TW201311648A - 製造光學活性（ｒ）－（－）－１－（２，４－二氯－苯基）－２－咪唑－１－基－乙醇的方法 - Google Patents

製造光學活性（ｒ）－（－）－１－（２，４－二氯－苯基）－２－咪唑－１－基－乙醇的方法 Download PDF

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Olondriz Francisco Marquillas
Sauter Antoni Planas
Javierre Xavier Perez
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Interquim Sa
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Abstract

本發明提供藉由生物催化不對稱還原1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(Ⅱ)製造(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇(I)之方法。本發明亦提供從(I)製造阿拉康唑(Arasertaconazole)之方法。

Description

製造光學活性( R )-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇的方法
本發明提供以簡易方式使用具有商業優勢之微生物之不對稱還原從1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(DCPE)製造光學活性(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇((R)-DCPI)之方法。
(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇(I)為用於合成被稱為(R)-舍他康唑及其鹽類之化合物所需的對掌性中間物，該舍他康唑及其鹽類為具有針對人類及動物的真菌及酵母之活性之抗真菌劑。
存在諸如以下已知方法用於製造光學活性中間物(R)-DCPI： 根據在英國專利第1244530號以及在Lämmerhofer M.及Linder W.(對掌性，1994年6月，第261 頁至第269頁)中描述之方法的具有光學活性酸之相應消旋混合物之解析度； 使用具有可接受光學純度之(-)-β二異松蒎基氯硼烷之1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(II)的鏡像選擇性還原(WO03/068770)； 具有鹼性脂肪酶或施氏假單胞菌脂肪酶之消旋醇之生物合成解析度(CN1765887)；及 在存在NADH(1,4-二氫-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸)之情況下具有ADH-A(乙醇脫氫酶A)之2-氯-1-(2,4-二氯苯基)的生物還原(由Mangas-Sanchez，J.等人所著，2011年第76(7)期之有機化學日記之第2115頁至第2122頁)提供相關對掌性結構單元(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，該(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇可使用在100℃下作為溶劑之氫化鈉(NaH)及N,N-二甲基甲醯胺(DMF)經由具有咪唑之親核取代反應化學轉變為(R)-DCPI。作者報告說藉由獨立乙醇脫氫酶獲得鏡像純DCPI之DCPE之所欲還原失敗。如此使得作者去發現製造(R)-DCPI之上述替代生物合成途徑。
本文報告之方法為用於從DCPE製造具有高光學純度之(R)-DCPI中間物之首個綠色生物催化方法。此外，一直沒有用於藉由使用能夠不對稱還原1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(II)之微生物從1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(II)製造光學活性(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1- 基-乙醇之已知方法。
