TW201330855A - 金銀花萃取物及其製備方法與應用 - Google Patents

金銀花萃取物及其製備方法與應用 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種金銀花萃取物及皮膚用藥,其中上述金銀花萃取物的組成包括:20-50重量份的綠原酸(chlorogenic acid);1-5重量份的齊墩果酸(oleanolic acid);以及0.001-5重量份的熊果酸(ursolic acid)。本發明亦提供一種金銀花萃取物的製備方法,包括:利用一包含乙醇的極性溶劑,對金銀花進行一超音波萃取,以得到一金銀花粗萃物,其中上述超音波萃取溫度介於約15-45℃;以及以一分子拓印高分子對上述金銀花粗萃物進行純化以得到一金銀花萃取物。

Description

金銀花萃取物及其製備方法與應用
本發明係關於一金銀花萃取物,尤其是關於一種具有抗痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes)功效的金銀花萃取物、以及其製備方法及應用。
台灣東部地區由於地理環境因素影響,且具有豐富天然資源可供利用,天然物年產值約計12億元,尤其東部保有許多台灣特有原生植物,其中以台東的金銀花及花蓮的丹蔘為東部地區推廣栽種面積最廣且具特色。如何衍生東部特用作物其產品應用,有助於帶動東部經濟價值。而其中一項特用作物-金銀花,於《本草綱目》記載其善於化毒,故治癰疽、腫毒、瘡癬等”。自古以來,金銀花常用於清熱解毒,治療溫病發熱,熱毒血痢,癰瘍等癥,亦用於風熱感冒,支氣管炎等病癥。而現代藥理研究表明,金銀花具有抑菌、抗病毒、抗炎、解熱、調節免疫等作用。近年來文獻報導指出,金銀花含環己六醇、黃酮類、皂苷類等,具有廣泛抗菌作用,文獻指出對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、雙球菌、蠟樣芽胞桿菌等均有較強的抑制作用,且對鉤端螺旋體、流感病毒等多種病原微生物亦有抑制作用。
痤瘡是由痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes)所引起的一種慢性皮膚毛囊炎症,目前治療青春痘大多使用過氧化苯(Benzoyl Peroxide)、硫磺(Sulfur)、三氯生(Triclosan)、口服抗生素-四環黴素(Tetracycline),外用抗生素-紅黴素(Erythromycin)、克林達黴素(Clindamycin)等。而造成青春痘的病原菌為痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes),也包含其他共生菌如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),因此若能找到一種中草藥種同時具備抗這類菌種的能力,將有助於應用於青春痘照護相關產品開發。
中華人民共和國專利申請號CN200710003451.0,”含慶大黴素的藥物(Medicine containing gentamycin)”專利,雖然此前案專利提到採用與金銀花同屬的銀花,約占中藥材8.6%,然而此萃取法是以水萃取,主要目的在於應用中藥萃取物進行氣血運行的調理,並未探討金銀花萃取物對於抗痤瘡桿菌的功效。
美國專利號6083921“Pharmaceutical compositions and method of using same”,揭示一種藥物的組成,由黃芩(Radix scutellariae)、金銀花(Flos Lonicera)、以及連翹(Fructus forsythiae)萃取活性物質而來,不同的成分組成其抗菌效果有異,但亦無抗痤瘡桿菌的功效探討,且此前案的金銀花萃取物為水溶性的綠原酸,而非萃取油溶性的活性物質。
中華民國專利公開第200932205號”痤瘡肌膚用皮膚外用劑”,此前案之痤瘡肌膚用皮膚外用劑的特徵在於杜鵑醇及其衍生物中之至少1種以上,再結合炎症抑制效果的植物萃取物,例如:由山黃梔(Gardenia Florida)、芍藥(Paeonia Albiflora root)、金銀花(Lonicera japonica)之萃取物。該案並未提供金銀花萃取物之萃取方法,且未探討金銀花具抗痤瘡桿菌之功效。
