TW201309728A - 具高抗體介導細胞毒殺作用之抗ｃｄ２０抗體在治療瓦氏症中的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關於針對CD20抗原之一單株抗體對瓦氏巨球蛋白血症的治療用途，該抗體具較高的抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作用(ADCC)及/或具有啟動表達Fc γ RIII的效應細胞之能力，並且具有其中至少60%的寡糖為非岩藻糖化的一Fc區域。

Description

具高抗體介導細胞毒殺作用之抗CD20抗體在治療瓦氏症中的用途
本發明係有關於用於治療瓦氏症(也稱為瓦氏巨球蛋白血症(Waldenström Macroglobulinemia))的針對CD20抗原之單株抗體。
本發明應用於醫學領域，尤其應用於免疫治療領域。
在下文之描述中，在括弧([ ])中之參考文獻是指在實例後提供的參考文獻列表。
瓦氏巨球蛋白血症或瓦氏症(Waldenström Macroglobulinemia)是一種罕見的疾病，其發生率為每年每百萬人中新增三件病例。它是緩慢(無痛)疾病，其主要影響平均年齡為63歲的老年人(Vijay A.,Gertz M.A.2007.Waldenström macroglobulinemia.Blood.109(12)：5096-5103,[1])。也有例外地在40歲之前發生的病例。
世界衛生組織(WHO)以瓦氏症之特性為骨髓之淋巴漿細胞淋巴癌(Harris NL,Jaffe ES et al.J Clin Oncol 1999；17.3835-49,[2])，發生於血清之單株免疫球蛋白M(IgM)中。無論濃度，它是由髓質淋巴漿細胞性浸潤和單株IgM免疫球蛋白定義的。臨床上，患者經常表現與貧血相關的虛弱。腫瘤症狀可能伴隨多發性腺病和脾腫大而存在，並且當IgM高於30 g/l時常會產生 黏度過大相關臨床徵狀，包括頭痛、視力問題、同位連生、神經病學症狀。該異型蛋白質也可具有自體抗體及/或冷凝球蛋白活性，此係由自身免疫的表現型所導致，伴隨混合的冷凝球蛋白(其可以在至多20%的病例中觀察到)。在少數患者中發生的神經疾病，可以和該IgM異型蛋白質在抗體活性相關，該抗體針對該髓鞘或者髓鞘相關的糖蛋白(抗MAG抗體)的抗原。其他可以觀察到的與存在於組織中的IgM相關的症狀有：在皮膚中伴隨丘疹樣和結節的存在，在血管小球中伴隨腸的蛋白尿症和腹瀉。由於輕鏈堆積的澱粉分解有時候出現，特別是在心臟和腎臟中。
腫瘤細胞之起源可能是B淋巴細胞，其發育過程在經歷濾泡生發中心後(但在漿細胞階段之前)被停止。這可能由IgM+及/或IgM+、IgD+記憶細胞產生，其在該同型轉變的起始階段表現短缺。
通過蛋白質電泳分析該疾病。若患者未產生任何症狀，建立簡單的監控。反之，若患者具有下述症狀則提出治療：腱鞘囊腫或者脾臟體積增大(脾腫大)、自體免疫信號、具有症狀的冷凝球蛋白、黏度過大血液相關的復發症，或者神經疾病。
嘌呤類似物，例如氟達拉濱，在這些血液病之治療中表現較大的進步，這些主要的形式標準化學療法難以治療(Leblond V et al.,French Cooperative Group on Chronic Lymphocytic Leukemia and Macroglobulinemia.2001.Multicenter,randomized comparative trial of fludarabine and the combination of cyclophosphamide-doxorubicin-prednisone in 92 patients with Waldenström macroglobulinemia in first relapse or with primary refractory disease.Blood.2001 98：2640-2644,[3]；Dimopoulos MA et al.,(2009A).Update on treatment recommendations from the Fourth International Workshop on Waldenstrom's Macroglobulinemia.J.Clin.Oncol.27：120-126,[4]；Neparidze N,Dhodapkar MV.2009.Waldenstrom's macroglobulinemia：Recent advances in biology and therapy.Clin.Adv.Hematol.Oncol.7：677-681,[5]；Treon SP.2009.How I treat Waldenström macroglobulinemia.Blood.114：2375-2385,[6])。儘管如此，這些病變到目前為止若非使用同種異體移植，否則仍然難以治療。
目前，利妥昔(抗CD20抗原之抗體)組合化學療法被推薦為首要的治療方法(Treon 2009[6],Dimopoulos MA,Kastritis E,Roussou M,Eleutherakis-Papaiakovou E,Migkou M,Gavriatopoulou M,Tassidou A,Terpos E.(2009B).rituximab-based treatments in Waldenström's macroglobulinemia.Clin.Lymphoma Myeloma.9：59-61,[7])。
CD20抗原是疏水膜蛋白，其分子量為35-37 kDa，伴隨在表面上的成熟B淋巴細胞(Valentine et al.(1987)Proc Natl Acad Sci U S A.84(22)：8085-9[8]；Valentine et al.(1989) J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287[9])。其在該B淋巴細胞發育的過程中表達，截至前B階段早期，直到分化成漿細胞，在這一階段，表達消失。CD20抗原在正常B淋巴細胞和惡性B細胞中都會出現。更具體而言，CD20抗原在大多數表現型淋巴瘤中(80%的淋巴瘤)表達：其例如在超過90%的B淋巴細胞NHL中表達。
CD20的功能尚未完全釐清，但是它可能作為鈣通道起作用，並且在調節分化的該第一階段發揮作用(Golay et al.(1985)J.Immunol.；135(6)：3795-801[10])和在B淋巴細胞的增殖中發揮作用(Tedder et al.(1986)Sur J.Immunol.1986 Aug；16(8)：881-7[11])。
因此，雖然其在B淋巴細胞的活化和繁殖中作用未明，但由於其位置，CD20抗原是在治療有關於腫瘤B淋巴細胞的病原方面重要的靶標，例如NHL或者B-CLL(B-細胞慢性淋巴細胞白血病)，伴隨特異性識別CD20的抗體。進一步地，這種抗原是在免疫治療中的理想靶標，因為它係有關於已知表達調控或者多態性的膜蛋白。
在治療瓦氏症的環境中，在單一療法以治療中使用利妥昔會導致充分的應答(大約35%應答，Gertz MA et al.Multicenter phase 2 trial of rituximab for Waldenström macroglobulinemia(WM)：an Eastern Cooperative Oncology Group Study(E3A98).Leuk Lymphoma.45(10)：2047-55,[12])。
