TW201241183A - Thermostable paenibacillus xylanases - Google Patents

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201241183 六、發明說明： 相關申清案 本申請案主張美國臨時申請案第61/391,260號的優先權 (申請於2010年10月8日）’該内容在此處全部併入作為參 考資料。 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於突變的木聚醣酶。 【先前技術】 内切β-1，4-木聚酶酶(E.C.3.2.1.8)藉由隨機水解來解聚木 1醣骨幹。木聚醋是植物細胞壁中僅次於纖維素的第二種最 常見的半纖維素。近來，木聚醣和木聚酶的各種應用一直備 受關注，例如：動物飼料的添加物，麵包、食品和飲料的製 造上’紙漿和紙類的處理，以及供生產生質酒精之生物 處理步驟。 雖然來自嗜熱性生物的木聚醣酶已可獲得，但它們可能 並不適合工業製程。因此’有需要具改善的酵素活性及耐熱 性的突變木聚膽酶。 【發明内容】 本發明至少部分係基於發現了多種具增進的酵素活性及 耐熱性的突變類芽孢桿菌（尸⑽）木聚聽酶。因此， 本發明係關於包括突變木聚醣酶、編碼它們的核酸，以及使 用木聚酷酶的方法。 在一方面，此處所描述的是一種分離的多肽，其包含與 木聚醣酶Χ-Η2 (XylX-H2 )胺基酸序列，即SEQ ID ΝΟ:2， 至少有90%相同度的胺基酸序列。此多肽含有在對應於SEq ID NO:2的第44個殘基的位置之Ala，在對應於SEQ ID NO:2 的第345及346個殘基的位置之兩個胺基酸的缺失，並且與 小枯草;t干函（⑺叫办^5•例治）的野生型木聚酷酶 201241183 相較下表現出較低的最適溫度和較高的比活性。在一些具體 實施例中，該多肽包含SEQIDN0:2與至多50個，例如：1、 10、15、20、25、30及45個的保守胺基酸置換。此多肽可 包含SEQIDNO:2的胺基酸序列。 在另一方面，此處所描述的是一種分離的核酸分子，其 具編碼包含與SEQ ID NO:2胺基酸序列有90%相同度的胺 基酸序列之多肽之核酸序列，其中該多肽包含在對應SEqID NO:2的第44個殘基的位置上之Ala，在對應SEQ ID NO:2 的第345及346個殘基的位置之兩個胺基酸的缺失，並且與 小枯草桿菌的野生型木聚醣酶相較下表現出較低的最適溫度 和較高的比活性。在某些案例中，該核酸分子的核酸序列為 SEQIDNO:l 〇 本發明尚包含一種含有此處所述之核酸分子的表現載 體，以及具有此表現載體的宿主細胞。 在又另一方面，本發明關於一種包含突變木聚醣酶之胺 基酸序列之分離的多肽，例如：木聚醣酶X_R (Xylx_R)木聚 醣酶X-Hl (Xylx-Hl)、木聚醣酶X-Ll (Xyk-Ll)、及木聚醣 酶 X-L2 (Xylx-L2)。 本發明亦包含一種降解木聚醣的方法，該方法包含提供 此所述的木聚醣多肽，以及混合木聚醣和此多肽。 本發明一或多個具體實施例的細節闡述於如後附隨的圖 式及說明。本發明之其它特徵，物件及其優點將於說明、圖 式及申請專利範圍中清楚呈現。 【實施方式】 此處所述者為五種突變木聚醣酶，其係由來自小枯草桿 菌BL11之41-kDa木聚醣酶（Xylx)的活體外致變而來。具 體而言，這些突變的其中一種Xylx_H2擁有pH適應性、耐 熱性及高比活性。這些特徵使此木聚醣酶適於多種應用。 本發明包括分離的木聚醣多肽及其功能同等物。圖2表 201241183 示五個突變木聚聽_的胺基酸序列之比對，即

XylX~Hl、XylX-m、XylX-Ll 及 XylX-L2。XylX_H2 的胺 基酸序列（SEQIDNO:2)表示於圖7。 木聚醣酶的功能或特徵可包括，例如··酵素活性、耐熱 性、動能參數、溫度或展現最佳活性的溫度範圍（即最適溫 度）、及pH或展現最佳活性的pH範圍。該技術領域具有通 常知識者將能透過技術領域中已知及下述的方法來決定木聚 醣酶的功能和特徵。

此處所使用之「分離的多肽」乙詞或「實質純化的多肽」 乙詞係指實質上不含天然相連之分子之錄，即天然相連之 分子至多丨含該乡肽的製備物之乾重量的篇。純度可藉由 任何適當的方法啦’例如，管柱層析法、聚丙烯酿胺膠體 電泳法及南效液相層析法（HPLC)。 兩段胺基酸序列的辨識可由Karlin及Altschul 之 Proc， =atl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990 所描述的算法來決 定’其係由 Karim 及 Altschul 之 Natl. Acad. Sci. USA 5873-5877, 1993修正而來。此種算法被納入施

Mol. Biol. 215:403-410, 1990 的 NBLAST 及 XBLAST 程式 中。BLAST核苦酸的搜尋係利用侧^丁程式、分數= 議、字長=12，以取得與本發明的核子具同源性的核 苦酸序列AST蛋白質的搜尋係利用 XBLAST程式、分 數—50,字長=3’以取得與基準多肽具同源性的胺基酸 序列。為了並列比較具缺口的序列，使用她⑽等人於