美國專利號5,834,000“Antiviral and antimicrobial herbal complex”,揭示以95%乙醇(ethanol)以及5%異丙醇(isopropyl alcohol)於82℃下萃取金銀花,其萃取物成分以黃酮類為主,例如木犀草素(Luteolin)、忍冬苷(Lonicerin)、木犀草素葡萄糖苷(Luteolin glucoside)、肌醇(inositol)等,具有抗菌及減緩喉嚨痛功效,然而此前案並未揭示金銀花萃取物具有抑制痤瘡桿菌或治療青春痘的功效。
美國專利號6063383“Pharmaceutical suppository composites for fever and influenza and method of producing the composites”,揭示一種治療發燒與流行性之感冒的栓劑合成物,其成分中包含金銀花(flos lonicerae japonicae)。此前案係以高溫煎煮的方式進行活性物質的萃取,其具有抗菌功效,除了可抑制發燒、排毒外,還提到可治療青春痘。
由於目前講求天然的皮膚照護,以避免多餘的化學產品造成皮膚負擔,因此尋求其他天然抗痤瘡桿菌的中草藥,進行青春痘照護相關材料開發,具市場需求。
本發明提供一種金銀花萃取物,其組成包括:20-50重量份的綠原酸(chlorogenic acid);1-5重量份的齊墩果酸(oleanolic acid);以及0.001-5重量份的熊果酸(ursolic acid)。
本發明亦提供一種金銀花萃取物的製備方法,包括:利用一包含乙醇的極性溶劑,對金銀花進行一超音波萃取,以得到一金銀花粗萃物,其中上述超音波萃取溫度介於約15-45℃;以及以一分子拓印高分子對上述金銀花粗萃物進行純化以得到一金銀花萃取物。
本發明尚提供一種皮膚用藥,包括上述之金銀花萃取物。
本發明提供一種金銀花的萃取及純化製程,所得之金銀花脆取物具抑制痤瘡桿菌的活性成分。上述金銀花的萃取及純化製程係將中草藥-金銀花先以適合溶劑進行低溫超音波製程以萃取金銀花中的活性成分,其具有抗痤瘡桿菌的功效。本發明另透過分子拓印高分子(Molecular Imprinted Polymer;MIP)技術,其可運用於短管柱層析或是浸泡過濾的方式進行萃取物的純化,同時提高金銀花萃取物多項活性成分,以應用於青春痘照護相關皮膚用藥。此外,本發明亦可採用高速細胞破碎輔助萃取製程,以加快活性成分的萃取效果。
在一實施例中,上述金銀花萃取物的組成可包括:20-50重量份,較佳20-30重量份的綠原酸(chlorogenic acid);1-5重量份,較佳3-5重量份的齊墩果酸(oleanolic acid);以及0.001-5重量份,較佳0.002-5重量份的熊果酸(ursolic acid)。在另一實施例中,本發明之金銀花萃取物基本上由上述綠原酸(chlorogenic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)、以及熊果酸(ursolic acid)所組成(consisting essentially of)。在又一實施例中,本發明之金銀花萃取物僅由上述綠原酸(chlorogenic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)、以及熊果酸(ursolic acid)所組成(consisting of)。
上述金銀花粗萃物的製備方法可包括:選擇性地(optionally)利用一均質機對金銀花進行一細胞破碎製程,以使上述金銀花微小化;接著利用一包含乙醇的極性溶劑,對金銀花進行一超音波萃取,而後進行過濾以去除固體渣,以得到一金銀花粗萃物。此處之金銀花可使用金銀花的市售乾貨。上述細胞破碎製程為一選擇性的步驟,用以提高萃取效率,此技藝人士亦可使用均質機以外之其他慣用於破碎的工具或手段。上述包含乙醇的極性溶劑中乙醇濃度可介於約50-95 vol%,較佳介於約70-95 vol%,若乙醇濃度低於50 vol%,則具有抑制痤瘡桿菌的功效性成分,被提取出來的量不足。上述超音波萃取時間介於約1-5小時,較佳2-3小時,上述超音波萃取溫度介於約15-45℃,較佳15-35℃。