且應注意，目前對於瓦氏症的患者的NK(自然殺 手細胞)細胞的研究極少，而迄今發表的三項研究報告則提出相互矛盾的結果。在一個家族性巨球蛋白血症中，該NK細胞表現功能正常(Ogmundsdottir HM et al.,1995.Familial macroglobulinaemia：hyperactive B-cells but normal natural killer function.Scand.J.Immunol.40：195-200,[13])，而在其他具有與多發性神經病變相關的單株丙種球蛋白病的患者中，NK細胞的比例大大降低(Vrethem M,Dahle C,Ekerfeldt C,Nilsson J,Ekstedt B,Ernerudh J.1994.Abnormalities in T-lymphocyte populations in blood from patients with demyelinating polyneuropathy associated with monoclonal gammopathy.J.Neurol.Sci.122：171-178,[14])。更近的研究顯示，在瓦氏症患者中，在用沙利度胺治療後NK細胞擴散和活化(Zeldis JB et al.,2003.Potential new therapeutics for Waldenstrom's macroglobulinemia.Semin.Oncol.30：275-281,[15])。儘管如此，這些多項研究不能解釋所有的NK細胞在這種疾病中的表型和功能特性，或者是它們在使用單克隆抗體的免疫療法中之影響。
因此，需要一種治療工具，來克服在瓦氏巨球蛋白血症(以下簡稱瓦氏症)相關治療中的缺陷和障礙。
發明概要
申請人所做的顯著研究目前允許提供針對瓦氏症患者的CD20抗體的優化的抗體免疫療法之治療工具。
有利的是，根據本發明之該治療工具產生的骨髓中毒性低於標準化學療法。
因此本發明之首要主題係有關於針對該CD20抗原之單株抗體，對於其在瓦氏症的治療中之用途，這種抗體具有增高的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性及/或具有啟動表達Fc γ RIII的效應細胞之能力，並且具有其中至少60%的寡糖為非岩藻糖化的一Fc區域。
該抗體可以例如，具有至少70%，或者至少80%，或者至少90%，或者甚至100%之非岩藻糖化的寡糖。選擇地，岩藻糖含量可以為20%和45%之間或者在25%和40%之間。
為了本發明的目的，「單克隆抗體」與「單克隆抗體組合物」為同義表述，並且係有關於具有相同和獨有的特異性的抗體分子的製備。
在本發明意思之範圍以內，「抗體」係有關於任意的免疫球蛋白，其由至少一種重鏈和至少一種輕鏈組成，其通過二硫鍵彼此連接。每個鏈由其N-末端位點針對該抗體之抗原可變區(或區域)(由該輕鏈的重排V-J基因和該重鏈的重排V-D-J基因編碼)以及C-末端位元點之恆定區，該C-末端位點之恆定區由該輕鏈單一的CL區域或者該重鏈的幾個區域組成。
根據本發明該抗體可以是嵌合抗體，即其該輕鏈和重鏈之可變區屬於物種(來自於該輕鏈和重鏈之恆定區)。選擇地，本發明該抗體可以是擬人化的抗體，即人類抗體具有來自另一物種抗體的超變數部分，並且具 有比人類抗體具有更好的耐受性和更長的半衰期。選擇地，根據本發明的該抗體可以使人類抗體。
因此，本發明所使用的抗體也具有來自一非鼠源物種之輕鏈和重鏈之恆定區。在這方面，可以使用所有非鼠源哺乳類物種和家族，尤其是例如人類、猴、鼠科(除了小鼠)、豬科、牛科、馬科、貓科、犬科，以及禽類。
本發明所使用的抗體可以通過使用標準重組DNA技術建立，這種技術是熟諳此技藝人士熟知的；並且尤其可以使用該技術來建立「嵌合」抗體，這種技術例如在Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,pp.6851-55(1984)[30]中描述的，其中重組DNA技術被用於替換重鏈恆定區及/或輕鏈之恆定區(來自於具有人類免疫球蛋白相關區域的非人類哺乳動物的抗體)。後文將描述具體實施例。
在本發明的意思範圍內，「針對該CD20抗原」是指該單克隆抗體與所有或者部分的該CD20抗原結合的能力。
在本發明的意思範圍內，「較高的」是指相對於該相同抗體或者該利妥昔，該抗體不具有Fc區，其少於60%(不包括在內)的該寡糖被非岩藻糖化，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)及/或啟動表達FcγRIII的效應細胞之能力，高於該相同抗體(其具有至少60%(不包括在內)的寡糖是非岩藻糖化的)，或者高於利妥昔。該ADCC及/或該啟動表達FcγRIII的效應細胞之能力可以高於至少50%，或者高於至少60%， 或者至少70%，或者80%，或者90%。
在本發明的意思範圍內，「相同抗體」是指抗體，其一級序列和本發明該抗體相同。
作為實例，該ADCC可以根據該抗體的EC50(半數最大有效濃度，或者要求達到50%的最大裂解的抗體劑量)定量。例如，該EC50可以如此，該相同抗體或者利妥昔的數量(需要達到50%的最大裂解，該裂解用本發明該抗體觀察)至少比根據本發明該抗體高出2倍，或者至少5倍，或者至少10倍；該相同抗體具有Fc區，其少於60%(不包括在內)的該寡糖被非岩藻糖化。
在本發明的意思範圍內，「EC50」是指抗體的數量要求達到50%的最大裂解。該EC50可以例如使用任意現有技術熟諳此技藝人士已知的技術(Shi J,Orth JD,Mitchison T,Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5 Cancer Res.2008 May 1；68(9)：3269-76[29])測量。
該相同抗體，其少於60%(不包括在內)的該寡糖被非岩藻糖化，可以由CHO細胞系產生，例如細胞系CHO DG44。
在一個具體實施例中，本發明所使用的該抗體還包括大量複合寡糖，該寡糖具有通過修飾糖基化增加的一等分構象。
在本發明的意思範圍內，「等分構象」是指任意的β1,4-接枝插入的N-乙醯氨基葡萄糖，尤其地通過GNTIII的作用。
在這個實施例中，該抗體也包括至少20%，例如至少30%，或者至少40%，或者更進一步地至少50%、60%、70%的寡糖具有一等分構象並且其為非岩藻糖化的。
在這個實施例中，產生該抗體的方法是本領域已知的，並且都可以使用，例如，這些在文獻WO9954342、EP1692182、WO2004065540、US6602684中描述的方法，這些清單不作為限制；產生抗體的方法，該抗體包括至少一個Fc區域和免疫球蛋白並具有插入的N-乙醯氨基葡萄糖殘基(插入的GlcNac)，例如這些方法之描述可以參見文獻EP 1 071 700和US 2005/123546，這些清單不作為限制。例如，該抗體能夠在一宿主細胞中產生，該宿主細胞表達至少一種編碼多肽的核酸，該多肽具有足量的β-(1,4)N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶Ⅲ活性以修飾該抗體Fc區域之糖基化。
在另一實施例中，本發明所使用的該抗體可以具有低岩藻糖基化，即岩藻糖含量低於65%的一聚糖結構。
在另一實施例中，本發明所使用的該抗體可以具有低岩藻糖基化，即聚糖結構岩藻糖含量低於50%的形式G0F+G1F。例如，該抗體也包括含量水準高於60%的形式G0+G1+G0F+G1F，形式G0F+G1F少於50%。在另一具體實施例中，該抗體可以具有高於60%的形式G0+G1+G0F+G1F的含量水準，該岩藻糖含量少於65%。這些形式更加具體地選自下述形式：
在這個其他的實施例中，在一Asn297糖基化位點上，該抗體還包括具有末端甘露糖及/或非插入的末端N-乙醯氨基葡萄糖的一聚糖結構。
在一Asn297糖基化位點上，該抗體可以具有短鏈的、低唾液酸化的雙觸角型聚糖結構和含量水準高於60%的形式G0+G1+G0F+G1F，形式G0F+G1F少於50%。
例如，該抗體組合物可以具有唾液酸含量低於25%、20%、15%，或者10%，優選地5%、4%、3%或者2%。
該抗體組合物可以具有含量水準高於60%，優選地高於80%的形式G0+G1+G0F+G1F，理解的是形式G0F+G1F低於50%，優選地低於30%。
