca attgtgatgt tccccatgtg aaccgtattg actaccagtt gattgatatc tctgagaatg gctttgttag ccttttgacc gacagtggtg gcaccaagga cgacctcaag cttcccaccg atgataatet cagcgctctg atgaagagtg gattegagga gggaaaggat gtggtggtgt ctgtcatgtc ttccatggga gaggageaga tctgtgccgt caaggaagtt ggtggtggca agtaaaaccc attetetgag agaggataat cttattacca gtggtcaatg ttataagaac aagaacttgt tttttttcct ttttctaatt tagatcattt gtgttgtgtt tctttgttgc -81 - 94139.doc aagacaacca ttatctatta ttggt11tgg attgtttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 a 661 <210> 141 <211> 662 <212> DNA <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：合成的構換體 <400> 141 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 ttttcgctat cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 cttttgttca ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat 300 ttgaaattat aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 ctctaatgac cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 tcactaggca acaaatacat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 at 662 <2i0> 142 <211> 325 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 142 60 120 180 240 300 325 ggtgcacgcc ctgatgaagc agtgtcttgg ggtaaaataa ggggatctgc taaaactgtc aaggtgtact gtgatgctac catagccttc cctttgttgg ttgctgaaac atttgcctcc aagagagaac aaagctgtga gcacaagacc taagcccaag aaagcttacg tctcttttat cggtttgttc ttccatcttg ttgttgtacc ctttgtcctg ctttacataa cattcatctc taaaacaata ctacctcctt ttgacaaaaa ataaaaaaaa ttggaaaaat ggtttcacaa gaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa <210> 143 <211> 906 <212> DNA <2丨3>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的搆築體 -82- 94139.doc <400> 143 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta 480 cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct 900 tggatc 906 <210> 144 <211> 325 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 144 tttttttttt gtcaaaagga aacaacaaga tgtgctcaca ctatggtagc acactgcttc tttttttttt tattcttgtg aaaccatttt tccaattttt tttatttttt 60 ggtagtattg ttttagagat gaatgttatg taaagcagga caaagggtac 120 tggaagaaca aaccgataaa agagacgtaa gctttcttgg gcttaggtct 180 gctttgttct ctcttggagg caaatgtttc agcaaccaac aaagggaagg 240 atcacagtac accttgacag ttttagcaga tccccttatt ttaccccaag 300 atcagggcgt gcacc 325 <210> 145 <211> 662 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 145 gaattgatcc tctagagctt tcgttcgtat atgcatcagt ttcattgcgc acacaccaga ggaaaactgt ttttcttgta ccatttgttg ttttcgctat cgaactgtgc aaatggaaat ccttttgttc attctcaaat taatattatt tttgaaatta taagagatat gcaaacattt cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt ttcactaggc aacaaatata ttttcagacc catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 ggatggagaa gagttaatga atgatatggt 240 tgttttttct cttatttgtt gtgtgttgaa 300 tgttttgagt aaaaatgtgt caaatcgtgg 360 aaaacacttg tagttgtacc attatgctta 420 tagaaaagct gaaatgttac tgaatacaag 480 •83· 94139.doc tatgtcctct tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 tgtcagattc taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 tgaaaatatt ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 at 662 <210> 146 <211> 28 <212> DNA <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：引子 <400> 146 aagctcgaga tgtcggacga agagcacc 28 <210> 147 <211> 28 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400〉 147 gtagagctcc accaatacca tctgcagc 28 <210> 148 <211> 906 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 148 