接著,以一分子拓印高分子對所得之金銀花粗萃物進行純化以得到一金銀花萃取物。本發明採用分子拓印高分子(Molecular Imprinted Polymer;MIP)技術來萃取並純化金銀花中的有效成分。分子拓印高分子乃目前常用來辨識分子的合成高分子,主要是利用官能基分子(Function Monomer)與模版分子(Template)之間的相互作用力,達到分離的效果,是一種具特異選擇性辨識方法,通常當層析管柱的充填物可加強純化的效果。
在一實施例中,利用上述分子拓印高分子對所得之金銀花粗萃物進行純化的方法包括:準備欲萃取之一有效成分以作為一模板分子,接著利用一官能單體(Functional monomer)捕捉上述模板分子,再將上述官能單體(Functional monomer)與一基材(Matrix)單體進行一聚合反應,然後去除上述有效成分以得到一分子拓印材料。在一實施例中,上述有效成分可包括:綠原酸(chlorogenic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)、熊果酸(ursolic acid)、或上述之組合。比起基材單體,官能單體具有羧酸基,可與有效成分形成氫鍵以利於捕捉有效成分,上述官能單體可具有羧酸、磺酸、或雜環基(例如含氮、氧的環類),或可包括但不限於:甲基丙烯酸(Methacrylic Acid,MAA)、丙烯酸(Acrylic acid,AA)、衣康酸(Itaconic acid)、乙烯基苯甲酸(4-vinylbenzoic acid)、丙烯氨基-甲基丙烷磺酸(2-Acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid)、2-乙烯基吡啶(2-Vinylpyridine)、4-乙烯基吡啶(4-Vinylpyridine)、或上述之組合。上述基材單體可包括但不限於:甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate,MMA)、4-二乙烯基苯(4-divinylbenzene)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene glycol dimethacrylate,EGDMA)、或季戊四醇三丙烯酸酯(Pentaerythritol triacrylate,PETA)。
然後,再將上述分子拓印材料裝入一管柱或一濾袋中;並且將上述金銀花粗萃物選擇性地(optionally)經過一濃縮及/或冷凍乾燥步驟後,再溶於乙醇/或甲醇中以得到一金銀花粗萃物乙醇/或甲醇溶液,並使其通過上述管柱或上述濾袋,以利用上述管柱或上述濾袋中的分子拓印材料捉取金銀花粗萃物中的有效成分。上述乙醇或甲醇濃度介於約30-95 vol%,較佳介於約60-95 vol%,若乙醇濃度低於30 vol%或高於95 vol%,則金銀花粗萃物的溶解度降低,進而降低純化步驟的回收率。在另一實施例中,上述利用分子拓印高分子進行純化的步驟,亦可直接使用前述未經濃縮之金銀花粗萃物,使其通過上述管柱或上述濾袋,以利用上述管柱或上述濾袋中的分子拓印材料捉取金銀花粗萃物中的有效成分。最後利用例如40-60℃的溫水,流洗出上述有效成分並收集以得到一金銀花萃取物。
本發明所使用的分子拓印高分子(Molecular Imprinted Polymer;MIP)技術乃運用短管柱層析(<10 cm)或是浸泡過濾方式使得分離的效果較為模糊,以同時獲得尺寸相當且含同樣官能基的數種活性成分,如綠原酸(chlorogenic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)、以及熊果酸(ursolic acid)等,對青春痘照護相關產品而言,本發明之金銀花萃取物可同時具備抗病原菌痤瘡桿菌及其他共生菌如金黃色葡萄球菌的效果,更具應用於青春痘照護相關材料的機會。
