TW201208586A - Energy saving brewing method - Google Patents

Energy saving brewing method Download PDF

Info

Publication number
TW201208586A
TW201208586A TW100119499A TW100119499A TW201208586A TW 201208586 A TW201208586 A TW 201208586A TW 100119499 A TW100119499 A TW 100119499A TW 100119499 A TW100119499 A TW 100119499A TW 201208586 A TW201208586 A TW 201208586A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
barley
functional
wort
malt
mutation
Prior art date
Application number
TW100119499A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI554216B (zh
Inventor
Soeren Knudsen
Preben Riis
Birgitte Skadhauge
Lene Bech
Ole Olsen
Original Assignee
Carlsberg Breweries As
Heineken Supply Chain Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43431774&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW201208586(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Carlsberg Breweries As, Heineken Supply Chain Bv filed Critical Carlsberg Breweries As
Publication of TW201208586A publication Critical patent/TW201208586A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI554216B publication Critical patent/TWI554216B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C1/00—Preparation of malt
    • C12C1/18—Preparation of malt extract or of special kinds of malt, e.g. caramel, black malt
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/38—Other non-alcoholic beverages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/20—Malt products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/20—Malt products
    • A23L7/25—Fermentation of cereal malt or of cereal by malting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11012—Linoleate 13S-lipoxygenase (1.13.11.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01009—Thiol S-methyltransferase (2.1.1.9)

Description

201208586 六、發明說明： 本甲請案中引用之所有專利及非專利參考文獻均以全 文引用的方式併入本文中。 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於製備基於大麥之飲料（例如基於麥芽之 飲料，諸如啤酒）㈣能方法。本發明進一步係關於適用 於本發明方法之大麥植物。綠士夕士 > m物0羊5之本發明描述在一株植 .物中具有無功能型脂肪加氧酶（無功能型L〇x i)、無功 能型脂肪加氧酶_2 (無功能㉟LqX_2)及無功能型腺普 〒硫胺酸:甲硫胺酸S-甲基轉移酶（亦稱為無功能型… 胺酸（Met)-s_甲基轉移酶或無功能型mmt)之組合性狀的 大麥植物，亦即，無功能型應]•無功能型l〇X_2無功能 型MMT.大麥植物（在本文中亦可互換地稱為雙重無功能型 LOX-無功能型MMT)，該植物尤其適用於製備本文所述之 基於大麥之飲料的節能方法。 【先前技術】 孵麥芽設施及醸造廠 大麥（Barley ; Hordeum vuigare，L)是—種在不同氣 候條件下廣泛種植用於食物及飲料生產 物。藉由採用高能耗方法，例如在分別用於以=; 穿汁煮沸操作的孵麥芽及釀造廠設施中大量生產基於該植 物之飲料。 & 畔麥芽通常包括浸泡大麥籽粒以促進萌芽，接著在高 溫下窝式乾燥，此舉使得該製程特別耗能。熏式乾燥之關 201208586 鍵目標包括.（1)終止萌芽；（ii)乾燥已萌芽之大麥榖粒； (111 )酶變性，尤其野生型大麥中之脂肪酶及L〇x酶；及（) 將主要由S-曱基-Met ( SMM )組成之二甲硫醚（DMS )前 驅物（DMSP)轉化成揮發性DMS[正常淺色麥芽在窯式乾 燥後，DMSP含量以乾重計平均為4ppm (參看Techn〇i〇gy
Brewing and Malting，Kunze，2004, VLB Berlin，第 l58 至 162頁）]。在窯式乾燥期間某些酶活性得到保留（例如澱 粉酶、蛋白酶等）。 在釀造廠中，釀造製程大體上消耗約一半能量’對應 於48,000至83,000 kJ/hL範圍内之能量負荷（M〇dern brewhouse technology，Brauwelt Iiuernati〇nal 2004，第 41〇 至412頁）。大部分能量是在麥芽汁煮沸製程中消耗，一般 而言，此製程之目的在於提供：（i)蛋白質凝聚；（ii)酶去 活，（111 )麥芽汁滅菌；（iv )萃取啤酒花化合物；（V ) 酸異構化；及（Vi)蒸發不需要之揮發性化合物，分別例如 3石瓜腐臭味物質DMS以及反式-2-壬烯酸（T；2N )。 麥芽汁以傳統方式煮沸至少50至6〇分鐘以允許至少 ίο%至 15%之總體蒸發（參看 Technology Brewing and
Malting，KUnze，2004, VLB Berlin，第 i i 章），但現在通常 藉由技術手段改良為6%至8%。亦已試圖藉由例如將蒸發 減至最少至低達3%至4%，與將不需要之揮發性化合物萃 取至所注入蒸汽中的汽提製程組合來更進一步降低能耗 (參看例如Bonacchelli等人，2〇07)。人們認為，麥芽汁中 不需要之揮發性化合物之含量使得難以進一步減少或甚至 201208586 消除蒸發。 T2N是沸點為88<5(：的揮發性C9烯醛，其在i97〇年被 特性化為使啤酒具有紙板樣異味的分子（Jamies〇n及 Gheluwe，1970 )。由於T2N在人類中之味覺臨限水準極低， 先如測疋為約 0.7 nM 或 〇· 1 ppb ( Meilgaard，1975 )，因此 即使酸含量微小之產品感覺也像陳年產品。然而，T2N含 里在新鮮皁酒中一般極低（Lermusjeau等人，1 999 )，表明 陳化過程促進自由T2N自相應加合物中釋放（Nyb〇rg等人， 1999 )。後續觀察結果顯示麥芽汁之潛在T2N與產品儲存後 所形成之自由T2N之間具有相關性（Kuroda等人，2005 )。 寞式乾燥及麥芽汁煮沸代表操作目標可在於降低基於 大麥之飲料中之T2N含量的獨立加工步驟。高溫下之窯式 乾燥可使T2N形成中所涉及之酶（諸如脂肪酶及l〇x )去 活（參看例如 Technology Brewing and Malting, Kunzp, 2004, VLB Berlin，第162頁），同時麥芽汁煮沸亦可移除自由 T2N。 大麥籽粒含有3種LOX酶，稱為LOX-1、LOX-2及 LOX-3 ( van Mechelen 等人，1999 )。LOX-1 之主要活性催化 由亞麻油酸形成9-氫過氧基十八碳二烯酸（9-HPODE ;參 看圖1A，LOX路徑之部分回顧），9-HPODE為T2N及三經 基十八碳烯酸（THA)之前驅物。LOX-2主要催化亞麻油 酸轉化成13-HPODE，13-HPODE進一步代謝成己醛，亦即 6 201208586 具有約0.4 PPm之高味覺臨限的C6醛（Meilgaard，上文）。 考慮到LOX-2具有極低9-HPODE形成活性，因此若干報導 已指出’ T2N是經由涉及最初由L0X-1催化，接著9-HP0DE 經由9-氫過氧化物裂解酶作用而裂解的亞麻油酸轉化成 9_HP0DE之生物化學路徑所產生（參看例如Kuroda等人， 2003，2005 ; Noodermeer 等人，2001 )。 馨·於LOX-1具有上述性質，因此該酶為努力降低基於 大麥之產品中的T2N含量的適用去活目標，實際上由以下 兩個觀察結果得到證實：（i) Kur〇da等人（2〇〇5)提出[οχ」 活性與麥芽汁潛在T2N之間具有相關性，主要是因為已認 為關於該麥芽汁中形成潛在T2N, L〇x_2能力低下。然而， .似乎在麥芽中之總L〇x活性與麥芽汁潛在τ2Ν之間並無相 關性，（η )已描述用於降低大麥中之L〇x_ i活性的方法❶ 已開發出共同具有LOX-1活性部分或完全降低之性質 的若干種不同大麥植物。例如，在D〇uma，Ac.等人之pCT 申-月案WO 02/05 3 721中揭示具有低[οχ」活性的大麥軒粒 及大麥植物，而Breddam，K.等人之w〇 2〇〇5/〇87934著重 於缺乏LOX_ 1 ,¾性的兩種不同大麥突變體：剪接位點突變 體及具有過早轉終止密碼子之突變體n仙⑽，& 等人之EP 16G9866描述—種II由篩選地方大麥品種之集合 鑑別出的無L〇x-i活性的大麥植物。 DMS 在基於大麥之飲料以及許多 蔬菜及食品 (包括茶、可 201208586
可、牛奶、葡萄酒、烈酒（諸如朗姆酒（rum ))、甜玉求及 眾多烹調蔬菜）中，DMS使產品具有突出的氣味及風味標 誌。視啤酒類型而定，DMS含量典型地可達到150 ppb( 150 pg/L )，而該化合物通常造成不合需要之「烹調蔬菜」或「甘 藍樣」風味。就此而言，不僅感覺臨限為約30至45 pg/L (Meilgaard，1982 )較為重要，而且將來源於DMS之風味保 持在不引人注意之含量（< 1 0 ppb )亦很重要。 啤酒生產中的上述寞式乾燥及麥芽汁煮沸加工步驟影 響基於大麥之飲料中的DMS含量’主要是因為該兩個製程 可能誘導SMM化學轉化成DMS (參看例如Techn〇i〇gy
Brewing and Malting，Kunze，2004，VLB Berlin，第 160 頁）。由於化合物DMS之沸點僅為37。〇至38。〇，因此大部 分DMS將簡單地蒸發至大氣中β然而，當麥芽汁煮沸之持 續時間或力度不足以轉化殘餘SMM時，DMS可能隨麥芽汁 冷卻而繼續形成，極可能轉移至啤酒中。 SMM代表萌芽大麥籽粒中在嶋循環之功能性組分 作用下所合成的幾乎所有、可能所有的DMSp池（圖⑴。 在此MMT催化曱基自s_腺苷·Met(Ad〇Met)轉移至Met, 從而形成SMM。化入榀c1V/ru „ —丄， 匕。物SMM又可充當在酶Hcy_s_甲基轉 移酶（HMT)催化之拓處士丄^ 匕之反應中由尚半胱胺酸（Hey )合成Met 之甲基供體。 在科學文獻中， 技術調節SMM合成 然而，對於反義相關 其已被認為是一個藉由使用例如反義 的機會（McEIroy 及 Jacobsen, 1 995 )。 目標基因’並未提供指導。儘管如此， 201208586 預期積極結果之可能性仍然可疑，因為SMM含量大幅降低 可能對大麥之生長及發育有害。McEIroy及Jac〇bsen(上文） 並未論述獲得較低SMM含量的替代方案。此外，如下文中 詳細論述，反義技術尚未成功應用於大麥十以完全消除基 因表現。 已開發出用於降低啤酒中之DMS含量的技術方法。因 而，AU 38578/93描述一種降低麥芽中之DMS含量的方法， 該方法包含對該麥芽進行蒸汽處理。在Bisgaard_Frantzen, Η 等人之專利申明案US 2006/0057684中描述包含在>70°C下 熱處理麥芽漿的釀造方法。且在Reuther，H.之美國專利第 5,242,694號中提出用於製備低碳水化合物啤酒的方法，其 中該方法包含使麥芽汁長時間沸騰，接著用二氧化碳（c〇2) 洗知、„亥麥芽汁。然而，已知所有上述處理均消耗大量能量， 從而可能改變麥芽或麥芽汁特性。 突變型大麥植物 令人遺憾的是，不存在可用於製備完全缺乏指定蛋白 質表現的轉殖基因大麥植物的方法…般對於大麥而言， 應用反義技術產生仍表現—些所述蛋白質的轉殖基因植物 (々參看例如Robbins等人· ; StaM等人，2〇〇4;η職η =人’ 2007 )〇同樣’尚未開發出用於大麥植物的藉由使用 欲合RNA/DNA或定點突變誘發來製備特定突變的有效方 與此致且儘管已進行多方努力，本申請案之發明 者仍未獲悉關於大麥中之成功寡核苷酸引導之基因靶向的 201208586 任何公開實例。雖然未在大麥中實行，但丨ida及Terada (2〇〇5) 指出已在玉米、於草及稻縠中測試了寡核苷酸引導之基因 乾向’但在所有案例中以除草劑抗性基因乙酿乳酸合成酶 (ALS )作為目標。根據lida及Terada (上文）之結論，上 述策略在經適當改進後是否適用於除可直接選擇之基因 (諸如ALS基因）以外的基因仍有待確定。雖然尚未得到證 實，但使用辞指核酸酶之靶向突變誘發代表可能允許未來 在基礎植物生物學中進行研究或進行作物植物改良的另一 工具（Durai 等人，2005 ; Tzfira 及 White，2005 ; Kumar 等 人，2006 然而，亦在此情況下，突變誘發尚未實行或成 功應用於大麥中。 儘f如此’可藉由使用照射或化學處理進行隨機突變 誘發來製備大麥突變體，諸如用疊氮化鈉（NaN3 )溶液培 育籽粒12小時至隔夜。一實例係關於使用NaNs進行突變 绣發之大麥軒粒’且隨後針對尚自由礙酸S旨含量進行筛選 以嘗試篩選出低植酸酯突變體（Rasmussen及 1998 );在2,〇〇〇粒所篩選籽粒中鑑別出總共1〇個突變體。 儘管遠非始終可能，但NaNs處理後發現特定突變體取決於 堅持及有效篩選方法。 可持續性 在尋求能量、環境及食物挑戰之解決方案的當今世 界’社會的—個焦點在於限制或降低大氣c〇2濃度，尤其 關注工業系統之C〇2排放。主要原因在於溫室氣體之濃度 201208586 增加導致地球能量平衡&變，#巾c〇2^大單—貢獻因 素。由於對氣候變化之廣泛關注，而且基於經濟基本原理 及限制，釀造廠可能藉由儘可能地有效使用能量以及更有 效地減少來自操作之溫室氣體排放而發揮積極作用。 迄今為止’關注點正是解決上述可持續性問題之技術 手段。 【發明内容】 已描述降低L〇X活性及DMS之廳含量的熱處理方 法。該處理一般在孵麥芽及/或製備麥芽汁期間進行，意謂 允許大麥在進行熱處理前積聚具有LOX活性之產物。對大 麥之分析顯示，即使在孵麥芽前，大麥中亦存在顯著量之 具有LOX活性的產物（Wackerbauer及Meyna, 2〇〇2 )。顯 而易見，熱處理方法為高能耗方法。 本發明提供用於製備具有低含量之一或多種異味物質 及其前驅物（特別是低含量之DMS及T2N及其前驅物）的 基於榖類之飲料的方法’其中該方法涉及能量輸入減少， 該方法包含以下步驟： (i)提供穀類植物或其部分，其中該縠類植物包含： (a )引起功能性L〇x_丨完全喪失之第一突變，·及 (b )引起功此性L〇x_2完全喪失之第二突變；及 (c )引起功能性MMT完全喪失之第三突變； (η )視情況將該穀類之至少一部分孵麥芽，由此獲得 經孵麥芽之穀類； (ill)將該穀類及/或經孵麥芽之穀類及視情況選用之其 201208586 他佐劑製曝，由此獲得麥芽汁； (iv) 視，清況在其他成分存在下加熱該麥芽彳，盆中萬 發麥芽汁體積之至多4%，由此獲得經加熱之麥芽汁；… (v) 將該經加熱之麥芽汁加工成飲料； 由此製得具有低含量之一或 或多種異味物質及其前驅物 的來源於榖類之飲料。 詳言之，本發明提供用於製備具有低含量之一或多種 異味物質及其前驅物（特別是低含量之DMS及T2N及其前 驅物）的基於大麥之飲料的方法，其中該方法涉及能量輸 入減少，該方法包含以下步驟： (^ )提供大麥植物或其部分，其中該大麥植物包含 (狂）引起功能性LOX-1完全喪失之第_突變；及 (b) 引起功能性L0X_2完全喪失之第二突變；及 (c) 引起功能性MMT完全喪失之第三突變； (11 )視情況將該大麥之至少一部分孵麥芽由此獲得 經解麥芽之大麥； (iii)將該大麥及/或經孵麥芽之大麥及視情況選用之其 他佐劑製醪，由此獲得麥芽汁； (i v )視情況在其他成分存在下加熱該麥芽汁，其中蒸 發麥芽汁體積之至多4〇/。’由此獲得經加熱之麥芽汁； (v )將該經加熱之麥芽汁加工成飲料； 由此製彳于具有低含量之一或多種異味物質及其前驅物 的來源於大麥之飲料。 本發明之目標亦在於提供適用於本發明方法之大麥植 12 201208586 物。因而，本發明之-目標在於提供農藝學上適用之大失 ，其包含：有3種不同性狀，亦即無功能型咖： 功::MMTA麥植物(本”亦稱為「雙 功能型mmt」）。適用大麥植物之選擇 利用下文詳細描述之生物化學分析，不僅關注植物二擇 而且亦關注應·1、Γ^Χ·2及ΜΜΤ酶活性之組合缺乏 :明之大麥植物可引入任何適合育種流程，諸如自花授 粉、回交、群體雜交及其類似技術。 杖 加速植物育種過程之一方式包含藉由應用組織培養及 =技術來初步繁殖所產生之突變體。如實施们中所述 中所不意性表示，採用傳統大麥育種流程，由雙重 無功能型而大麥植物及無功能型刪了植物產生具有雙 重無功此型L0X_無功能型ΜΜΤ性狀的大麥植物。因而， 本發明之另-態樣將提供細胞，其在生長及分化時產生旦 有雙^功能型L〇x.無功能型μμτ性狀的大麥植物。例 如《種可包括傳統雜交，使用諸如花藥培養或小抱子培 、、气σ養來製備來源於花藥之可繁殖雙重單倍 物。 α本發明揭不可經由應用無功能型LOX榖粒來降低窯式 乾燥之能量輪入，m4(i 因為不需要使内源性LOX酶去活。本發 明所述之雙售· τ丄Au …、功月b型LOX-無功能型MMT突變體可用於 生產缺乏相庫酿 〜姆活性的原料’從而使相關突變體在孵麥芽 設施中之寞式私 、V 燥期間達成較低能耗，而且亦由於麥芽汁 煮沸期間之埶^、, “’、玲入減少而在釀造廠中達成較低能耗。 13 201208586 自啤酒或飲料品質觀點，亦需要雙重無功能型L〇x-無 功能型MMT原料，以在功能上消除或顯著降低產品中之 T2N及DMS含量。 除上述雙重無功能型LOX-無功能型MMT麥芽之可能 性質以外，相應大麥可能亦適用於生產低異味大麥啤酒， 在本文中定義為藉由省略孵麥芽製程而替代提供由許多外 來酶組成之麥芽漿（例如N0V0zymes生產之酶混合物〇ndea Pro)生產的啤酒。如下文於實施例7中所述，本發明之發 明者意外發現，藉由將未經孵麥芽之雙重無功能型L〇x-無 功能型MMT大麥原料製醪而產生之麥芽汁含有極低含量之 T2N及DMS異味物質，而由野生型大麥產生之麥芽汁的 DMS含量出奇地高，儘管大麥籽粒尚未經歷萌芽。因此， 乾燥成熟大麥軒粒中必定存在一定量的DMS前驅物 (DMSP)’ 一種尚未描述之新性質，其將在本申請案之啤酒 產品中進行探究。因此，雙重無功能型L〇x_無功能型mm丁 榖粒適用於生產大麥釀造之麥芽汁及啤酒以使新鮮及陳化 啤酒產品中之T2N及DMS含量降至最低。 【實施方式】 定義 在以下描述、圖及表t，使用許多術語。為提供說明 書及申請專利範圍，包括賦予該等術語之範疇，提供以下 定義： 如本文所使用，「一（a)」可視其使用情形而意謂一或 多個（種）。 14 201208586 術言吾「曾站 °° 屣身學性狀（agronomic trait ) j描述促成植物之 效月b或經濟價值的該植物之表型或遺傳性狀。該等性狀包 括抗病性、抗蟲性、抗病毒性、抗線蟲性、乾旱耐受性、 尚'^度耐受性、產量、株高、成熟天數、籽粒等級（亦即 才子粒大小分級）、籽粒氮含量及其類似性狀。 術語「大麥（barley)」在提及製造基於大麥之飲料（諸 如啤酒）之製程時，尤其當用於描述孵麥芽製程時，意謂 大麥軒粒。在所有其他情況下，除非另外規定，否則「大 麥」思明大麥植物（Hordeum vulgare，L )，包括任何育種品 系或栽培品種或變種，而大麥植物之部分可為大麥植物之 任何部分，例如任何組織或細胞。 在「大麥釀造（barley brewing )」製程中，藉由將未經 孵麥芽之大麥之萃取物與可水解大麥組分之酶混合物一起 培育來製備麥芽汁。由大麥釀造所產生之麥芽汁可稱為「大 麥麥芽汁（barley wort )」或「大麥釀造之（barley-brewed )」 麥芽汁。 「抗病性（disease resistance )」欲指植物避免疾病症狀， 疾病症狀為植物-病原體相互作用之結果。以此方式可防止 病原體導致植物疾病及相關疾病症狀。或者，可將由病原 體導致之疾病症狀減至最少，或者減少甚至預防由病原體 導致之疾病症狀。 如本文所使用之「DMSP」為DMS前驅物或潛在dms 之縮寫，亦即可能在飲料生產期間轉化成DMS之分子。SMM 代表DMSP之主要部分（若非全部）。DMSP含量在本文中 15 201208586 定義為藉由在驗性條件下煮沸1小時，可由指定植物材料 或其產物中之DMSP產生之DMS的量。如本文所定義，1 ppb DMSP可轉化成1 ppb DMS。 如本文所使用，術語「雙重無功能型LOX ( double null-LOX)」是指引起功能性LOX-1完全喪失之第一突變及 引起功能性LOX-2完全喪失之第二突變。因而，「雙重無功 能型 LOX 大麥植物（double null-LOX barley plant)」為包 含引起功能性LOX-1完全喪失之第一突變及引起功能性 LOX-2完全喪失之第二突變的大麥植物。類似地，「雙重無 功能型LOX籽粒（double null-LOX kernels)」為具有引起 功能性LOX-1完全喪失之第一突變及引起功能性LOX-2完 全喪失之第二突變的籽粒。 術語 「雙重無功能型 LOX-無功能型 MMT (double-null-LOX-null-MMT)」是指引起功能性 LOX-1 完 全喪失之第一突變及引起功能性LOX-2完全喪失之第二突 變及引起功能性MMT完全喪失之第三突變。因而，「雙重 無功能型 LOX-無功能型 MMT 大麥植物 (double-null-LOX-null-MMT barley plant )」為包含引起功 能性LOX-1完全喪失之第一突變及引起功能性LOX-2完全 喪失之第二突變及引起功能性MMT完全喪失之第三突變的 大麥植物。類似地，「雙重無功能型LOX-無功能型MMT籽 粒（double-null-LOX-null-MMT kernels)」為具有引起功能 性LOX-1完全喪失之第一突變及引起功能性LOX-2完全喪 失之第二突變及引起功能性MMT完全喪失之第三突變的籽 16 201208586 粒適用雙重無功能型LOX-無功能型MMT之一實例稱為 「二重無功能（Triple_NuU)」且描述於下文之實施例中。 如本文所定義，「穀類（cereal)」植物為禾本科植物家 矢之員主要裁培用於獲得其含澱粉種子或籽粒。穀類 植物包括（但不限於）大麥（大麥屬（H〇rdeum))、小麥（小 麥屬（Triticum))、稻榖（稻屬（〇ryza))、玉米（玉蜀黍 屬（Zea))、黑麥（黑麥屬（Secale))、燕麥（燕麥屬（Avena))、 尚粱（高粱屬（Sorghum))及黑小麥（Triticaie)(黑麥小 麥之雜交種）。 在指定核酸之情形中，「編碼（enc〇ding/enc〇ded)」意 谓包含轉譯成指定蛋白質之資訊。編碼蛋白質之核酸或聚 核苷酸可在該核酸之轉譯區内包含非轉譯序列（例如内含 子），或可在例如cDNA中缺乏該等插入非轉譯序列。使用 迸碼子來說明編碼蛋白質之資訊。 如本文所使用，在核酸情形中之「表現（expressi〇n)」 應理解為來源於核酸片段之有彡mRNA <反義RNA之轉錄 及積聚。蛋白質情形中所使用之「表現」是指mRNA轉譯 成多肽。 術扣基因（gene )」意謂產生多肽鏈中所涉及之dn A 之區段；其包括在編碼區之前及之後的區域（啟動子及終 止子）。此外，植物基因一般由間雜有内含子之外顯子組 成。轉錄成RNA後，藉由剪接移除内含 腿（mRNA)。外顯子與内含子之間的「剪接位點 sites)」典型地由充當剪接過程之剪接信號的共同序列決 17 201208586 疋’剪接過程由自初級RN A轉錄物缺失内含子及在切除之 内含子的任一側上接合或融合剩餘RNA之末端組成。在— 些情況下，剪接之替代或不同模式可由相同的單一 DNa區 段產生不同蛋白質。天然基因可稱為「内源性基因 (endogenous gene)」。 如本文所使用，「異源（heterologous)」在提及核酸時 為來源於外來物種之核酸，或者若來自相同物種，則其天 然形式之組成及/或基因體基因座藉由故意人為干預而進行 了實質性修飾之核酸。 如本文所使用，術語「萌芽（germinati〇n)」意謂大麥 軒粒在S種組成物中開始或恢復生長，諸如在自然界中所 發現之正常土壞中。因@，萌芽胚為正經歷萌芽之胚。萌 芽亦可在置於生長室中之罐裝土壤或其類似物十進行，或 例如在置於標準實驗室培養皿（petd㉞）中之濕潤渡紙 亡或在畔.麥芽期間（例如在解麥芽工廠之浸泡貯槽或萌芽 盒中）進行°帛芽—般應理解為包括籽粒水合、籽粒膨脹 及誘導胚生長。影響萌芽之環境因素包括水分、溫度及氧 含量。觀察到根及芽發育。 内部種早、、籽粒（kernei)」$義為包含穀類穎果（亦稱為 穎二著於雜、外穎及内穎。在大部分大麥變種中，外穎及内 、^者於賴果’且在脫粒後作為籽粒之一部分。然而，亦 變種。在此等大麥中，賴果不具有外賴及内賴， ’、麥般自由地脫粒而出。術語「籽粒」及「穀粒 graln」在本文中可互換使用。 18 201208586 「榖粒發育（grain development)」是指自卵細胞被花粉 細胞授精開始之時段。在授精期間，代謝儲備物（例如糖、 寡醣、澱粉、酚類物質、胺基酸及蛋白質）在存在及不存 在液泡靶向下沈積至籽粒（穀粒）胚乳、種皮、糊粉粒及 子葉盤中的不同組織中，從而導致籽粒（穀粒）擴大、籽 粒（穀粒）充實，且以籽粒（縠粒）脫水為結束。 術語「功能性…完全喪失（t〇tal 1〇ss 〇f funetiQnal…、 是指缺乏指定酶活性。因而，「功能性L〇x_丨及l〇x_2完 全喪失（total loss of functional LOX-1 and LOX-2)」之大 麥植物為不具有可偵測之LOXq及L〇x_2活性的大麥植 物在本务明之上下文中，藉由測定由亞麻油酸形成 9-HPODE及13-HPODE之分析程序來測定[οχ]及l〇X 2 活性，儘管LOX-1及LOX-2酶可能具有其他活性。較佳如 國際專利PCT/DK2009/〇5〇355之實施例4中所述測定由亞 麻油酸形成9-HPODE及13-HPODE。應使用萌芽之胚之蛋 白質萃取物來測定活性。在本發明之上下文中，當使用亞 麻油酸作為受質時，當使用國際專利pct/DK2〇()9/()5()355 之貫施例4中所述之分析時，產生對應於國際專利 PCT/DK2009/050355之圖5A中所示標準物之9_Hp〇DE峰 之5%以下、較佳3〇/。以下的層析圖峰，及/或對應於國際專 利PCT/DK2009/050355之圖5A中所示標準物之13 HP〇de 峰之5%以下、較佳3%以下的層析圖峰視為無可偵測之 LOX-1及LOX-2活性。用於獲得功能性L〇x完全喪失之分 子方法包含產生導致完全不存在該酶之轉錄物的突變、完 19 201208586 全不存在相應所編碼酶的突變或導致所編碼之酶完全去活 之犬變。類似地’「功能性MMT完全喪失（total loss of functional MMT )」之大麥植物是指缺乏mmT酶活性，亦即 當使用下文之實施例2中所述之分析時，不具有可偵測之 MMT活性的大麥植物。或者’藉由分離該大麥之mmt cDNA 並碟定該cDNA編碼之蛋白質是否能夠催化曱基自SAM轉 移至Met由此形成SMM來測定大麥植物之MMT活性。 術語「LOX-1活性（l〇X- 1 activity )」是指大麥L0X-1 酶之酶活性。詳言之，在本發明之上下文令，「L〇x_丨活性」 為酶催化亞麻油酸雙氧化（dioxygenation)形成9-HPODE 及程度小得多的13-HP0DE。儘管L0X-1酶能夠催化其他 反應，但根據本發明，出於測定L〇X-1活性之目的，應僅 考慮9-HP0DE及13-HP0DE形成活性。圖ία概述亞麻油 酸轉化成9-HP0DE之生物化學路徑。 術語「LOX-2活性（LOX-2 activity )」是指大麥L0X-2 酉母之酶活性。詳言之’在本發明之上下文中，「L〇x_2活性」 為酶催化亞麻油酸雙氧化形成1 3-HPODE及程度小得多的 9-HP0DE。儘管LOX-2酶能夠催化其他反應，但根據本發 明’出於測定L0X-2活性之目的，應僅考慮i3_hp〇dE及 9-HP0DE形成活性。圖1A概述亞麻油酸轉化成13_Hp〇DE 之生物化學路徑。 術語「麥芽飲料（malt beverage)」及術語「基於麥芽 之飲料（malt based beverage )」是指使用麥芽製備之飲料， 較佳為藉由包括用熱水培育麥芽之步驟的方法所製備的飲 20 201208586 枓。5亥4術語在本文中可 ^ ^ re t 換使用。麥芽飲料可為例如喳 酒或瑪爾提那（maltina) w如皁 釀造」來生產（參看上述定義）。早西7Γ 了使用大麥 術語「酿·酵麥芽飲剌_广f . ermented malt beverage)j 已讀酵，亦即與酵母—起培f之麥芽飲料。 限/JT/ ("a1—)」為在控制環境條件下（包括但不 牙的特定形式。根據本發明拉萌 a…u αη 、叔程’孵麥芽在大麥籽粒ρ 次泡期間及/或之後開始進行。 麥芽製程，例如在熏式乾㈣j由乾魅大麥軒粒終止辉 式乾燥，但本發明之一僖埶 黑 乾燥。在麥芽尚未經窯 •、‘、式 、，黑式乾刼的情況下，其稱為「綠麥芽 C green malt) ι 〇 Λ # ^ , 雙重無功此型L〇X-無功能型ΜΜΤ大來 製備之麥芽組成物應理解為包含雙重無功能型而_ 型ΜΜΤ麥芽，咭a从拙土 …刀月t· ^ 、 啫如純雙重無功能型LOX-無功能型Mmt 芽或包含雙重無功能型L0X·無功能型MMT麥芽之任何 夕芽摻σ物。4組成物較佳僅由雙重無功能型無功能 型ΜΜΤ麥芽製備。麥芽可藉由例如研磨進行加工，且因而 稱為「「經研磨之麥芽（milledmalt)」或「麵粉（fl〇ur)」。 「製醪（maShing)」為在水中培育經研磨之麥芽。較佳 在特疋度下且在特定體積之水中進行製锻。水之溫度及 積”有重要J·生’因為此等因素影響來源於麥芽之酶活性 之降低速率’且因此尤其影響可能發生之澱粉水解之量. 蛋白酶作用亦可能具有重H詩可在㈣存在下進 21 201208586 行佐劑應理解為包含除麥芽以外之任何碳水化合物來 原諸如（但不限於）大麥（包括例如雙重無功能型L〇X_ 無功旎型MMT大麥）、大麥糖漿；或玉米、或稻榖，呈完 整籽粒形式或加工產物形式，如粗穀粉、糖漿或澱粉。所 有上述佐劑可主要用作萃取物之額外來源（糖漿典型地在 麥芽汁加熱期間給予）。釀造廠中對佐劑加工之要求視所用 佐劑之狀態及類型而定’且特定言之視澱粉膠凝或液化溫 度而定。若膠凝溫度高於正常麥芽醣化溫度，則澱粉在添 加至麥芽漿中之前即膠凝並液化。 術S吾「MMT活性（MMT activity )」是指大麥甲硫胺酸 S-曱基轉移酶之酶活性。在本發明之上下文中，「mmt活性」 為MMT催化Met之硫原子曱基化以產生SMM。儘管MMT 酶可能能夠催化其他反應’但根據本發明，出於測定MMT 活性之目的’應僅考慮SMM形成活性。圖1B概述藉由曱 基化將Met轉化成SMM之生物化學反應。 「突變（mutations )」包括基因之編碼區及非編碼區中 之缺失、插入、取代、顛換及點突變。缺失可能為整個基 因缺失或僅基因之一部分缺失，其中非編碼區較佳為啟動 子區或終止子區或内含子。點突變可能關係到一個鹼基或 一個鹼基對之改變’且可能產生終止密碼子、讀框轉移突 變或胺基酸取代。參考本文之圖8,該圖呈示關於突變型大 麥之榖粒在育種計劃中如何繁殖之概觀，世代M3縠粒及其 直接繁殖之榖粒或其任何後代（包括植物）可稱為「原始 突變體（raw mutant )」。此外，仍參考本文之圖8，術語「育 22 201208586 、種品系（breeding line )」是指世代M4之穀粒及其任何後代 (包括植物）’其可為栽培品種植物雜交之結果或與具有 獨立特定性狀之另一育種品系雜交之結果。 術浯「無功能LOX (null_L〇x)」是指ί〇χ編碼基因 中存在突變，導致所編碼之L〇x酶（LOXq或[OX·〗或 L〇X-l及LOX-2兩者）之功能完全喪失。在編碼L〇x之基 因中產生過早終止（無義）密碼子的突變僅代表一種機制， 經由該機制可獲得功能性L〇x完全喪失。用於獲得功能性 L〇X完全喪失之分子方法包含產生導致完全不存在該酶之 轉錄物的突變或導致所編碼之酶完全去活的突變。「無功能 LOX ( NuU-LOX)」在提及植物時是指具有引起功能性l〇x 酶完全喪失之突變的植物。 如本文所使用，術語「無功能型MMT ( nuU_MMT)」 疋指功能性S-腺苷甲硫胺酸：甲硫胺酸s_甲基轉移酶（亦稱 為曱硫胺酸S-甲基轉移酶）完全喪失。因而，「無功能型 MMT大麥植物（nuli_MMT bariey 為在編碼丁 之基因中包含引起功能性MMT完全喪失之突變的大麥植 物。類似地’「無功能型MMT籽粒（null-MMT kernels )」 為在編碼MMT之基因中包含引起功能性MMT完全喪失之 突變的籽粒。 可操作地連接（〇perabiy linked)」為用於指單一聚核 苦酸上之兩個或兩個以上核酸片段結合以使一者之功能受 另者影響的術語。例如，啟動子可操作地連接於編碼序 列’此時其能夠影響該編碼序列之表現，亦即該編碼序列 23 201208586 處於該啟動子之轉錄控制下。編碼序列可以有義或反義方 向可操作地連接至調控序列。 「PCR」或「聚合酶鏈式反應（p〇lymerase化如 reaction)」為熟習此項技術者所熟知，其為用於擴增特定 DNA區段之技術（Mullis，K.B.等人之美國專利第4,683，195 號及第4,800，159號）。 「植物（plant)」或「植物材料（plantmateriai)」包括 可再生出大麥植物的植物細胞、植物原生質體及植物細胞 組織培養物，包括植物愈傷組織，及植物中之完整植物細 胞，或植物部分，諸如胚、花粉、胚珠、花、籽粒、葉、 根、根尖、花藥或任何植物部分或植物產品。在一具體實 例中，植物材料可為不能再生出大麥植物的植物細胞。 術語「植物產品（plant product：)」意謂藉由對植物或 植物材料進行加工而產生的產品。因而，該植物產品可為 例如麥#麥芽汁、酿酵或非礙酵飲料、食物或飼料產品。 如本文所使用，「重組（rec〇mbinant)」在提及蛋白質 時為來源於外來物種之蛋白質，或者若來自相同物種，則 其天然形式之組成藉由故意人為干預進行了實質性修飾之 蛋白質。 咬「專家啤酒品嘗小組（speciaHst beer taste ρ』）」在本 申月案之3義内為在品嘗及描述啤酒風味（特別關注醛、 紙味、陳味、酯、高級醇、脂肪酸及硫組分）方面受過廣 泛培訓之專家小組。雖然存在許多用於評估風味組分之分 析工具，但風味活性組分之相對重要性難以用分析法評 24 201208586 .定。然而’該等複雜性質可由品嘗專家評估。其持續訓練 包括品嘗及評估標準啤酒樣品。 術語「剪接位點（splice site)」意謂基因之外顯子與内 含子之間的邊界。因而，剪接位點可為自外顯子延伸至内 含子之邊緣（稱為「供體位點（d〇n〇rsite)j或分離内含子 與外顯子之邊緣（稱為「接受位點（accept〇rsite)」）。植物 中之剪接位點典型地包含共同序列。内含子之5，端一般由 保守GT二核苷酸（mRNA中為GU)組成，且内含子之3, 端通常由保守二核苷酸AG組成。因而，内含子之5,剪接位 點包含内含子之5,端，而3,剪接位點包含内含子之3,端。 在本發明之上下文中，内含子之剪接位點較佳為由内含子 之最5,二核苷酸（―般為GT)組成之5,剪接位點，或由内 含子之最3，二核芽酸（一般為aG),组成之3,剪接位點。 除非另外說明，否則r T2N」意謂呈自由形式之反式 2-壬烯醛（T2N)。T2N有時亦稱為2·Ε_壬烯醛。 術5吾「潛在T2N ( T2N potential )」描述能夠在一或多 個反應巾釋放T2N或轉化成T2N的化學物f。在本發明之 上下文中，潛在T2N定義為在l〇〇°C、pH 4.0下培育2小時 期間釋放至溶液（例如麥芽汁或啤酒）中的τ2Ν之濃度。 就實施而言，測定起始Τ2Ν濃度，此後在100。〇、ρΗ 4.0 下培月♦液2小時，接著測定Τ2Ν濃度。起始τ2Ν濃度與 終止Τ2Ν濃度之間的差稱為潛在Τ2Ν<>酸性熱處理導致τ2Ν 自潛在Τ2Ν釋放’例如自「Τ2Ν加合物（Τ2ν 」釋 &，術语T2N加合物用於描述與一或多種物質結合之τ2Ν， 25 201208586 包括（但不限於）蛋白質、亞硫酸鹽、細胞碎屑、細胞壁 或其類似物。一般而言，人類不會感覺到T2N加合物本身 之異味。然而，自該等T2N加合物釋放之T2N可產生異味。 「組織培養物（Tissue culture)」指示包含相同或不同類 型之經分離細胞的組成物’或組織成植物部分（包括例如 原生質體、愈傷組織、胚、花粉、花藥及其類似物）之該 等細胞的集合。 如本文所使用，「轉殖基因（transgenic )」包括提及已 藉由引入異源核酸而進行修飾之細胞或來源於以此方式修 飾之細胞的細胞。因而，例如，轉殖基因細胞表現在該細 胞之天然形式中未以相同形式中發現之基因或表現由於故 意人為干預而以其他方式異常表現、表現不足或完全不表 現之天然基因。如本文所使用之術語「轉殖基因」在提及 植物、尤其大麥植物時不涵蓋藉由傳統植物育種（例如基 於NaN3之突變誘發）或因天然產生之事件而非故意人類= 新使細胞發生改變。 「野生大麥（wild barley)」，亦即二棱大麥（H〇rdeum vulgare ssp· spontaneum )，被認為是大麥之現代栽培形式的 祖先。認為大麥自野生狀態轉化成栽培狀態與將該植物馴 化成「地方大麥品種（baHey Undrace)」同時發生。與野生 大麥相比，此等植物在遺傳上與現代栽培品種更密切相關。 術語「野生型（wnd_type)」大麥是指以習知方式產生 之大麥植物。該術語較佳指本發明之大麥植物所來源的大 麥植物，亦即親本植物。野生型大麥籽粒—般可以「栽培 26 201208586 品種（cultivar )」或「變種（variety )」（亦即國家植物育種 組織（national plant breeding organization)所列出之彼等 遺傳上相似之籽粒）形式自例如種子公司獲得。儘管可獲 开于若干無功能型LOX-1大麥’栽培品種（例如栽培品種 Chamonix及Charmay )，但為了更透徹地理解本發明，所有 無功能型LOX-1植物、無功能型LOX-2植物、雙重無功能 型LOX植物及雙重無功能型l〇X_無功能型MMT植物在本 文中均視為突變型植物而非野生型植物。表述「栽培品種」 及「變種」在本文中可互換使用。 術語「麥芽汁（wort )」意謂麥芽（諸如經研磨之麥芽 或綠麥芽或經研磨之綠麥芽）之液體萃取物。在大麥釀造 中，亦可藉由將未經孵麥芽之大麥之萃取物與可水解大麥 組分之酶混合物一起培育來製備麥芽汁。除該等麥芽或來 源於大麥之萃取物以外，亦可由麥芽及其他組分製備液體 萃取物’諸如部分轉化成可醱酵糖之其他含澱粉材料。麥 芽汁一般藉由製醪而獲得，在用熱水製醪後自縠渣（spent grain )萃取殘餘糖及其他化合物之製程中，視情況接著進 行「喷淋（sparging)」。典型地在過濾槽、麥芽漿過濾器或 另一允許分離萃取水與榖渣之裝置中進行喷淋。製醪後所 獲得之麥芽汁一般稱為「初次麥芽汁（first w〇rt)」，而在喷 淋後獲得之麥芽汁一般稱為「二次麥芽汁（sec〇ndw〇rt)」。 若未加以規定，則術語麥芽汁可為初次麥芽汁、二次麥芽 ^或兩者之組合。在習知啤酒生產期間，將麥芽汁與啤酒 花一起煮沸，然而本發明提供減少煮沸或避免煮沸麥芽汁 27 201208586 無啤酒化之麥芽汁亦可稱為 之万法· w句|钳麥芽汁f w〇rt)J，而與啤酒花一起煮 麥芽汁（b〇ued wort)J。 之麥…稱為「煮彿 製備基於大麥之飲料的方法 本發明係關於製備具有低含量異味物質及其前驅物之 基於大麥之飲料的方法，其中該等方法包括能量輸入減 >、。異味物質如下文所述，但異味物質較佳為T2N及麵。 該等方法包括使用大麥植物，較佳為雙重無功能型⑽益 功能型_Τ大麥植物。下文更詳細地描述該等大麥植物: 根據本發明’該方法-般包含將該雙重無功能型而_ 無功能型MMT大麥植物辉麥芽的步驟，但在本發明之一些 具體實例中，&於大麥之飲料是使用未經孵#芽之大麥製 備。在下文之章節「孵麥芽」中更詳細地描述孵麥芽。夕 該方法進一步包含藉由視情況在其他佐劑存在下將雙 重無功能型L0X-無功能型MMT大麥或雙重無功能型 無功能型MMT麥芽或其混合物製醪來製備麥芽汁的步驟。 在下文之章節「製醪」中更詳細地描述製酸。 該方法亦包含視情況在其他成分存在下加熱該麥芽汁 的步驟，其中蒸發麥芽汁體積之至多4%，例如至多2%， 由此獲得經加熱之麥芽汁。在本文之章節「加熱麥芽汁」 中更詳細地描述此步驟。 最後，該方法包含將經加熱之麥芽汁加工成飲料。在 下文之早節「製備飲料」中更詳細地描述該方法之該部分。 28 201208586 孵麥芽 術語「孵麥芽」應理 境條件下進行之製程中萌芽:::：大麥籽粒在㈣ 芽 丁乾屎步驟。该乾燥步驟較佳可為已萌 茅籽粒在尚溫下之窯式乾燥。 ’燥之刖’已浸泡及萌芽之大麥穀粒稱為「綠麥芽」， 對本發明之植物產品。辉麥芽事件之此上述順序 、X穀粒改質之許多酶之合成、主要使死亡胚乳之細 匕J解聚以調用榖粒養分並活化其他解聚酶之過程非常重 要在隨後之乾燥製程中，由於化學褐變反 及色彩。 度王甘木 孵麥芽為尚能耗製程。由於需要高溫，因此特定言之 式乾燥亦為耗能製程。窯式乾燥有若干目標，特定言之 匕括.（Ο乾燥已萌芽之大麥籽粒；（π)終止萌芽；（⑴） 使脂肪加氧酶變性以降低Τ2Ν及潛在Τ2Ν之含量；及（iv) 由則驅物產生DMS並移除DMS以降低潛在DMS及dmS 之含量。 、根據本發明，可在較低溫度下進行熏式乾燥並仍實現 上述目標。藉由採用功能性LOX-1及LOX-2喪失之大麥植 不需要使脂肪加氧酶變性。藉由採用功能性MMT喪失 之大麥植物’不需要降低DMS及潛在DMS之含量，因為 k等3量在s亥等大麥植物中極低。因此，可乾燥大麥穀粒 並且甚至可在較低溫度下終止萌芽。 29 201208586 因而，本發明之孵麥芽較佳包含以下步驟： )α '包雙重無功能型LOX-無功能型MMT大麥； (b )使該大麥萌芽；及 (c )乾燥該大麥，較佳藉由窯式乾燥。 可藉由熟習此項技術者已知的任何習知方法進行浸 ^ ° -非限制性實例包括在⑽至25<t範圍内之溫度下以 交替乾濕條件進行浸泡。在浸泡期間，例如，可濕式培育 八夕持續3 〇分鐘至3小時之範圍，接著乾式培育持續3 〇 鐘至3小時之範圍’且視情況重複該培育流程2至5次 範圍内之次數。浸泡後之最終水含量可在例如4G%至50% 範圍内。 ^可藉由熟習此項技術者已知的任何習知方法進行萌 芽。-非限制性實例包括在听至2rc範圍内之溫度下萌 芽持續1 4小時之範圍，視情況同時改變溫度。 非限制性實例概述於下文之 適合浸泡及萌芽流程之一 貫施例9中。
延於實施例ό及實施例8及實施例9中。 然而，該窯式乾燥較佳在較低溫度下進行，更佳在低 窯式乾燥可在習知溫度下進行’諸如至少 在8〇C至90C之範圍内，諸如* 30 201208586 於。8〇°C之溫度下，更佳在低於75t之溫度下，諸如在低於 70 C之溫度下，例如在低於机之溫度下諸如在低於抓 之溫度下’例如在低於抑之溫度下，諸如在低於贼之 溫度下^列如在低於价之溫度下，諸如在低於爪之溫 進行因而，在熏式乾燥期間之任何時間，溫度較佳 不上升至高於8(TC，較佳不上升至高於75t。 為充分乾燥已萌芽之大麥軒粒，若在較低溫度下進行 該乾燥，則可增加寞式乾燥時間。進行寞式乾燥較佳持續 足以將已萌芽籽粒之水含量降至1〇%以下，較佳以下， 更佳6%以下的時間。因而，在㈣之習知以乾燥溫度下， ‘.、、九、時間可在1小時至3小時範圍内，而在7代至崎範 圍内之溫度下寒丈丘舎栏堂· Φ 1 , 4? ，、、，、』而要1小時至1 〇小時範圍内之窯烘 時間’在50 c至70°c範圍内之溫度下窯烘可能需要3小時 至5〇小時範圍内之寞供時間，而在低於抓（例如在听 至50°C範圍内）之溫度下熏供可能需要超過4〇小時之寞洪 時間’諸如在40小時至6〇小時範圍内，例如在45小時至 52小時範圍内，諸如48小時。 在一態樣令，本發明亦係關於藉由孵麥芽，較佳藉由 直接如上文所述孵麥芽而自雙重無功能型識-無功能型 MMT大麥籽粒製備之麥芽組成物。 即使如上文所述在較低窯烘溫度下製備時，該等麥芽 組成物亦包含低含量之T2N及潛在T2N。詳言之，該等麥 芽組成物包含低含量之潛在T2N (及T2N前驅物）。 已描述可藉由浸泡製程降低大麥籽粒中之L〇x活性， 31 201208586 在浸泡製程中大麥可經受高溫及/或乳酸處理。然而該等 浸泡製程亦消耗能量。此外，該處理可能具有其他不良效 應，諸如降低需要之酶活性，例如植酸酶活性。此外，該 處理僅降低進行熱處理以後時間之L0X活性，且因而對由 LOX活性獲得的產物之先前積聚不具影響。 在本發明之一具體實例中，使用大麥籽粒未在至少 7〇°C之溫度下經受浸泡的方法來製備植物產品。使用大麥籽 粒不經受在至少57。(：之溫度下在乳酸存在下浸泡之方法來 製備本發明之植物產品亦較佳。 該等麥芽組成物所包含之T2N較佳為以相同方式自野 生型大麥、較佳自栽培品種p〇wer或栽培品種Quench或栽 培品種Rosalina製備之麥芽組成物中所包含之T2N的6〇% 以下’較佳50%以下’更佳40%以下’甚至更佳30%以下， 例如20%以下。 此外’該等麥芽組成物（即使當在7 〇。匚至8 〇。〇範圍内 之溫度下窯式乾燥時）所包含之T2N較佳為以相同方式自 野生型大麥、較佳自栽培品種Power或栽培品種Quench或 栽培品種Rosalina製備之麥芽組成物中所包含之T2N的 60〇/〇以下T2N’較佳50%以下，更佳40%以下，甚至更佳 30%以下，更佳20%以下。 此外’該等麥芽組成物（即使當在5〇。(：至70°C範圍内 之溫度下窯式乾燥時）所包含之T2N較佳為以相同方式自 野生型大麥、較佳自栽培品種P〇wer或栽培品種Quench或 栽培品種Rosalina製備之麥芽組成物中所包含之T2N的 32 201208586 6〇%以下’較佳50%以下，更佳40%以下，甚至更佳3〇%以 下，更佳20%以下。 此外’該等麥芽組成物（即使當在40。(：至50°C範圍内 之溫度下窯式乾燥時）所包含之T2N較佳為以相同方式自 野生型大麥、較佳自栽培品種P〇Wer或栽培品種Quench或 栽培品種Rosalina製備之麥芽組成物中所包含之T2N的 60%以下，較佳50%以下，更佳40%以下，甚至更佳3〇%以 下，更佳20%以下。 除低含量之T2N及潛在T2N以外，本發明之麥芽亦包 含低含量之DMS及DMS前驅物，即使當在上述較低窯烘 溫度下製備時。 、^ 令人感興趣的是，DMS為具有相當高揮發性的化合 物，其沸點為37。(：至38。(：（Imashuku，上文），且在麥芽: 產期間’例如在熏式乾燥期間，組成物一般經受加熱，使 得大畺DMS蒸發。然而，在冷卻正常麥芽組成物期間， 前驅物（DMSP )可產生更多DMS。本發明之—主要優勢在 於麥芽組成物中不產生或僅產生極少DMSp (特定言之 SMM) 〇 ° 已描述用於降低麥芽中之刪濃度的方法。許多此等 方法依賴於對麥芽進行高能耗熱處理。該熱處理可為例如 f窯式乾燥期間簡單地加熱麥芽，或其可包括藉由施加蒸 /飞來使自由DMS揮發及/或移除。因而，蒸汽處理麥芽可降 低麥芽中之自由DMS含量，卻又代表具有高能耗之製程。 此外此等方法主要降低麥芽中之自由Ο·含量，而對 33 201208586 在本發明之一具體實例中，本 燥期間僅經受包括藉由蒸汽來 限處理’或者不經受包括使用 除的處理。 中’本發明之麥芽較佳未用溴 SMM含量僅具有極小影響。 發明之麥芽組成物在窯式乾 使自由DMS揮發及移除的有 蒸汽來使自由DMS揮發及移 在本發明之一具體實例 酸鹽（諸如溴酸卸或溴酸鈣）處理。 本發明之麥芽組成物較佳包含至多3 _自由dms， 較佳至多2^/g，更佳至多1μ§/γ甚至更佳至多〇 5^/g， 諸如至多0.2叫/g自自DMS。此夕卜，較佳的是本發明之麥 芽組成物較佳包含至多2 pg/g DMSp，較佳至多i，更 佳至夕0.5 pg/g，甚至更佳至多〇 2 DMSp。(較 佳可為SMM )之濃度在此處及本文件之其他處指示為可由 該DMSP釋放之DMS的激度。 更佳的是，該等麥芽組成物（即使當在7〇〇c至8〇1範 圍内之溫度下窯式乾燥時）包含至多2 pg/g DMSp (較佳為 SMM) ’較佳至多1 gg/g，更佳至多〇」叫/g，甚至更佳至 多 0.2 pg/g DMSP (較佳為 SMM )。 更佳的是’該等麥芽組成物（即使當在5 〇它至7 〇。〇範 圍内之溫度下窯式乾燥時）包含至多2 pg/g DMSp (較佳為 SMM)較佳至多1 pg/g，更佳至多〇. 5 pg/g，甚至更佳至 多 0.2 pg/g DMSP (較佳為 SMM )。 更佳的疋’該專麥芽組成物（即使當在4 0。〇至5 0。〇範 圍内之溫度下窯式乾燥時）包含至多2 pg/g DMSP (較佳為 SMM)，較佳至多1 gg/g，更佳至多〇 $ pg/g，甚至更佳至 34 201208586 多 0.2 pg/g DMSP (較佳為 SMM)。 在另一態樣中，本發明係關於綠麥芽組成物，其包含 至多5000 PPbDMSP，更佳至多25〇〇ppb，更佳至多1〇〇〇 ppb ’甚至更佳至多5〇〇 ppb，更佳至多25〇响，例如至多 150 ppb DMSP。亦較佳的是，該等綠麥芽組成物包含至多 2〇〇PPb自由DMS’較佳至多15〇ppb，更佳至多i〇〇ppb， 甚至更佳至多50 ppb ’諸如至多25 ppb自由DMS。 雖然麥芽之主要用途為用於飲料生產，但其亦可用於 其他工業製程，例如用作烘烤工業中之酶來源，或在食品 工業中用作調味及著色劑，例如以麥芽或麥芽粉形式:: 間接呈麥芽糖浆等形式。因@，本發明之植物產 任 何上述產品。 ’ 仕另一恐樣中，本發 诅奶座匕-3·卿果驭甚至 糖聚組成’諸如大麥糖漿或大麥芽糖漿。植物產品亦可 大麥或麥芽之萃取物。 物產經進一步加工’例如研磨。因而，本發明之 磨之二何種類之麥芽，諸如未經加工之麥芽或經 ::…諸如麵粉。經研磨之麥芽及其麵粉包含麥芽 不此再萌芽之死亡細胞的化學組分。 =佳在乾燥狀態下進行研磨，亦即在乾燥時研磨 牙。因而，較佳不在水存在下研磨麥芽。 製醪 L〇X-無功能型 本發明方法包含藉由將雙重無功能型 35 201208586 MMT大麥及/或麥芽及視情況選用之其他佐劑製醪來生產 麥芽汁的步驟。該製膠步驟亦可視情況包含喷淋，且因此 s亥製醪步驟可為包括喷淋步驟的製醪步驟或不包括喷淋步 驟的製醪步驟。 一般而言’麥芽汁生產以研磨雙重無功能型L〇x_無功 能型MMT麥芽及/或雙重無功能型L〇x無功能型MM丁大 麥起始。若添加其他佐劑，則此等物質亦可視其性質加以 研磨。若佐劑為穀類，則其可例如進行研磨，而糖漿、糖 及其類似物一般將不進行研磨。研磨將有助於水在製醪階 敛接近榖粒粒子。在製醪期間’於孵麥芽期間所引發之受 質的酶促解聚可能持續。 在圖9中，步驟4至步驟6說明由麥芽製備麥芽汁之 常用方法…般而t ’麥芽㈣由將經研磨之麥芽與水組 合並培育，亦即在製醪製程中製備。在製醪期間，麥芽/液 體組成物可補充其他富含碳水化合物之佐劑組成物，例如 經研磨之大麥、玉米或稻榖佐劑。未經衅麥芽之縠類佐劑 通常幾乎不含或不含活性冑，使得補《麥芽或外源酶以提 供多醣解聚等所必需之酶變得非常重要。 在製醪期間，將經研磨之雙重無功能型L〇x_無功能型 MMT麥芽及/或經研磨之雙重無功能型⑽-無功能型顧丁 大麥及視情況選用之其他佐劑與液體部分（諸如水）一起 培育。培育溫度一般保持恆定（等溫製醪）或逐漸增加， 例如以依序方式增力口。在任一情況下，|芽/大麥/佐劑中之 可溶性物質均釋放至該液體部分中。隨後進行過遽分離麥 36 201208586 也與殘餘固體粒子’固體粒子亦稱為「毅潰」。如此獲得 之芽汁亦可稱為「初次麥芽汁」。在亦稱為喷淋之製程期 間，：向穀邊中添加其他液體，諸如水。喷淋及過濾後， 可獲得·「二次麥芽汁」。可藉由重複該程序來製備其他麥芽 汁Bnggs等人（上文）及H〇ugh等人（上文）描述用於 製備麥芽汁之適合程序的非限制性實例。 已描述可藉由對酶進行熱處理來降低L〇x活性且可藉 由熱處理來降低DMS含量。此外，已描述麥芽汁可經減 理以降低LOX活性並降低卿含量及/或可在高溫下進行 製醪以達到相同目標。然而’熱處理可能具有不良效應， 諸如降低其他酶活性此外熱處理消耗能量。此外，熱處 理僅降低進行熱處理以後時間之脂肪加氧酶活性及DMs含 里，且因而其不影響來源於L0X活性之產物及DMs前驅物 的先前積聚。 因此，在本發明之一具體實例中，使用以下方法製備 麥芽汁：其中初始製醪溫度不超過70〇c，較佳不超過69^， 因而例如初始製醪溫度可在3(rc至69t:範圍内，諸如在 3 5°C至69°C範圍内，例如在35°C至65°C範圍内，諸如在35°C 至5 5 C範圍内’例如在3 5 C至4 5 °C範圍内’諸如為約4 0 °C。 在製醪期間，本發明之麥芽汁經受7〇。〇或7〇°c以上之溫度 不超過25分鐘亦較佳，較佳不超過2〇分鐘，且麥芽汁經 受78°C或78°C以上之溫度不超過2〇分鐘亦較佳，較佳不超 過15分鐘’更佳不超過10分鐘。若製醪溫度過高，則此 性質將影響麥芽漿中之酶活性，且可能降低或甚至消除所 37 201208586 需要之酶活性，由此將會導致麥 是，本發明之麥芽汁在製醇 ：：變。更佳的 度不超過】〇。分鐘，較佳不超過9。八，以上之溫 分鐘，更佳不超過70分鐘。 