TW201244708A - Stem cells packaging and shipping - Google Patents

Description

201244708 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於包裝及運輸各種幹細胞之方法及產品。 【先前技術】 幹細胞係特徵在於能夠經由有絲細胞分裂自我更新並分 化成多種特化細胞類型之細胞類型。人類幹細胞通常係能 夠自我更新並產生多種成熟人類細胞譜系之全能或多能前 體細胞。此能力用作器官及組織發育所必需之細胞分化及 特化之基礎。最近證據證明，可採用幹細胞來重建 (repopulate)許多（若非全部）组織並恢復生理及解剖功能。 因此，幹細胞具有用於治療眾多種疾病及損傷（包括神經 系統創傷、惡性腫瘤、遺傳疾病、血紅素病及免疫缺陷） 之潛力。人們已對許多不同類型之哺乳動物幹細胞進行表 徵。實例包括胚胎幹細胞、胚胎生殖細胞、成人幹細胞及 已知之其他定向幹細胞或祖細胞。另外，臍帶血係間質幹 細胞以及造血幹細胞及祖細胞之已知替代源。 然而’後勤問題經常阻礙該等細胞之應用。舉例而言， 幹細胞（包括臍帶血細胞）在經採集後以常規方式極冷保藏 於儲存設備（例如細胞庫）中’且在需要時，自該等設備輸 送至醫院。此極冷保藏過程（其中細胞或組織係藉由冷卻 至低於零下之低溫（通常7 7 K或-19 6 °C，液氮沸點）來保藏） 會承擔某些風險。舉例而言’保藏細胞可因在接近低溫或 升溫至室溫期間凍結而受到損害。該等風險對於幹細胞 (包括膪帶血細胞）而言尤其嚴重，此乃因幹細胞移植中最 162352.doc 201244708 重要態樣之一係移植時活幹細胞之數目及其發育潛力。出 於此考慮，經盡可能紐之時間以常規極冷保藏方式運輸幹 細胞。實際上，在乾冰上或液氮運輸器中過夜運輸係工業 標準且必須格外小心地監測溫度。然而，此實踐不會消除 風險。同樣’長途（例如’洲際）輸送成本極高且不切實 際》 因此’業内非常需要更實際的運輸幹細胞之程序或方 法。本發明可滿足此需要及其他需要。 【發明内容】 本發明至少部分地基於以下意想不到之發現，包裝及運 輸幹細胞之方法不需要極冷保藏且不會顯著損害幹細胞之 存活率或發育潛力。 因此’本發明之一個態樣之特徵在於含有以下之包裝產 品：含有複數個多能細胞之組合物，及包含基質之容器； 該基質具有聚合物。該聚合物可為聚四氟乙烯（PTFE)、全 氟烧氧基（PFA)、氟化乙烯丙烯（FEp)、聚二氟亞乙烯 (PVDF)、聚乙烯或聚氣乙烯（pvc)，其具有低摩擦或無黏 性之性質。該聚合物亦可為適於生物製品之其他聚合物， 例如超低密度聚乙烯、低密度聚乙烯（LDPE)、線性低密度 聚乙烯（LLDPE)、高密度聚乙烯（Hdpe)、同轴定向聚丙烯 (COPP)、雙軸定向聚丙烯（Bopp)、聚對苯二甲酸乙二酯 (PET) '聚酿亞胺樹脂（例如耐綸（nyi〇n))、乙烯乙稀醇聚合 物（EVOH)及其金屬化形式。 包裝產品可呈任何適宜形狀，包括（但不限於）袋、針筒 162352.doc 201244708 或主射器用小瓶。在一個實例中’該產品經幹細胞預填充 以供臨床使用。多能細胞可為幹細胞’例如造灰幹細胞或 間質幹細胞。組合物可含有周邊血細胞、臍帶血細胞或骨 髓細胞。 組合物可具有在5_4〇。〇之範圍内之溫度，例如5_3<rc、 5_30°C、⑺-…它或！5·25^。組合物可含有培養基、較佳 不依賴C〇2之培養基（CIM)。在一較佳實施例中，培養基含 有（例如）0.5-20% (例如，1%、2%、3%、4%、5%、7〇/〇、 8%、9%、10%、15%及2〇%)之血清（例如人類血清）。在另 一實施例中，該組合物係醫藥組合物且含有醫藥上可接受 之載劑。可出於（例如）運輸目的將包裝產品密封。組合物 可含有至少1X106個細胞，例如2xl〇6個、5χ1〇6個、 個、20Χ106個、4〇χ1〇6個、8〇χ1〇6個、1〇〇χΐ〇6個或2〇〇χ 1〇6個細胞。上述細胞可為CD34+、CD133+、CD344 CD133 +或其他類型之幹細胞。 在一個實施例中，上述細胞（例如，周邊血細胞、臍帶 血細胞或骨髓）可為彼等已經冷凍並解凍者，例如彼等自 血庫獲得者。在該情形下，培養基可含有約l(M〇〇 U/ml (例如 10 U/m卜 15 U/nU、2〇 u/m卜 25 u/ml、3〇 胸】、4 U/ml > 50 U/ml . 60 U/ml > 70 U/ml，80 U/ml，9〇 U/mli loo U/ml)2DNAse(例如，人類DNAse)。另—選擇為舍 胞可剛剛自供體獲得且未經冷束且在此情形下，驗ei 非必需且該組合物可不含DNAse。 在第二態樣中’本發明之特徵在於製備上述包裝產品之 162352.doc 201244708 (a)提供含有多能細胞之組合