在一實施例中,本發明之銀花萃取物的製備方法更可包括經高分子拓印純化得到一金銀花萃取物之後,對此金銀花萃取物進行一濃縮與冷凍乾燥步驟以得到一固態的金銀花萃取物。
在一實施例中,由上述金銀花萃取物的製備方法所得之金銀花萃取物可作為一皮膚用藥,其中上述皮膚用藥中之未經高分子拓印純化過程,直接進行過濾、濃縮與冷凍乾燥步驟的金銀花粗萃取物濃度大於約10 mg/mL,若為經高分子拓印純化過程、濃縮與冷凍乾燥步驟之固態的金銀花萃取物,則其濃度大於約0.1 mg/mL,較佳介於約0.5-10 mg/mL。上述藥物的型態可包括但不限於:乳液型、貼片型、或膠體型,提供青春痘照護一種新的中草藥選擇標的。
綜上所述,本發明所提供之金銀花萃取物,除了具備金銀花之抗金黃色葡萄球菌(Staphy1ococcus aureus)的功效外,更發現其具備抗痤瘡桿菌的能力,因此本發明之金銀花萃取物能同時抗造成青春痘(痤瘡)病原的痤瘡桿菌(Propionibacterium acnes),與共生菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),可應用於皮膚用藥並具有青春痘照護的條件。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂,下文特舉出實施例,作詳細說明如下:
實施例1. 製備金銀花粗萃物
將200g乾燥後金銀花運用均質機,於大於10,000 rpm高速轉速下,進行原料料微小化及細胞壁的破碎,預期透過高速細胞破碎輔助萃取製程,提高活性物質萃取率。
接著將微小化後的金銀花粉末,添加1.8升95%高濃度酒精為溶劑,攪拌混合均勻後,室溫下(25℃)以超音波設備進行萃取2小時。
再進行一過濾步驟:經超音波萃取後的萃取液,以TOYO定性濾紙NO1(孔徑6 μm/厚度0.2 mm/直徑110 mm/濾紙材質:棉纖維)進行過濾以去除固體渣,每張濾紙過濾使用時間約45秒即更換濾紙,避免濾紙阻塞。
接著進行一濃縮步驟:過濾後的濾液,利用旋轉減壓濃縮機去除溶劑,水浴溫度:40℃,真空度650-720 mmHg;將初始體積約2000 ml,濃縮約至300 ml,再加入2倍二次去離子水,再濃縮至200 mL,分裝成兩袋,每袋約100 ml,放置-20℃冰箱一天。
最後進行一冷凍乾燥步驟:利用真空冷凍乾燥機(溫度:-86.9℃、真空度:4.9Pa),乾燥時間約兩天,去除多於水分及溶劑,得到乾燥後的粗萃物以利後續成分使用。要進行MIP純化的樣品則省略此冷凍乾燥步驟。
實施例2. 金銀花粗萃物成分分析及抗痤瘡桿菌、金黃色葡萄球菌的效果
測試菌種以培養液於厭氧狀態下37℃培養24~48小時,於2天後以培養液進行系列10倍稀釋調整細菌濃度。測試細菌濃度為106-107 CFU/mL。試驗物質與測試細菌以適當體積比例混合,並使各別最終濃度為50、40、30、20、10、0.5、0.3 mg/mL等所需濃度與(1~5)×106 CFU/mL(上述濃度實驗時的測試細菌分別為2.7×106、2.5×106、2.5×106、2.5×106、3.5×106、6.5×106、9.2×106 CFU/mL)。於設計之時間點取出0.1 mL混合培養液塗抹於洋菜培養基上,放置於37℃培養箱於厭氧狀態下培養24~48小時,於菌落出現後進行計數。
抑菌率=(A-B)/A×100%
因長青春痘時,除痤瘡桿菌外常伴隨金黃色葡萄球菌等共生菌,而粗萃取也含綠原酸,表1顯示金銀花95%酒精粗萃物20 mg/mL與對照組處理金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,ATCC 6538P)18小時後之抑菌效果,其數據顯示本發明之金銀花酒精粗萃物具抑金黃色葡萄球菌的效果,因而可加強治療青春痘的效果。
參見表2,係探討以不同酒精濃度萃取之金銀花粗萃物的抗菌效果。其中以95%酒精粗萃物的抗痤瘡桿菌效果較佳,由粗萃物的成分分析(HPLC)推斷,應是齊墩果酸與熊果酸的貢獻,令95%的酒精粗萃物具抗痤瘡桿菌的能力。
為驗證抗痤瘡桿菌的活性物質種類,選用標準品評估其抗痤瘡桿菌的效果,表3與表4顯示不同標準品定量菌種培養計數法結果,其中齊墩果酸(Oleanolic acid)、熊果酸(Ursolic acid)具抗痤瘡桿菌的效果、而綠原酸(Chlorogenic acid)反而會令痤瘡桿菌孳生。