更佳不超過⑽ 在本發明之一較佳1 $ ^ 1中，製醪期間的溫度不超 過，較佳不超過78<3(：^ 適合製峻之-非限制性實例為： (U在35t至45。(：範圍内之㈤ _ ,. ^ ，皿度（諸如約40°C )下製 醪持續1 0分鐘至30分鐘範圍内 ,。、丄 图円之時間，諸如約20分鐘； (2) 在30分鐘至9〇分赫鎔固七 軌圍内、較佳在45分鐘至75 为知範圍内（諸如約6〇分鐘）， 逢里）加熱至60 C至70t：範圍内、 較佳⑽至6rc範圍内之溫度，諸如約阶； (3) 。在5分鐘至15分鐘範圍内（諸如約1〇分鐘）加 熱至7〇°C至8〇°C範圍内、較佳听至7代範圍内之溫度， 諸如約78°C。 適合製躍之另一非限制性實例為： (4)在55C至65°C範圍内之溫度（諸如約6〇。〇下製 曝持續H)分鐘至30分鐘範圍内之時間，諸如約2〇分鐘； (5 )在30为鐘至90分鐘範圍内、較佳在45分鐘至75 分鐘範圍内（諸如約60分鐘）加熱至6〇艺至7〇。〇範圍内、 較佳6(TC至65。(：範圍内之溫度，諸如約65β(：; (ό )在5为知至15分鐘範圍内（諸如約1 〇分鐘）加 熱至7CTC至8(TC範圍内、較佳75。〇至78。〇範圍内之溫度， 諸如約7 8 °C。 38 201208586 ， 如上文所提及’可藉由將雙重無功能型LOX-無功能型 MMT大麥植物或其部分（諸如未經孵麥芽之雙重無功能型 LOX-無功能型MMT籽粒，特定言之’經研磨之未經孵麥 芽之雙重無功能型LOX-無功能型MMT籽粒，或其部分） 製醪來製備麥芽汁組成物。未經孵麥芽之大麥籽粒缺乏或 僅含有限量的對麥芽汁生產有益之酶，諸如能夠降解細胞 壁之酶或能夠將澱粉解聚成糖之酶。因而，在使用未經孵 麥芽之雙重無功能型LOX-無功能型MMT進行製醪的本發 明具體實例中，較佳向麥芽聚中添加—或多種適合外來辕 造酶。適合酶可為脂肪酶、澱粉降解酶（例如澱粉酶）、葡 聚糖酶[較佳為（1-4)-β-葡聚糖酶及/或葡聚糖 酶]，及/或木聚糖酶（諸如阿拉伯木聚糖酶），及/或蛋白酶， 或I 3或夕種上述酶之酶混合物，例如cerefi〇、uitrano 或〇ndeaPro(Novozymes)。由未經孵麥芽之大麥製備之麥 芽汁生產飲料的方法亦可稱為「大麥釀造」，且其麥芽汁組 成物稱為「大麥麥芽汁」或「大麥釀造之」麥芽汁。 亦可使用經孵麥芽及未經孵麥芽之雙重無功能型l〇x_ 無功能型_T大麥植物或其部分之混合物來製備麥芽汁組 成在此情況下可在製備期間添加一或多種適合酶。更 特疋。之，在存在或不存在外來釀造酶下，本發明之大麥 可以任何組合與麥芽-起用於製醪，諸如（但不限於）大 麥：麥芽之比例=約1〇〇:〇或約75:25或約5〇:5〇或約25:75。 在本發明之其他具體實例中，較佳不存在外來酶，特 定言之在製曝前或製曝期間不漆加外來蛋白酶及/或外來纖 39 201208586 維素酶及/或外來α-澱粉酶及/或外來卜澱粉酶及/或外來產 麥芽糖α-澱粉酶。 製醇後所獲得之麥芽汁亦可稱為「甜麥芽汁」。在習知 方法中，在存在或不存在啤酒花下將甜麥芽汁煮沸此後 其可稱為煮沸之麥芽汁。 如本文所使用之術語「約（approximately )」意謂土， 較佳±5%，更佳±2%。 加熱麥芽汁 本發明之用於製備基於大麥之飲料的方法包括將上文 章節「製醪」中所述之製醪步驟後所獲得之麥芽汁加熱的 步驟。 ^ 本發明之一優勢在於，可在不需要長時間加熱麥芽汁 下製備具有低含量之異味物質及其前驅物（特定言之τ2Ν 及DMS及其刖驅物）的基於大麥之飲料。 ^在習知釀造中，一般將麥芽汁煮沸持續較長時間。麥 芽汁煮沸具有若干目標，特定言之：（i )使酶去活；（ii )使 蛋白質凝聚；（iii)將麥芽汁滅菌；（iv)萃取啤酒花化合物； (v)使α-酸異構化；（vi)使DMSp轉化成;及（w) 蒸發DMS及T2N » 若干此等目標可在不進行長時間煮沸下達成。因而， 滅菌僅需要短時間煮沸或加熱。萃取啤酒花化合物亦可在 短時間煮沸或加熱期間進行。預先異構化t α-酸可購得並 可添加至麥芽汁中。 藉由採用功能性L0X]及L0X_2喪失之大麥植物，不 201208586 需要使LOX變性。此外，藉由採用功能性Lop及^ 喪失之大麥植物亦消除對降低T2N含量之需要。藉由採用 功此性MMT喪失之大麥植物，亦不需要降低DMs及潛在 麵，含量，因為該等含量在該等大麥植物中極低。此曰外， 可乾燥大麥榖粒並且甚至可在較低溫度下終止萌芽。 已試圖藉由各種手段降低麥芽汁煮彿期間的能耗，例 如藉由將蒸發降至低達3%與將不需要之揮發性化合物萃取 至蒸汽中的汽提製程組合。然而，蒸汽之產生亦為耗能過 程。 亦已試圖在不進行經典麥芽汁煮沸下製備麥芽汁。缺 二’此等方法在製駿以及用蒸汽汽提麥芽汁期間一般利用、 同達95 C之高溫，因而視為高能耗製程。 本發明方法提供減少蒸發之可能性，且 存在汽提製程下進行。因而，根據 在不 I加熱麥#汁：較佳蒸發麥芽汁體積之至多4%，又較佳 至夕；3%，甚至更佳至多2%， 多1。/，甘厂 选主更佳至多1.5% ,更佳至 。至更佳至多〇.5%，甚至更佳至多〇 夕在不存在麥芽汁之蒸 口至 發甚至更佳。在；卜進仃上述減少之蒸 文佳在不存在例如用蒸 減少之蒸發亦較佳。 麥芽汁下進仃上述 可藉由在基本上密閉之容器 熱麥芽汁來實現減少之蒸發。^較佳在，閉容器_加 佳。何其他步財均不切μ發液體更 因此，本發明之一較佳具體實例係關於製備具有低： 201208586 !之或多種異味物質及其前驅物（較佳為Τ2Ν及DMS及 其月馬區物）的某^| 巷於大麥之飲料的方法，其中該方法涉及能 量輸入減少，該方法包含以下步驟： ()提供大麥植物或其部分，其中該大麥植物包含： (a )引起功此性L〇x_ i完全喪失之第一突變；及 (b )引起功旎性L〇x_2完全喪失之第二突變；及 ()引起功月b性MMT完全喪失之第三突變； (")視情況將該大麥之至少—部㈣麥芽，由此獲得 經孵麥芽之大麥； (m)將該大麥及/或經解麥芽之大麥及視情況選用之其 他佐劑製醪，由此獲得麥芽汁； (iV)視情況在其他成分存在下加熱該麥芽汁； (v)將該經加熱之麥芽汁加工成飲料； 其中在完成步驟（ii)後，七甘s > 哪、U便，或甚至在完成以上步驟（iv) 後，該方法期間所蒸發之液體 猫積為至多4%，例如至多 3% ’諸如至多2%，例如至多1 夕1.5 /〇 ’啫如至多1 %，由此製 備具有低含量之一或多種I4 、未物為及其前驅物的來源於大 麥之飲料。 上文之步驟㈤較佳用處於基本 如處於密閉容器中）之麥芽汁進行。 。中（ 在另一較佳具體實例中，本菸 • β 不士明棱供用於製備具有 含=多種異味物f及其前驅物（較佳為Τ2Ν及⑽ :二=的基於大麥之飲料的方法，其中該方法涉 能里輸入減少，該方法包含以下步驟： 42 201208586 (1)提供大麥植物或其部分’其中該大麥植物包含： (a )引起功能性LOX-1完全喪失之第一突變；及 (b )引起功能性LOX-2完全喪失之第二突變；及 (c )引起功能性MMT完全喪失之第三突變； (11 )視情況將該大麥之至少一部分孵麥芽，由此獲得 經孵麥芽之大麥； (ui )將该大麥及/或經孵麥芽之大麥及視情況選用之其 他佐劑製醪，由此獲得麥芽汁； (w)視情況在其他成分存在下加熱該麥芽汁； (v )將s亥經加熱之麥芽汁加工成飲料； 其中將該液體/麥芽汁/飲料加熱至8〇。〇以上之溫度持 續至多30分鐘，更佳持續至多2〇分鐘，由此製備具有低 含量之—或多種異味物質及其前驅物的來源、於大麥之飲 料。 在該方法期間，較佳將該液體/麥芽汁/飲料加埶至8〇它 至99.rc範圍内之溫度，較佳加熱i 8代至99 5。。範圍内 之溫度’諸如加熱i 8(rc至99t之溫度，更佳加執至9代 至机範圍内之溫度，更佳加熱至95t至99t範圍内之溫 度持績至多3 0分鐘，較佳5客9 π八拉 L, 夕2〇分鐘，諸如10分鐘至30 为釦範圍内，例如10分鐘至2〇分鐘範圍内。 汁組合，且此後進行 根據本發明之方法， 不論是純初次麥芽汁 煮沸後其可稱為「煮 首先，將第二麥芽汁及其他麥芽 加熱，或可加熱各個別種類或麥芽汁 不必煮沸麥芽汁。未煮沸之麥芽汁， 或組合麥芽汁，亦稱為「甜麥芽汁j; 43 201208586 沸之麥芽汁」。若麥芽汁將用於生產啤酒，則往往在煮沸前 添加啤酒花。 在傳統啤酒酿造方法中，將麥芽汁煮沸持續較長時 間’ -般在60分鐘至m分鐘範圍内，以蒸發麥芽汁體積 之至少5%且有時甚至多達25%。“，長時間煮沸由於許 多其他原因而不合需要，例如因為長時間煮沸需要顯著能 量供應。 根據本發明，具有低含量T2N、潛在T2N、DMS及DMSP 之麥芽汁甚至可在不進行長時間煮沸下由雙重無功能型 LOX-無功能型MMT大麥製造。因而，將本發明之一 具體實例之麥芽计煮沸至多3〇分鐘，更佳 甚至更佳至多10分鐘，更佳至多5分鐘，甚至更二' :釦’更佳為完全不煮沸該麥芽’汁。更佳在 法之步驟後將該㈣/麥芽汁/飲料㈣ 更佳至多15分鐘，甚 0 “里’ 鐘，甚至更佳至多i一 更佳至多5分 夕刀在里，更佳完全不煮沸該液體/麥芽汁/ 飲料。較佳在基本上密H Φ 十/ 熱麥芽汁。 1之“中，較佳在密閉容器中加 在本文中術語「煮沸」意謂使 到水蒸發之π许m 々个牙汁或飲枓達 皿又。因此，在常壓下，煮沸將意 體（諸如麥芽汁）達到1GG°C或梢高於m 7 因而將本發明之一且體實例之來年、4_ v 100。。之·” U -體貫例之麥芽汁保持在至少 0C之狐度下持續至多3〇分鐘 分鐘，甚至更伟姓接 文佳持續至多15 更佳持續至多10分鐘，更佳持續 44 201208586 甚至更佳持續至多丨分鐘，更佳完全不將麥芽汁加熱至至 少100 C之溫度。此外，較佳在完成本發明方法之步驟（^ ) 後將該液體/麥芽汁/飲料保持在至少100<t之溫度下持續至 多30分鐘，更佳至多15分鐘，甚至更佳至多1〇分鐘:更 佳至多5分鐘，甚至更佳至多丨分鐘，更佳完全不將該液 體/麥芽汁/飲料加熱至至少1 〇〇。〇之溫度。 本發明製備基於大麥之飲料的整個方法在任何時間均 不包括加熱至超過99.8T：、較佳99.5°c、更佳99°C之溫度 亦較佳。 相反’該方法可包括將麥芽汁加熱至至多99 8。〇、諸如 至多99.5 C、例如至多99。〇、諸如至多98°C之溫度持續有 限量之時間的步驟。該有限量之時間較佳為至多3〇分鐘， 更佳為至多1 5分鐘，甚至更佳為至多1〇分鐘。 因而，較佳將麥芽汁加熱至高於8 〇。〇之溫度，較佳在 80°C至99.8°C範圍内，諸如在80。〇至99 5°c範圍内，例如在 80 C至99°C範圍内，更佳加熱至90°C至99°C範圍内之溫度， 更佳加熱至95°C至99t範圍内之溫度，持續至多30分鐘， 較佳至多20分鐘’諸如在1〇分鐘至3〇分鐘範圍内，例如 在10分鐘至20分鐘範圍内。 在本發明之另一具體實例中，在煮沸麥芽汁之後及醱 酵之前麥芽汁較佳不進行（例如用C02洗滌）。 麥芽汁 在另一態樣中，本發明係關於植物產品類型，其為麥 芽汁組成物。該等麥芽汁組成物較佳由來源於雙重無功能 45 201208586 型LOX-無功能型MMT籽粒之麥芽組成物製備。該等麥芽 可僅由雙重無功能型L0X_無功能型MMT籽粒或亦包含其 他籽粒之混合物製備。本發明亦係關於使用單獨或與其他 、’且刀混σ之雙重無功能型L〇x_無功能型大麥或其部 分（諸如綠麥芽）製備的麥芽汁組成物。 本發明之麥芽汁組成物較佳藉由上文之章節 衣啼、 中所述之製if來製備。此外，麥芽汁組成物可能已如上文 之章節「加熱麥芽汁」中所述進行了加熱。 較佳的是’該等麥芽汁組成物中所包含之潛在t2n較 佳為以相同方式自野生型大麥、較佳自栽培品種ρ。而或 栽培品種—製備之麥芽汁組成物中所包含之潛在 Τ2Ν的60%以下’更佳5〇%以下，甚至更佳㈣以下。 該麥芽汁可為初次參芽许M L + Λ ^ I牙，十及/或二次麥芽汁及/或其他 麥芽汁及/或其混合物。麥芽汁 麥芽/十組成物可為甜麥芽汁、經加 熱之麥穿汁或其混合物。經加埶 μ 热之麥牙汁較佳如上文之章 卽加熱麥芽汁」令所述進行了 Λ_ mm 。進灯了加熱。麥芽汁組成物亦可 為大麥麥茅汁。一般而言，麥芽汁組成物含有高含量 基氮及可醱酵碳水化合物， 糖。 Γ醱酵奴水化合物主要為麥芽 熱處==甜為甜麥芽汁，亦即未㈣ 以相同方式自野生型大:=::含:— 品種—製備之麥芽汁組 ::::广裁培 _下’更―麥芽汁二 46 201208586 乾燥之麥芽製備，則其甚至可包含更少潛 JL rU ^ 囚而’ 在由已在5〇t至70。〇範圍内之溫度下窒式 哕甜d 没卜黑式乾燥之麥芽製備 孑甜麥牙汁的本發明具體實例中，該甜麥芽汁中所包人 潛在T2N較佳可為以相同方式自野生型大麥、較佳二 口口種Power製備之麥芽汁組成物中所包含之潛在UN ^ 5〇%以下，甚至更佳45%以下，諸士〇 4〇%以下。在由已在 4〇°C至50。(：範圍内之溫度下寞式乾燥之麥芽製備該甜麥芽
^的本發明具體實例中’該甜麥芽汁中所包含之潛在T2N 較佳可為以相同方式自野生型大麥、車交佳自栽培品種
Quench或栽培品種R〇saUna製備之麥芽汁組成物中二:含 之潛在Τ2Ν的50%以下，甚至更佳娜以下更佳浙二 下。 該甜麥芽汁較佳亦包含低含fiDMSp，較佳包含BO pg/L以下DMSP (較佳為SMM)，更佳i〇〇 以下甚 至更佳50 _以下’更佳3G _以下，甚至更佳2〇球 以下，更佳15 gg/L以下DMSP (較佳為SMM)。即使該麥 芽汁由在較低溫度下寞式乾燥之麥芽製備，其仍包含低含 量之DMSP。因而，在由已在5〇。。至赃範圍内之溫度下 熏式乾燥之麥芽製備該甜麥芽汁的本發明具體實例中，則 該甜麥芽汁較佳可包含150 ^/L以下之DMSp，更佳ι〇〇 gg/L以下，甚至更佳5〇 gg/L以下，更佳3〇 ^g/L以下甚 至更佳20叫/L以下，更佳15叫几以下之DMsp。在由已 在40°C至5G°C範圍内之溫度下熏式乾燥之麥芽製備該甜麥 芽汁的本發明具體實例中，則該甜麥芽汁較佳可包含15〇 47 201208586 pg/L以下之DMSP ’更佳100 pg/L以下，甚至更佳5〇 以下，更佳30 pg/L以下’甚至更佳20 pg/L以下，更佳15 pg/L以下之DMSP。 該甜麥芽汁較佳亦包含低含量之DMS，較佳包含9〇 pg/L以下之DMS，甚至更佳50 pg/L以下，更佳3〇叫化 以下’甚至更佳20 pg/L以下之DMS。 麥芽汁亦可為僅熱處理較短時間之麥芽汁，諸如在 95°C至99.8°C範圍内或95。(：至99。(：範圍内之溫度下持續1〇 至30分鐘範圍内之時間。在此情況下，該麥芽汁中所包含 之潛在T2N較佳為以相同方式自野生型大麥、較佳自栽培 品種Power或栽培品種R〇saHna製備之麥芽汁組成物中戶^ 包含之潛在T2N的至多60%，更佳至多5〇%，甚至更佳至 多45/。，更佳至多40%。該麥芽汁較佳亦包含至多15〇叫几 DMSP，更佳1〇0叫几以下，甚至更佳5〇盹几以下，更佳 30邮/L以下’甚至更佳2〇 _以下，更佳15㈣[以下 之DMSP。該麥芽汁較佳亦包含至多150 _ DMS，更佳 1〇〇^以下’甚至更佳以下，更佳3〇_以下， 甚至更佳20 pg/L以下之DMS。 麥芽汁亦可為經加熱之麥芽汁（較佳如上文之章節「加 熱麥芽汁」巾料進行加熱）m兄下，轉芽汁中所 3之潛在T2N較佳為以相同方式自野生型大麥、較佳自 栽培品種Ρ°·㈣的麥芽汁組成物中所包含之潛在T2N 的至多60%，更佳至多5〇%，更佳至多4㈣。 該經加熱之麥芽汁較佳亦包含低含量之麵卜較佳包 48 201208586 含15〇 Pg/L以下之DMSP，更佳1 〇〇 pg/L以下，甚至更佳 50 pg/L以下，更佳30料/L以下，甚至更佳2〇 pg/L以下， 更佳1 5 pg/L以下之DMSP。在由已在5〇°C至70°C範圍内之 溫度下窯式乾燥之麥芽製備該經冷卻之麥芽汁的本發明具 體實例令，則該甜麥芽汁較佳可包含15〇 pg/L以下之 DMSP，更佳1〇〇 pg/L以下，甚至更佳5〇叫/；1以下，更佳 30 pg/L以下，甚至更佳2〇 gg/L以下，更佳15 gg/L以下 之DMSP。甚至在由已在4〇。〇至5(Γ(：範圍内之溫度下窯式 乾燥之麥芽製備該經冷卻之麥芽汁的本發明具體實例中， 則°亥甜麥芽汁較佳亦可包含1 50 pg/L以下之DMSP，更佳 100 pg/L以下，甚至更佳5〇 gg/L以下，更佳3〇盹/L以下， 甚至更佳20叫/L以下，更佳15 pg/L以下之DMSP。該經 加熱之麥芽汁較佳亦包含低含量之DMS，較佳包含3〇叫几 以下之DMSP，更佳20 pg/L以下之DMSP。 麥芽汁亦可為經加熱之麥芽汁（較佳如上文之章節「加 熱麥芽汁」中所述進行加熱），隨後將其冷卻（本文中亦稱 為經冷卻之麥芽汁）’在此情況下，該麥芽汁中所包含之潛 在T2N較佳為以相同方式自野生型大麥、較佳自栽培品種 Power或栽培品種RGSaUna製備的麥芽汁組成物中所包含 之潛在T2N的至多60〇/〇，更佳至多5〇%，更佳至多4〇%。 在由已在40。。至50。。範圍内之溫度下窯式乾燥之麥芽製備 “ ”里冷卻之麥芽汁的本發明具體實例巾，則該甜麥芽汁中 所包含之潛在T2N較佳可為以相同方式自野生型大麥、較 佳自栽培品種Power或栽培品種心心⑽製備之麥芽汁級 49 201208586 成物中所包含之潑方丁 οχτ 更佳3 0%以下。 @ 5。%以下，甚至更佳40。/。以下， Λ ^卻之麥芽汁較佳亦包含低含量之DMSP，較佳包 含，甚至更佳5。一下，更：3〇 ::以下’甚至更佳2。…下，更佳W以下之 DMSP。該經冷卻之麥芽汁較佳亦包含低含量之麵 包含9。一下之DMS，甚至更佳5。_以下，更;圭 3〇離以下’甚至更佳2〇離以下之刪。 在本發明之—特^具體實例中，本發明之麥芽汁組成 :、、大麥麥芽汁’諸如經加熱之大麥麥芽汁，亦即藉由谇 :未經r子麥芽（且較佳經研磨）之雙重無功能型l〇x_無： 此'MMT籽粒與水、較佳藉由製醪及喷淋而製備的麥芽 汁。遠大麥麥芽汁之特徵在於T2N及潛纟t2n之含量極 低6亥大麥麥芽汁所包含之潛在Τ2Ν較佳為以相同方式自 予生f大麥、較佳自栽培品種p〇wer製備之麥芽汁組成物 中所包含之潛在T2N的5〇%以下，更佳桃以下甚至更 佳3〇%以下。亦較佳的是，該大麥麥芽汁中所包含之T2N 前驅物較佳為以相同方式自野生型大麥、較佳自栽培品種 Power或栽培品種Quench或栽培品種R〇saiina製備之麥芽 汁組成物中所包含之T2N前驅物的6g%以下，更佳遍以 下’甚至更佳30%以下。 飲料 在一較佳態樣中，本發明係關於飲料，更佳為由雙重 50 201208586 •無功此型L〇X_無功能型MMT大麥製備的基於大麥之飲 料在—較佳具體實例中，該等飲料可為麥芽飲料，甚至 更佳為職酵飲料，諸如醱酵麥芽飲料’較佳為酒精飲料， 諸如皁酒’其中該飲料是使用雙重無功能型l〇x_無功能型 MMT大麥或其部分製備。因此，在本發明之一較佳具體實 :列中’較佳藉由使雙重無功能型L〇x_無功能型mmt大麥 部分或其萃取物醱酵，例如藉由使單獨或與其他成分 _之來自又重無功能型L〇x_無功能型mmt麥芽之麥芽 汁醱酵來製備飲料。 在本發明之一較佳具體實例中，上述飲料是藉由包含 以下步驟之方法製備： (0提供大麥植物或其部分，其中該大麥植物包含： (a)引起功能性l〇X_1完全喪失之第一突變；及 (b )引起功能性LOXj完全喪失之第二突變；及 (c )引起功能性MMT完全喪失之第三突變； (")視情況將該大麥之至少一部分孵麥芽，由此獲得 經孵麥芽之大麥； ("Ο將該大麥及/或經孵麥芽之大麥及視情況選用之其 他佐劑製醪，由此獲得麥芽汁； (iv )視情況在其他成分存在下加熱該麥芽汁，其中蒸 發麥芽汁體積之至多4% ,由此獲得經加熱之麥芽汁； (v )將該經加熱之麥芽汁加工成飲料。 然而，在其他具體實例中，本發明係關於由雙重無功 能型LOX-無功能型MMT大麥製備的任何基於大麥之飲 51 201208586 料、。因而，本發明亦係關於使用習知方法（諸如習知釀造 方法）由雙重無功能型L0X_無功能型ΜΜτ大麥製備的基 於大麥之飲料。 在本發月之某些具體貫例中，飲料為非醱酵飲料，例 如麥芽汁’較佳為由雙重無功能型L〇x-無功能型Μ·麥 芽製備的麥芽汁。 本發明範圍内亦包含該飲料可由未經解麥芽之大麥植 物’較佳未經时芽之雙重無功能型l〇x_無功㈣題丁 大麥植物或其部分製備，例如藉由大麥釀造。 飲料可為無酒精飲料’諸如無酒精啤酒或其他種類之 無酒精飲料’諸如無酒精麥芽飲料，諸如瑪_提那。 然而，該飲料較佳由雙重無功能型如力能型刪丁 大麥籽粒製備之麥芽組成物製備。該飲料更佳為啤酒。此 飲可為熟習此項技術者已知的任何種類之啤酒。在一具 體實例中’啤酒為例如陳啤酒。啤酒較佳使用包含已萌芽 之雙重無功能型L0X_無功能型膽大麥之麥芽組成物釀 以亥Μ更佳使用僅由已萌芽之雙重無功能型l〇x·無功 月里MMT大麥製備之麥芽組成物釀造。然而，麥芽組成物 亦可包含其他組分’例如其他已萌芽或未萌芽之穀類，諸 如野生型大麥、雙重無功能型LOX-無功能型MMT大麥、 i麥及/或黑麥’或未萌芽之含糖原料，或來源於經孵麥芽 或未、孵麥芽之原料的組成物’包括糖漿組成物。然而， 較佳的疋’用於製備該啤酒之所有大麥（諸如所有經解麥 芽及7或未經孵麥芽之大麥及/或已萌芽及/或未萌芽之大麥） 52 201208586 較佳為雙重無功能型LOX-無功能型Mmt大麥。 因而，本發明亦係關於製造飲料之方法^該 以下步驟： 农巴含 〇)提供包含已萌芽之雙重無功能 鑛籽粒的麥芽組成物； L〇X_無功能型 (i i )將s亥麥芽組成物加工成飲料。 在一較佳具體實例中，本發明之飲料為由窯烘麥 佳如上文之章#「孵麥芽」中所述而製備）製備之麥 製造的啤酒，更佳藉由將該寞烘麥芽製醪（較佳如上文^ 章節「製醪」中所述)，其中該製醪亦可視情況含有噴牀： 驟。此外，該麥芽汁較佳經加熱，較佳如上文之章節「\ 熱麥芽汁」中所述，但在本發明之某些具體實例中，「麥^ 汁可以習知方式藉由煮沸進行加熱。如此製造之啤酒在本 文中亦可稱為「經孵麥芽」。然而，本發明之飲料亦可為由 大麥麥芽汁製備的啤酒》該啤酒亦稱為「大麥啤酒。 一般而言，酒精飲料（諸如啤酒）可由經孵麥^及/或 未經孵麥芽之大麥縠粒製造。除啤酒花及酵母以外，麥芽 亦有助於啤酒之風味及色彩。此外，#芽充t可醱酵糖及 酶之來源。一般啤酒生產製程之示意性代表圖展示於圖9 中，而適合孵麥芽及釀造方法之實例的詳細描述可見於例 如Briggs等人（1981)及Hough等人（1982)之公開案中。可獲 得許多用於分析大麥、麥芽及啤酒產品的定期更新之方 法，例如（但不限於）美國縠類化學家協會（American Association of Cereal Chemists) ( 1995 )、美國酿造化學家 53 201208586 學會（American Society of Brewing Chemists) ( 1992 )、歐 洲酿造協會（European Brewery Convention) ( l998 )及酿 造研究所（Institute of Brewing) ( 1997 )。已認識到指定釀 造廠採用許多特定程序，其中最顯著之變化與局部消費者 之偏好有關。生產啤酒之任何此類方法均可用於本發明。 由麥芽汁生產啤酒之第一個步驟較佳包括如上文所述 加熱該麥芽汁，接著為隨後之麥芽汁冷卻階段及視情況進 行之渦流浴靜置。冷卻後，將麥芽汁轉移至含有酵母之酿 酵罐中◎該酵母較佳為釀造酵母卡爾斯伯酵母 (Saccharomyces carlsbergensis )。麥穿汁將醱酵持續任何適 合時段，一般在1天至100天範圍内。在數天長之醱酵過 程中’糖被轉化成酒精及C〇2 ’伴隨產生一些風味物質。 隨後，啤酒可進行進一步處理，例如冷藏。亦可過濾 及/或貯藏（該過程將產生令人愉悦之香味及較少酵母樣風 味）。亦可添加添加劑。此外，可添加C〇2。最後，哮酒可 進行巴氏滅菌及/或過濾’接著將其封裝（例如瓶裝或罐 裝）。在一較佳具體貫例中’本發明飲料中所包含之潛在T2N 為以相同方式自野生型大麥、較佳自栽培品種p〇wer或栽 培品種Quench或栽培品種R0Salina製備之飲料中所包含之 潛在T2N的70%以下’較佳60%以下，更佳50%以下。若 將原始举取物（飲料係基於此原始萃取物）之。p調節至在 10°P至12°P範圍内，更佳調節至n〇p，則本發明之飲料包 含至多2 ppb潛在T2N亦較佳，更佳包含至多1 5 ppb潛在 T2N。 54 201208586 在一較佳具體實例中，本發明飲料中所包含之丁2N前 驅物為以相同方式自野生型大麥、較佳自栽培品種p〇wer 或栽培品種Quench或栽培品種R0salina製備之飲料中所包 含之T2N前驅物的70%以下，較佳6〇。/〇以下，更佳5〇%以 下。若將原始萃取物（飲料係基於此原始萃取物）之。p調 節至在10〇p至12°p範圍内，更佳調節至u〇p，則本發明 之飲料包含至多2 ppb T2N前驅物亦較佳，更佳包含至多 1 - 5 ppb T2N 前驅物。 該飲料（較佳為啤酒）亦較佳包含至多6〇 ppb dms 更佳50Ppb以下，甚至更佳4〇ppb以下，更佳3〇ppb以下 甚至更佳20 ppb以下，更佳1 〇 ppb以下DMS。 在本發明之一特定具體實例中，飲料為大麥啤酒，其 所包含之潛在T2N為以相同方式自野生型大麥、較佳自栽 培品種Power或Quench製備之大麥啤酒中所包含之潛在 T2N的60%以下，較佳5〇%以下。 -在本發明之另一特定具體實例中，飲料（較佳為啤酒） 由經加熱之麥芽汁製備，其僅經熱處理較短時間，諸如在 95°C至99.8。(：範圍内或95。(：至99。(：範圍内之溫度下，持續 1〇分鐘至30分鐘範圍内之日夺間。該經加熱之麥芽汁較佳已 如上文之章節「加熱麥芽汁」中所述進行加熱。在飲料（較 佳為口皁酒）是由該經加熱之麥芽汁製備的本發明具體實例 中’則該飲料（較佳為啤酒）所包含之潛在T2n為以相同 方式自野生型大麥、較佳自栽培品種ρ〇赠或栽培品種 Quench或栽培品種R〇saUna製備之啤酒中所包含之潛在 55 201208586 T2N的60%以下，較佳50%以下，更佳45%以下。在此具 體貫例中’該飲料（較佳為啤酒）所包含之T2N前驅物為 以相同方式自野生型大麥、較佳自栽培品種p〇wer或栽培 品種Quench或栽培品種R0Saiina製備之飲料（較佳為啤酒） 中所包含之T2N前驅物的60%以下亦較佳，較佳5〇%以下’ 更佳4 5 %以下。在此具體實例中，本發明之啤酒包含至多2 ppb潛在T2N亦較佳，更佳至多1·5 ppb潛在T2N。在此具 體實例中，若將原始萃取物（飲料係基於此原始萃取物） 之。P調節至101至12〇P範圍内，更佳調節至u〇p,則本 發明之啤酒包含至多2 ppb T2N前驅物更佳，更佳包含至多 1.5 ppb T2N前驅物。該飲料（較佳為啤酒）亦較佳包含至 多60PpbDMS，更佳5〇ppb以下，甚至更佳4〇一以下， 更佳30PPb以下，甚至更佳2〇ppb以下，更佳i〇ppb以下 DMS。 「感官品質（〇rganoleptic qualities)」意謂利用人類嗅 覺及味覺所感測到之品質。該等品質由例如專家啤酒品嘗 小組來分析。該小組較佳在品嘗及描述啤酒風味方面受過 培訓’其中特別關注醛、紙味、陳味、酯、高級醇、脂肪 酸及硫組分。 一般而言，品嘗小組將由3至3〇名範圍内之成員組 成’例如在5至15名成員範圍内，較佳在8至12名成員 範圍内。品嘗小組可評估各種風味之存在，諸如紙味、氧 化風味、陳味及不新鮮之異味物質以及酯、高級醇、硫組 分及啤酒主體之風味。就本發明而言，較佳特別減少紙味 56 201208586 及/或陳味異味物質， H 而與使用相同方法自野生型大麥製備 之飲料相比，較佳可增加諸如芳族、醋類、醇類/溶劑、花 香及/或牟㉝化之風味物f。確定飲料之「感官品質」的一 種方法七田述於國際專利申請案鹰別87州之實施例6 中確疋飲料之「感官品質」的另一方法描述於國際專利 申《月案PCT/DK2009/050355之實施例8及實施例9中。另 一實例描述於下文之實施例”。在較佳具體實例中，穩 定感官品質可至少部分歸因於T2N或潛在t2n含量低。芳 族、醋類、醇類/溶劑、花香及/或啤酒花味道較佳可如國際 =利申請案PCT/DK2()()9/()5()315之實施例7中所述進行端 疋。在-較佳具體實例中，本發明之飲料具有芳族、醋類、 醇類/溶劑、花香及/或啤酒花味道之評分，如國際專利申請 案PCT/DK2009/0503 15之第4!頁L15至第44頁j 9所述月。 本發明飲料之特徵較佳在於在3〇〇c至4〇<t範圍内之溫 度（諸如約37。(：）下儲存至少i週後，與以相同方式自野 生型大麥植物（較佳為栽培品種Quench或栽培品種 Rosalina)製備之類似飲料相比具有較少紙味。該紙味=佳 為90%以下，更佳80。/。以下，諸如7〇%以下，如受過=訓 之品嘗小組所評估。 。° 本發明之飲料在高溫下儲存後與自野生型大麥製備 類似飲料相比具有減少之紙味亦較佳。當受過培訓之專尸 品嘗小組（如上文所述）確定「紙味」性質且以〇至 里表（其中〇為不存在’而5為極限值）進行呼八時 發明之飲料較佳具有以下紙味評分之一，或較佳兩 本 57 201208586 (Ο在37°c下培育一週後，與以相同方式自野生型大 麥、較佳自栽培品種Quench或栽培品種R〇saUna製備之飲 料的紙味評分相比，紙味評分低至少〇 5，較佳低至少〇 7 ; (u)在37°C下培育兩週後，與以相同方式自野生型大 麥、較佳自栽培品種p0wer或栽培品種R〇saUina製備之飲 料的紙味評分相比，紙味評分低至少〇 5，較佳低至少， 更佳低至少0 · 8、至少1 » 令人感興趣的是，本發明揭示根據本發明製造之飲料 的總體風味評分與自野生型大麥製備之飲料相比得到改 良。此結果可部分歸因於發現DMS可能遮蔽某些合乎需要 之味道》 因此，當在不煮沸相應麥芽汁下（較佳使用加壓加熱） 製備本發明之飲料時，該飲料之總體風味評分較佳比以相 同方式自野生型大麥、較佳自栽培品種Quench或栽培品種 Rosalina製備之飲料的風味評分高至少丨，較佳高至少i $， 更佳高至少2。該風’評分應在丨至9之量表上進行評分， 其中9代表專家啤酒品嘗小組所給出之最佳評分。 當飲料即使在儲存後亦包含極低含量之自由T2N時， 稱該飲料具有「穩定感官品質」。因此，本發明之一目標在 於提供使用雙重無功能型L0X_無功能型MMT大麥植物製 造的飲料（諸如具有穩定感官品質之啤酒）。 因此，在於30C至40°C範圍内之溫度下，較佳在37。〇 下儲存至少1週、較佳至少2週、更佳至少3週、甚至更 佳至少4週後，本發明飲料中所包含之自由T2N較佳為以 58 201208586 相同方式自野生型大麥、較佳自栽培品種Quench或栽培品 種Rosalina製備之飲料中所包含之自由T2N的80%以下， 較佳70%以下’更佳65%以下，甚至更佳6〇%以下，甚至 更佳5 5%以下。本發明之飲料在37。〇下儲存2週後包含 0.025 ppb以下之自由T2N亦較佳。 在本發明之另一特定具體實例中，飲料（較佳為啤酒） 由經加熱之麥芽汁製備，該經加熱之麥芽汁僅熱處理較短 時間，諸如在95°C至99°C範圍内之溫度下持續1〇分鐘至 3 0分鐘範圍内之時間。該經加熱之麥芽汁較佳已如上文之 章節「加熱麥芽汁」中所述進行加熱。在飲料（較佳為啤 酒）是由該經加熱之麥芽汁製備的本發明具體實例中，則 在於30 C至40°C範圍内之溫度下，較佳在37。〇下儲存至少 1週、較佳至少2週、更佳至少3週、甚至更佳至少4週後， 該飲料（較佳為啤酒）中所包含之自由T2N為以相同方式 自野生型大麥、較佳自栽培品種Quench或栽培品種 Rosalina製備之飲料中所包含之自由T2N的8〇%以下，較 佳70%以下，更佳65%以下。 詳言之，在於30。(：至40°C範圍内之溫度下，較佳在37〇c 下，在不超過ioPpm之亞硫酸鹽含量、較佳11)13111至l〇ppm 範圍内之亞硫酸鹽含量、更佳！卯爪至8 ppm範圍内、更 佳2 ppm至6 ppm範圍内、更佳3卯爪至6 ppm範圍内之 亞硫酸鹽含量存在下儲存2週後，由該經加熱之麥芽汁製 備之該等飲肖（較佳為啤酒）較佳包含極低含量之t2n , 較佳其所包含之自自Τ2Ν為以相同方式自野生型大麥、較 59 201208586 佳自栽培品種Quench或栽培品種Rosanna製備之飲料中所 包含之自由T2N的80%以下，較佳70%以下，更佳65%以 在3 7 C下儲存8週後’本發明飲料（諸如哮酒，例如 大麥啤酒）包含極低含量之T2N亦較佳，較佳其所包含之 自由T2N為以相同方式自野生型大麥、較佳自栽培品種 Quench或栽培品種Rosanna製備之飲料中所包含之自由 T2N的80%以下，較佳70%以下，更佳6〇%以下，甚至更 佳5%以下。 在一具體實例中’本發明係關於具有低含量之某些三 羥基十八碳烯酸（亦表示為THA )的飲料（諸如啤酒），特 定言之係關於具有低含量之9，12，13_THA及91〇13_tha的 飲料。THA之特徵在於苦味（Baur及Gr〇sch，丨977 ; 4人，1 9 7 7 )，使得該等化合物在飲料中不合需要。 因而需要9，12，13-THA及9，10，13-THA之含量儘可能 低，例如低於1.3 Ppm，諸如低於i pp心因此，91213 tha 之含里較佳儘可能低，例如低於i 3 ppm，諸如低於i卯爪。 9，10，13-THA之含量儘可能低亦較佳，例如低於i 3 ， 諸如低於lPpm。然而，來源於麥芽之飲料（諸如啤酒）中 9，12，13-THA及9，10，13-THA之總體濃度亦視製備該特定飲 料所使用之麥芽的量而定。因而，一般而$，高濃度啤酒 (Strong beer)與較輕淡啤酒相比將包含更多 及9，1〇，13-ΤΗΑ，使得較高總體含量之9，1213 tha及 9，1〇，13.ΤΗΑ在較高濃度啤酒+可接受。因此，與以相同方 60 201208586 式自野生型大麥、較佳自栽培品種Power或栽培品種 Quench或栽培品種R〇saHna製備之飲料相比，本發明之飲 料較佳包含較低含量之9，12，13-THA及9，10，13-THA。詳言 之，本發明飲料之9，12，13_THA含量較佳為以相同方式自野 生型大麥、較佳自栽培品種Power或栽培品種R0salina製 備之飲料中之含量的至多50%，較佳至多40%，更佳至多 3 0% »更佳本發明飲料之9，1〇，13_THa含量為以相同方式自 野生型大麥、較佳自栽培品種P〇wer或栽培品種Quench或 栽培品種R0salina製備之飲料中之含量的至多7〇0/。，較佳 至多60% ’諸如至多50%，例如至多4〇%。該等飲料可使 用雙重無功能型LOX-無功能型MMT大麥製備。 在本發明之一具體實例中，由雙重無功能型L〇X-無功 能型MMT大麥製備之飲料具有改良之泡沫品質。當飲料為 啤酒時’此品質尤其有意義。因此，本發明之一目標在於 提供具有優良泡沫品質之飲料，諸如啤酒。與以相同方式 自野生型大麥、較佳自栽培品種Quench製備之飲料相比， 較佳本發明之飲料在6 0分鐘至8 0分鐘内，較佳在8 〇分鐘 内產生多至少1.5倍泡泳，較佳多至少2倍，更佳多至少3 倍泡沫。如下文之實施例8中所述測定該泡沫產生。 植物產品 本發明之一目標在於提供植物產品，較佳為以低含量 之一或多種異味物質為特徵的大麥植物產品》詳言之，本 發明之一目標在於提供植物產品，較佳為具有低含量之 61 201208586 T2N、DMS及其相應前驅物的大麥植物產品。如本發明所 述，該等植物產品宜由雙重無功能型1〇χ_無功能型MMT 大麥製備。s亥植物產品可為麥芽，較佳為上文之章節「孵 麥芽」中所述之任何麥芽。該產品可為麥芽汁，較佳為上 文之章節「麥芽汁」中所述的任何麥芽汁；其亦可為飲料， 較佳為上文之章節「飲料」中所述的任何飲料。然而，植 物產品亦可為以低含量之T2N、潛在T2N、DMS及DMSp 為特徵的由雙重無功能型L0X_無功能型MMT大麥植物或 其部分製備的其他植物產品。 因而，本發明係關於植物產品，其可為包含下文所述 之大麥植物或其部分的組成物，或由該等大麥植物或其部 分製備的組成物，諸如由該等大麥植物或其部分製備的植 物產品。因為該等大麥植物缺乏LOU、L〇X 2及mmt活 性，因此該等組成物一般包含極低含量之異味物質及其前 驅物分子，且特定言之包含極低含量之Τ2Ν、潛在Τ2Ν、 DIMS及DMSP。本文摇述包含具有引起功能性[οχ」完全 喪失之第一突變、引起功能性L〇x_2完全喪失之第二突變 及引起功旎性MMT完全喪失之第三突變的大麥植物之適用 植物產品或由該等大麥植物製備之適用植物產品之實例。 該等植物產品較佳包含以下性質中之一或多者，較佳 包έ以下I1生質中之至少兩者，甚至更佳包含所有以下性質： (1 )自由Τ2Ν為以相同方式自野生型大麥植物、較佳 自栽培種Power或栽培品種Quench或栽培品種R〇saiina 製備之類似植物產品中所包含之自由丁則6〇%以下，甚 62 201208586 至更佳50%以下，更佳40%以下，諸如30%以下，較佳2〇% 以下，更佳10 %以下； (ii )潛在T2N為以相同方式自野生型大麥植物、較佳 自栽培品種Power或栽培品種Quench或栽培品種R〇saHna 製備之類似植物產品中所包含之潛在T2n的60%以下，甚 至更佳50%以下，更佳40。/。以下，諸如30%以下，較佳25% 以下； (ill ) DMS為以相同方式自野生型大麥植物、較佳自栽 培品種Power或栽培品種Quencll或栽培品種R〇saUna製備 之類似植物產品中所包含之DMS的30%以下，較佳20%以 下’更佳15%以下，甚至更佳10%以下； (iv ) SMM為以相同方式自野生型大麥植物、較佳自栽 培品種Power或栽培品種Quench或栽培品種R〇salina製備 之類似植物產品中所包含之SMM的30%以下，較佳20%以 下’更佳15°/。以下’甚至更佳1〇%以下，諸如5%以下，例 如2 %以下； (v ) DMSP為以相同方式自野生型大麥植物、較佳自栽 培品種Power或栽培品種Quench或栽培品種R0saiina製備 之類似植物產品中所包含之DMSP的30%以下，較佳2〇% 以下’更佳15。/。以下，甚至更佳1〇%以下。 在一態樣中’本發明係關於具有引起功能性LOX—i完 全喪失之第一突變、引起功能性LOX-2完全喪失之第二突 變及引起功能性MMT完全喪失之第三突變的大麥籽粒。本 發明亦係關於包含該等籽粒之組成物及由該等籽粒製備之 63 201208586 組成物以及由該等籽粒製備之植物產品。 在另一態樣中’本發明係關於植物產品，其可為包含 雙重無功能型LOX-無功能型MMT大麥植物或其部分的食 物組成物、飼料組成物及芳香原料組成物。食物組成物可 為例如（但不限於）經孵麥芽及未經孵麥芽之大麥籽粒、 經研磨之大麥、大麥粕、麵包、粥、包含大麥之縠類混合 物、保健品（諸如包含大麥之飲料）、大麥糖漿及薄片狀、 經研磨、經微粉化或經擠壓之大麥組成物。飼料組成物包 括例如包含大麥籽粒及/或大麥粕之組成物。飼料組成物可 為例如麥芽漿。芳香原料組成物描述於下文中。 本發明亦係關於各種本發明植物產品之混合物。例 如’在一態樣中，本發明係關於由以下各物之混合物製備 的組成物： (1 )包含含有引起功能性LOX-1完全喪失之第一突變、 引起功能性LOX-2完全喪失之第二突變及引起功能性mmt 完全喪失之第三突變的大麥植物或其部分的組成物；及 (11 )由雙重無功能型LOX-無功能型MMT籽粒製備的 麥穿組成物。 可利用各種方法確定大麥植物或植物產品是否由在 LOX-1、LOX-2及MMT基因中攜帶分別導致功能性LOX-1 完全喪失、功能性LOX-2完全喪失及功能性MMT完全喪 失之突變的大麥植物製備。植物產品一般將包含至少一些 來自用於製造該等植物產品之植物的基因體DNA。因而， 麥芽將含有大量基因體DNA，但即使大麥或麥芽萃取物（諸 64 201208586 ' 如麥芽汁）亦可能包含來自該大麥或麥芽之基因體DNA或 其片段。基於大麥之飲料（諸如啤酒）亦可包含來自該植 物之基因體DNA或其片段。藉由分析植物產品中之DNA， 可確定用於製備植物產品之植物是否在LOX-1、LOX-2及 MMT基因中攜帶導致功能性LOX-1完全喪失、功能性 LOX-2完全喪失及功能性MMT完全喪失的突變。該等突變 可為例如下文之章節「功能性LOX喪失」中所述之LOX-1 及LOX-2基因中之任何突變。MM.T基因中之該突變可為例 如上文之章節「功能性MMT喪失」中所述之MMT基因中 之任何突變。可藉由任何適用方法分析基因體DNA，諸如 定序或基於擴增之方法，包括基於PCR之方法。若假定 LOX-1基因及/或LOX-2基因及/或MMT基因中存在特定突 變，則可採用多形現象分析，例如SNP分析。關於確定LOX-1 基因及/或LOX-2基因中之突變，適用SNP分析之一非限制 性實例描述於國際專利申請案PCT/DK2009/050355之實施 例10中。關於確定MMT基因中之突變，適用SNP分析之 一非限制性實例描述於國際專利申請案 PCT/DK2009/05 03 15之實施例13及實施例17中。熟習此 項技術者將能夠改適此等實施例中所述之特定SNP分析以 用於其他突變或其他起適物質。 若上述植物產品僅由雙重無功能型LOX-無功能型 MMT大麥植物製備，則大麥LOX-1 mRNA、LOX-2 mRNA 及MMT mRNA及/或大麥LOX-1蛋白、LOX-2蛋白及MMT 蛋白之存在及不存在亦可指示該植物產品是否由雙重無功 65 201208586 能型LOX_&功能型MMT大麥植物製備。亦可藉由西方墨 點分析（western blot analysis )或其他蛋白質分析，或藉由 RT-PCR或北方墨點分析（Northern blot analysis)或其他 mRN A分析法來檢驗植物產品。當植物產品為麥芽時，該等 分析尤其適用。 大麥植物 本發明係關於基於穀類之飲料。縠類可選自例如由大 麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、稻縠、高粱、小米、黑小 麥、蕎麥、福尼奥米（foni〇)及藜麥（quin〇na)所組成之 群組。穀類更佳選自由大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米及 稻榖所組成之群組，榖類更佳為大麥。 因而，本發明較佳係關於基於大麥之飲料及適用於製 備本發明飲料之大麥植物。 大麥為植物的一個科。「野生大麥」，亦即二棱大麥 (Hordeum vulgare ssp. spontaneum)，被認為是大麥之現代 栽培形式的祖先。認為大麥自野生狀態轉化成栽培狀態與 許多基因座處對偶基因頻率之澈底改變相符。快速確定馴 化植物群體（稱為「地方大麥品種」）t之新性狀的農民積 極地選擇稀有對偶基因及新突變事件。與野生大麥相比， 此等植物在遺傳上與現代載培品種更密切相關。直至十九 世紀晚期，地方大麥品種 <乃α近親系與雜種分離之高度混 雜混合物形式存在，包括數種來源於較早世代之無規雜交 的植物。大部分地方品種在先進農業中已被純品系載培品 66 201208586 .種替代。中等至或較高程度之遺傳多樣性形成其餘地方品 種之特徵。最初，「現代大麥（m〇dernbarley)」載培品種代 表自地方品種中選擇。後來該等品種由確定之純品系（諸 如具有不同地理起源之純品系）之間的逐輪循環雜交獲 得1最終’結果為許多（可能所有）先進農業之遺傳基礎 顯著縮窄。相較於地方品種，現代大麥載培品種具有許多 改良之性質（Nev〇, 1992 ; von Bothmer 等人，1992 )，例如 (但不限於）—或多種以下性質：（i )被覆籽粒及裸籽粒；（Π ) 種子休目民’（丨丨丨）抗病性；（iv )環境耐受性（例如對乾旱或 土壤pH值之耐受性）；（v )離胺酸及其他胺基酸之量；（vi ) 蛋白質含量；（vii)氮含量；（νΠυ碳水化合物組成；（ix) 大麥醇溶蛋白（hordein)含量及組成；p葡 聚糖及阿拉伯木聚糖含量；（xi )產量；（xii )秸稈硬度；及 (xiii)株高。 在本發明中’術語「大麥植物」包含任何大麥植物， 諸如地方大麥品種或現代大麥載培品種。因而，本發明係 關於包含引起功能性LOX-1完全喪失之第一突變及引起功 此性LOX-2完全喪失之第二突變及引起功能性MMT完全 喪失之第三突變的任何大麥植物。該種大麥植物之一實例 描述於下文之實施例中’且稱為「三重無功能」或「三重 無功能型大麥」。 然而，用於本發明之較佳大麥植物為現代大麥載培品 種或純品系。用於本發明之大麥栽培品質可選自例如由
Sebastian、Quench、Celeste、Lux、prestige、Saloon、Neruda、 67 201208586
Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、 Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Maresi、Steffi、 Gimpe 卜 Cheri、Krona、Camargue、Chariot、Derkado、Prisma、 Union、Beka、Kym、Asahi 5、KOU A'Swan Hals'Kanto Nakate Gold、Hakata 2 號、Kirin-choku 1 號、Kanto 晚熟變種 Gold、 Fuji Nijo、New Golden、Satukio Nijo、Seijo 17 號、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、Nishino Gold、Misato golden、Haruna Nijo、Scarlett、Rosalina 及 Jersey 戶斤組成 之群組，較佳選自由 Haruna Nijo、Sebastian、Quench、 Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda 及 Power 所組成 之群組，較佳選自由 Harrington、Klages、Manley'Schooner、 Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Arie卜 Lenka、 Maresi、Steffi、Gimpel、Cheri、Krona、Camargue、Chariot、 Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi 5、KOU A、 Swan Hals、Kanto Nakate Gold、Hakata 2 號、Kirin-choku 1、 Kanto 晚熟變種 Gold、Fuji Nijo、New Golden、Satukio Nijo、 Seijo 17 號、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、 Nishino Gold、Misato golden、Haruna Nijo、Scarlett 及 Jersey 所組成之群組，較佳選自由 Haruna Nijo、Sebastian、 Tangent、Lux、Prestige、Saloon ' Neruda、Power、Quench、 NFC Tipple、Barke、Class 及 Vintage 所組成之群組。 在本發明之一具體實例中，大麥植物因此為包含引起 功能性LOX-1完全喪失之第一突變及引起功能性LOX-2活 性完全喪失之第二突變及引起功能性MMT完全喪失之第三 68 201208586 文所列大麥載培 因而大麥植物較 突變的現代大麥載培品種（較佳為選自上 ⑽種之群的載培品# )。纟此具體實例中， 佳不為地方大麥品種。 夕植物可呈任何適合形式。例如，本發明之大麥植 可為活大麥植物、經乾燥之植物、均質化之植物或經研 :,大夕籽粒。植物可為成熟植物、胚、已萌芽之轩粒、 :孵麥牙之籽粒、經研磨之經孵麥芽籽粒、經研磨立 或其類似物。 大麥植物之部分可為該植物之任何適合部分，諸如軒 粒、胚、葉、莖、根、花或其部分。部分可為例如籽粒、 胚、葉、莖、根或花之切片。大麥植物之部分亦可為組織 勻漿之部分或經研磨大麥植物或籽粒之部分。 在本發明之一具體實例中，大麥植物之部分可為該大 麥植物之細胞，諸如可在組織培養物中試管内繁殖的活細 胞。然而在其他具體實例中，大麥植物之部分可為不能成 熟形成整株大麥植物的活細胞，亦即不為可繁殖材料之細 胞0 功能性LOX喪失 本發明係關於具有第一突變、第二突變及第三突變之 大麥植物或其部分或其植物產品，其中該第—突變導致功 能性LOX-1完全喪失，且該第二突變導致功能性L〇X-2完 全喪失。第三突變導致功能性MMT完全喪失，如下 广又之章 節「功能MMT喪失」中更詳細描述。 69 201208586 功能性LOX-1完全喪失及功能性LOX-2完全喪失可獨 立地基於不同機制。例如，LOX-1及LOX-2活性之一或兩 者之功能完全喪失可能由大麥植物中之功能障礙蛋白質所 致，亦即功能障礙LOX-1及/或LOX-2蛋白，諸如不具有可 偵測之9-HPODE形成活性的突變型 LOX-1蛋白（其中 9-HPODE較佳可如國際專利申請案PCT/DK2009/050355之 實施例4中所述進行測定）及/或不具有可偵測之13-HPODE 形成活性的突變型LOX-2蛋白（其中13-HPODE較佳可如 國際專利申請案PCT/DK2009/050355之實施例4中所述進 行測定）。 功能性LOX-1及/或LOX-2完全喪失可能由缺乏LOX-1 及/或LOX-2蛋白所致。顯然，缺乏LOX-1蛋白將導致功能 性LOX-1喪失，而缺乏LOX-2蛋白將導致功能性LOX-2 完全喪失。因而，大麥植物較佳可不包含或僅包含極少 LOX-1及/或LOX-2蛋白，更佳不包含可偵測之LOX-1及/ 或LOX-2蛋白。LOX-1及/或LOX-2蛋白可藉由熟習此項 技術者已知的任何適合方法進行偵測。然而，較佳藉由用 特異性LOX-1及LOX-2抗體（諸如針對LOX-1及LOX-2 之多株抗體）偵測LOX-1蛋白的技術來偵測該（等）蛋白 質。該等技術可為例如西方墨點法或ELISA。該等抗體可 為單株抗體或多株抗體。然而，該等抗體較佳具有多株性 質，分別識別LOX-1及LOX-2蛋白内的若干不同抗原決定 基。亦可間接偵測LOX-1及/或LOX-2蛋白，例如藉由測定 LOX-1活性之方法或藉由測定LOX-2活性之方法。在本發 70 201208586 . 明之一較佳具體貫例中’使用國際專利申請案W〇 2005/087934之實施例4中所述之方法偵測[οχ」蛋白。可 以類似方式使用與大麥LOX-2結合之抗體偵測L.〇x_2蛋 白。 LOX-1及LOX-2活性之一或兩者之功能完全喪失亦可 歸因於不存在或存在極少LOX-丨轉錄物及/或l〇x_2轉錄 物’較佳為LOX-1轉錄物及/或LOX-2轉錄物不表現。熟習 此項技術者應承認，不存在LOX-1及/或L〇x_2轉錄物亦將 分別造成不存在轉譯之LOX-1及/或L0X_2蛋白。或者，功 能性LOX-1及功能性L0X_2完全喪失亦可歸因於表現異常 LOX-1轉錄物及/或異常L0X·2轉錄物。異常及/或 LOX-2轉錄物可由例如剪接位點中之突變所致的轉錄物異 常剪接所引起。因而，本發明之大麥植物可在某一剪接位 點中攜帶突變，諸如5·剪接位點或3,剪接位點，例如在内 含子之一或兩個最5,核苷酸令，或在内含子之最3,核芽酸 之一中。具有LOX- 1轉錄物異常剪接之突變體之一實例在 WO 2005/08 7934中描述為突變體Α618β例如可藉由北方墨 點法或RT-PCR實驗偵測編碼[οχ」或L〇x_2之轉錄物之 表現。 突變造成本發明大麥植物之功能性LOX-1及L〇x_2酶 完全喪失。因而，本發明之大麥植物-般在LQX]基因中 攜帶突變:該突變亦可處於調控區令，例如在啟動子或内 含子内’或该突變可處於編喝區中。突變亦可為LOX-i基 因或其部分之缺失，諸如整個編碼區缺失。類似地，本發 71 201208586 明之大麥植物一般在LOX-2基因中攜帶突變。該突變亦可 處於調控區中，例如在啟動子或内含子内，或該突變可處 於編碼區中。突變亦可為LOX-2基因或其部分之缺失，諸 如整個編碼區缺失。因而，亦可藉由鑑別編碼LOX-1之基 因或編碼LOX-2之基因中的突變來偵測功能性LOX-1及/ 或LOX-2酶完全喪失之原因。可藉由例如對編碼LOX-1及 LOX-2之基因進行定序來偵測該等基因中的突變。較佳在 鑑別突變後藉由測試LOX-1及/或LOX-2活性來證實功能完 全喪失。 術語「LOX-1蛋白（LOX-1 protein)」意欲涵蓋如WO 2005/087934 之 SEQ ID N0:3 或 W0 2005/087934 之 SEQ ID N0:7中所述之大麥全長L0X-1蛋白或其功能同源物。 L0X-1之活性位點位於該酶之C端部分。詳言之，預期涵 蓋胺基酸殘基520至862之區域或其部分（較佳為第520 至862號胺基酸之整個區域）與LOX-1活性相關。因此， 在一具體實例中，無功能型L0X-1大麥較佳包含編碼 L0X-1之突變形式的基因，該突變形式缺乏L0X-1胺基酸 5 20至862中之一些或全部。該突變型LOX-1亦可能缺乏 野生型LOX-1中所存在之其他胺基酸殘基。 因此，本發明之雙重無功能型L0X大麥可包含不具功 能性之L0X-1截短形式，諸如N端截短形式或C端截短形 式。該截短形式較佳包含不超過800個，更佳不超過750 個，甚至更佳不超過700個，更佳不超過690個，甚至更 佳不超過680個，更佳不超過670個L0X-1之連續胺基酸， 72 201208586 諸如不超過665個，例如不超過65〇個，諸如不超過6〇〇 個，例如不超過550個，諸如不超過5〇〇個，例如不超過 450個，諸如不超過425個，例如不超過399個w〇 2005/087934之SEQ ID NO:3之LOX-1之連續胺基酸。該 截短形式較佳僅包含LOX-1之N端片段，較佳至多8〇〇個， 更佳至多750個，甚至更佳至多7〇〇個，更佳至多69〇個， 甚至更佳至多680個，更佳至多670個，甚至更佳至多665 個WO 2005/087934之SEQ ID N〇:3之N端胺基酸諸如不 超過665個，例如不超過65〇個，諸如不超過6〇〇個，例 如至多550個，諸如至多5〇〇個，例如至多45〇個，諸如 至多425個，例如至多399個w〇 2〇〇5/〇87934之seq⑴ NO:3之N端胺基酸。除[οχ。片段以外’該截短形式亦可 視情況包含野生型LOX]中不存在之其他c端序列。此可 能特定言之為由異常剪接產生截短形式之情形。該等其他c 端序列較佳由至多50個、更佳至多3〇個、甚至更佳至多 10個、更佳至多4個或至多1個胺基酸組成。 在極佳具體實例中，截短形式可由w〇 2005/087934 之SEQ ID NO:3之胺基酸1至665組成。 在本發明之一較佳具體實例中，大麥植物包含轉錄成 mRNA之LOX]編碼基因，該mRNA包含在野生型 mRNA之終止密碼子上游的無義密碼子或終止密碼子。該種 無義密碼子在本文中稱為早熟無義密碼子。轉錄成該植物 之瓜跳的所有L〇x_u碼基因較佳均包含早熟無義密碼 子或終止密碼子。無義密碼子或終止密碼子較佳位於起始 73 201208586 密碼子下游至多800個密碼子處，更佳至多750個，甚至 更佳至多700個，更佳至多690個，甚至更佳至多680個， 更佳至多670個，甚至更佳至多665個密碼子處。編碼LOX-1 之野生型基因體DNA之序列提供於WO 2005/087934之 SEQ ID ΝΟ:1 或 WO 2005/087934 之 SEQ ID NO:5 中。 在一較佳具體實例中，本發明之大麥植物包含編碼 LOX-1之基因，其中自該基因轉錄之相應前mRNA包含對 應於 WO 2005/087934 之 SEQ ID NO:2 的序列。 在本發明之一極佳具體實例中，編碼本發明之雙重無 功能型LOX大麥植物之突變型LOX-1的基因包含無義突 變，該突變對應於WO 2005/087934之SEQ ID NO: 1之位置 3574處的G —A取代。 術語「LOX-2蛋白」意欲涵蓋如國際專利申請案 PCT/DK2009/050355之SEQ ID NO:5中所述之大麥全長 LOX-2蛋白或其功能同源物。LOX-2之活性位點位於LOX-2 之C端部分。詳言之，預期涵蓋胺基酸殘基5 1 5至7 17之 區域或其部分與LOX-2活性相關。基於對大豆LOX-1晶體 結構之檢驗，大麥LOX-2酶之活性位點間隙之預期序列區 段由胺基酸殘基515至525及707至717表示。所轉譯之 突變型LOX-2蛋白（亦即大麥雙重無功能型LOX突變體 A6 89之LOX-2之C端截短形式）含有最多684個殘基，且 將因此缺乏活性位點間隙之第二序列區段，由此使其不具 活性。根據本發明之一具體實例，本發明之雙重無功能型 LOX大麥較佳包含編碼LOX-2之突變形式的基因，該突變 74 201208586 形式缺乏LOX-2之胺基酸515至717中之一些或全部，較 佳缺乏胺基酸707至717中之一些或全部，甚至更佳缺乏 胺基酸707至717中之全部。該突變型LOX-2亦可能缺乏 野生型LOX-2 t所存在之其他胺基酸殘基。 因此，雙重無功能型LOX大麥可包含不具功能性之 LOX-2截短形式，諸如N端截短形式或C端截短形式。今 戴短形式較佳包含不超過8 00個、更佳不超過75〇個、甚 至更佳不超過725個、更佳不超過700個、甚至更佳不超 過690個、更佳不超過684個國際專利申請案 PCT/DK2009/050355 之 SEQ ID NO:5 之 LOX-2 之連續胺基 酸。該戴短形式較佳僅包含LOX-2之N端片段。因此，該 截短形式較佳包含至多800個、更佳至多75〇‘個、甚至更 佳至多725個、更佳至多700個、甚至更佳至多69〇個、 更佳至多684個國際專利申請案PCT/DK2〇〇9/〇5〇355之 SEQIDN0..5之N端胺基酸。除L0X_12片段以外，該截短 形式亦可視情況包含野生型L〇x_2中不存在之其他c端序 列:此可能肖定言之為由異常剪接產生截短形式之情形。 該等其他c端序列較佳由至多50個、更佳至多3〇個、甚 至更佳至多1G個、更佳至多4個或至多⑽胺基酸組成。 在一極佳具體實例中，截短形式可由國際專利申請案 PCT/DK2GG9/G5G355 之 SEQ ID NQ:5 之胺基酸 1 至 684 組 成。 在本發明之一較佳具體實 L〇X_2之mRNA的基因，其中該mRNA在野生型l〇x. 75 201208586 mRNA之終止密碼子上游包含無義密碼子或終止密碼子。該 種無義密碼子在本文中稱為早熟無義密碼子。轉錄成編碼 該植物之LOX-2之mRNA的所有基因較佳均包含早熟無義 密碼子或終止密碼子。無義密碼子或終止密碼子較佳位於 起始密碼子下游至多800個密碼子處，更佳至多750個， 甚至更佳至多725個，更佳至多700個，甚至更佳至多690 個，更佳至多684個密碼子處。編碼LOX-2之野生型基因 體DNA之序列提供於國際專利申請案PCT/DK2009/050355 之 SEQ ID ΝΟ:1 中。 在本發明之一極佳具體實例中，編碼雙重無功能型 LOX大麥植物之突變型LOX-2的基因包含無義突變，該突 變對應於國際專利申請案PCT/DK2009/050355之SEQ ID NO:1之位置2689處的G —A取代。 可藉由熟習此項技術者已知的任何適合方法來製備本 發明之大麥植物，較佳藉由下文之章節「製備雙重無功能 型LOX-無功能型MMT大麥」中所述之方法之一。 功能性MMT喪失 本發明係關於具有第一突變、第二突變及第三突變之 大麥植物或其部分或其植物產品，其中該第一突變導致功 能性LOX-1完全喪失，且該第二突變導致功能性LOX-2完 全喪失，該兩者更詳細地描述於上文之章節「功能性LOX 喪失」中。第三突變導致功能性MMT完全喪失。 功能性MMT完全喪失可能基於不同機制。例如，功能 76 201208586 / 性MMT完全喪失可能由該植物中之功能障礙蛋白質所致， 亦即功能障礙ΜΜΤ酶，諸如不具有可偵測之活性的突變型 ΜΜΤ蛋白。舉例而言，突變體之ΜΜΤ蛋白可為截短蛋白 質。ΜΜΤ活性喪失可類似地基於不同機制，例如由功能障 礙ΜΜΤ蛋白所致。 突變型ΜΜΤ蛋白之活性較佳根據其催化甲基自SAM 轉移至Met由此形成SMM的能力來測定。此可例如如國際 專利申請案PCT/DK2009/0503 15之實施例4中所述來進 行。較佳藉由測定相應經分離之大麥cDNA之轉譯序列來 獲得突變型MMT之胺基酸序列。此可基本上如國際專利申 請案PCT/DK2009/05 03 15之實施例8中所述來進行。或者， 藉由如國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15之實施例11及 實施例1 2中所述在細菌細胞培養物中異源表現，接著驗證 重組蛋白質為無活性MMT酶來獲得本發明大麥植物之突變 型 MMT。