者（例如接收醫院之信使、 方法。該方法包括以下步驟：

I I品並將該包裝產品遞送至接收 代理人或工作人員）之步驟。在 遞送步驟期間，溫度可在5_4(rc之範圍内，例如5-37。〇、 5-3(TC、、12_抓或15-25口即室溫或 rt)。使用 該方法時，細胞可經1至8天（例如至少24小時或2天、3 天、4天、5天、6天、7天或8天）遞送。 在遞送後，多能細胞可具有超過4〇%(例如，45〇/〇、 50°/。、55% ' 60。/。、65%、70% ' 75%、80%、85%、9〇〇/0及 95%)之回收率。同樣，在遞送後，多能細胞可具有超過 50%(例如，45%、50%、55%、60%、65%、70%、750/〇、 80°/。、85。/。、90°/。及95%)之存活率（如藉由本文揭示之錐蟲 藍（Trypan Blue)排除法所測定）。在一個實施例中，在遞送 後’多能細胞可具有超過0.5%之CD34+細胞（例如， 0.55% ' 0.6% ' 0.65% ' 0.7% ' 0.75% ' 0.8% ' 0.85% ' 0.9% ' 0.95% ' 1.0% ' 1.1% ' 1.15% χ 1.2%、1.3%、 1.4%、1.5·%、1.6%、1.7%、1.8%、1·9.% 或 2.0%)。在另 一實施例中，在遞送後，多能細胞可具有超過0.25〇/〇之 CD133+ 細胞（例如，0.25%、0.3%、0.35% ' 〇.4。/〇、 0.45%、〇.50/0、0.55%、〇.60/〇、0.65〇/〇、〇.70/0、〇.750/〇、 0.8%、0.85%、0.9%、0.95%、1·0ο/〇、ΐ·ΐ〇/〇、ι.15〇/〇、 162352.doc 201244708 1.2% ' 1.3% ' 1.4% ' 1.5.% 2.0%)。在再一實施例中， 超過2(例如 、1_6%、1.7%、1.8。/〇、ι.9·0/〇或 在遞送後，多能細胞能夠形成 胞。可根據下文實 <列中所述之方法來測定上述值。 10、15、20、25 或 30) CFU/5X104之細 本發明一或多㈣施例之詳細内容陳述於下文說明書 中根據說明書及申請專利範圍可明瞭本發明之其他特 徵、目標及優點。 【實施方式】 本發明係關於在諸如室溫（即，15_25。〇等條件下長時間 包裝及/或運輸幹細胞或幹含細胞之製劑（例如，臍帶血）。 對於臨床使用而言，由此包裝並運輸之幹細胞及製劑意想 不到地具有令人滿意之存活率及發育潛力。 圖1中顯不採集、處理、運輸及測試臍帶血細胞或自臍 帶血分離之細胞組份之程序之實例。 簡言之，臍帶血細胞可在醫院現場採集或自臍帶血庫 (例如由STEMCYTE公司維持者）獲得。儘管可使用任何業 内認可之採集及儲存程序，但較佳程序闡述於下文實例 中。通常，應對各種感染標記物實施無菌性測試。另外， 應在冷凍用於極冷保藏之前測定並記錄總細胞數、CD34+ 細胞數及單位體積。所採集血液含有往往在冷凍及解凍期 間分解之紅血球（RBC)。在該情形下，在溶解後，RBC之 DN A會增加所採集臍帶血細胞之黏度並阻礙將臍帶血細胞 進一步處理用於臨床使用。為防止此情形發生，可在極冷 保藏之前將DNAse添加至所採集細胞中以分。這樣 162352.doc 201244708 做可降低細胞之黏性及團集且由此允許以滲透梯度（例 如’嚴聚糖）更好地分離細胞。可使用許多市售。 實例包括由GENENTECH出售之PULM〇ZYME⑧。 另一選擇A，臍帶A可經處理以移I紅血&，以便實質 上排空紅血球。若需要，可藉由渗透梯度（例如，#、聚糖） 或以下文實例1中所述之方式將濟帶血分離成許多有用單 位（例如，總單核細胞（TMN)、白血球、淋巴球、cd34+細 胞、CD133 +細胞、巨噬細胞及其他細胞）。同樣，如上文 所提及，欲運輸之臍帶血細胞可剛剛自供體獲得且未經冷 凍。在該等方法中，在包裝及/或運輸此等新鮮單位期間 無需DNAse。此外，可根據業已知之方法（例如彼等闡述 於美國申請案20080166324中者）排空血漿，該案件之内容 以全文引用方式併入本文中。 然後，在醫院現場或在現場外（例如上述血庫）包裝所採 集細胞並準備於處理設備中運輸。若細胞已經極冷保藏， 則可以下文實例1中所述之方式將其解凍。可再次對各種 感染標記物實施無菌性測試且應測定並記錄總細胞數、 CD34+細胞數、濃度及單位體積。然後’將細胞置於上述 容器中以形成藉由指定載具運輸之包裝。 儘管可使用許多培養基，但不依賴C〇2之培養基（CIM)較 佳。該等CIM培養基防止鉀排空並產生較佳細胞存活率。 同樣，其能夠在無大氣C〇2(〇.〇4%)下維持長期pH穩定性。 CIM培養基之實例包括彼等由GIBCO以（例如）目錄編號 8045出售者。亦較佳使用人類血清。 I62352.doc 201244708 可使用該等細胞來形成具有醫藥上可接受之載劑之醫藥 組合物。作為非限制性實例，可採用生理緩衝鹽水（例 如，約135-150 mM NaCl)作為醫藥上可接受之載劑。其他 適宜載劑包括（但不限於）水、緩衝水、0.4%鹽水、0.3%甘 胺酸及諸如此類。適用於遞送本發明之經培養幹細胞及鋰 鹽的其他載劑闡述於（例如）REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing公司，Philadelphia, Pa.，第 18 版（1995)中。 如本文所揭示，容器之材料至關重要。一般而言，材料 可為對細胞具有低摩擦或無黏性且對細胞無毒或對幹細胞 接收者無害之聚合物。適宜聚合物之實例包括（但不限於） 聚四氟乙烯（PTFE)、全氟烷氧基（PFA)、氟化乙烯丙烯 (FEP)、聚二氟亞乙烯（PVDF)、聚乙烯、聚氣乙烯（PVC)、 超低密度聚乙烯、低密度聚乙烯（LDPE)、線性低密度聚乙 烯（LLDPE)、高密度聚乙烯（HDPE)、同軸定向聚丙烯 (COPP)、雙軸定向聚丙烯（BOPP)、聚對苯二甲酸乙二酯 (PET)、聚醯亞胺樹脂（例如耐綸）、乙烯乙烯醇聚合物 (EVOH)及其金屬化形式。若其他聚合物之摩擦係數（針對 拋光鋼）與彼等上述聚合物相當或比其低，亦可使用該等 其他聚合物。上述聚合物之摩擦係數為業内已知且以引用 方式併入本文中。舉例而言，摩擦係數可低於0.5，例如 0.4、0.3、0.2或0.1。在較佳實施例中，可使用基於 PTFE、PFA、PEP或PVDF之容器（由DUPONT以商標 TEFLON出售）、HYCLONE之基於聚乙烯之容器或 162352.doc 201244708 TERUMO之基於PVC之容器β 容器之基質可形成為適於接收並容納細胞之任何形狀。 形狀之實例包括（但不限於）袋、管、針筒或注射器用小 瓶在些實施例中’所形成基質呈適於培養或適於在各 種組織（例如CNS)中進行幹細胞移植或植入之位點之形 狀。實例包括帶、薄膜、線、載玻片、微珠、微粒、細胞 培養板、微孔板及生物反應器，以上全部皆可接收細胞。 如本文所述’在運輸期間’包裝中之細胞無需保持於較 低溫度下（例如極冷保藏）或過夜遞送。而是，可在相當寬 之溫度範圍（包括室溫）内經相當長時間段（例如，3至8天） 運輸細胞。儘管該等條件不太嚴格，但較佳在溫度保護容 器中運輸及/或利用溫度探針監測包裝，以向運輸器或接 收者提供資訊（若需要）。由於條件不太嚴格，因此可避免 與運輸極冷保藏細胞相關之成本。另外，由於運輸時間可 長達5至8天，因此長途（例如洲際）運輸變得實際。因此， 遠離特定幹細胞源之患者（例如’彼等具有稀有、匹配 HLA類型者）將能夠自幹細胞移植受益。 在信使收到細胞後’可以下文實例中所述之方式處理細 胞並測试其用於移植之適宜性。為此，可使用以下4個標 準來確定細胞是否適於移植。 細胞計數 必須有足量活細胞用於移植及分析。較佳地，移植（例 如’至脊髓中）所需細胞數目至少兩倍較佳，以便將有足 量剩餘細胞用於分析細胞。舉例而言，如下文實例2中所 162352.doc -10· 201244708 揭示，對於A組、B組及C組而言，移植需要16 μ卜32 y 及64 μΐ細胞懸浮液（100,000個細胞/μ1)。換言之，使用i 6 百萬、3.2百萬及6.4百萬細胞。使該量加倍將分別需要最 少3.2百冑、6.4百萬及12.8百萬單核細胞。若運輸物含有 較少細胞’則運輸物不應適於移植。 存活率 製劑中應避免過多死細胞。為此，可使用利用錐蟲藍排 除（TBE)之手動計數作為存活率標準4百分比表示，細 胞懸浮液之TBE代表未染成藍色之細胞除以染色細胞與未 染色細胞之總數。對於指定用於移植之細胞而言，tbe應 為至少70%。一般而言，如下文實例中所述之洗滌程序會 消除死細胞且細胞懸浮液在即將移植前通常具有大於9〇〇/〇 之 ΤΒΕ 〇 污染 應報告任何污染跡象或風險。此包括（例如）運輸袋中存 在任何流體H細胞料液之異、在顯微鏡下可 見之細菌或真菌或先前污染之報告。如本文所揭示，應小 心排除母體B型肝炎核心抗原以及所有其他感染因子為陽 佳之臍帶血單位’該等其他感染因子原本根據國家骨趙捐 a 十劃（National Marrow Donor Pr〇gram)(NMDP)通常會將 濟帶血單位排除在註冊之外。 單核細胞 “最終製劑應具有95%或更多之單核細胞。若細胞之存活 率計數顯示超過5%之其他細胞（例如紅金球或嗜中性球）， 162352.doc 201244708 則不應將該等細胞用於移植。應注意，臍帶血中可能存在 一些不成熟有核紅血球。 在較佳實施例中，若以下屬實，則應淘汰該包裝：⑴溫 度曲線顯示超出12°C至28eC之指定可允許範圍之溫度，及 (ii)自初始解凍（用於處理之臍帶血單位）開始之總逝去時間 不超過5天》 在上述程序中，可將抗生素添加至細胞製劑中。舉例而 言，可在細胞處理開始時添加健他黴素（gentamycin)以降 低處理及運輸期間污染之風險。即使多次先前培養基填充 測試已確定未引入污染，健他黴素亦可抑制細菌生長。在 接收醫卩元’將細胞洗務並再懸浮兩次，以顯著稀釋可能存 在於細胞懸浮液中之抗生素。吾人發現，在6個月時段期 間，洗滌溶液培養物在15個經處理臍帶血單位中不會生成 任何陽性培養物。同樣，2週CFU培養物未顯示任何細菌 生長。 在上述程序中，可使用諸如闡述於美國申請案 20100189696 、 201〇〇323920 、 20080227197及2〇〇8〇166324 中之彼等方法等方法進一步處理臍帶血幹細胞以擴增幹細 胞彙集物，即，活體外擴增，該等案件之内容以全文引用 方式併入本文中。術語「活體外擴增」係指在實驗室中培 月幹細胞。可自哺乳動物抽取此等細胞且可藉由在適當環 境中（例如，在含有鋰鹽之培養基中）培育產生額外量之細 胞。右可能，建立穩定細胞系以允許細胞連續繁殖。 可使用各種幹細胞來實踐本發明。幹細胞之實例包括臍 162352.doc 12 201244708 帶血細胞、造血幹細胞、胚胎幹細胞、骨髓幹細胞、周邊 血幹細胞、胎盤血及可分化成功能細胞（例如，神經元細 胞或神經膠質細胞）之其他幹細胞。術語「幹細胞」係指 能夠分化成許多最終分化之特化細胞類型之任何細胞。幹 細胞發源自所有胚層（即，外胚層、中胚層及内胚層）。典 型幹細胞源包括胚胎、骨髓、周邊血、臍帶血、胎盤血、 肌肉組織及脂肪組織。 幹細胞可為全能或多能。全能幹細胞通常具有發育成任 何細胞類型之能力。全能幹細胞可源自胚胎與非胚胎二 者。多能細胞通常係能夠分化成若干不同的最終分化細胞 類型之細胞。舉例而言，多能幹細胞可產生神經系統細 胞、皮膚細胞、肝細胞、腎細胞、血液細胞、肌肉細胞、 骨細胞等。多能幹細胞之實例包括（但不限於）臍帶血幹細 胞、神經幹細胞、造血幹細胞、脂肪源幹細胞、間質幹細 胞、胎盤源幹細胞、落齒源幹細胞（exfoliated tooth-derived stem cell)及毛囊 幹細胞 。 相反 ，多 能或成 人幹細 胞通常產生有限細胞類型。除非另有說明，否則本文所用 術語幹細胞包括祖細胞。早能幹細胞僅可產生一種細胞類 型，但具有區別其與非幹細胞之自我更新之性質。該等幹 細胞可源自各種組織或器官系統’包括（但不限於）血液、 神經、肌肉、皮膚、腸、骨、腎、肝、胰、胸腺及諸如此 類。根據本發明’幹細胞可源自成人或新生組織或器官。 本發明中所述細胞可為實質上純淨。術語「實質上純 淨」在參照所獲得幹細胞或細胞（例如，分化細胞）使用 162352.doc 13 201244708 時，意指指定細胞構成製劑中細胞之實質性部分或大部分 (即’超過20%、30%、4〇%、5〇%、6〇%、7〇% ' 8〇% ' 90/。或95°/。）。舉例而言，實質上純化之細胞群體構成製劑 中細胞之至少約70%、—般製劑中細胞之約8〇%且尤其製 劑中細胞之至少約9〇% (例如，95〇/〇、97〇/〇、99%或 100%) 〇 在較佳實施例中，使用臍帶血細胞。該等細胞可如下文 實例部分中所述或藉由業内已知方法獲得且隨後藉由標準 技術測試。為證實細胞之分化潛力，可藉由業内已知方法 對其實施誘導以形成（例如）各種集落形成單位。由此證實 之細胞可進一步在非分化培養基中繁殖超過1〇次、2〇次、 50次或1〇〇次群體加倍而不會顯示自發分化、衰老、形態 變化、増加之生長速率或分化成神經元之能力變化。該等 細胞在使用前可藉由標準方法儲存。 本文在參照細胞時可互換使用之術語「增殖」及「擴 增」係指相同類型細胞之數目藉由分裂而增加。術語「分 化」係指細胞特化用於特定功能之發育過程，例如，其中 細胞獲得一或多種不同於初始細胞類型之形態特性及/或 功能。術語「分化」包括譜系定向與終末分化過程二者。 分化可（例如）藉由使用免疫組織化學或熟習此項技術者已 知之其他程序監測譜系標記物之存在或不存在來評估。源 自祖細胞之分化後代細胞可（但未必）與幹細胞之源組織相 同之胚層或組織有關。舉例而言，神經祖細胞及肌肉袓細 胞可分化成造血細胞譜系。本文可互換使用之術語「譜系 162352.doc 201244708 —w」及特化（sPecification)」係指幹細胞經歷之過程， :、中幹細胞產生定向形成特定限定範圍之分化細胞類型之 祖細胞。定向祖細胞經常能夠進行自我更新或細胞分裂。 術-終末分化」係指細胞最終分化成完全分化之成熟細 胞。舉例而言’造血袓細胞及肌肉祖細胞可分化成神經或 神經膠質細胞譜系，其終末分化產生成熟神㈣或神經谬 質、··田胞。通常，終末分化與退出細胞週期及停止增殖相 關。 本文所用術語「祖細胞」係指定向為特定細胞譜系且藉 由一系列細胞分裂產生該譜系之細胞的細胞。祖細胞之實 例包括以下譜系之前體細胞：神經元譜系、肝譜系、腎原 性譜系、生脂譜系、成骨性譜系、破骨性譜系、肺泡譜 系、心臟譜系、腸譜系或内皮譜系。 術語「培養」係指使幹細胞維持在其可增殖並避免衰老 之條件下。舉例而言’在本發明中，在含有鋰鹽及視情況 一或多種生長因子（即’生長因子混合劑）之培養基中培養 幹細胞。 術語「濟帶血」係指自出生後剩餘之臍帶之血液獲得的 多能性及多能幹細胞源。臍帶血中得到之幹細胞之實例包 括（但不限於）間質幹細胞、造血幹細胞及祖細胞。間質幹 細胞及祖細胞通常可分化成神經細胞、骨髓基質細胞、軟 骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、腱細胞及韌帶細 胞。造血幹細胞通常可產生淋巴譜系細胞、骨髓譜系細胞 及紅血球譜系細胞。採集及處理臍帶血之方法的詳細說明 162352.doc •15· 201244708 提供於下文中。 術°°料血單位」係、指自I一供體採集之腾帶血之體 積在本發明方法中通常使用單一腾帶血單位，但亦可使 用多腾帶血單位（例如雙臍帶血單位）來增加幹細胞數。 本文所用術語「實質上排空血裂」&「血毁排空的」係 指已移除大於約 30%、35%、4〇%、45%、5〇〇/。' 55%、 60/。、65%、70%、75%、80%、85。/。、90%或 95%之血漿體 積的經處理臍帶血單位。舉例而言，可藉由離心臍帶血並 分離細胞部分與血漿部分來實質上排空血漿。實質性排空 後殘留之血漿體積通常係約〇體積％至約3〇體積％、較佳約 10體積°/〇至約30體積〇/〇。 本文所用術語「非紅血球·排空」及「未排空紅血球」 係指已移除小於約 30%、25%、20%、15。/。、10%、5%、 4%、3%、2°/。或1%之紅血球體積的經處理臍帶血單位。本 文所用術§吾「實質上排空紅血球」及「紅血球_排空」係 指已移除大於約 30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70°/。、75%、80%、85%、90。/。或95¼之紅血球 體積的經處理臍帶血單位。 有核細胞」係指具有核（即包含染色體DNA之細胞器） 之細胞。有核細胞包括（例如）白血球及幹細胞。「無核細 胞」包括（例如）成人紅血球。 實例1 本實例闡述受控解凍冷凍單袋STEMCYTE臍帶血單位 (UCBU)及包裝之實例性程序。 162352.doc 16 201244708 1· Hsa/Gentran洗滌液之製備 將以下物項置於生物安全櫃（BSC)中：4個醇拭子、 解凍袋裝置（轉移包單元（Transfer Pack Unit))、1袋Gentran 40、1個針筒過濾器、1 (2)x50 mL HAS、1根針、1個血激 轉移裝置及1把剪刀。在生物安全櫃内，用血漿轉移裝置 一端刺穿解凍袋裝置之1號袋的外注射埠。若單位小於或 等於10 0 mL極冷保藏體積，則使用300 mL轉移裝置；若單 位大於100 mL ’則使用600 mL轉移裝置。然後移出蓋並用 70%異丙醇（IPA)拭子清潔50 mL HSA小瓶之橡膠隔膜。用 上述血漿轉移裝置之第二尖刺刺穿HAS隔膜《將附接有針 筒過濾器之皮下注射針插入緊靠血毁尖刺之HS A隔膜中， 以為小瓶開孔。將HSA小瓶升至高於1號袋以使小瓶^5〇 mL)之全部内含物流入轉移袋中。對於體積>1〇〇 mL之 UCBU而言’應將2小瓶（1〇〇 mL)排入600 mL轉移袋中。將 HSA小瓶與1號袋之間之管道靠近1號袋之注射埠加熱密 封’然後丟棄HSA小瓶及過多管道。用新血漿轉移裝置刺 穿1號袋之殘留注射埠，隨後關閉轉移裝置管道上之輥 夾。用血漿轉移裝置之另一端刺穿Gentran 40袋之注射 璋。 然後，將1號袋置於電子秤上且將皮重設為零。對於極 冷保藏體積不大於100 mL之UCBU而言，鬆開轉移管道以 使190 g Gentran 40運行至1號袋中。體積大於1〇〇 mL時，將380 g Gentran 40轉移至1號袋中。將血漿轉移管 道靠近1號袋加熱密封並丟棄管道。1號袋中之最終體積應 162352.doc 201244708 為約240 mL(或480 mL)，且最終濃度為5%(對於HAS)及 8%(對於Gentran)。然後在1號袋之標籤上記錄洗滌液製劑 之曰期、時間及操作者之首字母。將解凍袋裝置置於2°C -8°C冷凍器中並維持約30分鐘，然後解凍UCBU。洗滌溶液 應在製備後1天使用。 根據下文第II部分中所述之程序解凍一袋冷凍UCBC :