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt 60 aaagactggc gaacagttea tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt 120 cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct 180 cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 240 attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 300 ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 360 tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gageategtg gaaaaagaag acgttccaac 420 cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca egettgteta 480 cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca 540 aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt 600 gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 660 catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 720 catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 780 ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 840 ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tetetaaget 900 •84- 94139.doc tggatc 906 <210> 149 <211> 497 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 149 atgtcggacg aagagcacca cttcgaatcc aaggccgatg ccggagcttc aaagacgtat 60 cctcaacaag ctggtactat tcgtaaaggt ggtcacatcg tcataaaaaa tcgtccttgc 120 aaggtggttg aagtttcaac ttccaagaca ggcaagcacg gtcatgctaa atgtcactcg 180 tggcaattga cattttcact ggaaagaaac ttgaggatat tgttccctct tctcacaatt 240 gtgatgttcc tcatgtgaat aggactgatt atcaacttat tgatatctct gaggatggct 300 ttgtgagtct gttgactgaa aatggtaaca ccaaggatga cttgagactc ccaactgatg 360 atactcttct ggctcaggtc aaagatggtt ttgctgaggg gaaagacctg gttctatcag 420 tgatgtctgc catgggagag gagcagattt gtggtatcaa ggacattggc cctaagtagc 480 tgcagatggt attggtg 497 <210> 150 <211> 662 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 150 gaattgatcc atgcatcagt ggaaaactgt 111 tcgctat cttttgttca ttgaaattat ctctaatgac tcactaggca tatgtcctct tgtcagattc tgaaaatatt at tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgtcc gtcaagttca 60 ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat 300 aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 662 <210〉 151 <211> 27 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 94139.doc ·85· <400> 151 cgactcgagc agccatgtct gacgagg <210> 152 <211> 29 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <400> 152 atcgagctca tcacttgggg ccaatatcc <210> 153 <211> 906 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 153 cactgaatca aaggccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactggc gaacagttca tacagagtct cttacgactc aatgacaaga agaaaatctt cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctacctccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca cgcttgtcta cctccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggaattgaga cttttcaaca aagggtaau tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctaagct tggatc <210> 154 <211> 486 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的搆築體 <400> 154 86· 94139.doc cagccatgtc tgacgaggag catcaatttg agtctaaggc tgatgccgga gcatcaaaaa 60 cttaccctca acaagctggt actattcgta agaacggtta tatcgtcatc aaaggccgtc 120 catgcaaggt tgtggaagtc tctacatcca aaactggcaa gcacggtcac gccaaatgtc 180 atttcgttgc tattgacatc ttcactggga agaagcttga ggatattgtc ccctcttcac 240 acaattgtga tgtgccccat gttaatcgta cagattatca gcttattgac atctctgaag 300 atggatttgt gagtctgctt actgacaatg gtaacaccaa ggatgacctc aggcttccta 360 ctgatgaaaa tctgctttca ctgatcaagg acgggtttgc cgagggtaag gacctcgttg 420 tgtctgttat gtcagctatg