表5係根據本發明實施例2,顯示不同濃度粗萃物定量菌種培養計數法結果。由表5可知以95%酒精萃取金銀花所得之金銀花粗萃物,其濃度大於20 mg/ml時的抗痤瘡桿菌(ATCC 6919)效果可達98%以上。
第1a-1d圖係根據本發明實施例1,顯示金銀花粗萃物經過HPLC成分分析扣除層析液背景值所得之結果,其中第1d圖顯示以95%酒精萃取金銀花所得之金銀花粗萃物的成分,可明顯看出其具有綠原酸(chlorogenic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)、以及熊果酸(ursolic acid)等活性成分(齊墩果酸與熊果酸的延遲時間之峰值幾乎重疊)。
實施例3. 金銀花粗萃物進行分子拓印方式純化得到金銀花萃取物
分子拓印高分子製備方式:將模板分子(Oleanolic acid)60mg,與1.5 ml甲基丙烯酸(Methacrylic Acid,MAA)攪拌均勻後,加入10.5ml甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate,MMA)溶液中再混合攪拌均勻,並一邊吹入氮氣除氧。接著將上述溶液在惰性氣體下加熱至70℃,再加入10 mg的偶氮二異丁腈(2,2-azobisisobutyronitrile,AIBN,Initiator),持續約2~3小時至形成高分子聚合物。再將上述聚合物以機械力粉碎,研磨成細緻粉體,並以100網目金屬網過篩。然後將過篩的白色粉末狀MIP材,加入60℃溫水中以洗去模板分子,清洗數次後乾燥,以得乾燥後的MIP材(分子拓印高分子)。
分子拓印方式純化方式:乾燥後的金銀花粗萃物先溶於30%或70%酒精中。取上述乾燥後MIP材,裝入短管柱中,或裝入濾袋中,然後將上述金銀花粗萃物乙醇溶液通過上述管柱或上述濾袋,以利用上述管柱或上述濾袋中的上述分子拓印材料捉取上述金銀花粗萃物中與齊墩果酸(Oleanolic acid)相似官能基的熊果酸(Ursolic acid)及綠原酸(Chlorogenic acid)等活性成分,最後再將已捉取活性成分的MIP,加入60℃溫水中以沖提出活性成分並收集,透過冷凍乾燥方式,乾燥純化後得到一固態的金銀花萃取物。
第2a-2b圖係根據本發明實施例,顯示以HPLC分析純化後的金銀花萃取物之成分。第2a圖顯示未經過分子拓印純化之金銀花粗萃物的HPLC成分分析結果(已扣除層析液背景值)。第2b圖顯示經過分子拓印純化之金銀花萃取物的HPLC成分分析結果。在第2b圖之經過分子拓印純化之金銀花萃取物中,以延遲時間(Retention time)3.49峰(綠原酸)及63.15峰(oleanolic acid)為例,各比第2a圖提高>10%及2倍的純度,第2a-2b圖之HPLC分析結果所計算出之組成成分比例係整理於表6。
實施例4. 比較金銀花粗萃物與純化後之固態的金銀花萃取物的抗痤瘡桿菌效果
分析含20 mg/ml乾燥之金銀花粗萃取物的抗痤瘡桿菌效果為98%。表7係根據本發明實施例3,分子拓印純化後的金銀花萃取物定量菌種培養計數法結果。而純化後萃取物之中齊墩果酸(Oleanolic acid)提高2倍,其僅需含10 mg/ml乾燥之固態的金銀花萃取物即可達到>99.99%抗菌效果。
實施例5. 金銀花粗萃取物的DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl)抗氧化分析
配製1000 ppm的粗萃取液5 ml,再取0.0197 g之DPPH(MW=394.32),配製成50 ml之甲醇溶液(濃度為1 mM),接著取萃取液5ml,加入1 ml新配製之DPPH(1 mM),混和靜置30分鐘,於517 nm測其吸光值。以萃取液之溶劑取代樣品做為控制組。
DPPH自由基清除能力百分率=[1-(樣品吸光值/未加樣品之控制組吸光值)]×100
第3圖係根據本發明之實施例5,顯示以不同濃度的乙醇對金銀花進行粗萃,所得之金銀花粗萃物之DPPH自由基清除能力,其中以維他命C與維他命E作為控制組,當今銀花粗萃物濃度為250 ppm時即具備超過80%的DPPH去除能力,且接近約95%之維他命C及維他命E的DPPH去除能力水準。表8係顯示根據第3圖之DPPH測試結果所得之抗氧化能力。
