201229508 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關水對生物體危險性之直接且綜合評價之 方法。 【先前技術】 目前，水之安全性評價係以自來水及排放水中與水質 污濁標準有關之分析爲主，並利用物理化學之分析方法。 由於物理化學之分析方法係將水中所含之化學物質成分經 濃縮•萃取·純化後，藉由色相層析儀（氣體•液體•離 子）或該等儀器與質量分析儀組合之機器以進行分析之方 法，除了前處理方法極爲繁雜，由於欲測定之化學物質各 自的操作順序相異，針對所有種類的化學物質進行全面性 之分析時，必須耗費極大的勞力及成本。主要的分析項目 自來水係包括殘留氯以及色度、濁度等10個項目，飮料水 爲50個項目，有關保護人體健康的環境標準項目爲3 6項等 ，而該等物質之成分分析法係可明確得知水中所含之已知 的有害性物質濃度之方法。 然而，水是溶解有各種物質的混合物，當所含的各物 質（金屬及化學物質）處於混合狀態下，因交互作用而產 生新的物質，其影響尙屬未知。 另外，由產生了新的交互作用物質，認爲有時會減少 原本應被測定物質之量，而無法正確測定。而除了水屬於 混合物以外，因各物質的累積，亦存在產生更大的有害性 -5- 201229508 之疑慮。由於該等對人體之有害性之評價，以以往之成分 分析方法僅能停留在間接評價，而無法評價對人體的直接 的影響，另外，亦難以進行對於人體直接的有害性之評價 。因此，必須要使用能夠直接掌握•評價未特定之物質對 於人體健康影響之方法。 解決上述課題之技術，存在有利用生物體及細胞評價 之技術（Bioassay )。生物檢定法並非分離分析各種化學 物質之方法，而是將化學物質對於生物體之有害性，以對 於生物調節作用之影響（成長性、增殖性及細胞傷害性） 而掌握之方法。 具代表性對於環境水之評價例係美國•水質淨化法（ Clean Water Act)爲基準之水質標準而制定之排放水規範 ：WET ( Whole Effluent Toxicity)，係使用魚·水备· 藻類，評價排放水流域內之環境水整體性的有害性（非專 利文件1、2 )。此外，一般係使用以環境水中所含之各種 有害化合物等爲對象，OECD ( Organisation for Economic Co-operation and Development:經濟協力開發機構）之生 態影響試驗，及使用微生物與實驗動物之化學物質及毒物 之試驗（非專利文件3 )。 另一方面，醫藥品、化妝品之安全性試驗大多利用實 驗動物再加上培養細胞。 〔先前技術文件〕 〔專利文件〕 專利文件1 :毒性物質之評價法，特開200 1 - 1 33452號
-6- S 201229508 公報 〔非專利文件〕 非專利文件 1 : Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. Fifth Edition， Unites States Environmental Protection Agency, October 2 0 0 2. 非專利文件 2: Short-term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms. Fourth Edition, Unites States Environmental Protection Agency, October 2 0 0 2. 非專利文件3 :生物體影響試驗指導手冊，日本環境 毒性學會編，昭倉出版，2003年 【發明內容】 〔發明欲解決之課題〕 先前生態系中之水質評價（使用魚類之水環境評價試 驗）終究只是調査對魚類的健康威脅，由於魚類與人類種 間差異極大，難以直接將該結果對照至對人體健康的影響 。另外，極少有將如同水般含有「未知混合物」之受驗物 質運用於培養細胞之例。且亦存留有因細胞種類顯現有害 性程度之差異之問題。 