功能性MMT完全喪失可藉由缺乏MMT蛋白而實現。 缺乏MMT蛋白將導致MMT功能喪失。因而，大麥植物可 不包含或僅包含極少可偵測之MMT蛋白，較佳不包含可偵 測之MMT蛋白。可藉由熟習此項技術者已知的任何適合方 法來偵測MMT蛋白之存在或不存在。然而，較佳藉由用識 別MMT之特異性抗體偵測MMT蛋白之技術來分析蛋白 質。該等技術可為例如西方墨點法或酶聯免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assay)，且該等特異性抗體 可為單株抗體或多株抗體。然而，該等抗體較佳為識別MMT 77 201208586 蛋白内之若干不同抗原決定基的多株抗體。其亦可藉由例 如用於MMT活性測定之方法間接偵測。因而，在本發明之 一較佳具體實例中，據稱大麥植物在編碼MMT之基因中摘 帶突變，因而導致MMT活性完全喪失，此時在該植物中不 可偵測到MMT蛋白。詳言之，此為在該大麥植物中（較佳 在該大麥植物之籽粒中）不可偵測到具有12〇 kDa±i〇%之 近似質量的MMT蛋白的情形，如藉由西方墨點法所分析。 功旎性MMT完全喪失亦可歸因於不存在或存在極少 MMT mRNA轉錄，較佳歸因於不存在MMT mRNA轉錄。 熟習此項技術者應承認，不存在MMT轉錄物亦將導致不存 在MMT蛋白。 然而，功能性MMT完全喪失較佳歸因於異常MMT轉 錄物之表現。該轉錄物較佳可由例如剪接位點中之突變所 致的初級轉錄物之異常剪接事件所引起。編碼mmt之轉錄 物之表現可藉由例如北方墨點法< RT_pcR #法進行谓測。 本發明大麥植物中之功能性MMT完全喪失是由一或多 個突變所引起。因而，本發明之大麥植物一般在膽基因 中攜帶至少-個突變。1亥（等）突變亦可處於調控區中， Ή在啟動子或内含子内，或該（等）突變可處於蛋白質 編碼區中。突變亦可為ΜΜΤ基因或其部分之缺失，例如 基因之編碼區缺失。因而，功能性ΜΜΤ喪失亦可藉 析.爲馬ΜΜΤ之基因中的突變進行偵測。ΜΜΤ編碼基 之大炎可藉由例如對該基因進行定序，接著將其與野 5序列較佳國際專利申請案pCT/DK2〇〇9/〇5〇315中作 78 201208586 * 為SEQ ID NO:3提供的栽培品種Prestige之野生型序列或 栽培品種 Sebastian之野生型序列（國際專利申請案 PCT/DK2009/0503 15 之 SEQ ID NO:16)相比較來偵測。鑑 別突變後，較佳藉由測試MMT活性來證實功能喪失，例如， 如國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15之實施例2或實施 例4中所述。 術語MMTt蛋白（MMT protein )意欲涵蓋如國際專利 申請案PCT/DK2009/0503 15之SEQ ID NO:6中所述之大麥 全長MMT蛋白或其功能同源物。在此情形中，功能同源物 為與SEQ ID NO:6中所述之大麥MMT蛋白具有相同程度之 MMT活性（±25% )的MMT蛋白，其中該MMT活性如國 際專利申請案PCT/DK2 009/05 03 15之實施例2或實施例4 中所述進行測定。 攜帶導致MMT活性完全喪失之第三突變的大麥植物可 包含MMT之非功能性截短形式，諸如N端截短形式或C 端截短形式。大麥植物可包含MMT之超過一種截短形式， 諸如2種或例如3種，或諸如超過3種不同的MMT之截短 形式，該等截短形式可由異常剪接之轉錄物產生。該等截 短形式僅包含MMT之N端片段。除野生型MMT之N端片 段以外，MMT之該等截短形式亦可包含野生型MMT中未 發現之其他C端序列。該等其他C端序列可為例如轉譯之 内含子序列，諸如因異常剪接而包含於突變型mRNA中之 序列。該等截短MMT形式較佳包含至多500個、更佳至多 450個、甚至更佳至多400個、更佳至多350個、甚至更佳
79 C 201208586 至多320個、更佳至多311個或至多288個國際專利申請案 PCT/DK2 009/0 503 1 5 之 SEQ ID NO:6 之 N 端胺基酸殘基。 此特定言之為該大麥植物完全喪失MMT活性之情形。然 而 ，MMT 亦可包含更少國際專利申請案 PCT/DK2 00 9/0 5 03 15 之 SEQ ID NO:6 之 N 端胺基酸，諸如 不超過300個，例如不超過250個，諸如不超過200個， 例如至多1 50個，例如不超過147個，或不超過1 33個該 序列之N端胺基酸。 在一極佳具體實例中，截短MMT形式可由國際專利申 請案 PCT/DK2009/05 03 15 之 SEQ ID NO:6 之胺基酸 1 至 311 或胺基酸1至288及視情況存在之野生型MMT中不存在之 其他C端序列組成。該等其他C端序列較佳由至多50個、 更佳至多30個、甚至更佳至多10個、更佳至多4個或至 多1個胺基酸組成。在一極佳具體實例中，MMT之截短形 式可為國際專利申請案 PCT/DK2009/0503 15之 SEQ ID ΝΟ:11，或國際專利申請案 PCT/DK2009/0503 1 5 之 SEQ ID NO:13，或國際專利申請案 PCT/DK2009/0503 15 之 SEQ ID NO:15之蛋白質。國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15之 SEQ ID ΝΟ:11 或 SEQ ID NO:13 或 SEQ ID NO:15 之蛋白質 均不代表功能性MMT酶。 在另一極佳具體實例中，截短MMT形式可由國際專利 申請案 PCT/DK2009/0503 15 之 SEQ ID NO:18 之胺基酸 1 至147或胺基酸1至133及視情況存在之野生型MMT中不 存在之其他C端序列組成。該等其他C端序列較佳由至多 80 201208586 50個、更佳至多40個、甚至更佳至多39個或至多33個或 至多30個胺基酸組成。在一極佳具體實例中，MMT之截短 形式可為國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15之SEQ ID NCh22 或 SEQ ID ΝΟ··24 或 SEQ ID ΝΟ··26 之蛋白質。國際 專利申請案 PCT/DK2009/050315 之 SEQ ID ΝΟ:22 或 SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26之蛋白質均不為功能性MMT酶。 MMT之上述截短形式可存在於例如在MMT基因中攜 帶突變的大麥植物中，其中該突變引入過早終止密碼子， 從而產生編碼MMT之上述截短形式之基因。 在本發明之一較佳具體實例中，大麥植物包含轉錄成 mRNA之MMT基因，其包含在不進行干預下剪接到一起的 一些但並非全部野生型MMT基因（大麥之野生型MMT基 因之内含子-外顯子結構展示於國際專利申請案 PCT/DK2009/0503 15之圖9中）。在本發明之一具體實例 中，本發明大麥植物之MMT mRNA相應地較佳至多包含外 顯子1、2、3、4及5在不進行干預下剪接到一起，或例如 至多包含外顯子1及2在不進行干預下剪接到一起《除該 等剪接到一起之外顯子以外，本發明大麥植物之MMT mRNA可包含來源於野生型内含子及/或外顯子之其他3'端 序列，其中内含子分隔外顯子序列。本發明大麥植物之異 常MMT mRNA之較佳實例（如藉由RT-PCR所確定且相應 地片段長度以 bp表示）說明於國際專利申請案 PCT/DK2009/〇5〇315之圖I2及圖16中。本發明大麥植物 之異常mRNA更佳為國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15 81 201208586 之圖12中所說明在5,端進一步包含外顯子1及2的mRNA， 或國際專利申請案PCT/DK2009/050315之圖16中所說明在 5'端進一步包含外顯子1的mRN A。 在本發明之一極佳具體實例中，在MMT基因中攜帶導 致功旎性MMT完全喪失之第三突變的大麥植物在MMT基 因内之剪接位點中包含產生異常剪接之mRNA的突變。該 犬變更佳位於MMT基因之内含子中，甚至更佳位於内含子 之5剪接位點中，諸如位於内含子丨（該内含子分隔外顯子 1及外顯子2 )上之5,剪接位點中，諸如位於内含子2 (該 内含子分隔外顯子2及外顯子3)上之5ι剪接位點中，諸如 位於内含子3 (該内含子分隔外顯子3及外顯子4 )上之5, 剪接位點中，諸如位於内含子4(該内含子分隔外顯子4及 外顯子5)上之5,剪接位點中，諸如位於内含子5 (該内含 子分隔外顯子5及外顯子6)上之5,剪接位點中，諸如位於 内含子6 (該内含子分隔外顯子6及外顯子7)上之5，剪接 位財，最佳位於内含子2或内含子5上之5,剪接位點中。 该突變較佳為上述.内含子之末端5,鹼基之G — A突變。 I而，極佳突變為内含子2之末端5,驗基之G — A突變大或文内 含子5之最5ι鹼基之g — a突變。 可藉由熟習此項技術者已知的任何適合方法來製備本 ，明之大麥植⑯’較佳藉由下文之章節「製備雙重無功能 型L〇X_無功能型MMT大麥」中所述之方法。 ’、、、此 製備雙重無功能型LOX-無功能型MMT大麥 82 201208586 ‘纟發明之大麥植物可藉由熟習此項技術者已知的任何 適合方法來製備。本發明之大麥植物較佳藉由包含以下步 驟之方法製備：在大麥植物或其部分（例如大麥籽粒）中 誘發突變，接著篩選並選擇以功能性LOX]完全喪失、功 此性L〇X-2完全喪失及’或功能性mmt完全喪失為特徵的 大麥植物。 本發明之大麥植物包含至少3個突變。因此，該等植 物可藉由以下方法製備：製備僅包含該等突變之一：各別 大^植才勿’且此後使該$大麥植物雜交以獲得具有所有3 個大隻之大麥植物；或藉由將該等突變相繼引入大麥植物 中；或藉由此等方法之組合。 因而，本發明之大麥植物可藉由以下方法製備：在大 麥植物或其部分（例如大麥籽粒）中誘發突變，接著篩選 並k擇以功能性LOX4完全喪失為特徵的大麥植物；及在 另大麥植物或其部分（例如大麥籽粒）+誘發突變，接 著筛選並選擇以功能性L〇x_2 $全喪失為特徵的大麥植 2 ’及在另-大麥植物或其部分（例如大麥籽粒）中誘發 欠接著歸選並選擇以功能性MMT完全喪失為特徵的大 物所選大麥植物最終可進行若干輪雜交以獲得攜帶 所有3個突變之大麥植物。 或者，本發明之大麥植物可藉由以下方法製備：在大 、物或其分（例如大麥籽粒）中誘發突變，接著篩選 =選擇以功能性XX完全喪失為特徵的大麥植物。可視情況 ，、殖該等所選大麥植物，並接著可在此等大麥植物（或其 83 201208586 部分，例如大麥籽粒）中誘發突變，接著篩選並選擇以功 月b f生YY 70全喪失為特徵的大麥植物。可視情況繁殖該等所 選大麥植物或其部分，且接著： (1)可在此等大麥植物（或其部分，例如大麥籽粒）中 誘叙犬邊，接著篩選並選擇以功能性zz完全喪失為特徵的 大麥植物；或 (u)可使此等大麥植物與以功能性zz完全喪失為特徵 的大麥植物雜交。 在上述雜交中，χχ、γγ及ZZ各自表示LOX-卜LOX-2 或ΜΜΤ ,其中XX不同於γγ，γγ不同於。 在一較佳具體實例中’大麥植物可藉由包括以下步驟 之方法製備：在大麥植物或其部分（例如大麥籽粒）中誘 發突變’其中該等大麥植物已攜帶導致功能性L〇x_丨酶完 全喪失之突變；接著篩選並選擇另外攜帶導致功能性L〇x_2 元全喪失之突變的大麥植物（亦即無功能型L〇x_ 1 _無功能 型LOX-2植物’或雙重無功能型[οχ植物）。此方法進一 步包括在其他大麥植物或其部分中誘發突變，及篩選並選 擇功能性MMT完全喪失之大麥植物，及最終使此等大麥植 物與無功能型LOX-1-無功能型L〇x_2大麥植物雜交。 適合無功能型LOX-1大麥植物描述於例如國際專利申 請案 WO 2005/087934 中。 篩選方法較佳利用萌芽胚作為起始物質來鑑別以功能 性LOX-2完全喪失為特徵的大麥植物。令人感興趣的是， 基於篩選多達21，000個不顯示單一無功能塑LOX-2大麥突 84 201208586 體之成熟胚，本發明之發明者已發現使用成熟胚作為起 始物質用於篩選L〇X-2活性不佳。 本發明之一目標在於提供製備雙重無功能型L〇x-無功 能型MMT大麥植物的方法，該方法包含以下步驟：（〇製備 雙重無功能㈤LOX大麥植物；及（π )製備無功能型_丁 大麥植物，（in )使該雙重無功能型L〇x大麥植物與該無功 能型MMT大麥植物雜交；（iv)選擇雙重無功能型l〇x-無 功能型MMT大麥植物。 製備該等雙重無功能型L〇x大麥植物較佳可藉由包含 以下步驟之方法進行： (Ο提供LOX-1活性功能完全喪失（諸如功能性L〇x_ i 酶完全喪失）之大麥植物或其部分；及 (η)在該大麥植物及/或來自該大麥植物之大麥細胞及/ 或大麥組織及/或大麥籽粒及/或大麥胚中誘發突變，由此獲 得Μ0代大麥；及 (111 )將該等經突變誘發之大麥植物、籽粒及/或胚育種 至少2代，由此獲得Μχ代大麥植物，其中χ為u之整數； 及 (iv )由該ΜΧ大麥植物獲得胚；及 (ν )使該等胚萌芽；及 (V1 )測定該等已萌芽胚或其部分中之LOX-1及LOX-2 活性；及 (vii )選擇已萌芽胚中[οχ]活性及L〇X 2活性完全 喪失之植物；及 85 201208586 (viii)分析LOX-1基因及LOX-2基因中之突變；及 (選擇LOX-1基因及LOX-2基因中帶有突變之植 物’亦即雙重無功能型LOX植物； 由此獲得LOX-1及LOX-2基因中帶有導致功能性 LOX-1及功能性l〇X-2完全喪失之突變的大麥植物。 製備該等無功能型MMT大麥植物較佳可使用包含以下 步驟之方法進行： (i )在大麥植物及/或大麥細胞及/或大麥組織及/或大麥 籽粒及/或大麥胚中誘發突變，由此獲得M〇代大麥；及 (Η )藉由例如育種使該等經突變誘發之大麥植物、籽 粒及/或胚繁殖22代，由此獲得Μχ代大麥植物其中X為 22之整數；及 (iii )獲得該等Μχ大麥植物之樣品；及 (i ν )測疋5亥樣品中之s Μ Μ含量；及 (V)選擇樣品中包含10 ppb以下SMM、較佳包含5 ppb 以下SMM、更佳不包含可偵測之SMM的植物；及 (vi )對至少一部分MMT基因進行定序；及 (vii)選擇MMT基因中帶有突變的植物。 上述LOX-1活性完全喪失之大麥植物可為例如w〇 2005/087934中所述之任何[οχ]活性完全喪失之大麥植 物’較佳為突變體D112或其子代植物。 上述方法中之突變誘發步驟可包括在選自由大麥植 物、大麥細胞、大麥組織、大麥籽粒及大麥胚所組成之群 組、較佳選自由大麥植物、大麥籽粒及大麥胚所組成之群 86 201208586 、組'為大麥籽粒的活材料中誘發突變。 甲:支誘發可藉由任何適合方法進行❶在一具體實例 —將大麥植物或其部分（例如大麥籽粒或個別大麥 胞）與大變誘發劑_起培育來進行突變誘發。該試劑為 $習此項技術者所已知，包括例如（但不限於）疊氮化納 (1^3)、甲烷磺酸乙酯（EMS)、疊氮甘油（AG，3_疊氮基 ’丙—醇）、甲基亞硝基脲（mnu )及順丁烯二醯肼 (MH ； maleic hydrazid) 〇 ^在另具體貫例中’藉由照射（例如UV )在大麥植物 或其^分（諸如籽粒）中進行突變誘發。在本發明之較佳 ,、體貫例中，根據下文之章節「化學突變誘發」中所述之 I:何方法進行突變誘發。適合突變誘發方案之一非限制性 實例提供於國際專利申請案pCT/DK2〇〇9/〇5〇355之實施例 2中。 進仃突變誘發之方式較佳使得：當薛選M3代大麥時， 所要突變體之預期頻率為4 1〇，_顆毅粒中至少〇 5例， 諸如在0.5至5例範圍内’例如在〇 9至2 3例範圍内。在 一較佳具體實例中，在大麥籽粒中進行突變誘發。應用誘 突變劑之籽粒稱為M0代（亦參看圖8 )。 可測定由軋芽大麥胚組成之樣品中，較佳萌芽大麥胚 之液體萃取物中的L0X活性。該樣品（諸如該萃取物）可 由該萌芽胚之任何適合部分製備。一般而言，大麥樣品在 製備該樣品之萃取物及測定L0X_2活性之前必須使用任何 適合方法均質化。詳言之，較佳由萌芽胚或其部分製備蛋 87 201208586 白質萃取物且使用該单取物測定L〇x活性。均質化可例如 使用機械力進行，例如料由振 …士“ u肖由振盪或攪拌，諸如藉由在珠粒 (诸如玻璃或砂質珠粒）存在下振盪。 在-較佳具體實例中，萌芽之胚為心代，其中… 之整數ϋ佳為2至10範圍内，更佳…範圍内之整 數°在-極佳具體實例中，敎Μ3代萌芽肢或來源於該等 :之樣品中的L0X活性。在該具體實例中，較佳種植經突 交誘發之Μ0代大麥籽粒以獲得大麥植物，將其雜交以獲得 吣代籽粒。重複該程序直至獲得Μ3代籽粒(亦參看圖”。 測定LOX活性可使用任何適合分析進行較佳藉由下 文所述之方法之-。詳言之’分析較佳提供關於亞麻油酸 破L〇X_1及L〇X·2雙氧化形成9-HPODE及i3_hp〇de的 資料。一般而言，分析因此將包括以下步驟： (0提供由已萌芽大麥胚或其部分製備的蛋白質萃取 物；及 (i i )提供亞麻油酸；及 (in )將該蛋白質萃取物與該亞麻油酸一起培育；及 (iv)偵測由亞麻油酸形成9-HPODE及13-HPODE之雙 氧化。 該方法之步驟（iv )較佳包含測定該等萌芽胚（較佳為 由該等萌芽胚製備之蛋白質萃取物）中的9Hp〇DE及 1 3 HPODE含量。該步驟可包含直接或間接測定9_hp〇de 及13-HPODE之含量 '可測定所有HP〇DE之總含量，在此 情況下較佳具體量測9-HPODE及13-HPODE以供證實。一 88 201208586 種方法可為例如將來自萌芽胚之蛋白質萃取物與作為受質 之亞麻油酸一起培育以便形成9_HP〇de及13-HPODE的方 法。接著可藉由各種方法偵測該等Hp〇DE。一種方法可包 括產生可偵測之化合物，諸如染料。例如，該方法可為在 血紅素（hemoglobin)存在下由所形成hpodE催化3-二甲 胺基苯甲酸與3-甲基_2_苯并噻唑啉酮腙之氧化偶合以形成 吲達胺（indamine )染料，該染料可使用分光光度計在Μ” 下進行里測。該種方法之一實例描述於國際專利申請案 PCT/DK2009/050355之實施例！及實施例2中。使用此分 析岭為小於0.2個A5”單位之吸收讀數指示不存在 活丨生及不存在L〇x_2活性。然而用於測定1及2 活ί·生之更精確方法為將來自萌芽胚之蛋白質萃取物與亞麻 油酉文起培月，接著測定9-HPODE及13-HPODE含量。 HPODE及i3_Hp〇DE含量可例如使用基於之分析 進行測定。 可直接或間接量測由亞麻油酸形成9_Hp〇DE及 13 HP〇DE之雙氧化。任何適合彳貞測方法均可用於本發明。 在本發明之—具體實例中’偵測亞麻油酸氫過氧化物。可 直接偵測9册咖及13_Ηρ_，例如藉由層析法，諸如 HPLC，如國際專利申請案pCT/DK2〇〇9/〇5〇355之 中所述。 。 ρ本發明揭示自萌芽胚萃取蛋白f以供測定職活性之 些態樣具有重要意義。因而’較佳使用酸性緩衝 文蛋白質’較佳為pH值在2至6範圍内之緩衝液，更 89 201208586 佳在3至5範圍内，甚至更佳在3.5至5範圍内，更佳在# 至5範圍内，pH值甚至更佳為4.5。用於萃取之緩衝液較 佳基於有機酸，更佳為乳酸緩衝液。最佳使用i〇〇mM乳酸 緩衝液（pH4.5)製備蛋白質萃取物。 本發明之某些具體實例揭示用於偵測無功能型
及無功能型LOX-2植物的方法，該等方法包括使9 Hp〇DE 及13-HPODE與染料（例如3_甲基_2_苯并。塞唾琳嗣腺）反 應。較佳在添加亞麻油酸後向蛋白質萃取物中添加該染料 (例如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙）。較佳在蛋白質萃取物與 亞麻油酸接觸後至少i分鐘添加染料，更佳至少5分鐘， 甚至更佳至少10分鐘’諸如在！分鐘至6〇分鐘範圍内， 例如在5分鐘至30分鐘範圍内，諸如在1〇分鐘至2〇分鐘 範圍内 用於選擇本發明之大麥植物的較佳方法詳細描述於國 際專利申請案PCT/DK2009/050355之實施例2中。 可針對基於微量滴定板之分析程序或其他已知的重複 '，高產量分析格式㈣㈣擇料以允許快速_選許多樣 品。較佳分析至少5000株經突變誘發之大麥植物的[ΟΧ」 及LOX-2活性，諸如至少75〇〇株，例如至少1〇，_株， 諸如至少15,〇〇〇株，例如至少2〇，_株諸如至少乃_ 株。 ’ 測定編碼LOX]之基財之突變可藉由若干種不同的 方法進行。例如，可對L〇x·!基因進行完全或部分定序， 且將該序列與wo 2005/087934之seq m n〇 i或 90 201208586 2005/087934之SEQ ID NO:5相比較。若搜尋特定突變，則 可應用SNP分析。熟習此項技術者將能夠設計適用於偵測 指定特定突變，諸如在LOX—i之編碼序列中產生過早終2 密碼子（例如上文所述之任何過早終止密碼子）之突變 引子。如何進行SNP分析之一個實例描述於國際專^申= 案PCT/DK2009/050355之實施例10中，其中引子適用於^ 測LOX-1基因之核苷酸位置3474處的g — a突變。 測定編碼LOX-2之基因中之突變可藉由若干種不同的 方法進行。例如，可對L0X_2基因進行完全或部分定序， 且將該序列與國際專利申請案PCT/DK2009/050355之SEQ ID ΝΟ:1相比較。若搜尋特定突變，則可使帛sNp分析。 熟習此項技術者將能夠設計適用於偵測指定特定突變，諸 如在LOX-2之編碼序列中產生過早終止密碼子（例如上文 7述之任何過早終止密碼子）之突變的引子。如何進行SNp 刀析之一個實例描述於國際專利申請案 PCT/DK2_/〇50355之實施例1()中，纟中引子適用於偵測 LOX-2基因之核苷酸位置Μ”處的g —a突變。 本發月内亦可包含如本章節上文中詳細描述的製備雙 重無功能型LOX大麥植物之方法的步驟（vii〇及（h〇可 在進行V驟（VI )及（vu )之前進行，在此情況下該方法將 按序包含步驟f.·.、 ^ )、（lu)、（iv)、（v)、（viii)、（ix)、 (vi )及(vii )。特定士· + t 行疋5之’此可能為例如在已鑑別之雙重無 功能型LOX大麥植物的工成# 1丄 m物的子代植物中搜尋特定突變之情形。 選擇功能性]VIMT '入4· Μί心全喪失之大麥植物較佳包含自經突 201208586 變誘發之大麥植物獲得樣品，較佳自^之經突㈣ϋ 大麥植物，甚至更佳自ρ站贫 ^自已〇 4天之經突變誘發之大麥植 2獲得樣品。樣品較佳來自胚芽稍及/或初生葉較佳來自 葉。因!，樣品可為例如1咖至3咖範圍内之葉組織。 可卒取樣品並按照新開發之多步驟方案進行分析，如 本文所述，包括相繼制不同溶劑及結合物質…般而古， 可以例如溶劑或溶劑混合物，較佳以水及/或有機溶劑萃取 樣品。有機溶劑可為例如醇，較佳為甲醇，或有機溶劑可 為例如烧基函化物，較佳為三氣甲烧。在—較佳具體實例 中，溶劑為水、甲醇及三氣甲院之混合物。該萃取宜在例 如使用振盤器或混合器進行混合下進行。可向溶劑/樣品混 合物中添加固體支揮物’例如珠粒，諸如玻璃珠粒。 在一較佳具體實例中’用於測定ΜΜΤ活性之上述葉樣 ^是取自ΜΧ代杆粒，其中X為β之整數，較佳在2至10 範圍内更佳在3至8範圍内。在一極佳具體實例中，測 定M3 芽植物或其樣品（諸如葉）中之含量。在該 具體實例中’較佳種植經突變誘發之刚代大麥軒粒以獲得 大麥植物，隨後使其雜交以獲得M1代籽粒。重複該程序直 至可獲得M3代籽粒（參看圖8 )。 較佳基於下文所述之新穎程序測定SMM含量。令人感 一趣的是，此方法允許鬲產量篩選，使其可供鑑別以功能 性MMT完全喪失為特徵的大麥植物。 一般而言，該方法較佳包括使樣品或較佳如上文所述 製備之該樣品之萃取物與能夠結合SMM之化合物反應。發 92 201208586 .現0PA試劑（Sigma ’目錄號P7914 ;參看國際專利申請案 PCT/DK2009/05 03 15之圖2)(下文中僅稱為〇pAj尤其適 用於測定SMM含量。OPA尤其與SMM反應，形成稱為 SMM OPA之分子（參看國際專利申請案 PCT/DK2〇09/〇5〇315之圖2)。該反應較佳包括將〇pA與如 上文所述製備之樣品萃取物一起培育。此外，較佳向反應 混合物甲添加3-巯基丙酸。混合物較佳保持在鹼性pH值 下，較佳在pH 8至pH 11範圍内，更佳在pH 9至pH i i 範圍内，甚至更佳在pH 9.5至PH 10.5範圍内，諸如在pH 1 0下。培育較佳在〇 C至1 〇 °C範圍内之溫度下進行，較佳 在1 C至8°c範圍内，甚至更佳在2。〇至6°C範圍内，更佳在 3 C至5°C範圍内，諸如在4°C下。培育時間較佳yo分鐘。 基於觀察到SMM-OPA分別吸收及發射34〇 nm及45〇 nm之光，可藉由使用螢光光譜分析對其進行偵測◊初步偵 測過程較佳包括於管柱上，較佳於3〇x2 mm Gemini 3μ C18 管柱（Phenomenex，目錄號 OOA_4439_8〇;phen〇menex，2〇〇6) 上進行萃取物分離，接著使用高產量液相層析系統進行螢 光偵測，該系統較佳為設計用於鑑別及量測在34〇 nm下激 發且在450 nm下發射之分子之螢光量的超高效液相層析 (Ultra Performance Liquid Chromatography ; UPLC 系統，
Waters )。當使用此方法時，「無可偵測之SMM( n〇 detect^k SMM )」意謂不存在與SMM共溶離之可偵測化合物。在此 f月形中，層析峰上之小「肩峰（sh〇ulder )」視為假影峰。 因此，參看圖2 ’認為Asn/Ser峰右手側之小肩峰不代表SMm 93 201208586 :=舉例而言’…所示之上兩個層析圖視為描 2° _之SMM」，而3圖_下方之層析圖 含SMM之樣品。 衣刀離◦ SMM之❹】較佳可如實施例2或實施例*中所述來進 ^用於選擇本發明大麥植物之—較佳方法描述於下文之 實施例2中。用於分析之組織較佳自萌芽大麥植物取樣， 甚至更佳自已萌芽4天之大麥植物取樣。應注意，上述篩 選方法尤其適用、首先，該分析方法為新穎的。此外，上 述f法之顯著優勢在於該方法是為測定萌芽大麥植物（諸 如萌芽大麥植物之葉）中的SMM含量而建立。自萌芽大麥 取樣之時序獲得可用於對SMM進行基於UPLC之偵測的出 乎意料地潔淨的製劑。如上文所述之其他樣品，例如類似 榖粒之麥芽汁樣品在組成上過於複雜，且一般無法用於所 提及之測定SMM含量之層析方法中。 繼鑑別具有10 ppb以下SMM、較佳無可偵測之SMM 的大麥植物後，典型地對相應MMT基因或其部分進行定序 以確定所討論之大麥植物是否可歸類為在MMT基因中具有 突變。接著’選擇以不具有可偵測之SMM為特徵且MMT 編碼基因之一或多個鹼基不同於野生型序列的大麥植物。 在此情形中’野生型序列較佳為在相應野生型大麥載培品 種中所發現之序列，較佳為國際專利申請案 PCT/DK2009/0503 15作為SEQ ID NO:3提供之序列。較佳 突變描述於上文中。 所選大麥突變體可進一步繁殖，且針對SMM含量再_ 94 201208586 選後續各代之植物 入利用下文之章節 計劃中。 :選擇適用大麥植物後，此等植物可納 「植物育種」+所述之習知方法的育種 :旦已鑑別出含有L〇W中之特定突變及l〇x_2 基因中之特定突變及MMT基因t之特定突變（諸如任何上 述突變）的雙重無功能型L0X_無功能型ΜΜτ大麥植物， 即可藉由習知育種方法產生具有相同突變的其他大麥植 物，諸如熟習此項技術者所熟知的方法。例如，可 重無功能型LOX大麥植物與另一大麥載培品種回交， 繼選擇功能性L〇X]、L〇x_2&MM丁完全喪失之適用 大麥植物之後’可視情況進行一或多種其他筛選。例如， 所選突變體可進一步繁殖’且可測試新一代植物之功能性 LOX-1、LOX-2及MMT完全喪失。 在本發明之-具體實例中，本發日月之雙重無功能型 L〇X-無功能型MMT大麥植物較佳具有與野生型大麥相似 的植物生長生理學及穀粒發育。因此，雙重無功能型L〇x ^ 無功能型MMT大麥植物較佳在株高、每株植物之分蘖數、 開花開始時間及/或每穗縠粒數方面類似於野生型大麥（較 佳為栽培品種power或栽培品種Quench或栽培品種 Rosalina ) ° 此外，本發明之雙重無功能型L〇x_無功能型MMT大 麥植物較佳在株高、抽穗日期、抗病性、倒伏、斷穗 (ear-breakage)、成熟時間及產量方面類似於野生型大麥， 特定言之類似於栽培品種p0wer或栽培品種Quench。在本 95 201208586 發明之上下文中，「類似」應理解為在數目情況下相同 士 10%。此等參數可如下文之實施例5中所述進行確定。 在本發明之一極佳具體實例中，藉由使大麥品系A68 9 (ATCC專利寄存編號：pTA_9640 )與大麥品系8063 ( ATCC 專利寄存編號：PTA-9543 )雜交且視情況接著進一步育種 來製備大麥植物。 大麥品系A689之種子已於2008年12月4曰以「大麥 品糸 A689 ( Barley, Hordeum vulgare L.; Line A689)」之名 稱寄存於美國菌種保存中心（American Type Culture Collection ; ATCC )專利寄存部（Patent Depository ) ( 10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110，United States)(寄 存編號 PTA-9640 ) » 大麥品系8063之種子已於2008年10月13曰寄存於 美國菌種保存中心（ATCC )專利寄存部（10801 University Blvd_，Manassas ’ VA20110，United States)且稱為「大麥
品系 8063 (Barley，Hordeum vulgare; Line 8063 )」（ATCC 專利寄存編號：PTA-9543 )。 化學突變誘發 為產生本發明之雙重無功能犁L〇x_ &功能型MMT大 麥植物，藉由任何適合突變誘發方法製備極大數量之大麥 突變體（典型地在多輪中），例如藉由使用大麥籽粒之化學 突變誘發。已知此方法隨機引入突變。大麥之突變誘發可 使用任何突變誘發化合物進行。然而，較佳藉由用啊處 96 201208586 理籽粒，讓存活籽粒萌芽，接著分析後代植物來進行。由 經突變誘發之籽粒生長之植物世代稱為则，其含有任何指 定突變之異型接合嵌人 ° 自化授粉後收集之子代植物稱 為Mi代，其中指定突變分離為相應異型接合子及同型接合 子（參看圖8)。 用細3處理轩粒不等同於處理單一細胞，因為處理後 籽粒將含有一些非突變型細胞及多種具有職突變之細 胞。因為不產生生殖李之知砲么& 直糸之細胞系中之突變將會丟失，因此 目的在於使誘向可發育成有助於M1 K發育之生 殖組織的數種細胞。 為了評定總體突變效率，白化嵌合體及白化植物可叶 入_代及M1 A。計算突變體數目作為存活植物之函數提 供突變效率之估計值，而計算突變體數目作為經處理種； 之函數量測突變效率與籽粒殺死之組合。 應注意，細胞幾乎在基因表現之每一步驟均具有可能 會緩和破壞性突變之影響的品質保證機制。真核生物中之 :分研究之實例為無義介導之讀衰減（ :CD)，·其防止合成可能有害之過早截短蛋白質— 碼子由其相對於下游去二元：。在㈣中，_ 孖紊％疋兀件之位置而鑑別為過早。 ^過早終止（無義）“子（pTC)的突變有時增加可 Γ題突變之替代剪接轉錄物的含量，由此可能保存蛋白質 功能（Mendell 及 Dietz，2〇〇1)。 97 201208586 植物育種 在本發明之—具體實例中，目標在於提供農藝學上適 用之包含雙重無功能型LOX_無功能型ΜΜτ性狀的大麥植 物。作物開發通常為以引入新性狀開始之漫長而困難的過 ί《而自植物月種人員之觀點來看，此步驟幾乎總是產 生與田刖市售變種相比具有較不合需要之總體農藝學性狀 特徵的植物。 β 除雙重無功能型LOX-無功能型ΜΜΤ性狀以外，亦存 在產生適用於孵麥芽及/或釀造及/或作為飲料基質之市售 大麥變種的技術中亦可考慮的其他因t，例如籽粒產量及 大小及與孵麥芽效能或釀造效能相關的其他參數。由於許 多（若非所有）相關性狀已顯示受遺傳控制，因此本發明 亦提供現代同型接合高產量孵麥芽載培品種，其可由與本 公開案中所揭示之雙重無功能型L〇x_無功能型ΜΜτ大麥 植物雜交來製備。熟練大麥育種人員將能夠選擇並開發大 麥植物’該等大麥植物在與雙重無功能型LOX大麥-無功能 型ΜΜΤ大麥雜交後將產生優良載培品種。或者，大麥育種 人員可利用本發明之植物進行進一步突變誘發以產生來源 於雙重無功能型LOX-無功能型ΜΜΤ大麥的新載培品種。 用於確保將雙重無功能型LOX-無功能型ΜΜΤ性狀維 持於子代品系中的一種方法涉及LOX-1基因、LOX-2基因 及ΜΜΤ基因之SNP分析。較佳亦測定LOX-1、LOX-2及 ΜΜΤ活性。 本發明之大麥植物可引入任何適合育種流程中。 98 201208586 * 本發明之另一目標在於提供包含雙重無功能型LOX-無 功能型MMT性狀之農藝學良種大麥植物。因此，本發明亦 係關於藉由使第一親本大麥植物與第二親本大麥植物雜交 產生新雙重無功能型L0X-無功能型MMT大麥植物的方 法，其中第一植物或第二植物為雙重無功能型LOX-無功能 型MMT大麥。此外，第一親本大麥植物及第二親本大麥植 物均可來自雙重無功能型LOX-無功能型MMT大麥變種。 因而，使用雙重無功能型LOX-無功能型MMT大麥變種之 任何此類方法均為本發明之一部分：自花授粉、回交、群 體雜交及其類似方法。使用雙重無功能型LOX-無功能型 MMT大麥變種作為親本產生的所有植物均在本發明之範疇 内，包括由來源於雙重無功能型LOX-無功能型MMT大麥 變種之變種發育而成的植物。雙重無功能型LOX-無功能型 MMT大麥亦可用於遺傳轉型，在此情況下將外源DNA引入 雙重無功能型LOX-無功能型MMT植物或植物組織中並在 其中表現。 本發明可使用回交法以向另一載培品種中引入突變型 大麥植物之雙重無功能型LOX-無功能型MMT性狀，例如 栽培品種Scarlett或栽培品種Jersey或栽培品種Quench或 栽培品種Rosalina’該等栽培品種為當下之局產置畔麥牙大 麥載培品種。在標準回交方案中，使相關原始變種，亦即 輪回親本植物與攜帶所欲轉移之相關突變型LOX基因的第 二變種（非輪回親本植物）雜交。隨後將由此雜交產生之 所得雙重無功能型LOX子代植物與輪回親本植物雜交，重 99 201208586 複該過程直至獲得基本上輪回親本之所有規定特性加上非 輪回親本植物之雙重無功能型LOX-無功能型MMT性狀均 在所產生之植物中恢復的大麥植物。最終，使最後產生之 回交植物自花授粉，產生純雙重無功施型L〇x_無功能型 MMT育種子代植物。 加速植物育種過程之方式包含最初藉由應用組織培養 及再生技術來繁殖所產生之突變體。因而，本發明之另— 態樣將提供細胞，其在生長及分化時產生具有雙重無功能 型LOX-無功能型MMT性狀的大麥植物。例如，育種可包 括傳統雜交’製備來源於花藥之可繁殖植物，或使用小抱 子培養。 L Ο X路徑產物 在各種具體實例中，本發明係關於包含低含量之T2N 及潛在T2N的大麥植物及其產品。[οχ酶催化利用順·丨，順 -4戊二烯系統使多不飽和脂肪酸雙氧化之反應。在大麥 中’ Cls多不飽和脂肪酸亞麻油酸（18:2八9，12)及α_次亞麻油酸 (18:3Λ9’12’15)為主要L〇x受質。脂肪酸代謝之脂肪加氧酶路 控起始於在醯基鏈之C-9位置（主要由LOX-1催化）或C-13 位置（主要由LOX-2催化）添加分子氧，產生相應9-HPODE 及13-HPODE[當受質為α-次亞麻油酸時，9-氫過氧基十八 碳二烯酸（ΗΡΟΤΕ)及13-氫過氧基十八碳三烯酸（ΗΡΟΤΕ ) 為產物，但ΗΡΟΤΕ不充當Τ2Ν之前驅物]。在LOX路徑之 氫過氧化物裂解酶分支中，9-HPODE及13-HPODE可裂解 100 201208586 _· 成短鏈酮酸及醛（參看囷1A)。詳言之，9-HPODE可裂解 形成順式壬烯醛，其轉化成T2N，而i3_hp〇de為2-E-己 烯醛之前驅物。因而，預期L〇x_2催化亞麻油酸雙氧化之 主要產物13-HPODE並非導致形成陳味T2N之路徑中的上 游組分。 應承認’本發明涵蓋影響L〇X_ 1及LOX-2催化作用之 下游代謝物之產生，所產生之該等代謝物不為L〇x_ i或 LOX-2催化之反應的直接產物，而是由後續系列反應產生。 此等反應包括自發、因素誘導或酶催化之異構化及轉化。 因而，可藉由調節該路徑之其他組分（例如氫過氧化物裂 解酶（HPL·))之表現來影響此等下游代謝物之產生。" T2N及DMS以及其前驅物 本發明係關於製備具有低含量之一或多種異味物質及 其前驅物的飲料的方法。該等異味物質較佳為t2n及 DMS，且該等其前驅物分別為潛在Τ2Ν及DMsp。 因而，本發明之一目標在於減少或消除潛在T2n。因 而，本發明之一目標在於減少Τ2Ν前驅物及加合物之形 成。雖然若干與啤酒走味相關之化學反應仍難以捉摸，但 公認由潛在Τ2Ν產生自由Τ2Ν是哮酒產品中產生陳味的一 個主要原因（Kuroda等人，上文）。因此，本發明之一目標 在於提供具有低含量之潛在T2N的飲料以及具有低含量： T2N前驅物的飲料。 大部分潛在T2N自麥芽汗鐘软；ρ ώ 曰參牙汁轉移至成品啤酒，在成品啤 101 201208586 酒中可能釋放自由T2N ( Liegeois等人，2002 )，在此過程中 酸度及溢度條件為重要因素。參考本發明，潛在T2N之定 義如上文之定義中所述。亦可利用用於測定潛在T2N含量 的其他方法。為避免混淆，本發明上下文中「潛在T2N」 之含義如上文之定義部分中所述。能夠釋放T2N或轉化成 T2N之化學物質在本文中稱為「T2N前驅物」，且藉由除用 於測定潛在T2N之方法以外的替代方法所測定或量測之 T2N前驅物稱為「T2N前驅物」。特定言之，可藉由首先處 理樣品以使其中基本上所有（較佳所有）能夠釋放T2N或 轉化成T2N的化學物質分別實際上釋放T2N及/或轉化成 T2N來測定T2N前驅物。此後，測定T2N之含量。 本發明之大麥籽粒除無MMT活性以外亦不包含LOX-1 及L0X-2活性。令人感興趣的是，該等大麥軒粒含有極少 潛在T2N。 使用雙重無功能型L0X-無功能型MMT大麥籽粒生產 之啤酒因此將不僅具有極低含量之T2N，而且亦具有極低 含量之潛在T2N。雙重無功能型L0X-無功能型MMT大麥 籽’粒處於本發明範疇内，其產生含有極低含量潛在T2N之 啤酒產品，較佳為以相同方式自野生型大麥、較佳自栽培 品種Power生產之類似啤酒產品之潛在T2N含量的60%以 下，更佳50%以下。 來源於雙重無功能型LOX-無功能型MMT大麥籽粒之 植物產品較佳具有極低含量之T2N前驅物。由雙重無功能 型LOX-無功能型MMT大麥籽粒製備的植物產品處於本發 102 201208586 . 明範疇内，該等植物產品所含有之T2N前驅物為以相同方 式自野生型大麥、較佳自栽培品種P 〇 w e r生產之類似植物 產品之T2N前驅物的60%以下，更佳50%以下。 應注意，來自經微量孵麥芽之原料之樣品及產品中所 測得的T2N值通常比來自以較大規模生產之原料之樣品及 產品，例如30 kg大規模試驗孵麥芽樣品中的量測值高。然 而，大規模實驗與小規模實驗之相對T2N實驗值一般相似。 類似地，應注意，來自經微量孵麥芽之原料之樣品及 產品中所測得的潛在T2N及T2N前驅物通常比來自以較大 規模生產之原料之樣品及產品，例如30 kg大規模試驗孵麥 芽樣品中的量測值高。然而，大規模實驗與小規模實驗之 相對潛在T2N實驗值一般相似。 本發明之一目標亦為減少或消除DMS及DMSP，其中 DMSP較佳為SMM。 植物產品中SMM及DMS之量可藉由任何適合方法進 行測定。SMM基本上可如上文之章節「製備雙重無功能型 LOX-無功能型MMT大麥植物」中所述進行測定，其中描 述測定大麥樣品中之SMM含量。因而，可藉由使SMM與 諸如OPA之化合物偶合並藉由例如使用UPLC系統測定螢 光來測定SMM。對於定量量測，可測定對應於SMM峰之 層析圖面積。 為更精確量測DMS及DMSP (諸如SMM)之量，活化 後量測為DMS之化合物DMSP較佳藉由使用高觯析度毛細 管氣相層析來測定。麥芽汁或啤酒樣品中之總DMS在本文
103 S 201208586 中定義為自由DMS及其前驅物形式（稱為DMSP )之量的 總和。使用此定義’麥芽汁或啤酒樣品中DMSP之量可測 疋為總D M S (在素〉弗樣品中量測，較佳在於驗性條件下煮 沸1小時之樣品中）與自由DMS (在未煮沸之樣品中量測） 之間的差。實施例4詳細描述量測總DMS含量及自由DMS 含量的方法。 本文中DMSP以及SMM之量提供為在鹼性條件下煮沸 1小時可自該DMSP或該SMM釋放之DMS的濃度。 實施例 本文之實施例說明本發明之較佳具體實例，而不應視 為限制本發明。 除非另外指示，否則如Sambrook及Russel (2001)中所 述進行操縱核酸及細菌之基本分子生物學技術。 實施例1 篩選具有低LOX-2活性之萌芽大麥胚 改良之篩選材料。根據〖16丨1111〇£3等人（1978)所提供之 祥情’將自藉由雜交（無功能型LOX-1突變體D112x Jersey ) Sebastian產生之無功能型LOX-1品系Ca211901之大麥植 物收集的籽粒與誘突變劑NaA —起培育。大麥無功能型 LOX-1突變體D112描述於WO 2005/087934中且在2003 年9月11日以編號PTA_5487寄存於美國菌種保存中心 (ATCC ) ( 10801 University Boulevard > Manassas » Va. 104 201208586 • 20110，USA)。 選擇此程序之原因在於已知其在大麥基因體DNA中誘 導點突變’最終在由經突變誘發之DNA所編碼之蛋白質中 提供胺基酸殘基取代或截短《在本公開案之突變誘發實驗 中，選擇該方法以便在田間試驗中繁殖M1代突變型穀粒直 至兩代後代，最終產生高比例之同型接合植物用於筛選目 的（參看圖8 )。雖然不篩選]VI2代縠粒’主要因為預期此 等穀粒含’有相對較高比例之異型接合點突變，但使用M3代 突變型穀粒作為篩選材料，預期每1 〇，0 0 0顆榖粒中存在〇. 9 至2.3個突變（Kleinhofs等人，上文）。 令人驚訝的是，本發明之發明者發現分析萌芽胚與分 析成熟胚之％取物相比提供大大改良之分析結果（如國際 申請案PCT/DK2009/050355之實施例1所述）。因此，建立 高產量篩選程序以量測萌芽胚（包括其子葉盤組織）中之 LOX-2活性。
自3 5,125個大麥穗（20,977株M4代無功能型LOX-1 突變體D112及14，148株M3代無功能型LOX-1品系 Ca2 11 90 1植株）之成熟穀粒分離兩種胚，並轉移至96孔儲 存板（ABgene)中。引發胚萌芽，接著向各孔中添加2〇 水’用濕潤Kimnett組織及塑膠蓋板覆蓋。在20°C下於塑膠 袋中培育該等板48小時。培育後，萃取LOX-2酶；首先向 各孔中添加5 mm玻璃珠粒及200 μί萃取緩衝液（100 mM 乳酸溶液’ pH 4.5 )，接著在MM 300實驗室研磨機（Retsch) 中以27 s·1之頻率研磨35秒。隨後，在4°C下在Allegra 6R 105 201208586 離心機（Beckman-Coulter)中以4,000 rpm將板離心l〇分 鐘以使不溶性物質沈澱。基本上如關於分析成熟胚萃取物 之LOX-2活性（參看國際申請案pCT/DK2〇〇9/〇5〇355之實 施例1)所述來測定LOX-2活性，差別僅在於每次分析使 用僅30 萃取物而非40 μί。 鑑別潛在突變體。如上文所述，分析上述3 5,丨25株大 麥植株各自之兩顆穀粒的LOX-2活性，目的在於鑑別當與 無功能型LOX-1及野生型穀粒相比較時該活性大大降低之 榖粒。在M3代品系Ca2 11901中鑑別出總共7.株潛在原始 突變體。使此等突變體在溫室中進一步繁殖，收穫，接著 再篩選與極低LOX活性相關之性狀。最終，僅一支品系
Ca211901突變體（稱為突變體A689 )顯示基本上不展現 LOX-2活性。用LOX活性幾乎僅由LOX-2提供之萌芽胚萃 取物進行總LOX活性之詳細量測（Schmitt及vanMechelen， 1997 )。對於突變體A689之M3榖粒之萌芽胚，如藉由比 色LOX分析所測定，總l〇X活性為〇.i63±5.5% A595 U/萌 芽胚，而無功能型LOX-丨母體變種Ca2119(H之總L〇x活 性為1.224±3.8。/〇 A”5 U/萌芽胚（無功能型[οχ」原始突變 體D112之相應值為A”5 u/萌芽胚）。大麥品系 Α689之種子已於2〇08年12月4日以「大麥品系α689 (Barley，Hordeum vulgare L; Line Α689 )」之名稱寄存於美 國菌種保存中心（ATCC)專利寄存部（1〇8〇1 Universe BWd. ’ Manassas ’ VA 20110，United States)(寄存編號 PTA-9640 )。 106 201208586 ' 關於突變體A689中HPODE之分析描述於國際專利申 請案PCT/DK2009/050355之實施例4中。 突變體 A689 之性質描述於國際專利申請案 PCT/DK2009/050355 之實施例 5 中。 大麥突變體A689中LOX-2基因之定序描述於國際專 利申請案PCT/DK2009/050355之實施例10中，且該申請案 中之表7概述突變體A689之LOX-1及LOX-2基因中之突 變。 用於偵測雙重無功能型LOX突變體A689之方法描述 於國際專利申請案PCT/DK2009/050355之實施例11中。該 方法為用於偵測LOX-1中之突變及LOX-2中之突變的基於 SNP之方法。 實施例2 篩選無功能型MMT大麥突變體 按照Kleinhofs等人（1978)所提供之實驗詳情，將自栽 培品種Prestige及栽培品種Sebastian大麥植物收集之籽粒 分別與誘突變劑NaN3 —起培育。選擇此程序之原因在於已 知其可在大麥基因體DNA中誘導點突變。 在實驗中，在田間試驗中繁殖Ml代突變型穀粒直至兩 代後代，最終產生高比例之M3代同型接合植物以用於篩選 目的。預期M3代突變型穀粒以每10,000顆榖粒0.9至2.3 之頻率含有基因突變（Kleinhofs等人，上文）。應注意不篩 選M2榖粒。 107 201208586 令人感興趣的是，
本發明描述一種用於摘測缺乏MMT