Nucleic Acids Re, 25:3389-3402, 1997 Gapped BLA =式。使用BLAST及Gapped BLAST程式時，採用 侧程式的初始參數（例如：狐繼及丽^滞）。來見 網址 ncbi.nlm.nih.gov.。 〆 此處所述之多肽的胺基酸序列可能不同但不 聚「,Λ素活性。例如，其可包含-❹個保守胺i 酸置換。保寸胺級置換」係指某個絲賊紐另一個具 4 201241183 有相似側鏈的胺基酸所取代。該技術領域中已定義具有相似 側鏈的胺基酸殘基之家族。這些家族包括具有鹼性側鏈（例 如，賴胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如，天冬胺酸、 麩胺酸）、不帶電極性側鏈（例如，甘胺酸、天門冬胺酸、麵 醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸）、非極性側鏈 (例如，丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯 丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸）、貝塔分支側鏈（例如，蘇胺酸、 纈胺酸、異売胺酸）及芳香環側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、 色1¾¾，、組胺酸）的胺基酸。因此，以一個在犯卩ID no.2 經預測為非必要性胺基酸的殘基為例，較佳係以相同側鏈家 族中另一個胺基酸殘基來取代。或者，也可於SEQ Ι〇 n〇:2 的全部或部分序顺機導人錢，比如使闕和誘變的方 式’而其所造成的突變可被用纟篩選木聚酶酶的活性以辨識 出如下段實例中仍保有活性之突變。 伞知乃的夕肽可以合成或重組的方式獲得。為製備一毛 重組多肽，可以將編贼多肽的核酸連接另—編碼融合配伯 體的f酸，例如，麩胺基硫轉移酶（GST)、6x-His抗原決笼 位置標記（6x-Hisepitopetag)、或M13基因3蛋白質（ΜΓ

Gene 3 protein)。所得之融合核酸在合適的宿主細胞内所表項 的融合蛋白質能以該技術領域中已知的方法予以分離。經 ，的融合蛋白質可進-步加以處理，例如，藉由酵素切割以 去除融合配偶體而得到本發明的重組多狀。 ^發明亦包含編碼此處所述之突變木聚輯多狀的對應 核，序列。在-雛的頻實施财，該減包含聊ι〇 n- cDNA或基因體DNA )、rna分子⑷如，_ >、 =NA的_物。DNA或·A _似物可由 ，其結構不同於任何天_生的核酸 4生的基因體核酸之片段的結構。因此該名詞涵蓋，例如， 201241183 (a) DNA ’其具有天贿生之基@體DNa分子的部分之 :===生(=因;:的該分子之該 之基因趙DNA，其;式係使二 DNA ; (e)分離的分子，如 ·¥、土因體片段、聚合鎢鏈鎖反應（PCR)產生的片段， ”段;以及⑷重組核酸序列，其為雜交基因之一部 二合蛋白f的基因。上述之核酸可用來表現本發 控=產=可以操作性地連結测 載，係指_個可以運輸連結於其上之另—健酸的核酸 二三載體能自賴製或插入宿主腿。載體的實例包含質 热、Li斯ΐ體（C〇Smid；>、或病毒載體。本發明之載體包含處 乂j口在宿主細胞中表現該核酸的狀態。較佳地，該載體包 3 -或多種操作性地連結到欲表現之核酸序列的調控序列。 調控，列，含啟動子、職子、和其它表難歡元件（例 =多腺紐信息）。調控賴包含直紐滅序列持續表現 歹丨以及組織特異性調控及/或誘發的序列。表現載體的 «^十y以取決於諸如轉型細胞的選擇、欲取得之蛋白質的表 ，水平、及其類似者之因子。表現載體能被引入宿主細胞以 產生本發明的多肽。— 本發明的範圍尚包括一種含有上述核酸的宿主細胞。實 例包^大腸桿菌（£· c〇//)細胞、昆蟲細胞（例如，使用桿 =病毒表現載體）、酵母菌細胞、植物細胞、或哺乳類細胞。 ’見’如 ’ Goeddel，（1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 〇 為了製造本發明的多肽，可在能表現本發明之核酸編碼之多 肽的培養液中培養宿主細胞’並從培養的細胞或細胞培養液 中純化出該多肽。另一種情形，本發明的核酸可利用如T7 啟動子調控序列和T7聚合酶在活體外轉錄和轉譯。 201241183 本發明亦包含此處所述之木聚醣酶突變多 其使用方法。該組合物可以被用於各種方法 取二物。 解之方法。舉例而言，它們可以用於υ以酵素人= 醣之農林廢棄物的生物量轉換’供生質酒精製】^ 驟;”改善含木聚㈣物飼料及飼料成份處= 維來源之紙漿之漂白前處理；4)作為洪2 其匕涉及木聚醣降解之工業製程。 久、、 以下特定之實例僅供作說明之用，而非以任 其餘的揭露内容。無綱-步的_，咸相信本發 =域中具有通常知識者基於此處之說日脚可彻本發明至 ;所有在此處被引用的出版物皆以參考資“全份 實例 小枯草桿菌（Paemkc说奶⑺哪加似饥^) BL-11品系先 前在一個高溫及鹼性的環境下被鑑定並分離出來。參見 et al_，Bi〇resource Technol. 98: 2727-2733, 2007。來自 1枯草桿 菌BL-11編碼41-kDa之内切木聚醣酶（pre_Xylx)的開放^ 讀框架（ORP)係選殖並表現於大腸桿菌；編碼其内切葡聚 糖酶的ORF也已鑑定出來。參見，Ko et al，Biores〇ur Technd 101: 7882-7888, 2010。pre-XylX的胺基酸序列在資料庫裡和 與其最接近的序列只有73%相同。參見，Ko et al.，Process