本發明提供用於以簡單、高效且容易之方式，藉由用微生物生物催化不對稱還原酮化合物DCPE(II)來製造光學活性(R)-DCPI(I)之方法。
因此，本發明之一方面為提供將1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(II)還原為光學活性(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇(I)之生物催化方法。
更特定言之，用於製造光學活性(R)-DCPI(I)之方法包含以下步驟：允許微生物作用於1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(II)，該微生物具有酮之不對稱還原活性；及回收或收集所製造的光學活性(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇(I)。
本發明亦係關於用於從如上所述獲得之(R)-DCPI製造阿拉康唑之方法。
本發明之作者已發現，具有酮的不對稱還原活性之微生物能夠作用於1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(DCPE)來以非常容易、簡單且有效之方式製造相應的光學活性(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇((R)-DCPI)。
因此，在第一方面中，本發明提供用於製造光學活性(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇(I)之方法，該方法包含以下步驟：使式(II)化合物接觸微生物，其中該微生物具有酮的不對稱還原活性；及回收所如此製造之式(I)化 合物。
用於此方法中之微生物為能夠從DCPE製造(R)-DCPI之任何微生物。因此，如本文中所使用之術語「微生物」代表任何微觀有機物，包括細菌、真菌、微型藻類、原生生物，及古細菌。另外，為了執行本發明之方法，該微生物可為該微生物之個別細胞、該等細胞之菌種，或經加工之細胞之形式。
如本文中所使用，術語「經加工之細胞」”processed cells”包括經處理(treated)之細胞，諸如例如，經乾燥之細胞或經凍乾之細胞。因此，根據本發明之微生物可用作活的或死亡的有機物之濕細胞塊。在一較佳具體實例中，將微生物用作洗後之細胞塊，該細胞塊已經由離心作用隔離且吸收了生理鹽水。
能夠從1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(II)形成光學活性之(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇(I)之任何微生物皆可用於本發明之方法。具有該活性之微生物之說明性、非限制性實例為屬於酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖壺菌(Schizochytrium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、赤球菌屬(Rhodococcus)及假單胞菌屬(Pseudomonas)之彼等實例。特定言之，該等微生物之實例為屬於啤酒酵母菌、裂殖壺菌、開菲爾乳酸桿菌、赤紅球菌及螢光假單胞菌物種之彼等實例。赤紅球菌為根據本發明之較佳微生物。
在特定具體實例中，能夠從DCPE製造(R)-DCPI之菌 株的特定實例可包括啤酒酵母菌CECT 1170菌株、開菲爾乳酸桿菌DSMZ 20587菌株、赤紅球菌DSMZ 44541菌株、螢光假單胞菌CECT 378菌株，及裂殖壺菌菌株ATCC MYA-1381。
經由CECT編號識別之微生物列於來自「Colección Espaola de Cultivos Tipo」之目錄中且可自CECT網頁(www.cect.org)獲得。經由DSMZ編號識別之微生物列於由「Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen」出版之菌株目錄中且可自DSMZ網頁(www.dsmz.de)獲得。經由ATCC編號識別之微生物列於來自「美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)」之目錄中且可自ATCC網頁(www.atcc.org)獲得。