酸接著使所萃取胺基酸與 1產量篩選程序。因而，本發明者發現 芽大麥之胚芽鞘及初生葉中，且偵測 4天之穀粒之經粉碎葉組織中萃取胺基 '酸與OPA反應形成高度螢光產物來進 行（參看圖2)。 實際上，藉由在具有一張惠特曼1號（Whatman #1) 濾紙（ 296x20.9 mm)之密閉塑膠箱中使來自94株潛在突 變體及兩株野生型植物中之每一者的兩顆榖粒萌芽來進行 各分析。對多個潛在突變型榖粒重複該分析（參看下文）。 在開始萌芽時，向該塑膠箱中添加25 mL自來水，接著在 萌芽2天時再添加1 5 mL自來水。萌芽4天後，將i至3 cm 之葉組織轉移至儲存板（AB gene )中，其中96個1.2 mL 孔各自含有5 mm直徑之玻璃珠粒及5〇〇 水：甲醇2氣甲 烧之12:5:6 ( ν/ν/ν )混合物。接著在ΜΜ 3 00實驗室研磨機 (Retsch )中以30 Hz之頻率振盪該板45秒。隨後，將該板 轉移至離心機（Rotanta 460R，Hettich )，且在室溫下以4,000 rpm旋轉15分鐘以使不溶性物質沈澱。將丨〇 上清液轉 移至96孔儲存板（Waters ’目錄號186002481 )中，且與 200 μι H20 及 60 μΐ^ 含有 OPA 試劑（Sigma，目錄號 P7914):3-酼基丙酸（Aldrich，目錄號M580 1)之15,000:45 ( v/v )混合 物的反應溶液混合。在4 °C下培育混合物至少1 〇分鐘以使 樣品胺基酸被0PA定量衍生化。藉由使用裝備螢光偵測器 108 201208586 之基於Waters之UPLC系統，在具有3 μΓη粒子之2.1x3〇 mm C18 Gemini 管柱（phenomenex，目錄號 ooa-4439-80 )上使 用梯度溶離藉由混合移動相A ( 40 mM NaH2P04緩衝液， 調節至pH 7.8)與移動相B[如所描述之乙腈：曱醇：水之 45:45:10 (v:v:v)溶液（Phenomenex，2006)]來分離 2 經衍生化之混合物。在3 40 nm下激發所溶離之ορα衍生 物，同時在450 nm下量測光發射。層析圖之一實例展示於 圖2中以說明天冬胺酸（ASp )、麩胺酸（Glu )、天冬醯胺 (Asn)、絲胺酸（Ser)及SMM之溶離特徵。包括化合物δΜΜ 之原因在於總體計劃目的為鑑別缺乏合成SMM之能力的大 麥植物’亦即相應層析圖峰極小或較佳不存在的植物。 針對SMM含量分別篩選總共1〇,248顆及3,858顆經 NaN3突變之大麥栽培品種Prestige及栽培品種Sebastian之 籽粒’目的在於鑑別當與野生型榖粒相比較時該含量大大 降低之籽粒。僅鑑別出兩個M3代潛在突變體，亦即第8,〇63 说樣品之榖粒（來源於栽培品種prestige，且在下文中稱為 突變體8063，此名稱亦用於後代縠粒）及第14,〇18號樣品 之榖粒（來源於栽培品種Sebastian，且在下文中稱為突變 體14018 ’此名稱亦用於後代榖粒）。使各突變體之榖粒繁 殖至M4代’接著收穫，且最終進行再分析。結果驗證突變 體8063及突變體14018之穀粒具有極低SMM含量，可能 完全缺乏SMM。 西方墨點分析已驗證突變體8063及突變體14018缺乏 MMT酶（參看國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15之實施 109 201208586 例3 )。 MMT活性量測亦已驗證突變體8063缺乏MMT活性 (參看國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15之實施例4)。 如國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15之實施例9中 所述對大麥突變體8063的MMT基因進行定序揭示内含子5 之第一鹼基處發生G —A鹼基轉換（國際專利申請案 PCT/DK2009/050315 之 SEQ ID NO:8 之第 3076 號核苷酸）。 如國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15之實施例14中所述 對大麥突變體14018之MMT基因進行定序揭示緊鄰外顯子 2下游之剪接供體位點中處於内含子2之第一鹼基處，更特 定言之在第1462號核苷酸處發生G —A鹼基轉換。 此外，已確定MMT mRNA在突變體8063中截短（參 看國際專利申請案PCT/DK2009/050315之實施例11 )且由 該截短mRNA所編碼之突變型MMT蛋白不具MMT活性（參 看國際專利申請案PCT/DK2009/050315之實施例12)。亦 已確定MMT mRNA在突變體14018中截短（參看國際專利 申請案PCT/DK2009/0503 15之實施例15 )且由該截短mRNA 所編碼之突變型MMT蛋白不具MMT活性（參看國際專利 申請案PCT/DK2009/050315之實施例16)。 用於偵測突變體8063之MMT基因中突變之存在的方 法描述於國際專利申請案PCT/DK2009/050315之實施例11 中，且用於偵測突變體1401 8之MMT基因中突變之存在的 方法描述於國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15之實施例 17中。 110 201208586 實施例3 大麥雜交 圖3彙總藉由首先使大麥品系 A689[雙重無功能型 LOX，參看PCT專利申請案第PCT/DK2009/050355號]與品 系 8063[無功能型 MMT，參看 PCT專利申請案第 PCT/DK2009/0503 15號]雜交如何開發本發明之雙重無功能 型LOX-無功能型MMT大麥品系。使用標準育種技術開發 雙重單倍體品系，且在溫室中進行繁殖。在此等品系中選 擇在農藝學效能方面表現最佳以及不存在LOX-1活性（參 看Breddam，K.等人之美國專利第 7,420，105號之實施例 2 )、不存在 LOX-2 活性（參看 PCT 申請案第 PCT/DK2009/050355號之實施例2及本文之實施例1)以及 不存在 SMM 及 MMT 活性 （PCT 申請案第 PCT/DK2009/0503 15號之實施例2及實施例4及本文之實 施例2)之品系以供進一步繁殖與分析。此等品系在本文中 稱為「三重無功能型」。一般而言，對於LOX活性測定，收 穫雙重單倍體品系之種子，且接著分析各品系及對照變種 之12顆榖粒，得到量測值之標準偏差<5% (圖4 )。 實施例4 測定SMM含量 基本上如國際專利申請案PCT/DK2009/0503 15中所述 進行SMM之量測。首先，自置於微量滴定板之1.2 mL孔 111 201208586 中的1至3cm長之大麥葉子切片萃取SMM，其中各孔含有 5 mm直徑之玻璃珠粒及500 pL水：甲醇：三氣甲烷之12:5:6 (v/v/v )混合物《接著在電子調節至以30 Hz頻率振盈的 MM 3 00實驗室研磨機（Retsch )中培育該板45秒。離心後， 將10 pL上清液轉移至96孔儲存板（Waters，目錄號 186002481 )，並與 200 gL 水及 60 pL 含有 OPA 試劑（Sigma， 目錄號P7914) :3-巯基丙酸（Aldrich，目錄號M5801 )之 1 5,000:45 (v/v)混合物的反應溶液混合。在4。〇下培育混 合物至少1 0分鐘以使樣品之胺基酸被OPA定量衍生化。使 用裝備營光a十之UPLC系統（Waters )，在具有3 μηι粒子之 2‘1><30 mm C18 Gemini 管柱（Phenomenex，目錄號 00A-4439-80 )上’使用調節至pH 7.8且含有乙腈：甲醇：水 之45:45:10 ( v:v:v)溶液作為移動相的40 mM磷酸鈉緩衝 液（Phenomenex 2006 )分離2 經衍生化之混合物。在 340 nm下激發ΟΡΑ衍生物，同時在450 nm下量測光發射。 層析圖之一實例展示於圖5中，說明野生型及三重無功能 型突變體之天冬胺酸（Asp )、麩胺酸（Glu )、天冬醯胺 (Asn )、絲胺酸（Ser )及SMM之溶離特徵。觀察到三重無 功能型突變體顯著缺乏合成SMM之能力。 實施例5 農藝學效能 在田間s式驗中測试市售大麥栽培品種q u e n c h及p 0 w e r 以及無功能型LOX-1、無功能型MMT、無功能型LOX-1 - 112 201208586 ，無功能型l〇x_2 (雙重無功能型L〇x)、無功能型而小 ，功此型MMT及三重無功能型植物以比較其農藝學效能。 定期獲知關於株向、抽穗日期、抗病性、倒伏、成熟時間 及產量之資料（參看表1)。 ' 據k準田間試驗程序進行試驗。因此，將相等量之 :售1 :及突變品系之籽粒播種於2個位置之7_88 m2地塊 ，各包含3次重複試驗。在突變體與市售變種之間未觀 察到農藝學，('生壯+ + @ w 〇 狀之主要差異。不同突變品系及變種之大麥 、析表月所有所收穫之榖粒在孵麥芽及酿造方面均具 有良好且可接受之性質。 、 實施例6 微量孵麥芽及微量製穆 實驗設置 ^ π X下6種不同的大麥品系及載培品種進行微量孵麥 牙及微里製醪實驗（圖6A，其亦說明下文所述之實驗工作 ”程）（1)—重無功能型；（2)無功能型L〇x小無功能型 M ( 3)無功能型LOX-1-無功能型]Lop (大麥品系 A689 );(4)無功能塑MMT (大麥品系8()63) ;(5)無功能 型L〇X〈（大麥品系D112);(6)栽培品種p〇體。 =來自各上述品系或载培品種之3份225 g大麥樣品進 行微量孵麥芽實驗。如下進行浸泡及萌芽： ()在16 C下浸泡.3小時濕润；2丨小時乾燥；3小時 濕潤；U小時乾燥；3小時濕潤；21小時乾燥；最終水含 113 201208586 量為45% ; (ϋ) 萌芽 窯式乾燥 萌芽：在16°C下48至μ小時，直至變型>95%。 後，使3份樣品經受不同乾燥方案（圖6A中稱為 ): ”‘、 (i) 85°C乾燥：12.5小時以3〇cc開始且句升至 接著7.5小時勻升至85。〇;在85〇c下1 5小時； (75°C乾燥：12.5小B专以30。〇開始且勻升至55它 接著7.5小時勻升至75。(：；在乃艺下ι.5小時； (iii) 40°C乾燥：在40t下48小時。 於85 C及40 C下乾燥之樣品在萌芽後立即進行處理 而將其餘樣品冷凍2天，解凍，隨後如上文所述在75它 乾燥。 藉由混合90 g經研磨麥芽樣品與27〇mL自來水，接著 在5〇〇桃瓶子中在4(rc下培育20分鐘來進行微量製曝。 使溫度在25分鐘内句升至65t，接著在65χ：下停頓長達 6〇分鐘進行畴化。此後，使溫度在13分鐘内句升至π。。， 接著在78 C下it行長達i 〇分鐘之製锻終止階段。接著在冰 上冷卻所得麥芽汁，用700 mL冰冷自來水稀釋並經由權 疊式MN-616%過據器（Macherey_Nage丨）過遽。將4〇〇机 麥^汁轉移至500 mL#中，緊密封蓋並在沸水浴中加熱⑽ 刀知°在不進-步加熱下將瓶子留在水中再持續的分鐘之 時段。 關於DMSP含量之資料 201208586 - 為研九•不同窝式乾燥溫度對本申請案之野生型及突變 型麥芽之DMSP含量有何影響，首先將榖粒微量孵麥芽， 且Ik後分成等分試樣，接著在3種不同溫度4〇。〇、75。〇及 85°C下窯烘。 s有野生型MMT基因之大麥品系之穀粒的特徵在於最 f麥芽中之DMSP含量較高。然而，在較高溫度下熏烘後 里測到較低含量（表2 )。相反，在所有無功能型MMT基因 型之麥芽令，量測到特別低的DMSP含量。 亦里測由上述麥芽製造之麥芽汁中的DMSp含量，所 獲得之DMSP含量與麥芽中所量測之含量一致。此發現與 描述麥芽與麥芽汁之DMSp含量具有密切相關性之 Dickenson及Anders〇n (1 98 n之先前結果一致。對於所有無 功能型MMT基因型，相應麥芽汁中量測到特別低的DMsp 含量，而與製造麥芽時之熏式乾燥溫度無關。 關於T2N前驅物及自由T2N之含量的資料 為了研究不同熏式乾燥溫度對自由T2N及Τ2Ν前驅物 之含量有何影響，該等化合物於藉由如上文所述之微 量孵麥芽及微量製醪所產生之甜麥芽汁及冷卻麥芽汁中的 濃度。結果顯示於表3中。 對於野生型麥芽之麥芽汁窒彳 、 夕牙/卞黑式乾燥溫度對Τ2Ν及Τ2Ν 前驅物之濃度具有顯著影響。當 ^ a田便用野生型麥芽時，為避 免產生大量T2N前驅物，高窯烘溫度絕對必要。 寞洪溫度對無功能创 Τ〇γι 又L刀月L0X-1-無功能型MMT麥芽之 115 201208586 T2N及其加合物之產生的作用較小。 亦應注意，對於三重無功能型麥芽之麥芽汁，所有樣 品中之自Φ T2N及其前驅物之濃度較低，而與f式乾燥溫 度無關。 、酿 實施例7 用未經孵麥芽之大麥微量製醪 藉由混合90 g經研磨大麥樣品與27〇 mi自來水以及 0·12 g大麥釀造酶混合物〇ndea Pr〇 ( N〇v〇zymes )，接著在 54 C下於500 mL瓶子中培育30分鐘來進行未經孵麥芽之 栽培品種Power及三重無功能型大麥的微量製醪。使溫度 在1〇分鐘内勻升至64。(：，接著在64。〇下停頓長達45分鐘 以進行醣化。此後在14分鐘内勻升至78°C，接著在該溫度 下進行長達10分鐘之製醪終止階段。繼冷卻之後，如關於 微量麥芽製醪所述（參看實施例4 )進行稀釋、過濾及加熱 程序。 量測由栽培品種Power及三重無功能型大麥粉產生之 麥芽汁中的DMSP含量（表4 )。顯然，三重無功能型大麥 所產生之麥芽汁中的DMSP含量與野生型栽培品種power 相比顯著較低。此結果為令人驚訝之發現，因為認為大麥 不含 DMSP( Yang, B.等人：Factors involved in the formation of two precursors of dimethylsuiphide during malting, J. Am. Soc· Brew. Chem. 56:85-92, 1998)。 如PCT專利申請案第PCT/DK2009/050355號中所示 116 201208586 (σ參看該申請案之圖Η及實施例9)，雙重無功能型L〇x樣 之煮沸、大麥釀造及正常麥芽汁之T2N前驅物含量顯著 較低。因此，預期類似性質構成三重無功能型大麥麥芽汁 之特徵，使彳于二重無功能型大麥成為T2N及QMS異味物質 含量較低或完全缺乏T2N及QMS異味物質之大麥釀造飲料 的優質原料。 實施例8 以試驗規模孵麥芽及釀造 實驗設置 —三重無功能型麥芽及栽培品種Quench之麥芽（參考麥 芽）的孵麥芽及釀造分析涉及以下步驟：（丨）孵麥芽；（U) 麥芽汁製備；（iii)麥芽汁分離；（iv)麥芽汁煮沸；⑺用 酵母卡爾斯伯酵母使麥芽汁酸酵；（vi)貝宁藏啤；酉；（vii)清 皁酒（bnght beer )過渡；及（viii)啤酒裝瓶（參看圖⑼、 圖 6C) 〇 用三重無功能型籽粒及栽培品種Quench之籽粒以2〇 ^大的規模特料芽實驗，料實驗在麥芽作坊中如下 進行： ⑴在16°C下浸泡：i小時濕满；i小時乾燥；i小時 濕潤；1小時乾燥；1小時濕湖；最終水含量為45% ; (u)萌芽120小時，以16。〇開始且勻降至14艺； (⑴）乾燥14小時，以65t：開始且勻升至85〇(：;在85 下3小時。 117 201208586 對於三重無功能型及栽培品種Quench (栽培品種 Quench用作參考）之製醪，使用25 kg麥芽樣品。研磨個 別麥芽樣品後，添加自來水以獲得146 L體積。在4〇艺下 製醪20分鐘，接著在25分鐘内自401勻升至65在65。〇 下停頓6〇分鐘以進行醣化，接著經13分鐘加熱階段達到 78 C ’且在78°C下進行1〇分鐘製醪終止。 在1 〇 rc下將一個野生型栽培品種Quench之麥芽汁樣 品及一個三重無功能型麥芽汁樣品分別煮沸6〇分鐘（產生 6.7%蒸發），而其餘兩個麥芽汁樣品在98。〇下加熱6〇分鐘 (產生3 ·9%蒸發）。根據標準釀造實踐之規定進行如上文所 提及之其餘釀造步驟，亦即過濾、渦流分離、醱酵、貯藏 及封裝於綠色玻璃瓶中。 基本上如Hysert等人（1980)所述量測DMSP及DMS含 量，其中使用靜態頂空氣相層析法（headspace Ms chromatography)在35〇b硫化學發光偵測器（Sievers)上 進行硫特異性偵測。使用HS_40自動化設備（PerkinEhM) 進行頂空取樣。 藉由在鹼性條件下煮沸各別樣品〖小時來獲得綠麥芽 及窯烘麥芽之麥芽汁及萃取物中之DMS總含量亦即自由 DMS及DMSP之總和。煮沸及未煮沸之樣品接著進行頂空 分析以測定DMS含量。總DMS (在煮沸樣品中測得）與2 由DMS (在未煮沸樣品中測得）之間的差定義為等於樣品 中所存在之DMSP之量。基本上如敎麥芽汁中自由 之量（Hysert等人，上文）來測定啤酒中自由dms之量。 118 201208586 關於麥芽汁樣品中之DMSP/DMS及T2N前驅物/自由T2N 之含量的資料 使用現代釀造設備，正常情況下需要蒸發6%至1 〇%麥 芽汁以在相應成品啤酒中達成令人滿意之DMS含量，亦即 [DMS]<5 0 ppb ’此值為異味物質之人類味覺臨限含量。基 於此等事實，如上文所述設計試驗性釀造試驗。目標在於 測試減少能量輸入（諸如在加壓培育過程中不進行煮沸） 對麥芽汁及最終啤酒中之DMS含量的影響。因此，實驗設 置包括根據標準條件比較麥芽汁煮沸。 在加熱栽培品種Quench之麥芽汁期間所量測之dMSP 及自由DMS之含量較高，其中在加壓麥芽汁中觀察到自由 DMS含量隨時間增加。相反，經煮沸、蒸發之麥芽汁積聚 較夕DMS直至煮彿結束，此後自由DMS又開始積聚。與 如上文所述之微量製醪後之結果一致，試驗規模三重無功 能型麥芽之麥芽汁的特徵在於DMSP及自由DMS之含量與 來源於栽培品種Quench之類似樣品相比極低（參看表$ )。 值得注意的是，即使在麥芽汁中，三重無功能型麥芽之該 等DMS含量亦遠遠低於5〇 ppb之味覺臨限水準。 基本上如Gronqvist等人（1993)所述，在用〇_(2,3,4,5 6 五氟苯甲基）-羥基胺使羰基衍生化之後’藉由gc_ms測定 來自於栽培品種Quench之野生型麥芽及三重無功能型麥芽 之麥芽汁及啤酒中的T2N前驅物及自由T2N之濃度。 在加熱栽培品種Quench之麥芽汁期間所量測之T2n亍 £ 119 201208586 驅物之濃度較高，其中在開始煮沸/熱處理時發現最大值（表 6)。對於由三重無功能型麥芽製造之麥芽汁，發現徵前 驅。物之含量顯著較低（為使用野生型原料時之含量的約 辦〇,同樣，在開始煮沸/熱處理時發現最大值。低能量加 熱方案（亦即應用加壓熱處理）對兩種麥芽類型之Τ2Ν前 驅物含量僅具有較小影響。經測定，所有麥芽汁樣品中之 自由Τ2Ν含量均較低。 值得注思的疋，無功能型L〇x_ i及無功能型L〇x_2突 變之有益影響顯而易見，即使當在麥芽汁加熱期間應用減 少之能量輸入時。 關於啤酒樣品中之DMS及丁2N前驅物/自由T2N之含量的 資料 使用如上文所述'兩種不同煮沸/加熱方案，量測由三 重無功能型麥芽以及栽培品種Quench之野生型麥芽製造之 新鮮啤酒中的DMS濃度。結果彙總於表7中。 使用仏準煮’弗方案由栽培品種Quench之野生型麥芽製 造之啤酒含有65 ppb DMS，亦即略高於50 ppb之味覺臨 限。使用諸如上文關於野生型麥芽所述之r在加壓培育過 程中不煮沸」之節能程序導致最終啤酒中之DMS濃度極高 (1 5 1 ppb)。 相反，由三重無功能型麥芽製造之啤酒含有極低 含量，而與加熱程序無關。 與所應用之麥芽汁製備方法無關，與由栽培品種 120 201208586 ;Quench之野生型麥芽製造之啤酒相比，由三重無功能型麥 牙製造之啤酒含有少得多的T2N前驅物（共計減少鄉至 5 8% )，而與煮沸方法無關（表7 )。 在所測試之所有4種新鮮啤酒中（亦即使用栽培品種 Quench或三重無功能型麥芽，與允許蒸發或加壓麥芽汁製 備組合），新鮮啤酒中之自由T2N含量均較低，但在37它下 強制陳化2週後’可見顯著差異。雖然由使用標準煮沸或 加壓加熱產生之野生型麥芽製造之兩種啤酒分別含有〇 〇41 ppb及0.061 ppb T2N，但由三重無功能型麥芽製造之啤酒 的相應值更低，亦即分別降至該等值之95%及64%。（表7)。 關於啤酒泳之資料 比較在麥芽汁加熱時進行蒸發或加壓下由栽培品種 Quench麥芽（參看圖6B)及三重無功能型麥芽（參看圖 製造的試驗釀造啤酒。在取樣點9獲取啤酒（參看圖、 6C ) ’在超音波浴中除氣2〇分鐘，接著向1 5〇 哞酒中添 加50 mL H20。將混合物緩慢傾入由μ cm長、7 cm寬玻 璃管組成之泡沫塔中（分別在頂部及底部具有玻璃過濾器 及連接器）。N2氣體以400 mL/min之流速自底部鼓泡穿過 混合物以產生啤酒沫。將此啤酒沫引入管中，並收集於安 置於秤上之分級沈降圓錐體中。 以5分|里之間隔記錄4種啤酒中之每一種之總泡沫重 量’直至停止停止產生泡沫（圖7 )。泡沫含量相似，而與 蒸發或加壓程序無關。然而，在三重無功能型麥芽用作原 121 201208586 料之啤酒中’泡沫產生顯著改良。 啤酒品嘗 專家品嘗小組評估所製造之4種啤酒（亦即使用栽培 品種Quench或三重無功能型麥芽，與允許蒸發或加壓之麥 芽汁製備組合）’新製造之啤酒及在37°C下強制陳化1週及 2週之啤酒（表8 )。 由三重無功能型麥芽製造之新鮮啤酒獲得最高總體風 味評分，而與煮沸方法無關。相反，由野生型麥芽且使用 標準煮沸方案製造之啤酒獲得略低的總體風味評分，其被 認為具有「輕微DMS」。應用加壓加熱技術導致啤酒具有極 低總體風味評分，且被認為具有「強烈DMS」。 在3 7 C下強制陳化1或2週後’由三重無功能型麥芽 製造之啤酒與由野生型麥芽製造之啤酒相比具有顯著較低 之總陳化評分，此尤其歸因於起源於陳化組分T2N濃度較 低之「紙味」屬性的評分較低。 實施例9 以試驗規模進行孵麥芽及釀造 實驗設置 用三重無功能（雙重無功能型LOX-無功能型 型麥芽及栽培品種Rosalina (野生型參考）之表注％ >牙進行轉麥 芽及釀造分析涉及以下步驟：（i )孵麥芽；（ii )麥芽 牙冲製備； (出）麥芽汁分離；（iv )麥芽汁煮沸；（v )用酵 下爾斯伯 122 201208586 酵母使麥芽汁醱酵；（vi )貯藏啤酒；（vii )清啤酒過濾；及 (Viii)啤酒裝瓶。 用三重無功能型籽粒及栽培品種Rosalina之籽粒以21 kg大的規模進行孵麥芽實驗，該等實驗在麥芽作坊中如下 進行： (i)在16°C下浸泡：1小時濕潤；1小時乾燥；1小時 澡潤；1小時乾燥；1小時濕潤 滴水3 6小時直至最終水 含量為45% ; (1〇萌芽120小時，以16°C開始且勻降至; (111 )用正常溫度程式或低溫程式在試驗窯中乾燥/窯烘 經萌芽之籽粒； (iv )正常乾燥/窯烘程式，以45。〇開始，經14小時勻 升至85〇C ’接著在85它下培育2小時； (v)低溫乾燥/窯烘程序，以45〇c開始且經12小時勻升 至7 5。(：，接著在7 5 °C下培育2小時。 對於一重無功此型及栽培品種R〇salina之製醪，使用 34 kg麥芽樣品 。研磨個別麥芽樣品後，添加自來水以獲得 180L體積。在6(rc下製醪2〇分鐘，接著在5分鐘内自_ 勻升至65。(：。在65<t下停頓6〇分鐘以進行醣化，接著經 13分鐘加熱階段達到7 8。〇， 終止。 且在78。(：下進行1〇分鐘製醪
野生型栽培品種Rosalina 型麥芽汁樣品在1 〇〇。〇下分別I 之麥芽汁樣品及1重無功能
123 201208586 下保持60分鐘（產生〇%蒸發）。 用栽培品種 '窯烘條件及煮沸條件之不同組合製造6 種不同的麥芽汁（參看表9)。 根據標準釀造實踐之規定進行如上文所提及之其餘醸 造步驟，亦即渦流分離、醱酵、貯藏、過濾及封裝於綠色 玻璃瓶中。 如上文於實施例8中所述量測DMSP及DMS含量。 關於麥芽樣品中之DMSP/DMS含量的資料 在現代孵麥芽植物中，正常情況下需要以85cc之固化 溫度乾燥籽粒至少2小時以將麥芽令之DMSp降至較低含 量，亦即4.5毫克/公斤麥芽以下，以獲得可獲得具有令人 滿意之DMS含量之麥芽汁的麥芽（參看下文）。 基於此等事實，如上文所述設計試驗性孵麥芽試驗。 目標在於測試減少能量輸入（諸如低溫乾燥）對麥芽、麥 芽汁及最終哞酒中之DMS及DMSp含量的影響。因此，實 驗設置包括根據標準條件比較籽粒乾燥。 在使用85°C標準乾燥由栽培品種R〇saHna製造之麥芽 中，經量測DMSP為4.7毫克/公斤麥芽。在藉由於75 π下 乾燥而製造之栽培品種Rosa丨ina之麥芽中’經量測DMSp 為16.2毫克/公斤（表10)β在由三重無功能型榖粒製造之 麥芽中，獲得極低DMSP含量，實際上低於_極限，而 與乾燥溫度無關。 124 201208586 - 關於麥芽汁樣品中之DMSP/DMS含量的資料 使用現代釀造技術，正常情況下需要至少i小時煮沸， 從而蒸發4 · 5 %至1 〇〇/。麥芽汁，以在相應成品啤酒中達成令 人滿意之DMS含量，較佳[DMS]<5〇 ppb。基於此等事實， 如上文所述設計釀造試驗。目標在於測試減少能量輪入（諸 如低溫籽粒乾燥或在無蒸發下於密閉容器中熱處理）對麥 芽汁及最終啤酒中之DMS含量的影響。因此，實驗設置包 括根據標準條件比較籽粒乾燥及麥芽汁煮沸。 在加熱用正常乾燥製造之栽培品種R〇saHna之麥芽汁 功間所測彳于之DMSP及自由DMS之含量較高。在密閉容 益中觀察到自由DMS含量隨時間增加。相反，經煮沸、蒸 發之麥芽汁積聚較少DMS直至煮沸結束，此後自由DMs 開始積t。（表11 )對栽培品種R〇salina使用低溫乾燥時， DMSP及DMS含量比正常乾燥時高得多。在由栽培品種 Rosahna製造的所有3種麥芽汁中，最終麥芽汁之DMS含 里均兩於50 ppb。 與上文所述之其他結果一致，三重無功能型麥芽之麥 芽汁的特徵在於與來源於栽培品種R〇salina之類似樣品相 比，DMSP及自由DMS之含量極低。值得注意的是，即使 在麥芽汁中’三重無功能型麥芽之該等DMS含量亦遠遠低 於5 0 ppb，而與窯烘及煮沸方案無關。 關於麥芽汁樣品中之T2N前驅物/自由τ2Ν之含量的資料 基本上如 Groenqvist等人（1993)所述，在用 125 201208586 〇-(2,3,4,5’6-五氟苯〒基）_羥胺使羰基衍生化之後，藉由 GC-MS測定來自栽培品種R〇sa|ina之野生型麥芽及三重無 功能型麥芽的麥芽汁及相中之T2N前驅物及自由UN之 濃度。 在栽培品種R0salina之麥芽汁令所量測之τ2Ν前驅物 之濃度較问（表12)。對於由三重無功能型麥芽製造之麥芽 汁，發現Τ2Ν前驅物之含量特別低，為使用野生型原料時 之^量的桃。低能量加熱方案，亦即低m溫度或於密 閉合器中在無蒸發下對麥芽汁進行熱處理，僅對兩種麥芽 類里之T2N刖驅物含量具有極小影響。經測定，所有麥芽 汁樣品中之自由T2N含量均較低。 ▲值得注意的是，無功能型LOP及無功能型L〇x_2突 變之有益影響顯而易見，即使#應用減少之能量輸入時。 關於皁/酉樣00中之DMS及T2N前驅物/自由T2N之含量 資料 使用如上文所述之兩種不同籽粒乾燥及煮沸/加熱方 案’·量測由三重無功能型麥芽以及栽培品種R〇saUna之野 生型麥芽製造之新鮮啤酒中的刪滚度。結果囊總於表Η 中。 使用標準煮沸方案由使用標準乾燥條件產生之栽培品 種R〇SaUna之野生型麥芽製造之啤酒含有117PpbDMS，亦 即f於50 ppb。使用如上文所述之節能程序，諸如「在密 閉容器中無蒸發」，野生型麥芽產生174 ppb DMS，亦即最 126 201208586 終啤酒中之異味物質濃度極高。 相反’由三重無功能型麥芽製造之啤酒含有極低DMS 含量’而與煮沸及窯烘程序無關。 在所測試之所有啤酒中（亦即使用栽培品種R〇salina 之麥芽或三重無功能型麥芽，與允許蒸發下煮沸或在密閉 容器中於無蒸發下熱處理組合），新鮮啤酒中之自由T2N含 里均較低，但在37°C下強制陳化2週後，可見顯著差異。 雖然由在標準煮沸及在密閉容器_於無蒸發下熱處理下產 生之野生型麥芽製造之啤酒分別含有〇〇55 ppb及〇〇35 ppb T2N，但由三重無功能型麥芽製造之啤酒的相應值顯著 更低，亦即分別降低67%及51% (參看表13 )。 啤酒品嘗 專家品嘗小組評估所製造之6種啤酒（亦即使用栽培 口口種Rosallna之麥芽或三重無功能型麥芽，與允許蒸發下 煮彿或在密閉容器中於無蒸發下熱處理或者標準或低溫乾 燥、、且〇 )新製造之啤酒及在37°C下強制陳化2週之啤酒（表 14 )。 ▲由一重無功能型麥芽製造之新鮮啤酒獲得最高總體風 未平刀而與窯烘及煮沸方法無關。相反，由在85〇C下窯 予生i麥芽且使用標準煮沸方案製造之啤酒獲得低得 多的總體風味評分，其被認為具有「顯著DMS」。在麥芽汁 製備時應用在密閉容器中於無蒸發下熱處理導致啤酒且有 甚至更低之總體風味評分’其被認為具有「強烈DM二 127 201208586 在3 7°C下強制陳化2週後，由在851下窯烘之三重無 功能型麥芽在正常煮沸下製造之啤酒與由野生型麥芽製造 之相應哞酒相比具有顯著較低之總體陳化評分，此尤其歸 因於起源於陳化組分T2N濃度較低之「紙味」屬性評分較 低。 對於由野生型麥芽製造之啤酒’實際上不可能評估不 新鮮特性’此主要歸因於顯著至強烈之DMS異味物質。 實施例10 比較大麥釀造啤酒及正常啤酒之THA。 數十年前即已描述來源於亞麻油酸之啤酒特異性THA (Drost等人，1974 )。自此之後，各種報導已驗證啤酒中之 THA總含量在約5卯„1至12ppm範圍内（Hamberg，1991 ; 及其參考文獻）。雖然9，12，13-THA通常構成啤酒中THA之 75%至85%，而9，10，13-ThA共計15。/。至25。/。；但亦發現痕 量其他異構物。 在由二重無功能型大麥麥芽製備之麥芽汁所製造之〇牟 酒（參看實施例9)中，9，12，13_tha之濃度與由栽培品種 Rosalina之麥芽製造的對照啤酒相比降低8〇%至87% (表 15)。對於9，10，13-THA異構物，觀察到降低65%至72%。 使用標準HPLC質譜分析進行此等量測（Hamberg,上文）。 實施例11
擴增啤酒中來源於原料之DNA 128 201208586 若可使用PCR方法來確定麥穿粉混合物中物種特異性 DNA序列之存在或不存在，則鑑定啤酒樣品更具有挑戰 性。在啤酒製造中，來源於原料之核酸酶、高溫及過濾之 組合致應使啤酒產品僅含有低含量之可供擴增植物基因片 段之完整DNA。在此，描述一種組合DNA萃取與擴增之有 效新穎方法，該方法可產生可供觀測的足量DNA。 開發一種新穎四步驟方案用於啤酒樣品之原料鑑定。 其以連續方式利用3種生物分子套組之試劑及方案，最終 擴增DNA片段以供觀測： (i )經由結合至磁性珠粒而自啤酒中萃取DNA[按照 DNA 萃取套組 Speciation ( Tepnel Biosystems 有限公司，目 錄號90 1 040N )中關於液體樣品之說明書中之建議;j ; (Π)藉由等溫股鏈置換來擴增DNA( Illustra GenomiPhi V2 DNA 擴增套組 ’ GE Healthcare，目錄號 25-6600-30 ); (iii )用偵測特定 DNA 突變之引子，使用 REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix ( Sigma ’ 目錄號 XNAP-1KT)進行 PCR ; (iv )進行瓊脂糖凝膠電泳以分離擴增產物，接著用漠 化乙錠染色以觀測此等產物。 以上步驟（i)涉及自以下樣品之4〇〇 等分試樣純化 DNA ： (a )使用野生型麥芽：大麥之75%:25〇/〇混合物粉 (Carlsberg Breweries A/S ;標籤標註 26.11.11 704 )製造之
Tuborg Gr0n Pilsner ； 129 201208586 (b)使用包含5G%無功能型LOX-l麥芽之混合物以試 驗規模製造之啤酒（Carlsberg試驗標識符2C10084); (Ο使用由三重無功能型大麥製造之麥芽以試驗規模釀 造之未煮沸麥芽汁（Carlsberg試驗標識符2cn〇〇1 ); (d )使用三重無功能型麥芽以試驗規模釀造之煮沸麥 芽汁（Carlsberg試驗標識符2cu〇〇1 )，亦即由上文（c) 中所述之麥芽汁加工而來之麥芽汁。 最終將自各上述樣品（a)、（b)、（c)及⑷純化而來 中 〇 在以上步驟（ii )中，對來源於麥芽汁或啤酒之dna (如（1 )中之詳細描述加以純化）的丨樣品等分試樣進 行擴增。DNA經簡單加熱變性，且接著在含有非特異性結 合至DNA之隨機六聚物的樣品緩衝液中冷卻。添加含^ DNA聚合酶、隨機六聚物、核苷酸、鹽及緩衝液之 Mastermix，且採用20 μί之最終反應體積在3〇t下等溫擴 增2_0小時。隨後，在於65。〇下之1〇分鐘培育期間將聚合 酶加熱去活。 關於以上步驟（iii )，14PCR擴增之參數（包括如 以上（ii)中所述製備之樣品的1·〇或4.2 pL模板等分試樣 及备7 pmol用於偵測無功能型L〇x]突變之引子 (WO 2010/075860 之 SEQ ID NO:1〇)及 FL823 (w〇 2010/075860 之 SEQ IDNO:ll);參看 skadhauge，B 等人之 WO 2010/07 5 860 中之圖 18B )如下： 130 201208586 (i ) 1個循環，在96°C下變性2分鐘. (ii )以下30個循環： (a) 在95°C下變性1分鐘； (b) 在68°C下黏接1分鐘； (c) 在72°C下延伸1分鐘； (iii )最終在72°C下延伸1 〇分鐘； (iv )保持。
以上步驟（w)由在併有漠化乙旋之2%(w/v)壤 凝膠中電泳分離整個PCR混合物組成。電泳後，用“ 照射凝膠並獲取相片（圖10 )。 A 圖1〇中所示之DNA帶型的分析揭示無來自Tub〇rg啤 酒等分試樣之擴增產物，此為預期結果，因為原料具有野 生型起源，亦即並非來源於無功能型L〇x_丨大麥。然而， 在利用包含50%無功能型Loxq麥芽之混合物釀造之啤 酒樣品中可偵測到具有預期長度之擴增產物。類似地（但 更明顯），在由三重無功能型麥芽製備之未煮沸麥芽汁中獲 得染色。可能歸因於熱破壞且在沈澱後，在三重無功能型 原料之煮沸麥芽汁之樣品中較少PCR產物得以擴增。 藉由在各別PCR中用引子對FL1034-FL1039 (分別為 WO 2010/075860 之 SEQ ID NO:9 及 SEQ ID NO:8 ;亦參看 Skadhauge 等人之 WO 2010/075860 中之圖 18 )、引子組 20 (WO 2010/063288 之 SEQ ID ΝΟ··77 及 SEQ ID NO:81 )及引 子組 21 (WO 20 10/063288 之 SEQ ID NO:78 及 SEQ ID NO:82 ;亦參看 Knudsen 等人之 WO 2010/063288 A2 中之圖 131 201208586 15 )但在類似於以上本發明實施例中詳細描述之條件下利 用以上（ii )中所述之擴增產物，可驗證麥芽汁或啤酒樣品 是否是使用三重無功能型原料產生。
農藝學資料之比較[2〇〇9年之田間試驗（在Fyn
Denmark )] L 無功能型無功能型 栽培。〇種栽培品種無功能型無功能型LOXd- L0X4-三重無功 Quench Powei· LQX-l MMT無功能型無功能型 能 播種曰期 4月4曰 4月4曰 4月4 抽穗曰期 6月18日6月15日6月16 成熟時麥稈長度 (cm) 81 84 87 白粉病 0 5 0 斑點病1 2 3 3 葉錄病1 8 1 3 倒伏1 2 6 4 成熟曰期 8月3曰 7月31日 8月1 相對產量（％) 2 103 98 92 千粒重量（g) 49 48 53 蛋白質（％) 3 10.5 10.2 10.3 澱粉（％) 3 63.0 62.1 ω s 榖粒大小（％>2.5 ' mm) ^5.7 92.4 96.8 LOX-2 MMT 曰4月4曰 4月4曰 4月4曰 4月4日 日6月15日 6月16曰 6月16日6月17日 80 87 85 81 0 0 0 0 4 2 3 3 3 3 3 4 4 2 3 3 7月31曰8月1曰8月1曰8月2 93 103 100 101 54 53 47 49 10.5 10.5 10.4 10.5 62.9 62.4 63.1 62.7 94.6 99.2 99.1 95.3 在0至9之量表上，其中〇 表極度感染或倒伏。 代表無感染或倒伏，而9代 3個重複實驗在兩個不同位置與2〇〇9年公佈之丹麥春大 麥（Danish Spring barley )變種混合物產量相比之相對平均 產量。標準混合物產量設定為100❶/❶相對產量。 一 3藉由近紅外透射（NIT)光譜量測。 132 201208586 表2.微量孵麥芽及微量製醪中的DMSP含量 取樣描述項（參看圖6Α) 大麥類型 1 麥芽 2 3 4 甜麥芽汁煮沸之麥芽汁冷卻之麥芽汁 三重無功能 0.2 8 6 無功能型LOX-1-無功能 0.4 37 1 〇 型MMT iy 無功能型LOX-1-無功能 21.3 在40°C下 型 LOX-2 窯式乾燥 無功能型MMT - - - - 無功能型LOX-1 17.3 - - - 野生型栽培品種Power 21.3 2348 950 - 三重無功能 0.2 9 7 - 無功能型LOX-1-無功能 0.1 9 Q 型MMT Ο 無功能型LOX-1-無功能 11.9 在75°C下 型 LOX-2 窯式乾燥 無功能型MMT - - - - 無功能型LOX-1 8.8 - - - 野生型栽培品種Power 7.7 1017 393 - 三重無功能 0.1 4 5 - 無功能型LOX-1-無功能 0.1 7 C 型MMT 0 在85°C下 無功能型LOX-1-無功能 5.7 656 247 窯式乾燥 型 LOX-2 無功能型MMT 0.1 5 4 - 無功能型LOX-1 6.5 684 212 - 野生型栽培品種Power 7.1 880 286 - 133 201208586
表3.微量孵麥芽及微量製醪中的T2N及T2N前驅物（T2N pre·)含量 取樣描述項（參看圖6A) 1 4 大麥類型 麥芽汁 冷卻之麥芽汁 T2N T2N pre. T2N T2N pre. ppb 三重無功能 0.0 2.3 0.1 3.6 無功能型LOX-1-無功能 0.0 4.3 0.1 7.5 型MMT 無功能型LOX-1-無功能 在40°C下 型 LOX-2 窯式乾燥 無功能型MMT - - - - 無功能型LOX-1 - - - 野生型栽培品種Power 0.1 8.3 0.4 15.7 三重無功能 0.1 2.3 0.2 3.3 無功能型LOX-1-無功能 0.1 3.1 0.2 4.9 型MMT 無功能型LOX-1-無功能 在75°C下 型 LOX-2 窯式乾燥 無功能型MMT - - - - 無功能型LOX-1 - - - - 野生型栽培品種Power 0.2 5.2 0.3 8.2 三重無功能 0.1 1.8 0.1 2.5 無功能型LOX-1-無功能 0.1 2.1 0.1 3.1 型MMT 在85°C下 窯式乾燥 無功能型LOX-1 -無功能 型 LOX-2 0.1 1.8 0.1 2.5 無功能型MMT 0.4 4.2 0.4 6.4 無功能型LOX-1 0.1 2.2 0.1 6.6 野生型栽培品種Power 0.2 4.8 0.1 9.0 134 201208586 ' 表4.微量孵麥芽中的DMSP含量 取樣描述項 2 3 3 4 大麥類型 甜麥芽汁 煮沸30分鐘之 麥芽汁 煮沸60分鐘之 麥芽汁 冷卻之麥芽汁 με/L 野生型栽培品種Power 10.9 12.0 6.3 3.8 三重無功能 0.1 0.6 0.6 0.3 表5.兩種類型試驗規模製醪中的DMSP及DMS含量 取樣描述項（參看圖6B 、6C) 1 2 3 4 5 6 7 8 大麥類型 麥芽 在允許蒸發下加熱甜麥芽汁（分鐘； °C) 0 ； 67 22 ； 99 37 ； 101 52 ； 101 67 ； 101 82 ； 101 142；90 pg/L 野生型栽培 DMSP 4.7 725 682 516 369 288 219 101 品種Quench DMS 4.3 93 85 50 47 33 31 127 三重無功能 DMSP DMS 0.1 0.1 3 14 2 13 3 2 11 12 1 11 1 12 1 12 加壓加熱甜麥芽汁（分鐘；°C) 0 ； 69 22 ； 99 37 ; 98 52 ; 98 67 ; 98 82 ; 98 142；80 野生型栽培 DMSP 4.7 564 508 408 340 273 219 161 品種Quench DMS 4.8 51 51 60 64 76 80 164 三重無功能 DMSP DMS 0.0 0.1 15 20 5 20 3 3 19 18 3 19 2 20 2 20 135 201208586 表6.兩種«試驗規模製曝中的T2N前驅* (T2Npre· 及自由T2N之含量 項（參看圖6B、6C) 大麥類型 麥芽 梦下加熱甜麥芽汁(分鐘；°c ) 0〇 · e\e\ H ----- : 99 37 ； lQi 52 ; lQl 67 ； 101 82； 101 142； 90 野生型栽培T2N pre. 品種 Quench T2N 三重無功能T2gfe· 3.6 0.3 1.7 0.1 4.8 0.3 1.9 0.2 PPb 4.3 0.2 1.6 0.1 4.2 0.2 1.4 0.1 3.9 0.1 1.4 0.1 野生型栽培T2Npre. 品種 Quench T2N 三重無功能T2f2fe· 〇 ； 69 22 ； 99 3.8 4.0 0.2 0.2 1.6 1.8 0.2 0.2 加壓加熱甜麥芽汁（分鐘；。C) 3.9 0.1 1.2 0.1 3.7 0.1 1.4 0.1 37 ； 98 3.9 0.2 1.8 0.2 52 ； 98 3.8 0.2 1.6 0.1 67 ； 98 3.8 0.2 1.5 0.1 82 ； 98 142；80 3.8 3.3 0.2 0.2 1.4 1.5 0.1 0.1 表7.新鮮及陳化啤酒中之 DMS、 T2N前驅物及自 由T2N 啤酒培育條件 大麥類型 煮沸類型 新鮮 2 週，37 °C DMS T2N前驅物自由T2N S02 自由T2N (PPb) (PPb) (PPb) (ppm) (PPb) 野生型栽培品 種 Quench 在允許蒸發下 加熱甜麥芽汁 65 3.0 0.025 5 0.041 三重無功能 2 1.3 0.018 3 0.039 野生型栽培品 種 Quench 加壓加熱甜麥 芽汁 151 3.3 0.024 6 0.061 三重無功能 3 1.4 0.020 4 0.039 136 201208586 表8.自野生型栽培品種Quench及三重無功能型麥芽生產 之新鮮啤酒及陳化啤酒的感官評定 大麥類 型 煮沸類 型 新鮮 啤酒培育條件 1 週，37〇C 2週， 37。。 風味評分 1 註釋 陳化評分2 紙味評分2 陳化評分 紙味評分 野生型 栽培品 種 Quench 在允許 蒸發下 加熱甜 麥芽汁 4.4 顯著酸味 稍微氧化 微量DMS 微量硫 輕微酯味 3.1 2.4 2.4 2.1 三重無 功能 4.8 微量硫 微量脂肪酸 2.1 1.6 1.9 1.3 輕微穀味 野生型 栽培品 加壓加 輕微酯味 輕微陳味 熱甜麥 2.8 強烈DMS 3.5 2.3 3.3 2.4 種 Quench 芽汁 輕微貓味 輕微穀味 輕微穀味 三重無 4.8 輕微果味 2.6 1.9 1.9 1.1 功能 輕微酸味 輕微陳味 在1至9之量表上，其中9最佳 在0至5之量表上，其中0表示新鮮啤酒，而5表示極 度陳化之啤酒 3 在〇至5之量表上，其中5表示紙味極重之啤酒 137 201208586 表9.實驗綜述 乾燥/窯烘 煮沸 釀造編號 栽培品種 程式 固化溫度 容器 蒸發 rc) (%) 1 Rosalina 正常 85 開放 4.5 2 三重無功 能 正常 85 開放 4.5 3 Rosalina 正常 85 密閉 0 4 三重無功 能 正常 85 密閉 0 5 Rosalina 低溫 75 開放. 4.5 6 三重無功 能 低溫 75 開放 4.5 表10.麥芽樣品中之DMS 及 DMSP 乾燥/熏烘 DMS (mg/kg) DMSP (mg/kg) 栽培品種 程式 固化溫度 fc) Rosalina 正常 85 4.1 4.7 Rosalina 低溫 75 2.8 16.2 三重無功能 正常 85 <DL* <DL* 三重無功能 低溫 75 <DL* <DL* *低於偵測極限 表11.兩種類型試驗規模煮沸中的DMSP及DMS含量 在85°C下之正常籽粒乾燥及在開放容器中允許蒸發加 熱麥芽汁 取樣描述項（參看圖6) 大麥類型 1 2 3 4 5 7 加熱甜麥芽汁（分鐘；°C) 0 ； 67 22 ； 99 37 ； 100 52 ； 100 82 ； 100 142 ； 90 野生型栽培品種Rosalina ^SSP -a …& DMSP 二重功此 DMS 1245 212 痕量 痕量 1257 882 759 415 208 190 102 56 31 178 - - - - 痕量 - - - - 痕量 138 201208586 . 表11 (續）.兩種類型試驗規模煮沸中的DMSP及DMS含 量 在85°C下之正常籽粒乾燥及在密閉容器中在不蒸發下 加熱麥芽汁 取樣描述項（參看圖6) 1 2 3 4 5 7 大麥類型 加熱甜麥芽汁（分鐘；°C ) 0 ； 67 22 ； 99 37 ； 100 52 ； 100 82 ； 100 142 ； 90 μβ/L 野生型栽培品種Rosalina DMSP DMS 1180 183 1061 732 576 398 227 410 412 471 274 709 三重無功能 DMSP DMS 痕量 痕量 _ _ _ _ 痕量 痕量 表11 (續）.兩種類型試驗規模煮沸中的DMSP及DMS含 量 在75°C下低溫乾燥籽粒及在開放容器中在允許蒸發下 加熱麥芽汁。 取樣描述項（參看圖6) 1 2 3 4 5 7 大麥類型 加熱甜麥芽汁（分鐘；°C) 0 ； 67 22 ； 99 37 ； 100 52 ； 100 82 ； 100 142 ； 90 μβ/L 野生型栽培品種Rosalina DMSP DMS 1825 155 1665 V .1262 178 74 1005 611 32 27 376 154 三重無功能 DMSP DMS 11 4 - - - 2 4 139 201208586 表12.使用不同窯烘及煮沸方案生產之試驗規模麥芽汁中 的T2N前驅物（T2N pre )及自由T2N之含量 大麥類型 加熱開始時 經.加熱之麥芽汁 煮沸類型*) T2N T2N pre T2N T2N pre (ppb) (ppb) (ppb) (ppb) 在85°C下正常乾燥 野生型栽培品種Rosalina開放容器，允許蒸發 0.39 5.3 0.21 4.2 三重無功能 開放容器，允許蒸發 0.24 1.8 0.08 1.8 野生型栽培品種Rosalina 密閉容器，無蒸發 0.40 5.3 0.36 4.1 三重無功能 密閉容器，無蒸發 0.28 2.2 0.11 1.8 在75°C下低溫乾燥 野生型栽培品種Rosalina開放容器，允許蒸發 0.21 4.4 0.27 4.7 三重無功能 開放容器，允許蒸發 0.31 1.9 0.18 1.8 *)縮寫：開放容器 (ves. op )或密閉容器（ves .clo.) :無 蒸發(no. evap.) 或允許蒸發（evap. ) 表13.新鮮及陳化啤酒中的 DMS及 自由 T2N 大麥類型 煮沸類型*) DMS自由T2N (PPb) (ppb) S〇2 (ppm) 自由 T2N ***) (ppb) 在85°C下正常乾燥 野生型栽培品種 Rosalina 開放容器，允許蒸發 117 0,011 5 0.055 三重無功能 開放容器，允許蒸發 1 0.011 5 0.018 野生型栽培品種 Rosalina 密閉容器，無蒸發 326 0.011 5 0.035 三重無功能 密閉容器，無蒸發 2 0.012 4 0.017 在75°C下低溫乾燥 野生型栽培品種 Rosalina 開放容器，允許蒸發 174 - 10 - 三重無功能 開放容器，允許蒸發 5 - 5 - *)縮寫：開放容器（ves. op) 或密閉容器 ( ves. clo.):無 蒸發（no.evap.)或允許蒸發（evap·) * *)新鮮啤酒 "*)在37°C下培育2週之啤酒 140 201208586 ' 表14.由野生型栽培品種Rosalina及三重無功能型麥芽生 產之新鮮啤酒及陳化啤酒的感官評定_ 啤酒培育條件 大麥類型 煮沸類型*) 新鮮 37°C下2週 風味評分1 ΪΪΜ 陳化評分2紙味評分3 野生型栽培 品種 Rosalina 三重無功能 野生型栽培 品種 Rosalina 開放容器， 開放容器， 密閉容器 允許蒸發 允許蒸發 ，無蒸發 籽粒在85°C下正常乾燥 微量硫 3.4 5.7 3.1
顯著DMS 輕微回苦 強烈DMS 三重無功能密閉容器，無蒸發 開放㈣，允許蒸發 品種 Rosalina 三重無功能開放容器，允許蒸發 輕微酸味 輕微啤酒花味 輕微苦澀 輕微穀味 籽粒在75°C下低溫乾燥 輕微果味 顯著DMS 輕微苦味 輕微酸性 5.0 4.8 5.2 2.4 1 2.7 2.0 2.1 0.7 *)縮寫：開放容器（ves. op)或密閉容器（ves. clo.):無 蒸發（no.evap.)或允許蒸發（evap.) 1在1至9之量表上，其中9最佳 2 在0至5之量表上，其中0表示新鮮啤酒，而5表示極 度陳化之啤酒 3 在0至5之量表上，其中5表示紙味極重之啤酒
141 S 201208586 I5.由栽培品種R0sallna及三重無功能型突變體之麥芽 生產之啤酒中的THA。 煮沸類型 j 85°C下正i款嬋 9.12.13-H〇dea 9.10.13-Hodea 9.12.13-Hodea/ (mg/1) 9.10.13-Hodea 開放容器，允許蒸發 3.68 0.84 4.4 開放容器，允許蒸發 0.75 0.29 2.5 密閉容器，無蒸發 3.28 0.78 4.2 密閉容器，無蒸發 0.51 0.23 2.2 在75°C下低溫乾燥 開放容器，允許蒸發 3.77 0.8. 4.7 0.49 0.22 2.2 大麥類型 野生型栽培品種 Rosalina 三·重無功能 野生型栽培品種 Rosalina 三重無功能 野生型栽培品種 Rosalina 無功能 )縮寫：開放容器（ves. op)或密閉容器（ves cl〇 );無 蒸發（no. evap.)或允許蒸發（evap ) 查_16序列砉 seqIdI^ NO — . SEQID N〇：l SEQID N〇：2 seqid N0：3 seqId N〇：4 ----— SEQID N〇：5 --— SEQID N0：6 SEQID N〇：7 seqId 國際專利申請案wo 2005/087934之 SEQ ID NO:4 對應於
國際專利申請案wo 2005/087934之 SEQID NO: 1 國際專利申請案WO 2005/087934之 SEQIDNO.-2 國際專利申請案WO 2005/087934之 SEQ ID NO:3 國際專利申請案PCT/DK2009/050355 (公開為 WO 2010/075860 )之 SEQ ID __NOl_
國際專_ 請案 PCT/DK2009/050355 (公開為 WO 2010/075860)之 SEQ ID ___NO:2_
國際申請案 PCT/DK2009/050355 (公開為 WO 2010/075860 )之 SEQ ID —__NO:5_ 申請案 PCT/DK2009/050355 描述 涵蓋編碼LOX-1之基因之起始密碼子 及終止密碼子的栽培品種Barke之大麥 _ gDNA。 涵蓋編碼栽培品種Barke之LOX-1之相 應基因之起始密碼子及終止密碼子之 間的區域的突變體D112之大麥gDNA» 栽培品種Barke之全長LOX-1蛋白之蛋 白質序列。 突變體D112之無活性截短LOX-1之蛋 白質序列 - —--—--- 來自栽培品種Barke之編碼LOX-2之野 生型基因體DNA之序列。 來自大麥突變體A689之突變型LOX-之 基因體DNA之序列。 野生型大麥栽培品種Barke之全長 LOX-2蛋白之序列。 來自大麥突變體A689之缺乏LOX-2~ljr 142 201208586 NO:8 (公開為 WO 2010/075860)之 SEQ ID ---- NO:6 性之哭變型LOX-2蛋白之序列。 SEQID NO:9 國際專利申請案PCT/DK2009/050315 (公開為 WO 2010/063288 )之 SEQ ID —NO:3 栽培品種Prestige之大麥gDNA，涵蓋 MMT基因之起始密碼子及終止密碼子 的基因體序列。 SEQID NO:10 幽際專利申請案PCI7DK2009/050315 (公開為 WO 2010/063288 )之 SEQ ID __ NO:8 突變體8U6：3之大麥gDNA，涵蓋MMT 基因之起始密碼子及終止密碼子的 MMT基因體序列。 SEQID NO: 11 國際專利申請案PCT/DK2009/050315 (公開為 WO 2010/063288 )之 SEQ ID _ NO* 16 栽培品種Sebastian之大麥gDNA，涵蓋 MMT基因之起始密碼子及終止密碼子 的MMT基因體序列。 SEQID NO: 12 國際專利申請案PCT/DK2009/050315 (公開為 WO 2010/063288 )之 SEQ ID _______ NO: 19 哭變體14018之大麥gDNA，涵蓋MMT 基因之起始密碼子及終止密碼子的 MMT基因體序列。 SEQID NO: 13 國際專利申請案PCT/DK2009/050315 (公開為 WO 2010/063288 )之 SEQ ID --- NO:6 栽培品種Prestige之大麥MMT序列。 SEQID NO:14 國際專利申請案PCT/DK2009/050315 (公開為 WO 2010/063288 )之 SEQ ID NO: 18 栽培品種Sebastian之大麥MMT序列 SEQID NO: 15 國際專利申請案PCT/DK2009/050315 (公開為 WO 2010/063288 )之 SEQ ID NO:22 來源於突變體H018之錯誤剪接RNA 的完整轉譯序列。 SEQID NO: 16 囤際專利申請案PCT/DK2009/050315 (公開為 WO 2010/063288 )之 SEQ ID NO:24 來源於大麥突變體14018之錯誤煎接 RNA的完整轉譯序列。 SEQID NO: 17 國際專利申請案PCT/DK2009/050315 (公開為 WO 2010/063288 )之 SEQ ID NO-.26 來源於大麥突變體14018之錯誤剪接 RNA的完整轉譯序列。 所引用之參考文獻 專利文獻
Mullis，κ.Β·等人之美國專利第4.683.195號 Mullis，K.B.等人之美國專利第4.800.159號 Douma，A.C.等人之PCT專利申請案WO 02/053721 Breddam，K.等人之 PCT 專利申請案 WO 2005/087934 Hirota，N.等人之歐洲專利第EP 1609866號 Knudsen，S.等人之 PCT/DK2009/050315 143 201208586
Skadhauge，B.等人之 PCT/DK2009/050355 其他出版物
American Association of Cereal Chemists, 「Approved methods of the American Association of Cereal Chemists.」 ISBN 0-913250-86-4 (1995)。
American Society of Brewing Chemists, 「Methods of analysis of the American Society of Brewing Chemists.」 ISBN 1-881696-01-4 (1992)。
Baur, C.及 Grosch, W., 「Investigation about the taste of di-, tri- and tetrahydroxy fatty acids.」 Z. Lebensm. Unters. Forsch. 165: 82-84 (1977)。
Baur, C.等人， 「Enzymatic oxidation of linoleic acid: Formation of bittertasting fatty acids.」 Z. Lebensm. Unters. Forsch. 164:17 卜 176 (1977)。 B. Bonacchelli, C. De Brackeleire 及 F. Harmegnies 「Wort boiling -the Meura's concept with wortstripping」 Proceedings of the 31st International Congress of the European Brewery Convention Venice, Italy, 2007 年 5 月 6 日至 10 曰，Contribution no.58, ISBN 978-90-70143-24-4。
Briggs, D.E.等人，「Malting and brewing science.第 I 卷 Malt and sweet wort.」Chapman 及 Hall. New York. USA. ISBN 0412165805 (1981)。
Durai, S·等人， 「 Zinc finger nucleases: 144 201208586 custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells.」 Nucleic Acids Res. 33:5978-5990 (2005) »