Biochem. 45: 1638-1644,2010。 ' 在本研究中，活體外誘變的操作係用來改善源自小枯草 桿菌BL11、大小為41-kDa之木聚醣酶的酵素活性及耐熱 性。非分泌型細胞内木聚醣酶XylX_R係由直接誘變所製造。 四個突變係利用以作為模板的易錯PCR經過兩個階 段的誘變而獲得。

8 S 201241183 (1)材料和方法 除非特別說明，所有使用的化學 細而來韻有分財 (Darmstadt，德國）而來。細菌 二 .erck

Lr-Bri培魏。LB培養心 脒，5 g/L+酵母菌萃取物，及5孤Naa。載體pBc 大腸桿菌NM522係來自stratagene (La j〇ua，美國）。载體 pETUb、PET-25b及大腸桿菌舰⑽（腦）係自

_dis〇n，美國）。丁-赠〇r p〇ptima係來〆別 Biotech (^b)〇PCR Bio Basic, Inc. (MarkhJ

Ontario,加拿大)合成。 ’ ^步驟之活體外解之操作：⑴藉由直接輕建構僅 含成熟XylX (缺乏信號肽）的新開放式閱讀框架，（2)利用 易錯PCR製造π/Ζ的隨機突變庫，及（3)進一步的直接誘 變以消除分離而出的突變中不需要的部分。 第一階段和第二階段的PCR所使用的模板DNA係帶有 的 pBCKS(+)。參見 ’ Ko et al., Bioresour Technol. 1〇1: 7882-7888,2010。由第二階段所製造的突變DNA被用來作為 第三階段誘變的模板。第三階段的誘變與表現系統之建構協 同作業。前兩個階段所使用的引子對包含X3shH-F (5,-AGCAAGCTTGGCAACAACGATCAC-3,;與 XylX 之 N 端配對的核苷酸序列以底線標示）及X3shX-R (5 ’ -GCCTCTAGATCACCGGATCTCCA-3，;與 XylX 之 C 端 配對的核苷酸序列以底線標示）。 直接誘變係利用傳統PCR的流程。;cy/Z突變庫的建立係 使用Clontech (PaloAlto)的多樣化PCR隨機誘變套組並 參照其使用手冊之指示，以易錯PCR製造隨機突變。PCR產 物在以QIAquick純化套組（Qiagen，希爾登，德國）純化後 被選殖到質體pOptima裡。轉型株則養在LA (Luria-Bertani 洋菜膠）母本培養jni供進一步突變篩選。 201241183 篩it及分離XylX的突變係依照先前描述的流程並稍加 修正而進行。參見 ’ Ko et al.，Bioresour Technol. 101: 7882-7888, 2010。NM522轉型株係於含盤尼西林（loo 的LA母本培養皿中從密度為每個9公分的培養皿上有約50 到100個菌落中挑選而出。在37°C培養隔夜後，以每個母本 培養皿在含燕麥木聚醣（0.2%，w/v)、盤尼西林（1〇〇 、 D-環絲胺酸（1〇〇 pg/ml)及ipTg (異丙基-β_〇·硫代半乳糖 苷，1 mM)的LA培養jil製造出二次複型。複型在37〇c培 養4小時並於65°C加熱30分鐘。複型上的菌落係使用氣霧 劑噴灑〇_1% Triton X-100而溶解。經過2小時在65。(：進行 酵素反應後，以剛果紅染該複型。參見如，Wood et al.，Methods Enzymol. 160: 59-74, 1988。選擇表現出比較多清晰帶的菌落 並檢查以綠認該突變木聚醣酶的活性及序列。 編碼XylX突變的核苷酸序列以FS DNA聚合酶螢光染 劑終結子的反應來決定。定序產物以Applied Biosystems 377 擴展自動化定序儀偵測（Applied Biosystems，Foster City，CA, USA)。核苷酸序列和由其推衍出的胺基酸序列利用EMBL 計算服務（網址為ebi.ac.uk/Tools/sequence.html)的序列分 析工具來分析。相關序列係利用BLASTP 2.0及FASTA程 式搜尋資料庫而取得，即（SwissPort，PIR, PRF，and GenBank)。四個砂ZZ突變的核酸序列，即;万7、 砂/Z-Li及砂/义-12在GenBank分別以登入號HM630610, FJ168524, FJ168525 andHM630609 所儲存。 突變基因所編碼的胺基酸序列以各種軟體分析》預測的 信號肽和切點係利用N N( neural networks)及HMM (hidden Markov models)的方法分析。保守區域係利用interProScan (EMBL EBI)及PSI-CD (NCBI)來搜尋。最後，推衍出 的突變胺基酸序列以ClustalW (EMBL-EBI)與XylX及 pre-XylX序列進行多重比對。NCBI的保守區域搜尋服務(The Conserved Domain Search Service)被用來分析功能性酵素區