透過標準品驗證抗痤瘡桿菌的效果,數據顯示Oleanolic acid(齊墩果酸)、Ursolic acid(熊果酸)具抗痤瘡桿菌的效果,而因青春痘照護相關產品因最好具備抗病原菌痤瘡桿菌及其他共生菌如金黃色葡萄球菌效果,因此最好萃取純化過程能包含幾項活性物質,如綠原酸(chlorogenic acid)、齊墩果酸(oleanolic acid)、以及熊果酸(ursolic acid)等,因此的分子拓印高分子運用於短管柱(<10cm)層析或是浸泡過濾的純化,有機會同時提高金銀花萃取物多項活性物質,更具應用於青春痘照護相關材料的機會。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何所屬技術領域中具有通常知識者,在不脫離本發明之精神和範圍內,當可作任意之更動與潤飾,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1a-1d圖係根據本發明實施例,顯示金銀花粗萃物經過HPLC成分分析所得之結果(已扣除層析液背景值),其中第1a-1d圖分別顯示以標準品、與30%、60%、以及95%酒精萃取金銀花所得之金銀花粗萃物的成分。
第2a-2b圖係根據本發明實施例,顯示以HPLC分析純化後的金銀花萃取物之成分(已扣除層析液背景值),其中第2a圖顯示未經過分子拓印純化之金銀花粗萃物的HPLC成分分析結果,第2b圖顯示經過分子拓印純化之金銀花萃取物的HPLC成分分析結果。
第3圖係根據本發明之實施例,顯示以不同濃度的乙醇對金銀花進行粗萃,所得之金銀花粗萃物之DPPH自由基清除能力。

Claims (10)

  1. 一種金銀花萃取物,其組成包括:20-50重量份的綠原酸(chlorogenic acid);1-5重量份的齊墩果酸(oleanolic acid);以及0.001-5重量份的熊果酸(ursolic acid)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之金銀花萃取物,其組成包括:20-30重量份的綠原酸(chlorogenic acid);3-5重量份的齊墩果酸(oleanolic acid);以及0.002-5重量份的熊果酸(ursolic acid)。
  3. 一種金銀花萃取物的製備方法,包括:利用一包含乙醇的極性溶劑,對金銀花進行一超音波萃取,以得到一金銀花粗萃物,其中該超音波萃取溫度介於約15-45℃。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之金銀花萃取物的製備方法,其中該超音波萃取時間介於約1-5小時。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之金銀花萃取物的製備方法,其中該包含乙醇的極性溶劑中乙醇濃度介於約50-95 vol%。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之金銀花萃取物的製備方法,其中該包含乙醇的極性溶劑中乙醇濃度介於約70-95 vol%。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之金銀花萃取物的製備方法,進一步包含一對該金銀花粗萃物進行一分子拓印純化製程以得到一如申請專利範圍第1或2項所述之金銀花萃取物之步驟。
  8. 一種皮膚用藥,包括如申請專利範圍第1項所述之金銀花萃取物。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之皮膚用藥,其中該金銀花萃取物的濃度>0.1 mg/mL。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之皮膚用藥,其中該藥物的型態包括:乳液型、貼片型、或膠體型。
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