II.解凍/洗滌冷凍UCBU II.1.在程序前將以下項目置於BSC中：6 (12)χ50 mL離 心管；大、小冰冷冷包；5 (10)χ2·5 mL安瓿DNAse ; 1000 mL DNAse洗務緩衝液；100 mL 250 mM MgCl2 ; 非粒子性拭子；WFI水；4 (8)x25計量注射針；25 mL吸 量管；取樣位點連接器；2x10 mL針筒；2xl mL針筒； IPA拭子；電子秤；止血器及管道密封器。 2.根據以下公式計算所需DNAse及250 mM MgCl2溶液 之體積，且將由此製備之溶液置於適當大小之具有0.2 μιη盤式過濾器及注射用針之針筒中》 HSA/GENTRAN洗滌液所需DNAse之體積=HSA/ Gentran洗務液之體積+25 ; 所需注射至UCBU袋中之DNAse之體積=UCBU袋之體 積+25 ; HSA/GENTRAN洗滌液所需250 mM MgCl2之體積 =HSA/Gentran洗蘇液之體積+ 100 ; 所需注射至UCBU袋中之250 mM MgCl2之體積 =UCBU袋之體積+100。 162352.doc • 18* 201244708 II. 3.將冷凍離心機預冷至2°C-8°C。 離心機設定： 將離心機速度設定為1，860 g’s(3,080 rpm，在具 有 4管架（4-place carrier)之 SORVALL HS-4I呂轉子 上）。 將制動器置於中等設定上。（對於HERAEUS SUPERFUGE而言，將減速度設定為7)。 11.4 自隨附書面工作記錄極冷保藏體積。 11.5 計算臍帶血單位（UCBU)之1.5體積。 1.5 UCBU之體積=UCBU之體積（上文步驟4)χ1.5 11.6 驗證HSA/Gentran洗滌液及DNAse洗滌溶液已冷 凍至少30分鐘且不超過1天。 11.7 獲得約8"x 10”之塑膠袋◎將冰包或冷凍冰包垂直 置於桶内。用水填充至約6至8英吋。 11.8 將冰容器置於解凍程序之位置中。 11.9 將解凍袋裝置自冷凍器移至BSC。將取樣位點連 接器插入2個埠中之一者中且注入HSA/Gentran洗 滌液所需之DNAse試劑及MgCl2«混合並置於冷 包之間。