10 S 201241183 域。以SWISS-MODEL Workspace來模擬木聚醣酶的結構。 使用Novagen (Madison) pET表現系統以在大腸桿菌表 現基因。利用PCR增幅所選的pOptima菌落中含突變序列的 DNA片段。利用I和又Τζο I切割增幅的產物、將其選殖 入pET15b及pET25b ’並以此轉型大腸桿菌圓阳斗 (DE3)。 表現及純化XylX的突變係依照先前描述的流程進行。 參見，Ko et al·，BioresourTechnol. 101: 7882_7888, 2010。 標準木聚醣酶試驗係使用二硝基水楊酸（DNSA)方法， 並以D-木糖作為基準。參見如’ KCnig et al., Anal. Bioanal. Chem. 37: 80-87, 2002。易言之，含3〇 μ1的酵素樣本和3〇〇 μΐ、1.5%的燕麥木聚聽的反應混合物在pH 7、60°C的指定溫 度下放置。該反應以加入150 μΐ的DNSA (終止溶液）終止。 接著將該反應混合物離心並將上清液煮沸。煮沸的樣本接著 以ODmo測量。酵素活性（lUs)依上述的方法計算。使用的 緩衝液為100 mM磷酸緩衝液。溫度對於反應的影響係於將 反應混合物放置在範圍為40到80°C的溫度下實驗。所有的 試驗都進行三重複。 反應進行在最適條件下，即pH 7和60。(：，使用5到40 mg/mL的燕麥木聚醣溶液。所建構的木聚醣酶活性對受質濃 度的雙倒數Lineweaver-Burk圖形係利用線性回歸來估算 XylX-H2-25b及XylX-L2的動能參數。氡故值的估算係利用

Slgma圖形軟體ver· 10.0 (SPSS，Chicag〇)之非線性回歸來加 入雙曲線Michaelis-Menton方程式。 (2)XylX突變的基本骨幹： 為了確保所有胃錯PCR柄發的突變域在成熟的酵 素裡’即XylX ’而不出_师命汉的信號肽，該僅含初汉 編碼序列的ORF係由直接輕建構而成。依此所得到木聚醣 201241183 . ί 料 XylX_R ° X艰、Pre-XylX 及 XylX_RN 端序列的 經二圖1 ° Pre-XyK信號肽（39個胺基酸的長度）已 冓以—段8個胺基酸的人造肽，即MTMIITSL，所 =㈣細關料。在縣株的培養 jylX_R及Xylx酵素活性的粗略估算係以粗萃取物在 酴音、、nf 7rc中進行。其結果統整在其下之表卜未發現 ” /性的差異。融合募肽到Xylx的N端對於酵素活 有任何重大的影響。 表1·比較在不同溫度下，Xylx_R及兩個XylXs的酵素活 性。酵素活性以每!!^的全部蛋白質iJU來表示。、

Ij^c) ^~^Sli~ii~^J~1T ~P〇pSna-^/Z-i? ^04.03 1016.30 934.69 4〇ΓΊ^636~457Γ pBCKS(+)_X 932.59 1242.46 1091.99 547.11 170.31 4189 p〇ptima-xy/Z 733.12 976.97 806.92 419.16 146.38 31 4〇 (3)具增進特性的突變 易錯PCR所製造突變庫經篩選後，獲得兩株具增進活 性的突變。其中一個突變為錯異（即T44A)突'^，即

XylX-Hl。另一個為單一核苷酸所造成的缺失突變， XylX-Ll 〇 刪降XylX(或Xyl-R)的C端會造成酵素活性的增加， 其下為更詳細的描述。XylX-H2係由刪除Xyix_m CS端的 兩個胺基酸而來。XylX七2也包含一個C端的缺失。

XylX_R、XylX-m、XylX-H2、XylH-Ll 及 xylH_L2 的胺基酸序列之比較表示於圖2。XylX的功能性區域圖和 突變圖表示於圖3。

S 201241183 (4)反應最適條件及酵素活性 為了評估突變的表現，his標記之酵素以Ni-NTA親和 層析法來純化。於不同pH和溫度下決定純化的酵素活性。 其結果統整於如下之表2。在55oC及pH 7下，XylX-R ' XylX-Hl、XylX_H2及xylH_L1的活性最高。另一方面， XylX-L2的反應最適條件為5〇〇c及pH 8。突變的最適溫 度低野生型酵素約5-mXyK-Ll和XylX-L2較驗 性。表現出最高的木聚醣酶活性者為選殖入pET 25b之 所表現的重組木聚醣酶，於圖2標示為 XylX-，2·25!)。突變的最適活性高於大部分先前研究過的木 t醣酶。參見.Beg et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 326-338, 2001 ； ^ Sa-Pereira et al., Mol. Biotechnol. 24(3)： 2=81’ 2003 °於C端加入6xHis標記使得Xylx_H2_25b的 酵素活性高於以6xffis標記於N端的XyK_H2將近三倍。 表2.六個不同木聚麟的酵素雜及反應最適條件。