在本發明中，微生物可為野生型菌株，經由諸如細胞融合或基因操縱之基因工程技術獲得之其變體或重組體，只要彼等細胞具有從1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙酮(II)形成光學活性(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇(I)之能力。
用於生長本發明之微生物之培養基不受限制，只要微生物可以在該培養基中生長與繁殖。培養基通常包括，例如，碳源(醣類；醇類；有機酸；碳氫化合物；其他碳源)及氮源(無機酸銨鹽；有機酸銨鹽；無機或有機含氮化合物，諸如酵母萃取物、肉類萃取物、麥芽萃取物、大豆萃取物、蛋白腖、聚蛋白腖、尿素，等等)。在培養基中，可能併入常見用於培養微生物之適當量之彼等培養基，諸 如無機鹽、微量金屬鹽及維他命。在必要時，可以添加促進繁殖微生物之因素、改良製造本發明之目標化合物的能力的因素及維持培養基(諸如緩衝物質)之pH值之化合物。在特定情況下，用於生長酵母細胞、細菌細胞及微型藻類之較佳培養基如下：
酵母培養基：
細菌培養基：
微型藻類培養基：
微生物之培養可在對於微生物之生長及繁殖之最佳條件下進行，例如在5至9之pH值下且在20℃至50℃之溫度範圍中進行。培養可在厭氧或缺氧狀態中進行一至五天。
在本發明之方法之第一步驟中，使式(II)化合物與根據本發明之微生物接觸。存在可根據本發明之方法使用之熟知技術可將式(II)化合物與微生物接觸且允許微生物將DCPE不對稱地還原。
作為一實例，該方法包含將DCPE化合物與培養液混合或摻合以進行反應。
或者，在微生物細胞於緩衝溶液、水中清洗時或之後，將微生物細胞從再懸浮之培養液分離(例如經由離心作用、過濾，等等)，且然後將DCPE添加至生成之細胞懸浮液(靜止細胞)以進行反應。
在另一具體實例中，根據本發明之方法可使用細胞之經處理製劑(諸如經乾燥之細胞或細胞之經凍乾製劑)而非活細胞。
在另一特定具體實例中，如上所述之整個細胞或細胞製劑可經由用於本發明之方法的已知方法固化。作為一實例，微生物可實體地嵌入聚合物基質中。可以使用許多不同程序，使用非常廣泛的各種材料製備此類型之基質，例如使用具有低分子量之不飽和羧酸的聚合物，諸如丙烯酸及其衍生物。
在許多情況下，添加還原力來源，如NAD(P)H、葡萄糖、蔗糖、乙醇、異丙醇、甲醇、甲酸鹽之鹽等以達成較好產率。可直接使用DCPE(II)，或在不干擾反應之有機溶劑(例如醇類、二甲亞碸(DMSO))中溶解DCPE(II)而使用。
在微生物或其製劑之活性最佳的條件範圍內設定反應條件。因此，在較佳具體實例中，該等條件包括5至9之pH值範圍、20至50℃之溫度，並攪拌達大約1至120小時。在另一較佳具體實例中，以濕細胞計算細胞濃度在1至300 g/l的範圍之內。
根據本發明之方法製造的光學活性(R)-DCPI(I)可經由習知程序恢復或收穫，諸如例如細胞或其細胞製劑之分離(離心作用、過濾)及純化(用有機溶劑萃取、結晶、再結晶、層析法、濃縮及蒸餾)。可使用有機溶劑中之任一者(諸如丁醇之醇類；諸如己烷、環己烷、甲苯之碳氫化合物；諸如乙酸乙酯之酯類；酮類；醚類及其混合物)。可使用諸如三氯甲烷及二氯甲烷之鹵化烴。
如上所述，根據本發明之方法獲得之(R)-(-)-1-(2,4-二氯-苯基)-2-咪唑-1-基-乙醇(I)可用於製備舍他康唑(阿拉康唑)之(R)-鏡像異構物。
因此，在第二方面中，本發明亦代表用於製造舍他康唑(阿拉康唑)之(R)-鏡像異構物之方法，該方法包含將式 (II)化合物與微生物接觸，其中該微生物具有酮的不對稱還原活性；及用式(III)化合物將所得化合物(R)-DCPI(I)氧烷基化。
其中L為離去基。
常見離去基包括經取代苯甲酸鹽、鹵化物、磺酸鹽及全氟烷基磺酸鹽。離去基之非限定實例包含氯化物、溴化物、碘化物、甲苯磺酸鹽、甲磺醯基，及三氟甲基磺醯基。
阿拉康唑用適當酸之進一步處理可形成醫藥學上可接受的鹽。因此，所獲得之阿拉康唑，或其醫藥學上可接受的鹽可用於製備醫藥組合物。
現將更詳細地描述本發明，例如其決不意謂限制本發明之範疇，而更確切而言，該等實施例將用來參照隨附圖式圖示本發明。
實施例
本發明之方法之一般程序的實施例解釋如下：該方法可分為三個步驟。第一個步驟包括微生物生長及將生物質隔離以獲得活細胞或其製劑。第二步驟對應於經由微生物或在第一步驟中獲得之其製劑進行的生物轉化方法。最終，執行分析程序以決定獲得之(R)-DCPI的產率 及鏡像立體異構物純度。
1.細胞生長
為了培養用於本發明之微生物，可沒有限制地使用任何培養基，只要該等微生物可生長於該培養基中。然而，典型的較佳培養基如下：
酵母培養基：
細菌培養基：
微型藻類培養基：