' Π.10 自儲存處獲得冷凍UCBU。驗證箱上之UCBU ID 標籤匹配所需書面工作並記錄UCBU ID。 11.11 小心地打開冷凍箱且驗證UCBU袋上之UCBU ID 編號匹配箱上之ID及所需書面工作。 11.12 將來自箱之UCBU袋置於8"xl0"無菌袋中。將含 162352.doc 19 201244708 有UCBU之袋置於冰浴上。不要浸沒蟑。使用計 時器且計時5分鐘。 II· 13 5分鐘後’檢査UCBU以確定是否解冻^若未解 凍，則繼續定期檢査直至「融化」。自冰浴移出 解凍UCBU冷凍袋，用無絨拭子乾燥。 注意：立即開始隨後洗滌步驟。 11.14 將UCBU置於BSC内之冷包之間，使蟑暴露。將 UCBU輕輕地搖動10秒以混合。 11.15自UCBU袋上2個埠中之一者移除塞子。用取樣位 點連接器刺穿埠。 II. 17 在刺穿UCBU埠後’立即注入用於注入UCBU袋 中之DNAse試劑及MgCh (參見上文步驟2)。輕輕 地混合。 π· 1 8 用附接至解凍袋裝置之尖刺刺穿殘留槔。 注意：檢查以確保在刺穿UCBU前關閉解凍裝置 管道上之所有輥夾。 Π. 19 將冷包置於秤上。將UCBU袋置於冷包上。將另 一冷包置於UCBU袋頂部上並稱量該秤之皮重。 注意：UCBXJ及所有材料必須保持在2 °C-8 V下。 11.20將止血器夾緊至來自1號袋之管道上。打開接至 UCBU袋之管道上之輥夾。鬆開丨號袋上之止血 器，以轉移體積為UCBU 1.5倍之洗滌溶液（參見 上文步驟5) *記錄添加之體積。 Π.21 在完成洗滌液轉移後，夾緊管道。 162352.doc •20- 201244708 注意：應在解凍後盡可能快地完成此初始稀釋步 驟。 11.22 藉由將該袋手動旋轉約10秒來充分混合在UCBU 袋中之洗滌溶液與臍帶血，且保持UCBU在冷包 之間。 11.23 移除靠近2號袋之管道上之鋁夾或打開上面之輥 夾（若提供）且使洗滌液/血液混合物流入2號袋 中。自UCBU袋移出盡可能多的混合物。在此步 驟期間使2號袋保持在冷包之間。 11.24 在已完成轉移後關閉靠近2號袋之管道。 11.25 將UCBU袋重新置於位於秤平臺上之冷包之間， 且將該秤之皮重稱為零。 11.26 鬆開靠近1號袋之止血器且使等於UCBU之極冷保 藏體積之額外洗滌溶液流入UCBU袋中。在完成 時再夾緊靠近1號袋之管道。記錄添加之體積。 11.27 關閉緊靠已經洗滌之UCBU袋之輥夾。 11.28 充分混合UCBU袋中之洗滌液/血液混合物。自 UCBU袋之埠/尾區域移出盡可能多的臍帶血。 11.29 鬆開緊靠2號袋之管道且使洗滌液/血液混合物流 入2號袋中。卷起UCBU袋以確保自UCBU袋移出 盡可能多的血液。 注意：此時，解凍UCBU已藉由體積等於極冷保 藏UCBU 2.5倍之洗滌溶液（1,5乂初始七1.0乂 額外）稀釋。 162352.doc -21 - 201244708 11.30 11.31 11.32 11.33 11.34 11.35 11.36 11.37 11.38 11.39 11.40 11.41 夾緊緊靠2號袋之管道且關閉緊靠uCBU袋之輥 夾。 立即加熱密封位於產生兩個尖刺之「γ」連接下 方且緊靠2號袋之夾子上方之管道。密封後，可 移除過多管道。 用新血漿轉移裝置無菌刺穿2號袋之埠且將2號袋 之内含物轉移至保持於冰上之mL管中。 使含有50 mL管之離心桶平衡。 在〇°C至8°C下以約I860 g，s (3,080 rpm，在具有4 管架之Sorvall HS-4鋁轉子上）將50 mL管離心15 分鐘。應將離心機制動器設定於中等設定上。 在完成離心後’小心地移出經離心之5〇 mL管。 不要攪亂沈澱物》 在安全櫃中’打開離心管且抽出大部分洗滌液， 於管底留下約5 mL，而不攪亂沈澱物。 使用10 mL吸量管添加5 mL洗滌緩衝液且輕輕地 混合。 用洗滌緩衝液將50 mL管填充至50 mL標記處。 在 〇°C 至 8。(：下以約 i860 g，s (3,080 rpm，在具有4 管架之Sorvall HS-4鋁轉子上）將50 mL管離心10 分鐘。應將離心機制動器設定於中等設定上。 在完成離心後，小心地移出5〇 mL管。 在安全櫃中’打開離心管且抽出大部分洗滌液， 於管底留下約5 mL，而不攪亂沈澱物。 1623S2.doc -22- 201244708 II. 42藉由對著BSC表面輕叩管使各管中之細胞沈澱物 再懸浮。 然後使解凍UCBC經受如下文第Ιπ部分中所述之血液溶 解物程序或經觉如下文第IV部分中所述之單核細胞（MNC) 之分離。 1ΛΙ.江叙溶解物程序 III. 1 將以下物項置於BSC中 6 (12)x50 mL離心管 160 mL USP水（環境溫度） 160 mL 2x鹽水 III.2將22.5 mL環境溫度Usp水添加至每一 5〇爪^管 中。在添加水結束時開始3〇秒計時器。藉由移液 來混合。 III.3 在30秒後’立即將22·5 mL 1.8°/。（2X) NaCl溶液 添加至5 0 mL管中且藉由倒轉來輕輕地混合。利 用各管個別地完成步驟III.2及III.3。 III.4將各管分成2個管且用洗滌緩衝液將每一者填充 至 50 mL。 ΙΠ.5在〇°C至8°C下以約830 g，s (2,050 rpm，在具有4管 架之Sorvall HS-4鋁轉子上）將50 mi管離心1〇分 鐘。應將離心機制動器設定於中等設定上。