〔解決課題之手段〕 爲解決上述課題，以往採用之水成分分析法，及使用 201229508 魚•水蚤•藻類等水生生物之生物檢定法評估準確度低， 本發明之目的係評估水對於人體健康之複合性影響。 爲達成該目的，本發明之一例係使用可適用於對人體 健康影響評價之人體培養細胞，同時進行下列兩步驟：以 受驗水處理細胞之檢出急性有害物質之步驟；以及藉由檢 出以有害性標誌分子爲指標於低濃度範圍之有害性，取得 因長期攝取•暴露而發生慢性有害性風險資訊之步驟，提 供一種綜合性地評價健康危險因子之方法。 而本申請案之另一例係著眼於會因有害物質的不同， 而造成目標受害器官的不同，所使用之人體培養細胞來自 包含肝臟、肺、胃、腸、腎臟、神經、腦等複數種細胞， 而提高起因於細胞種不同而使有害性之表現方式有程度上 差異之檢出覆蓋率。 此時檢出對象之一例係將代謝物及遺傳基因表現量等 變化量作爲有害性標誌因子。 〔發明的效果〕 根據本發明之利用細胞之水質評價法，藉由同時實施 急性有害性之評價與發生長期有害性風險之評價此二種方 法，依細胞存活此種巨大變化而容易檢出高濃度的急性毒 性，同時藉由檢出低濃度範圍之有害性，而具有可早期預 測長期（慢性）有害性之優點。藉此可大範圍地評價對人 體健康之風險。另外，藉由定期採取•試驗受驗水，可對 水質進行持續性的追蹤評價，並可獲得現狀之有害性之增
S -8 - 201229508 減資訊。進而可得知受驗水全體的毒性程度，而可推測對 人體健康影響之程度。且由於無需使用需高度技術及高價 之物理化學分析儀器，可僅以簡單且廣泛使用之機器（培 養機器、分光光度劑、基因增幅機等）即獲得結果，故可 迅速•簡便地進行評價。 以下參照圖面說明本發明之實施方式。且該實施方式 僅本發明之一例，本發明並未限定於此。 圖1係說明與本發明有關之水質評價法順序之流程圖 ，係由S1〜S6之6個步驟構成。 S 1 :維持細胞 維持用於水質評價之細胞，係可藉由一般哺乳類細胞 培養法培養。培養液若爲可使所使用之細胞大致獲得良好 的生長之一般哺乳類動物細胞用之培養液，則並未特別限 定其種類。用於試驗之細胞以人類細胞爲佳，可使用來自 包含肝臟、肺、胃、腸、腎臟、神經、腦等複數種細胞。 S2 :以受驗水調製培養液 處理細胞之受驗水’只要是非明顯可知之高濃度污染 區域，均進行濃縮。此時，以不使受驗水成分產生變化之 方式’採用將受驗水溫度維持於3 0。(：以下且利用減壓法等 進行濃縮。其次’以受驗水溶解培養基粉末，並將pH調整 爲細胞培養時不會造成巨大有害影響之6.5〜8.0之範圍。 最有效之範圍係7.0〜7.2。最後再進行過濾器滅菌，調製 -9- 201229508 爲無菌之液體培養液。此時所使用之過濾器爲獲得充分滅 菌效果，以使用孔徑爲0.22μιη以下之過濾器爲佳。另外’ 此時可配合使用之細胞種類加入必要的添加物（血清、生 長因子等）。 S 3 :以受驗水處理細胞（暴露） 將於S1步驟中經繼代培養之一定量之細胞播種於培養 容器內，培養24小時，使細胞黏著於培養容器底面。其後 ，更換到以受驗水調製之培養液後繼續培養’使細胞暴露 於受驗水6〜72小時。暴露時間若爲對細胞之有害性爲蓄 積性之情況時，可持續暴露至72小時，但大多有害性可於 暴露時間爲24〜48即可確認。此時，對照組係使用繼代維 持用之培養液進行相同處理。 S4 :急性有害性評價 求出S 3之細胞處理後之細胞活性/生存率，並評價急 性有害性。可使用先前之方法測定細胞活性/生存率。測 定細胞生存率可使用以細胞膜通透性作爲指標進行調查之 色素法，調查增殖能力之聚落形成試驗法，以及利用ΜΤΤ (噻唑藍）會伴隨粒線體氧化之磷酸化能而還原、被分解 之現象來表示細胞生存率之ΜΤΤ法試驗法等。 例如使用中性紅（Neutral red)法時，藉由更換含中 性紅之培養液並進而培養2〜3小時，細胞會吸收中性紅， 而可測定吸收量。