將裝有如上所述500 ml之細胞製備培養基之2 L錐形瓶在121℃之溫度下熱壓殺菌達15分鐘，且灌入先前所述之一種微生物。將灌入的燒瓶在最佳生長溫度(通常30℃) 下搖動地(150至220 rpm)培養兩天。當生長的培養物達成8或以上之OD600，細胞可藉由離心作用隔離。隨後，將細胞用0.9%氯化鈉洗淨且在反應緩衝液(在30℃下，pH值為8的100 mM磷酸鈉緩衝液)中再懸浮以獲得靜止細胞。
2.一般生物轉化條件
將具有100 mg之DCPE(II)及160 mg之葡萄糖懸浮於100 mM磷酸鈉緩衝液中的反應燒瓶灌入上述製備之一定體積靜止細胞，以在40 ml之最終容積中達成所要之細胞濃度。該反應在30℃下於軌道搖動器(200 rpm)上進行三天。
在完成反應之後，懸浮液之pH值轉變至pH值12，且用乙酸乙酯(3x20 ml)萃取產物。各相之間的分離係經由離心作用(10000 rpm，15分鐘)達成。將溶劑蒸發以獲得棕黃色固體，該棕黃色固體在1M氫氯酸溶液中溶解。用乙酸乙酯(3x10 ml)萃取雜質。然後，將溶液用氫氧化鈉調節至pH值>12，且用乙酸乙酯(3x10 ml)萃取(R)-DCPI(I)。將溶劑蒸發且將製造及淨化的(R)-DCPI(I)溶於適當溶劑中用於高效液相層析法(high performance liquid chromatography；HPLC)分析。
3.用於測定產率及鏡像立體異構物純度之分析程序
DCPE生物轉化為(R)-DCPI之產率及鏡像立體異構物純度測定係使用對掌性解析度柱[Chiradex(5 μm,250x4.0mm)；移動相(甲醇/三乙胺0.2%,pH值6=25/75)]；柱溫：30℃；偵測：吸收率225 nm；流速：0.8 ml/min]。近似保持時間：DCPE 11分鐘；(R)-DCPI 17 分鐘；(S)-DCPI 19分鐘。
在此一般程序之內，可針對每一特定情況(諸如微生物、共溶劑，及共基質)進一步調整或最優化不同參數。彼等參數為：‧ DCPE-生物質量比率：起始材料DCPE與生物質量(以濕細胞計)之間的比率；‧ 存在10%的DMSO之情況下的DCPE-生物質量比率；‧ 共基質效應：用作還原力的共基質之影響；‧ 共溶劑效應：用以溶解DCPE的共溶劑之影響；‧ 溫度設定研究；‧ 反應時間設定研究；‧ 反應pH值設定研究；已使用赤紅球菌靜止細胞進行研究。
實施例1：DCPE-生物質量比率
為了研究化合物DCPE的量與細胞濃度(生物質量)之間的關係，按照一般程序中所述製備赤紅球菌之靜止細胞。以不同DCPE-靜止細胞比率執行若干反應，且測定獲得的產物(R)-DCPI(I)之產率及鏡像立體異構物純度(表1)。
將具有100 mg之DCPE(II)及160 mg之葡萄糖懸浮於100 mM磷酸鈉緩衝液中的反應燒瓶灌入如上所述製備之一定體積赤紅球菌靜止細胞，以在40 ml之最終容積中達成所要之細胞濃度。該反應在30℃下於軌道搖動器(200 rpm)上 進行三天。對於後處理操作，隨後進行一般程序。結果顯示於表1中。
對於低於50 mg/g的DCPE-生物質量比率，達成高轉化率。在後處理之後的產率超過60%，(R)-DCPI之鏡像立體異構物純度高。
實施例2：存在10%的DMSO之情況下的DCPE-生物質量比率
為了研究10%的DMSO存在於建立在第一實施例中之DCPE-生物質量比率的影響。為此目的，按照在一般程序中所述製備赤紅球菌之靜止細胞，且以不同DCPE-靜止細胞比率執行若干反應。測定獲得的產物(R)-DCPI(I)之產率及鏡像立體異構物純度(表2)。
將具有100 mg之DCPE溶於4 ml DMSO及160 mg葡萄糖的反應燒瓶灌入100 mM磷酸鈉緩衝液及上述製備之一定體積靜止細胞，以在40 ml之最終容積中獲得所要之細胞濃度。該反應在30℃下於軌道搖動器(200 rpm)上進行三天。
在完成反應之後，懸浮液之pH值轉變至pH值12，且用乙酸乙酯(3x20 ml)萃取產物。各相之間的分離係經由離心作用(10000 rpm，15分鐘)達成。將溶劑蒸發以獲得棕黃色油。DMSO痕量係經由在旋轉蒸發器中與水共蒸餾移除。如上已所述一般程序之後接下來的步驟。結果顯示於表2中。
雖然在某些狀況下，轉換率值高於實施例1中的轉換率值，但是在存在10%的DMSO之情況下進行的實驗中之後處理之後達到的產率可與實施例1之結果相當。(R)-DCPI鏡像異構物之鏡像立體異構物純度高。
實施例3：對無作為共基質之葡萄糖之效應
將DCPE-生物質量比率設定為28 mg/g，在存在且不存在作為共溶劑之DMSO情況下研究作為共基質之葡萄糖之影響(表3)。