European Brewery Convention. 「Analytica-EBC.」 ISBN 3-418-00759-7 (1998) 〇
Groenqvist，A.等人，r Carbonyl compounds during beer production in beer.」Proceedings of the 24th EBC Congress, Oslo,第 421-428 頁（1993) »
Hamberg，M.， 「Trihydroxyoctadecenoicacidsinbeer: Qualitative and quantitative analysis.」J. Agric. Food Chem. 39:1568-1572 (1991)。
Hansen, M.等人， 「Antisense-mediated suppression of C-hordein biosynthesis in the barley grain results in :.-correlated changes in the transcriptome, protein profile, and amino acid composition.」 J. Exp. Bot. 58:3987-3995 (2007)。
Hough，J.S.等人，「Malting and brewing science.第 II 卷 Hopped wort and beer.」 Chapman 及 Hall, New York, USA. ISBN 0412165902 (1982)。
Iida, S.及 Terada, R., 「Modification of endogenous natural genes by gene targeting in rice and other higher plants·」 Plant Mol. Biol. 59:205-21 9 (2005) o
Institute of Brewing, 「Institute of Brewing. Methods of analysis·」 ISBN 0-900489-10-3 (1 997)。 145 201208586
Jamieson, A.Μ.及 van Gheluwe, J.E.A., 「Identification of a compound responsible for cardboard flavor in beer·」 Proc. Am. Soc. Brew. Chem. 29:192-197 (1970)。
Kleinhofs, Α·等人，r Induction and selection of specific gene mutations in Hordeum and Pisum.」 Mut. Res. 5 1:29-35 (1978) 〇
Kumar, S.等人， 「Gene targeting in plants: fingers on the move.」 Trends Plant Sci. 1 1:1 59-1 6 1 (2006) 0
Kuroda，H.等人， 「Characterization of factors involved in the production of 2(E)-nonenal during mashing.」 Biosci. Biotechnol. Biochem. 67:691-697 (2003)。
Kuroda, H.等人， 「Characterization of 9-fatty acid hydroperoxide lyase-like activity in germinating barley seeds that transforms 9(S)-hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadienoic acid into 2(E)-nonenal. 」 Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:1661-1668(2005)。
Lermusieau, G.等人， 「Nonoxidative mechanism for development of trans-2-nonenal in beer·」 J. Am. Soc. Brew. Chem. 57:29-33 (1999)。
Li0geois，C·等人，「Release of deuterated (E)-2-nonenal during beer aging from labeled precursors synthesized before boiling·」J. Agric. Food Chem. 50:7634-7638 (2002) °
Maquat, L.E.及 Carmichael, G.G., 「Quality control of 146 201208586 _ mRNA function, j Cell 1 04:1 73-1 76(200 1) 〇
Meilgaard, M：C., 「Flavor chemistry of beer: Part II:
Flavor and threshold of 239 aroma volatiles.」 Tech. Q. MBAA 12:15卜167 (1975)。
Mended, J.T.及 Dietz, H.C·.， 「When the message goes awry: Disease-producing mutations that influence mRNA content and performance.」Cell 107:4 1 1-4 14 (2002)。
Nevo，E.， 「Resources for Breeding of Wild Barley·」， 「Barley: Genetics. Biochemistry. Molecular Biology and Biotechnology·」 Shewry. P.R.,編，第 3-18 頁.C.A.B. International. ISBN 0-85 198-725-7 (1992)。
Nyborg, M.等人， 「Investigations of the protective mechanism of sulfite against beer staling and formation of adducts with trans-2-nonenal.」 J. Am. Soc. Brew. Chem. 57:24-28(1999)。
Rasmussen, S.K·及 Hatzack，F” 「Identification of two low-phytate barley (Hordeum vulgare L.) grain mutants by TLC and genetic analysis.」Hereditas 129:1 07-1 1 2 (1 998)。
Robbins，M.P.等人， 「Gene manipulation of condensed tannins in higher plants. 」 Plant Physiol. 116:1133-1144(1998)。
Sambrook，J.及 Russell. D.W.， 「Molecular Cloning. A
Laboratory Manual.第 3 版」，Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. ISBN 147 201208586 0-87969-577-3(2001)。
Schmitt, N.F.及 van Mechelen. J.R.， 「Expression of lipoxygenase isoenzymes in developing barley grains.」 Plant Sci. 128:141-150 (1997)。
Stahl，Y.等人，r Antisense downregulation of the barley limit dextrinase inhibitor modulates starch granule sizes distribution, starch composition and amylopectin structure」· Plant J. 39:599-61 1 (2004) °
Tzfira, T·及 White. C, 「Towards targeted mutagenesis and gene replacement in plants.」 Trends Biotechnol. 23:567-569 (2.005) ° von Bothmer, R.等人， 「Diversity in barley (Hordeum vulgare).」，「Diversity in Barley (Hordeum vulgare).」 von Bothmer, R·，van Hintum，T·，Kntipffer，H·，Sato. K·，編，第 129-136 頁.ISBN 0-444-50587-7 (2003)。亦可在 http://www.genres.de/獲知。
Wackerbauer, K.及 Meyna， S.， 「Freie und triglyceride-gebundene Hydroxy fettsauren in Gerste und Malz」，Monatsschrift fiir Brauwissenschaft，heft 3/4: 52-57 (2002)。
Wu，J.等人，「Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) silences the accumulation of aberrant trypsin proteinase inhibitor mRNA in Nicotiana attenuata.」 Plant J. 51:693-706 (2007) ° 148 201208586 【圖式簡單說明】 圖1呈示形成T2N ( A )及SMM ( B )之大麥生物化學 路徑之簡化概觀。三重無功能型大麥中不存在之酶在黑框 中突出顯示。酶縮寫如本申請案中所定義。圖1B顯示SMM 循環之所選組分，其中SMM係由酶Met-S-甲基轉移酶 (MMT )催化甲基自S-腺苷甲硫胺酸（S am )轉移至甲硫 胺酸（Met)而合成。SMM又可充當在酶Hcy-S-曱基轉移 酶（HMT )催化之反應中由高半胱胺酸（Hcy )合成Met 之曱基供體。該說明展示該等基本上不可逆之反應以何種 方式連接。該循環之各輪轉換並無實際意義，因為其消耗 且接著再生兩個Met的同時將ATP轉化成腺苷、PPi及Pi (未圖示）。 圓2展示用於驗證突變體8〇63及突變體14〇18之無功 能型MMT表型的HPLC實驗之結果。（A)關於來自栽培品 種Prestige之芽的萃取物的基於hplc之分離的一實例，其 顯不天冬胺酸（Asp )、麩胺酸（Glu )、天冬醯胺（Asn )、 絲胺酸（Ser)及SMM之溶離。經〇pA衍生化之大麥芽萃 取物之螢光在340 nm下激發且在45 0 nm下量測發射。（B) 來自指定突變體及野生型栽培品種Sebastian之萃取物的基 於HPLC之分離。突變體萃取物之組分的分離提供無 特異性峰的層析圖。 圖3說明由無功能型LOX-1無功能型LOX-2 (雙重無 功能型LOX)與無功能型MMT大麥植物雜交產生三重無功 149 201208586 能型大麥之工作流程》 圖4關注來源於指定植物的樣品中的L〇x活性。成熟 大麥籽粒之總LOX活性測定的結果以灰色柱條顯示，而 色柱條指示萌芽胚中之LOX-2法，卜士 X. , A., 八z /古性。在無功能型L〇x_i_ 無功能型LOX-2才直物及三重無功能型植物中觀察到極低 LOX活性。 圈5說明萌芽之三重無功能型植物不能合成smm (上 圖，其中UPLC層析圖中不存在相應峰），而根據相應層析 圖峰在萌芽之野生型大麥栽培品種Quench中可容易地偵 測到該化合物（下圖）。指示所選胺基酸之溶離位置。 圖6圖解詳述微量孵麥芽及微量製醪（A)之工作流程， 以及由野生型大麥（B)及三重無功能型突變體（c)之籽 粒進行試驗孵麥芽.、試驗製醪及試驗釀造的工作流程。個 別樣品之流程以箭頭說明。起始物、中間物及最終產物在 清單頂部以粗體字型式標記；製程以斜體字型式表示。在 (A )中，流程清單下方以斜體表示之數字是指用於測定自 由T2N及其前驅物（2及4)以及DMSP及DMS ( 1、2、3 ) 之含量的取樣點’其中量測點4代表已冷卻之經加熱麥芽 汁。對於大麥粉之微量製醪，在取樣點2、3及4處量測樣 品。在（B )及（C )中，測定所有取樣點處之dmSP、DMS、 T2N前驅物及自由T2N含量。 圖7顯示由三重無功能型麥芽製造之啤酒與野生型栽 培品種Quench之麥芽所釀造之啤酒相比產生多約4倍啤酒 沫’不論是加壓麥芽汁煮沸抑或常壓麥芽汁煮沸。 150 201208586 • 圖8提供—個關於經祕3突變誘發之大麥籽粒可以何 種方式繁殖的實例。使世代刚之杆粒生長成植物，該植物 產生世Κ M1之籽粒。可播種此等籽粒以使其發育成M1植 物，該等Mi植物產生新的世代M2軒粒。接著，Μ〗植物 生長並產生世代M3之軒粒。可使世代M3之籽粒萌芽，例 如以供分析萌芽之M3植物的胜芽勒。此外，可使用來源於 M3植物籽粒之花與大麥品系或裁培品種雜交以獲得世代 M4之植物。Breddam，κ等人之pCT專利申請案㈣ 2005/087934中之圖1A提供相似圖式。 圖9展示較佳啤酒生產製程之簡化示意性概觀，其包 括浸泡大麥穀粒⑴、孵麥芽⑺、窯式乾燥⑺、研磨 經乾燥之麥芽（4)、製駿（5)、過據（6)、在添加啤酒花 存在下進行麥芽汁㈣⑺、在酵母存在下進行輯⑴、 啤酒成i⑺、啤酒_ (1G)、封裝（諸如封裝於瓶子、 罐子或其類似物中）（⑴及貼標籤（12)。個別製程可按段 分組，包含麥芽生產（1_3)、麥芽汁生產（4_7)、撥酵（Μ) 及製備成品啤酒（10_12)。儘管已說明較佳方法，但可預見 省略-些所描繚步驟之其他方& (例如可省略過濟，或可 不添加啤酒花，或可添加其他步驟，諸如添加佐劑、糖、 糖漿或碳酸鹽）。 圖10說明在使用無功能型LOX-1原料生產之味酒（包 含5〇% I功能型L0X-1之混合物）及麥芽汁樣〇口（三重盔 功能）巾如何鑑別無功能型L0X_ i來源之DNA片口段，而^ 在使用正常麥芽與野生型大麥（Tuborg)之混合物之麵粉生 151 201208586 產之嗱酒中鑑別。指示最終PCR擴增之模板體積。 【主要元件符號說明】 無 152 201208586 序列表 <110> 嘉士伯啤酒廠公司 海尼根供給鏈公司 <120> 節能釀造之方法 <130> P2253PC00 <160> 17 <170> Patentln第3.5版 <210> <211〉 <212〉 <213> 1 4165 DNA 大麥栽培品種Barke <400> 1 atgctgctgg gagggctgat cgacaccctc acgggggcga acaagagcgc ccggctcaag 60 ggcacggtgg tgctcatgcg caagaacgtg ctggacctca acgacttcgg cgccaccatc 120 atcgacggca tcggcgagtt cctcggcaag ggcgtcacct gccagcttat cagctccacc 180 gccgtcgacc aaggtaatca ctaccctcct ccggccttct cctctgttta caagatatag 240 tatttctttc gtgtgggccg gcggccatgg atggatggat gtgtctggat cggctaaaga 300 agataggata gctagccctg gccggtcgtc tttacctgag catgggcata tgccatcgaa 360 aaaagagaca acagcatgca tgcatggtgc gcgcaccaga ccacgcagag caccggatgc 420 tcgagacaaa gcaacacaac aagcaaggac gacacgtcaa aagcaacaca acaagcaagg 480 acggcacgtc aaaagcaaca caaacctaaa ctaaagcaca aagacgtaag agcaagcaca 540 caatcagcag gctataaaca gttgtcatca aaaacaacgc tggaagagag agagaaggaa 600 ggaagtagta gccatgaaaa attaaatcac cgggcgttgc tctttgccca acaattaatc 660 aagcaggata cgtggcatgt atagttcttg taagtaaact aagcatgtga tatgagaagg 720 tacgtggtgg tgcagacaac ggcggtcgcg ggaaggtggg cgcggaggcg gagctggagc 780 agtgggtgac gagcctgccg tcgctgacga cgggggagtc caagttcggc ctcaccttcg 840 actgggaggt ggagaagctc ggggtgccgg gcgccatcgt cgtcaacaac taccacagct 900 ccgagttcct gcttaaaacc atcaccctcc acgacgtccc cggccgcagc ggcaacctca 960 ccttcgtcgc caactcatgg atctaccccg ccgccaacta ccgatacagc cgcgtcttct 1020 tcgccaacga cgtgcgtgga ttttcctcta ctttcctctc ctttcatttt caccgccttc 1080 gtcattcatg gtcgatcatt aagtcttgcc aggacaatag atgatgagct aggagtggtt 1140 accacttagc agtacgtaca ttatttattc cgtgttggta gaaaaggata tggtttggtg 1200 cagatcgaca caagattgaa tgaaagttgc accgtggcac cgtggcagcg tggtaggtga 1260 aaataactgt tgcacggatc cacccacatg attgttttca tgaataaact ttttaaggat 1320 gtgtctagcc acatctagat gcatgtcaca taattattgc ataccaaaac gattaaatta 1380 201208586 agcataaaaa gaaaaggaaa aaaatactca catatctcga cgtaagatca atgatatagt 1440 atttagatat gcaatattta tcttacatct aaacctttct tcattcctaa atataagaca 1500 tttgtaagat ttcactatgg acaacatacg aaacaaaatc agtggatctc tctatgcatt 1560 cattatgtag tctataataa aatctttaaa agatcgtata ttttgcaacg gagggagtaa 1620 aacataactt tttaatagta atgttgcacg gctccacact cgcagacgta cctgccgagc 1680 cagatgccgg cggcgctgaa gccgtaccgc gacgacgagc tccggaacct gcgtggcgac 1740 gaccagcagg gcccgtacca ggagcacgac cgcatctacc gctacgacgt ctacaacgac 1800 ctcggcgagg gccgccccat cctcggcggc aactccgacc acccttaccc gcgccgcggc I860 cgcacggagc gcaagcccaa cgccagcgac ccgagcctgg agagccggct gtcgctgctg 1920 gagcagatct acgtgccgcg ggacgagaag ttcggccacc tcaagacgtc cgacttcctg 1980 ggctactcca tcaaggccat cacgcagggc atcctgccgg ccgtgcgcac ctacgtggac 2040 accacccccg gcgagttcga ctccttccag gacatcatca acctctatga gggcggcatc 2100 aagctgccca aggtggccgc cctggaggag ctccgtaagc agttcccgct ccagctcatc 2160 aaggacctcc tccccgtcgg cggcgactcc ctgcttaagc tccccgtgcc ccacatcatc 2220 caggagaaca agcaggcgtg gaggaccgac gaggagttcg cacgggaggt gctcgccggc 2280 gtcaacccgg tcatgatcac gcgtctcacg gtgagtcagc gattatttgt tcattgtgtg 2340 tgtatggtgt ccatggtgag aaagtgcaga tcttgatttg cgttgggtcg catgcacgca 2400 tgctgcatgc atgcaggagt tcccgccaaa aagtagtctg gaccctagca agtttggtga 2460 ccacaccagc accatcacgg cggagcacat agagaagaac ctcgagggcc tcacggtgca 2520 gcaggtaatt ggtccaagcc atcgacatca actatgattt acctaggagt aattggtagc 2580 tgtagataat ttggcttcgt tgcaattaat ttgatgctgg ccgatcaagt gatcgtattg 2640 ggtttgaaat ttgcaggcgc tggaaagcaa caggctgtac atccttgatc accatgaccg 2700 gttcatgccg ttcctgatcg acgtcaacaa cctgcccggc aacttcatct acgccacgag 2760 gaccctcttc ttcctgcgcg gcgacggcag gctcacgccg ctcgccatcg agctgagcga 2820 gcccatcatc cagggcggcc ttaccacggc caagagcaag gtttacacgc cggtgcccag 2880 cggctccgtc gaaggctggg tgtgggagct cgccaaggcc tacgtcgccg tcaatgactc 2940 cgggtggcac cagctcgtca gccactggta cgttctccac ggtcgatgtg attcagtcag 3000 tcgatgcaca acaactgatc gaaatatgat tgattgaaac gcgcaggctg aacactcacg 3060 cggtgatgga gccgttcgtg atctcgacga accggcacct tagcgtgacg cacccggtgc 3120 acaagctgct gagcccgcac taccgcgaca ccatgaccat caacgcgctg gcgcggcaga 3180 cgctcatcaa cgccggcggc atcttcgaga tgacggtgtt cccgggcaag ttcgcgttgg 3240 ggatgtcggc cgtggtgtac aaggactgga agttcaccga gcagggactg ccggacgatc 3300 tcatcaagag gtacgtacct ggtaaatgtt atgaatgtgt aaaacaaatt gggcgtctcg 3360 2 201208586 ctcactgaca ggaacgtggt aaaaaaaatg caggggcatg gcggtggagg acccgtcgag 3420 cccgtacaag gtgcggttgc tggtgtcgga ctacccgtac gcggcggacg ggctggcgat 3480 ctggcacgcc attgagcagt acgtgagcga gtacctggcc atctactacc cgaacgacgg 3540 cgtgctgcag ggcgatacgg aggtgcaggc gtggtggaag gagacgcgcg aggtcgggca 3600 cggcgacctc aaggacgccc catggtggcc caagatgcaa agtgtgccgg agctggccaa 3660 ggcgtgcacc accatcatct ggatcgggtc ggcgctgcat gcggcagtca acttcgggca 3720 gtacccctac gcggggttcc tcccgaaccg gccgacggtg agccggcgcc gcatgccgga 3780 gcccggcacg gaggagtacg cggagctgga gcgcgacccg gagcgggcct tcatccacac 3840 catcacgagc cagatccaga ccatcatcgg cgtgtcgctg ctggaggtgc tgtcgaagca 3900 ctcctccgac gagctgtacc tcgggcagcg ggacacgccg gagtggacct cggacccaaa 3960 ggccctggag gtgttcaagc ggttcagcga ccggctggtg gagatcgaga gcaaggtggt 4020 gggcatgaac catgacccgg agctcaagaa ccgcaacggc ccggctaagt ttccctacat 4080 gctgctctac cccaacacct ccgaccacaa gggcgccgct gccgggctta ccgccaaggg 4140 catccccaac agcatctcca tctaa 4165 <210> 2 <211> 4165 "<212> DNA <213> 大麥突變體D112 <400> 2 i atgctgctgg gagggctgat cgacaccctc acgggggcga acaagagcgc ccggctcaag 60 •ggcacggtgg tgctcatgcg caagaacgtg ctggacctca acgacttcgg cgccaccatc 120 atcgacggca tcggcgagtt cctcggcaag ggcgtcacct gccagcttat cagctccacc 180 gccgtcgacc aaggtaatca ctaccctcct ccggccttct cctctgttta caagatatag 240 tatttctttc gtgtgggccg gcggccatgg atggatggat gtgtctggat cggctaaaga 300 agataggata gctagccctg gccggtcgtc tttacctgag catgggcata tgccatcgaa 360 aaaagagaca acagcatgca tgcatggtgc gcgcaccaga ccacgcagag caccggatgc 420 tcgagacaaa gcaacacaac aagcaaggac gacacgtcaa aagcaacaca acaagcaagg 480 acggcacgtc aaaagcaaca caaacctaaa ctaaagcaca aagacgtaag agcaagcaca 540 caatcagcag gctataaaca gttgtcatca aaaacaacgc tggaagagag agagaaggaa 600 ggaagtagta gccatgaaaa attaaatcac cgggcgttgc tctttgccca acaattaatc 660 aagcaggata cgtggcatgt atagttcttg taagtaaact aagcatgtga tatgagaagg 720 tacgtggtgg tgcagacaac ggcggtcgcg ggaaggtggg cgcggaggcg gagctggagc 780 agtgggtgac gagcctgccg tcgctgacga cgggggagtc caagttcggc ctcaccttcg 840 actgggaggt ggagaagctc ggggtgccgg gcgccatcgt cgtcaacaac taccacagct 900 201208586 ccgagttcct gcttaaaacc atcaccctcc acgacgtccc cggccgcagc ggcaacctca 960 ccttcgtcgc caactcatgg atctaccccg ccgccaacta ccgatacagc cgcgtcttct 1020 tcgccaacga cgtgcgtgga ttttcctcta ctttcctctc ctttcatttt caccgccttc 1080 gtcattcatg gtcgatcatt aagtcttgcc aggacaatag atgatgagct aggagtggtt 1140 accacttagc agtacgtaca ttatttattc cgtgttggta gaaaaggata tggtttggtg 1200 cagatcgaca caagattgaa tgaaagttgc accgtggcac cgtggcagcg tggtaggtga 1260 aaataactgt tgcacggatc cacccacatg attgttttca tgaataaact ttttaaggat 1320 gtgtctagcc acatctagat gcatgtcaca taattattgc ataccaaaac gattaaatta 1380 agcataaaaa gaaaaggaaa aaaatactca catatctcga cgtaagatca atgatatagt 1440 atttagatat gcaatattta tcttacatct aaacctttct tcattcctaa atataagaca 1500 tttgtaagat ttcactatgg acaacatacg aaacaaaatc agtggatctc tctatgcatt 1560 cattatgtag tctataataa aatctttaaa agatcgtata ttttgcaacg gagggagtaa 1620 aacataactt tttaatagta atgttgcacg gctccacact cgcagacgta cctgccgagc 1680 cagatgccgg cggcgctgaa gccgtaccgc gacgacgagc tccggaacct gcgtggcgac 1740 gaccagcagg gcccgtacca ggagcacgac cgcatctacc gctacgacgt ctacaacgac 1800 ctcggcgagg gccgccccat cctcggcggc aactccgacc acccttaccc gcgccgcggc 1860 cgcacggagc gcaagcccaa cgccagcgac ccgagcctgg agagccggct gtcgctgctg 1920 gagcagatct acgtgccgcg ggacgagaag ttcggccacc tcaagacgtc cgacttcctg 1980 ggctactcca tcaaggccat cacgcagggc atcctgccgg ccgtgcgcac ctacgtggac 2040 accacccccg gcgagttcga ctccttccag gacatcatca acctctatga gggcggcatc 2100 aagctgccca aggtggccgc cctggaggag ctccgtaagc agttcccgct ccagctcatc 2160 aaggacctcc tccccgtcgg cggcgactcc ctgcttaagc tccccgtgcc ccacatcatc 2220 caggagaaca agcaggcgtg gaggaccgac gaggagttcg cacgggaggt gctcgccggc 2280 gtcaacccgg tcatgatcac gcgtctcacg gtgagtcagc gattatttgt tcattgtgtg 2340 tgtatggtgt ccatggtgag aaagtgcaga tcttgatttg cgttgggtcg catgcacgca 2400 tgctgcatgc atgcaggagt tcccgccaaa aagtagtctg gaccctagca agtttggtga 2460 ccacaccagc accatcacgg cggagcacat agagaagaac ctcgagggcc tcacggtgca 2520 gcaggtaatt ggtccaagcc atcgacatca actatgattt acctaggagt aattggtagc 2580 tgtagataat ttggcttcgt tgcaattaat ttgatgctgg ccgatcaagt gatcgtattg 2640 ggtttgaaat ttgcaggcgc tggaaagcaa caggctgtac atccttgatc accatgaccg 2700 gttcatgccg ttcctgatcg acgtcaacaa cctgcccggc aacttcatct acgccacgag 2760 gaccctcttc ttcctgcgcg gcgacggcag gctcacgccg ctcgccatcg agctgagcga 2820 201208586 gcccatcatc cagggcggcc ttaccacggc caagagcaag gtttacacgc cggtgcccag 2880 cggctccgtc gaaggctggg tgtgggagct cgccaaggcc tacgtcgccg tcaatgactc 2940 cgggtggcac cagctcgtca gccactggta cgttctccac ggtcgatgtg attcagtcag 3000 tcgatgcaca acaactgatc gaaatatgat tgattgaaac gcgcaggctg aacactcacg 3060 cggtgatgga gccgttcgtg atctcgacga accggcacct tagcgtgacg cacccggtgc 3120 acaagctgct gagcccgcac taccgcgaca ccatgaccat caacgcgctg gcgcggeaga 3180 cgctcatcaa cgccggcggc atcttcgaga tgacggtgtt cccgggcaag ttcgcgttgg 3240 ggatgtcggc cgtggtgtac aaggactgga agttcaccga gcagggactg ccggacgatc 3300 tcatcaagag gtacgtacct ggtaaatgtt atgaatgtgt aaaacaaatt gggcgtctcg 3360 ctcactgaca ggaacgtggt aaaaaaaatg caggggcatg gcggtggagg acccgtcgag 3420 cccgtacaag gtgcggttgc tggtgtcgga ctacccgtac gcggcggacg ggctggcgat 3480 ctggcacgcc attgagcagt acgtgagcga gtacctggcc atctactacc cgaacgacgg 3540 cgtgctgcag ggcgatacgg aggtgcaggc gtgatggaag gagacgcgcg aggtcgggca 3600 cggcgacctc aaggacgccc catggtggcc caagatgcaa agtgtgccgg agctggccaa 3660 ggcgtgcacc accatcatct ggatcgggtc ggcgctgcat gcggcagtca acttcgggca 3720 gtacccctac gcggggttcc tcccgaaccg gccgacggtg agccggcgcc gcatgccgga 3780 gcccggcacg gaggagtacg cggagctgga gcgcgacccg gagcgggcct tcatccacac 3840 catcacgagc cagatccaga ccatcatcgg cgtgtcgctg ctggaggtgc tgtcgaagca 3900 ctcctccgac gagctgtacc tcgggcagcg ggacacgccg gagtggacct cggacccaaa 3960 ggccctggag gtgttcaagc ggttcagcga ccggctggtg gagatcgaga gcaaggtggt 4020 gggcatgaac catgacccgg agctcaagaa ccgcaacggc ccggctaagt ttccctacat 4080 gctgctctac cccaacacct ccgaccacaa gggcgccgct gccgggctta ccgccaaggg 4140 catccccaac agcatctcca tctaa 4165 <210> 3 <211> 862 <212> PRT < 213 >大麥栽培品種Ba r ke <400> 3
Met Leu Leu Gly Gly Leu lie Asp Thr Leu Thr Gly Ala Asn Lys Ser 1 5 10 15
Ala Arg Leu Lys Gly Thr Val Val Leu Met Arg Lys Asn Val Leu Asp 20 25 30
Leu Asn Asp Phe Gly Ala Thr lie lie Asp Gly lie Gly Glu Phe Leu 35 40 45 5 201208586
Gly Lys Gly Val Thr Cys Gin Leu lie Ser Ser Thr Ala Val Asp Gin 50 55 60 Asp Asn Gly Gly Arg Gly Lys Val Gly Ala Glu Ala Glu Leu Glu Gin 65 70 75 80 Trp Val Thr Ser Leu Pro Ser Leu Thr Thr Gly Glu Ser Lys Phe Gly 85 90 95 Leu Thr Phe Asp Trp Glu Val Glu Lys Leu Gly Val Pro Gly Ala lie 100 105 110 Val Val Asn Asn Tyr His Ser Ser Glu Phe Leu Leu Lys Thr lie Thr 115 120 125 Leu His Asp Val Pro Gly Arg Ser Gly Asn Leu Thr Phe Val Ala Asn 130 135 140 Ser Trp lie Tyr Pro Ala Ala Asn Tyr Arg Tyr Ser Arg Val Phe Phe 145 150 155 160 Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro Ser Gin Met Pro Ala Ala Leu Lys Pro 165 170 175 Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin Gin Gly 180 185 190 Pro Tyr Gin Glu His Asp Arg lie Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr Asn Asp 195 200 205 Leu Gly Glu Gly Arg Pro lie Leu Gly Gly Asn Ser Asp His Pro Tyr 210 215 220 Pro Arg Arg Gly Arg Thr Glu Arg Lys Pro Asn Ala Ser Asp Pro Ser 225 230 235 240 Leu Glu Ser Arg Leu Ser Leu Leu Glu Gin lie Tyr Val Pro Arg Asp 245 250 255 Glu Lys Phe Gly His Leu Lys Thr Ser Asp Phe Leu Gly Tyr Ser lie 260 265 270 Lys Ala lie Thr Gin Gly lie Leu Pro Ala Val Arg Thr Tyr Val Asp 275 280 285 Thr Thr Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Gin Asp lie lie Asn Leu Tyr 290 295 300 201208586
Glu Gly Gly lie Lys Leu Pro Lys Val Ala Ala Leu Glu Glu Leu Arg 305 310 315 320
Lys Gin Phe Pro Leu Gin Leu lie Lys Asp Leu Leu Pro Val Gly Gly 325 330 335
Asp Ser Leu Leu Lys Leu Pro Val Pro His lie lie Gin Glu Asn Lys 340 345 350
Gin Ala Trp Arg Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Val Leu Ala Gly 355 360 365
Val Asn Pro Val Met lie Thr Arg Leu Thr Glu Phe Pro Pro Lys Ser 370 375 380
Ser Leu Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asp His Thr Ser Thr lie Thr Ala 385 390 395 400
Glu His lie Glu Lys Asn Leu Glu Gly Leu Thr Val Gin Gin Ala Leu 405 410 415
Glu Ser Asn Arg Leu Tyr lie Leu Asp His His Asp Arg Phe Met Pro 420 425 430
Phe Leu lie Asp Val Asn Asn Leu Pro Gly Asn Phe lie Tyr Ala Thr 435 440 445
Arg Thr Leu Phe Phe Leu Arg Gly Asp Gly Arg Leu Thr Pro Leu Ala 450 455 460 lie Glu Leu Ser Glu Pro lie lie Gin Gly Gly Leu Thr Thr Ala Lys 465 470 475 480
Ser Lys Val Tyr Thr Pro Val Pro Ser Gly Ser Val Glu Gly Trp Val 485 490 495
Trp Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Val Ala Val Asn Asp Ser Gly Trp His 500 505 510
Gin Leu Val Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Val Met Glu Pro Phe 515 520 525
Val lie Ser Thr Asn Arg His Leu Ser Val Thr His Pro Val His Lys 530 535 540
Leu Leu Ser Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Thr lie Asn Ala Leu Ala 545 550 555 560
Arg Gin Thr Leu lie Asn Ala Gly Gly lie Phe Glu Met Thr Val Phe 201208586 565 570 575
Pro Gly Lys Phe Ala Leu Gly Met Ser Ala Val Val Tyr Lys Asp Trp 580 585 590
Lys Phe Thr Glu Gin Gly Leu Pro Asp Asp Leu lie Lys Arg Gly Met 595 600 605
Ala Val Glu Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Lys Val Arg Leu Leu Val Ser 610 615 620
Asp Tyr Pro Tyr Ala Ala Asp Gly Leu Ala lie Trp His Ala lie Glu 625 630 635 640
Gin Tyr Val Ser Glu Tyr Leu Ala lie Tyr Tyr Pro Asn Asp Gly Val 645 650 655
Leu Gin Gly Asp Thr Glu Val Gin Ala Trp Trp Lys Glu Thr Arg Glu 660 665 670
Val Gly His Gly Asp Leu Lys Asp Ala Pro Trp Trp Pro Lys Met Gin 675 680 685
Ser Val Pro Glu Leu Ala Lys Ala Cys Thr Thr lie lie Trp lie Gly 690 695 700
Ser Ala Leu His Ala Ala Val Asn Phe Gly Gin Tyr Pro Tyr Ala Gly 705 710 715 720
Phe Leu Pro Asn Arg Pro Thr Val Ser Arg Arg Arg Met Pro Glu Pro 725 730 735
Gly Thr Glu Glu Tyr Ala Glu Leu Glu Arg Asp Pro Glu Arg Ala Phe 740 745 750 lie His Thr lie Thr Ser Gin lie Gin Thr lie lie Gly Val Ser Leu 755 760 765
Leu Glu Val Leu Ser Lys His Ser Ser Asp Glu Leu Tyr Leu Gly Gin 770 775 780
Arg Asp Thr Pro Glu Trp Thr Ser Asp Pro Lys Ala Leu Glu Val Phe 785 790 795 800
Lys Arg Phe Ser Asp Arg Leu Val Glu lie Glu Ser Lys Val Val Gly 805 810 815
Met Asn His Asp Pro Glu Leu Lys Asn Arg Asn Gly Pro Ala Lys Phe 820 825 830 8 201208586
Pro Tyr Met Leu Leu Tyr Pro Asn Thr Ser Asp His Lys Gly Ala Ala 835 840 845
Ala Gly Leu Thr Ala Lys Gly lie Pro Asn Ser lie Ser lie 850 855 860 <210> 4 <211〉 665
<212> PRT <213> 大麥突變體D112 <400> 4
Met Leu Leu Gly Gly Leu lie Asp Thr Leu Thr Gly Ala Asn Lys Ser 15 10 15
Ala Arg Leu Lys Gly Thr Val Val Leu Met Arg Lys Asn Val Leu Asp 20 25 30
Leu Asn Asp Phe Gly Ala Thr lie lie Asp Gly lie Gly Glu Phe Leu 35 40 45
Gly Lys Gly Val Thr Cys Gin Leu lie Ser Ser Thr Ala Val Asp Gin 50 55 60
Asp Asn Gly Gly Arg Gly Lys Val Gly Ala Glu Ala Glu Leu Glu Gin 65 70 75 80
Trp Val Thr Ser Leu Pro Ser Leu Thr Thr Gly Glu Ser Lys Phe Gly 85 90 95
Leu Thr Phe Asp Trp Glu Val Glu Lys Leu Gly Val Pro Gly Ala lie 100 105 110
Val Val Asn Asn Tyr His Ser Ser Glu Phe Leu Leu Lys Thr lie Thr 115 120 125
Leu His Asp Val Pro Gly Arg Ser Gly Asn Leu Thr Phe Val Ala Asn 130 135 140
Ser Trp lie Tyr Pro Ala Ala Asn Tyr Arg Tyr Ser Arg Val Phe Phe 145 150 155 160
Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro Ser Gin Met Pro Ala Ala Leu Lys Pro 165 170 175
Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin Gin Gly 180 185 190 201208586
Pro Tyr Gin Glu His Asp Arg lie Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr Asn Asp 195 200 205
Leu Gly Glu Gly Arg Pro lie Leu Gly Gly Asn Ser Asp His Pro Tyr 210 215 220
Pro Arg Arg Gly Arg Thr Glu Arg Lys Pro Asn Ala Ser Asp Pro Ser 225 230 235 240
Leu Glu Ser Arg Leu Ser Leu Leu Glu Gin lie Tyr Val Pro Arg Asp 245 250 255
Glu Lys Phe Gly His Leu Lys Thr Ser Asp Phe Leu Gly Tyr Ser lie 260 265 270
Lys Ala lie Thr Gin Gly lie Leu Pro Ala Val Arg Thr Tyr Val Asp 275 280 285
Thr Thr Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Gin Asp lie lie Asn Leu Tyr 290 295 300
Glu Gly Gly lie Lys Leu Pro Lys Val Ala Ala Leu Glu Glu Leu Arg 305 310 315 320
Lys Gin Phe Pro Leu Gin Leu lie Lys Asp Leu Leu Pro Val Gly Gly 325 330 335
Asp Ser Leu Leu Lys Leu Pro Val Pro His lie lie Gin Glu Asn Lys 340 345 350
Gin Ala Trp Arg Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Val Leu Ala Gly 355 360 365
Val Asn Pro Val Met lie Thr Arg Leu Thr Glu Phe Pro Pro Lys Ser 370 375 380
Ser Leu Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asp His Thr Ser Thr lie Thr Ala 385 390 395 400
Glu His lie Glu Lys Asn Leu Glu Gly Leu Thr Val Gin Gin Ala Leu 405 410 415
Glu Ser Asn Arg Leu Tyr lie Leu Asp His His Asp Arg Phe Met Pro 420 425 430
Phe Leu lie Asp Val Asn Asn Leu Pro Gly Asn Phe lie Tyr Ala Thr 435 440 445
Arg Thr Leu Phe Phe Leu Arg Gly Asp Gly Arg Leu Thr Pro Leu Ala 10 201208586 450 455 4 60 lie Glu Leu Ser Glu Pro lie lie Gin Gly Gly Leu Thr Thr Ala Lys 465 470 475 480
Ser Lys Val Tyr Thr Pro Val Pro Ser Gly Ser Val Glu Gly Trp Val 485 490 495
Trp Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Val Ala Val Asn Asp Ser Gly Trp His 500 505 510
Gin Leu Val Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Val Met Glu Pro Phe 515 520 525