S -10- 201229508 爲測定吸收量一般進行下述之後處理。亦即去除含中 性紅之培養液後，添加含氯化鈣之福馬林溶液（例如含1 % 氯化鈣之1 %福馬林溶液）固定培養細胞，進而藉由去除上 清液而去除未被細胞吸收之中性紅，接著再藉由添加含有 醋酸之乙醇（例如含1%醋酸之50%乙醇），萃取被活細胞 吸收之中性紅。可依常用方法，例如比色法及分光光度計 法等測定該萃取液中所含之中性紅之量爲佳，而使用分光 光度計測定吸光度，例如測定於540nm之吸光度之方法十 分簡便。 中性紅爲可溶性色素，僅活細胞可吸收至細胞體內之 物質。因毒性而使細胞增殖被抑制時，或被誘發細胞死亡 而使細胞數減少時，中性紅的吸收便減少。因此藉由測定 洗淨後細胞所吸收之中性紅，可推測相對於對照群之相對 的活細胞數，而可自相對生存率判定受驗水之有害性。 -11 - 201229508 量，即使細胞未出現如死亡等巨大的變化，亦可得知細胞 正發生微弱的損害。雖然依有害物質不同而存在蓄積性之 差，一般而言引起微弱有害性現象時，其發生慢性有害性 之風險即增高，亦可預測未來之風險。 基因表現程度之測定可依例如測定每單位檢體量之基 因之轉錄產物量之方法，以及比較每單位檢體量之基因之 轉譯產物量之方法進行。於測定基因之轉錄產物量時，可 將該基因之轉錄產物之mRNA量，藉由例如定量即時聚合 酶鏈式反應（以下記做定量R T - P C R )、微陣列法等而進 行。 基因之轉錄產物之mRNA量，使用以標誌基因之鹼基 序列爲基礎所設計、調製之探針或引子，再使用一般基因 工程之方法即可測定。此時，同時測定細胞中表現程度固 定之基因（以下記做對照基因），例如TBP ( TATA-box-binding protein，NM_003194)基因等之 mRNA量。依此可 求得該對照基因每單位mRNA量之標誌基因之mRNA量。 具體而言，針對例如使用定量R T - P C R之情況進行說 明。首先自欲測定基因表現程度之細胞，使用商用試劑組 等（例如 RNeasy Micro Kit, Qiagen 公司）萃取 mRNA，再 使用反轉錄反應試劑組（例如Superscript III CellDirect cDNA Synthesis Kit, Invitrogen 公司），調製對應於 mRNA 之逆轉錄反應產物（cDNA)。以調製之cdna爲鑄型，並 以具有一部分標誌基因之鹼基序列之DNA爲引子進行PCR 。藉由測定經增幅之DN A之螢光，可定量標誌基因之
-12- S 201229508 mRNA量。此時，同時測定對照基因TBP等之mRNA量，即 可求得該對照基因每單位mRNA量之標誌基因之mRNA量。 而藉由比較表現量，於受驗水處理群之標誌基因之表現量 ’相對於對照培養液處理群之表現量爲有意義之變動時， 可判定具有有害性。 S6 :綜合評價 將於S4步驟所得之急性有害性之評價結果，與S5步驟 中所得之藉由於低濃度範圍內檢出而預測慢性有害性之結 果進行綜合性的判斷，進行對人體健康之水質評價。 以下針對利用本發明細胞之水質評價法於污染地下水 之結果進行說明，但本發明並非限定於下述之實施例。 【實施方式】 〔實施例1〕 (1 )以受驗水調製培養液
受驗水係使用懷疑遭受污染之井水（污染地下水）° 將以減壓濃縮法濃縮10倍之受驗水稀釋，製作I/1 00、1/10 、等倍、3倍、5倍、8倍、10倍之稀釋系列。其次將DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培養基之粉末溶 解，並調整pH爲7.2，以0.22μιη過濾器過濾滅菌’添加1〇 (ν/ν) % FBS( Fetal Bovine Serum)，調製爲液體培養液 -13- 201229508 (2 )細胞處理 將來自人類肝臟細胞H epG2播於96孔之培養盤中，使 細胞濃度爲5xl〇4 ceiis/i〇〇pL，並於37。(：，5% C02環境下 培養24小時。培養液係使用含丨〇 ( Wv ) %FBS之DMEM。 於確認各孔中之細胞均黏著於底面之後，更換以受驗水之 濃縮·稀釋系列水所調製之培養液、對照培養液（維持繼 代用之培養液），進而培養24小時，進行細胞處理。 (3 )急性有害性評價 藉由中性紅分析法測定活細胞數目，計算出相對於使 用對照培養液之活細胞數目爲1 00%時之相對細胞生存率。 