ggtgaggaac agattaatgc tttgaaggat attggcccca 480 agtgat 486 <210> 155 <211> 662 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：合成的構築體 <400> 155 gaattgatcc atgcatcagt ggaaaactgt ttttcgctat cttttgttca ttgaaattat ctctaatgac tcactaggca tatgtcctct tgtcagattc tgaaaatatt at tctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca 60 ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gttcgagtat tatggcattg 120 ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg 180 cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc 240 ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat 300 aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc 360 cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat 420 acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag 480 tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct 540 taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta 600 ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg 660 662 <210> 156 <211> 22 <212> DNA <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：引子 <400> 156 cactgctcac tagtttgatg gc 22 <210〉 157 <211> 38 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 -87- 94139.doc 38 <400> 157 gcgaagcggc catggctcga gttttttttt tttttttt <210> 158 <211> 413 <212> DNA <213> 萵苣(Lactuca sativa) <400> 158 cactgctcac ggggaaaata ccctttactt gtcaaccaaa attttgtttg tgttactgat caaatcaaac tagtttgatg gcagtgattc tggtgctcga cctgatgaag ctgtctcctg 60 cgtggttctg ctaaatctgt caaggtgcac tgtgatgcaa ctatcgcgtt 120 gttgcagaaa catttgctgc aaagagagag ggggagatga aaaatgttga 180 gctttggttt aaaaaggtgg aacagtgtag gacagggact catttttgat 240 ctaaaaaatg gtctttggaa gaatattgat gcacacaaac aaggagacaa 300 cttggagagt gtaatgtaaa atgtctaaat aatttcaaag cttctcacaa 360 tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aactcgagcc atggccgctt cgc 413 <210〉 159 <211> 388 <212> DNA <213> 萵苣（Lactuca sativa) <400> 159 ctagtttgat acgtggttct tgttgcagaa agctttggtt gctaaaaaat tcttggagag act taaaaaa ggcagtgatt ctggtgctcg acctgatgaa gctgtctcct gggggaaaat 60 gctaaatctg tcaaggtgca ctgtgatgca actatcgcgt tccctttact 120 acatttgctg caaagagaga gggggagatg aaaaatgttg agtcaaccaa 180 taaaaaggtg gaacagtgta ggacagggac tcatttttga tattttgttt 240 ggtctttgga agaatattga tgcacacaaa caaggagaca atgttactga 300 tgtacatgta aaatgtctaa ataatttcaa agcttctcac aacaaatcaa 360 aaaaaaaaaa aaactcga 388 <210> 160 <211> 23 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：引子 <220> <221> modified_base <222> (3) <223> a, t， c or g <220〉 <221> modified_base <222〉 （12) <223> a， t， c or g <220〉 <221> modified_base <222> (18) 94139.doc •88· 1337185 <223> a, t，c or g <400> 160 ggnttraayc gnathggnaa ytt 23 <210〉 161 <211> 23 <212> DNA <213>人造的序列 <220〉 <223>人造序列的說明：引子 <220> <221> modified_base <222> (9) <223> a, t, c or g <220〉 <221> modified_base <222> (21) <223> a, t, c or g <400> 161 tgrtcgganc crtcraaytc ngc 23
<210> 162 <211〉 108 <212> DNA <213> 香蕉葉斑病菌（Mycosphaerella fijiensis) <400> 162 cgccaagcta tttaggtgac actatagaat actcaagcta tgcatccaac gcgttgggag 60 ctctcccata tggtcgacct gcaggcggcc gcgaattcac tagtgatt 108
<210> 163 <211> 487 <212> DNA <213> 香蕉葉斑病諸（Mycosphaerella fijiensis) <220> <221> CDS <222> (1)..(486) <400> 163 ggg tta aat cgt att gga aac ttc tta gtg cca aac gac aat tac tgc 48
Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Phe Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys 15 10 15 cgc 111 gaa gac tgg gtg atg cca ate etc gac aca atg etc gaa gaa 96