Val lie Ser Thr Asn Arg His Leu Ser Val Thr His Pro Val His Lys 530 535 540
Leu Leu Ser Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Thr lie Asn Ala Leu Ala 545 550 555 560
Arg Gin Thr Leu lie Asn Ala Gly Gly lie Phe Glu Met Thr Val Phe 565 570 575
Pro Gly Lys Phe Ala Leu Gly Met Ser Ala Val Val Tyr Lys Asp Trp 580 585 590
Lys Phe Thr Glu Gin Gly Leu Pro Asp Asp Leu lie Lys Arg Gly Met 595 600 605
Ala Val Glu Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Lys Val Arg Leu Leu Val Ser 610 615 620
Asp Tyr Pro Tyr Ala Ala Asp Gly Leu Ala lie Trp His Ala lie Glu 625 630 635 640
Gin Tyr Val Ser Glu Tyr Leu Ala lie Tyr Tyr Pro Asn Asp Gly Val 645 650 655
Leu Gin Gly Asp Thr Glu Val Gin Ala 660 665 <210> 5 <211> 3229
<212> DNA <213> 大麥栽培品種：Barke <400> 5 60 atgtttggcg tcggcggcat cgtgagcgac ctgacggggg gcctccgggg cgcccacctc aagggctccg tcgtcctcat gcgcaagaac gcgctcgact tcaacgactt cggcgccacc 120 11 201208586 gtcatggacg gcgtcaccga gctcctcggc cgcggcgtca cctgccagct catcagctcc 180 accaacgtcg accacagtga gcactcactc gccactcccc gttttgtaat ccctgccact 240 gtgatacatg gaaaacggaa gcagatccgc atcctcacgc ccgaaccaag caaataatat 300 atataaagaa ctaaaatgca cgtatggtta cggatgcatg cttatgcttg agcttgagct 360 tgagcttgag agacagggac gtgcaaaaaa taacttaata atggagtaac taatgtgaga 420 catgacgcac ggaggggttt accttactac taattaattg tcgagcagac aacggtgggc 480 gcgggaaggt gggcgcggag gcgaacctgg agcagtggct cctgccgacg aacctgccgt 540 tcatcaccac cggcgagaac aagttcgccg tcaccttcga ctggtcggtg gacaagctgg 600 gggtgccggg ggccatcatc gtcaagaaca accacgcctc cgagttcttc ctcaagacca 660 tcaccctcga caacgtgccc ggccgcggca ccatcgtctt cgtcgccaac tcatgggtct 720 acccgcaggc caagtaccgc tacaaccgcg tcttcttcgc caacgacgtg agtattttat 780 acgagtacca ctccatggta gctagtacga tggatttcgc ttgctcgatg cctgactggt 840 cggttccgtt gggacatacg tgccgcagac gtacctgccg caccagatgc cggcggcgct 900 gaagccgtac cgcgacgacg agctccggaa cctgaggggc gacgaccagc aggggcccta 960 cctggaccac gaccgcgtct accgctacga cgtctacaac gacctcggcg actcccgcga 1020 cgtcctcggc ggctccaagg acctccccta cccgcgccgc tgccgcaccg gccggaagcc 1080 ctcggacagc agtgcgtgtc tcctcccttc tccttccttt cgatctcccc ataacgtgta 1140 cttggtctga caagcatgtg tggccgacgc agagcccgac cacgagagcc ggctgctgcc 1200 gctggtgcag aacgtctacg tgccgcgcga cgagctcttc ggccacctca agcagtcgga 1260 cttcctgggc tacacgctca aggcgctggt ggacgggatc ataccggcca tccgcaccta 1320 cgtcgacctc tcccccggcg agttcgactc cttcgccgac atcctcaagc tctacgaggg 1380 cggcatcaag ctgcccaaca tcccggccct cgaggaggtg cgcaagcgct tcccgctcca 1440 gctcgtcaag gacctcatcc ccaagggcgg cgacttcctc ctcaagctcc ccaagccgga 1500 gatcatcaag gtagaccaga aagcgtggat gactgacgag gagttcgcca gggagatgct 1560 cgccggcgtc aaccccatga tgatcaaacg cctcaccgtg agtgacccac tccatctacc 1620 ggccattgaa caaaatcgtc catacatgtc actaatcaat actcacaccg ttttgaccgc 1680 gtgtgcagga gttccctccc aagagcactc tggatccgag caagtacggc gaccacacca 1740 gcaccatgac cgaggagcac gtggccaaga gcctggaggg cctcaccgtg cagcaggcgc 1800 tcgccggcaa caggctctac atcgtagacc agcacgacaa cctgatgccg ttcctgatcg 1860 acatcaacaa cctcgacgcc agcttcgtgt acgccacaag gacgctgctc ttcctgcgag 1920 gggacggcac gctggcgccg gtcgccatcg agctgagctc gccgctgatc cagggcgagc 1980 tgaccaccgc caagagcgcc gtgtacacgc cgcagcacgc cggcgtggag ggctggatat 2040 ggcagctcgc caaggcctac gcctccgtga acgactacgg 12 gtggcaccag ctcatcagcc 2100 201208586 actggctcaa cacgcacgcc gtcatggagc ccttcgtcat cgccaccaac aggcagctca 2160 gcgtcaccca cccggtctac aagctcctgc acccgcacta ccgcgacacc atgaacatca. 2220 acgcgcgggc gcgcgggctg ctcatcaacg ccggcggcgt catcgagatg accgtgttcc 2280 cgcacaagca cgccatgccc atgtcctcca tggtctacaa gcactggaac ttcaccgaac 2340 aagctctccc cgccgatcta atcaagaggt gcaacatgtt tacattatat aattgacgaa 2400 acggtccttg atttgatcaa aatgattaat cgatcttgat ggttgatgat gatgtagggg 2460 catggcggtg gaggacgcat cgagcccgca caaggtgcgg ctgctgatca aggactaccc 2520 gtacgcgacc gacgggctgg ccgtgtggga cgccatcgag cagtgggtgt cggactacct 2580 gaccatctac taccccaacg acggcgtgct gcagggcgac gtggagctgc aggcgtggtg 2640 gaaggaggtg agggaggtcg ggcacggcga cctcaaggac gcggcgtggt ggccaaagat 2700 gcagacggtg gcggagctga tcaaggcgtg cgccaccatc atctggaccg ggtcggcgct 2760 ccacgcggcc gtcaacttcg ggcagtaccc ctactcgggc taccacccca acaagccgtc 2820 ggcgagccgg aggccgatgc cggtgcaggg gagcgaggag tacgcggagc tggagcgaga 2880 cccggagaag gccttcatcc gcaccatcac cagccagttc catgccctgg tgggcatctc 2940 gctcatggag atcctctcca agcactcctc cgacgaggtc tacctgggcc agcacgacac 3000 gccggcgtgg acgtcggacg ccaaggcgct ggaggcgttc aagcggttcg gggcgaagct 3060 ggagggcatc gagaagcagg tggtggccat gaactcggac ccgcagctaa agaaccgcac 3120 cgggccggcc aagttcccat acatgctgct ctacccaaac acctccgacc acacgggaca 3180 ggccgagggg ctcaccgcca ggggcatccc gaacagcata tccatctga 3229 <210> 6 <211> 3229
<212> DNA <213> 大麥突變體A68 9 <400> 6 atgtttggcg tcggcggcat cgtgagcgac ctgacggggg gcctccgggg cgcccacctc 60 aagggctccg tcgtcctcat gcgcaagaac gcgctcgact tcaacgactt cggcgccacc 120 gtcatggacg gcgtcaccga gctcctcggc cgcggcgtca cctgccagct catcagctcc 180 accaacgtcg accacagtga gcactcactc gccactcccc gttttgtaat ccctgccact 240 gtgatacatg gaaaacggaa gcagatccgc atcctcacgc ccgaaccaag caaataatat 300 atataaagaa ctaaaatgca cgtatggtta cggatgcatg cttatgcttg agcttgagct 360 tgagcttgag agacagggac gtgcaaaaaa taacttaata atggagtaac taatgtgaga 420 catgacgcac ggaggggttt accttactac taattaattg tcgagcagac aacggtgggc 480 gcgggaaggt ggqcgcggag gcgaacctgg agcagtggct cctgccgacg aacctgccgt 540 tcatcaccac cggcgagaac aagttcgccg tcaccttcga ctggtcggtg gacaagctgg 600 13 201208586 gggtgccggg ggccatcatc gtcaagaaca accacgcctc cgagttcttc ctcaagacca 660 tcaccctcga caacgtgccc ggccgcggca ccatcgtctt cgtcgccaac tcatgggtct 720 acccgcaggc caagtaccgc tacaaccgcg tcttcttcgc caacgacgtg agtattttat 780 acgagtacca ctccatggta gctagtacga tggatttcgc ttgctcgatg cctgactggt 840 cggttccgtt gggacatacg tgccgcagac gtacctgccg caccagatgc cggcggcgct 900 gaagccgtac cgcgacgacg agctccggaa cctgaggggc gacgaccagc aggggcccta 960 cctggaccac gaccgcgtct accgctacga cgtctacaac gacctcggcg actcccgcga 1020 cgtcctcggc ggctccaagg acctccccta cccgcgccgc tgccgcaccg gccggaagcc 1080 ctcggacagc agtgcgtgtc tcctcccttc tccttccttt cgatctcccc ataacgtgta 1140 cttggtctga caagcatgtg tggccgacgc agagcccgac cacgagagcc ggctgctgcc 1200 gctggtgcag aacgtctacg tgccgcgcga cgagctcttc ggccacctca agcagtcgga 1260 cttcctgggc tacacgctca aggcgctggt ggacgggatc ataccggcca tccgcaccta 1320 cgtcgacctc tcccccggcg agttcgactc cttcgccgac atcctcaagc tctacgaggg 1380 cggcatcaag ctgcccaaca tcccggccct cgaggaggtg cgcaagcgct tcccgctcca 1440 gctcgtcaag gacctcatcc ccaagggcgg cgacttcctc ctcaagctcc ccaagccgga 1500 gatcatcaag gtagaccaga aagcgtggat gactgacgag gagttcgcca gggagatgct 1560 cgccggcgtc aaccccatga tgatcaaacg cctcaccgtg agtgacccac tccatctacc 1620 ggccattgaa caaaatcgtc catacatgtc actaatcaat actcacaccg ttttgaccgc 1680 gtgtgcagga gttccctccc aagagcactc tggatccgag caagtacggc gaccacacca 1740 gcaccatgac cgaggagcac gtggccaaga gcctggaggg cctcaccgtg cagcaggcgc 1800 tcgccggcaa caggctctac atcgtagacc agcacgacaa cctgatgccg ttcctgatcg I860 acatcaacaa cctcgacgcc agcttcgtgt acgccacaag gacgctgctc ttcctgcgag 1920 gggacggcac gctggcgccg gtcgccatcg agctgagctc gccgctgatc cagggcgagc 1980 tgaccaccgc caagagcgcc gtgtacacgc cgcagcacgc cggcgtggag ggctggatat 2040 ggcagctcgc caaggcctac gcctccgtga acgactacgg gtggcaccag ctcatcagcc 2100 actggctcaa cacgcacgcc gtcatggagc ccttcgtcat cgccaccaac aggcagctca 2160 gcgtcaccca cccggtctac aagctcctgc acccgcacta ccgcgacacc atgaacatca 2220 acgcgcgggc gcgcgggctg ctcatcaacg ccggcggcgt catcgagatg accgtgttcc 2280 cgcacaagca cgccatgccc atgtcctcca tggtctacaa gcactggaac ttcaccgaac 2340 aagctctccc cgccgatcta atcaagaggt gcaacatgtt tacattatat aattgacgaa 2400 acggtccttg atttgatcaa aatgattaat cgatcttgat ggttgatgat gatgtagggg 2460 catggcggtg gaggacgcat cgagcccgca caaggtgcgg ctgctgatca aggactaccc 2520 14 201208586 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3229 gtacgcgacc gacgggctgg ccgtgtggga cgccatcgag cagtgggtgt cggactacct gaccatctac taccccaacg acggcgtgct gcagggcgac gtggagctgc aggcgtggtg gaaggaggtg agggaggtcg ggcacggcga cctcaaggac gcggcgtgat ggccaaagat gcagacggtg gcggagctga tcaaggcgtg cgccaccatc a.tctggaccg ggtcggcgct ccacgcggcc gtcaacttcg ggcagtaccc ctactcgggc taccacccca acaagccgtc ggcgagccgg aggccgatgc cggtgcaggg gagcgaggag tacgcggagc tggagcgaga cccggagaag gccttcatcc gcaccatcac cagccagttc catgccctgg tgggcatctc gctcatggag atcctctcca agcactcctc cgacgaggtc tacctgggcc agcacgacac gccggcgtgg acgtcggacg ccaaggcgct ggaggcgttc aagcggttcg gggcgaagct ggagggcatc gagaagcagg tggtggccat gaactcggac ccgcagctaa agaaccgcac cgggccggcc aagttcccat acatgctgct ctacccaaac acctccgacc acacgggaca ggccgagggg ctcaccgcca ggggcatccc gaacagcata tccatctga <210> 7 <211> 864
<212> PRT <213> 大麥栽培品種：Barke <400> 7
Met Leu Gly Val Gly Gly lie Val Ser Asp Leu Thr Gly Gly lie Arg 1 5 10 15
Gly Ala His Leu Lys Gly Ser Val Val Leu Met Arg Lys Asn Ala Leu - 20 25 30
Asp Phe Asn Asp Phe Gly Ala His Val Met Asp Gly Val Thr Glu Leu 35 40 45
Leu Gly Arg Gly Val Thr Cys Gin Leu lie Ser Ser Thr Asn Val Asp 50 55 60
His Asn Asn Gly Gly Arg Gly Lys Val Gly Ala Glu Ala Asn Leu Glu 65 70 75 80
Gin Trp Leu Leu Pro Thr Asn Leu Pro Phe lie Thr Thr Gly Glu Asn 85 90 95
Lys Phe Ala Val Thr Phe Asp Trp Ser Val Asp Lys Leu Gly Val Pro 100 105 110
Gly Ala lie lie Val Lys Asn Asn His Ala Ser Glu Phe Phe Leu Lys 115 120 125
Thr lie Thr Leu Asp Asn Val Pro Gly Arg Gly Thr lie Val Phe Val 15 201208586 130 135 140
Ala Asn Ser Trp Val Tyr Pro Gin Ala Lys Tyr Arg Tyr Asn Arg Val 145 150, 155 160
Phe Phe Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro His Gin Met Pro Ala Ala Leu 165 170 175
Lys Pro Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin 180 185 190
Gin Gly Pro Tyr Leu Asp His Asp Arg Val Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr 195 200 205
Asn Asp Leu Gly Asp Ser Arg Asp Val Leu Gly Gly Ser Lys Asp Leu 210 215 220
Pro Tyr Pro Arg Arg Cys Arg Thr Gly Arg Lys Pro Ser Asp Ser Lys 225 230 235 240
Pro Asp His Glu Ser Arg Leu Leu Leu Leu Val Gin Asn Val Tyr Val 245 250 255
Leu Arg Asp Glu Leu Phe Gly His Leu Lys Gin Ser Asp Leu Leu Gly 260 265 270
Tyr Thr Leu Lys Gly Trp Leu Asp Gly lie lie Leu Ala lie Arg Thr 275 280 285
Tyr Val Asp Leu Ser Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Ala Asp lie Leu 290 295 300
Lys Leu Tyr Glu Gly Gly lie Lys Leu Pro Asn lie Pro Ala Leu Glu 305 310 3X5 320
Glu Val Arg Lys Arg Phe Pro Leu Gin Leu Val Lys Asp Leu lie Pro 325 330 335
Lys Gly Gly Asp Phe Leu Leu Lys Leu Pro Lys Pro Glu lie lie Lys 340 345 350
Val Asp Gin Lys Ala Trp Met Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Met 355 360 365
Leu Ala Gly Val Asn Pro Met Met lie Lys Arg Leu Thr Glu Phe Pro 370 375 380
Pro Lys Ser Thr Leu Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Asp His Thr Ser Thr 385 390 395 400 16 201208586
Met Thr Glu Glu His Val Ala Lys Ser Leu Glu Gly Leu Thr Val Gin 405 410 415 Gin Ala Leu Ala 420 Gly Asn Arg Leu Tyr lie Val Asp Gin His Asp Asn 425 430 Leu Met Pro Phe 435 Leu lie Asp lie Asn Asn Leu Asp Ala Ser Phe Val 440 445 Tyr Ala Thr Arg 450 Thr Leu Leu Phe Leu Arg Gly Asp Gly Thr Leu Ala 455 460 Pro Val Ala lie 465 Glu Leu Ser Ser Pro Leu lie Gin Gly Glu Leu Thr 470 475 480 Thr Ala Lys Ser Ala Val Tyr Thr Pro Gin His Ala Gly Val Glu Gly 485 490 495 Trp lie Trp Gin 500 Leu Ala Lys Ala Tyr Ala Ser Val Asn Asp Tyr Gly 505 510 Trp His Gin Leu 515 lie Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Val Met Glu 520 525 Pro Phe Val lie 530 Ala Thr Asn Arg Gin Leu Ser Val Thr His Pro Val 535 540 Tyr Lys Leu Leu 545 His Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Asn lie Asn Ala 550 555 560 Arg Ala Arg Gly Leu Leu He Asn Ala Gly Gly Val He Glu Met Thr 565 570 575 Val Phe Pro His 5,80 Lys His Ala Met Pro Met Ser Ser Met Val Tyr Lys 585 590 His Trp Asn Phe 595 Thr Glu Gin Ala Leu Pro Ala Asp Leu lie Lys Arg 600 605 Gly Met Ala Val 610 Glu Asp Ala Ser Ser Pro His Lys Val Arg Leu Leu 615 620 lie Lys Asp Tyr Pro Tyr Ala Thr Asp Gly Leu Ala Val Trp Asp Ala 625 630 635 640 lie Glu Gin Trp Val Ser Asp Tyr Leu Thr lie Tyr Tyr Pro Asn Asp 645 650 655 17 201208586
Gly Val Leu Gin Gly Asp Val Glu Leu Gin Ala Trp Trp Lys Glu Val 660 665 670
Arg Glu Val Gly His Gly Asp Leu Lys Asp Ala Ala Trp Trp Pro Lys 675 680 685
Met Gin Thr Val Ala Glu Leu lie Lys Ala Cys Ala Thr lie lie Trp 690 695 700
Thr Gly Ser Ala Leu His Ala Ala Val Asn Phe Gly Gin Tyr Pro Tyr 705 710 715 720
Ser Gly Tyr His Pro Asn Lys Pro Ser Ala Ser Arg Arg Pro Met Pro 725 730 735
Val Gin Gly Ser Glu Glu Tyr Ala Glu Leu Glu Arg Asp Pro Glu Lys 740 745 750
Ala Phe lie Arg Thr lie Thr Ser Gin Phe His Ala Leu Val Gly lie 755 760 765
Ser Leu Met Glu lie Leu Ser Lys His Ser Ser Asp Glu Val Tyr Leu 770 775 780
Gly Gin His Asp Thr Pro Ala Trp Thr Ser Asp Ala Lys Ala Leu Glu 785 790 795 800
Ala Phe Lys Arg Phe Gly Ala Lys Leu Glu Gly 工le Glu Lys Gin Val 805 810 815
Val Ala Met Asn Ser Asp Pro Gin Leu Lys Asn Arg Thr Gly Pro Ala 820 825 830
Lys Phe Pro Tyr Met Leu Leu Tyr Pro Asn Thr Ser Asp His Thr Gly 835 840 845 *
Gin_Ala Glu Gly Leu Thr Ala Arg Gly lie Pro Asn Ser lie Ser lie 850 855 860 <210> 8 <211> 684 <212> PRT . <213> 大麥突變體M89 <400> 8
Met Leu Gly Val Gly Gly lie Val Ser Asp Leu Thr Gly Gly lie Arg 15 10 15
Gly Ala His Leu Lys Gly Ser Val Val Leu Met Arg Lys Asn Ala Leu 18 201208586 20 25 30
Asp Phe Asn Asp Phe Gly Ala His Val Met Asp Gly Val Thr Glu Leu 35 40 45
Leu Gly Arg Gly Val Thr Cys Gin Leu lie Ser Ser Thr Asa Val Asp 50 55 60
His Asn Asn Gly Gly Arg Gly Lys Val Gly Ala Glu Ala Asn Leu Glu 65 70 75 80
Gin Trp Leu Leu Pro Thr Asn Leu Pro Phe lie Thr Thr Gly Glu Asn 85 90 95
Lys Phe Ala Val Thr Phe Asp Trp Ser Val Asp Lys Leu Gly Val Pro 100 105 110
Gly Ala lie lie Val Lys Asn Asn His Ala Ser Glu Phe Phe Leu Lys 115 120 125
Thr He Thr Leu Asp Asn Val Pro Gly Arg Gly Thr He Val Phe Val 130 135 140
Ala Asn Ser Trp Val Tyr Pro Gin Ala Lys Tyr Arg Tyr Asn Arg Val 145 150 155 160
Phe Phe Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro His Gin Met Pro Ala Ala Leu 165 170 175
Lys Pro Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin 180 185 190
Gin Gly Pro Tyr Leu Asp His Asp Arg Val Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr 195 200 205
Asn Asp Leu Gly Asp Ser Arg Asp Val Leu Gly Gly Ser Lys Asp Leu 210 215 220
Pro Tyr Pro Arg Arg Cys Arg Thr Gly Arg Lys Pro Ser Asp Ser Lys 225 230 235 240
Pro Asp His Glu Ser Arg Leu Leu Leu Leu Val Gin Asn Val Tyr Val 245 250 255
Leu Arg Asp Glu Leu Phe Gly His Leu Lys Gin Ser Asp Leu Leu Gly 260 265 270
Tyr Thr Leu Lys Gly Trp Leu Asp Gly lie lie Leu Ala lie Arg Thr 275 280 285 19 201208586
Tyr Val Asp Leu Ser Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Ala Asp lie Leu 290 295 300
Lys Leu Tyr Glu Gly Gly lie Lys Leu Pro Asn lie Pro Ala Leu Glu 305 310 315 320
Glu Val Arg Lys Arg Phe Pro Leu Gin Leu Val Lys Asp Leu lie Pro 325 330 335
Lys Gly Gly Asp Phe Leu Leu Lys Leu Pro Lys Pro Glu lie lie Lys 340 345 350
Val Asp Gin Lys Ala Trp Met Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Met 355 360 365
Leu Ala Gly Val Asn Pro Met Met lie Lys Arg Leu Thr Glu Phe Pro 370 375 380
Pro Lys Ser Thr Leu Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Asp His Thr Ser Thr 385 390 395 400
Met Thr Glu Glu His Val Ala Lys Ser Leu Glu Gly Leu Thr Val Gin 405 410 415
Gin Ala Leu Ala Gly Asn Arg Leu Tyr lie Val Asp Gin His Asp Asn 420 425 430
Leu Met Pro Phe Leu lie Asp lie Asn Asn Leu Asp Ala Ser Phe Val 435 440 445
Tyr Ala Thr Arg Thr Leu Leu Phe Leu Arg Gly Asp Gly Thr Leu Ala 450 455 460
Pro Val Ala lie Glu Leu Ser Ser Pro Leu lie Gin Gly Glu Leu Thr 465 470 475 480
Thr Ala Lys Ser Ala Val Tyr Thr Pro Gin His Ala Gly Val Glu Gly 485 490 495
Trp lie Trp Gin Leu Ala Lys Ala Tyr Ala Ser Val Asn Asp Tyr Gly 500 505 510
Trp His Gin Leu lie Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Val Met Glu 515 520 525
Pro Phe Val lie Ala Thr Asn Arg Gin Leu Ser Val Thr His Pro Val 530 535 540 20 201208586
Tyr Lys Leu Leu His Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Asn lie Asn Ala 545 550 555 560
Arg Ala Arg Gly Leu Leu lie Asn Ala Gly Gly Val lie Glu Met Thr 565 570 575
Val Phe Pro His Lys His Ala Met Pro Met Ser Ser Met Val Tyr Lys 580 585 590
His Trp Asn Phe Thr Glu Gin Ala Leu Pro Ala Asp Leu lie Lys Arg 595 600 605
Gly Met Ala Val Glu Asp Ala Ser Ser Pro His Lys Val Arg Leu Leu 610 615 620 lie Lys Asp Tyr Pro Tyr Ala Thr Asp Gly Leu Ala Val Trp Asp Ala 625 630 635 640 lie Glu Gin Trp Val Ser Asp Tyr Leu Thr lie Tyr Tyr Pro Asn Asp 645 650 655
Gly Val Leu Gin Gly Asp Val Glu Leu Gin Ala Trp Trp Lys Glu Val 660 665 670
Arg Glu Val Gly His Gly Asp Leu Lys Asp Ala Ala 675 680 <210> 9 •;<211> 6459
<212> DNA <213>大麥栽培品種Prestige <400> 9 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 atggctgcgg cggcggggga cgtggaggcg ttcctggcgg cgtgccaggc gtcgggcgac gcggcgtacg gcgccgccaa ggccgtgctg gagcggctcg aggcgccggc cacgcgcgcc gaggccaggc ggctcctcgg cgccgtgcga cggcgcttcg ccgccggcgg cccggccgcg gggctcgagt gcttccgcac cttccacttc cgcatccacg acgtcgtcct cgacccccac ctccaaggtt gcccggcccc ttccctacac acccgttgtc gacccgcatc tctttcgccg atctggccgt caaaagcacg cggcttggta gaaatcaagc ctgcaatcct gatccgttta tggctggcca gtcgatcagt aatttggcca taactggagt ataaccttgg tctctaatct ctacctgacc atataccgag ttggttttct ttcttcttgt ttccgtattt gtgtagtttt ttcttttctt tcgagcatga tgttctttga attaatgcgt accagactcc agtaattcga cattttgaat tttggcgagt gttcttggaa tttataacac aacgaggctt tgatcaagtg gtttatgtag aggagtgttt ttgttcttgt gcaccgtata caattctcta tttcccaaca 660 21 201208586 attttgatgg cctctaagca tcctgtagtc atgtctactg tgtaagctac agatttattc 720 atgtctatgt gtaagctgca aatggagaga aaagctatct atttggttgt tccagcttgt 780 tctttggcag aacaatcctg cccatcctat caccataagt ataaaagcac gacaaatgag 840 tggggcaagc atgctgccaa gctaatacac gacataagct acatattttg aggggcatgt 900 tatctttttt tttcccttct actcagtttc ttctttggga gaacaatcct actcaaccta 960 taatcataag aataaaagca agacagatga gtgctgcaga ctattggcat atataacaac 1020 taaataggac atctgtccgc tatatcttta gttaataatt gtatatagac gcagtctttg 1080 tgctggaaaa actgcaacta aatattttct tacattatat ggaatctggg tgtgatatga 1140 cttctttgtt acgttttgtg tgcataaagc attaacttct gtctttagtt ggcgcagcgg 1200 taaaaacacc cattgcttaa tattttattt gctttccgta gcttgataaa atttcaactg 1260 cttctaggat tccagcaaag aaagaagcta acaatgatgg agatacccag cattttcatt 1320 ccagaagact ggtcattcac tttctacgag ggtctcaacc ggcatccaga ttccatcttc 1380 agggataaga cagtagcaga gctgggatgt ggcaatggtt ggatatccat tgcacttgca 1440 gaaaagtggt gcccttcgaa ggttggcacc tcttgttccg tagatattta tcttatctcg 1500 tttgttgcaa acatgggacc tgcagaagtt agacatttac tcaggttact ttatatgaaa 1560 cttttaggtg tctgccagta gtctgctggt ggtctaattt tcttggtata cctgatgccg 1620 tcgagcatat tgctttcaaa ttttgggcaa ggcattacca ccacatattg tttctacaat 1680 gctgaacaat tgctctcctt tgaaaggaag aaaaacaaga atgacatgca ccttagtagt 1740 ttaagccaca aataccagcg aatcaaatta gtttgcagtc agcttggcat taccttactt 1800 gagccttggt tgttcttttg aaggtttatg gtctggatat aaacccaaga gctatcaaga 1860 ttgcatggat aaacctttac ttgaatgcac tagacgacga tggtctccca atctatgatg 1920 cggaggggaa aacattgctt gacagagtcg aattctatga atctgatctt ctttcttact 1980 gtagagataa caagatagaa cttgatcgca ttgttggatg cataccacag gtacggtcag 2040 gtttttacca atttcctgtg aatggggatt atagtcgatc agaacttgat caaaatgccc 2100 ttaatatctg cctttcagat tcttaacccc aatccagagg caatgtcaaa gattgtaact 2160 gaaaattcaa gtgaggagtt cttgtactcc ttgagcaact actgtgctct ccaggtgagt 2220 tgagatctat ttaaactcaa gccattcagt ttacctgtta ctaaatggtt acccatgtca 2280 gagtctccaa atctttttct tttctcaaac agcaaagaga gaagaaaact tttaagttct 2340 atcctgaaat tgactttaca atgcttgttc ataatctgct tacgaaatat gcgtttgaac 2400 atttctcttt tccttgtagg catgtggtca gacctttata taagaaaatg aagtttttgt 2460 agaaataatg tatgctttgt acttatgaca tggttccacc agtataatca atttaagtct 2520 aggtagttag gaacctagga tggagagcac cgacagtgta taatatatat atgtcgatag 2580 ggggttagca gtccaaatcc acctcaagtt caacctattg cataactttt ggtcttacaa 2640 22 201208586 cctgtatgga caaatgtgat cagcacccca gtctttccta taaaaatgtc tgctggaata 2700 tggaattatt aacagcggta tttattttta ccctgtttaa ttttttcctt tgctaaaaga 2760 atgataatcc ttatgccacg aggttacatt gtattactca agtcaatatt tgttactatg 2820 gctgattgta cgattccagc ttccggttgt taattttgtt atgtttgtga actttgctgc 2880 attcagggtt ttgttgagga ccaatttggc ctcgggttga ttgctcgggc tgttgaagaa 2940 gggatatctg tgataaagcc tagtggtctt atggtattca acatgggagg ccggccagga 3000 caaggtgtct gtgagcgcct atttctacgc cgtggatttc gcatcaataa gctctggcaa 3060 acaaaaatta tgcaggtagc aattctttga gtgactagat gttaactaat cccagtgttt 3120 ttccatgcca gcaacagcat tatatcctgg ttagaggaat atgctcttca tgttgcacac 3180 caatcttcag ctgggcctag aattttcatc taccggctta catttttaca ttacagaacc 3240 aatttttgtt gaggatcatt accaactagt tgggtctttg caggctgctg acacagacat 3300 ctccgcttta gttgaaattg agaaaaatag ccgacatcgc ttcgagttct ttatggatct 3360 tgttggggat cagcctgtgt gtgcgcgcac agcatgggca tacatgaaat ctggtggccg 3420 catttcacat gctttgtctg tgtatagctg tcaacttcgc cagcccaacc aggtacctat 3480 actctctgat tagatcttta caacaataat atagtaatgt caggaataat aataatttgg 3540 agaatttcag gtgaagaaaa tatttgagtt ccttaaagac ggattccatg aagtcagcag 3600 ctccctcgat ttgtcctttg atgatgattc tgttgctgat gaaaaaattc ctttcctagc 3660 atacctagct agtttcttgc aagagaataa gtctaatcct tgtgagcctc cagctggatg 3720 tttaaatttc cggaatcttg ttgctggatt tatgaagagt taccaccaca tcccattaac 3780 tcctgatgta agacttggtg tctattgcct acaattatgt ttgcttatta gaaattcata 3840 agatcaacct atttgatgct tctcacgtat gcttcatgtg acacttcctt ttcctctggt 3900 gcaccagaat gttgttgtgt tcccatcccg tgctgttgca atcgaaaatg ctcttcggtt 3960 gttctcacct ggacttgcaa ttgttgacga acacctaacc agacacttgc ccaagcaatg 4020 gttaacatct ttagcaattg aggtactttg accgatactc ccctctttct ttctgtgttt 4080 ggaactgtgg aaaatacatg tgttctgtga agaaaaagtt atgctgacaa gaatttcgat 4140 gttattgcca ttcttctaaa tttcaggaaa gtaaccatgc taaagataca gtaactgtaa 4200 tcgaagcacc acgccaatca gatttgctga ttgagttgat caggaaactg aagcctcagg 4260 ttgttgttac tggcatggct cagtttgagg ctatcaccag tgctgctttc gtgaacttat 4320 taagtgtaac gaaagatgtt ggttcccgat tattactaga tatttcagaa catctggaat 4380 tgtctagtct gccaagctca aatggtgtat tgaaatatct tgctgggaag accctgcctt 4440 cacatgcggc tatattgtgt ggcttagtta agaatcaggt gtgtgtcaat cagcctgaac 4500 tctagttgaa ctgttgtgca tactatatag aatatcttga cttttatatg tactttagaa 4560 23 201208586 acactgttta aatgtactca tttctttttg cttcatttta cttgcaggtt tattctgatc 4620 tggaagttgc ttttgctatc tctgaagatc caactgttta taaggcattg tcacaaacta 4680 ttgagctatt ggaaggacat acttctgtga tcagccagca ctattatggt tgtcttttcc 4740 atgagctgct ggcatttcaa attggtgacc ggcatccaca acaagaggta aacatggctt 4800 gcctcttcca gttctccatc tcactcagtt ctgtccacaa ggtgccgaat gatctgttca 4860 agtggacact cccctcagca cgggcaagct agtccatgaa tttggattag ttccctctta 4920 gctgggtact tcgattacac cacaatgagc tcctcaacgt ggtctggttt atgtttttca 4980 tgttttccct ctaatgtttg gttgctcttt ttcagagaga acctgcagaa gtgatatcta 5040 aggagatgat agggttttca agttcagcta tgtccaccct agaaggagct gagtttttcg 5100 ttcctggttc catggaatcc ggtgtcatac atatggatct ggaccgcagc ttcttgccag 5160 taccttctgc agtaaacgcc tccattttcg aaagttttgt tcgtcagaac atcactgatt 5220 ctgaaaccga tgtccgttcc agcattcagc agctggtgaa agatagctat ggtt.tctcag 5280 caggcggtgc ttctgaaatt atatacggga acacctgtct cgcgctcttc aacaagcttg 5340 ttctttgctg catgcaagaa cagggcacct tgcttttccc cttgggaacc aacgggcatt 5400 acgtcaacgc agcaaagttt gtgaatgcaa ccaccttgac tattccaacg aaggcagatt 5460 caggcttcaa gatcgaacca agtgctctag ccgacacact agagaaggtg tctcagccgt 5520 gggtctatat ttctggcccc acaatcaacc ctactggctt cctgtacagt gacgacgata 5580 tagcagagct gctttctgtc tgtgcgacat acggagccag ggtggtgata gatacctcct 5640 cctctggtct ggagttccaa gccaccggct gcagccagtg gaatttggaa agatgtcttt 5700 ctaatgtcaa gtcttcaaag ccctcgttct ccgttgtcct gctcggagag ctgtcctttg 5760 agctgaccac ggctgggctt gatttcgggt ttctgattat gagcgactcg tccttggttg 5820 acacatttta cagtttccca agcttgagtc ggccacacag cacgttgaag tacacgttca 5880 ggaagctgtt gggtcttaag aaccagaagg atcagcattt ctctgatctc atccttgagc 5940 agaaggagac gttgaagaat cgtgccgacc agttgatcaa ggtatgcctt ttgggatatc 6000 ctgtgtttag gctctctgtt ttcttcccct gatcagctct ccgatcccct tacatcctta 6060 ggctaatttc agtacttcaa gtttgccacg catttctgac atattctttc ctcttgtttt 6120 attttcctgt gatgtgatga acagacgctt gagagctgcg gctgggacgc tgtgggctgc 6180 catggcggca tctcgatgct tgcaaaaccg accgcctaca ttggcaaatc gctcaaggtg 6240 gacggctttg agggcaagct ggacagccac aacatgaggg aagccctcct gaggtccacc 6300 gggctgtgca ttagcagcag cgggtggaca ggggtgccgg actactgccg cttcagcttt 6360 gctctggaga gcggcgactt cgaccgggcc atggagtgca tcgcccggtt cagggagctg 6420 gtccttggtg gcggtgctaa ggtgaatggt agcaactag 6459 24 201208586 • <210> 10 . <211> 6459