該抗體組合物可以包括具有短鏈的、低唾液酸化的雙觸角型聚糖結構，連接點的甘露糖和非插入末端N-乙醯氨基葡萄糖，該聚糖結構具有含量水準高於60%的形式G0+G1+G0F+G1F和低岩藻糖基化，該聚糖結構具有含量水準低於50%的形式G0F+G1F。
在一個具體實施例中，本發明所使用的該抗體可以具有聚糖結構，如在文獻WO 01/77181中描述的。
該單克隆抗體可以製備，描述參見文獻WO 2006/064121(LFB)，或者在文獻WO 01/77181(LFB)中，通過選擇細胞系，使可以製備具有高ADCC活性的FcyRIII型(CD 16)的抗體，即免疫系統效應細胞的該CD16受體之強親和力。例如，該抗體可以在雜種瘤中製備，特別是雜種骨髓瘤細胞，其用該K6H6-B5融合伴侶(ATCC CRL 1823)獲得；或者在動物或人類細胞中，其使用包含編碼該抗體基因之載體轉染，尤其是來自於Vero細胞系(ATCC CCL-81)之細胞，鼠雜種瘤細胞系例如鼠雜種瘤細胞系YB2/0(ATCC CRL-1662、細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20，保藏於美國典型培養物保藏中心)或CHO細胞系Lec-1(ATCC CRL-1735)、CHO-Lec10、CHO dhfr-(例如CHO DX Bil、CHO DG44)、CHO Lec13、SP2/0、NSO、293、BHK、COS、IR983F、例如Namalwa之人類骨髓瘤或者其他人類起源的細胞例如PERC6、CHO Pro-5、CHO dhfr-(CHO DX Bil、CHO DG44)、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653。
有利的是，該抗體在選自以下的細胞系中製備：YB2/0、Vero、CHO-lec10、CHO-lec13、CHO-lec1、CHOK1SV Potelligent®(Lonza,Switzerland)、CHOGnTIII(Glycart,Switzerland)。該抗體可以在細胞系EB66(Vivalis)中製備。
更為有利的是，本發明所使用的該抗體在鼠雜種瘤細胞系中製備。由於其賦予該抗體一些它特定的性能， 製備該抗體之該細胞系是一種重要特性。實際上，該抗體之表達方式是翻譯後修飾的來源，特別是該糖基化修飾，其在一個細胞系與另一個細胞系中有變化，並且因此賦予抗體不同的功能特性，無論是否具有相同的一級結構。
在一個優選的實施例中，該抗體在鼠雜種瘤YB2/0(細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20，在美國典型培養物保藏中心保藏，編號ATCC CRL-166)中產生。對於其能力，該細胞系被選擇用於製備相對於例如在CHO中製備的相同一級結構的抗體具有改善的ADCC活性的抗體。
本領域熟練技術人員已知的其他來製備低岩藻糖化的抗體的方法，可以用來製備本發明抗體。這些方法例如在細胞中製備抗體之方法，該細胞在kifunensine存在的情況下培養，如在文獻US7700321中描述的。
岩藻糖類似物可以被引入到製備抗體細胞的培養基中，如在文獻US 20090317869中描述的。
製備抗體的其他方法可以(例如)利用GDP-岩藻糖產生途徑被已知的細胞，例如通過抑制岩藻糖產生迴圈中的至少一種酶，例如其描述參見文獻EP 1 500 698、文獻EP 1 792 987或者文獻US 7 846 725，該清單不作限制。可以使用干擾RNA(iRNA)抑制1,6-岩藻糖基轉移酶，其描述參見於文獻US 7 393 683或者文獻WO2006133148。
這些也可以是在轉基因動物中製備抗體的方法，其 描述參見於文獻WO200748077。這些也可以是在酵母中製備抗體之方法，例如在文獻WO 0200879中描述的。這些也可以是製備具有改善的半衰期或者藥代動力學性能的抗體之方法，類似這些在文獻US20120128663、US20120088905、US20120028304、US20110110928、US20100317834、US20080292621和US20080242845中描述。
在這種情況下，其抗體之Fc區具有100%非岩藻糖化寡糖，即當該抗體之Fc區徹底地缺乏岩藻糖化，那麼可以使用本領域已知的方法製備，例如這些描述可參見於文獻EP1176195、US 7 214 775、US 6 994 292、US 7 425 449、US2010223686、WO2007099988、EP 1 705 251，這些清單沒有窮盡。這種方法例如使用宿主細胞表達至少一種編碼本發明該抗體之核酸，並且其糖基化被修飾，通過刪除編碼α1,6-岩藻糖基轉移酶之基因，或者通過添加突變基因來去除α1,6-岩藻糖基轉移酶活性，並且最終使其表達無岩藻糖之抗體。這種方法也可以包括使該Fc部分的該氨基酸突變。
該抗體可以是針對該CD20抗原之單克隆抗體，其中每個輕鏈的該可變區由鼠源序列氨基酸SEQ ID NO：1編碼，其中每個重鏈之可變區是由鼠源核酸序列SEQ ID NO：2編碼，並且其中該輕鏈和該重鏈之恆定區來自於非鼠源物種。
該鼠源核酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分別編碼抗體的每個該輕鏈之可變區和每個該重鏈之可 變區，該抗體由鼠雜種瘤CAT-13.6E12製備，其可以在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)獲得，登記號ACC 474。該雜種瘤製備鼠單克隆抗體，其為針對CD20之IgG2a,κ型。
但是，序列SEQ ID NO：1包括核酸，其關於編碼該抗體輕鏈可變區之序列發生變化，該抗體由鼠雜種瘤CAT-13.6E12製備。
已經選擇了這些鼠源序列，由於該鼠源抗體CAT-13.6E12針對該CD20抗原之特異性，因此其起源於根據本發明該抗體可變區之序列。根據本發明該抗體之該可變區與序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)具有至少70%的相似性，這種序列相似性賦予根據本發明該抗體與鼠抗體CAT-13.6E12相同的特異性。優選的是，這種序列相似性也賦予本發明抗體和鼠源抗體CAT-13.6E12之間相同的靶標親和性。
有利的是，本發明所使用的該抗體的每條輕鏈之可變區是由序列編碼，該序列與鼠源核酸序列(SEQ ID NO：1)至少80%相似性；根據本發明該抗體每條重鏈之可變區是由序列編碼，該序列與鼠源核酸序列(SEQ ID NO：2)至少80%相似性。
本發明所使用的該抗體的每條輕鏈之可變區是由序列編碼，該序列與鼠源核酸序列(SEQ ID NO：1)至少95%相似性；根據本發明該抗體每條重鏈之可變區是由序列編碼，該序列與鼠源核酸序列(SEQ ID NO：2) 至少95%相似性。
有利的是，本發明所使用的該抗體之每條輕鏈之可變區是由序列編碼，該序列與鼠源核酸序列(SEQ ID NO：1)至少99%相似性；根據本發明該抗體每條重鏈之可變區是由序列編碼，該序列與鼠源核酸序列(SEQ ID NO：2)至少99%相似性。
有利的是，為本發明目的可以使用任意具有其重鏈和輕鏈可變區之抗體，並且具有一個或多個核甘酸的替換、插入或者刪除，其中該序列修飾符合如上文所定義的序列相似性百分比，並且其沒有改變該抗體對靶標之特異性，或者對靶標之親和性。
在本發明中使用的該抗體也延伸至具有該CAT-13.6E12抗體之CDR區(互補決定區域)之任意抗體，其與FR區域(框架，該可變區之非常保守區)相關。這種抗體具有與該鼠抗體CAT-13.6E12相當的親和性和特異性，較佳地係具有相似性。
本發明所使用的該抗體之每條輕鏈之可變區是由鼠源核酸序列(SEQ ID NO：1)編碼，並且根據本發明該抗體之每條重鏈之可變區是由鼠源核酸序列(SEQ ID NO：2)編碼。