III.6在完成離心後，自桶小心地移出經離心之5〇 mL 管。 ΙΠ.7在安全櫃中，打開離心管且抽出大部分洗滌液， 162352.doc -23. 201244708 於管底留下約1 mL，而不攪亂沈澱物。 111.8 添加5 mL洗滌緩衝液且使用10 ml吸量管輕輕地 使細胞沈澱物再懸浮。 111.9 用額外10 ml DNAse洗滌緩衝液洗滌管且將細胞 一起彙集至一個管中。 III. 10用DNAse洗滌緩衝液使彙集細胞之體積達到30 mL。

注意：藉由將溫度設定為25°C且將速度設定為 7,000 rpm來開始離心機預熱（centrifuge warming)。按壓啟動（通常花費約30秒）。 IV.自人類臍帶血分離MNC

IV. 1 將以下物項置於BSC中：6x50 mL離心管；90 mL LSM ; 10x25 mL吸量管；2x10 mL吸量管；1個 圓錐管（225 mL) IV.2 在225 mL無菌圓錐管中用1:5 DNAse洗滌緩衝液 稀釋臍帶血細胞。藉由渦漩輕輕地混合經稀釋血 液。 IV.3 將六（6)個50 mL離心管置於BSC中。 IV.4 使用25 mL無菌吸量管將30 mL稀釋血液分配至 每一 50 mL管中》 IV.5 用13 mL LSM填充10 mL無菌吸量管。將吸量管 沿管側向下緩慢地清至底部。使管保持一定角 度’同時將LSM輕輕地移液至血液液面以不。抵 靠管壁緩慢地移出吸量管以防止各層混合。 1623S2.doc -24· 201244708 注意：不要自吸量管完全排出LSM-氣泡會攪亂

LSMM IV. 6 封閉管且將其小心地轉移至離心機。 IV.7 將該等管置於浮桶式轉子中，在24°C之溫度下以 約 467 g’s (1,540 rpm，在具有 4 管架之 Sorvall HS-4紹轉子而言；或1600 rpm，在S4 180轉子 上）保持32分鐘，且鬆開制動器（對於Heraeus Superfuge而言，將減速度設定為2)。驗證離心機 已達到指定速度。 IV. 8 將六（6)個50 mL無菌管置於BSC中之支架中。 11.9 在離心後，自離心機小心地移出該等管以防止各 層混合’且將其與新管一起置於支架中。 11.10設定離心機以供冷卻：將溫度設定為1(rc，且將 計時器設定為10分鐘。藉由按壓開始鍵來啟動離 心機 11.11打開BSC中之離心管。抽出上清液，使單核層暴 露。使用10 mL無菌吸量管僅採集單核層（棕黃色 塗層）°轉移至新管中且用DNAse洗滌緩衝液將 各管填充至45 mL。 IV. 12將該等管置於浮桶式轉子中且將離心機設定為約 467 g’s (1，540 rpm，在具有 4管架之 s〇rvall HS-4鋁轉子上）並在i(TC溫度下译持1〇分鐘且 使制動器保持於中等設定（對於heraeus SUPERFUGE而言，將減速度設定為7)。 162352.doc •25· 201244708 IV. 13在離心後，在安全櫃中，打開該等管且抽出大部 为上清液’留下約1 mL，而不會授乱沈殿物。 IV.14標記一個50 mL新離心管：「經彙集MNC」、 V90195」、「步驟 IV.14」、此]vianufacturing

Direction之批號、今日日期及操作者之首字母。 IV. 15使用1〇 mL無菌吸量管用5 mL DNAse洗滌緩衝液 使細胞沈澱物輕輕地再懸浮。將細胞彙集至單一 離心管中。 IV.16在彙集細胞後’用4 mL體積之DNAse洗滌緩衝液 洗滌所有6個管以確保採集所有單核細胞 (MNC)。 IV. 17將洗滌液轉移至經標記「經囊集MNC」管中且添 加DNAse洗滌緩衝液直至50 mL。 IV. 18將該管置於具有平衡管之浮桶式轉子中，將離心 機設定為約467 g's (1，540 rpm，在具有4管架之 SORVALL HS-4銘轉子上）且在i〇°c溫度下保持1〇 分鐘，且開啟制動器》 IV. 19在離心後，在安全櫃中，打開該等管且抽出大部 分洗滌液，於管留下約1 mL，而不會攪亂細胞沈 澱物。 IV.20使用10 mL無菌吸量管用5 mL洗滌緩衝液使沈澱 物再懸浮。 IV.21使經彙集MNC管之體積達到20 mL，充分混合。 11.22將經充分混合之MNC之A量體積試樣轉移至管 162352.doc •26· 201244708 中，以用於存活率及MNC細胞計數。記錄取樣 量。 IV.23 測定細胞密度及存活率％。 IV.24 根據下式計算細胞總數： 來自IV.23之活細胞密度χ(20-自IV.22取樣之量）。 IV. 25 若活細胞總數小於2千萬，則聯繫臨床協調員。 在等待調查結果期間保留淘汰批次。 然後根據下文第V部分中所述之程序將根據上述程序製 備之細胞轉移至各種輸送袋中。使用以下三種類型之具有 魯爾鎖定接頭（luer lock fitting)之試樣袋：HYCLONE ΡΕ 試樣袋（THERMO SCIENTIFIC)、TEFLON® 袋（DU PONT) 及 TERUFKEX®轉移袋（TERUMO, PVC)。 HYCLONE PE試樣袋（例如，HYCLONE 60 mL至 20 L 2-D Labtainer，其具有兩個端蟑，例如SH3b6500及 SH3b6500)係由CX3-9膜（三層9密耳澆注膜）構築而成，其 中外膜層係與超低密度聚乙烯接觸層共擠出之聚酯彈性 體。TERUFKEX® 轉移袋（例如，1BB*T015CB70 > 1BB*T030CB71 、 1BB*T060CB71 、 1BB*T080BB71 、 1BB*T100BB71 及 1ΒΒ*Τ200ΒΒ71)係基於 PVC 的》 TEFLON®袋係基於PFA的（例如，PFA袋-2.0密耳或-5.0密 耳 TEFLON® 袋）。 V,將細胞轉移至輸送袋 V. 1 將以下物項置於BSC中：2x50 mL離心管；100