<212> DNA <213> 大麥突變體8063 <400> 10 atggctgcgg cggcggggga cgtggaggcg ttcctggcgg cgtgccaggc gtcgggcgac 60 gcggcgtacg gcgccgccaa ggccgtgctg gagcggctcg aggcgccggc cacgcgcgcc 120 gaggccaggc ggctcctcgg cgccgtgcga cggcgcttcg ccgccggcgg cccggccgcg 180 gggctcgagt gcttccgcac cttccacttc cgcatccacg acgtcgtcct cgacccccac 240 ctccaaggtt gcccggcccc ttccctacac acccgttgtc gacccgcatc tctttcgccg 300 atctggccgt caaaagcacg cggcttggta gaaatcaagc ctgcaatcct gatccgttta 360 tggctggcca gtcgatcagt aatttggcca taactggagt ataaccttgg tctctaatct 420 ctacctgacc atataccgag ttggttttct ttcttcttgt ttccgtattt gtgtagtttt 480 ttcttttctt tcgagcatga tgttctttga attaatgcgt accagactcc agtaattcga 540 cattttgaat tttggcgagt gttcttggaa tttataacac aacgaggctt tgatcaagtg 600 gtttatgtag aggagtgttt ttgttcttgt gcaccgtata caattctcta tttcccaaca 660 attttgatgg cctctaagca tcctgtagtc atgtctactg tgtaagctac agatttattc 720 atgtctatgt gtaagctgca aatggagaga aaagctatct atttggttgt tccagcttgt 780 tctttggcag aacaatcctg cccatcctat caccataagt ataaaagcac gacaaatgag 840 tggggcaagc atgctgccaa gctaatacac gacataagct acatattttg aggggcatgt 900 tatctttttt tttcccttct actcagtttc ttctttggga gaacaatcct actcaaccta 960 taatcata.ag aataaaagca agacagatga gtgctgcaga ctattggcat atataacaac 1020 taaataggac atctgtccgc tatatcttta gttaataatt gtatatagac gcagtctttg 1080 tgctggaaaa actgcaacta aatattttct tacattatat ggaatctggg tgtgatatga 1140 cttctttgtt acgttttgtg tgcataaagc attaacttct gtctttagtt ggcgcagcgg 1200 taaaaacacc cattgcttaa tattttattt gctttccgta gcttgataaa atttcaactg 1260 cttctaggat tccagcaaag aaagaagcta acaatgatgg agatacccag cattttcatt 1320 ccagaagact ggtcattcac tttctacgag ggtctcaacc ggcatccaga ttccatcttc 1380 agggataaga cagtagcaga gctgggatgt ggcaatggtt ggatatccat tgcacttgca 1440 gaaaagtggt gcccttcgaa ggttggcacc tcttgttccg tagatattta tcttatctcg 1500 tttgttgcaa acatgggacc tgcagaagtt agacatttac tcaggttact ttatatgaaa 1560 cttttaggtg tctgccagta gtctgctggt ggtctaattt tcttggtata cctgatgccg 1620 tcgagcatat tgctttcaaa ttttgggcaa ggcattacca ccacatattg tttctacaat 1680 gctgaacaat tgctctcctt tgaaaggaag aaaaacaaga atgacatgca ccttagtagt 1740 ttaagccaca aataccagcg aatcaaatta gtttgcagtc agcttggcat taccttactt 1800 25 201208586 gagccttggt tgttcttttg aaggtttatg gtctggatat aaacccaaga gctatcaaga 1860 ttgcatggat aaacctttac ttgaatgcac tagacgacga tggtctccca atctatgatg 1920 cggaggggaa aacattgctt gacagagtcg aattctatga atctgatctt ctttcttact 1980 gtagagataa caagatagaa cttgatcgca ttgttggatg cataccacag gtacggtcag 2040 gtttttacca atttcctgtg aatggggatt atagtcgatc agaacttgat caaaatgccc 2100 ttaatatctg cctttcagat tcttaacccc aatccagagg caatgtcaaa gattgtaact 2160 gaaaattcaa gtgaggagtt cttgtactcc ttgagcaact actgtgctct ccaggtgagt 2220 tgagatctat ttaaactcaa gccattcagt ttacctgtta ctaaatggtt acccatgtca 2280 gagtctccaa atctttttct tttctcaaac agcaaagaga gaagaaaact tttaagttct 2340 atcctgaaat tgactttaca atgcttgttc ataatctgct tacgaaatat gcgtttgaac 2400 atttctcttt tccttgtagg catgtggtca gacctttata taagaaaatg aagtttttgt 2460 agaaataatg tatgctttgt acttatgaca tggttccacc agtataatca atttaagtct 2520 aggtagttag gaacctagga tggagagcac cgacagtgta taatatatat atgtcgatag 2580 ggggttagca gtccaaatcc acctcaagtt caacctattg cataactttt ggtcttacaa 2640 cctgtatgga caaatgtgat cagcacccca gtctttccta taaaaatgtc tgctggaata 2700 tggaattatt aacagcggta tttattttta ccctgtttaa ttttttcctt tgctaaaaga 2760 atgataatcc ttatgccacg aggttacatt gtattactca agtcaatatt tgttactatg 2820 gctgattgta cgattccagc ttccggttgt taattttgtt atgtttgtga actttgctgc 2880 attcagggtt ttgttgagga ccaatttggc ctcgggttga ttgctcgggc tgttgaagaa 2940 gggatatctg tgataaagcc tagtggtctt atggtattca acatgggagg ccggccagga 3000 caaggtgtct gtgagcgcct atttctacgc cgtggatttc gcatcaataa gctctggcaa 3060 acaaaaatta tgcagatagc aattctttga gtgactagat gttaactaat cccagtgttt 3120 ttccatgcca gcaacagcat tatatcctgg ttagaggaat atgctcttca tgttgcacac 3180 caatcttcag ctgggcctag aattttcatc taccggctta catttttaca ttacagaacc 3240 aatttttgtt gaggatcatt accaactagt tgggtctttg caggctgctg acacagacat 3300 ctccgcttta gttgaaattg agaaaaatag ccgacatcgc ttcgagttct ttatggatct 3360 tgttggggat cagcctgtgt gtgcgcgcac agcatgggca tacatgaaat ctggtggccg 3420 catttcacat gctttgtctg tgtatagctg tcaacttcgc cagcccaacc aggtacctat 3480 actctctgat tagatcttta caacaataat atagtaatgt caggaataat aataatttgg 3540 agaatttcag gtgaagaaaa tatttgagtt ccttaaagac ggattccatg aagtcagcag 3600 ctccctcgat ttgtcctttg atgatgattc tgttgctgat gaaaaaattc ctttcctagc 3660 atacctagct agtttcttgc aagagaataa gtctaatcct tgtgagcctc cagctggatg 3720 26 201208586 tttaaatttc cggaatcttg ttgctggatt tatgaagagt taccaccaca tcccattaac 3780 tcctgatgta agacttggtg tctattgcct acaattatgt ttgcttatta gaaattcata 3840 agatcaacct atttgatgct tctcacgtat gcttcatgtg acacttcctt ttcctctggt 3900 gcaccagaat gttgttgtgt tcccatcccg tgctgttgca atcgaaaatg ctcttcggtt 3960 gttctcacct ggacttgcaa ttgttgacga acacctaacc agacacttgc ccaagcaatg 4020 gttaacatct ttagcaattg aggtactttg accgatactc ccctctttct ttctgtgttt 4080 ggaactgtgg aaaatacatg tgttctgtga agaaaaagtt atgctgacaa gaatttcgat 4140 gttattgcca ttcttctaaa tttcaggaaa gtaaccatgc taaagataca gtaactgtaa 4200 tcgaagcacc acgccaatca gatttgctga ttgagttgat caggaaactg aagcctcagg 4260 ttgttgttac tggcatggct cagtttgagg ctatcaccag tgctgctttc gtgaacttat 4320 taagtgtaac gaaagatgtt ggttcccgat tattactaga tatttcagaa catctggaat 4380 tgtctagtct gccaagctca aatggtgtat tgaaatatct tgctgggaag accctgcctt 4440 cacatgcggc tatattgtgt ggcttagtta agaatcaggt gtgtgtcaat cagcctgaac 4500 tctagttgaa ctgttgtgca tactatatag aatatcttga cttttatatg tactttagaa 4560 acactgttta aatgtactca tttctttttg cttcatttta cttgcaggtt tattctgatc 4620 tggaagttgc ttttgctatc tctgaagatc caactgttta taaggcattg tcacaaacta 4680 ttgagctatt ggaaggacat acttctgtga tcagccagca ctattatggt tgtcttttcc 4740 atgagctgct ggcatttcaa attggtgacc ggcatccaca acaagaggta aacatggctt 4800 gcctcttcca gttctccatc tcactcagtt ctgtccacaa ggtgccgaat gatctgttca 4860 agtggacact cccctcagca cgggcaagct agtccatgaa tttggattag ttccctctta 4920 gctgggtact tcgattacac cacaatgagc tcctcaacgt ggtctggttt atgtttttca 4980 tgttttccct ctaatgtttg gttgctcttt ttcagagaga acctgcagaa gtgatatcta 5040 aggagatgat agggttttca agttcagcta tgtccaccct agaaggagct gagtttttcg 5100 ttcctggttc catggaatcc ggtgtcatac atatggatct ggaccgcagc ttcttgccag 5160 taccttctgc agtaaacgcc tccattttcg aaagttttgt tcgtcagaac atcactgatt 5220 ctgaaaccga tgtccgttcc agcattcagc agctggtgaa agatagctat ggtttctcag 5280 caggcggtgc ttctgaaatt atatacggga acacctgtct cgcgctcttc aacaagcttg 5340 ttctttgctg catgcaagaa cagggcacct tgcttttccc cttgggaacc aacgggcatt 5400 acgtcaacgc agcaaagttt gtgaatgcaa ccaccttgac tattccaacg aaggcagatt 5460 caggcttcaa gatcgaacca agtgctctag ccgacacact agagaaggtg tctcagccgt 5520 gggtctatat ttctggcccc acaatcaacc ctactggctt cctgtacagt gacgacgata 5580 tagcagagct gctttctgtc tgtgcgacat acggagccag ggtggtgata gatacctcct 5640 cctctggtct ggagttccaa gccaccggct gcagccagtg gaatttggaa agatgtcttt 5700 27 201208586 ctaatgtcaa gtcttcaaag ccctcgttct ccgttgtcct gctcggagag ctgtcctttg 5760 agctgaccac ggctgggctt gatttcgggt ttctgattat gagcgactcg tccttggttg 5820 acacatttta cagtttccca agcttgagtc ggccacacag cacgttgaag tacacgttca 5880 ggaagctgtt gggtcttaag aaccagaagg atcagcattt ctctgatctc atccttgagc 5940 agaaggagac gttgaagaat cgtgccgacc agttgatcaa ggtatgcctt ttgggatatc 6000 ctgtgtttag gctctctgtt ttcttcccct gatcagctct ccgatcccct tacatcctta 6060 ggctaatttc agtacttcaa gtttgccacg catttctgac atattctttc ctcttgtttt 6120 attttcctgt gatgtgatga acagacgctt gagagctgcg gctgggacgc tgtgggctgc 6180 catggcggca tctcgatgct tgcaaaaccg accgcctaca ttggcaaatc gctcaaggtg 6240 gacggctttg agggcaagct ggacagccac aacatgaggg aagccctcct gaggtccacc 6300 gggctgtgca ttagcagcag cgggtggaca ggggtgccgg actactgccg cttcagcttt 6360 gctctggaga gcggcgactt cgaccgggcc atggagtgca tcgcccggtt cagggagctg 6420 gtccttggtg gcggtgctaa ggtgaatggt agcaactag 6459 <210> 11 <211> 6459
<212> DNA <213>大麥栽培品種Sebastian <400> 11 atggctgcgg cggcggggga cgtggaggcg ttcctggcgg cgtgccaggc gtcgggcgac 60 gcggcgtacg gcgccgccaa ggccgtgctg gagcggctcg aggcgccggc cacgcgcgcc 120 gaggccaggc ggctcctcgg cgccgtgcga cggcgcttcg ccgccggcgg cccggccgcg 180 gggctcgagt gcttccgcac cttccacttc cgcatccacg acgtcgtcct cgacccccac 240 ctccaaggtt gcccggcccc ttccctacac acccgttgtc gacccgcatc tctttcgccg 300 atctggccgt caaaagcacg cggcttggta gaaatcaagc ctgcaatcct gatccgttta 360 tggctggcca gtcgatcagt aatttggcca taactggagt ataaccttgg tctctaatct 420 ctacctgacc atataccgag ttggttttct ttcttcttgt ttccgtattt gtgtagtttt 480 ttcttttctt tcgagcatga tgttctttga attaatgcgt accagactcc agtaattcga 540 cattttgaat tttggcgagt gttcttggaa tttataacac aacgaggctt tgatcaagtg 600 gtttatgtag aggagtgttt ttgttcttgt gcaccgtata caattctcta tttcccaaca 660 attttgatgg cctctaagca tcctgtagtc atgtctactg tgtaagctac agatttattc 720 atgtctatgt gtaagctgca aatggagaga aaagctatct atttggttgt tccagcttgt 780 tctttggcag aacaatcctg cccatcctat caccataagt ataaaagcac gacaaatgag 840 tggggcaagc atgctgccaa gctaatacac gacataagct acatattttg aggggcatgt 900 tatctttttt tttcccttct actcagtttc ttctttggga gaacaatcct actcaaccta 960 28 201208586 taatcataag aataaaagca agacagatga gtgctgcaga ctattggcat atataacaac 1020 taaataggac atctgtccgc tatatcttta gttaataatt gtatatagac gcagtctttg 1080 tgctggaaaa actgcaacta aatattttct tacattatat ggaatctggg tgtgatatga 1140 cttctttgtt acgttttgtg tgcataaagc attaacttct gtctttagtt ggcgcagcgg 1200 taaaaacacc cattgcttaa tattttattt gctttccgta gcttgataaa atttcaactg 1260 cttctaggat tccagcaaag aaagaagcta acaatgatgg agatacccag cattttcatt 1320 ccagaagact ggtcattcac tttctacgag ggtctcaacc ggcatccaga ttccatcttc 1380 agggataaga cagtagcaga gctgggatgt ggcaatggtt ggatatccat tgcacttgca 1440 gaaaagtggt gcccttcgaa ggttggcacc tcttgttccg tagatattta tcttatctcg 1500 tttgttgcaa acatgggacc tgcagaagtt agacatttac tcaggttact ttatatgaaa 1560 cttttaggtg tctgccagta gtctgctggt ggtctaattt tcttggtata cctgatgccg 1620 tcgagcatat tgctttcaaa ttttgggcaa ggcattacca ccacatattg tttctacaat 1680 gctgaacaat tgctctcctt tgaaaggaag aaaaacaaga atgacatgca ccttagtagt 1740 ttaagccaca aataccagcg aatcaaatta gtttgcagtc agcttggcat taccttactt 1800 gagccttggt tgttcttttg aaggtttatg gtctggatat aaacccaaga gctatcaaga I860 ttgcatggat aaacctttac ttgaatgcac tagacgacga tggtctccca atctatgatg 1920 cggaggggaa aacattgctt gacagagtcg aattctatga atctgatctt ctttcttact 1980 gtagagataa caagatagaa cttgatcgca ttgttggatg cataccacag gtacggtcag 2040 gtttttacca"atttcctgtg aatggggatt atagtcgatc agaacttgat caaaatgccc 2100 ttaatatctg cctttcagat tcttaacccc aatccagagg caatgtcaaa gattgtaact 2160 gaaaattcaa gtgaggagtt cttgtactcc ttgagcaact actgtgctct ccaggtgagt 2220 tgagatctat ttaaactcaa gccattcagt ttacctgtta ctaaatggtt acccatgtca 2280 gagtctccaa atctttttct tttctcaaac agcaaagaga gaagaaaact tttaagttct 2340 atcctgaaat tgactttaca atgcttgttc ataatctgct tacgaaatat gcgtttgaac 2400 atttctcttt tccttgtagg catgtggtca gacctttata taagaaaatg aagtttttgt 2460 agaaataatg tatgctttgt acttatgaca tggttccacc agtataatca atttaagtct 2520 aggtagttag gaacctagga tggagagcac cgacagtgta taatatatat atgtcgatag 2580 ggggttagca gtccaaatcc acctcaagtt caacctattg cataactttt ggtcttacaa 2640 cctgtatgga caaatgtgat cagcacccca gtctttccta taaaaatgtc tgctggaata 2700 tggaattatt aacagcggta tttattttta ccctgtttaa ttttttcctt tgctaaaaga 2760 atgataatcc ttatgccacg aggttacatt gtattactca agtcaatatt tgttactatg 2820 gctgattgta cgattccagc ttccggttgt taattttgtt atgtttgtga actttgctgc 2880 29 201208586 attcagggtt ttgttgagga ccaatttggc ctcgggttga ttgctcgggc tgttgaagaa 2940 gggatatctg tgataaagcc tagtggtctt atggtattca acatgggagg ccggccagga 3000 caaggtgtct gtgagcgcct atttctacgc cgtggatttc gcatcaataa gctctggcaa 3060 acaaaaatta tgcaggtagc aattctttga gtgactagat gttaactaat cccagtgttt 3120 ttccatgcca gcaacagcat tatatcctgg ttagaggaat atgctcttca tgttgcacac 3180 caatcttcag ctgggcctag aattttcatc taccggctta catttttaca ttacagaacc 3240 aatttttgtt gaggatcatt accaactagt tgggtctttg caggctgctg acacagacat 3300 .ctccgcttta gttgaaattg agaaaaatag ccgacatcgc ttcgagttct ttatggatct 3360 tgttggggat cagcctgtgt gtgcgcgcac agcatgggca tacatgaaat ctggtggccg 3420 catttcacat gctttgtctg tgtatagctg tcaacttcgc cagcccaacc aggtacctat 3480 actctctgat tagatcttta caacaataat atagtaatgt caggaataat aataatttgg 3540 agaatttcag gtgaagaaaa tatttgagtt ccttaaagac ggattccatg aagtcagcag 3600 ctccctcgat ttgtcctttg atgatgattc tgttgctgat gaaaaaattc ctttcctagc 3660 atacctagct agtttcttgc aagagaataa gtctaatcct tgtgagcctc cagctggatg 3720 tttaaatttc cggaatcttg ttgctggatt tatgaagagt taccaccaca tcccattaac 3780 tcctgatgta agacttggtg tctattgcct acaattatgt ttgcttatta gaaattcata 3840 agatcaacct atttgatgct tctcacgtat gcttcatgtg acacttcctt ttcctctggt 3900 gcaccagaat gttgttgtgt tcccatcccg tgctgttgca atcgaaaatg ctcttcggtt 3960 gttctcacct ggacttgcaa ttgttgacga acacctaacc agacacttgc ccaagcaatg 4020 gttaacatct ttagcaattg aggtactttg accgatactc ccctctttct ttctgtgttt 4080 ggaactgtgg aaaatacatg tgttctgtga agaaaaagtt atgctgacaa gaatttcgat 4140 gttattgcca ttcttctaaa tttcaggaaa gtaaccatgc taaagataca gtaactgtaa 4200 tcgaagcacc acgccaatca gatttgctga ttgagttgat caggaaactg aagcctcagg 4260 ttgttgttac tggcatggct cagtttgagg ctatcaccag tgctgctttc gtgaacttat 4320 taagtgtaac gaaagatgtt ggttcccgat tattactaga tatttcagaa catctggaat 4380 tgtctagtct gccaagctca aatggtgtat tgaaatatct tgctgggaag accctgcctt 4440 cacatgcggc tatattgtgt ggcttagtta agaatcaggt gtgtgtcaat cagcctgaac 4500 tctagttgaa ctgttgtgca tactatatag aatatcttga cttttatatg tactttagaa 4560 acactgttta aatgtactca tttctttttg cttcatttta cttgcaggtt tattctgatc 4620 tggaagttgc ttttgctatc tctgaagatc caactgttta taaggcattg tcacaaacta 4680 ttgagctatt ggaaggacat acttctgtga tcagccagca ctattatggt tgtcttttcc 4740 atgagctgct ggcatttcaa attggtgacc ggcatccaca acaagaggta aacatggctt 4800 gcctcttcca gttctccatc tcactcagtt ctgtccacaa 30 ggtgccgaat gatctgttca 4860 201208586 agtggacact cccctcagca cgggcaagct agtccatgaa tttggattag ttccctctta 4920 gctgggtact tcgattacac cacaatgagc tcctcaacgt ggtctggttt atgtttttca 4980 tgttttccct ctaatgtttg gttgctcttt ttcagagaga acctgcagaa gtgatatcta 5040 aggagatgat agggttttca agttcagcta tgtccaccct agaaggagct gagtttttcg 5100 ttcctggttc catggaatcc ggtgtcatac atatggatct ggaccgcagc ttcttgccag 5160 taccttctgc agtaaacgcc tccattttcg aaagttttgt tcgtcagaac atcactgatt 5220 ctgaaaccga tgtccgttcc agcattcagc agctggtgaa agatagctat ggtttctcag 5280 caggcggtgc ttctgaaatt atatacggga acacctgtct cgcgctcttc aacaagcttg 5340 ttctttgctg catgcaagaa cagggcacct tgcttttccc cttgggaacc aacgggcatt 5400 acgtcaacgc agcaaagttt gtgaatgcaa ccaccttgac tattccaacg aaggcagatt 5460 caggcttcaa gatcgaacca agtgctctag ccgacacact agagaaggtg tctcagccgt 5520 gggtctatat ttctggcccc acaatcaacc ctactggctt cctgtacagt gacgacgata 5580 tagcagagct gctttctgtc tgtgcgacat acggagccag ggtggtgata gatacctcct 5640 cctctggtct ggagttccaa gccaccggct gcagccagtg gaatttggaa agatgtcttt 5700 ctaatgtcaa gtcttcaaag ccctcgttct ccgttgtcct gctcggagag ctgtcctttg 5760 agctgaccac ggctgggctt gatttcgggt ttctgattat gagcgactcg tccttggttg 5820 acacatttta cagtttccca agcttgagtc ggccacacag cacgttgaag tacacgttca 5880 ggaagctgttf gggtcttaag aaccagaagg atcagcattt ctctgatctc atccttgagc 5940 agaaggagac gttgaagaat cgtgccgacc agttgatcaa ggtatgcctt ttgggatatc 6000 ctgtgtttag gctctctgtt ttcttcccct gatcagctct ccgatcccct tacatcctta 6060 ggctaatttc agtacttcaa gtttgccacg catttctgac atattctttc ctcttgtttt 6120 attttcctgt gatgtgatga acagacgctt gagagctgcg gctgggacgc tgtgggctgc 6180 catggcggca tctcgatgct tgcaaaaccg accgcctaca ttggcaaatc gctcaaggtg 6240 gacggctttg agggcaagct ggacagccac aacatgaggg aagccctcct gaggtccacc 6300 gggctgtgca ttagcagcag cgggtggaca ggggtgccgg actactgccg cttcagcttt 6360 gctctggaga gcggcgactt cgaccgggcc atggagtgca tcgcccggtt cagggagctg 6420 gtccttggtg gcggtgctaa ggtgaatggt agcaactag 6459 <210> 12 <211> 6459
<212> DNA <213> 大麥突變體14018 <400> 12 atggctgcgg cggcggggga cgtggaggcg ttcctggcgg cgtgccaggc gtcgggcgac 60 gcggcgtacg gcgccgccaa ggccgtgctg gagcggctcg aggcgccggc cacgcgcgcc 120 31 201208586 gaggccaggc ggctcctcgg cgccgtgcga cggcgcttcg ccgccggcgg cccggccgcg 180 gggctcgagt gcttccgcac cttccacttc cgcatccacg acgtcgtcct cgacccccac 240 ctccaaggtt gcccggcccc ttccctacac acccgttgtc gacccgcatc tctttcgccg 300 atctggccgt caaaagcacg cggcttggta gaaatcaagc ctgcaatcct gatccgttta 360 tggctggcca gtcgatcagt aatttggcca taactggagt ataaccttgg tctctaatct 420 ctacctgacc atataccgag ttggttttct ttcttcttgt ttccgtattt gtgtagtttt 480 ttcttttctt tcgagcatga tgttctttga attaatgcgt accagactcc agtaattcga 540 cattttgaat tttggcgagt gttcttggaa tttataacac aacgaggctt tgatcaagtg 600 gtttatgtag aggagtgttt ttgttcttgt gcaccgtata caattctcta tttcccaaca 660 attttgatgg cctctaagca tcctgtagtc atgtctactg tgtaagctac agatttattc 720 atgtctatgt gtaagctgca aatggagaga aaagctatct atttggttgt tccagcttgt 780 tctttggcag aacaatcctg cccatcctat caccataagt ataaaagcac gacaaatgag 840 tggggcaagc atgctgccaa gctaatacac gacataagct acatattttg aggggcatgt 900 tatctttttt tttcccttct actcagtttc ttctttggga gaacaatcct actcaaccta 960 taatcataag aataaaagca agacagatga gtgctgcaga ctattggcat atataacaac 1020 taaataggac atctgtccgc tatatcttta gttaataatt gtatatagac gcagtctttg 1080 tgctggaaaa actgcaacta aatattttct tacattatat ggaatctggg tgtgatatga 1140 cttctttgtt acgttttgtg tg.cataaagc attaacttct gtctttagtt ggcgcagcgg 1200 taaaaacacc cattgcttaa tattttattt gctttccgta gcttgataaa atttcaactg 1260 cttctaggat tccagcaaag aaagaagcta acaatgatgg agatacccag cattttcatt 1320 ccagaagact ggtcattcac tttctacgag ggtctcaacc ggcatccaga ttccatcttc 1380 agggataaga cagtagcaga gctgggatgt ggcaatggtt ggatatccat tgcacttgca 1440 gaaaagtggt gcccttcgaa gattggcacc tcttgttccg tagatattta tcttatctcg 1500 tttgttgcaa acatgggacc tgcagaagtt agacatttac tcaggttact ttatatgaaa 1560 cttttaggtg tctgccagta gtctgctggt ggtctaattt tcttggtata cctgatgccg 1620 tcgagcatat tgctttcaaa ttttgggcaa ggcattacca ccacatattg tttctacaat 1680 gctgaacaat tgctctcctt tgaaaggaag aaaaacaaga atgacatgca ccttagtagt 1740 ttaagccaca aataccagcg aatcaaatta gtttgcagtc agcttggcat taccttactt 1800 gagccttggt tgttcttttg aaggtttatg gtctggatat aaacccaaga gctatcaaga I860 ttgcatggat aaacctttac ttgaatgcac tagacgacga tggtctccca atctatgatg 1920 cggaggggaa aacattgctt gacagagtcg aattctatga atctgatctt ctttcttact . 1980 gtagagataa caagatagaa cttgatcgca ttgttggatg cataccacag gtacggtcag 2040 32 201208586 gtttttacca atttcctgtg aatggggatt atagtcgatc agaacttgat caaaatgccc 2100 ttaatatctg cctttcagat tcttaacccc aatccagagg caatgtcaaa gattgtaact 2160 gaaaattcaa gtgaggagtt cttgtactcc ttgagcaact actgtgctct ccaggtgagt 2220 tgagatctat ttaaactcaa gccattcagt ttacctgtta ctaaatggtt acccatgtca 2280 gagtctccaa atctttttct tttctcaaac agcaaagaga gaagaaaact tttaagttct 2340 atcctgaaat tgactttaca atgcttgttc ataatctgct tacgaaatat gcgtttgaac 2400 atttctcttt tccttgtagg catgtggtca gacctttata taagaaaatg aagtttttgt 2460 agaaataatg tatgctttgt acttatgaca tggttccacc agtataatca atttaagtct 2520 aggtagttag gaacctagga tggagagcac cgacagtgta taatatatat atgtcgatag 2580 ggggttagca gtccaaatcc acctcaagtt caacctattg cataactttt ggtcttacaa 2640 cctgtatgga caaatgtgat cagcacccca gtctttccta taaaaatgtc tgctggaata 2700 tggaattatt aacagcggta tttattttta ccctgtttaa ttttttcctt tgctaaaaga 2760 atgataatcc ttatgccacg aggttacatt gtattactca agtcaatatt tgttactatg 2820 gctgattgta cgattccagc ttccggttgt taattttgtt atgtttgtga actttgctgc 2880 attcagggtt ttgttgagga ccaatttggc ctcgggttga ttgctcgggc tgttgaagaa 2940 gggatatctg tgataaagcc tagtggtctt atggtattca acatgggagg ccggccagga 3000 caaggtgtct gtgagcgcct atttctacgc cgtggatttc gcatcaataa gctctggcaa 3060 acaaaaatta tgcaggtagc aattctttga gtgactagat gttaactaat cccagtgttt 3120 ttccatgcca gcaacagcat tatatcctgg ttagaggaat atgctcttca tgttgcacac 3180 caatcttcag ctgggcctag aattttcatc taccggctta catttttaca ttacagaacc 3240 aatttttgtt gaggatcatt accaactagt tgggtctttg caggctgctg acacagacat 3300 ctccgcttta gttgaaattg agaaaaatag ccgacatcgc ttcgagttct ttatggatct 3360 tgttggggat cagcctgtgt gtgcgcgcac agcatgggca tacatgaaat ctggtggccg 3420 catttcacat gctttgtctg tgtatagctg tcaacttcgc cagcccaacc aggtacctat 3480 actctctgat tagatcttta caacaataat atagtaatgt caggaataat aataatttgg 3540 agaatttcag gtgaagaaaa tatttgagtt ccttaaagac ggattccatg aagtcagcag 3600 ctccctcgat ttgtcctttg atgatgattc tgttgctgat gaaaaaattc ctttcctagc 3660 atacctagct agtttcttgc aagagaataa gtctaatcct tgtgagcctc cagctggatg 3720 tttaaatttc cggaatcttg ttgctggatt tatgaagagt taccaccaca tcccattaac 3780 tcctgatgta agacttggtg tctattgcct acaattatgt ttgcttatta gaaattcata 3840 agatcaacct atttgatgct tctcacgtat gcttcatgtg acacttcctt ttcctctggt 3900 gcaccagaat gttgttgtgt tcccatcccg tgctgttgca atcgaaaatg ctcttcggtt 3960 gttctcacct ggacttgcaa ttgttgacga acacctaacc agacacttgc ccaagcaatg 4020 33 201208586 gttaacatct ttagcaattg aggtactttg accgatactc ccctctttct ttctgtgttt 4080 ggaactgtgg aaaatacatg tgttctgtga agaaaaagtt atgctgacaa gaatttcgat 4140 gttattgcca ttcttctaaa tttcaggaaa gtaaccatgc taaagataca gtaactgtaa 4200 乜cgaagcacc acgccaatca gatttgctga ttgagttgat caggaaactg aagcctcagg 4260 ttgttgttac tggcatggot cagtttgagg ctatcaccag tgctgctttc gtgaacttat 4320 taagtgtaac gaaagatgtt ggttcccgat tattactaga tatttcagaa catctggaat 4380 tgtctagtct gccaagctca aatggtgtat tgaaatatct tgctgggaag accctgcctt 4440 cacatgcggc tatattgtgt ggcttagtta agaatcaggt gtgtgtcaat cagcctgaac 4500 tctagttgaa ctgttgtgca tactatatag aatatcttga cttttatatg tactttagaa 4560 acactgttta aatgtactca tttctttttg cttcatttta cttgcaggtt tattctgatc 4620 tggaagttgc ttttgctatc tctgaagatc caactgttta taaggcattg tcacaaacta 4680 ttgagctatt ggaaggacat acttctgtga tcagccagca ctattatggt tgtcttttcc 4740 atgagctgct ggcatttcaa attggtgacc ggcatccaca acaagaggta aacatggctt 4800 gcctcttcca gttctccatc tcactcagtt ctgtccacaa ggtgccgaat gatctgttca 4860 agtggacact cccctcagca cgggcaagct agtccatgaa tttggattag ttccctctta 4920 gctgggtact tcgattacac cacaatgagc tcctcaacgt ggtctggttt atgtttttca 4980 tgttttccct ctaatgtttg gttgctcttt ttcagagaga acctgcagaa gtgatatcta 5040 aggagatgat agggttttca agttcagcta tgtccaccct agaaggagct gagtttttcg 5100 ttcctggttc catggaatcc ggtgtcatac atatggatct ggaccgcagc ttcttgccag 5160 taccttctgc agtaaacgcc tccattttcg aaagttttgt tcgtcagaac atcactgatt 5220 ctgaaaccga tgtccgttcc agcattcagc agctggtgaa agatagctat ggtttctcag 5280 caggcggtgc ttctgaaatt atatacggga acacctgtct cgcgctcttc aacaagcttg 5340 ttctttgctg catgcaagaa cagggcacct tgcttttccc cttgggaacc aacgggcatt 5400 acgtcaacgc agcaaagttt gtgaatgcaa ccaccttgac tattccaacg aaggcagatt 5460 caggcttcaa gatcgaacca agtgctctag ccgacacact agagaaggtg tctcagccgt 5520 gggtctatat ttctggcccc acaatcaacc ctactggctt cctgtacagt gacgacgata 5580 tagcagagct gctttctgtc tgtgcgacat acggagccag ggtggtgata gatacctcct 5640 cctctggtct ggagttccaa gccaccggct gcagccagtg gaatttggaa agatgtcttt 5700 ctaatgtcaa gtcttcaaag ccctcgttct ccgttgtcct gctcggagag ctgtcctttg 5760 agctgaccac ggctgggctt gatttcgggt ttctgattat gagcgactcg tccttggttg 5820 acacatttta cagtttccca agcttgagtc ggccacacag cacgttgaag tacacgttca 5880 ggaagctgtt gggtcttaag aaccagaagg atcagcattt ctctgatctc atccttgagc 5940 34 201208586 agaaggagac gttgaagaat cgtgccgacc agttgatcaa ggtatgcctt ttgggatatc 6000 ctgtgtttag gctctctgtt ttcttcccct gatcagctct ccgatcccct tacatcctta 6060 ggctaatttc agtacttcaa gtttgccacg catttctgac atattctttc ctcttgtttt 6120 attttcctgt gatgtgatga acagacgctt gagagctgcg gctgggacgc tgtgggctgc 6180 catggcggca tctcgatgct tgcaaaaccg accgcctaca ttggcaaatc gctcaaggtg 6240 gacggctttg agggcaagct ggacagccac aacatgaggg aagccctcct gaggtccacc 6300 gggctgtgca ttagcagcag cgggtggaca ggggtgccgg actactgccg cttcagcttt 6360 gctctggaga gcggcgactt cgaccgggcc atggagtgca tcgcccggtt cagggagctg 6420 gtccttggtg gcggtgctaa ggtgaatggt agcaactag 6459 <210> 13