因此，本發明使用的抗體，特別是作為藥物，可以是針對該CD20抗原之單克隆抗體，其中每條輕鏈之該可變區是由鼠源核酸序列(SEQ ID NO：1)編碼，每條重鏈之可變區是由鼠源核酸序列(SEQ ID NO：2)編碼，並且該輕鏈和該重鏈之恆定區是來自一非鼠源物種之 恆定區域。
因此，「針對該CD20抗原」是指是該單克隆抗體與所有或者部分的該CD20抗原結合的能力，特別是由該抗體EMAB603識別的表位，也稱為R603。
本發明所使用的該抗體之每條輕鏈和每條重鏈之恆定區可以是人類恆定區。本發明的這個優選的實施例使得其可以減少該抗體在人類中的免疫原性，並且因此其改善了其在人類中治療給藥的效力。在本發明一個優選的實施例中，根據本發明該抗體每條輕鏈之恆定區是K型。所有的同種免疫球蛋白對於實施本發明是合適的，例如Km(1)、Km(1,2)、Km(1,2,3)或者Km(3)，但是優選的同種免疫球蛋白是Km(3)。
選擇地，根據本發明的抗體之每條輕鏈之恆定區是λ型。
在本發明的一個具體方面中，並且特別的，當在本發明中使用的該抗體之該每條輕鏈和每條重鏈之恆定區是來自於人類區域時，該抗體之每條重鏈之恆定區是γ型。根據這種選擇該抗體之每條重鏈之恆定區可以是γ1型、γ2型、γ3型(這三種型之恆定區具有連接人類補體之特性)或者γ4型。該抗體具有γ型之每條重鏈之恆定區，其屬於該IgG類別。該G型免疫球蛋白(IgG)是異質二聚體，其由2條重鏈和2條輕鏈組成，彼此通過二硫鍵連接。每個鏈由其N-末端位點針對該抗體之抗原特異可變區(或區域)(由該輕鏈之重排V-J基因和該重鏈之重排V-D-J基因編碼)以及C-末端位元點之 恆定區，該C-末端位點之恆定區由該輕鏈單一的CL區域或者該重鏈之幾個區域(CH1、CH2和CH3)組成。該可變區：和重鏈之該CH1和CL區域連接形成了Fab部分，其通過非常彈性的鉸鏈區連接到Fc區，允許每個Fab將自身連接到它的抗原靶標上，調節該抗體之效應性質，保持其進入效應分子，例如受體FcγR和C1q。述Fc區(由2個球形結構域CH2和CH3組成)在CH2結構域被糖基化，伴隨在兩條鏈之每條中存在氨基乳糖苷型之雙觸角型N-聚糖(與該Asn 297結合)。
優選的是，該抗體每條重鏈之恆定區為γ1型，由於此抗體在大多數個體(人)中顯示出創建ADCC活性的能力。在這方面，任何同種抗免疫球蛋白適合於實施此發明，例如，G1m(3)、G1m(1，2，17)、G1m(1，17)或GIM(1，3)。優選的是，該同種免疫球蛋白是G1m(1，17)。
在本發明的一個特定方面中，該抗體之每條重鏈之恆定區為γ1型，它由人類的核酸序列(SEQ ID NO：3)編碼，其每條輕鏈之恆定區由人類的核酸序列(SEQ ID NO：4)編碼。通過這種方式，這種抗體具有小鼠可變區和人的恆定區，以及γ1型重鏈。因此，此抗體屬於IgG1亞類。根據本發明中使用的該抗體之實施例，該抗體具有兩條輕鏈和兩條重鏈；其中該輕鏈可變區：由鼠源核酸序列(SEQ ID NO：1)編碼的輕鏈，該輕鏈人類恆定區由核酸序列(SEQ ID NO：4)編碼；該重鏈可變區：由鼠源核酸序列(SEQ ID NO：2)編碼，重鏈恆定區由 核酸序列(SEQ ID NO：3)編碼。
優選的是，根據本發明該抗體之每條輕鏈由人-鼠嵌合體核酸序列(SEQ ID NO：5)編碼的，每條重鏈是由人-鼠嵌合體核酸序列(SEQ ID NO：6)編碼的。鼠人嵌合核酸序列(SEQ ID NO：5)編碼每個抗體之輕鏈可以通過融合編碼小鼠抗體每個輕鏈可變區之核酸序列(SEQ ID NO：1)和編碼人類抗體每個輕鏈之恆定區之核酸序列(SEQ ID NO：4)來獲得。
鼠人嵌合核酸序列(SEQ ID NO：6；其編碼每個抗體之重鏈)可以通過融合編碼小鼠抗體每個重鏈可變區之核酸序列(SEQ ID NO：2)和編碼人類抗體每個重鏈之恆定區之核酸序列(SEQ ID NO：3)來獲得。
在本發明的一個特定方面中，當該抗體之每條輕鏈由鼠人嵌合核酸序列(SEQ ID NO：5)編碼，及每條重鏈由鼠嵌合核酸序列(SEQ ID NO：6)編碼時，每條輕鏈之氨基酸序列可由核酸序列(SEQ ID NO：5)推導出來，為序列(SEQ ID NO：7)，並且每條重鏈之氨基酸序列可由核酸序列(SEQ ID NO：6)推導出來，為序列(SEQ ID NO：8)。
序列(SEQ ID NO：7)中第106位之氨基酸是賴氨酸(K)。
本發明還延伸到抗體之用途，其中由人鼠嵌合核酸序列所編碼的每個輕鏈與人鼠嵌合核酸(SEQ ID NO：7)有至少70%的同源性或相似性，而且由人鼠嵌合核酸序列所編碼的每個重鏈與人鼠嵌合核酸(SEQ ID NO：8) 有至少70%的同源性或相似性，這些修改不會改變抗體之特異性或效應活性，例如該ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)活性等。
在另一個具體實施例中，根據本發明的另一個抗體為抗體EMAB603(也稱為LFB-R603)，由2005年11月29日以CNCM註冊號I-3529保存於Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM,Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15)的細胞克隆R603產生。抗體LFB-R603之每個輕鏈由鼠人嵌合核酸序列(SEQ ID NO：5)編碼，而且每個重鏈由鼠人嵌合核酸序列(SEQ ID NO：6)編碼。這種嵌合抗體與鼠源抗體CAT-13.6E12競爭與CD20連接，並且比利妥昔單抗之細胞毒性活性更大，可部分歸因於這些抗體重鏈之N-糖鏈之特定糖基化。事實上，R603克隆產生特異性抗體組合物LFB-R603，其具有的岩藻糖/半乳糖水準比率小於0.6，它已被專利申請FR 03 12229所證明，其最佳地賦予抗體是高ADCC活性。
根據本發明的抗體表達載體的一個實例是序列(SEQ ID NO：17)載體。這個載體為是允許根據本發明的該抗體表達的載體，其中輕鏈由核酸序列(SEQ ID NO：5)編碼，推導的多肽序列為序列(SEQ ID NO：7)，重鏈由核酸序列(SEQ ID NO：6)編碼，推導的多肽序列為序列(SEQ ID NO：8)。此載體是核酸分子，其中已經插入編碼抗體之每個輕鏈之核酸序列(SEQ ID NO：5)和編碼抗體每個重鏈之核酸序列(SEQ ID NO：6)，然後 將它們引入、並將其保持在一宿主細胞中。在一宿主細胞中允許表達外來的核酸片段，因為它含有必要的表達序列(啟動子、多聚腺苷酸序列、選擇基因)。這種載體在操作技術上是眾所周知的，可以是一種腺病毒、逆轉錄病毒、質粒或噬菌體，並不限於這份名單上。在另一實施例中，本發明的抗體可以通過在細胞中共同表達兩個表達載體來產生，一方面允許輕鏈表達，另一方面允許抗體之重鏈表達。如前述，這些載體有表達的必要序列(啟動子、多聚腺苷酸序列、選擇基因)。
在技術上，適用於這些細胞之培養基是眾所周知的，非詳盡的實例包括培養基RPMI1640(The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)[16]),Eagle’s MEM(Science,122,501(1952)[17]),Dulbecco’s改善的MEM(Virology,8,396(1959)[18]),F12培養基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,53,288(1965)[19]),IMDM(J.Experimental Medicine,147,923(1978)[20])，或者在文獻EP1229125中描述的。
有利的是，發明中使用的抗體可能允許形成記憶性T淋巴細胞。這些記憶T淋巴細胞具有增殖能力，並可在第二次接觸增殖細胞期間迅速啟動。
該抗體在被給藥的受試者中可允許外周血B細胞耗竭到至少20%，或至少30%或至少50%，並優選地為至少60%或70%。