Arg Phe Glu Asp Trp Val Met Pro lie Leu Asp Thr Met Leu Glu Glu 20 25 30 -89- 94139.doc 144 1337185 144 cag gaa gca tgc aag ggt teg ggc gaa gca ate cac tgg act ccc age Gin Glu Ala Cys Lys Gly Ser Gly Glu Ala lie His Trp Thr Pro Ser 35 40 45 aaa ate ate aac egg ett ggc aag gag gtc aac gac gaa teg tee gtg Lys lie lie Asn Arg Leu Gly Lys Glu Val Asn Asp Glu Ser Ser Val 50 55 60 tac tac tgg gca tgg aag aac gac att cca gtg ttc tgt ccg geg ett Tyr Tyr Trp Ala Trp Lys Asn Asp lie Pro Val Phe Cys Pro Ala Leu 65 70 75 80 act gat ggc agt etc gga gac atg ctg tac ttc cac aeg ttc aaa tee Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Thr Phe Lys Ser 85 90 95 tea ccg cag cag ett ega gtc gac att gtg gaa gac ate ega aag ate Ser Pro Gin Gin Leu Arg Val Asp lie Val Glu Asp lie Arg Lys lie 100 105 110 aac acc etc gee gtc ega gee aag ege act ggc atg ate att etc gga Asn Thr Leu Ala Val Arg Ala Lys Arg Thr Gly Met lie lie Leu Gly 115 120 125 ggc ggc att gtc aag cac cac ate gca aat gee aac ctg atg ege aat Gly Gly lie Val Lys His His lie Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 130 135 140 ggc geg gaa age gca gtg tac ate aat acc geg ccg aat teg aeg gat Gly Ala Glu Ser Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Pro Asn Ser Thr Asp 145 150 155 160 ccg acc a Pro Thr 192 240 288 336 384 432 480 487
<210> 164 <211> 162 <212> PRT <213> 香蕉葉斑病菌（Mycosphaerella fijiensis) <400> 164
Gly Leu Asn Arg lie Gly Asn Phe Leu Val Pro Asn Asp Asn Tyr Cys 15 10 15
Arg Phe Glu Asp Trp Val Met Pro lie Leu Asp Thr Met Leu Glu Glu 20 25 30
Gin Glu Ala Cys Lys Gly Ser Gly Glu Ala lie His Trp Thr Pro Ser 35 40 45
Lys lie lie Asn Arg Leu Gly Lys Glu Val Asn Asp Glu Ser Ser Val 50 55 60 • 90- 94139.doc 1337185
Tyr Tyr Trp Ala Trp Lys Asn Asp lie Pro Val Phe Cys Pro Ala Leu 65 70 75 80
Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Leu Tyr Phe His Thr Phe Lys Ser 85 90 95
Ser Pro Gin Gin Leu Arg Val Asp lie Val Glu Asp lie Arg Lys lie 100 105 110
Asn Thr Leu Ala Val Arg Ala Lys Arg Thr Gly Met lie lie Leu Gly 115 120 125
Gly Gly lie Val Lys His His lie Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 130 135 140
Gly Ala Glu Ser Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Pro Asn Ser Thr Asp 145 150 155 160
Pro Thr
<210> 165 <211> 214 <212> DNA <2I3> 香蕉葉斑病菌（Mycosphaerella fijiensis) <400> 165 aatcgaattc ccgcggccgc catggcggcc gggagcatgc gacgtcgggc ccaattcgcc 60 ctatagtgag tcgtattaca attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 120 cctggcggta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 180 agcgaagagg cccgcaccga tcgccct tcc aaca 214 -91- 94139.doc

Claims (1)

1337185
七、申請專利範圍： 1. 一種油菜脫氧羥腐胺離胺酸合成酶（DHS)的反義聚核普 酸’其中該油菜DHS包括SEQ ID NO: 71中所示之胺基酸 序列，且其中該反義聚核苷酸的轉錄可抑制油菜植物中 内源性DHS的表現。 2_ —種用來轉型植物的表現載體，其包括根據請求項 反義聚核苷酸及可操作地連接於該反義聚核苷酸以提供 該反義聚核苷酸的轉錄的調控序列。 3. —種抑制油菜植物中内源性脫氧羥腐胺離胺酸合成酶 (DHS)表現的方法，其包括將包括根據請求項1之油菜 DHS之反義聚核苷酸及可操作地連接於該反義聚核苷酸 以提供該反義聚核苷酸轉錄之調控序列的載體併入植物 的至少一個細胞之基因組内，且藉此該反義聚核苷酸的 該轉錄抑制該植物中内源性DHS的表現。 4. 一種編碼油菜脫氧羥腐胺離胺酸合成酶（d h s)的核酸分 子的反義聚核苦酸’其中該油菜_係由包括剛m NO. 70之核酸序列所編碼，且其中該反義聚核苷酸的轉 錄可抑制油菜植物中内源性DHS的表現。 5. 種用來轉型植物的表現載體，其包括根據請求項々之 反義聚核#酸及可操作地連接於該反義聚核#酸以提供 該反義聚核苷酸的轉錄的調控序列。 & -種抑制油菜植物中内源性脫氧經腐胺離胺酸合成酶表 現的方法’其包括將包括根據請求項4之油菜麵之反義 聚核苦SiL及可操作地連接於該反義聚核_酸以提供該反 94139-990728.doc 1337185 義聚核苷酸轉錄之調控序列的載體併入植物的至少一個 細胞之基因組内，且藉此該反義聚核苷酸的該轉錄抑制 該植物中内源性DHS的表現。 94139-990728.doc
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