酵素ί單位/純化酵素之毫克 b· L 標記之酵素。 c. N端標記之酵素。 13 201241183 致。與XylX-R比較，xylx_m表現出約1〇%活性的增加， 而XylX-Ll則增加50%。值得注意的是，XyJX_L2及 XylX-H2比Xyix七及XyK表現出兩倍或更多的活性。 XylX-Hi之10%活性增加可歸因於T44A突變。須注音的是， =同位置（T44M)的另—健變造鱗素活性重/的喪失 (資料土顯示）。此研究的突變酵素功能良好，其於衫奶〇c 及PH範圍為5-9之間，高於60 %的殘餘活性能持續4個多 小時（資料未顯示）。 上述突變的蛋白質結構係以SWISS_M〇DEL w〇rkspace 模擬。XylX、XylX-R、Xylx_m及父yK H2的構造幾乎相 同。XylX-Ll及Xyix_L2 *同於其它翻其肽序列的缺失。 XylX-R及XylX-L2的構造表示於圖4。 (5)溫度對XylX-H2-25b及XylX-L2穩定度的影響 研究溫度對XylX-H2-25b及XyK-L2穩定度的影變係 於40。。0：到80 %及pH 7下進行。見圖5。於pH 7 到60°C下，該兩個突變木聚醣酶的活性在8小時内皆維持初 始值的80%以上。於70弋及8(fc下，該兩個突變木聚醣酶 的殘餘活性即使經8小時後仍能有約初始值的1〇 0/〇。 以繪製殘餘活性對時間的自然對數圖及其後的線性歸 來估計從40 V到6〇。〇：的半生期。該兩個突變: =料生期’ 其下表3，長於Α部分絲研究的細菌木 聚醣酶。參見，Techapun et al.，Process Biochem. 38: 1327-1340, 2003。。兩個突變在6〇°c的半生期皆超過24小時。即是在7〇〇c 及80°C ’ XylX-H2-25b之内插半生期分別為96及36分鐘。 兩個犬變在70 C及80°C的内插半生期長於來自嗜熱桿菌 iGeobacUlusstearothermophilus) %變的饭。參i:Zh尬gQt al·’ Bioresource Technol· 101: 9272-9278, 2010。優良的耐熱性 使兩個突變皆成為引人注意的生質轉換之候選者，諸如，需 長反應時間的同時糖化及發酵以及其它在較高溫下進行的工

14 S 201241183 業應用。 表3. XylX-H2 and XylX-L2木聚醣酶於pH 7的丰蜂细〇 溫度 t/2 (min) (°C) H2 L2 40 2472 2424 50 1488 1866 60 1656 1764 70 96 66 80 36 12 (6) XylX-H2及XylX-L2的動能參數 決定木聚糖濃度對於XylX-H2-25b、Xyix-L2及 pre-XylX釋放還原糖類的反應速率。見圖6。由圖6得到如 下表4所列突變木聚醣酶在60 °C、pH 7的動能參數。最言 之tax、尺m及匕^值顯示XylX-H2-25b在各方面的優越性= XylX-L2表現了不同的樣態：雖然其還原糖釋放速率在所有 木聚糖濃度下皆高於pre-XylX ’但xyix七2突變的&值是 其中最大的’為 19.23 士 3.62 (mg/mL)。 兔土2^IX- H2_^ XylX-L2於下的動能參數。 木聚醣酶 Vmax Km kcat _(^ol/minmg) (mg/mL) (1/s) H2-25b 11688.02 ±504.74 3.87 ±0.39 8526.46 L2 6642.27± 961.22 19.23 ±3.62. 2780.68 15 201241183

其它實施方式 本說明書揭露的所有特徵可以組合於任何組合中。 明書揭露的每—項特徵可峨另-項具相同、相當、或類;以 =的特徵所取代。因此_有綱，每項揭露的特徵都僅 作為具相當_似特徵之同屬㈣的實例。 該技術領域具有通常知識者可由上述輕易地確認本發明 =重要特徵並可在不會偏離其精神和範圍下，對本發明作不 5的改麦和修正使其適用於各種用途和條件。因此， 利範圍亦包括其它實施方式。 11 【圖式簡單說明】 圖1色一個揭示pre-XylX、XylX和XylX_R N端序列 直圖式這裡所列出的胺基酸序列為該蛋白質N端的領導殘 =。黑色陰影標示的序列為pre_Xylx的信號肽。Xylx_R N 端利用誘變產生之錄的絲麟灰色陰影標示。 圖2為XylX_R和其它突變木聚醣酶胺基酸序列的比對 圖。此處為XylX-R胺基酸序列。陰影標示的殘基表示相較 於XylX-R的序列有改變的位置。 夕囷3為野生型木聚醣轉的功能區域代表圖，即Xy|X及 =種突變木聚_。家族n糖基水解酶以—個富含脯胺酸的 連接子與家族6的碳水化合物結合組件連接。Xylx_L1及

XylX-L2沒有具功能的碳水化合物結合區域。上方的尺規 不胺基酸殘基的數字。 圖4為利用SMSS_M0del所模擬之XyK_R (上圖） f XylX_L2 (下圖）的結構圖。其上已標示出殘基蘇胺酸44、 麩胺酸103及麩胺酸192的位置。

S 16 201241183 圖5為表示在pH7時XylX-H2-25b (上圖）及XylX-L2 (下圖）之耐熱性的圖示。 圖 6 為表示 pre_xyix、Xyix-L2 及 XylX-H2-25b 之反應 速率的圖示。 圖7列出Xyix_H2核酸序列（SEQ ID ΝΟ:1)及胺基酸 序列（SEQIDN0:2)。 圖8列出選殖於pET25b的Xylx_H2之核酸及胺基酸序 列（XylX-H2之c端帶有一個6xHis的標記）。 圖9列出選殖於pET15b的XylX-H2之核酸及胺基酸序 列（XylX-H2之N端帶有一個6xHis的標記）。 【主要元件符號說明】 無 17 201241183 ' 20120130·ACA0065TW-序列表.txt 序列表 • <110>中央硏究院 <120>木聚醣酶XylX-H2、其DNA與胺基酸序列及應用 <130〉 100136818 <150> US 61/391,260 <151〉 2010-10-08 <160> 6 <170> Patentln version 3.5