mL輸送培養基（V90199.· CIM+10% HS，2 mM 162352.doc 27· 201244708

GlutaMAX，半乳糖及100 u/mL正大黴素 (Gentamicin));及2x5 mL吸量管；無菌輸送袋； V.2 计算所需輸送培養基之體積：所需輸送培養基之 體積（mL)=來自步驟IV.24之細胞總數x 1〇.6。 V·3 將經標記MNC管置於具有平衡管之浮捅式轉子 中，將離心機設定為約467 g，s (i，040 rpm，在具 有4管架之SORVALL HS-4鋁轉子上）並在1〇。〇溫 度下保持1 〇分鐘且使制動器保持於中等設定（對 於Z/eraewiSwper/wge而言’將減速度設定為7)。 V.4 在離心後，在安全櫃中’打開該等管且將上清液 抽出至廢容器中。 V5. 使用丨〇 mL無菌吸量管用5 mL輸送培養基使沈澱 物再懸浮。 V.6 添加培養基以將細胞濃度調節至ΐχ106/π^。 V.7 計算所需正大黴素之體積。 所需正大黴素之體積（mL)=來自步驟γ·2.之細胞 之總體積+500。 V.8 取出3 ml細胞用於保留並轉移至15 mi圓錐管 中。 V.9 將正大黴素（V.7中計算之體積）添加至細胞懸浮液 中並輕輕地混合。 V. 1 0 將細胞懸浮液轉移至輸送袋中。 V.11 對該袋作以下標記：「自冷凍UCBU製備之 MNC」、ID編號、「V90195」、「步驟V.11」、此 162352.doc • 28 · 201244708

Manufacturing Direction之批號、總細胞計數、 今曰日期及操作者之首字母。 V. 12 根據輸送用SOP400.014包裝細胞。細胞單位包括 具有產品說明書之證書：單位編號、批號、細胞 計數、存活率及無菌性資訊。將COA拷貝附加至 此文件。 ν·13 使用〇_5 mL細胞保留物來接種一管TSB培養液且 使用0.5 ml來接種一管酼基乙酸鹽培養液。 V.14 將1_〇 mL試樣作為保留試樣於2-8。(：下儲存一週 時間。對管作以下標記：「自冷凍UCBU製備之 MNC之2-8C保留試樣j' ID編號、「步驟v. I*」、 批號、總細胞計數、日期及操作者之首字母。 V.15 將1·〇 mL試樣作為保留試樣儲存於。對 該管作以下標s己「自冷；東UCBU製備之MNC之 -80°C保留試樣」、ID編號、「步驟v. j 5」、批號、 總細胞計數、日期及操作者之首字母。 以上述方式將該等細胞包裝於若干不同培養基中且隨後 在許多不同溫度下經1至8天時間輸送至不同位點。 實例2 在本實例中’實施分析以檢測以上文實例i中所述之方 式包裝並運輸之臍帶血細胞。 在袋之包裝藉由空運到達後’將包裝於其容器中儲存於 安全位置直至處理且溫度監測器保持隨包裝一起。在處理 前，檢查包裝且記錄包裝中之任何變化β亦自最初解凍原 162352.doc -29· 201244708 始血液單位以供處理起記錄總逝去時間。 開包 打開運輸容器；取出含有huCB_MNC袋之包裝且保持在 指定溫度（RT)下。在生物安全榧（BSC)中，檢查袋之損害 或洩漏。在生物安全櫃中，輕輕地搖動袋以混合細胞。使 用一對無菌手套及魯爾鎖定針筒，將各袋之内含物轉移至 30 m卜50 ml或1〇〇 ml標記為huCB MNC之無菌離心管 中。然後在指定溫度（RT)丁將該等管以4〇〇Xg離心1〇分 鐘。使用10 ml吸量管，抽出來自離心管之上清液，而不 攪亂沈澱物且保存用於無菌性測試（試樣丨）。利用存於臨床 等級生理鹽水中之1 ml 1%正常血清白蛋白(NSA)使細胞沈 版物再懸浮以形成注射用初始細胞懸浮液。 UCB-MNC之存活♦分析及細胞計數 1.存活率分析 在安全櫃中，藉由使用100 μ丨吸頭（tip)將50 μΐ細胞懸浮 液分配並混合至含有450 μΐ補充有1% NSA之生理鹽水之 12X75 mm管中來製備1:1〇細胞稀釋液。使用1〇〇 y吸頭， 將40 μ1稀釋細胞懸浮液移液至存於0.5 ml埃彭道夫管 (EPPENDORF tube)中之10 μ1錐蟲藍溶液中。在藉由若干 次移液混合後，將經錐蟲藍染色之細胞懸浮液裝入經改良 牛鲍氏叶數血球什（Impr〇ved Neubauer c〇unting hem〇Cyt〇meter)中用於在4個各自為Ϊ mmx i mm之大正方形 (含有16個小正方形）中計數染成淡藍色之死細胞及未染色 活細胞之數目。無核RBC可容易地與未染色有核活細胞區 162352.doc 201244708 分’此乃因其在顯微鏡下在物鏡上下調焦時看似反射鏡。 然後，藉由用未染色細胞之數目除以染成淡藍色之細胞及 未染色細胞之總數來計算活細胞之百分比。 2.手動計數 在安全櫃中，藉由將5〇 μΐ上述初始細胞懸浮液轉移至存 於12x75 mm管中之具有亞曱基藍之45〇 μ1 3%乙酸溶液中 來製備1:100細胞稀釋液。將所得細胞懸浮液裝入經改良 牛鲍氏計數血球計之上室與下室二者中用於在上室與下室 二者中在8個各自為1 mmxl mm之大正方形中對染成淡藍 色之細胞之數目計數。藉由用總計數除以8且乘以丨〇〇(稀 釋因數）及10,000來計算細胞數。 3%乙酸使RBC溶解係瞬時的，而有核細胞保持至少4〇分 鐘το好。在補充有亞甲基藍之3 %乙酸中將有核細胞染成 藍色。細胞濃度經最佳調節以生成每1 mmxl mm之正方形 中約有50個細胞之密度。就n2應在NjVlShi範圍内之程度 上而言’源自上（N,)室及下（n2)室之計數係相當的。否 則’重複填充程序及計數以避免因技術缺陷及能力不足所 造成之非隨機性及不精確性》 3.自動化計數 亦利用血液分析儀Beckman Coulter ACT Diff對細胞懸 浮液計數以複檢手動計數之準確性。 細胞準備 在記錄細胞存活率及細胞計數後，將含有細胞之管以 40〇χ发離心5分鐘。抽出各管中之上清液，而不攪亂細胞沈 162352.doc •31 · 201244708 澱物’且用補充有1% NSA之臨床等級生理鹽水使細胞再 懸浮並將其調節至1 X 1 〇5個活細胞/μΐ之濃度。然後，將i μΐ所得細胞懸浮液轉移至兩個〇·25 ml無菌埃彭道夫管（其 中一個用於備份）中。隨後將細胞懸浮液用於以下注射劑 量： a· 4 μ1χ4次注射（16xl05個活細胞） 13.8口卜4次注射（32><105個活細胞） 〇.16以1\4次注射（64乂105個活細胞）。 簡言之，將具有細胞之埃彭道夫管輸送至操作室。在操 作室中，將細胞懸浮液填充至具有補充有1% NSA之臨床 荨級生理鹽水的漢密爾頓針筒（Hamilton syringe)及蝴蝶針 中。更具體而言，經由蝴蝶針將適當體積之細胞懸浮液填 充至50从1或丨00 μ丨漢密爾頓針筒中，然後投與3組個體a、 B及C。對於A組或B組而言，使用50 μι漢密爾頓針筒來抽 出 20 μΐ (5 μ1χ4)(對於 Α組）或 40 μΐ (1〇 μΐχ4)(對於 Β組）。對 於C組而言，使用1〇〇 μΐ漢密爾頓針筒來抽出80 μ卜在每 一個體之脊髓之背根進入區_進行4次注射。 將上述備份管以4〇〇Xg離心5分鐘。抽出所得上清液且保 存用於無菌性測試（試樣2)β然後使細胞經受藉由直接免疫 螢光之譜系分析（參見下文）及集落形成單位（CFU)分析。 無菌性測試 使上述試樣丨及試樣2二者（步驟38)在進行醫院之標準方 案或適當手動方案後立即經受無菌性測試。 集落形成單位（CFIJ)分析 162352.doc •32· 201244708 首先對活細胞數計數且隨後進行培養以確定在2週期間 内所形成CFU之數目。簡言之，將細胞移液至存於IMDM (杜貝克氏改良鷹氏培養基（Iscove's Modified Dulbecco's Medium))中之補充有生長因子rhG-CSF及rhIL-3之預混合 甲基纖維素培養基（Methocult H4230 ; STEMCELL TECHNOLOGIES公司）中。最終調節濃度係1°/。甲基纖維 素、30%胎牛血清、1%小血清白蛋白、10-4 Μ 2-酼基乙 醇、2 mM 1-麵醢胺酸、10 ng/ml rhIL-3及 500 ng/ml rhG-CSF。輕輕地渦旋細胞且將1.1 ml細胞懸浮液（5xlO4個細 胞）以一式兩份平鋪於35 mmxlO mm無菌培養皿（FISHER 8(：1£1^”1(：)上》在37°(：下於水飽和5% C02培育器中培養 細胞後，利用標準倒置顯微鏡對由20個或更多個細胞組成 之CFU-GM集落手動計數。記錄受細菌或真菌污染之培養 物（若有）。 hUCB-MNC之直接免疫螢光分析 以下係當存在足量剩餘細胞時欲實施之可選分析。端視 制度性實踐而定，分析技術可係雙或單平臺，且實施或不 實施洗滌。使用ISHAGE選通策略來計數CD34+細胞及 CD133 +細胞。 此分析所需試劑包括針對人類細胞表面抗原之單株抗體 (IgG-PE、CD45-FITC、CD34-PE及 CD133-PE)、7-胺基-放 線菌素（7-AAD ; eBioScience 或等效物）、ImmunoPrep 全血 溶解試劑（BECKMAN COULTER)、洗滌緩衝液（補充有 0.1°/。疊氮化鈉之PBS)、染色緩衝液（補充有0.1%疊氮化鈉 162352.doc -33- 201244708 及1% NS A之PBS)、1 %低聚甲醛溶液及12x75 mm聚苯乙烯 測試管。以下係染色程序 1. 對於存活率分析之步驟7製備之細胞懸浮液而言，若 需要，用1% NSA將有核細胞計數調節至<lxl07/ml。 2. 標記12x75 mm管，如下分配抗體及細胞： 抗體 管1 管2 管3 CD45-FITC (μΐ) 20 20 20 CD34-PE (μΐ) - 20 CD133-PE (μΐ) - - 10 IgGl-PE (μΐ) 20 - _ 7-AAD (μΐ) 5 5 5 細胞試彳i〇iL) 100 100 100 3. 輕輕地渦旋且在黑暗中於4°C下靜置20分鐘或在室溫 下靜置30分鐘. 4. 使用Q-Prep分配器及ImmunoPrep全血溶解試劑進行溶 解、中和及固定染色。在黑暗中靜置至少1小時，然 後獲取信號，或 4a.將500 μΐ RBC溶解緩衝液添加至細胞懸浮液中，輕輕 地混合且在黑暗中於室溫下培育10分鐘。用2 ml冷洗 滌緩衝液洗滌兩次。在2-8°C下以30〇xg離心5分鐘。 移除上清液，使細胞再懸浮於0.5 ml 1 %低聚曱醛溶 液中》 5. 使用如圖XI中繪示之ISHAGE方案獲取不小於75,000 之CD45 +事件及最低100之CD34+事件。 圖6中顯示使用依照ISHAGE導則之方案進行CD34計數 之實例。使用無洗滌方案用CD45-FITC及CD34-PE標記細 胞。在分析前，添加7-AAD。在SS對CD45之細胞圖上設 162352.doc -34- 201244708 定區域A以描繪白血球。設定區域B以包圍CD34 +ve細 胞。在針對（A及B)選通之SS對CD45之點圖上設定包括弱 陽性CD45細胞之區域C »在SS對CD45之點圖上繪製圍繞 淋巴球之區域D且使用其來選通SS對FS之圖。繪製區域E 以包括所有淋巴球且將此區域拷貝至針對（A及B及C)選通 之另一散佈圖（E2)上。在SS對7-AAD之點圖上繪製區域F 以排除7-AAD陽性細胞（死亡）及針對此區域選通之所有先 前圖。然後將區域E2中之細胞記錄為CD34 +細胞。 1.袋型及溫度 如圖2中所示，當在上述3種類型之袋中經3天時間運輸 幹細胞時，袋型與運輸溫度二者皆不同程度地影響回收率 (圖2A)、細胞存活率（圖2B)、CD 34+細胞群體之含量（圖 2(：)、0〇13 3 +細胞群體之含量（圖2〇)及€?1；(圖^)。 舉例而言，儘管回收率及細胞存活率在3種袋型之間係 相當的（參見圖2A及2B) ’但彼等利用HYCLONE PE試樣袋 及TERUMO (PVC)袋所運輸細胞中CD 34+細胞群體及CD 133+細胞群體之含量較高（圖2C及2D)。相反，利用 TEFLON®袋運輸之細胞之CFU顯著高於利用HYCLONE PE 試樣袋運輸之細胞，利用HYCLONE PE試樣袋運輸之細胞 之CFU顯著高於利用TERUMO (PVC)袋運輸之細胞（圖 2E)。