將具有100 mg之DCPE的反應燒瓶灌入100 mM磷酸鈉緩衝液及一定體積赤紅球菌之靜止細胞，以在40 ml之最終容積中達成90 g/l之細胞濃度(以濕細胞計；對應於28 mg DCPE/g細胞之生物質關係)。該反應在30℃下於軌道搖動器(200 rpm)上進行三天。結果顯示於表3中。
與實施例1及實施例2相比，無共基質(作為還原力之葡萄糖)顯著影響轉換反應產物，且將產率減半。(R)-DCPI鏡像異構物之鏡像立體異構物純度高。
實施例4：共溶劑濃度研究
在細胞濃度之最優條件中且在存在作為共基質之葡萄糖的情況下執行反應。在介於0-10%的範圍之間測試兩種溶劑(DMSO及異丙醇)。
將具有25 mg DCPE、一定體積共溶劑(DMSO，異丙醇)及40 mg葡萄糖(視情況而定)之反應燒瓶灌入100 mM磷酸鈉緩衝液及一定體積赤紅球菌之靜止細胞，以在10 ml之最終容積中達成90 g/l之細胞濃度(以濕細胞計；對應於28 mg DCPE/g細胞之生物質關係)。該反應在30℃下於軌道搖動器(200 rpm)上進行三天。在完成反應之後，懸浮液之pH值轉變至pH值12，且用乙酸乙酯(3x20 ml)萃取產物。各相之間的分離係經由離心作用(10000 rpm，15分鐘)達成。將溶劑蒸發以獲得棕黃色油。DMSO痕量係經由在旋轉蒸發器中與水共蒸餾移除。如上已所述一般程序之後的 接下來步驟。結果概括於表4中。
(*)：鏡像立體異構物純度
作為共溶劑之異丙醇之存在顯著地影響所感興趣反應的轉化率之產率。此外，當將異丙醇用作共基質(無葡萄糖)時，達到不良轉化率。以0至10%的DMSO進行之反應達成優良轉化產率。
實施例5：反應溫度設定
根據在先前實施例中發現的最優條件，反應在自20℃至50℃的溫度範圍中進行。
將具有25 mg之DCPE及40 mg之葡萄糖的反應燒瓶灌入100 mM磷酸鈉緩衝液及一定體積赤紅球菌之靜止細胞，以在10 ml之最終容積中達成90 g/l之細胞濃度(以濕細胞計；對應於28 mg之DCPE/g細胞之生物質關係)。該 反應在30℃下於軌道搖動器(200 rpm)上進行三天。在24小時及72小時之反應時間取出0.5 ml樣本且用1 ml之甲醇將樣本稀釋。在混合樣本之後，經由離心作用分離赤紅球菌靜止細胞。自由細胞上澄液之樣本係用甲醇稀釋且在上文報告之方法之後經由HPLC分析。
當反應在30℃下進行時，將達成定量轉化率。低於30℃之溫度將減緩反應，而對於在37℃及50℃下進行的反應，會達成不良轉化率。
實施例6：反應時間設定
為了研究反應之進度，在不同反應時間(從1小時至92小時)取出不同樣本。
將具有25 mg之DCPE及40 mg之葡萄糖的反應燒瓶灌入100 mM磷酸鈉緩衝液及一定體積赤紅球菌之靜止細胞，以在10 ml之最終容積中達成90 g/l之細胞濃度(以濕細胞計；對應於28 mg之DCPE/g細胞之生物質關係)。該反應在30℃下於軌道搖動器(200 rpm)上進行四天。在不同反應時間取出0.5 ml樣本且用1 ml之甲醇將該樣本稀釋。在混合樣本之後，經由離心作用分離赤紅球菌靜止細胞。自由細胞上澄液之樣本係用甲醇稀釋且根據上文報告之方法經由HPLC分析。
結果顯示於表5中。
EP：鏡像立體異構物純度
對於在本實施例中使用的反應條件，完全的轉換係在小於2天的反應中達成。
實施例7：反應pH值設定
根據在先前實施例中發現的最優條件，反應係在自5至9的pH值範圍內進行。
將具有25 mg之DCPE及40 mg之葡萄糖的反應燒瓶灌入100 mM磷酸鈉緩衝液及一定體積赤紅球菌之靜止細胞，以在10 ml之最終容積中達成90 g/l之細胞濃度(以濕細胞計；對應於28 mg之DCPE/g細胞之生物質關係)。該反應在30℃下於軌道搖動器(180 rpm)上進行兩天。在18小時及40小時之反應時間取出0.2 ml樣本且用1.8 ml之甲醇將樣本稀釋。在混合樣本之後，經由離心作用分離赤紅球菌靜止細胞。自由細胞上澄液之樣本係用甲醇稀釋且在上文報告之方法之後經由HPLC分析。
結果顯示(第1圖)當反應的pH值範圍在7與8之間時達成之定量轉化率，其中pH值為8時的轉化率更快。低於7的pH值減緩反應，且在反應40小時之後達成不良轉化率。當反應在pH值為9時進行時，在40小時之後達成80%的轉化率。
實施例8：DCPE之半製備生物催化還原