<210> 1 <211> 1032 <212> DNA <213> 小枯草桿菌（Paenibacillus campinasensis) <400> 1 atgaccatga ttacgccaag cttggcaaca acgatcactt ccaacgagat tggaacgcat 60 gacggttatg actatgaatt ttggaaggac agcggcggtt ccggcagcat gacactgaac 120 agcggcggtg cgttcagcgc tcagtggagc aacatcaaca acattctgtt ccgcaagggc 180 aaaaagttca atgagacaca gacacatcag caaatcggga acatgtcgat cacctacggc 240 gccaactttc agccgaacgg caatgcctac ttaaccgtat acggttggac ggtggatccg 300 ctcgttgaat tttacattgt cgacagctgg ggaacatacc gtccgacagg tacgcataaa 360 ggaaccatta acgtggatgg cggcacgtac gatatttatg agacgacccg ggtgaaccag 420 ccatcgatta aaggaacggc gacgttcaag cagtattgga gtgtccggac gtcgaagcga 480 acgagcggta cgatctcggt cagcgagcat ttcagagcct gggaaagccg cggcatgccg 540 atggggaaaa tgtatgaagt cgccatgacg gtagagggct atcagagcag cggaagcgcg 600 aatgtgtaca gcaatacatt gaccatcggc ggcggcaacc cgggcggtgg aaatccggga 660 gaaggcacga acccgggaac ggtgacgaga gtcgaagccg agaacatgac caaaagcggg 720 cagtacacgg gcaatatcag ctcgccgttc aatggtgttg ccctgtatgc caacaacgat 780 tcggtcaaat atacgcagta tttttccact agcactcata gtttctcact gcggggggcg 840 tcgaacaatg ccaacatggc ccgggtggac ctgaagatcg gcggccagac gaaaggcacc 900 ttctactttg gcggaagcag tcccgcggtg tatacgctaa acaatgtgag tcatggcacc 960 ggcaatcagg agattgagct gattgttacg gcggatgacg ggacatggga cgcctacatt 1020 gactatctcg ag 1032

<210> 2 <211> 344 <212> PRT <213> 小枯草桿菌（Paenibacillus campinasensis) <400> 2

Met Thr Met lie Thr Pro Ser Leu Ala Thr Thr lie Thr Ser Asn Glu 1 5 10 15 lie Gly Thr His Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly 20 25 30

Gly Ser Gly Ser Met Thr Leu Asn Ser Gly Gly Ala Phe Ser Ala Gin 35 40 45 第1頁 201241183 20120130-ACA0065TW·序列表.txt

Trp Ser Asn lie Asn Asn lie Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn 50 55 60

Glu Thr Gin Thr His Gin Gin lie Gly Asn Met Ser lie Thr Tyr Gly 65 70 75 80

Ala Asn Phe Gin Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Val Tyr Gly Trp 85 90 95

Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Phe Tyr lie Val Asp Ser Trp Gly Thr 100 105 110

Tyr Arg Pro Thr Gly Thr His Lys Gly Thr lie Asn Val Asp Gly Gly 115 120 125

Thr Tyr Asp lie Tyr Glu Thr Thr Arg Val Asn Gin Pro Ser lie Lys 130 135 140

Gly Thr Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg 145 150 155 160

Thr Ser Gly Thr lie Ser Val Ser Glu His Phe Arg Ala Trp Glu Ser 165 170 175

Arg Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu Val Ala Met Thr Val Glu 180 185 190

Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Thr 195 200 205 lie Gly Gly Gly Asn Pro Gly Gly Gly Asn Pro Gly Glu Gly Thr Asn 210 215 220

Pro Gly Thr Val Thr Arg Val Glu Ala Glu Asn Met Thr Lys Ser Gly 225 230 235 240

Gin Tyr Thr Gly Asn lie Ser Ser Pro Phe Asn Gly Val Ala Leu Tyr 245 250 255

Ala Asn Asn Asp Ser Val Lys Tyr Thr Gin Tyr Phe Ser Thr Ser Thr 260 265 270

His Ser Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ser Asn Asn Ala Asn Met Ala Arg 275 280 285

Val Asp Leu Lys lie Gly Gly Gin Thr Lys Gly Thr Phe Tyr Phe Gly 290 295 300

Gly Ser Ser Pro Ala Val Tyr Thr Leu Asn Asn Val Ser His Gly Thr 305 310 315 320

Gly Asn Gin Glu lie Glu Leu lie Val Thr Ala Asp Asp Gly Thr Trp 325 330 335

Asp Ala Tyr lie Asp Tyr Leu Glu 第2頁 201241183 20120130-ACA0065TW-序列表.txt 340

<210> 3 <211> 1107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>選殖於pET25b的XylX-H2之DNA序列 <400> 3 atgaccatga ttacgccaag cttggcaaca acgatcactt ccaacgagat tggaacgcat 60 gacggttatg actatgaatt ttggaaggac agcggcggtt ccggcagcat gacactgaac 120 agcggcggtg cgttcagcgc tcagtggagc aacatcaaca acattctgtt ccgcaagggc 180 aaaaagttca atgagacaca gacacatcag caaatcggga acatgtcgat cacctacggc 240 gccaactttc agccgaacgg caatgcctac ttaaccgtat acggttggac ggtggatccg 300 ctcgttgaat tttacattgt cgacagctgg ggaacatacc gtccgacagg tacgcataaa 360 ggaaccatta acgtggatgg cggcacgtac gatatttatg agacgacccg ggtgaaccag 420 ccatcgatta aaggaacggc gacgttcaag cagtattgga gtgtccggac gtcgaagcga 480 acgagcggta cgatctcggt cagcgagcat ttcagagcct gggaaagccg cggcatgccg 540 atggggaaaa tgtatgaagt cgccatgacg gtagagggct atcagagcag cggaagcgcg 600 aatgtgtaca gcaatacatt gaccatcggc ggcggcaacc cgggcggtgg aaatccggga 660 gaaggcacga acccgggaac ggtgacgaga gtcgaagccg agaacatgac caaaagcggg 720 cagtacacgg gcaatatcag ctcgccgttc aatggtgttg ccctgtatgc caacaacgat 780 tcggtcaaat atacgcagta tttttccact agcactcata gtttctcact gcggggggcg 840 tcgaacaatg ccaacatggc ccgggtggac ctgaagatcg gcggccagac gaaaggcacc 900 ttctactttg gcggaagcag tcccgcggtg tatacgctaa acaatgtgag tcatggcacc 960 ggcaatcagg agattgagct gattgttacg gcggatgacg ggacatggga cgcctacatt 1020 gactatctcg agatcaaacg ggctagccag ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat 1080 gtcgagcacc accaccacca ccactga 1107