就運輸溫度而言，在RT下運輸之細胞顯示較低回收率或 細胞存活率之趨勢（圖2A及2B)。然而，意想不到的是，不 管袋型，在RT下運輸之細胞之CD 34 +細胞群體含量及CD 162352.doc -35- 201244708 133 +細胞群體含量較高（圖2C及2D)。此外，亦意想不到的 是，在TEFLON®袋中於RT下運輸之細胞具有最高CFU值 且類似地，在HYCLONE PE試樣袋中於RT下運輸之細胞亦 具有高CFU值。 上述結果證明，在RT下運輸幹細胞具有意想不到之較高 CFU值或較高CD 34+細胞群體含量及CD 133 +細胞群體含 量。 2.培養基 亦檢測運輸培養基之效應。有人發現，在約2天後，在 CIM培養基中運輸之細胞比彼等.在IMDM中運輸者具有更 高細胞存活率（圖3及4)。特定而言，在5天後，CIM培養基 中之細胞仍具有約74%之存活率。 然後比較CIM培養基與HYPOTHERMOSOL® (HTS)培養 基（BIOLIFE SOLUTIONS)。吾人發現，一般而言，在 TEFLON袋中在RT或4°C下於CIM培養基中運輸之細胞的細 胞回收率、存活率及CD 34 +細胞含量與彼等在HTS培養基 中者相當或比其高（圖5A-C)。意想不到的是，在CIM培養 基中於RT下運輸之細胞具有CD 34+細胞含量、CD 133 +細 胞含量及CFU之最高值。亦發現，不管袋型，1% NSA會 改良HTS與CIM二者中之細胞存活率。參見下表1至3。 表1 運輸條件 HTS 4°C CIMRT CIM 4°C 用於細胞再懸浮之培養基 PBS NSA PBS NSA PBS NSA 存活毕 67.3% 94.0% 50.0% 87.0% 68.7% 96.0% 運輸袋：Teflon 162352.doc -36- 201244708 表2 運輸袋 Terumu HyCIone 輸送條件 CIMRT CIM 4eC CIMRT CIM 4°C 用於細胞再懸浮之培養基 PBS NSA PBS NSA PBS NSA PBS NSA 存活率 14.0% 83.0% 28.5% 87.5% 16.5% 75.5% 10.5% 80.0% 表3 小時 0 1 2 3 4 5 存活率(錐蟲藍排除） 87.5% 80.0% 81.0% 81.0% 82.0% 80.0% 存活率(7AAD) 78.7% 79.0% 80.2% 80.5% 79.4% 83.1% 使細胞懸浮於1% NSA中 總之，吾人發現，在用於測試各程序之袋中，TEFLON 袋獲得最佳CFU計數。然而，由於該等袋不存在GMP源且 TEFLON袋需要對内含物進行開口處理，因此應格夕卜小心 避免污染風險。HYCLONE袋比TERUMO袋具有更高存活 率、有核細胞總計數及CFU計數。因此，選擇HYCLONE 袋進行進一步運輸及實驗。 實施其他分析以檢測在CIM袋及TEFLON袋中運輸之細 胞上之溫度。數據顯示如下。 1. TEFLON袋中之人類單核細胞，在4°C/不依賴C02之培養 基下培育 分析 第0天，週一 第1天，週二 第2天，週三 第4天，週五 第7天，週一 FACS CD34 0.93% 0.96% 1.07% 0.76 1.04% CD133 0.64% 0.89% 0.58 0.6 0.59% 細胞存活率 錐蟲藍陰性 94% 92% 90% 82% 86% 總MNC數目 35xlOb 33xl0b 31xl0b 25x10° 22x10b 2. TEFLON袋中之人類單核細胞，在4°C/不依賴C02之培養 基下培育 162352.doc -37- 201244708 分析 第0天，週一 第1天，週二 第2天，週三 第4天，週五 第7天，週一 FACS CD34+ 0.88% 0.68% 0.80% 0.73% 0.95% CD133+ 0.99% 1.02% 0.79% 0.60% 0.67% 細胞存活率 錐蟲藍陰性 94% 90% 87% 77% 84% 總MNC數目 40x10。 36x10。 33χ106 28x10° 26x10b 3. TEFLON袋中之人類單核細胞，在RT/不依賴C02之培養 基下培育 分析 第0天，週一 第1天，週二 第2天，週三 第4天，週五 第8天，週二 FACS CD34 0.88% 1.05% 1.99% 2.18% 1.46% CD133 0.92% 1.18% 2.20% 2.19% 1.42% 細胞存活率 錐蟲藍陰性 98% 89% 83% 74% 48% 總MNC數目 31xl0b 26x10。 23xlOb 19xlOb 8.4x10。 4. TEFLON袋中之人類單核細胞，在37°C/不依賴C02之培 養基單元P.22下培育 分析 第0天，週一 第1天，週二 第2天，週三 第4天，週五 第7天，週一 FACS CD34+ 0.88% 0.56% 0.55% 0.65% 0.62% CD133 0.99% 0.64% 0.71% 0.56% 0.87% 細胞存活率 錐蟲藍陰性 94% 86% 81% 66% 80% 總MNC數目 4〇xl06 2〇xl06 17χ106 14χ106 6.4x106 如上表中所示，在RT下在不依賴C02之培養基中於 TEFLON袋中培育之人類單核細胞在8天時間内具有CD34+ 細胞或CD133 +細胞之最高相對含量。 應將較佳實施例之上述實例及說明視為舉例說明，而不 應視為限制如藉由申請專利範圍所界定之本發明。本文所 引用之所有出版物皆以全文引用方式併入本文中。如應瞭 解，可利用上文所述特徵之許多變化形式及組合，此並不 162352.doc -38- 201244708 背離如申請專利範圍中所述之本發明。不應將此等變化形 式視為背離本發明之範圍，且所有此等變化形式皆意欲包 括在下文申請專利範圍之範圍内。 【圖式簡單説明】 圖1係顯示幹細胞採集、處理、運輸及在收到後進行測 試之實例性程序之操作的流程圖。 圖2A至2E係一組圖，其顯示’當在3種類型之袋中經3 天時間運輸幹細胞時’袋型與運輸溫度二者皆不同程度地 影響回收率（圖2A)、細胞存活率（圖2B)、CD 34+細胞群體 之含量（圖2C)、CD 133 +細胞群體之含量（圖2D)及CFU(圖 2E) 〇 圖3係顯示IMDM及CIM在RT下對細胞存活率之效應的表 及圖。 圖4係顯示IMDM及CIM培養基在RT及4°C下對細胞存活 率之效應的表及圖。 圖5 A至5E係一組圖，其顯示，當在TEFLON袋中於RT或 4°C下運輸細胞時，CIM及HTS培養基對細胞回收率（5A)、 存活率（5B)、CD 34+細胞含量（5C)、CD 123 +細胞含量（5D) 及CFU(5E)具有不同效應。 圖6係顯示對周邊血中之CD34 +細胞計數的一組直方圖。 圖7係所測試3種袋之照片：HYCLONE聚乙烯袋（左）、 TERUMO聚氣乙烯袋（中）及TEFLON袋（右）。 162352.doc -39-