設定在先前實施例中研究的所有參數之最優條件，在pH值為7.9的100 mM磷酸鹽緩衝液中之130 ml之90 g/L的赤紅球菌靜止細胞懸浮液中執行以400 mg之DCPE及700 mg之葡萄糖開始的製備反應。該反應在30℃下於軌道搖動器(180 rpm)上進行三天。在不同反應時間取出0.5 ml樣本且用1 ml之甲醇將該樣本稀釋。在混合樣本之後，經由離心作用分離赤紅球菌靜止細胞。自由細胞上澄液之樣本係用甲醇稀釋且根據上文報告之方法經由HPLC分析。
在完成反應之後，懸浮液之pH值轉變至pH值12，且用乙酸乙酯(4x50 ml)萃取產物。各相之間的分離係經由離心作用(10000 rpm，12分鐘)達成。將溶劑蒸發以獲得棕黃色油，該棕黃色油在1M氫氯酸溶液中溶解。用乙酸乙酯(3x10 ml)萃取帶色雜質。然後，將溶液用氫氧化鈉調節至pH值>12，且用乙酸乙酯(3x10 ml)萃取(R)-DCPI。將有機相用硫酸鈉乾燥，且將溶劑移除以得出淡黃色玻璃狀物質。將物質從己烷(25 ml)再結晶以得出作為淡黃色固體之產物(R)-DCPI(產率概括於表6中)。
EP：鏡像立體異構物純度
在後處理之後，完成產物(R)-DCPI之光譜特徵化(1H-NMR、13C-NMR、FT-IR及比旋光度)。
1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ 3.84(dd,J=8.4及14.4 Hz,1H)、4.18(dd,J=2及14 Hz,1H)、5.20(dd,J=2.4及8.4,1H)、6.78(s,1H)、6.88(s,1H)、7.28(dd,J=2及8.4 Hz,1H)、7.33(s,1H)、7.38(d,J=2,1H)、7.58(d,J=8.4 Hz,1H).
13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ 53.5、69.4、119.5、127.6、128.2、128.7、129.0、131.9、134.1、137.5
FT-IR(cm-1)3420 st(O-H)、3114 st(C-H，雜環)、1515 st(C-N)、1077 st(C-Cl，芳族)
[α]25 D=-95.54(c=1.0003,MeOH,ee 97%)；標準(R)-DCPI[α]25 D=-98.94(c=1.0097,MeOH).
從400 mg之DCPE開始並且接著在先前實施例(在pH值為7.9的磷酸鹽緩衝液中之90 g/l的靜止細胞，生物質量 比率34 mg/g細胞及3天)中發現的最優條件可獲得定量轉化率。在後處理之後，獲得319 mg之(R)-DCPI(99%轉化率、80%產率)。根據與(R)-DCPI標準之獨立樣本相比的光譜資料，將產物識別為(R)-DCPI。
以下實施例顯示在篩選條件下DCPE與其他微生物之生物催化還原的研究。
實施例9：經由螢光假單胞菌之DCPE的生物催化還原
在具有從3毫升培養物製備的1 ml螢光假單胞菌靜止細胞之艾本德(Eppendorf)管中，添加DCPE(20mM)及葡萄糖(22 mM)。實驗條件及結果概括於表7中。
EP：鏡像立體異構物純度
實施例10：經由啤酒酵母菌之DCPE的生物催化還原
藉由遵循實施例9中描述之程序進行反應。從3 ml培養物製備啤酒酵母菌靜止細胞。實驗條件及結果概括於表8中。
EP：鏡像立體異構物純度
實施例11：經由裂殖壺菌之DCPE之生物催化還原
藉由遵循實施例9中描述之程序進行反應。從50 ml培養物製備 裂殖壺菌 靜止細胞。實驗條件及結果概括於表9中。
EP：鏡像立體異構物純度
實施例12：經由開菲爾乳酸桿菌之DCPE之生物催化還原
藉由遵循實施例9中描述之程序進行反應。從50 ml培養物製備 開菲爾乳酸桿菌 靜止細胞。實驗條件及結果概括於表10中。
EP：鏡像立體異構物純度
第1圖：經由在不同pH值(pH=5至pH=9)且在18及40小時之反應時(左側面板)及pH輪廓(右側面板)之DCPE的赤紅球菌轉換百分比之DCPE的生物催化還原。

Claims (23)

  1. 一種製造式(I)化合物之方法 該方法包含： i)使式(II)化合物 接觸微生物，其中該微生物具有酮的不對稱還原活性；以及ii)回收如此製造之該式(I)化合物。
  2. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中該微生物係選自由細菌、真菌、微型藻類、原生生物及古細菌組成之群組。
  3. 根據申請專利範圍第2項的方法，其中該微生物為一細菌細胞。