本發明中使用的該抗體，可伴隨藥學上的可接受的載體一起給藥，並適用於預期的治療效果。
在這方面中，該抗體可用於單一療法或聯合化學療法。
如果其用於單一療法，該抗體可以使用，並且沒有給藥其他針對瓦氏症之活性組分，或者距離另一個針對瓦氏症之治療超過6個月，使用該抗體貫穿於治療。在這個實施例中，只要其他活性成分對瓦氏症沒有預防性或治療性效果，那麼該抗體可以和其他設計的活性成分一起給藥以預防或者治療副作用或有害效應。有利的是，單一療法可被用於脆弱的患者，例如，針對其年齡或慢性病或隱性疾病之藥物治療，或全血細胞減少患者之治療。
如果其用於化學治療，它可能與一個或多個其他活性成分相聯繫，例如單克隆抗體，抗一種或幾種其他抗原，在淋巴細胞中表達，例如但不限於，抗原CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11、CD16、CD18、CD19、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD29、CD30、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD49、CD50、CD52、CD53、CD54、CD55、CD58、CD59、CD69、CD70、CD71、CD80、CD81、CD82、CD86、CD95、CD103、CD118、CD119、CD120、CD132、CD210、CD217。
根據本發明的抗體，可結合用於細胞表達FcγR，例如NK細胞、NKT(自然殺傷T)細胞、淋巴細胞Tγδ、巨噬細胞、單核細胞或樹突狀細胞，即結合細胞療法(Peller S,Kaufman S Blood 1991,78：1569([21])；Kimby E et al.1989 Leukemia 3(7)：501-504([22])；Soorskaar D et al.1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87(2)；159-164([23])；Ziegler HW et al.1981 Int J Cancer 27(3)；321-327([24])；Chaperot L et al.2000 Leukemia 14(9)：1667-77([25])；Vuillier F,Dighiero G 2003 Bull Cancer.90(8-9)：744-50([26]))。
給藥於患者之該抗體劑量，可以包括在0.5 mg/m2和1000 mg/m2之間，例如在50 mg/m2和700 mg/m2之間，或者進一步在100 mg/m2和500 mg/m2之間，或進一步在200 mg/m2和400 mg/m2之間。抗體之劑量可小於375 mg/m2，或187.5 mg/m2，75 mg/m2，37.5 mg/m2，15 mg/m2，7.5 mg/m2或特別有利地是小於3.75 mg/m2或小於1 mg/m2或0.5 mg/m2。有利的給藥劑量包括在187.5 mg/m2和75 mg/m2之間，或75 mg/m2和37.5 mg/m2之間，75 mg/m2和15 mg/m2之間，75 mg/m2和7.5 mg/m2之間或進一步在75 mg/m2和3.75 mg/m2之間。更優選的是，給藥劑量包括在3.75 mg/m2和0.5 mg/m2之間，更具體的包括在2 mg/m2和1 mg/m2之間，這些劑量可以靜脈給藥給藥。
有利的是，該抗體在接近於增殖位點時給藥，或在增殖位點內給藥。
既可進行一個單一的劑量(即單一給藥)之給藥，或通過重複注射。如果重複注射，每一次給藥可以與先前的一個(其被認為是單劑量給藥)給藥有足夠的間隔。例如，每一次給藥可以與前面的給藥間隔開至少一個星期，或至少2周，或至少3周，或至少4周，或至 少6周，或至少10周，或至少6個月。
該抗體可用於等待造血幹細胞移植的患者。
該抗體可用於在非常嚴重血小板減少患者。
本發明可以定義為：利用根據本發明的抗體製備設計用於治療瓦氏症之藥物。在這種情況下，上述所有的技術特點，替代品和實施例和組合是適用的。
本發明的另一主題，為藥物組合物之用途，包括根據發明的抗體和至少一種藥學上可接受的賦形劑，以產生治療瓦氏症之藥劑。在這種情況下，所有的技術特點，替代品和上面提到的實施例，及其組合均可適用。賦形劑可為技術上熟知的任何已知賦形劑如Rituxan ®，Herceptin ®，Synagis®，CAMPATH®，Zevalin®，Avastin®，並不加以限制。
換句話說，本發明的其他主題可能被定義為藥物組合物，包括根據本發明的抗體和藥學上可接受的賦形劑，使用於瓦氏症之治療。
此外，本發明的另一個主題是設計用於治療瓦氏症之藥劑之製備方法，包括將本發明中使用的單克隆抗體與藥學上可接受載體混合，然後獲得該藥劑。
本發明的另一個主題是使用符合上述定義的抗體，製造設計治療瓦氏症之藥劑，其可能可以單藥治療。
本發明的另一個主題是瓦氏症之治療方法，包括給藥於對其需要的患者抗體或如上該藥劑、藥學上可接受的賦形劑，其可能可以在單一療法中使用。
有利的是，治療方法包括給藥瓦氏症患者抗體之步 驟。
藉由閱讀以下提供之說明實例(參照附圖)，熟諳此技藝人士或可領略本發明之其他優點。
實例1：構建抗CD20嵌合抗體EMAB603之表達載體
A.小鼠抗體CAT-13.6E12可變區序列的測定
分離鼠雜種瘤細胞CAT-13.6E12(供應商：DSMZ,ref.ACC 474)總RNA製備免疫球蛋白IgG2a,κ型(RNAeasy試劑盒，QIAGEN ref.74104)。逆轉錄後，使用5-RACE技術(cDNA末端快速擴增)(GeneRacer試劑盒，Invitrogen ref.L1500-01)擴增抗體CAT-13.6E12輕鏈(VK)和重鏈(VH)之可變區。這兩個步驟使用的引物如下：
1.反轉錄引物
a.鼠源Kappa特異性反義引物(SEQ ID NO：9)
5'-ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC-3'
b.鼠源G2a特異性反義引物(SEQ ID NO：10)
5'-CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG-3'
2. 5'RACE PCR引物
a.鼠源Kappa特異性反義引物(SEQ ID NO：11)
5'-TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC-3'
b.鼠源G2a特異性反義引物(SEQ ID NO：12)
5'-GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG-3'
在該載體pCR4Blunt-TOPO(Zero blunt TOPO PCR克隆試劑盒，Invitrogen,ref.K2875-20)中克隆獲得該VH和VK PCR產物，然後測序。該鼠抗體CAT-13.6E12之Vκ區核苷酸序列在序列(SEQ ID NO：1)中表示，除了最後一個核苷酸被A取代(AAA替代了AAC)。該基因Vκ屬於Vκ4家族(Kabat et al.,"Sequences of Proteins of Immunological Interest",NIH Publication,91-3242(1991)[27])。CAT-13.6E12之該VH區之核苷酸序列是序列(SEQ ID NO：2)。該VH基因屬於VH1家族。
B.嵌合抗體EMAB603之該重鏈和輕鏈之表達載體構建
1.抗體EMAB603之κ輕鏈載體
測序載體pCR4Blunt-TOPO之該克隆VK序列通過使用下面的克隆引物擴增：
a)VK正義引物(SEQ ID NO：13)