Claims (1)

1. 201244708 七、申請專利範圍： 1. 一種包裝產品，其包含 含有複數個多能細胞之組合物，及 容納該組合物且包含基質之容器，其中該基質包含聚 合物》 2. 如晴求項1之包裝產品’其中該聚合物係聚四氟乙稀 (PTFE)、全氟烧氧基（PFA)、氣化乙烯丙烯（fep)、聚二 氟亞乙烯（PVDF)、聚乙烯或聚氯乙烯（pvc) » 3. 如請求項1之包裝產品’其中該容器係袋、管、針筒或 注射器用小瓶。 4. 如請求項1之包裝產品，其中該等多能細胞係幹細胞。 5. 如請求項4之包裝產品，其中該等幹細胞係造血幹細 胞、間質幹細胞或胚胎幹細胞。 6. 如凊求項1之包裝產品，其中該組合物含有周邊血細 胞、臍帶血細胞、骨髓細胞或胎盤血細胞。 如睛求項1之包裝產品，其中該組合物具有在5t：至3〇。〇 之範圍内之溫度。 其中該組合物具有在l〇°C至3〇。〇 其中該組合物具有在15。(：至25°C 其中該組合物含有培養基。 ’其中該培養基係不依賴C02之 8.如請求項7之包裝產品 之範圍内之溫度。 9_如請求項8之包裝產品 之範圍内之溫度。 10.如請求項1之包裝產品， Π.如請求項1〇之包裝產品 培養基。 162352.doc 201244708 12. 如請求項"之包裝產品’其中該培養基含有血清。 13. 如請求則之包裝產品’其中該血清係人類血清。 14. 如請求t之包裝產品，其中該組合物係醫藥組合物且 含有醫藥上可接受之載劑。 15. 如請求項丨之包裝產品，其中該容器經密封。 16_如請求項丨之包裝產品，其中該組合物含有至少ixi〇6/mi 之細胞。 17·如請求項!之包裝產品’其中該組合物含有已經冷凍並 解凍之周邊血細胞、臍帶血細胞或骨髓細胞。 18·如請求項丨之包裝產品，其中該組合物含有未經冷凍之 周邊血細胞、臍帶血細胞或骨髓細胞。 19.如晴求項i之包裝產品，其中該等多能細胞係或 CD133+ 〇 2〇. 一種製備如請求項1之包裝產品的方法，其包含 提供含有多能細胞之組合物； 提供包含基質之容器，其中該基質包含聚合物； 將該組合物置於該容器中；及 密封該容器。 21. —種運輸多能細胞之方法，其包含提供如請求項丨之包 裝產品及將該包裝產品遞送至接收者。 22_如請求項21之方法，其中該遞送步驟係在5(?c至3〇艽之範 圍内之溫度下實施。 23.如請求項22之方法，其中該遞送步驟係在…它至儿工之 範圍内之溫度下實施。 162352.doc -2 - 201244708 24.如請求項22之方法，I由 其中該遞送步騾係在！5。(：至25 °C之 範圍内之溫度下實施β 25. 如請求項21之方法，其中在該遞送後，該等多能細胞具 有超過40%之回收率。 26. 如請求項21之方法，其中太 路 _ _ . 丹1f在該遞送後’該等多能細胞具 有超過70%之存活率。 27. 如請求項21之方法，其中在該遞送後，該等多能細胞具 有超過0.5%之CD34 +細胞》 28. 如請求項21之方法，其中在該遞送後，該等多能細胞具 有超過0.25%之CD133 +細胞。 29. 如請求項21之方法，其中在該遞送後，該等多能細胞能 夠形成超過2 CFU/5xl04個細胞。 30. 如請求項21之方法，其中該遞送步驟係經至少i天實 施0 3 1.如請求項30之方法，其中該遞送步驟係經至少3天實 施。 32.如請求項3〇之方法，其中該遞送步驟係經至少$天實 施。 162352.doc