  4. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項的方法，其中該微生物係呈下列形式：培養液(culture broth)、來自該培養液之分離細胞、細胞之經處理製劑或其固化(immobilized) 形式。
  5. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項的方法，其中該微生物係選自由酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖壺菌(Schizochytrium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、赤球菌屬(Rhodococcus)及假單胞菌屬(Pseudomonas)微生物組成之群組。
  6. 根據申請專利範圍第4項的方法，其中該微生物係選自由酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖壺菌(Schizochytrium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、赤球菌屬(Rhodococcus)及假單胞菌屬(Pseudomonas)微生物組成之群組。
  7. 根據申請專利範圍第5項的方法，其中該微生物係選自由啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)、開菲爾乳酸桿菌(Lactobacillus kefiri)、赤紅球菌(Rhodococcus ruber)及螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)組成之群組。
  8. 根據申請專利範圍第6項的方法，其中該微生物係選自由啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)、開菲爾乳酸桿菌(Lactobacillus kefiri)、赤紅球菌(Rhodococcus ruber)及螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)組成之群組。
  9. 根據申請專利範圍第7項的方法，其中該微生物為赤紅球菌。
  10. 根據申請專利範圍第8項的方法，其中該微生物為 赤紅球菌。
  11. 一種用於製造舍他康唑(阿拉康唑)之(R)-鏡像異構物之方法 該方法包含以下步驟：i)使式(II)化合物 接觸微生物，其中該微生物具有酮的不對稱還原活性；以及(ii)將根據步驟i)獲得的該式(R)-DCPI(I)化合物 用式(III)化合物O-烷基化 其中L為選自由氯化物、溴化物、碘化物、甲苯磺酸鹽、甲磺醯基及三氟甲基磺醯鹽組成之群組的離去基。
  12. 根據申請專利範圍第11項的方法，該方法進一步包含步驟iii)，該步驟iii)將根據步驟ii)獲得之該化合物與酸化合物反應以形成其醫藥學上可接受的鹽。
  13. 根據申請專利範圍第11項的方法，其中該微生物係選自由細菌、真菌、微型藻類、原生生物及古細菌組成之群組。
  14. 根據申請專利範圍第12項的方法，其中該微生物係選自由細菌、真菌、微型藻類、原生生物及古細菌組成之群組。
  15. 根據申請專利範圍第13項的方法，其中該微生物為 一細菌細胞。
  16. 根據申請專利範圍第14項的方法，其中該微生物為一細菌細胞。
  17. 根據申請專利範圍第11至16項中任一項的方法，其中該微生物係呈下列形式：培養液、來自該培養液之分離細胞、細胞之經處理製劑或其固化形式。
  18. 根據申請專利範圍第11至16項中任一項的方法，其中該微生物係選自由酵母菌屬、裂殖壺菌、乳桿菌屬、赤球菌屬及假單胞菌屬微生物組成之群組。
  19. 根據申請專利範圍第17項的方法，其中該微生物係選自由酵母菌屬、裂殖壺菌、乳桿菌屬、赤球菌屬及假單胞菌屬微生物組成之群組。
  20. 根據申請專利範圍第18項的方法，其中該微生物係選自由啤酒酵母菌、裂殖壺菌、開菲爾乳酸桿菌、赤紅球菌，及螢光假單胞菌組成之群組。
  21. 根據申請專利範圍第19項的方法，其中該微生物係選自由啤酒酵母菌、裂殖壺菌、開菲爾乳酸桿菌、赤紅球菌，及螢光假單胞菌組成之群組。
  22. 根據申請專利範圍第20項的方法，其中該微生物為赤紅球菌。
  23. 根據申請專利範圍第21項的方法，其中該微生物為赤紅球菌。
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