具體而言係去除以受驗水調製之培養液，更換爲含濃度 15(^§/11^之中性紅之〇^1£1^培養基，藉由進而培養3小時 ，使細胞吸收中性紅。其後，再去除含中性紅之培養液後 ，添加含1 %氯化鈣之1 %福馬林溶液固定培養細胞，再藉 由去除上清液而去除未被細胞吸收之中性紅，接著再藉由 添加含有1 %醋酸之50%乙醇，萃取被活細胞吸收之中性紅 。使用分光光度計測定於540nm之吸光度，測定萃取液中 所含之中性紅之量。由於採用中性紅法僅活細胞在細胞內 可吸收中性紅，而可將中性紅之吸光度視爲活細胞數。求 得對照培養液之吸光度爲1 00%時之相對値，可求得受驗水 處理群之相對生存率。 如圖2所示，受驗水自等倍開始，濃縮率愈高有害性 愈增，使用1 〇倍濃縮水時細胞全數死亡。分析該受驗水成
-14- S 201229508 分時，發現爲含有約1 mg/L之高濃度之無機砷的污染水， 可檢出1 mg/L以上之砷污染，確認再加上濃縮進而亦可檢 出低濃度之有害性。 (4 )藉由計測基因表現量評價於低濃度範圍之有害性 自經受驗水處理之細胞萃取全RN A後調製逆轉錄反應 物（cDNA)，再對細胞損傷之標誌基因之NFE2L2(nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2，NM_006 1 64)、DEFB1 (defensin，beta 1，NM_0052 1 8) ' TBP (對照基因）等 3基 因進行定量PCR。相對於對照培養液處理細胞，標誌基因 之NFE2L2、DEFB1之基因表現量爲有意義變動之情況時， 會引起細胞傷害，可預測每日攝取·暴露於該水時有引起 慢性傷害之危險性。以下更具體說明之。 自經受驗水處理6小時之lxlO5之細胞，使用市售之試 劑組RNeasy Micro Kit ( Qiagen公司），依試劑組所附實 驗方法萃取全RNA。 使用定量RT-PCR調製cDNA時，可使用市售之試劑組 Superscript III CellDirect cDNA Synthesis Kit(Invitrogen 公司）所含試藥，自2pg的全RNA，以如後所述方法進行逆 轉錄反應，調製cDNA溶液。於2pg的全RNA(22pL)中添 加 50 mM Oligo dT (20) 2μί、10 mM dNTP mix 2μί > 再於 65 °C下反應5分鐘後，置於冰浴1分鐘以上。進而添加5X First Strand Buffer 8μί、0.1M DTT 2pL、RNase OUT 2μί 、Superscript III 2pL使全量爲 40μί，於 50°C 下反應 60 分 201229508 鐘後，再使其於70 °C下反應1 5分鐘，置於冰浴，可得 c D N A 〇 使用定量RT-PCR測定3基因之表現程度，係以自受驗 水處理群與對照培養液處理群之細胞所得之cDN A爲鑄型 ，並藉由使用下述反應條件進行PCR而可求得。定量係使 用購入之各基因之 TaqMan Gene Expression Assay ( PCR Forward Primer、PCR Reverse Primer、TaqMan探針之混 合物，AppliedBiosystem公司）。亦即，相對於上述之lpL 之 cDNA 溶液，調製含 lpL 之 TaqMan Gene Expression Assay，Premix Ex Taq 1 2.5 μ L > DW10.5pL 之 25pL反應液 ，再將調製之反應液使用Thermal Cycler Dice TP800 ( Takara公司），以95°C保溫10秒鐘後，再以95°C 5秒，60 °C 3 0秒爲一循環，進行40個循環之反應條件施行PCR。 計算對照基因TBP之每mRNA量之NFE2L2基因及 DEFB1基因之mRNA量，並比較相對於對照培養液處理， 受驗水處理之標誌基因之表現量。如圖3所示，NFE2L2及 DEFB 1基因相對於對照培養液處理之表現量同時增加，可 得知引起某種有害現象。藉此，確認藉由計測細胞之有害 性標誌因子，可檢出於低濃度範圍之微弱的有害性。 (5 )綜合評價 對於上述（3 )中急性有害性之評價結果（圖2 )，與 上述（4 )中藉由計測基因表現量評價低濃度範圍之有害 性結果（圖3 )進行綜合性的判斷。本受驗水（丨倍液）於