<210> 4 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223>選殖於pET25b的XylX-H2之胺基酸序列 <400> 4

Met Thr Met lie Thr Pro Ser Leu Ala Thr Thr lie Thr Ser Asn Glu 1 5 10 15 lie Gly Thr His Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Phe Trp Lys Asp Ser Gly 20 25 30

Gly Ser Gly Ser Met Thr Leu Asn Ser Gly Gly Ala Phe Ser Ala Gin 35 40 45

Trp Ser Asn lie Asn Asn lie Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys Phe Asn 50 55 60 第3頁 201241183 20120130-ACA0065TW·序列表.txt

Glu Thr Gin Thr His Gin Gin He Gly Asn Met Ser lie Thr Tyr Gly 65 70 75 80

Ala Asn Phe Gin Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Val Tyr Gly Trp 85 90 95

Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Phe Tyr lie Val Asp Ser Trp Gly Thr 100 105 110

Tyr Arg Pro Thr Gly Thr His Lys Gly Thr lie Asn Val Asp Gly Gly 115 120 125

Thr Tyr Asp lie Tyr Glu Thr Thr Arg Val Asn Gin Pro Ser lie Lys 130 135 140

Gly Thr Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg 145 150 155 160

Thr Ser Gly Thr lie Ser Val Ser Glu His Phe Arg Ala Trp Glu Ser 165 170 175

Arg Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu Val Ala Met Thr Val Glu 180 185 190

Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn Thr Leu Thr 195 200 205 lie Gly Gly Gly Asn Pro Gly Gly Gly Asn Pro Gly Glu Gly Thr Asn 210 215 220

Pro Gly Thr Val Thr Arg Val Glu Ala Glu Asn Met Thr Lys Ser Gly 225 230 235 240

Gin Tyr Thr Gly Asn lie Ser Ser Pro Phe Asn Gly Val Ala Leu Tyr 245 250 255

Ala Asn Asn Asp Ser Val Lys Tyr Thr Gin Tyr Phe Ser Thr Ser Thr 260 265 270

His Ser Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ser Asn Asn Ala Asn Met Ala Arg 275 280 285

Val Asp Leu Lys He Gly Gly Gin Thr Lys Gly Thr Phe Tyr Phe Gly 290 295 300

Gly Ser Ser Pro Ala Val Tyr Thr Leu Asn Asn Val Ser His Gly Thr 305 310 315 320

Gly Asn Gin Glu lie Glu Leu lie Val Thr Ala Asp Asp Gly Thr Trp 325 330 335

Asp Ala Tyr lie Asp Tyr Leu Glu lie Lys Arg Ala Ser Gin Pro Glu 340 345 350

Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu His His His His His His 第4頁 s 201241183 20120130-ACA0065T1-序列表.txt 355 360 365

<210> 5 <211〉Π55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>選殖於pET15b的XylX-H2之DNA序列 <400> 5 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atgaccatga ttacgccaag cttggcaaca acgatcactt ccaacgagat tggaacgcat 120 gacggttatg actatgaatt ttggaaggac agcggcggtt ccggcagcat gacactgaac 180 agcggcggtg cgttcagcgc tcagtggagc aacatcaaca acattctgtt ccgcaagggc 240 aaaaagttca atgagacaca gacacatcag caaatcggga acatgtcgat cacctacggc 300 gccaactttc agccgaacgg caatgcctac ttaaccgtat acggttggac ggtggatccg 360 ctcgttgaat tttacattgt cgacagctgg ggaacatacc gtccgacagg tacgcataaa 420 ggaaccatta acgtggatgg cggcacgtac gatatttatg agacgacccg ggtgaaccag 480 ccatcgatta aaggaacggc gacgttcaag cagtattgga gtgtccggac gtcgaagcga 540 acgagcggta cgatctcggt cagcgagcat ttcagagcct gggaaagccg cggcatgccg 600 atggggaaaa tgtatgaagt cgccatgacg gtagagggct atcagagcag cggaagcgcg 660 aatgtgtaca gcaatacatt gaccatcggc ggcggcaacc cgggcggtgg aaatccggga 720 gaaggcacga acccgggaac ggtgacgaga gtcgaagccg agaacatgac caaaagcggg 780 cagtacacgg gcaatatcag ctcgccgttc aatggtgttg ccctgtatgc caacaacgat 840 tcggtcaaat atacgcagta tttttccact agcactcata gtttctcact gcggggggcg 900 tcgaacaatg ccaacatggc ccgggtggac ctgaagatcg gcggccagac gaaaggcacc 960 ttctactttg gcggaagcag tcccgcggtg tatacgctaa acaatgtgag tcatggcacc 1020 ggcaatcagg agattgagct gattgttacg gcggatgacg ggacatggga cgcctacatt 1080 gactatctcg aggatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 1140 accgctgagc aataa 1155