5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACC ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3'
下劃線的序列對應的為限制性位點Spe I，加粗序列對應的為Kozak共有序列，啟動子ATG為斜體。
b)VK反義引物：(SEQ ID NO：14)
5'-TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGT CCG TT TATTTCCAGCCTGGT-3'
此引物產生小鼠Vκ序列(斜體)和人類之恆定區(Cκ)(粗體)的連接。下劃線序列對應的為Dra III酶切位點。
從而獲得PCR Vκ產物，含有編碼小鼠抗體CAT-13.6E12天然信號肽之編碼序列，其具有突變AAC->AAA(加框的核苷酸序列為反義引物，SEQ ID NO：14)，與突變體N106K相對的CAT-13.6E12天然序列Vκ相對應。
此載體編碼該嵌合抗體EMAB603之輕鏈序列見核苷酸序列(SEQ ID NO：5)，對應於推導的多肽序列(SEQ ID NO：7)。
然後對輕鏈嵌合載體(第1圖)之Spe I和Dra III位點之間進行PCR Vκ克隆，其對應序列(SEQ ID NO：1)，在人類之恆定區Cκ之5'內，其中該核酸序列是序列(SEQ ID NO：4)。通過預先沉默誘變來修飾此嵌合載體之人類序列Cκ，以創建限制性位點Dra III從而允許克隆鼠Vκ序列。此嵌合載體含有RSV啟動子和bGH(牛生長激素)聚腺苷酸序列以及dhfr(二氫葉酸還原酶)選擇基因。
2.重鏈載體
類似方法應用於該抗體EMAB603重鏈的嵌合。
首次使用以下克隆引物擴增在克隆載體pCR4Blunt-TOPO中的VH序列：
a)VH正義引物(SEQ ID NO：15)
5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACC ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTC-3'
下劃線之序列對應的為Spe I限制位點，加粗序列對應的為Kozak共有序列，啟動ATG為斜體。
b)VH反義引物(SEQ ID NO：16)
5'-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGC TGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC-3'
此引物產生的小鼠VH序列(斜體)和人類GI恆定區(粗體)之連接。下劃線序列對應的為Apa I限制位點。
擴增的VH片段包含編碼小鼠抗體CAT-13.6E12天然信號肽之序列。接下來此VH PCR克隆被克隆島重鏈嵌合載體(第2圖)之該Spe I和該Apa I位點之間，對應序列(SEQ ID NO：2)，在人恆定區γ1之5'端內，其中核酸序列是序列(SEQ ID NO：3)。此嵌合載體含有RSV之啟動子和bGH(牛生長激素)聚腺苷酸化序列以及neo選擇基因。
嵌合抗體EMAB603的重鏈序列由該載體編碼，其呈現在核苷酸序列(見SEQ ID NO：6)中，以及作為推導的多肽序列(SEQ ID NO：8)中。
3.最終表達載體
抗體EMAB603之表達載體
單一的表達載體含有抗CD20抗體EMAB-603之兩 個重鏈和輕鏈轉錄單位，其由該兩個輕鏈之嵌合載體構建；並且該Ce鏈表達載體HK463-25(FDA)具有兩個選擇基因，neo(neo-磷酸轉移酶II)和dhfr(二氫葉酸還原酶)，以及在RSV啟動子控制下的兩個重鏈和輕鏈轉錄單位(第3圖)。
實例2：源於YB2/0株之細胞系的建立，以製備抗CD20嵌合抗體EMAB603
在EMS培養基(Invitrogen,ref.041-95181M)中培養鼠YB2/0細胞系(ATCC# CRL-1662)，該培養基含有5%胎牛血清(JRH Biosciences,ref.12107)。轉染時，在Optimix培養基(Equibio,ref.EKITE1)中，與25μg的(用於表達抗體EMAB603的)輕鏈載體pRSV-HL-EMAB-603一起，對500萬轉染細胞進行電穿孔(Biorad electroporator，模型1652077)。應用的電穿孔條件為：對於0.5毫升電碗，230伏和960微法拉。然後每個電碗分佈了5個P96板，密度為5000個細胞/孔。佈置和選擇性RPMI培養基(Invitrogen,ref.21875-034)中含5%透析血清(Invitrogen,ref.10603-017)，500 μg/ml的G418(Invitrogen,ref.10131-027)和25nM的胺甲基葉酸(Sigma,ref.M8407)，在轉染後3天完成。
對耐藥性轉染小孔的上清液進行篩選，通過特定的人類Ig序列之酶聯免疫吸附法(ELISA assay)確定是否存在嵌合免疫球蛋白(Ig)。
產生大部分的抗體之該10個轉染子在P24板中擴增，它們的上清液用ELISA法重新分析以測定上清以估計其產生率，並選擇3個最好的產生者通過限制稀釋(40細胞/板)進行複製。
在克隆的終點，選擇該克隆R603以產生該嵌合抗體EMAB603，並逐漸適應於CD雜種瘤(Invitrogen,réf.11279-023)產生。通過擴大適應於CD雜種瘤細胞培養基之介質培養物實現了嵌合抗體EMAB603的產生，其通過在75 cm2和175 cm2瓶中稀釋至的3×105細胞/毫升來獲得，然後稀釋至4.5x105細胞/毫升1滾筒型瓶子中。達到最大體積後，繼續培養直至細胞存活率不超過20%。投產後，由蛋白質A(高效液相色譜法純度估計<95%)親和純化嵌合抗體EMAB603並進行聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測。
實例3：瓦氏巨球蛋白血症患者之NK細胞表型和功能研究
1)測定抗CD20抗體LFB-R603對瓦氏症(WD)細胞之最優化療效
研究瓦氏症患者NK細胞之表型和功能，並對相同年齡之健康捐獻者和CLL患者之NK細胞與作比較。
其目的是為了確定在監測及/或治療瓦氏症中，NK細胞之角色，以及在治療抗CD20中由NK細胞介導的ADCC更特別的角色。
通過與利妥昔比較，測定最優化抗CD20抗體 LFB-R603之體外療效。
選擇免疫療法治療的患者，更特別是最優化抗CD20的LFB，因此，作為結果的功能定位。
2)人口研究和使用的材料
從巴黎總醫院Pitié-Salpêtrière臨床血液學部門(Clinical Hematology department of the Hôpital Pitié-Salpêtrière)治療的患者中取20例瓦氏症患者的細胞。這一群約100名的患者是在法國監測到的瓦氏症患者中最大的群體，並允許選擇徵募患者(平均每週2例)，探索一套目前使用的在不同臨床協定下診斷和預期指標。
這項研究是患者不及時治療或已經超過6個月治療以來的最後一次治療(排除以前以抗CD20或抗CD52治療的患者)。收回所有臨床醫生規定的在生物面板中抽取的樣本。
將得到的結果與以前在兩個早期研究中獲得的結果進行比較：一方面為一組在A和B/C(Le Garff-Tavernier et al.,Leukemia 2011,Jan；25(1)：101-9)期中的57例CLL患者，另一方面為另一組p53基因缺失的CLL患者，並在同一實驗室使用相同的標準進行研究。
將這些組的結果與相應年齡及健康對照組血液樣本的結果進行比較(n=25)(Le Garff Tavernier M,et al.,2010.Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span.Aging Cell.9： 527-535,[28])。
3)迴圈NK細胞之表型