-16- S 201229508 生存率（圖2)及標誌基因表現量（圖3)同樣顯示有害性 ，特別由於發現影響相對生存率（圖2 )，而判斷有害人 體健康。另外，評價假設含有與1/100、1Π0濃度具相同有 害性之受驗水時，圖2之相對生存率並未檢出有害性，但 於圖3之基因表現量之比較中可檢出有害性，因而可預測 於慢性攝取時對人體健康有害。 因此，藉由併行本發明之急性有害性評價與藉由計測 基因表現量評價低濃度範圍之有害性，可評價對於人體健 康廣大範圍之風險。 〔實施例2〕 使用與實施例1同樣之污染地下水作爲受驗水，並例 舉使用來自複數種臟器之人類培養細胞之急性有害性評價 〇 調製受驗水、細胞處理、急性有害性評價之順序如實 施例1。細胞則使用來自人類肝癌細胞之HepG2、來自人類 胎兒腎臓細胞之HEK293、來自人類大腸癌細胞之CACO-2 、來自人類肺癌細胞之A549等4種。關於培養液HepG2與 A549係使用DMEM培養基，HEK293與CACO-2則使用含 1 0 % F B S 與 0 · 1 m Μ ΝΕΑΑ ( Non-Essential Amino Acid )之 MEM ( Minimum Essential Medium)培養基。 如圖4所示，受驗水之有害性於肝、腎、大腸等消化 系統之細胞檢出，其中尤以來自腎臟細胞感受性較高，且 可得知於肺等呼吸系統之細胞有較不易檢出之傾向。由於 -17- 201229508 依細胞種類不同對於有害性之生物調節作用會有所差異， 可明確得知以本評價法中使用複數之細胞種類進行試驗爲 佳。 〔實施例3〕 使用模擬製作之環境水，例舉檢出複合有害性之例。 日本飲用水之標準値爲砷〇.〇lmg/L，氟0.8 mg/L，鉻 0 · 0 5 m g/ L，推測相對於標準値經1 〇倍、1 〇 〇倍濃縮之値並 加以混合，評價急性有害性。模擬水係於純水中加入亞砷 酸鈉、氟化鈉、二鉻酸鉀製作。各元素之濃度係依據化合 物之分子量換算而計算。使用來自人類肝癌細胞之HePG2 ，除受驗水之外採用與實施例1相同之方法進行試驗。此 時，生存率與有害性強度相反，以生存率愈低有害性愈高 來判斷。 如圖5所示，（a )之以日本飮用水標準値之1 〇倍濃度 之砷O.lmg/L，氟8mg/L，六價鉻0.5mg/L，並未單獨檢出 砷、氟之有害性，混合液則檢出非常低之有害性。而相對 的六價鉻具顯著有害性，而將六價鉻與砷、氟混合時亦未 出現有害性之變動。然而（b )之與以日本飲用水標準値 之1〇〇倍濃度之砷lmg/L，六價鉻5mg/L單獨之有害性相比 ，與（a )中未發現有害性增強效果之1 0倍濃度之氟混合 ，生存率降低有害性增加。此3種之混合液進而降低生存 率，因有害物質之混合而使被增強之有害性被檢出。由此 可確認本發明之混合數種有害物質之水之有害性評價爲有 -18-
S 201229508 效。 【圖式簡單說明】 [圖1 ]說明利用細胞之水質評價法順序之流程圖。 [圖2]表示以實施例1之污染地下水評價結果爲基礎之 急性有害性。 [圖3]表示以實施例1之污染地下水評價結果爲基礎之 藉由基因表現量變動之低濃度有害性。 [圖4]表示以實施例2之污染地下水評價結果爲基礎之 對於4種細胞有急性有害性。 [圖5 ]表示以實施例3之污染地下水評價結果爲基礎之 急性有害性。 【主要元件符號說明】 1 〇 1 :表示維持細胞步驟之圖格 1 02 :表示以受驗水調製培養液步驟之圖格 1 03 :表示以受驗水處理細胞（暴露）步驟之圖格 104 :表示評價急性有害性步驟之圖格 1 05 :表示藉由測定生物調節作用分子評價低濃度之 有害性步驟之圖格 1 06 :表示綜合評價步驟之圖格 -19·