<210> 6 <211> 384 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223>選殖於pET15b的XylX-H2之胺基酸序列 <400> 6

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 15 10 15

Arg Gly Ser His Met Thr Met lie Thr Pro Ser Leu Ala Thr Thr lie 20 25 30

Thr Ser Asn Glu lie Gly Thr His Asp Gly Tyr Asp Tyr Glu Phe Trp 第5頁 201241183 20120130-ACA0065TW·序列表.txt

Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Ser Met Thr Leu Asn Ser Gly Gly Ala 50 55 60

Phe Ser Ala Gin Trp Ser Asn lie Asn Asn lie Leu Phe Arg Lys Gly 65 70 75 80

Lys Lys Phe Asn Glu Thr Gin Thr His Gin Gin lie Gly Asn Met Ser 85 90 95 lie Thr Tyr Gly Ala Asn Phe Gin Pro Asn Gly Asn Ala Tyr Leu Thr 100 105 110

Val Tyr Gly Trp Thr Val Asp Pro Leu Val Glu Phe Tyr lie Val Asp 115 120 125

Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr His Lys Gly Thr lie Asn 130 135 140

Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp lie Tyr Glu Thr Thr Arg Val Asn Gin 145 150 155 160

Pro Ser lie Lys Gly Thr Ala Thr Phe Lys Gin Tyr Trp Ser Val Arg 165 170 175

Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr lie Ser Val Ser Glu His Phe Arg 180 185 190

Ala Trp Glu Ser Arg Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu Val Ala 195 200 205

Met Thr Val Glu Gly Tyr Gin Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Tyr Ser 210 215 220

Asn Thr Leu Thr lie Gly Gly Gly Asn Pro Gly Gly Gly Asn Pro Gly 225 230 235 240

Glu Gly Thr Asn Pro Gly Thr Val Thr Arg Val Glu Ala Glu Asn Met 245 250 255

Thr Lys Ser Gly Gin Tyr Thr Gly Asn lie Ser Ser Pro Phe Asn Gly 260 265 270

Val Ala Leu Tyr Ala Asn Asn Asp Ser Val Lys Tyr Thr Gin Tyr Phe 275 280 285

Ser Thr Ser Thr His Ser Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ser Asn Asn Ala 290 295 300

Asn Met Ala Arg Val Asp Leu Lys lie Gly Gly Gin Thr Lys Gly Thr 305 310 315 320

Phe Tyr Phe Gly Gly Ser Ser Pro Ala Val Tyr Thr Leu Asn Asn Val 325 330 335

Ser His Gly Thr Gly Asn Gin Glu lie Glu Leu lie Val Thr Ala Asp 340 345 350 第6頁 201241183 20120130-ACA0065TW-序列表.txt

Asp Gly Thr Trp Asp Ala Tyr lie Asp Tyr Leu Glu Asp Pro Ala Ala 355 360 365

Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gin 370 375 380 第7頁

Claims (1)

1. 201241183 七、申請專利範圍： 4 1. 一種分離的多肽，其包含與SEQIDNO:2的胺基 酸序列至少有90%相同度之胺基酸序列，其中該多肽包 含在對應於SEQ ID NO:2第44個殘基的位置之Ala，以 及在對應於SEQ ID ]SfO:2第345及346個殘基的位置之 兩個胺基酸的缺失，且其中該多肽相較於來自小枯草桿 ί (尸campz'wosewz·)之野生型木聚_酶表現 出較低的最適溫度及較高比活性。 2. 如申請專利範圍第1項之多肽，其中該多肽包含 與SEQ ID NO.2的胺基酸序列至少有95%相同度之胺基 酸序列。 3_如申請專利範圍第1項之多肽，其中該多肽包含 SEQIDNO:2的胺基酸序列。 4.如申請專利範圍第1項之多肽，其中該多肽進一 步包含His標記。 5·如申請專利範圍第3項之多肽，其中該多肽進一 步包含His標記於C端。 6. —種分離的多肽，其包含選自由木聚酶酶X_R (XylX_R)、木聚醣酶 X_H1 (Xyix_Hl)、木聚醣酶 X_L1 (XylX-Ll)及木聚醣酶X-L2 (XylX-L2)所組成之群之突 變木聚醣酶的胺基酸序列。 7. 如申請專利範圍第6項之多肽，其中該多肽包含 XylX-R之胺基酸序列。 8. 如申請專利範圍第6項之多肽，其中該多肽包含 XylX-Hl之胺基酸序列。 9. 如申請專利範圍第6項之多肽，其中該多肽包含 XylX-Ll之胺基酸序列。 10. 如申請專利祐圍第6項之多肽’其中該多肽包含 XylX-L2之胺基酸序列。 201241183 丨1·〜種分離的核酸分子，龙 第項之多肽之核酸序列。Ί 3編碼申請專利範圍 12.如申請專利範圍第u 序列包括SEQIDNO:l。 、核馱分子，其中核酸 體。13. 一種包含申請專利範圍第Π項之核酸的表現载 14. -種包含申請專利範圍第13項之表現載體的宿 主細胞。 /5· —種降解木聚醣之方法，該方法包含提供申請專 利範圍第1項之多肽，以及混合木聚醣和該多肽。 S