<211> 1088 <212> PRT <213>大麥栽培品種Prestige <400> 13
Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin 15 10 15
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg 20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala 35. 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys 50 55 60
Phe Arg Thr Phe His Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His 65 70 75 80
Leu Gin Gly Phe Gin Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro 85 90 95
Ser lie Phe lie Pro Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu 100 105 110
Asn Arg His Pro Asp Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu 115 120 125
Gly Cys Gly Asn Gly Trp lie Ser lie Ala Leu Ala Glu Lys Trp Cys 130 135 140
Pro Ser Lys Val Tyr Gly Leu Asp lie Asn Pro Arg Ala lie Lys lie 145 150 155 160 35 201208586
Ala Trp lie
Asn Leu Tyr Leu Asn Ala Leu Asp Asp Asp Gly Leu Pro 165 170 175 lie Tyr Asp
Ala Glu Gly Lys Thr Leu Leu Asp Arg Val Glu Phe Tyr 180 185 190
Glu Ser Asp 195
Leu Leu Ser Tyr Cys Arg Asp Asn Lys lie Glu Leu Asp 200 205
Arg lie Val 210
Gly Cys lie Pro Gin lie Leu Asn Pro Asn Pro Glu Ala 215 220
Met Ser Lys 225 lie Val Thr Glu Asn Ser Ser Glu Glu Phe Leu Tyr Ser 230 235 240
Leu Ser Asn
Tyr Cys Ala Leu Gin Gly Phe Val Glu Asp Gin Phe Gly 245 250 255
Leu Gly Leu lie Ala Arg Ala Val Glu Glu Gly lie Ser Val lie Lys 260 265 270
Pro Ser Gly 275
Leu Met Val Phe Asn Met Gly Gly Arg Pro Gly Gin Gly 280 285
Val Cys Glu 290
Arg Leu Phe Leu Arg Arg Gly Phe Ar.g lie Asn Lys Leu 295 300
Trp Gin Thr 305
Lys lie Met Gin Ala Ala Asp Thr Asp lie Ser Ala Leu 310 315 320
Val Glu lie
Glu Lys Asn Ser Arg His Arg Phe Glu Phe Phe Met Asp 325 330 335
Leu Val Gly
Asp Gin Pro Val Cys Ala Arg Thr Ala Trp Ala Tyr Met 340 345 350
Lys Ser Gly 355
Gly Arg 工le Ser His Ala Leu Ser Val Tyr Ser Cys Gin 360 365
Leu Arg Gin 370
Pro Asn Gin Val Lys Lys lie Phe Glu Phe Leu Lys Asp 375 380
Gly Phe His 385
Glu Val Ser Ser Ser Leu Asp Leu Ser Phe Asp Asp Asp 390 395 400
Ser Val Ala
Asp Glu Lys lie Pro Phe Leu Ala Tyr Leu Ala Ser Phe 405 410 415 36 201208586 • Leu Gin Glu Asn Lys Ser Asn Pro Cys Glu Pro Pro Ala Gly Cys Leu 420 425 430
Asn Phe Arg Asn Leu Val Ala Gly Phe Met Lys Ser Tyr His His lie 435 440 445
Pro Leu Thr Pro Asp Asn Val Val Val Phe Pro Ser Arg Ala Val Ala 450 455 460 lie Glu Asn Ala Leu Arg Leu Phe Ser Pro Gly Leu Ala lie Val Asp 465 470 475 480
Glu His Leu Thr Arg His Leu Pro Lys Gin Trp Leu Thr Ser Leu Ala 485 490 495 lie Glu Glu Ser Asn His Ala Lys Asp Thr Val Thr Val lie Glu Ala 500 505 510
Pro Arg Gin Ser Asp Leu Leu lie Glu Leu lie Arg Lys Leu Lys Pro 515 520 525
Gin Val Val Val Thr Gly Met Ala Gin Phe Glu Ala lie Thr Ser Ala 530 535 540
Ala Phe Val Asn Leu Leu Ser Val Thr Lys Asp Val Gly Ser Arg Leu 545 550 555 560
Leu Leu Asp lie Ser Glu His Leu Glu Leu Ser Ser Leu Pro Ser Ser 565 570 575
Asn Gly Val Leu Lys Tyr Leu Ala Gly Lys Thr Leu Pro Ser His Ala 580 585 590
Ala lie Leu Cys Gly Leu Val Lys Asn Gin Val Tyr Ser Asp Leu Glu 595 600 605
Val Ala Phe Ala lie Ser Glu Asp Pro Thr Val Tyr Lys Ala Leu Ser 610 615 620
Gin Thr lie Glu Leu Leu Glu Gly His Thr Ser Val lie Ser Gin His 625 630 635 640
Tyr Tyr Gly Cys Leu Phe His Glu Leu Leu Ala Phe Gin lie Gly Asp 645 650 655
Arg His Pro Gin Gin Glu Arg Glu Pro Ala Glu Val lie Ser Lys Glu 660 665 670
Met lie Gly Phe Ser Ser Ser Ala Met Ser Thr Leu Glu Gly Ala Glu 37 201208586 675 680 685 Phe Phe Val Pro Gly Ser Met Glu Ser Gly Val lie His Met Asp Leu 690 695 700
Asp Arg Ser Phe Leu Pro Val Pro Ser Ala Val Asn Ala Ser lie Phe 705 710 715 720
Glu Ser Phe Val Arg Gin Asn lie Thr Asp Ser Glu Thr Asp Val Arg 725 730 735
Ser Ser lie Gin Gin Leu Val Lys Asp Ser Tyr Gly Phe Ser Ala Gly 740 745 750
Gly Ala Ser Glu lie lie Tyr Gly Asn Thr Cys Leu Ala Leu Phe Asn 755 760 765
Lys Leu Val Leu Cys Cys Met Gin Glu Gin Gly Thr Leu Leu Phe Pro 770 775 780
Leu Gly Thr Asn Gly His Tyr Val Asn Ala Ala Lys Phe Val Asn Ala 785 790 795 800
Thr Thr Leu Thr lie Pro Thr Lys Ala Asp Ser Gly Phe Lys lie Glu 805 810 815
Pro Ser Ala Leu Ala Asp Thr Leu Glu Lys Val Ser Gin Pro Trp Val 820 825 830
Tyr lie Ser Gly Pro Thr lie Asn Pro Thr Gly Phe Leu Tyr Ser Asp 835 840 845
Asp Asp lie Ala Glu Leu Leu Ser Val Cys Ala Thr Tyr Gly Ala Arg 850 855 860
Val Val lie Asp Thr Ser Ser Ser Gly Leu Glu Phe Gin Ala Thr Gly 865 870 875 880
Cys Ser Gin Trp Asn Leu Glu Arg Cys Leu Ser Asn Val Lys Ser Ser 885 890 895
Lys Pro Ser Phe Ser Val Val Leu Leu Gly Glu Leu Ser Phe Glu Leu 900 905 910
Thr Thr Ala Gly Leu Asp Phe Gly Phe Leu lie Met Ser Asp Ser Ser 915 920 925
Leu Val Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Pro Ser Leu Ser Arg Pro His Ser 930 935 940 38 201208586
Thr Leu Lys Tyr Thr Phe Arg Lys Leu Leu Gly Leu Lys Asn Gin Lys 945 950 955 960
Asp Gin His Phe Ser Asp Leu lie Leu Glu Gin Lys Glu Thr Leu Lys 965 970 975
Asn Arg Ala Asp Gin Leu lie Lys Thr Leu Glu Ser Cys Gly Trp Asp 980 985 990
Ala Val Gly Cys His Gly Gly lie Ser Met Leu Ala Lys Pro Thr Ala 995 1000 1005
Tyr lie Gly Lys Ser Leu Lys Val Asp Gly Phe Glu Gly Lys Leu 1010 1015 1020
Asp Ser His Asn Met Arg Glu Ala Leu Leu Arg Ser Thr Gly Leu 1025 1030 1035
Cys lie Ser Ser Ser Gly Trp Thr Gly Val Pro Asp Tyr Cys Arg 1040 1045 1050
Phe Ser Phe Ala Leu Glu Ser Gly Asp Phe Asp Arg Ala Met Glu 1055 1060 1065
Cys lie Ala Arg Phe Arg Glu Leu Val Leu Gly Gly Gly Ala Lys 1070 1075 1080
Val Asn Gly Ser Asn 1085 <210> 14
<211> 1088 <212> PRT <213〉大麥栽培品種Sebastian <400> 14
Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin 15 10 15
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg 20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala 35 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys 50 55 60 39 201208586
Phe Arg Thr Phe His 65 Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His 70 75 80 Leu Gin Gly Phe Gin 85 Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro 90 95 Ser lie Phe lie Pro 100 Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu 105 110 Asn Arg His Pro Asp 115 Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu 120 125 Gly Cys Gly Asn Gly 130 Trp lie Ser lie Ala Leu Ala Glu Lys Trp Cys 135 140 Pro Ser Lys Val Tyr 145 Gly Leu Asp lie Asn Pro Arg Pro lie Lys lie 150 155 160 Ala Trp lie Asn Leu 165 Tyr Leu Asn Ala Leu Asp Asp Asp Gly Leu Pro 170 175 lie Tyr Asp Ala Glu 180 Gly Lys Thr Leu Leu Asp Arg Val Glu Phe Tyr 185 190 Glu Ser Asp Leu Leu 195 Ser Tyr Cys Arg Asp Asn Lys lie Glu Leu Asp 200 205 Arg lie Val Gly Cys 210 lie Pro Gin lie Leu Asn Pro Asn Pro Glu Ala 215 220 Met Ser Lys lie Val 225 Thr Glu Asn Ser Ser Glu Glu Phe Leu Tyr Ser 230 235 240 Leu Ser Asn Tyr Cys 245 Ala Leu Gin Gly Phe Val Glu Asp Gin Phe Gly 250 255 Leu Gly Leu lie Ala 260 Arg Ala Val Glu Glu Gly lie Ser Val lie Lys 265 270 Pro Ser Gly Leu Met 275 Val Phe Asn Met Gly Gly Arg Pro Gly Gin Gly 280 285 Val Cys Glu Arg Leu 290 Phe Leu Arg Arg Gly Phe Arg lie Asn Lys Leu 295 300 Trp Gin Thr Lys lie 305 Met Gin Ala Ala Asp Thr Asp lie Ser Ala Leu 310 315 320 Val Glu lie Glu Lys Asn Ser Arg His Arg Phe Glu Phe Phe Met Asp 40 201208586 325. 330 335
Leu Val Gly Asp Gin Pro Val Cys Ala Arg Thr Ala Trp Ala Tyr Met 340 345 350
Lys Ser Gly Gly Arg lie Ser His Ala Leu Ser Val Tyr Ser Cys Gin 355 360 365
Leu Arg Gin Pro Asn Gin Val Lys Lys lie Phe Glu Phe Leu Lys Asp 370 375 380
Gly Phe His Glu Val Ser Ser Ser Leu Asp Leu Ser Phe Asp Asp Asp 385 390 395 400
Ser Val Ala Asp Glu Lys lie Pro Phe Leu Ala Tyr Leu Ala Ser Phe 405 410 415
Leu Gin Glu Asn Lys Ser Asn Pro Cys Glu Pro Pro Ala Gly Cys Leu 420 425 430
Asn Phe Arg Asn Leu Val Ala Gly Phe Met Lys Ser Tyr His His lie 435 440 445
Pro Leu Thr Pro Asp Asn Val Val Val Phe Pro Ser Arg Ala Val Ala 450 455 460 lie Glu Asn Ala Leu Arg Leu Phe Ser Pro Gly Leu Ala lie Val Asp 465 470 475 480
Glu His Leu Thr Arg His Leu Pro Lys Gin Trp Leu Thr Ser Leu Ala 485 490 495 lie Glu Glu Ser Asn His Ala Lys Asp Thr Val Thr Val lie Glu Ala 500 505 510
Pro Arg Gin Ser Asp Leu Leu lie Glu Leu lie Arg Lys Leu Lys Pro 515 520 525
Gin Val Val Val Thr Gly Met Ala Gin Phe Glu Ala lie Thr Ser Ala 530 535 540
Ala Phe Val Asn Leu Leu Ser Val Thr Lys Asp Val Gly Ser Arg Leu 545 550 555 560
Leu Leu Asp lie Ser Glu His Leu Glu Leu Ser Ser Leu Pro Ser Ser 565 570 575
Asn Gly Val Leu Lys Tyr Leu Ala Gly Lys Thr Leu Pro Ser His Ala 580 585 590 41 201208586
Ala lie Leu Cys 595 Gly Leu Val Lys Asn Gin Val Tyr Ser Asp Leu Glu 600 605 Val Ala Phe Ala 610 lie Ser Glu Asp Pro Thr Val Tyr Lys Ala Leu Ser 615 620 Gin Thr lie Glu 625 Leu Leu Glu Gly His Thr Ser Val lie Ser Gin His 630 635 640 Tyr Tyr Gly Cys Leu Phe His Glu Leu Leu Ala Phe Gin lie Gly Asp 645 650 655 Arg His Pro Gin 660 Gin Glu Arg Glu Pro Ala Glu Val lie Ser Lys Glu 665 670 Met lie Gly Phe 675 Ser Ser Ser Ala Met Ser Thr Leu Glu Gly Ala Glu 680 685 Phe Phe Val Pro 690 Gly Ser Met Glu Ser Gly Val lie His Met Asp Leu 695 700 Asp Arg Ser Phe 705 Leu Pro Val Pro Ser Ala Val Asn Ala Ser lie Phe 710 715 720 Glu Ser Phe Val Arg Gin Asn He Thr Asp Ser Glu Thr Asp Val Arg 725 730 735 Ser Ser lie Gin 740 Gin Leu Val Lys Asp Ser Tyr Gly Phe Ser Ala Gly 745 750 Gly Ala Ser Glu 755 lie lie Tyr Gly Asn Thr Cys Leu Ala Leu Phe Asn 760 765 Lys Leu Val Leu 770 Cys Cys Met Gin Glu Gin Gly Thr Leu Leu Phe Pro 775 780 Leu Gly Thr Asn 785 Gly His Tyr Val Asn Ala Ala Lys Phe Val Asn Ala 790 795 800 Thr Thr Leu Thr lie Pro Thr Lys Ala Asp Ser Gly Phe Lys lie Glu 805 810 815 Pro Ser Ala Leu 820 Ala Asp Thr Leu Glu Lys Val Ser Gin Pro Trp Val 825 830 Tyr lie Ser Gly 835 Pro Thr lie Asn Pro Thr Gly Phe Leu Tyr Ser Asp 840 845 42 201208586
Asp Asp He Ala Glu Leu Leu Ser Val Cys Ala Thr Tyr Gly Ala Arg 850 855 860
Val Val lie Asp Thr Ser Ser Ser Gly Leu Glu Phe Gin Ala Thr Gly 865 870 875 880
Cys Ser Gin Trp Asn Leu Glu Arg Cys Leu Ser Asn Val Lys Ser Ser 885 890 895
Lys Pro Ser Phe Ser Val Val Leu Leu Gly Glu Leu Ser Phe Glu Leu 900 905 910
Thr Thr Ala Gly Leu Asp Phe Gly Phe Leu lie Met Ser Asp Ser Ser 915 920 925
Leu Val Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Pro Ser Leu Ser Arg Pro His Ser 930 935 940
Thr Leu Lys Tyr Thr Phe Arg Lys Leu Leu Gly Leu Lys Asn Gin Lys 945 950 955 960
Asp Gin His Phe Ser Asp Leu lie Leu Glu Gin Lys Glu Thr Leu Lys 965 970 975
Asn Arg Ala Asp Gin Leu lie Lys Met Leu Glu Ser Cys Gly Trp Asp 980 985 990
Ala Val Gly Cys His Gly Gly lie Ser Met Leu Ala Lys Pro Thr Ala 995 1000 1005
Tyr lie Gly Lys Ser Leu Lys Val Asp Gly Phe Glu Gly Lys Leu 1010 1015 1020
Asp Ser His Asn Met Arg Glu Ala Leu Leu Arg Ser Thr Gly Leu 1025 1030 1035
Cys lie Ser Ser Ser Gly Trp Thr Gly Val Pro Asp Tyr Cys Arg 1040 1045 1050
Phe Ser Phe Ala Leu Glu Ser Gly Asp Phe Asp Arg Ala Met Glu 1055 1060 1065
Cys lie Ala Arg Phe Arg Glu Leu Val Leu Gly Gly Gly Ala Lys 1070 1075 1080
Val Asn Gly Ser Asn 1085 43 201208586 <210> 15
<211> 186 <212> PRT <213> 大麥突變體14018 <400> 15
Met Ala Ala Ala Ala GXy Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin 15 10 15
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg 20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala 35 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys 50 55 60
Phe Arg Thr Phe His Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His 65 70 75 80
Leu Gin Gly Phe Gin Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro 85 90 95
Ser lie Phe lie Pro Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu 100 105 110
Asn Arg His Pro Asp Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu 115 120 125
Gly Cys Gly Asn Gly Trp lie Ser lie Ala Leu Ala Glu Lys Trp Cys 130 135 140
Pro Ser Lys lie Gly Thr Ser Cys Ser Val Asp lie Tyr Leu lie Ser 145 150 155 160
Phe Val Ala Asn Met Gly Pro Ala Glu Val Arg His Leu Leu Arg Leu 165 170 175
Leu Tyr Met Lys Leu Leu Gly Val Cys Gin 180 185
<210> 16 <211> 180 <212> PRT <213〉大麥突變體14018 <400> 16
Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin 15 10 15 44 201208586
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg 20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala 35 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys 50 55 60
Phe Arg Thr Phe His Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His 65 70 Ί5 80
Leu Gin Gly Phe Gin Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro 85 90 95
Ser lie Phe lie Pro Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu 100 105 110
Asn Arg His Pro Asp Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu 115 120 125
Gly Cys Gly Asn Gly Trp lie Ser lie Ala Leu Ala Glu Lys Trp Cys 130 135 140
Pro Ser Lys lie Gly Thr Ser Cys Ser Val Asp lie Tyr Leu lie Ser 145 150 155 160
Phe Val Ala Asn Met Gly Pro Ala Glu Val Arg His Leu Leu Arg Phe 165 170 175
Met Val Trp lie 180 <210〉 17 <211> 163
<212> PRT <213> 大麥突變體14018 <400> 17
Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin 15 10 15
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg 20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala 35 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys 45 201208586 50 55 60
Phe Arg Thr Phe His Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His 65 70 75 80
Leu Gin Gly Phe Gin Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro 85 90 95
Ser lie Phe lie Pro Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu 100 105 110
Asn Arg His Pro Asp Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu 115 120 125
Gly Cys Gly Asn Gly Leu Trp Ser Gly Tyr Lys Pro Lys Ser Tyr Gin 130 135 140
Asp Cys Met Asp Lys Pro Leu Leu Glu Cys Thr Arg Arg Arg Trp Ser 145 150 155 160
Pro Asn Leu 46

Claims (1)

  1. 201208586 七、申請專利範圍： 1· 一種製備具有低含量之一或多種異味物質及/或其前 驅物的基於榖類之飲料的方法，其中該方法涉及能量輸入 減少’該方法包含以下步驟： (1)提供穀類植物或其部分’其中該穀類植物包含： (a )引起功能性脂肪加氧酶-i ( L〇x_丨）完全喪失之 第一突變；及 (b ).引起功能性L0X_2完全喪失之第二突變；及 (c)引起功此性S -腺芽甲硫胺酸：甲硫胺酸曱基轉 移酶（MMT )完全喪失之第三突變； (1〇視情況將該縠類之至少一部分孵麥芽，由此獲得 經孵麥芽之縠類； (u i )將該榖類及/或經孵麥芽之榖類及視情況選用之 其他佐劑製醪，由此獲得麥芽汁； (iv )視情況在其他成分存在下加熱該麥芽汁，其中蒸 發該麥芽汁體積之至多4%，由此獲得經加熱之麥芽汁； (v)將該經加熱之麥芽汁加工成飲料； 由此製備具有低含量之 ^ 或多種異味物質及/或其前驅 物的該來源於榖類之飲料。 2.如申請專利範圍第丨項 仗vb — 士』 只艾方法，其中該方法為用於製 備具有低含量之一或多錄里。土心 種〃未物質及/或其前驅物的基於大 麥之飲料的方法，其中該方法旦 J及此里輸入減少，該方，、务 包含以下步驟： π ⑴提供大麥植物或其部分，其中該大麥植物包含： 201208586 (a )引起功能性脂肪加氧酶-1 ( LOX-1 )完全喪失之 第一突變；及 (b )引起功能性LOX-2完全喪失之第二突變；及 (c )引起功能性S -腺苦甲硫胺酸：曱硫胺酸§ -甲基轉 移酶（MMT )完全喪失之第三突變； (i i )視情況將該穀類之至少一部分脾麥芽，由此獲得 經孵麥芽之榖類； (i i i )將β亥縠類及/或經孵麥芽之榖類及視情況選用之 其他佐劑製醪，由此獲得麥芽汁； (iv )視情況在其他成分存在下加熱該麥芽汁，其中蒸 發該麥芽汁體積之至多4%，由此獲得經加熱之麥芽汁； (v )將該經加熱之麥芽汁加工成飲料； 由此製備具有低含量之一或多種異味物質及/或其前驅 物的來源於榖類之飲料。如申請專利範圍第丨項之方法， 其中該穀類為大麥植物。 3.如申請專利範圍第2項之方法’其中步驟（i)包含 提供大麥籽粒。 4_如申請專利範圍第1項之方法，其中該等異味物質 二甲硫醚（DMS)及反式-2·壬烯醛（T2N)。 5. 如申請專利範㈣2項之方法，其中該等異味物質 二甲硫喊（DMS)及反式·2_壬歸搭（t2n)。 6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該等之 含量為麵之含量低於30ppb，較佳低於⑽，更佳 於2〇PPb，且該等T2N之低含量為含量低於^响， 2 201208586 如低於0.024 ppb。 7.如申請專利範圍第5項之方法，其中該等DMS之低 含里為DMS之含量低於30 ppb，較佳低於25 ppb，更佳低 於20Ppb，且該等T2N之低含量為含量低於〇 〇25ppb，諸 如低於0.024 ppb 〇 8_如申請專利範圍第丨項之方法’其中該等異味物質之 前驅物為S-甲基•甲硫胺酸（smm)及潛在T2N » 9 ·如申請專利範圍第2項之方法’其中該等異味物質之 前驅物為S-甲基-甲硫胺酸（SMM)及潛在T2N。 1 〇.如申請專利範圍第8項之方法，其中該等SMM及潛 在T2N之低含量為SMM之含量低於5〇 ppb，較佳低於 PPb，更佳低於30 ppb，甚至更佳低於2〇 ppb，且潛在T2N 之含量‘低於2 ppb，較佳低於1.5 ppb。 11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該等SMM及潛 在T2N之低含量為SMM之含量低於5〇 ppb，較佳.低於4〇 Ppb，更佳低於30ppb，甚至更佳低於2〇ppb，且潛在T2N 之含量低於2 ppb，較佳低於1>5 ppb。 12. 如申請專利範圍第8至u項中任一項之方法，其中 該等SMM之低含量為SMM之含量低於5〇 ppb，較佳低於 4〇 ppb ,更佳低於30 ppb ’甚至更佳低於2〇 ppb，且該等潛 在T2N之低含量為潛在T2N之含量為以相同方式自野生型 大麥，較佳自栽培品種Quench製備之飲料中潛在UN含量 之60%以下，較佳5〇%以下。 13. 如申請專利範圍第丨至n項中任一項之方法，其中 3 201208586 將所有該所提供之大麥孵麥芽。 ，大L如申請專利範圍第1至U項中任-項之方法，其中 "大麥係使用包含以下步驟之方法孵麥芽： a )浸泡該大麥； b )使該大麥萌芽； c )將該大麥窯式乾燥。 二5.”請專利範圍第14項之方法，其中 ㈣之溫度下進行，更佳在至多m：之溫S =下，，諸如在至多6。。。之溫度下進行，例如在3 :概度下進仃，諸如在至多5(rc之溫度下進行，例如 45C之溫度下進行，諸如在至多啊之溫度下進行 ^如令請專利範圍第14項之方法，其令該窯式乾朴 :式乾_間的任何時間均不上升至㈣以 不上升至75°c以上。 牧佳 該所Γ如中請專利範圍第2至U項中任一項之方法，其令 〆斤長:供之大麥均未經解麥芽。 …8_如申請專利範圍第1至U項中任一項之方法，其令 "麥及/或該經孵麥芽之大麥在該製醪之前經研磨。 19.如申請專利範圍第！至u項中任一項之方法 该麥芽汁組成物藉由涉及在不超 ” 之製醇步驟的方法製造。〇 %之咖度下使用製躁 兮制2〇·Μ請專利範圍第1至U項中任一項之方法，其令 / ,醪期間之溫度在任何時間均不超過8〇t，較佳不超過 4 201208586 78〇C。 21. 如申請專利範圍第1至U項中任-項之方法，坌中 在步驟（出）中添加其他佐劑，且該等其他佐劑係選自:王 米、稻穀及未經孵麥芽之除大麥以外之榖_組成之群心 22. 如申請專利範圍第項中任一項之方法，其中 ^ 2 (Μ中添加其他成分且該等其他成分為啤酒花或其 23.如申請專利範圍第！至w中任一項之方法盆中 將轉芽汁加熱至至多99.rc之溫度，諸如至多99.代，例 如至多99°C之溫度。 24.如申請專利範圍第 涉及加熱該麥芽汁之步驟 閉之容器中的情況下進行 中的情:;況下進行。 1至11項中任一項之方法，其中 (iv)係在該麥芽汁處於基本上密 ，較佳在該麥芽汁處於密閉容器 項之方法，其中 3 0分鐘，較佳 2 5.如申請專利範圍第1至11項中任一 將該麥芽汁加熱至8 G t以上之溫度持續至多 持續至多2 0分鐘。 —26.如申請專利範圍第u η項中任一項之方法 热發該麥芽汁體積之至多3%’諸如至多2。/。，例如至多1%， 諸如至多〇·5%，例如至多0.1%，諸如至多0·01% β =·如申請專利範圍第20項之方法，其中蒸發。該麥芽汁 體積之至夕3%’諸如至多2%，例如至多1%，諸 0.5% ’例如至多〇 1%，諸如至多〇 〇1%。 28.如申請專利範圍第u u項中任一項之方法，其中 201208586 步驟V )包含冷卻該經加熱之麥芽汁。 29.如申請專利範圍第！至"項中任一項之方法，其中 步驟v )包含.使該麥芽汁酸酵。 '、 3〇.如申請專利範圍第1至11項中任一項之方法，其中 該方法在任何步驟均不涉及加熱至超過99<>c之溫声。 31. 如申請專利範圍第丨丨項中任一項之方其中 該方法不涉及加熱至8〇t以上之溫度持續超過3〇分鐘二較 佳不超過2 0分鐘。 32. —種大麥植物或其部分，其中該大麥植物包含： a )引起功能性LOX-1完全喪失之第一突變；及 b )引起功此性LOX-2完全喪失之第二突變；及 c )引起功能MMT完全喪失之第三突變。 33_如申請專利範圍第32項之大麥植物，其中編碼該植 物之LOX-1的基因包含選自由讀框轉移突變、缺失、無義 犬變、插入及剪接位點突變所組成之群組的突變。 34_如申請專利範圍第32項之大麥植物或其部分其中 該編碼該植物之LOX-1之基因包含過早終止密碼子。^ 35. 如申請專利範圍第32項之大麥植物或其部分其中 該編碼該植物之LQX]之基因包含位於起始密碼子下游至 多705個、較佳至彡665個密碼子處的過早終止密碼子。 36. 如申請專利範圍第35項之大麥植物或其部分，其中 該編碼該植物之LOX-丨之基因包含無義密碼子’該密碼子 對應於SEQ ID NO:2之第3572至3574號鹼基。 3 7.如申請專利範圍帛3 2項之大麥植物，其中編碼該植 6 201208586 物之L〇X-2的基因包含選自由讀框轉移突變、缺失、無義 突變、插入及剪接位點突變所組成之群組的突變。 .38·如申請專利範圍第37項之大麥植物或其部分，其中 該編碼該植物之L0X-2之基因包含過早終止密碼子。 39_如申請專利範圍第37項之大麥植物或其部分，其中 »玄編碼該植物之LOX-2之基因包含位於起始密碼子下游至 多707個、較佳至多684個密碼子處的過早終止密碼子。 40.如申請專利範圍第39項之大麥植物或其部分，其中 該編碼該植物之LOX_2之基因包含處於SEQ⑴N〇:5之核 苷酸位置2689處導致形成終止密碼子的突變。 4 1.如申請專利範圍第3 2項之大麥植物，其中編碼該植 物之ΜΜΤ的基因包含選自由讀框轉移突變、缺失、無義突 變 '插入及剪接位點突變所組成之群組的突變。 4 2,.;.如申請專利範圍第4丨項之大麥植物或其部分，其中 該編碼ΜΜΤ之基因中之突變處於剪接位點内。 43. 如申請專利範圍第41項之大麥植物或其部分其中 該編碼ΜΜΤ之基因中之突變處於内含子之剪接位點内。 44. 如申請專利範圍第41項之大麥植物或其部分，其中 該編碼ΜΜΤ之基因中之突變為内含子之5，剪接位點内的突 變’諸如内含子之末端5,鹼基之G — A突變。 45. 如申請專利範圍第41項之大麥植物或其部分，其中 該編碼ΜΜΤ之基因中之突變為選自由内含子2及内含子$ 所組成之群組的内含子之5,剪接位點内之突變。 46. 如申請專利範圍第45項之大麥植物或其部分，其中 201208586 該編碼MMT之基因中之突變為Seqidn〇:9之第別冗號 驗基的G—>A突變。 47,如申請專利範圍第45項之大麥植物或其部分其中 該編碼ΜΜΤ之基因中之突變為SEQlDN〇:n之第“以號 驗基的G—>>A突變。 4 8 ·如申請專利範圍第4丨項之大麥植物或其部分，其中 該突變產生編碼MMT之截短形式之基因，該MMT之截短 形式包含野生型MMT之N端片段及視情況存在之野生型 MMT中未發現之其他c端序列，其中該N端片段包含至多 500個，更佳至多45〇個，甚至更佳至多4〇〇個更佳至多 31〇個，甚至更佳至多32〇個，更佳至多311個或至多288 個SEQ IDNO:13之N端胺基酸殘基。 4 9 ·如申請專利範圍第3 2項之大麥植物或其部分，其中 該第一突變為如申請專利範圍第33至36項中任一項之突 變’且該第二突變為如申請專利範圍第37至40項中任一 項之突變，且該第三突變為如申請專利範圍第41至48項 中任一項之突變。 50.如申請專利範圍第32項之大麥植物或其部分，其中 該植物為2008年10月13曰以編號PTA-9543寄存於ATCC 之名.稱為「大麥品系&063 (Barley, Hordeum vulgare: Line 8063 )」的大麥植物及以寄存編號PTA-9640寄存於ATCC 之名稱為「大麥品系 A689( Barley，Hordeum vulgare L.: Line A689 )」的大麥植物的子代。 8 1 1. —種麥芽組成物，其包含經加工之大麥植物或其部 201208586 分，其中β亥大麥植物為如申靖直u & 甲°月專利軏圍第32至48及50項 中任一項之大麥植物。 π 52.如申請專利範圍第51 甘士外丄Α 麥牙組成物，其中該大麥 植物之邊部分為籽粒。 士申叫專利範圍第5 i項之麥芽組成物，其中該麥芽 組成物係選自由綠麥芽及經熏式乾燥之麥芽所組成之群 细〇 、5 4 ·如申請專利_ 5 1 之麥芽組成物，其中該麥芽 組成物為經研磨之麥芽。 55. 如申請專利範圍第51項之麥芽組成物，其中該麥芽 組成物包含至多2响、較佳至乡1 pg/g、更佳至多0.5 Kg/g、甚至更佳至多〇.2 pg/g SMM。 56. —種基於大麥之飲料，其係由如申請專利範圍第& 至48及50項中任一項之大麥植物或其部分製備。 57. 如申請專利範圍第56項之飲料，其中該飲料係藉由 包含以下步驟之方法製備： (i )提供大麥植物或其部分，其中該大麥植物包含： (a)引起功能性脂肪加氧酶_丨（LOX-1 )完全喪失之 第一突變；及 (b )引起功能性LOX-2完全喪失之第二突變；及 (c)引起功能性S-腺苷甲硫胺酸：甲硫胺酸S-曱基轉 移酶（MMT)完全喪失之第三突變； (ii )視情況將該穀類之至少一部分孵麥芽，由此獲得 經孵麥芽之縠類；· 201208586 (Hi)將該穀類及/或經孵麥芽之穀類及視情況選用之 其他佐劑製躍，由此獲得麥芽汁； (lv )視情況在其他成分存在下加熱該麥芽汁，其中蒸 發該麥芽汁體積之至多4%，由此獲得經加熱之麥芽汁； (v )將該經加熱之麥芽汁加工成飲料。 58·如申凊專利範圍第56項之飲料，其中該飲料為麥芽 飲料。 59_如申請專利範圍第56項之飲料，其中該飲料為經醱 酵之麥芽飲料。 60. 如申請專利範圍第56項之飲料，其中該飲料為啤 61. 如申請專利範圍第57項之飲料，其中該飲料為啤 酒。 62. 如申請專利範圍第56項之飲料，其中該飲料為大麥 啤酒。 63. 如申請專利範圍第56項之飲料，其中該飲料為無酒 精麥芽飲料》 64. 如申請專利範圍第56項之飲料，其中該飲料與以相 同方式自野生型大麥’較佳為自栽培品種Quench製備之飲 料相比在60分鐘至8〇分鐘内產生至少多1.5倍，較佳至少 多2倍，更佳至少多3倍泡沫。 八、圖式： (如次頁） 10
TW100119499A 2010-06-03 2011-06-03 製備具有低含量之異味物質及/或其前驅物的基於大麥之飲料的方法、大麥植物細胞、麥芽組成物及基於大麥之飲料 TWI554216B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201070243 2010-06-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201208586A true TW201208586A (en) 2012-03-01
TWI554216B TWI554216B (zh) 2016-10-21

Family

ID=43431774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100119499A TWI554216B (zh) 2010-06-03 2011-06-03 製備具有低含量之異味物質及/或其前驅物的基於大麥之飲料的方法、大麥植物細胞、麥芽組成物及基於大麥之飲料

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP2575433B1 (zh)
JP (1) JP6007174B2 (zh)
CN (1) CN103209584B (zh)
AR (1) AR081635A1 (zh)
AU (1) AU2011260702B2 (zh)
BR (1) BR112012030806B8 (zh)
CA (1) CA2801142C (zh)
DK (1) DK2575433T3 (zh)
EA (1) EA031578B1 (zh)
ES (1) ES2600353T3 (zh)
HU (1) HUE029857T2 (zh)
MY (1) MY159408A (zh)
SA (1) SA111320504B1 (zh)
SG (1) SG185696A1 (zh)
TW (1) TWI554216B (zh)
WO (1) WO2011150933A2 (zh)
ZA (1) ZA201209379B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6723529B2 (ja) * 2015-07-14 2020-07-15 株式会社東洋新薬 ホップ葉含有飲食用組成物
FR3049432B1 (fr) * 2016-03-31 2019-08-09 Lesaffre Et Compagnie Procede de personnalisation du gout de pains ou de viennoiseries
RS60961B1 (sr) 2016-07-01 2020-11-30 Carlsberg Breweries As Prerađena pića zasnovana na žitaricama
EP3731628A1 (en) * 2017-12-28 2020-11-04 Carlsberg A/S Barley with increased hydrolytic enzyme activity
EP3732279B1 (en) 2017-12-28 2023-08-30 Carlsberg A/S Method for producing an extract of cereal and method for processing this extract into beverage
WO2019129736A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Carlsberg A/S Cereal plants with improved cell wall properties
JP7408552B2 (ja) 2017-12-28 2024-01-05 カールスバーグ アグシャセルスガーブ 穀物抽出物を作製するための高速手法
WO2019207063A1 (en) 2018-04-25 2019-10-31 Carlsberg A/S Barley based beverages
CN109287746A (zh) * 2018-11-16 2019-02-01 中南林业科技大学 一种利用润糙调质抑制米糠酸败的方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5242694A (en) 1992-02-18 1993-09-07 G. Heileman Brewing Company, Inc. Process for brewing low carbohydrate near beer
AU653472B2 (en) * 1992-05-14 1994-09-29 Joe White Maltings Limited Malt production
GB9722027D0 (en) * 1997-10-17 1997-12-17 Melica Hb Methods
EP1346030B1 (en) 2000-12-29 2011-11-02 Carlsberg Research Laboratory Low-lipoxygenase 1 barley
EP1527157A1 (en) * 2002-07-25 2005-05-04 Novozymes A/S Mashing process
JP4113795B2 (ja) 2003-03-25 2008-07-09 サッポロビール株式会社 大麦リポキシゲナーゼ−１遺伝子、大麦の選抜方法、麦芽アルコール飲料用原料及び麦芽アルコール飲料の製造方法
US7420105B2 (en) * 2004-03-11 2008-09-02 Carlsberg A/S Barley for production of flavor-stable beverage
DK1994136T3 (en) * 2006-03-07 2017-09-04 Novozymes As Process of beer brewing
JP5253896B2 (ja) * 2008-06-13 2013-07-31 麒麟麦酒株式会社 麦芽発酵飲料の製造に用いる大麦の前処理方法
PL2373154T3 (pl) 2008-12-03 2017-01-31 Carlsberg Breweries A/S Napoje otrzymywane z jęczmienia i słodu o niskim poziomie siarczku dimetylu
SA109310019B1 (ar) * 2008-12-30 2014-09-10 Carlsberg Breweries As شعير له نشاط ليبوأوكسجيناز منخفض

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012030806B8 (pt) 2022-05-10
SG185696A1 (en) 2013-01-30
ZA201209379B (en) 2014-02-26
BR112012030806B1 (pt) 2020-11-10
BR112012030806A2 (pt) 2017-12-12
JP6007174B2 (ja) 2016-10-12
CA2801142C (en) 2019-04-30
AU2011260702A1 (en) 2013-01-24
CN103209584B (zh) 2014-10-29
TWI554216B (zh) 2016-10-21
EP2575433A2 (en) 2013-04-10
CN103209584A (zh) 2013-07-17
WO2011150933A2 (en) 2011-12-08
EA201291444A1 (ru) 2013-06-28
AR081635A1 (es) 2012-10-10
JP2013526875A (ja) 2013-06-27
EA031578B1 (ru) 2019-01-31
ES2600353T3 (es) 2017-02-08
SA111320504B1 (ar) 2014-08-11
MY159408A (en) 2016-12-30
WO2011150933A3 (en) 2012-06-07
AU2011260702B2 (en) 2014-07-31
HUE029857T2 (en) 2017-04-28
EP2575433B1 (en) 2016-09-07
DK2575433T3 (en) 2016-12-19
CA2801142A1 (en) 2011-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5670347B2 (ja) リポキシゲナーゼ活性を低減させたオオムギおよびそれらから調製した飲料
JP5774997B2 (ja) 低ｄｍｓレベルの大麦由来飲料およびモルト由来飲料
TW201208586A (en) Energy saving brewing method
US20170183611A1 (en) Energy saving brewing method
JP7410030B2 (ja) 高められた加水分解酵素活性を有する大麦
LI et al. GERSTE MIT REDUZIERTER LIPOXYGENASE AKTIVITÄT UND EIN DAMIT HERGESTELLTES GETRÄNK ORGE À ACTIVITÉ RÉDUITE EN LIPOXYGÉNASE ET UNE BOISSON PRODUITE À PARTIR DE CETTE ORGE