通過流式細胞儀對提取血液(在新鮮血液中)進行這項研究。在兩個早期的研究中，研究分析了NK人口表型之標記，定義為CD3-CD56 +：a)CD56之弱或強表達；b)啟動NK細胞活性受體，包括NCR(NKp30、NKp44、NKp46)、NKp80、2B4、NKG2C和NKG2D；c)抑制NK細胞活性受體：KIR(p58a、p58b、P70)、NKG2A、ILT-2和LAIR-1；d)參與細胞活化(CD69、HLA-DR)及在ADCC中(CD16)之受體。
將結果與同年齡之健康捐獻者(Le Garff-Tavernier et al.,[28])及CLL患者(資料未顯示)之樣本中得到的結果進行了比較。
4)瓦氏症患者之NK細胞產生細胞因數和細胞質內毒素組分
對使用聚蔗糖分離純化後得到的PBMC(外周血單核細胞)進行此研究。然後PBMC由10納克/毫升的IL-12和100納克/毫升IL-18中進行17小時(標記的IFN-γ)不啟動或啟動。然後在使用cytofix/cytoperm試劑盒(BD Biosciences)連接和透化PBMC之前完成用抗-CD3和抗-CD56對NK細胞之表面進行標記。最後，在由流式細胞儀分析之前完成細胞質內的IFN-γ，穿孔蛋白和A/B粒酶之標記。
一方面將得到的同年齡之健康捐獻者之樣本(Le Garff-Tavernier et al.,[28])結果，與另一方面CLL患者(資料未顯示)得到的結果進行比較。
5)直接細胞毒性試驗
採用直接裂解試驗檢測瓦氏症患者之NK細胞毒素之能力。這項測試是從inter-IFC細胞計數平臺上通過流式細胞儀及/或三胞純化NK細胞後分離的淋巴細胞中進行的，對K562靶細胞(CMH細胞系類-I陰性(ATCC CCL 243))，在IL-2下培養72小時。與從健康捐獻者之PBMC中獲得的裂解活性進行了比較。這是在缺乏和存在1000個單位的proleukin-2下，進行48小時下完成。
6)測定該ADCC
使用2個不同類型的測試檢測NK細胞製造ADCC之能力。本監測在瓦氏症患者之PBMC下完成，存在關於自體瓦氏症細胞抗CD20之LFB-R603時。該2種使用方法是：
-由瓦氏症細胞鹽析51Cr之ADCC。
這項技術的目的是確定的NK細胞裂解的瓦氏症細胞比例。在inter-IFT血細胞計數平臺上，使用三細胞純化NK對瓦氏症患者(迴圈克隆患者)之Raji之細胞(表達FcγR或FcγR+細胞系)或自體B細胞進行研究，並預先用鉻酸鹽處理。在IFB-R603抗體存在下進行這些研究中，在沒有啟動的情況下與利妥昔單抗相比。
-脫粒試驗
這項技術的目的是確定未經事先淨化的，由瓦氏症細胞啟動的NK細胞水準。它是從瓦氏症患者中存在不同的介於0和10,000納克/毫升LFB-R603的濃度下，CD107a/LAMP1和孟寧素脫粒標記組成的PBMC下完成的。由在NK細胞(CD3-CD56 +)表面上CD107a的表達水準確定脫粒的比例。這些不同的方法是在缺乏及/或存在抗CD20 LFB-R603或利妥昔單抗的情況下使用的。
得到的結果與同年齡的健康捐獻者(Le Garff-Tavernier et al.,[27])和CLL患者(資料未顯示)的樣品進行了比較。
7)細胞凋亡之測定
在LFB-R603抗體存在下，使用propidium碘化物和Annexin V進行傳統的流式細胞儀檢測細胞凋亡測試，對得到的結果與利妥昔單抗和參考分子(如氟達拉濱，茶鹼)進行比較。
實例4：結果
方法：
未處理或在它們的最後一次治療前至少距離6個月的來自37個瓦氏症患者之血液樣本，其被收集以定量在NK細胞上CD16(3G8克隆，Quantibrite®)之表達量及/或測量其功能之能力。
以B型血細胞克隆功能的存在(瓦氏症克隆+)或不存在(瓦氏症克隆-)將患者分為兩組。存在10和1000納克/毫升的抗CD20單株抗體時，在有或無抗CD20+ Raji目標細胞對PBMC培養細胞後，由NK細胞表面表達的CD107a來估計NK細胞的脫粒。
使用鍍鉻鹽析與純化NK細胞和自體B細胞或誘導Raji靶細胞進行該ADCC試驗，在存在抗CD20單株抗體時(濃度為1納克/毫升和100納克/毫升)。
結果：
存在的Raji細胞中，在低ublituximab濃度(LFB-R603)下檢測到了高的ADCC水準(>40%)，並穩定保持在100納克/毫升。相反，對利妥昔而言，要實現類似的功效有必要達到最高濃度。
這些結果由該NK細胞得脫粒所證實，在低濃度下，觀察到了CD107a與ublituximab的顯著表達水準，與利妥昔(P<0.001)濃度相關，與不同的患者組無關；而在最高濃度下，在兩個抗CD20單克隆抗體中獲得了類似的效果。在自體B細胞存在下，脫粒測試顯示，沒有發現克隆瓦氏症患者NK細胞脫粒，與CD20單克隆抗體及其濃度無關。
在8例克隆+瓦氏症患者之NK細胞中，有3例顯示出NK CD107a+ NK細胞，存在兩種ublituximab濃度下。這三例瓦氏症患者對應的患者具有最顯著的迴圈克隆(單克隆血細胞的35%，30%和14%)，並表現出顯著的效應/靶比例。相反，對利妥昔而言，8例患者中只有1例表現出NK CD107a+ NK細胞，而且是在最強的 劑量下。在兩組患者中檢測到的NK細胞表達頻率和細胞表面表達水準與CD16相似。值得注意的是，這些資料被ADCC證實。在克隆瓦氏症患者中存在純化的B細胞，定量的ADCC缺乏或水準低，與使用濃度和抗CD20單克隆抗體無關。
有趣的是，在克隆+瓦氏症患者中，ADCC檢測在所有5例患者中都用ublituximab，但5例中只有2例用最高濃度的利妥昔。
結論：
這些結果顯示，存在於Raji細胞之低濃度抗體，ublituximab對ADCC的誘導比利妥昔更加有效。這些結果表明，在外周血腫瘤細胞中同時誘導NK細胞脫粒和ADCC時，ublituximab可能比利妥昔更加有效
這些結果揭示了最優化抗CD20抗體新角色在瓦氏症控制中之作用。
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第1圖為CKHu載體之圖解說明，其用於EMAB603抗體kappa輕鏈的嵌合。
第2圖為G1Hu載體之圖解說明，其用於EMAB603抗體重鏈的嵌合。
第3圖為重鏈和輕鏈表達載體之圖解說明，其用於產生抗體R603。
第4圖顯示了使用51Cr在Raji靶細胞中ADCC之測試結果。測量裂解百分比，其作為該抗CD20單克隆抗體LFB-R603(ublituximab-方塊)或該利妥昔抗體(菱形)濃度(納克/毫升)之函數。A為測量60歲以下的 5個正常受試者之ADCC百分比。B為測量60歲及以上的3個正常受試者之ADCC百分比。C和D，為測量兩個瓦氏症患者之ADCC百分比。在C和D中測量到的反應劑量曲線特性類似于在健康受試者中觀察到的；平穩狀態的抗CD20達到100納克/毫升，各抗CD20相同。
第5圖顯示了在目前Raji細胞中低劑量抗CD20(1納克/毫升)ADCC之51Cr測試結果。使用迴圈B克隆測量WD患者之裂解百分比，接著給藥利妥昔抗體(菱形)，抗體LFB-R603(方塊)和奧沙利鉑抗體(三角形)依次測量沒有迴圈克隆的瓦氏症患者，正常個體與CLL個體。不論迴圈B克隆是否存在，瓦氏症患者都表現出相同的結果，而且在裂解細胞中，LFB-R603比利妥昔和奧沙利鉑更有效。該瓦氏症患者之NK細胞與Raji靶細胞反向相關。
第6圖顯示了在Raji細胞中及高劑量抗CD20(100納克/毫升)下，51Cr對ADCC之測試結果。測量具有迴圈B克隆的瓦氏症患者，無迴圈B克隆的瓦氏症患者，正常受試者及CLL受試者中的裂解百分比，進一步給藥抗體利妥昔(菱形)或抗體LFB-R603(方塊)或抗體奧沙利鉑(三角形)。在瓦氏症患者中，不論迴圈B克隆是否存在，結果都是相同的。不論抗CD20如何，在平穩狀態測量的所有NK細胞(瓦氏症患者，CLL患者或正常受試者)中的ADCC百分比是相似的。瓦氏 症患者之NK細胞與Raji細胞之ADCC反向相關。
第7圖顯示了與自體條件(目標=自體B細胞)下51Cr對ADCC之測試結果。測量裂解百分比，作為存在于正常受試者(A/、B/和C/)或瓦氏症患者中NK細胞和自體B淋巴細胞之迴圈B克隆(B細胞測試對應於腫瘤B細胞(D/)抗體利妥昔(菱形)或LFB-R603(方塊)或奧沙利鉑(三角形)中濃度(納克/毫升)之函數。在自體條件及異種條件下觀察到的ADCC劑量-反應曲線特性是不同的。
第8圖顯示了自體B細胞中，在自體條件及低抗體劑量(1納克/毫升)下，51Cr對ADCC之測試結果。對存在於抗體利妥昔(菱形)或LFB-R603(方塊)或奧沙利鉑(三角形)中具有迴圈B克隆的瓦氏症患者，無迴圈B克隆的瓦氏症患者，正常受試者以及CLL受試者之裂解百分比進行測量。在瓦氏症患者中，與利妥昔相比，LFB-R603之裂解率較高，與在該CLL中獲得的結果類似。
第9圖顯示了在自體B細胞中自體條件下，高抗體劑量(100納克/毫升)51Cr對ADCC之測試結果。對存在於抗體利妥昔(菱形)或LFB-R603(方塊)或奧沙利鉑(三角形)中具有迴圈B克隆之瓦氏症患者，無迴圈B克隆之瓦氏症患者，正常受試者以及CLL受試者之裂解百分比進行測量。在瓦氏症患者中，觀察到的反應似乎取決於腫瘤B細胞的存在與否：在非腫瘤B細胞的存在下，ADCC百分比是類似的與抗CD20無關， 而在腫瘤B細胞存在下，LFB-R603中位數ADCC百分比相對奧沙利鉑和利妥昔較高。瓦氏症患者中存在的非腫瘤B細胞之ADCC反應類似于正常受試者中存在的B細胞之ADCC反應；瓦氏症腫瘤B細胞存在的ADCC反應類似於CLLB細胞中存在的ADCC反應。
第10圖顯示在兩個具有迴圈B克隆(腫瘤細胞)之瓦氏症患者中，在一個較高的抗體劑量(100納克/毫升)與自體條件下，51Cr對ADCC之測試結果。正常的B細胞(交叉線陰影列)或腫瘤的B細胞(灰柱)之裂解百分比在存在利妥昔或LFB-R603或奧沙利鉑的情況下顯示。患者之一從未接受瓦氏症(A/)治療，而其他患者曾接受利妥昔(B/)。
第11圖顯示在自體B細胞中自體條件下具有高抗體劑量(100納克/毫升)時51Cr對ADCC之測試結果。測量利妥昔或LFB-R603存在的B細胞裂解百分比，作為CD20中MFI(平均螢光強度)的函數。
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<212> DNA
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<223> 反轉錄引物：鼠源Kappa特異性反義引物
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<212> DNA
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<223> 反轉錄引物：鼠源G2a特異性反義引物
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<212> DNA
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<223> 5'RACE PCR引物：鼠源Kappa特異性反義引物
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<223> 抗體EMAB603之輕鏈載體：VK正義引物
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<212> DNA
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<223> 重鏈載體：VH正義引物
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<223> 重鏈載體：VH正義引物
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<211> 11141
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> 質體HK463-25之序列全長
<400> 17

Claims (18)

  1. 一種抗CD20抗原之單株抗體，其具有較高的抗體依賴性細胞介導的細胞毒殺作(ADCC)及/或具有啟動表達Fc γ RIII的效應細胞之能力，並且具有其中至少60%的寡糖為非岩藻糖化的一Fc區域，該抗體可用於瓦氏症(Waldenström’s diseas)之治療。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中，該抗體還包括一定量複合寡糖，該寡糖具有通過修飾糖基化而增加的一等分構象。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項中任何一項之抗體，其中，該抗體還至少包括20%的寡糖，該寡糖具有一等分構象並且是非岩藻糖化的。
  4. 如申請專利範圍第1至3中任何一項之抗體，其中，該抗體能夠在一宿主細胞中產生，該宿主細胞表達至少一種編碼一多肽的核酸，該多肽具有足量的β-(1,4)N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶Ⅲ活性以修飾該抗體Fc區域之糖基化。
  5. 如申請專利範圍第1項之抗體，該抗體還包括高於60%的含量水準的形式G0+G1+G0F+G1F，低於50%的形式G0F+G1F。
  6. 如申請專利範圍第1項或第5項中任何一項之抗體，其中，在一Asn297糖基化位點上，該抗體還包括具有末端甘露糖及/或非插的末端N-乙醯氨基葡萄糖的一聚糖結構。
  7. 如申請專利範圍第1項和第5項至第6項中任何一項之抗體，其中，在一Asn297糖基化位點上，該抗體還包 括具有短鏈的低唾液酸化的雙觸角型聚糖結構。
  8. 如上述申請專利範圍中任何一項之抗體，其中，該抗體具有一Fc區域，其100%的寡糖都為非岩藻糖化的。
  9. 如上述申請專利範圍中任何一項之抗體，其中，該抗體在鼠雜種瘤YB2/0中產生(細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20，保存於美國典型培養物保藏中心，編號ATCC CRL-1662)。
  10. 如申請專利範圍第5項至第8項中任何一項之抗體，其中，該抗體由在法國巴斯德研究所國家微生物菌種保存中心(CNCM)以CNCM登記號碼I-3529保存的細胞複製體R603產生。
  11. 如上述申請專利範圍中任何一項之抗體，其中，每個輕鏈之可變區：由鼠源序列氨基酸SEQ ID NO：1編碼，其中每個重鏈之可變區由鼠源核酸序列SEQ ID NO：2編碼，並且其中該輕鏈和該重鏈之恆定區來自一非鼠源物種。
  12. 如申請專利範圍第11項之抗體，其中，每個輕鏈和每個重鏈之恆定區為人類之恆定區。
  13. 如申請專利範圍第11項或第12項之抗體，其中，每個重鏈之恆定區由人類核酸序列SEQ ID NO：3編碼，並且其中每個其輕鏈之恆定區由人類核酸序列SEQ ID NO：4編碼。
  14. 如申請專利範圍第11項至第13項中任何一項之抗體，其中，每個輕鏈由鼠人嵌合核酸序列SEQ ID NO：5編碼，並且其中每個重鏈由鼠人嵌合核酸序列SEQ ID NO：6編碼。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗體，其中，每個輕鏈由氨基酸序列SEQ ID NO：7構成，並且其中每個重鏈由氨基酸序列SEQ ID NO：8構成。
  16. 如上述申請專利範圍中任何一項之抗體，其係用於治療瓦氏症之單一療法中。
  17. 如上述申請專利範圍中任何一項之抗體，其係用於造血幹細胞移植候選患者身上。
  18. 如上述申請專利範圍中任何一項之抗體，其係用於血小板減少患者身上。
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